MXPA99012024A - Uso de ligandos mhc de la clase ii como adyuvantes para la vacunacion y de lag-3 en el tratamientodel cancer - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a uso de un ligando MHC de la clase II, talcomo CD4 o LAG-3, para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar las condiciones patológicas que involucran una respuesta inmune especifica del antígeno, asícomo el uso de LAG-3 en la inmunoterapia contra el cáncer. La invención también abarca una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un antígeno capaz de inducir una respuesta inmune especifica del antígeno, junto con una cantidad efectiva de un ligando MHC de la clase II en donde el ligando MHC de la clase II estápresente como un agente similar a adyuvante.

Description

USO DE LIGANDOS MHC DE LA CLASE II COMO ADYUVANTES PARA LA VACUNACIÓN Y DE LAG-3 EN EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER Descripción de la Invención La presente invención se refiere al uso de LAG-3 y CD4, y de una manera más general al uso de los ligandos MHC de la clase II o ligandos similares MHC de la clase II como adyuvantes para vacunas, con el fin de disparar una respuesta inmune especifica del antigeno, asi como el uso de LAG-3 como un agente terapéutico en la inmunoterapia contra el cánce . Es ahora reconocido que las proteínas codificadas por la región MHC de la clase II están involucradas en muchos aspectos del reconocimiento inmune, incluyendo la interacción entre las diferentes células linfoides tales como linfocitos y células presentadoras de antigeno. Las diferentes observaciones han mostrado también que otros mecanismos que no tienen lugar via CD4 participan en la función efectora de los linfocitos T cooperadores .

El gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3) expresado en células T humanas activadas por CD4+ y CD8+ asi como en células NK activadas, codifica para una proteina membranal del tipo I de 503 aminoácidos con cuatro dominios de la superfamilia de inmunoglubulina extracelular (IgSF) (1), y es un ligando para las moléculas de MHC de la clase II (2) . El análisis de esta secuencia reveló parches notables de identidad con tramos de secuencias de aminoácidos encontrados en las posiciones correspondientes en CD4, aunque la homología completa de la secuencia de aminoácidos con CD4 humana es escasamente por arriba del nivel antecedente (aproximadamente 20% de identidad secuencial) . Existen también algunas homologías de secuencia interna en la molécula LAG-3 entre los dominios 1 (DI) y 3 (D3) asi como entre los dominios 2 (D2) y 4 (D4), sugiriendo que LAG-3 ha evolucionado como CD4 por duplicación de genes a partir de una estructura (1) preexistente de 2 IgSF. Además, los genes LAG-3 y CD4 están localizados en muy estrecha proximidad sobre la parte distal del brazo corto del cromosoma 12 (3) . LAG-3 y CD4 pueden por lo tanto ser considerados como "primeros hermanos" evolutivos dentro de .IgSF (2) .

