NL1009045C2

NL1009045C2 - Peptide with endotoxin neutralizing activity.

Info

Publication number: NL1009045C2
Application number: NL1009045A
Authority: NL
Inventors: Johannes Antonius Gerar Strijp; Cornelis Petrus Maria V Kessel
Original assignee: Univ Utrecht
Priority date: 1998-04-29
Filing date: 1998-04-29
Publication date: 1999-11-01
Also published as: WO1999055731A1; AU3445299A; EP1073678A1

Description

PEPTIDE MET ENDOTOXINE-NEUTRALISERENDE ACTIVITEITPEPTIDE WITH ENDOTOXIN NEUTRALIZING ACTIVITY

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuw peptide met endotoxine-neutraliserende activiteit en een nieuwe manier voor de behandeling van sepsis. De uitvinding verschaft verder mogelijkheden voor thera-5 peutische en preventieve behandeling van de ziekte van Alzheimer.The present invention relates to a new peptide with endotoxin neutralizing activity and a new way of treating sepsis. The invention further provides possibilities for therapeutic and preventive treatment of Alzheimer's disease.

Sepsis omvat heel in het algemeen de ziektebeelden die ontstaan door de aanwezigheid van zich vermenigvuldigende bacteriën in bloed. De directe oorzaak van 10 de ziekteverschijnselen zijn toxische stoffen, die door de bacteriën worden afgegeven of vrijkomen bij lyse daarvan. Gram-negatieve bacteriën produceren bijvoorbeeld lipopolysacchariden (LPS) als onderdeel van hun celwand. Deze lipopolysacchariden zijn onder veel omstandigheden 15 toxisch. In beginsel zijn ze gebonden aan de cel en komen ze pas vrij wanneer de cel lyseert. Lipopolysacchariden worden ook wel endotoxines genoemd.Sepsis generally includes the syndromes caused by the presence of multiplying bacteria in blood. The direct cause of the disease symptoms are toxic substances, which are released or released by the bacteria upon lysis. Gram negative bacteria, for example, produce lipopolysaccharides (LPS) as part of their cell wall. These lipopolysaccharides are toxic under many circumstances. In principle, they are bound to the cell and are not released until the cell lyses. Lipopolysaccharides are also known as endotoxins.

Infectie met Gram-negatieve bacteriën kan leiden tot een levensbedreigende ziekte, die wordt geïni-20 tieerd door specifieke binding van LPS aan fagocyten, zoals monocyten, macrofagen en granulocyten (neutrofie-len). Deze worden hierdoor geactiveerd en scheiden verschillende cytokines uit, zoals tumor necrose factor-α (TNF-α), interleukine 1 (IL-1), IL-6, IL-8, en andere 25 ontstekingsmediatoren. Deze verbindingen initiëren ofwel direct of door activatie van secundaire mediatoren een cascade van gebeurtenissen, die uiteindelijk resulteren in koorts en afwijkingen in de bloedstolling, vaatverwij-ding, orgaanfalen en uiteindelijk septische shock.Infection with Gram-negative bacteria can lead to a life-threatening disease, which is initiated by specific binding of LPS to phagocytes, such as monocytes, macrophages and granulocytes (neutrophils). These are activated by this and secrete several cytokines, such as tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin 1 (IL-1), IL-6, IL-8, and other inflammatory mediators. These compounds initiate a cascade of events, either directly or by activation of secondary mediators, which ultimately result in fever and abnormalities in blood clotting, vasodilation, organ failure and ultimately septic shock.

30 Er zijn reeds verschillende behandelingen voor sepsis voorgesteld. Zo worden bijvoorbeeld voor de behandeling van specifiek Gram-negatieve sepsis monoclonale antilichamen tegen endotoxine gebruikt. Ook worden er momenteel proeven genomen met recombinant BPI, een pro-35 duct van de neutrofielen met een sterk lipopolysacchari-de-neutraliserende werking.Different treatments for sepsis have already been proposed. For example, monoclonal antibodies to endotoxin are used for the treatment of specific Gram negative sepsis. Trials are also currently being conducted with recombinant BPI, a neutrophil product with a strong lipopolysaccharide neutralizing effect.

Voor behandeling van algemene sepsis worden tegen cytokines gerichte antilichamen gebruikt of antago- »1 009045 2 nisten voor de oplosbare TNF (tumor necrose factor)-receptor of voor de interleukine-1 receptor.Antibodies directed against cytokines or antagonists for the soluble TNF (tumor necrosis factor) receptor or for the interleukin-1 receptor are used for treatment of general sepsis.

