NL1006069C2

NL1006069C2 - Process for the preparation of peptides.

Info

Publication number: NL1006069C2
Application number: NL1006069A
Authority: NL
Inventors: Enrico Gautier Funhoff; Birgit Schulze
Original assignee: Dsm Nv
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1997-05-16
Publication date: 1998-11-17
Also published as: WO1998051815A1; AU7555298A

Description

- 1 - WERKWIJZE VOOR DE BEREIDING VAN PEPTIDEN 5- 1 - METHOD FOR PREPARING PEPTIDES 5

De uitvinding betreft een werkwijze voor de bereiding van een peptide waarin een vrij aminozuur waarvan de aminofunctie een secundaire aminogroep is, als nucleofiele component een peptide-binding aangaat 10 met een N-beschermd-aminozuur, of een derivaat daarvan, als carboxyldonor, in aanwezigheid van een geschikt enzym.The invention relates to a process for the preparation of a peptide in which a free amino acid whose amino function is a secondary amino group, as nucleophilic component, forms a peptide bond with an N-protected amino acid, or a derivative thereof, as a carboxyl donor, in the presence of a suitable enzyme.

In Shui-Tein Chen et al., Bioorganic &In Shui-Tein Chen et al., Bioorganic &

Medical Chemistry Letters, Vol. 4, No. 3, pp. 443-448, 15 1994 wordt de koppeling van proline als nucleofiele component beschreven. In de bekende koppeling wordt echter proline steeds in gederivatiseerde vorm, i.c. als amide of als ester toegepast.Medical Chemistry Letters, Vol. 4, no. 3, pp. 443-448, 1994 describes the coupling of proline as a nucleophilic component. In the known coupling, however, proline is always used in derivatized form, i.e. as an amide or as an ester.

Gebleken is dat, vergeleken met aminozuren 20 waarvan de aminofunctie een primaire aminogroep is, de (enzymatische) koppeling van aminozuren -als nucleofiele component- waarvan de aminofunctie een secundaire aminogroep is, veel moeilijker verloopt, waardoor in het verleden steeds een gederivatiseerde 25 vorm van de carboxylgroep van de nucleofiele component, bevoorbeeld een ester of amide, moest worden toegepast. Aanvraagster heeft nu gevonden dat het mogelijk is om aminozuren waarvan de aminofunctie een secundaire aminogroep is, als vrij zuur als nucleofiele component 30 toe te passen in de bereiding van peptiden.It has been found that, compared to amino acids 20 of which the amino function is a primary amino group, the (enzymatic) coupling of amino acids - as a nucleophilic component - of which the amino function is a secondary amino group, proceeds much more difficult, as a result of which a derivatized form of the carboxyl group of the nucleophilic component, e.g. an ester or amide, had to be used. Applicant has now found that it is possible to use amino acids whose amino function is a secondary amino group as free acid as nucleophilic component in the preparation of peptides.

Een peptide kan worden voorgesteld als een verbinding A-B-OH waarin A is afgeleid van een aminozuur AOH of een derivaat daarvan (carboxyldonor), en via de carboxygroep gebonden is aan de aminofunctie 35 van aminozuur BOH (nucleofiele component), waarin OH duidt op de vrije zuurfunctie.A peptide can be represented as a compound AB-OH in which A is derived from an amino acid AOH or a derivative thereof (carboxyl donor), and is bound via the carboxy group to the amino function of amino acid BOH (nucleophilic component), wherein OH denotes the free acid function.

1006069 - 2 -1006069 - 2 -

Een belangrijke groep van aminozuren die als nucleofiele component kunnen worden toegepast, zijn bijvoorbeeld al dan niet gesubstitueerde prolines, in het bijzonder L-prolines. Proline vormt een belangrijke 5 bouwsteen in veel bekende farmaceutica.An important group of amino acids that can be used as a nucleophilic component are, for example, substituted or unsubstituted prolines, in particular L-prolines. Proline is an important building block in many well-known pharmaceuticals.

Geschikte aminozuren die als carboxyldonor kunnen worden toegepast zijn bijvoorbeeld (fenyl)alanine, (fenyl)glcyine, valine en lysine, in het bjizonder het L-enantiomeer van deze aminozuren.Suitable amino acids that can be used as a carboxyl donor are, for example, (phenyl) alanine, (phenyl) glcyine, valine and lysine, especially the L-enantiomer of these amino acids.