Como CD4 hLAG-3 está compuesto de ectodo inios similares a Ig con una porción de firma xC en los dominios 2 y 4; no obstante una diferencia con CD4 es la presencia de una secuencia extra-bucle en el dominio 1 (reconocido por el Ab (anticuerpo monoclonal) 17B4) y una porción rica en prolina intracitoplásmica (repeticiones EP) en LAG-3 humano (hLAG-3) . Recientemente, el gen 3 de activación de linfocitos murinos (m.LAG-3) fue clonado y se encontró aproximadamente 70% de homología con hLAG-3, con la misma porción rica en prolina en la cola intracitoplásmica. La estimulación especifica de antigeno de los clones de células T CD4+ en presencia del anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 conduce a la proliferación prolongada, y a la producción de citocinas (5) . Se ha sugerido un papel regulador de h.LAG-3 sobre los linfocitos T CD4+ activados, mediante reticulación de las moléculas MHC de la clase II expresadas sobre las células T, con las proteínas de fusión de Ig-LAG-3 (6) . La interacción de MHC de la clase II con LAG-3 inhibe las señales a través de las moléculas MHC de la clase II expresadas sobre las células T CD4+ (disminución de la proliferación y producción de citocinas), sugiriendo que LAG-3 y MHC de la clase II son moléculas efectoras para la subregulación de las respuestas inmunes mediadas por las células T cooperadoras. La proteina de fusión a Ig hLAG-3 se encontró que se enlaza a las moléculas xenogénicas MHC de la clase II (murinas y de mono) . Además, se ha propuesto que mLAG-3 transduce una señal positiva en células efectoras, ya que los ratones transgénicos con una mutación nula en LAG-3 tienen un defecto en el compartimento de las células NK (7) . Las lineas celulares de tumores de ratón manipulas mediante ingeniería genética para expresar las moléculas membranales (B7.1, B7.2, CD95L, etc.) o secretadas (IL-2, IL-12, etc.) son frecuentemente utilizadas para investigar las respuestas inmunes o los efectos antitumorales . Este procedimiento implica que muchas células tumorales son potencialmente antigénicas (9), y se vuelven inmunogénicas cuando éstas expresan las moléculas. Los tumores de ratones experimentales se clasifican como intrínsecamente inmunogénicos cuando, después de una inyección simple dentro de ratones singénicos como vacunas celulares no replicantes, promueven una respuesta inmune protectora contra un reto letal subsecuente. Los tumores que no conservan esta iniaunogenicidad residual son definidos como pobremente inmunogénicos o no inmunogénicos. Las respuestas inmunes antitumorales son mediadas principalmente por células T (12) . Estudios recientes han implicado un déficit en la presentación eficiente del antigeno y el aprestamiento de las células T, que es problemático para la implementación práctica de una vacuna tumoral ideal. Por supuesto, se ha demostrado que las células tumorales en trans fección, con los genes que codifican para diversas citocinas, tales cómo IL-2, IL-4, IL-12 o GM-CSF o genes que codifican para las moléculas coestimuladoras tales como B7 no conducen completamente al rechazo primario de las células modificadas, pero frecuentemente provocan inmunidad protectora contra el reto subsecuente con células tumorales no modificadas (13) . Las células presentadoras de antigeno profesionales (APCs) son capaces de recoger, procesar y presentar antigeno a las células T en el contexto de las señales estimuladoras requeridas para la activación de células T, conduciendo a la presentación óptima del antigeno. En particular, está bien establecido que las células dendriticas MHC de la clase II+ (DCs) juegan un papel crucial en el procesamiento y en la presentación de antigeno al sistema inmune. Los inventores lanzaron la hipótesis de que la inmunogenicidad tumoral podria ser incrementada si el tumor pudiera ser modificado para disparar directamente las APCs del huésped tales como macrófagos y células dendriticas. Por supuesto, se ha reportado que la reticulación de las moléculas MHC de la clase II expresadas específicamente por tales células, utilizando anticuerpo monoclonal (mAb) o superantigenos , transduce las señales dando como resultado la producción de TNFa e IL-12 (14, 15) . Ellos hablan reportado previamente que el gen 3 de la activación de linfocitos (LAG-3), el cual estaba incrustado en el locus CD4 (1, 16) codifica para una proteina que se enlaza a las moléculas humanas y murinas MHC de la clase II con mayores afinidades que CD4 (17, 6 ) . Los inventores de la presente solicitud han investigado si la expresión de h.LAG-3, CD4 humano (hCD4) y m.LAG-3 sobre tres tumores de ratón MHC de la clase II (el sarcoma pobremente inmunogénico MCA 205 y el adenocarcinoma no inmunogénico TS/A + RENCA) pueden mediar una respuesta inmune para rechazar el tumor de ratón y pueden inducir la inmunidad sistémica. Como resultado, ellos han descubierto que LAG-3 humano o murino, ya sea expresado como proteínas membranales en lineas celulares de tumores sólidos o inoculadas en ratones como una proteina soluble indujo una potente inmunidad contra los tumores murinos altamente malignos. La inmunidad fue dependiente de las células T y especifica del antigeno. Ellos han investigado además el papel de CD4 y encontraron que CD4 humano (hCD4) también indujo una respuesta antitumoral sistémica. Se ha encontrado que la inmunidad inducida es mediada por las células T, ya que se obtuvo la misma respuesta antitumoral con ratones desnudos que carecen de los linfocitos T. El efecto antitumoral fue todavía encontrado cuando se utilizan diferentes lineas de células tumorales que muestran diferente inmunogenicidad intrínseca asi como diferentes cepas de ratones que expresan diferentes genes de MHC. Además, los efectos inducidos por h.LAG-3 y hCD4 fueron observados cuando las lineas de células tumorales que expresan hLAG-3 o hCD4 fueron inyectadas en un sitio distante del sitio de inoculación inicial de las lineas celulares tumorales del tipo silvestre. Además, la administración sistémica de hLAG-3 soluble induce directamente una inhibición del crecimiento tumoral in vi vo . Todos los resultados anteriormente mencionados muestran que LAG-3 y CD4 son capaces de provocar una respuesta inmune especifica del antigeno, mediada por células T y pueden ser útiles como una herramienta en la inmunoterapia, con el fin de prevenir la aparición de un cáncer entre poblaciones en riesgo o más en general en cualquier inmunoterapia que involucre una respuesta inmune mediada por células T especificas de antigeno, y que LAG-3 es además útil como una herramienta para inhibir el desarrollo tumoral in vi vo . Los inventores han demostrado además que cuando se administra LAG-3 junto con un antigeno contra el cual se busca una respuesta inmune, éste fue capaz de trabajar como un adyuvante para una vacuna. Este papel puede ser explicado por una presentación mejorada del antigeno por las APCs profesionales (células dendriticas y macrófagos) localizadas por debajo de la piel y disparadas via MHC de la clase II. En consecuencia, ya que la inducción de una inmunidad de células T CD8+ esté involucrada en infecciones virales (por ejemplo, SIDA, hepatitis y herpes) y parasitarias y bacterianas intracelulares (por ejemplo, tuberculosis leprosa) y el cáncer, LAG-3 será particularmente útil para la vacunación terapéutica contra los agentes patógenos involucrados en estas enfermedades asi como en el tratamiento del cáncer. De acuerdo a uno de sus aspectos, la presente invención se refiere al uso de un ligando MHC de la clase II o un ligando similar a MHC de la clase II para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar condiciones patológicas, que involucran una respuesta inmune especifica al antigeno, preferentemente una respuesta inmune mediada por células T, especificas del antigeno. En una primera modalidad, la molécula de enlace a MHC de la clase II es LAG-3 asi como derivados de la misma, capaz de enlazarse al ligando de la clase MHC de LAG-3. Por derivados de LAG-3, en el sentido de la presente invención, se entiende los mutantes, variantes y fragmentos de LAG-3 a saber, fragmentos solubles de LAG-3 con la condición de que éstos mantengan la habilidad de LAG-3 para enlazarse a moléculas MHC de la clase II. De este modo, se pueden utilizar las siguientes formas de LAG-3: la proteina LAG-3 completa, un fragmento polipeptidico soluble de la misma que consiste de al menos uno de los cuatro dominios extracelulares de inmunoglubulina, a saber la parte soluble de LAG-3 comprendida de la región extracelular que abarca desde el aminoácido 23 hasta el aminoácido 448 de la secuencia LAG-3 descrita en la solicitud de Patente Francesa FR 90 00 126, - un fragmento de LAG-3 que consiste substancialmente de los primeros y segundos dominios , un fragmento de LAG-3 que consiste substancialmente del primero y segundo dominios, y los cuatro dominios, tales como se definen en el documento WO 95/30750, como tales, una forma mutante de LAG-3 soluble o un fragmento de la misma que comprende los dominios extracelulares Di y D2 y que consiste de: una substitución de un aminoácido en una de las siguientes posiciones: • posición 73 donde ARG está sustituida con GLU • posición 75 donde ARG está sustituida con ALA o GLU, • posición 76 donde ARG está sustituida con GLU, o una combinación de dos o más de esas sustituciones . - una sustitución de un aminoácido en una de las siguientes posiciones: • posición 30 donde ASP está sustituida con ALA; • posición 56 donde HIS está sustituida con ALA; • posición 77 donde TYR está sustituida con PHE; • posición 88 donde ARG está sustituida con ALA; • posición 103 donde ARG está sustituida con ALA; • posición 109 donde ASP está sustituida con GLU; • posición 115 donde ARG está sustituida con ALA; o una supresión de la región comprendida entre la posición 54 y la posición 66, o una combinación de dos o más de esas sustituciones.