Tot nu toe werd met de bekende methoden nog geen totaal bevredigend resultaat verkregen.Until now, no completely satisfactory result has been obtained with the known methods.

5 Het is daarom het eerste doel van de onderhavi ge uitvinding een nieuwe methode van behandeling en diagnose van sepsis te verschaffen.It is therefore the primary object of the present invention to provide a new method of treatment and diagnosis of sepsis.

Verrassenderwijs werd gevonden dat een peptide met de aminozuurvolgorde QALNYEIRGYVIIKP in staat is aan 10 endotoxine te binden. Dit peptide dat hierin verder zal worden aangeduid als "het peptide" is gelijk aan de aminozuren 186-200 van het op zichzelf bekende eiwit Serum Amyloid P component (SAP). Door het peptide wordt binding van het circulerende LPS aan de fagocyten en 15 daarmee activatie daarvan voorkomen. Op deze wijze is het peptide in staat de biologische werking van endotoxine te neutraliseren.Surprisingly, it has been found that a peptide of the amino acid sequence QALNYEIRGYVIIKP is capable of binding to endotoxin. This peptide, which will hereinafter be referred to as "the peptide", is equivalent to amino acids 186-200 of the known protein Serum Amyloid P component (SAP). The peptide prevents binding of the circulating LPS to the phagocytes and thus their activation. In this way, the peptide is able to neutralize the biological activity of endotoxin.

De onderhavige uitvinding betreft naast het peptide zelf ook het gebruik van het peptide voor de ver-20 vaardiging van een farmaceutische samenstelling voor het neutraliseren van lipopolysaccharide(n) in het algemeen en de behandeling van sepsis in het bijzonder. Het peptide is zeer succesvol in het remmen van de binding van LPS aan monocyten.In addition to the peptide itself, the present invention also relates to the use of the peptide for the manufacture of a pharmaceutical composition for neutralizing lipopolysaccharide (s) in general and the treatment of sepsis in particular. The peptide is very successful in inhibiting the binding of LPS to monocytes.

25 In het onderzoek dat leidde tot de onderhavige uitvinding werd verder afgeleid dat LPS mogelijk betrokken is als omgevingsfactor bij het ontstaan van de ziekte van Alzheimer. De ziekte van Alzheimer valt samen met bepaalde vormen van kanker, rheumatoïde artritis, diabe-30 tes en het Down syndroom onder de noemer 'amyloidosis'. Dit is een verzameling van ziektes, die worden gekenmerkt door extracellulaire afzettingen van normale of gemuteerde eiwitten. De amyloïde afzettingen in Alzheimer zijn gerangschikt in een karakteristiek driedimensionaal 35 patroon van zogeheten "beta-pleated sheets". De subunit eiwitcomponent bestaat uit het amyloïde beta-eiwit (A beta-P). Dit is een klein fragment van ongeveer 40 aminozuren, dat door enzymen wordt vrijgemaakt uit het 1 009045 3 transmembraan beta-amyloïde precursoreiwit (beta-APP). De verwerking van dit precursoreiwit kan op meerdere manieren gebeuren, en resulteert dan in een normaal voorkomend oplosbaar fragment of, onder bepaalde omstandigheden via 5 alternatieve proteases, een intact beta-fragment. De productie van amyloïde beta-eiwit is op zichzelf dan ook een normale fysiologische gebeurtenis en het bestaan van A beta-P is aantoonbaar in de hersenvloeistof (CFS) van gezonde mensen. Echter, de afzetting van amyloïde beta-10 eiwit is de primaire gebeurtenis die aanleiding geeft tot de ziekte van Alzheimer.In the research that led to the present invention it was further deduced that LPS may be involved as an environmental factor in the development of Alzheimer's disease. Alzheimer's disease coincides with certain cancers, rheumatoid arthritis, diabetes 30 and Down syndrome under the name of 'amyloidosis'. This is a collection of diseases characterized by extracellular deposits of normal or mutated proteins. The amyloid deposits in Alzheimer's are arranged in a characteristic three-dimensional pattern of so-called "beta-pleated sheets". The subunit protein component consists of the amyloid beta protein (A beta-P). This is a small fragment of about 40 amino acids released by enzymes from the transmembrane beta-amyloid precursor protein (beta-APP). The processing of this precursor protein can be done in several ways, resulting in a normally occurring soluble fragment or, under certain conditions via 5 alternative proteases, an intact beta fragment. The production of amyloid beta protein is therefore a normal physiological event in itself and the existence of A beta-P is demonstrable in the brain fluid (CFS) of healthy people. However, the deposition of amyloid beta-10 protein is the primary event leading to Alzheimer's disease.