10 Als derivaten komen in principe alle bekende vormen van de zuren in aanmerking bijvoorbeeld amiden en esters, in al dan niet gesubstitueerde vorm alsmede peptiden en eventueel een al dan niet N-gesubstitueerd amide of een ester daarvan. Geschikte esters zijn bijvoorbeeld 15 alkylesters, in het bijzonder Ci-C* alkylesters. De aminozuren of derivaten ervan die als carboxyldonor kunnen worden toegepast hebben als substituent op de aminofunctie bijvoorbeeld een beschermgroep of een N-beschermd aminozuur of een al dan niet beschermd 20 peptide. Aminozuur-beschermgroepen zijn algemeen bekend en bijvoorbeeld beschreen in T.W. Green, Protecting groups in Organic Synthesis, John Wiley & Son, New York, 1981. Veel gebruikte beschermgroepen zijn bijvoorbeeld de t-butyloxycarbonylgroep (BOC), de 9-25 fluorenylmethyloxycarbonylgroep (Fmoc), de benzyloxycarbonylgroep (Z), de ftaalyl-groep en de formylgroep.In principle, all known forms of the acids are suitable as derivatives, for example amides and esters, in unsubstituted or substituted form, as well as peptides and optionally an N or unsubstituted amide or an ester thereof. Suitable esters are, for example, 15 alkyl esters, in particular C 1 -C * alkyl esters. The amino acids or derivatives thereof which can be used as a carboxyl donor have as substituent on the amino function for example a protecting group or an N-protected amino acid or a protected or unprotected peptide. Amino acid protecting groups are well known and described, for example, in T.W. Green, Protecting groups in Organic Synthesis, John Wiley & Son, New York, 1981. Commonly used protecting groups include the t-butyloxycarbonyl group (BOC), the 9-25 fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc), the benzyloxycarbonyl group (Z), the phthalyl group and the formyl group.

Geschikte enzymen die kunnen worden toegepast in de werkwijze volgens de uitvinding zijn bijvoorbeeld 30 enzymen afkomstig van schimmels, bij voorkeur van het genus Rhizopus. in het bijzonder van Rhizopus orvzea. De beste resultaten werden bereikt met Peptidase R van de firma Amano, een endoprotease.Suitable enzymes that can be used in the method according to the invention are, for example, enzymes from fungi, preferably from the genus Rhizopus. in particular Rhizopus orvzea. The best results were obtained with Peptidase R from Amano, an endoprotease.

De enzymatische koppelingsreactie wordt bij 35 voorkeur uitgevoerd in water eventueel in aanwezigheid van een buffer, bijvoorbeeld een fosfaatbuffer. Het is 1006069 - 3 - echter eveneens mogelijk de reactie uit te voeren in een organisch oplosmiddel bijvoorbeeld een alcohol, in het bijzonder tert. butanol, 2-hexanol of tetr. amylalcohol; een alifatische of aromatische 5 koolwaterstof, in het bijzonder hexaan, octaan of tolueen; of een ester in het bijzonder butylacetaat.The enzymatic coupling reaction is preferably carried out in water, optionally in the presence of a buffer, for example a phosphate buffer. However, it is also possible to carry out the reaction in an organic solvent, for example an alcohol, in particular tert. butanol, 2-hexanol or tetr. amyl alcohol; an aliphatic or aromatic hydrocarbon, especially hexane, octane or toluene; or an ester in particular butyl acetate.

De temperatuur waarbij de koppelingsreactie wordt uitgevoerd is niet bijzonder kritisch en ligt bijvoorkeur tussen -50 en +80°C, in het bijzonder 10 tussen -20 en +50°C.The temperature at which the coupling reaction is carried out is not particularly critical and is preferably between -50 and + 80 ° C, in particular between -20 and + 50 ° C.