Estos mutantes se describen en PNAS, Junio 1997 (4) o una variante fisiológica de LAG-3 comprendida de una proteina de 52 kD que contiene DI, D2, y D3. De acuerdo a una segunda modalidad, la proteina de enlace a MHC de la clase II es CD4 o un derivado de la misma capaz de enlazarse al ligando MHC de la clase II de CD4. Los derivados de CD4 son tales como se definen para los derivados de LAG-3. Estos son, a saber, mutantes, variantes y fragmentos de CD4, tales como fragmentos solubles de CD4 con la condición de éstos conserven la habilidad de CD4 para enlazarse a moléculas MHC de la clase II. LAG-3 y CD4, a saber hLAG-3 y hCD4 o los derivados de los mismos tales como se define anteriormente pueden ser administrados como porciones recombinantes que expresan dichas moléculas, por ejemplo células transfectadas o virus recombinantes . La presente invención se refiere también a células tumorales transfectadas con un ADN que codifica para al menos un ligando MHC de la clase II, tal como CD4 o LAG-3 o derivados de los mismos.

Un objetivo adicional de la presente invención es también el uso de las células, como células tumorales, transfectadas con un ADN que codifica para al menos un ligando MHC de la clase II tal como CD4 o LAG-3 o derivados de los mismos, para la fabricación de un medicamento, preferentemente un medicamento para la prevención o tratamiento de condiciones patológicas que involucran una respuesta inmune especifica del antigeno, como una respuesta inmune mediada por células T, especifica del antigeno, o para el tratamiento de desórdenes patológicos como el cáncer. Las células transfectadas son preferente células de mamífero y en particular células de tumor de mamífero. De acuerdo a uno de sus aspectos, la presente invención se refiere a un proceso para la preparación de células transfectadas con un ADN que codifica para al menos un ligando MHC de la clase II, tal como CD4 o LAG-3 o derivados de los mismos, que comprende los pasos de remover las células de un paciente, transfectar dichas células con un ADN que codifica para al menos un ligando similar a MHC de la clase II, tal como CD4 o LAG-3 o derivados de los mismos, y recuperando las células así transfectadas.

Para la preparación de células tumorales de acuerdo a la invención, este proceso será reproducido sobre células tumorales removidas de un paciente . No obstante, de acuerdo a una modalidad preferida, la proteína de enlace a MHC de la clase II, a saber CD4 o LAG-3 o el derivado de los mismos, se administra en una forma libre, a saber en una forma soluble al inocularlas sis témicamente, por ejemplo como una inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa. El medicamento de acuerdo a la invención puede ser utilizado como una vacuna para prevenir desórdenes asociados con una respuesta inmune específica del antígeno, preferentemente una respuesta inmune mediada por células T. Para ese fin, ésta se administra en un vehículo adecuado junto con uno o varios antígenos contra los cuales se busca una respuesta inmune. El antígeno puede ser un agente infeccioso inactivado o atenuado o un antígeno purificado, eventualmente obtenido mediante procedimientos recombinantes de proteínas, tales como un antígeno de un agente infeccioso o un antígeno tumoral, los cuales preferentemente son capaces de promover una respuesta inmune mediada por las células T. La vacuna puede ser utilizada para prevenir que *"un sujeto adquiera una enfermedad infecciosa, tal como una enfermedad viral, bacteriana o parasitaria, en donde el agente infeccioso promueve una respuesta inmune específica del antígeno, preferentemente una respuesta inmune mediada por células T . La vacuna puede también ser utilizada para el tratamiento del paciente contra una enfermedad infecciosa tal como se mencionó anteriormente en la presente, que involucra una respuesta inmune mediada por células T, a saber una respuesta inmune mediada por células T CD8+. Los ejemplos de enfermedades que requieren un refuerzo de una inmunidad mediada por células T, existente, se proporcionan en la siguiente tabla.

T ab l a Patógenos Agentes Enfermedades Virus HIV SIDA HBV, HCV Hepatitis HSV, CMV, HHV Falla del transplante, sarcoma de Kaposi HTLV1 Cáncer En tales casos, el antígeno es desmenuzado en las células y los péptidos correspondientes cargados dentro de las moléculas MHC de la clase I y presentados en la superficie de las células donde éstas son reconocidas por las células CD8+. Los resultados de los inventores muestran que las moléculas LAG-3Ig inducen la respuesta eficiente de células T en animales, y estimulan las células dendríticas inmaduras y los monocitos in vi tro, lo que sugiere fuertemente que LAG-3 es un adyuvante natural de células T en situaciones donde éste puede reticular las moléculas MHC de la clase II en APCs profesionales . La vacuna puede también ser utilizada para prevenir a un sujeto contra el cáncer, ya sea cáncer tumoral sólido o leucemia. La vacuna puede además ser utilizada para el tratamiento de un paciente contra el cáncer.

En este caso, la proteina de enlace a MHC de la clase II, a saber, LAG-3 o CD4 es administrada a un sujeto ya sea subcutáneamente, intradérmicamente o como un rocío nasal junto con uno o varios antígenos capaces de promover una respuesta inmune, preferentemente una respuesta inmune mediada por las células T. El antígeno puede ser un péptido, un lipopéptido, una proteína recombinante, o ADN que codifica para estos antígenos. La vacuna anticancerosa puede ser inoculada a poblaciones en riesgos identificados por su genotipo (vacuna preventiva) o a pacientes (vacuna terapéutica) que poseen un tumor o están en alto riesgo de recaída después de la cirugía. Ya sea que la vacuna sea utilizada como una vacuna convencional (preventiva) o una vacuna terapéutica, ésta puede ser administrada como un plásmido "desnudo" (19) que incorpora una secuencia de ADN que codifica para LAG-3 o CD4, preferentemente bajo el control de un promotor fuerte . El plásmido contiene también preferentemente el ADN que codifica para el antígeno contra el cual se busca una respuesta inmune.