Met de amyloïde afzettingen zijn ook andere eiwitten geassocieerd, waaronder SAP en serum amyloïde A (SAA). Volgens de uitvinding is nu gevonden dat zowel SAP 15 als SAA kunnen binden aan LPS en in staat zijn de biologische activiteit van LPS te neutraliseren. Op zichzelf hebben deze twee amyloïde geassocieerde plasma-eiwitten geen structurele verwantschap.Other proteins are also associated with the amyloid deposits, including SAP and serum amyloid A (SAA). According to the invention, it has now been found that both SAP 15 and SAA can bind to LPS and neutralize the biological activity of LPS. On their own, these two amyloid-associated plasma proteins have no structural relationship.

Volgens de onderhavige uitvinding wordt nu 20 voorgesteld dat LPS een binding aangaat met de serum amyloïde eiwitten SAP en SAA, waardoor de rol van SAP en SAA in de initiatie van amyloïde afzettingen wordt beïnvloed. Het vermoeden bestaat dat door de binding van LPS aan SAP en SAA het ontstaan van afzettingen gestimuleerd wordt.According to the present invention, it is now proposed that LPS bind to the serum amyloid proteins SAP and SAA, thereby influencing the role of SAP and SAA in the initiation of amyloid deposits. It is suspected that the formation of deposits is stimulated by the binding of LPS to SAP and SAA.

25 De hypothese is nu dat (chronische) bacteriële infecties en met name LPS als omgevingsfactor bijdragen aan het ontstaan van de ziekte van Alzheimer. Vermoed wordt namelijk dat de basis voor Alzheimer de alternatieve splitsing van het beta-amyloïde precursoreiwit is, die 30 mogelijk buiten de hersenen in de circulatie plaatsvindt. Er zijn aanwijzingen dat oplosbaar amyloïde beta-eiwit in plasma is geassocieerd met lipoproteïnen, met name de VHDL- en HDL3-fracties, waarin het gecomplexeerd is met het apolipoproteïne J (ApoJ). Het complex ApoJ/amyloïde 35 beta-eiwit is in staat de bloed-hersenen-barrière te passeren. Op deze wijze komt het amyloïde beta-eiwit in de hersenen terecht, waar het wordt afgezet. SAA is even- p1 009045 4 eens een apolipoproteïne dat geassocieerd is met de HDL-fractie en met name met de HDL3-subfractie.25 The hypothesis is now that (chronic) bacterial infections and LPS in particular as an environmental factor contribute to the development of Alzheimer's disease. Namely, it is suspected that the basis for Alzheimer's is the alternative cleavage of the beta amyloid precursor protein, which may occur in circulation outside the brain. There is some evidence that soluble amyloid beta protein in plasma is associated with lipoproteins, especially the VHDL and HDL3 fractions, in which it is complexed with the apolipoprotein J (ApoJ). The ApoJ / amyloid 35 beta protein complex is able to cross the blood-brain barrier. In this way, the amyloid beta protein enters the brain, where it is deposited. SAA is also an apolipoprotein associated with the HDL fraction and especially with the HDL3 subfraction.

Verder wordt vermoed dat LPS ook via een indirecte weg een rol speelt bij het ontstaan van de ziekte 5 van Alzheimer. Cytokines, zoals interleukine 1 (IL-1) en interleukine 6 (IL-6), leiden tot overexpressie van beta-amyloïde precursoreiwit in de vaatwand en in microglia en astrocyten in de hersenen. Dit duidt op een rol voor de acute fase-response in de ontwikkeling van de ziekte van 10 Alzheimer. LPS is een potente initiator van de acute fase-response en initieert tevens de productie van IL-l en IL-6. Omdat beide cytokines leiden tot meer beta-amy-loïde precursoreiwit wordt een indirecte rol van LPS aangenomen.Furthermore, it is suspected that LPS also plays an indirect role in the development of Alzheimer's disease. Cytokines, such as interleukin 1 (IL-1) and interleukin 6 (IL-6), overexpress beta-amyloid precursor protein in the vessel wall and in microglia and astrocytes in the brain. This indicates a role for the acute phase response in the development of Alzheimer's disease. LPS is a potent initiator of the acute phase response and also initiates the production of IL-1 and IL-6. Since both cytokines lead to more beta-amyloid precursor protein, an indirect role of LPS is assumed.