De pH waarbij de koppelingsreactie wordt uitgevoerd ligt bij voorkeur tussen 3 en 11, in het bijzonder tussen 7 en 10. Desgewenst kan de pH tijdens de reactie op een constante waarde worden gehouden, 15 bijvoorbeeld met behulp van pH-stat. De optimale pH wordt in de praktijk veelal bepaald door een afweging van enerzijds een hogere enzymactiviteit bij lagere pH en anderzijds de concentratie gedeprotoneerd aminozuur (nucleofiel component) die hoger is naarmate de pH 20 hoger is. Daarnaast bleek bij hogere pH, in het bijzonder bij pH groter dan 8, geen of nauwelijks enzymatische hydrolyse plaats te vinden van het product.The pH at which the coupling reaction is carried out is preferably between 3 and 11, in particular between 7 and 10. If desired, the pH can be kept at a constant value during the reaction, for example by means of pH stat. In practice, the optimum pH is usually determined by weighing on the one hand a higher enzyme activity at a lower pH and on the other hand the concentration of deprotonated amino acid (nucleophilic component) that is higher the higher the pH is. In addition, at higher pH, in particular at pH greater than 8, little or no enzymatic hydrolysis of the product was found to take place.

De concentratie van de carboxyldonor ligt bij 25 voorkeur tussen 50 mM en 1 M, in het bijzonder tussen 250 en 500 mM. De concentratie van de nucleofiele component ligt bij voorkeur tussen 50 mM en 20 M, in het bijzonder tussen 0,5 en 2 M.The concentration of the carboxyl donor is preferably between 50 mM and 1 M, in particular between 250 and 500 mM. The concentration of the nucleophilic component is preferably between 50 mM and 20 M, in particular between 0.5 and 2 M.

De uitvinding zal nu verder worden toegelicht 30 aan de hand van de voorbeelden, zonder evenwel daardoor te worden beperkt.The invention will now be further elucidated on the basis of the examples, without, however, being limited thereby.

1006069 - 4 -1006069 - 4 -

Voorbeeld IExample I

Enzymatische synthese van Z-Ala-ProEnzymatic synthesis of Z-Ala-Pro

In 15 ml 50 mM fosfaatbuffer (pH = 8,0) werd onder roeren 1,71 g proline (1,0 M) opgelost en 889 mg 5 (0,25 H) methylester van Z-Ala gesuspendeerd bij een temperatuur van 45°C. Na instellen van de pH op 8 werd 75 mg van het enzympreparaat Peptidase R (Amano; batch PRR 03522 R) toegevoegd om de reactie te starten. Gedurende de reactie werd de pH constant gehouden op pH 10 =8 door dosering van 0,5 M NaOH (pH-stat). Tijdens de reactie werden 250 μΐ monsters genomen en toegevoegd aan 25 ml 60% 25 mM fosforzuur (pH = 2,20)/40% methanol welke werden geanalyseerd, met behulp van een HPLC, op de vorming van Z-Ala en Z-Ala-Pro (Kolom Nucleosil 120-15 5-Cie, UV detectie bij λ = 210 mm op een Spectra Physics UV2000). Na 23 uur werd een opbrengst van 26,5 mM Z-Ala-Pro gehaald.1.71 g of proline (1.0 M) was dissolved in 15 ml of 50 mM phosphate buffer (pH = 8.0) and 889 mg of 5 (0.25 H) methyl ester of Z-Ala was suspended at a temperature of 45 ° C. After adjusting the pH to 8, 75 mg of the enzyme preparation Peptidase R (Amano; batch PRR 03522 R) was added to start the reaction. During the reaction, the pH was kept constant at pH 10 = 8 by dosing 0.5 M NaOH (pH stat). During the reaction, 250 μΐ samples were taken and added to 25 ml of 60% 25 mM phosphoric acid (pH = 2.20) / 40% methanol which were analyzed by HPLC to form Z-Ala and Z-Ala -Pro (Column Nucleosil 120-15 5-Cie, UV detection at λ = 210 mm on a Spectra Physics UV2000). After 23 hours, a yield of 26.5 mM Z-Ala-Pro was obtained.