Un objetivo adicional de la presente invención es de este modo una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un ligando MHC de la clase II en combinación con una cantidad efectiva de un antígeno capaz de estimular el sistema inmune, preferentemente por— edio de la respuesta de células T. En otro aspecto más, la presente invención se refiere al uso de LAG-3 como un medicamento para la inmunoterapia anticancerosa en pacientes que poseen un tumor canceroso. En este caso, LAG-3 se administra preferentemente como una proteína LAG-3 libre o un derivado de la misma en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente de un derivado soluble tal como se definió previamente. LAG-3 puede ser administrado como una inyección intratumoral o inyección sistémica, por ejemplo subcutánea, intravenosa o intramuscular. Un objetivo adicional de la presente invención se refiere a un método para terapia génica tumoral que comprende los pasos que consisten de retirar una porción de células tumorales de un paciente, transfectar dichas células con un ADN que codifica para al menos un ligando MHC de la clase II, tal como CD4 o LAG-3 o derivados de los mismos y reintroduciendo las células así transfectadas dentro del paciente. Los siguientes ejemplos demuestran la actividad de LAG-3 y CD4 en la prevención o tratamiento de las condiciones patológicas que involucran una respuesta inmune mediada por células T . Para el mejor entendimiento de la invención, se puede hacer referencia a las figuras anexas, en donde : - la figura 1 representa el tamaño del tumor principal de ratones C57BL/6 inoculados con las células tumorales MCA 205 de tipo silvestre (MCA, WT), las células tumorales MCA 205 transfectadas con hCD4 (MCA hCD4) y las células tumorales MCA 205 transfectadas con h.LAG-3 (MCA h.LAG-3); - la figura 2 representa los resultados (tamaño medio del tumor) obtenidos después del nuevo reto de los mismos ratones con las células tumorales MCA del tipo silvestre a una dosis tumorigénica mínima; - la figura 3 representa los resultados (tamaño tumoral medio) obtenidos después del nuevo reto de los mismos ratones con la línea de células tumorales MC 38 irreleventes ; la figura 4 representa los resultados (tamaño tumoral medio) obtenidos con una cepa diferente de ratones (BALB/c) y un línea de células tumorales diferentes (TS/A) ya sea de tipo silvestre (TS/A wt) o transfectadas con hCD4 (TS/A hCD4) o hLAG-3 (TS/A h.LAG-3); la figura 5 representa los resultados (tamaño tumoral medio) obtenidos con los tumores existentes tratados con diferentes dosis de células MCA que expresan hLAG-3; la figura 6 representa los resultados (tamaño tumoral medio) obtenidos con LAG-3 soluble inyectado junto con las células MCA (MCA wt, MCA wt + 25 µg de LAG-3 y MCA wt + 250 µg LAG-3) ; la figura dentro del marco de la figura 6 representa el porcentaje de ratones con tumor, las figuras 7 y 8 representan los resultados de la expresión de LAG-3 en la membrana de linfocitos de infiltración tumoral (TILs) en cinco pacientes (P1-P5) portadores de un carcinoma de células renales (RCC) . - la figura 9 ilustra el rechazo de las células tumorales hLAG-3+, mediado por linfocitos CD8+ a) análisis FACS de la expresión de CD8 por TILs a partir de ratones control (wt MCA 205) comparado con TILs de ratones hLAG-3 MCA 205. b) las células T CD8+ contribuyen al control del desarrollo tumoral hLAG-3 TS/A. Los ratones recibieron 200 µg intraperi tonealmente de anticuerpo monoclonal purificado específico de CD4 o de CD8 en los días -3, -2, -1, +4 y +8. Las células tumorales de tipo silvestre o h.LAG-3 TS/A (MTD) fueron inoculadas subcutáneamente en el día 0. Los datos son las medias ± s.e.m. de 5 ratones en cada grupo a partir de un experimento simple. Estos experimentos fueron realizados dos veces con resultados similares. c) actividad incrementada de CTLs antitumorales en ratones que tuvieron células hLAG-3/TS/A rechazadas. Los ratones recibieron transplantes subcutáneamente de 5 x 104 células hLAG-3/TS/A y fueron retados nuevamente en~el día 30 con 2.5 x 105 células progenitoras TS/A. Los bazos fueron recolectados en el día 60 en ratones libres de tumores y las células fueron co-cul tivadas por 6 días con las células objetivo indicadas que habían sido irradiadas. La actividad citolítica contra las células objetivo indicadas fue examinada en un ensayo de liberación de 51Cr estándar, de 4 horas con diferentes proporciones de efector/ob et ivo (E:T) . Los resultados para dos ratones se muestran también. Estos experimentos fueron realizados dos veces en 4 ratones con resultados similares. - la figura 10 representa los resultados (tamaño medio del tumor) de ratones (20 ratones C57BL/6) injertados con un MTD de las células de sarcoma singénico MCA 205 recibiendo una inyección de vacuna simple de LAG-3Ig. En el día 6, 4 grupos de 5 ratones fueron formados y recibieron una inyección de vacuna simple subcutánea (200 µl) . El antígeno es representado por células MCA 205 irradiadas (100 Gy) .

Los experimentos ilustrados en los ejemplos fueron llevados a cabo mediante el uso de los siguientes materiales y métodos.