15 Het van SAP afgeleide peptide volgens de uit vinding met een sterke LPS bindende en neutraliserende werking kan derhalve van belang zijn voor het uitschakelen van de rol van LPS in het ontstaan van de ziekte van Alzheimer.Thus, the SAP-derived peptide of the invention having a strong LPS binding and neutralizing activity may be of interest in eliminating the role of LPS in the development of Alzheimer's disease.

20 Deze invloed kan zowel betrekking hebben op de initiatie als de verdere progressie van de ziekte.This influence can relate to the initiation as well as the further progression of the disease.

Volgens een verder aspect verschaft de onderhavige uitvinding derhalve het gebruik van het peptide voor de vervaardiging van een farmaceutische samenstelling 25 voor de therapeutische en preventieve behandeling van de ziekte van Alzheimer.According to a further aspect, the present invention therefore provides the use of the peptide for the manufacture of a pharmaceutical composition for the therapeutic and preventive treatment of Alzheimer's disease.

De farmaceutische samenstellingen, die volgens de uitvinding het peptide als actief ingrediënt bevatten, zullen in het bijzonder bedoeld zijn voor parenteraal, en 30 dan met name intraveneus gebruik. De farmaceutische samenstellingen kunnen bereid worden door het combineren (dat wil zeggen mengen, oplossen etc.) van het peptide met voor intraveneuze toediening geschikte, farmaceutisch acceptabele excipiënten. De concentratie van het actieve 35 ingrediënt in een farmaceutische samenstelling kan variëren tussen 0.001% and 100%, afhankelijk van de aard van de behandeling en de wijze van toediening. De toe te dienen dosis van het actieve ingrediënt hangt eveneens af *1 009045 5 van de toedieningsroute en toepassing, maar kan bijvoorbeeld variëren tussen 0.01 μg en 1 mg per kg lichaamsgewicht, bij voorkeur tussen 0.1 ^g and 100 ^g per kg lichaamsgewicht .The pharmaceutical compositions containing the peptide as active ingredient according to the invention will be particularly intended for parenteral, and especially intravenous use. The pharmaceutical compositions can be prepared by combining (i.e. mixing, dissolving, etc.) the peptide with pharmaceutically acceptable excipients suitable for intravenous administration. The concentration of the active ingredient in a pharmaceutical composition can vary between 0.001% and 100% depending on the nature of the treatment and the mode of administration. The dose of the active ingredient to be administered also depends on the route of administration and application, but may vary, for example, between 0.01 µg and 1 mg per kg body weight, preferably between 0.1 ^ g and 100 ^ g per kg body weight.

5 Naast gebruik in een farmaceutische samenstel ling kan het peptide ook gebruikt worden voor diagnose van infectie met Gram-negatieve bacteriën of sepsis. Daartoe verschaft de uitvinding een diagnostische werkwijze voor het aantonen van de aanwezigheid van endotoxi-10 ne in bloed of bloedfracties, zoals serum of plasma, omvattende het in contact brengen van een drager met daaraan gebonden peptide met een te onderzoeken bloedmonster teneinde binding van endotoxine aan het peptide mogelijk te maken, het verwijderen van niet-gebonden 15 materiaal en het visualiseren en/of kwantificeren van de binding tussen endotoxine en het peptide.In addition to use in a pharmaceutical composition, the peptide can also be used for diagnosis of infection with Gram negative bacteria or sepsis. To this end, the invention provides a diagnostic method for demonstrating the presence of endotoxin in blood or blood fractions, such as serum or plasma, comprising contacting a carrier with bound peptide with an assay blood sample to bind endotoxin to enabling the peptide, removing unbound material and visualizing and / or quantifying the binding between endotoxin and the peptide.

Verder verschaft de uitvinding een diagnostische kit voor het uitvoeren van de werkwijze, omvattende een drager met daaraan gebonden peptide en middelen 20 voor het visualiseren en/of kwantificeren van binding tussen endotoxine en het peptide.Furthermore, the invention provides a diagnostic kit for carrying out the method, comprising a carrier with attached peptide and means for visualizing and / or quantifying binding between endotoxin and the peptide.