Voorbeeld IIExample II

20 Enzymatische synthese van Z-Val-Pro20 Enzymatic Synthesis of Z-Val-Pro

In 15 ml 50 mM fosfaatbuffer (pH = 8,0) werd onder roeren 1,71 g proline (1,0 M) opgelost en 830 mg (0,21 M) methylester van Z-Val gesuspendeerd bij een temperatuur van 37,5°C. Na instellen van de pH op 8 25 werd 100 mg van het enzympreparaat Peptidase R (Amano) toegevoegd om de reactie te starten. Gedurende de reactie werd de pH constant gehouden op pH=8 door dosering van 0,5 M NaOH (pH-stat). Tijdens de reacie werden 250 μΐ monsters genomen en toegevoegd aan 25 ml 30 60% 25 mM fosforzuur (pH=2,20)/40% methanol welke werden geanalyseerd, met behulp van een HPLC, op de vorming van Z-Val en Z-Val-Pro (Kolom nucleosil 120-5-C18, UV detectie bij λ=210 nm op een Spectra Physics UV 2000). Na 27 uur werd bij een conversie van 40% een 35 opbrengst van 2,8 mM Z-Val-Pro gehaald.1.71 g proline (1.0 M) was dissolved in 15 ml 50 mM phosphate buffer (pH = 8.0) and 830 mg (0.21 M) methyl ester of Z-Val was suspended at a temperature of 37.5 ° C. After adjusting the pH to 8, 100 mg of the enzyme preparation Peptidase R (Amano) was added to start the reaction. During the reaction, the pH was kept constant at pH = 8 by dosing 0.5 M NaOH (pH stat). During the reaction, 250 μΐ samples were taken and added to 25 ml of 60% 25 mM phosphoric acid (pH = 2.20) / 40% methanol which were analyzed by HPLC for the formation of Z-Val and Z- Val-Pro (Column nucleosil 120-5-C18, UV detection at λ = 210 nm on a Spectra Physics UV 2000). After 27 hours, at a conversion of 40%, a yield of 2.8 mM Z-Val-Pro was obtained.

1006069 - 5 -1006069 - 5 -

Voorbeeld IIIExample III

Enzymatische synthese van Z-Glv-ProEnzymatic synthesis of Z-Glv-Pro

In 15 ml 50 mM fosfaatbuffer (pH=8,0) werd onder roeren 1,71 g proline (1,0 M) en 94 mg (0,028 M) 5 methylester van Z-Gly opgelost bij een temperatuur van 37,5°C. Na instellen van de pH op 8 werd 80 mg van het enzympreparaat Peptidase R (Amano) toegevoegd om de reactie te starten. Gedurende de reactie werd de pH constant gehouden op pH=8 door dosering van 0,5 M NaOH 10 (pH-stat). Tijdens de reactie werden 250 μΐ monsters genomen en toegevoegd aan 25 ml 60% 25 mM fosforzuur (pH=2,20)/40% methanol welke werden geanalyseerd, met behulp van een HPLC, op de vorming van Z-Gly (Kolom Nucleosil 120-50-Cie, UV detectie bij λ=210 nm op een 15 Spectra Physics UV2000). Via NMR werd de opbrengst Z-Gly-Pro bepaald. Deze was na 24 uur, bij volledige conversie, 20%.1.71 g of proline (1.0 M) and 94 mg (0.028 M) of 5-methyl ester of Z-Gly were dissolved in a 15 ml 50 mM phosphate buffer (pH = 8.0) at a temperature of 37.5 ° C. . After adjusting the pH to 8, 80 mg of the enzyme preparation Peptidase R (Amano) was added to start the reaction. During the reaction, the pH was kept constant at pH = 8 by dosing 0.5 M NaOH 10 (pH stat). During the reaction, 250 μΐ samples were taken and added to 25 ml of 60% 25 mM phosphoric acid (pH = 2.20) / 40% methanol which were analyzed by HPLC for Z-Gly formation (Column Nucleosil 120 -50-Cie, UV detection at λ = 210 nm on a 15 Spectra Physics UV2000). The yield of Z-Gly-Pro was determined by NMR. This was 20% after 24 hours, at full conversion.

10060691006069

Claims

1. A method for the preparation of a peptide, wherein a free amino acid whose amino function is a secondary amino group, as a nucleophilic component, forms a peptide bond with an N-protected amino acid or a derivative thereof, as a carboxyl donor in the presence of an enzyme.

The method according to claim 1, wherein a proline is used as the nucleophilic component.

The method according to claim 1 or 2, wherein the enzyme derived from a fungus is used.

The method of claim 1, wherein an enzyme derived from Rhizopus orizea is used.

A method according to any one of claims 1-4, wherein the coupling takes place at a temperature between -20 and + 50 ° C.

6. Method according to any one of claims 1-5, wherein the coupling takes place at a pH between 7 and 10.

7. Process for the preparation of a peptide, as described and illustrated by the examples.

Peptide prepared by the method according to any one of claims 1-7. 1006069