MATARIALES Y MÉTODOS 1 Líneas de células tumorales _ Las líneas de células tumorales MHC de la clase I+ y de la clase II" utilizadas fueron: la linea de células MCA 205 de sarcoma inducido por metilcolantreno, pobremente inmunogénico, (singénico de ratones C57BL/6 H-2b), la línea celular de carcinoma renal inmunogénico RENCA y la línea de células TS/A de adenocarcinoma mamario espontáneo, no diferenciado, no inmunogénico (ambos singénicos de ratones BALB/C H-2d) . La línea de células de carcinoma de colón MC38 (singénica proveniente de ratones C57BL/6) fue utilizada en el experimento de nuevo reto como tumor control. Las células fueron mantenidas a 37°C en una atmósfera humidificada con 10% de C02, en aire, en medio completo (medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con glutamina) piruvato de sodio, penicilina/estreptomicina, 10% de suero fetal de ternera libre de endotoxina y 2-ß-mercaptoetanol 0.05 mM) . Para los experimentos de inmunoteñido y los experimentos in vivo , las células fueron removidas de sus recipientes de cultivo con PBS que contenía EDTA lmM. Antes de la inyección subcutánea, las células fueron lavadas tres veces en PBS frío IX y resuspendidas en el mismo amortiguador. Las células no fueron cultivadas por más de dos semanas. 2. Ratones _ _ Ratones hembra C57BL/6, de 6 u 8 semanas de edad, fueron adquiridas de IFFRA-CREDO Laboratories (Lyon Francia) . Ratones hembra BALB/c de 4 a 8 semanas de edad fueron adquiridos de JANVIER Laboratories, (Francia) . Todas estas cepas de ratones fueron criadas en condiciones libres de patógenos específicos. Se adquirieron hembras desnudas de las instalaciones de animales del Instituto Gustave Roussy y se mantuvieron bajo microambientes protegidos. 3. Construcciones genéticas — Los ADNs de hLAG-3, mLAG-3 y hCD4 fueron clonados dentro del vector plasmídico de higromicina NT (los sitios de clonación son Xbal para hLAG-3 y HCD4 y Xhol para m.LAG-3, bajo el promotor SRa (18) . El ADNhc de LAG-3 clonado en la orientación inversa fue utilizado como un control negativo. Todas las lineas de células tumorales (2.5 x 106 células) fueron transfectadas mediante electroporesis utilizando un aparato Eurogentec (Bélgica) : las células MCA 205 a 200V, las células TS/A y RENCA a 300V, 1500 µF y resistencia en derivación infinita. Los transfectantes fueron seleccionados en higromicina B (Sigma) : MCA 205 en 100 µg/ml de RENCA y los transfectantes TS/A en 200 µg/ml. Las células resistentes que expresan las moléculas transfectadas fueron identificadas utilizando un citofluorímetro Élite (Coulter, Hialeah, FL) y clonadas mediante dilución limitante. El mejor clon para cada construcción en cada una de las líneas de células tumorales se utilizó en este estudio.

Análisis citofluorimétrico Las células resistentes que expresan las moléculas transfectadas fueron teñidas mediante inmunofluorescencia indirecta, con cantidades de saturación de los mAbs purificados o de fluidos de ascitis. Las células fueron primeramente incubadas con los anticuerpos monoclonales (mAbs) : 17B4 (anti-hLAG-3.1) (2), OKT4 (anti-hCD4), un preinmunosuero de conejo (denominado PIS) utilizado como el control negativo y un inmunosuero de conejo anti-mLAG-3 (denominado IS) . La expresión de las moléculas murinas MHC de la clase I y II sobre los tumores fueron detectadas con los siguientes mAbs: 34-1-2S para H-2Kd y Dd, 28-8-6S para H-2 Kb y Db, 14-4-4S (para Ed) , M50114 (para IA e IE) . Fueron lavadas e incubadas con suero de cabra antiratón conjugado a FITC (GAM Coulter) o suero de cabra anti-conejo conjugado a FITC (GAR Southern Biotechnologies Inc.) . Para estudiar la presencia de las células infiltradoras o el reclutamiento de células en la periferia tumoral, algunos ratones fueron sacrificados y los tumores fueron disociados. Las células fueron teñidas mediante inmunofluorescencia directa, con 17B4-FITC o los siguientes mAbs (Phar ingen) : anti-mCD4-PE (L3T4), anti-mCD8 (Ly-2 y Ly-3.2), anti-mNK (2B4) y anti-mCD22 (Lyb-8.2) . Las células fueron clasificadas utilizando un citofluorímetro Élite de Coulter) . Las líneas celulares positivas fueron luego clonadas mediante dilución limitante de LAG-3+, o los clones de CD4+ fueron congelados para el uso posterior . Para general moléculas LAG-3 solubles, los dominios extracelulares de h.LAG-3 y mLAG-3 fueron fusionados a las porciones Fc de hlgGl y mlgG2a respectivamente, como se describe (6) . Las proteínas recombinantes resultantes, hLAG-3Ig y mLAG-3Ig, fueron producidas en células CHO y purificadas sobre columnas de proteína A.

. Experimentos tumorales in vi vo _ __ .1 Establecimiento de desarrollo tumoral y vacunación El establecimiento de líneas de células tumorales se realizó subcutáneamente utilizando la dosis tumorigénica mínima (MTD) a 2xl05 células/ratón para MCA 205, 5xl04 células para TS/A y 105 células para RENCA o un incremento de 5 veces el MTD. Los ratones que estuvieron libre de tumores 30 días después de la inyección fueron retados nuevamente con la línea de células tumorales progenituras (5 x MTD) . La línea celular de carcinoma de colón MC38 fue utilizada a 105 células como un tumor control en ratones C57BL/6 que rechazaron el tumor TS/A. Ratones limpios o libres de enfermedad C57BL/6 o BALB/c de igual edad fueron inyectados con las líneas de células tumorales. El desarrollo tumoral fue verificado periódicamente dos a tres veces a la semana mediante la medición de dos diámetros tumorales perpendiculares utilizando calibradores. En el día de los experimentos tumorales in vi vo, las células fueron analizadas mediante citofluorímetro y se realizó el ensayo de proliferación in vi tro . .2 Modelos de terapia tumoral En el día 0, las líneas de células tumorales de tipo silvestre fueron inoculadas subcutáneamente en el flanco izquierdo (MTD) . En el día 0, 3 ó 6, las células tumorales LAG-3+ fueron inyectadas en el flanco derecho (MTD o MTD cinco veces) para determinar los efectos antitumorales sobre las células no trasfectadas en un sitio distante. El desarrollo tumoral fue verificado periódicamente como se describe anteriormente. .3 Para el análisis citométrico, los ratones fueron inoculados s.c. 5 x células tumorales MTD como se describe anteriormente. En el día 8 los tumores fueron disociados y analizados con los anticuerpos monoclonales CD3-PE, CD4-PE, CD8-PE, CD80-FITC, CD86-FITC, 2B4-PE (célula NK) , CD22-PE (célula B) o hLAG-3FITC con un citofluorímetro Élite (Coulter) . .4 Para el agotamiento de linfocitos, los ratones recibieron 200 µg intraperitonealmente de anticuerpo monoclonal anti-CD4 (YTS 191.1.2) o anti-CD8 (18) en los días 3, -2, -1, +4 y +8. Las células tumorales TS/A de tipo silvestre o h.LAG-3 fueron inoculadas s.c. en el día 0 (MTD) . El análisis citofluorométrico de ratones control que reciben estas dosis de mAb mostró una reducción mayor de 95% de la población objetivo en bazo (datos no mostrados ) . 6. Estudios in vi tro Para los ensayos de citotoxicidad, las CTL a corto plazo, específicas de tumor, fueron generadas utilizando cultivos de células tumorales de linfocitos mixtos. En resumen, se recolectaron 3 x 107 células esplénicas en el día 30 de ratones que habían rechazado tumores establecidos. Estas células fueron estimuladas con 3 x 106 células tumorales progenituras, irradiadas, en medio completo por 4 días y luego suplementadas con 50 Ul/ml de hIL-2 recombinante (Cetus) por 2 días. Las funciones efectoras de los esplenocitos fueron probadas en el día 6 en un ensayo de liberación de 51Cr estándar de 4 horas (proporciones efector a objetivo de 25/1 a 200/1) contra las células objetivo marcadas: células tumorales autólogas, un sarcoma irrelevante a H-2d, WEHI 164 y una línea de células YAC sensible a NK . El porcentaje de lisis por triplicado fue calculado como [(cpm experimental promedio menos cpm espontáneo promedio )/ (cpm máximo promedio - cpm espontáneo promedio)] x 100. Se definió la lisis especifica como la lisis de esplenocitos de ratón que rechazaron las células tumorales menos la lisis de los esplenocitos de ratones limpios.