De drager kan verschillende vormen aannemen, zoals een microtiterplaat, een kolom, een membraan of korrels. Deze laatsten kunnen bijvoorbeeld magnetische 25 korrels zijn, zoals Dynabeads™.The support can take various forms, such as a microtiter plate, a column, a membrane or granules. The latter can be, for example, magnetic beads, such as Dynabeads ™.

Binding van endotoxine aan het peptide kan op verschillende manieren gedetecteerd worden. Zo kan gebruik gemaakt worden van een gelabeld antilichaam tegen endotoxine.Binding of endotoxin to the peptide can be detected in various ways. For example, a labeled antibody to endotoxin can be used.

30 De uitvinding zal verder worden geïllustreerd in de hierna volgende voorbeelden, die niet de bedoeling hebben de uitvinding op enigerlei wijze te beperken.The invention will be further illustrated in the following examples, which are not intended to limit the invention in any way.

In de voorbeelden zal verwezen worden naar de volgende begeleidende figuren: 35 Figuur 1 toont het effect van het peptide op LPS-binding aan monocyten. Op de X-as is de concentratie van het peptide uitgezet. Op de Y-as staat de gemiddelde fluorescentie, welke de ReLPS-binding weergeeft.In the examples, reference will be made to the following accompanying figures: Figure 1 shows the effect of the peptide on LPS binding to monocytes. The concentration of the peptide is plotted on the X axis. The Y axis shows the mean fluorescence, which represents the ReLPS bond.

1 0 09045 61 0 09045 6

Figuur 2 toont de remming van de LPS "priming" van neutrofielen in volbloed door het peptide ("pepl86-200") in aanwezigheid van LPS. In de grafiek is de peptidenconcentratie uitgezet tegen het percentage remming, 5 weergegeven als de totale luminescentierespons in 10 minuten (10' AUC).Figure 2 shows the inhibition of LPS priming of whole blood neutrophils by the peptide ("pepl86-200") in the presence of LPS. In the graph, the peptide concentration is plotted against the percent inhibition, expressed as the total luminescence response in 10 minutes (10 'AUC).

Figuur 3 toont de efficiëntie waarmee 30 μΜ peptide verschillende concentraties LPS remt.Figure 3 shows the efficiency with which 30 μΜ peptide inhibits different concentrations of LPS.

Figuur 4 laat de sterfte bij muizen onder 10 invloed van LPS zien in de aanwezigheid van het peptide (peptide + LPS) in vergelijking met een controle (buffer + LPS).Figure 4 shows mortality in mice under the influence of LPS in the presence of the peptide (peptide + LPS) compared to a control (buffer + LPS).

VOORBEELDENEXAMPLES

15 VOORBEELD 1EXAMPLE 1

Remming van endotoxine-aeïnduceerde monocvt-activatie door het peptide volgens de uitvinding 1.1 Materialen en methode 20 LPS van Salmonella Re595 (ReLPS, supra) wordt gelabeld met FITC (Sigma; F7250) onder condities, waaronder LPS als monomeer aanwezig is, resulterend in een FITC-LPS preparaat met een ratio van 1 molecuul FITC per molecuul LPS. Na uitvoerige ontzouting en dialyse tegen 25 PBS, wordt de stock-oplossing van FITC-LPS bewaard bij -20°C.Inhibition of endotoxin-induced monocvt activation by the peptide of the invention 1.1 Materials and method 20 LPS of Salmonella Re595 (ReLPS, supra) is labeled with FITC (Sigma; F7250) under conditions including LPS as monomer, resulting in a FITC-LPS preparation with a ratio of 1 molecule of FITC per molecule of LPS. After extensive desalination and dialysis against 25 PBS, the stock solution of FITC-LPS is stored at -20 ° C.