RESULTADOS EJEMPLO 1: Expresi ón superfi ci al de l as mol écul as hCD4 , hLAG-3 , mLAG-3 y MHC sobre líneas de cél ul as t umoral es .

Los clones de tumores trans fectados fueron teñidos como se detalla en la sección 2.2, y se analizaron para comparar el nivel de expresión de hCD4, h.LAG-3 y mLAG-3. El mejor clon para cada construcción fue utilizado en este estudio. Las siguientes lineas de células tumorales TS/A expresan altos niveles de moléculas MHC de la clase I y MCA 205 expresa bajos niveles de MHC de la clase I. No se observo diferencia significativa entre la expresión de MHC de la clase I sobre lineas de células tumorales progenitoras en comparación a los clones transfectados .

EJEMPLO II " -_-_ Model os de es tabl ecimi en to tumoral y vacunaci ón : Efec tos compara ti vos de hCD4 y hLAG-3.

Estos experimentos fueron realizados para examinar la tumorigenicidad de células después de la transfección del gen: MCA 205 y TS/A como se muestra en las figuras 1 y 4 RENCA. La inducción de inmunidad antitumoral del tumor LAG-3+ se comparó a las líneas de células tumorales progenitoras . Las células MCA 205, TS/A y RENCA de tipo silvestre se desarrollaron progresivamente cuando fueron implantadas subcutáneamente ya sea dentro de ratones singénicos C57 BL/6 o BALB/C o en ratones nu/nu. Las células tumorales transfectadas establemente después de la selección con higromicina con el ADNc de h.LAG-3 clonado en una orientación inversa, tuvieron una velocidad de desarrollo similar. Los animales que' recibieron MCA-LAG-3 rechazaron su tumor. Los animales que recibieron MCA-CD4 mostraron un desarrollo tumoral más bajo que los animales que recibieron MCA de tipo silvestre.

Dos de ellos (de 5) rechazaron completamente el tumor (figura 1) . Se obtuvieron resultados similares con LAG-3 (datos no mostrados) . Estos resultados indican que la expresión ectópica de hLAG-3, mLAG-3 y hCD4 incrementa la inmunogenicidad de las líneas de células de sarcoma MCA y previene la formación del tumor del transíectante MCA, por ejemplo éste induce un potente inmunidad contra un tumor murino altamente maligno . Se obtienen resultados similares con células de tumor TS/A en ratones BALB/C (figura 2) . Se obtuvieron además resultados similares con las células tumorales RENCA en ratones BALB/C singénicos . De este modo, se obtiene el efecto antitumoral : - en diferentes cepas de ratones que expresan diferentes genes complejos de MHC; utilizando diferentes lineas de células tumorales (que muestran diferente inmunogenicidad intrínseca, TS/A<MCA) . Ratones desnudos (nu/nu) fueron inoculados con las células tumorales tipo MCA, de tipo silvestre, MCA hLAG-3 y MCA hCD4 y los transfectantes se desarrollaron de manera similar. Esto apoya el hecho de que la inmunidad reforzada por hLAG-3 o hCD4, sistémica, de larga duración, o específica del tumor son irradiadas por células T. Los ratones inoculados previamente con MCA tipo silvestre, MCA h.LAG-3 y MCA hCD4 y libres de tumor después de 30 días de la inyección con MTD fueron retados nuevamente (1 vez) con un incremento de cinco veces de la línea de células tumorales progenitoras MTD o con una línea de células de carcinoma de colón MC38, singénicas, no relacionadas . Los resultados se representan en las figuras 2 y 3. Después del nuevo reto, el desarrollo de MCA de tipo silvestre fue retardado en los animales sobrevivientes para animales que recibieron células MCA-LAG-3 y células MCA-CD4 (figura 2) . No se observó efecto en animales retados nuevamente con el tumor irrelevante MC38 (figura 3) . Esto indica que la expresión ectópica de b.LAG-3 y hCD4 tienen un efecto similar a adyuvante e induce una inmunidad específica de antígeno, de larga duración, contra el tumor progenitor no modificado .

EJEMPLO III: _ Terapia de tumores MCA 205 tipo sil ves tre en ra tones C57BL/6 con MCA-hLAG-3 Tres grupos de cinco ratones cada uno fueron utilizados para el experimento. Cada grupo fue inoculado en un flanco con MCA tipo silvestre y tres días más tarde, con cada uno de MCA wt (grupo 1 ) , MCA-hLAG-3 a 2 x 105 células (grupo 2) y MCA-hLAG-3 a 1 x 10 106 células (grupo 3 ) . El tamaño del tumor original fue medido en cada grupo después de 30 días. Los resultados se representan en la figura 5. La inyección de MCA-hLAG-3 _ retardó el desarrollo del tumor de una manera dependiente de la dosis . Este experimento confirma el efecto sistémico de LAG-3 sobre el desarrollo del tumor e indica que LAG-3 representa un agente terapéutico contra tumores sólidos.