Mononucleaire leukocyten (monocyten en lymfocy-ten) worden geïsoleerd uit Heparine-bloed van gezonde vrijwilligers via een Ficoll (Pharmacia) gradiënt volgens 30 standaard methode. Na wassen worden de cellen opgenomen in isotone HEPES buffer (met 1 mM CaCl2 en 2% BSA). Preparaten met het peptide worden gemengd met FITC-LPS en vervolgens toegevoegd aan 3xl05 mononucleaire cellen en 30 ng/ml recombinant-LBP (verkregen van Dr. Lichtenstein) in 35 een totaal volume van 50 μΐ en een FITC-LPS concentratie 2,5 ng/ml. Na een incubatieperiode van 30 min bij 37°C, worden de monsters op ijs bewaard.Mononuclear leukocytes (monocytes and lymphocytes) are isolated from Heparin blood from healthy volunteers via a Ficoll (Pharmacia) gradient according to standard method. After washing, the cells are taken up in isotonic HEPES buffer (with 1 mM CaCl2 and 2% BSA). Compositions containing the peptide are mixed with FITC-LPS and then added to 3x105 mononuclear cells and 30 ng / ml recombinant LBP (obtained from Dr. Lichtenstein) in a total volume of 50 μΐ and a FITC-LPS concentration 2.5 ng / ml. After an incubation period of 30 min at 37 ° C, the samples are kept on ice.

*1 009045 7* 1 009045 7

Analyse van monocyt geassocieerde FITC-LPS binding vindt plaats met FACScan™ Flow cytometer. Forward en Sideward Scatter parameters worden gebruikt om de monocytenpopulatie te identificeren. Met LysisII™ soft-5 ware (Beckton & Dickinson) wordt de gemiddelde fluores-centiewaarde van 5000 monocyten berekend. Zie ook Weer-sing A.J.L. et al., J. Immunol. 145, 318-324 (1990)).Analysis of monocyte associated FITC-LPS binding is performed with FACScan ™ Flow cytometer. Forward and Sideward Scatter parameters are used to identify the monocyte population. LysisII ™ soft-5 ware (Beckton & Dickinson) calculates the average fluorescence value of 5000 monocytes. See also Weather A.J.L. et al., J. Immunol. 145, 318-324 (1990)).

2.2 Resultaten 10 Figuur 1 toont de concentratie-afhankelijke inhibitie van FITC-LPS-binding aan monocyten in vitro. Hieruit blijkt dat het peptide bijzonder efficiënt de binding van endotoxine aan monocyten kan remmen. Zelfs de laagste geteste concentratie van 0,01 μΜ geeft nog 30% 15 remming van de FITC-LPS binding.2.2 Results Figure 1 shows the concentration dependent inhibition of FITC-LPS binding to monocytes in vitro. This shows that the peptide can particularly efficiently inhibit the binding of endotoxin to monocytes. Even the lowest tested concentration of 0.01 μΜ still gives 30% inhibition of the FITC-LPS binding.

VOORBEELD 2EXAMPLE 2

Remming van endotoxine-geïnduceerde neutrofiel-activatie door het peptide 1. Materialen en methode 5 Volbloed (ontstold met EDTA) wordt direct na afname geïncubeerd met lng/ml ReLPS, en een monster peptide in een totaal volume van 250 μΐ gedurende 30 min bij 37°C. Vervolgens worden de monsters lOx verdund met PBS/glucose (5%). Hiervan wordt 100 μΐ in een luminometer 10 (Berthold; Autolumat LB953) geplaatst, waarna via automatische injectie aan elke buis luminol (180 μΜ) en 1 μΜ fMLP (formylmethyonyl-leucyl-fenylalanine) als stimulus worden toegevoegd. De luminescentierespons wordt continu gemeten gedurende 10 min. en de resultaten uitgedrukt als 15 totale luminescentierespons ("area under the curve" = AUC) .Inhibition of endotoxin-induced neutrophil activation by the peptide 1. Materials and method 5 Whole blood (coagulated with EDTA) is incubated immediately after collection with lng / ml ReLPS, and a sample peptide in a total volume of 250 μΐ for 30 min at 37 ° C. The samples are then diluted 10x with PBS / glucose (5%). 100 μΐ of this is placed in a luminometer 10 (Berthold; Autolumat LB953), after which luminol (180 μΜ) and 1 μΜ fMLP (formylmethyonyl-leucyl-phenylalanine) are added to each tube by automatic injection. The luminescence response is measured continuously for 10 min. And the results expressed as 15 total luminescence response (area under the curve = AUC).

2. Resultaten2. Results

Figuur 2 toont de remming van de LPS "priming" 20 van neutrofielen door het peptide in een compleet volbloed systeem. De remming van de priming is peptidenconcentratie afhankelijk en is maximaal bij 10 μΜ. Het 1 009045 δ bijzondere van deze bevinding is wel dat de remming van LPS plaats vindt in een ex vivo, niet-gemanipuleerde volbloedomgeving, welke de in vivo situatie het dichtst benadert.Figure 2 shows the inhibition of the LPS priming of neutrophils by the peptide in a complete whole blood system. The inhibition of the priming is peptide concentration dependent and is maximal at 10 μΜ. The peculiarity of this finding is that the inhibition of LPS takes place in an ex vivo, non-engineered whole blood environment, which comes closest to the in vivo situation.

5 Figuur 3 geeft de efficiëntie weer van 30 μΜ peptide om verschillende concentraties LPS in het volbloed "priming" systeem te remmen. Ook 10 ng/ml LPS wordt nog voor 50% geremd.Figure 3 shows the efficiency of 30 μΜ peptide to inhibit different concentrations of LPS in the whole blood priming system. 10 ng / ml LPS is also still 50% inhibited.

10 VOORBEELD 310 EXAMPLE 3

Bescherming tegen endotoxine-geïnduceerde mortaliteit in muizen door peptide (186-200) 1. Materialen en methodeProtection against endotoxin-induced mortality in mice by peptide (186-200) 1. Materials and method

In vivo-beschermingsexperimenten worden uitge-15 voerd in een acuut endotoxaemia muizenmodel met ReLPS.In vivo protection experiments are performed in an acute endotoxemia mouse model with ReLPS.

Het peptidenpreparaat wordt eerst geïncubeerd met ReLPS in een HBSS-buffer met 2% humaan albumine gedurende 30 min. bij 37°C. Vervolgens wordt dit mengsel in combinatie met actinomycine D (25 μg per muis) intraveneus toege-20 diend aan BALB/c-muizen van 8 weken oud. De overleving wordt gedurende 5 dagen vervolgd.The peptide preparation is first incubated with ReLPS in an HBSS buffer containing 2% human albumin for 30 min at 37 ° C. This mixture is then administered intravenously to 8 week old BALB / c mice in combination with actinomycin D (25 µg per mouse). Survival is continued for 5 days.

2. Resultaten2. Results

De overleving van 2 groepen van 8 muizen inge-25 spoten met 3 pg ReLPS met en zonder peptide is weergegeven in figuur 4. De muizen die zijn ingespoten met alleen peptide (dus zonder LPS) overleefden allen, dus vertoonden geen acute nadelige gevolgen van het peptide (niet getoond). De 8 muizen ingespoten met LPS plus buffer zijn 30 allemaal dood binnen 12 uur (-♦). Echter, van de groep van 8 muizen ingespoten met LPS plus peptide (30 μΜ of 5 mg/kg) leeft 50% nog na 12 uur en vertoont als hele groep een duidelijk vertraagde sterfte (--).The survival of 2 groups of 8 mice injected with 3 µg of ReLPS with and without peptide is shown in figure 4. The mice injected with peptide alone (ie without LPS) all survived, so showed no acute adverse effects of the peptide (not shown). The 8 mice injected with LPS plus buffer are all dead within 12 hours (- ♦). However, of the group of 8 mice injected with LPS plus peptide (30 μΜ or 5 mg / kg), 50% are still alive after 12 hours and as a whole group show markedly delayed mortality (-).

*1009045* 1009045

Claims

1. Peptide having endotoxin neutralizing activity, which peptide consists of the amino acids: QALNYEIRGYVIIKP.

A peptide according to claim 1 for use for neutralizing lipopolysaccharides.

Use of the peptide according to claim 1 for the manufacture of a pharmaceutical composition for neutralizing lipopolysaccharide.

Use of the peptide according to claim 1 for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of sepsis.

A diagnostic method for detecting the presence of endotoxin in blood or blood fractions, such as serum or plasma, comprising contacting a carrier with the peptide bound thereto according to claim 1 with a blood sample to be tested in order to bind endotoxin to the peptide, removing unbound material and visualizing and / or quantifying the binding between endotoxin and the peptide.

6. Diagnostic kit for carrying out the method according to claim 5, comprising a carrier with the peptide bound to claim 1 and means for visualizing and / or quantifying binding between endotoxin and the peptide.

Use of the peptide according to claim 1 for the manufacture of a pharmaceutical composition for the therapeutic and / or preventive treatment of Alzheimer's disease. • 1 0090 4 5