EJEMPLO IV: _ _ Terapi a de t umores MCA 205 de tipo sil vestre en ratones C57BL/6 con LAG-3 sol ubl e .

Tres grupos de cinco ratones cada uno, fueron simultáneamente inoculados ya sea con MCA de tipo silvestre (wt) suspendido en PBS (grupo 1) o en PBS que contiene LAG-3 humano soluble (shLAG-3 D1D4) en cantidades de 25 µg (grupo 2) ó 250 µg (grupo 3) . El tamaño de los tumores fue medido para cada grupo en un periodo de 30 días. Los resultados se representan en la figura 6. La co-administración de h.LAG-3 D1D4 indujo un retardo del desarrollo del tumor, dependiente de la dosis . Esto demuestra que la administración sistémica de h.LAG-3 soluble induce directamente una inhibición del desarrollo tumoral in vi vo .

EJEMPLO V: Expresi ón de LAG-3 in vi vo s obre linfoci tos infi l tradores de t umores h umanos (TILs ) en carcinoma de cél ul a s renal es (RCC) .

En humanos, LAG-3 es expresado en tejidos (por ejemplo, órganos linfoides secundarios inflamados), pero no sobre la superficie de PBMCs (3), incluso en PBMCs CD25+, CD69+ activados in vi vo . LAG-3 es expresado a más altos niveles sobre células CD8+ restringidas a MHC de la clase I, activadas, que sobre las células CD4+ restringidas a MHC de la clase 11 (3), y la inducción de la expresión de LAG-3 por IL-12 o por la combinación más potente de IL-2 + IL- 12 que es más fuerte sobre células CD8+ que sobre células DE4+. LAG-3 es un antígeno de activación débilmente expresado in vi vo, así como in vi tro y es algunas veces difícil de evaluar el porcentaje y/o la especificidad de la marcación de fluorescencia en tumores recién disociados. Ya que LAG-3 puede interferir con los APCs de MHC de la clase II+ en tumores humanos, se evaluó su expresión en una serie de tumores que se sabe son infiltrados por células T, utilizando inmunohis toquí ica (el procedimiento APAAP) . La expresión de LAG-3 sobre TILs fue detectada en todas las muestras probadas, incluyendo 5 melanomas, 10 adenocarcinomas de células renales y 7 linfornas de células B. Ocho pacientes fueron investigados para la expresión de LAG-3 sobre los linfocitos que infiltran tumores, en tumores de carcinoma de células renales . Los tumores disociados son utilizados para experimentos mediante ensayos citofluorimétricos . La expresión de LAG-3 fue estudiada entre la población de linfocitos, determinada por su tamaño y granulocidad . Las células muertas fueron excluidas del estudio mediante tinción con yoduro de propidio. Las TILs fueron positivamente teñidas con 17B4, un anticuerpo monoclonal específico del epítope del extra-bucle de LAG-3.. Los resultados se representan en la figura 7 para los pacientes P1-P3 y la figura 8 para los pacientes P4 y P5. Para todos los pacientes se observó un desplazamiento del pico fluorescente que muestra el enlace del anticuerpo 17B4 en la superficie de los linfdcitos .

De este modo, en todos los pacientes, los TILs expresaron efectivamente LAG-3 con un porcentaje significativo (30%) de RCC-TIL en pacientes no relacionados. En todas las muestras, se encontró que las células T CD3+ expresan LAG-3 (intervalo de 11% a 48%) con más alta expresión en las células T CD8+. En contraste, las células mononucleares de sangre periférica fueron LAG-3- en estos pacientes, mostrando que la expresión de LAG-3 en los linfocitos es un fenómeno relacionado a la activación de células T en tumores. Además, mediante el uso de un ensayo de ELISA, se encontraron altas concentraciones (aproximadamente 1 ng/ml) de LAG-3 soluble en sangre de pacientes con cáncer. Estos datos muestran que LAG-3 es una molécula involucrada en la respuesta antitumoral de origen natural en humanos, y apoyan e_l uso de LAG-3 para reforzar la inmunosupervivencia de las células tumorales en humanos .

EJEMPLO VI: Las cél ulas CD8" son medi adoras del rechazo primari o El rechazo de los transfectantes b.LAG-3 MCA 205 y TS/A fue dependiente de los linfocitos T, ya que no se observó rechazo en los ratones nu/nu deficientes en células T. Después de la inyección de 5 x MTD de estas células, se extirparon tumores de 10 mm de diámetro en el día 8 y las células tumorales disociadas y los linfocitos que infiltran al tumor se analizaron mediante FACS . Los tumores de tipo silvestre así como los transfectantes de LAG-3, inicialmente CD80" y CD86", habían permanecido negativos para estos marcadores después de la inoculación, mientras que LAG-3 fue detectada constantemente sobre tumores hLAG-3, utilizando el mAb 17B4 anti-LAG-3 (datos no mostrados) . Sobre tumores explantados en el día 8, el porcentaje de células CD8+ fue aproximadamente de 21% en tumores MCA 205 de hLAG-3 versus 4% en tumores MCA 205 de tipo silvestre (figura 9a), mientras que no se observó diferencia cuando se analizaron los subgrupos de células CD4+ , B o NK . Se obtuvieron resultados similares para los tumores TS/A (datos no mostrados) . Finalmente, la contribución respectiva de las células T CD4+ y CD8+ a la respuesta antitumoral fue examinada al agotar a los ratones de estos subgrupos celulares. Como se muestra en la figura 9b, la administración del anticuerpo monoclonal específico de CD8 al tiempo de la inoculación de h.LAG-3/TS/A MTD abroga el rechazo de •las células tumorales hLAG-3/TS/A. La participación de las células cooperadoras CD4+ es sugerida por el efecto parcial observado con el mAb específico de CD4 (figura 9b) .

EJEMPLO VII: La respues ta de CTL específi ca del t umor es aumentada por hLAG-3 Para dirigirse además al mecanismo detrás de la actividad antitumoral de LAG-3 se evaluó su efecto sobre la generación de linfocitos T citotóxicos (CTL) que matan las células TS/A no inmunogénicas. Se cosecharon esplenocitos de ratones implantados con el tumor h.LAG-3/TS/A, los cuales fueron capaces de rechazar 5x de células tumorales MTD de tipo silvestre en experimentos de reto repetido y se rees timularon in vi tro por 6 días con células TS/A irradiadas . La actividad de CTL fue detectada en esplenocitos de ratones implantados con células tumorales h.LAG-3 (figura 9c), mientras que los esplenocitos provenientes de animales limpios no mostraron actividad citotóxica (datos no mostrados) . La actividad de CTL parece ser selectiva para las células TS/A no inmunogénica ya que las células de sarcoma WEHI singénicas, así como las células YAC sensibles a NK, no fueron usadas ( figura 9c) .

EJEMPLO VIII: Terapia de tumores establecidos Los inventores han mostrado que el control del desarrollo tumoral podría ser logrado mediante el uso de una molécula LAG-3 soluble como un adyuvante para vacuna. Una inyección simple de una mezcla del antígeno (células tumorales irradiadas) más el refuerzo (mLAG-3Ig 1 µg ó 0.1 µg) fue eficiente (figura 10) .

Se asume que las moléculas LAG-3 solubles in vi vo podrían señalar a las células de Langerhans (o cualquier APC presente en el sitio de la vacuna) vía las moléculas MHC de la clase II para aprestar eficientemente a las células T CD8+.

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Claims (25)

REI INDICACIONES

1. El uso de un ligando MHC de la clase II tal como CD4 o LAG-3 como un agente similar a adyuvante para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de las condiciones patológicas que involucran una respuesta inmune específica al antígeno.

2. El uso de un ligando MHC de la clase II, tal como CD4 o LAG-3 para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de condiciones patológicas que involucran una respuesta inmune mediada por células T, específica del antígeno .

3. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la molécula membranal que se enlaza a MHC de la clase II es CD4 o LAG-3 así como los derivados de los mismos capaces de enlazarse al ligando MHC de la clase II, correspondiente .

4. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la molécula membranal que se enlaza a MHC de la clase II es LAG-3, mutantes del mismo o un fragmento soluble del mismo.

5. El uso de LAG-3 como un adyuvante para vacunas terapéuticas, para el tratamiento de condiciones que involucran una inmunidad celular dependiente de las células T CD8+.

6. El uso de LAG-3 soluble de conformidad con la reivindicación 5, en donde LAG-3 soluble es administrado junto con un antígeno contra el cual se busca una respuesta inmune de células T.

7. El uso de LAG-3 soluble de conformidad con la reivindicaciones 5 ó 6, para el tratamiento de enfermedades infecciosas, a saber enfermedades virales, parasitarias o bacterianas.

8. El uso de LAG-3 soluble de conformidad con la reivindicaciones 5 ó 6, para el tratamiento del cáncer.

9. El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde los fragmentos solubles de LAG-3 se selecciona del grupo que consiste de fragmentos D?-D2 y D?-D de LAG-3.

10. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el medicamento comprende el ligando MHC de la clase II en la forma de células transfectadas que expresan dicho ligando o en la forma de una molécula soluble de ese ligando.

11. El uso de conformidad con las reivindicaciones 1 6 2, para la fabricación de una vacuna para prevenir la aparición o para tratar el desorden una vez que ha ocµrrido .

12. El uso de conformidad con las reivindicaciones 1 6 2, para la fabricación de una vacuna para prevenir la aparición o para tratar el desorden, cuyo curso es influenciado por una respuesta inmune mediada por células T específicas del antigeno, o para el tratamiento del desorden una vez que éste ha ocurrido.

13. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde el ligando MHC de la clase II es utilizado como un plásmido desnudo que incorpora una secuencia de ADN que codifica para LAG-3 o CD4.

14. El uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde el plásmido también contiene el ADN que codifica para el antígeno contra el cual se busca una respuesta inmune.

15. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el desorden patológico es un cáncer.

16. El uso de LAG-3, para la fabricación de un medicamento para la inmunoterapia anticancerosa.

17. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un antígeno capaz de inducir una respuesta inmune específica del antígeno, junto con una cantidad efectiva de un ligando MHC de la clase II, en donde el ligando MHC de la clase II está presente como un agente similar a un adyuvante.

18. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un antígeno capaz de inducir una respuesta inmune mediada por células T, específica del antígeno, junto con una cantidad efectiva de un ligando MHC de la clase II, en donde el ligando MHC de la clase II está presente como un agente similar a un adyuvante,

19. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, en donde el ligando MHC de la clase II es h.LAG-3 o hCD4.

20. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, en donde el ligando MHC de la clase II es LAG-3 soluble humano.

21. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, como una vacuna.

22. Las células tumorales transfectadas con un ADN que codifica para al menos un ligando MHC de la clase II, tal como CD4 o LAG-3, o derivados de los mismos .

23. El uso de las células transfectadas con 'un ADN que codifica para al menos un ligando MHC de la clase II, tales como CD4 o LAG-3, o derivados de los mismos, o de células tumorales de conformidad con la reivindicación 18, para la fabricación de un medicamento como se define en las reivindicaciones 1, 2 y 11 a 16.

24. Un proceso para la preparación de células transfectadas con un ADN que codifica para al menos un ligando MHC de la clase II, tal como CD4 o LAG-3 o derivados de los mismos, que comprende los pasos de retirar las células de un paciente, la transfección de dichas células con al menos un ligando MHC de la clase II, tal como CD4 o LAG-3 o derivados de los mismos, y la recuperación de las células así transfectadas.

25. Un proceso para la preparación de células tumorales transfectadas con un ADN que codifica para al menos un ligando MHC de la clase II, tales como CD4 o LAG-3 o derivados de los mismo, que comprende los pasos que consisten de retirar las células tumorales de un paciente, transfectar dichas células tumorales con al menos un ligando MHC de la clase II, tales como CD4 o LAG-3 o derivados de los mismos, y recuperar las células tumorales así transfectadas .