MXPA99009443A - Composiciones farmaceuticas que tienen actividad supresora del apetito - Google Patents
Composiciones farmaceuticas que tienen actividad supresora del apetitoInfo
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Abstract
Una composición farmacéutica que contiene un extracto que se obtiene de una planta del género Trichocaulon u Hoodia que contiene un agente supresor del apetito que tiene la siguiente formula (1), también se provee un procedimiento para obtener el extracto y un procedimiento para sintetizar el compuesto y sus análogos y derivados;la invención también se extiende al uso de dichos extractos y al compuesto y sus análogos pana la fabricación de medicamentos que tienen actividad supresora de apetito;la invención proporciona adicionalmente nuevos intermediarios para la síntesis del compuesto.
Description
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE TIENEN ACTIVIDAD SUPRESORA DEL APETITO
ale MEMORIA DESCRIPTIVA
Esta invención se relaciona con glicósidos esteroides, con composiciones que contienen dichos glicósidos esteroides, y con un nuevo uso de estos glicósidos esteroides y de las composiciones que los contienen. La invención además se relaciona con un método para extraer y aislar estos
glicósidos esteroides de material de planta, con un método para producir sintéticamente estos glicósidos esteroides, y con los productos de dicha extracción y dicho proceso de síntesis. En una- aplicación particular, la invención se relaciona con un agente supresor del apetito, con un proceso para producir sintéticamente el
agente supresor del apetito, con un proceso para extraer el agente supresor del apetito de material de planta, con una composición supresora del apetito que contiene el agente supresor del apetito, y con un método para suprimir el apetito. De acuerdo con la invención, se proporciona un proceso para
preparar un extracto de una planta del género Trichocaulon o del género Hoodia, comprendiendo el extracto un agente supresor del apetito, incluyendo el proceso las etapas de tratar material de planta recogido, con un disolvente, para extraer una fracción que tiene actividad supresora del apetito, separar la solución de extracción del resto del material de planta, remover el disolvente de la solución de extracción, y recuperar el extracto. El extracto recuperado de esa forma puede ser más purificado, por ejemplo, por medio de procedimientos de extracción de disolvente adecuados. 5 La invención además proporciona un extracto de planta que está hecho de plantas del grupo que comprenden el género Trichocaulon y el género Hoodia, y que actividad supresora del apetito. El extracto se puede preparar a partir de material de planta como ser los tallos y raíces de dichas plantas del género Trichocaulon o del género
• 10 Hoodia. El género Trichocaulon y el género Hoodia incluyen plantas suculentas que crecen en regiones áridas como las que se encuentran en Sudáfrica. En una aplicación de la invención, el extracto supresor del apetito activo se obtiene de la especie Trichocaulon piliferum. La especie Trichocaulon officinale también puede utilizarse para proporcionar un extracto
supresor del apetito activo. En otra aplicación de la invención, el extracto
• supresor del apetito activo puede obtenerse de la especie Hoodia currorii, Hoodia gordonii, Hoodia lugardii. Los bioensayos conducidos por el solicitante en ratas han indicado que ciertos de los extractos posee actividad supresora del apetito. 20 El material de planta puede ser homogeneizado en presencia de un disolvente adecuado, por ejemplo, un disolvente de cloruro de metileno/ metanol, por medio de un aparato como un mezclador Waring. La solución de extracción luego puede ser separada del material de planta residual por medio de un procedimiento de separación apropiado, como por ejemplo, filtración o centrifugación. El disolvente puede ser removido por medio del evaporador giratorio, con preferencia en un baño de agua a una temperatura de 60°C. El extracto crudo separado luego puede ser adicionalmente extraído con cloruro 5 de metileno y agua antes de ser separado en un extracto de cloruro de metileno y un extracto de agua. Al extracto de cloruro de metileno se le puede remover el disolvente por medio de evaporación en un evaporador giratorio, y el extracto resultante puede ser adicionalmente purificado por medio de una extracción de metanol/hexano. El producto de la extracción de
metanol/hexano luego puede ser separado para producir un extracto de metanol y un extracto de hexano. El extracto de metanol puede ser evaporado para remover el disolvente, para producir un extracto activo parcialmente purificado. El extracto activo parcialmente purificado puede disolverse en
metanol, y puede ser adicionalmente fraccionado por cromatografía de columna, empleando gel de sílice como un medio de absorción, y una mezcla de cloroformo/ 30% metanol como un eluente. Se puede obtener la pluralidad de diferentes fracciones, y cada una puede ser evaluada, mediante procedimientos de bioensayo estándares, para determinar la actividad
supresora del apetito de las mismas. Una fracción que tiene actividad supresora del apetito puede ser con preferencia adicionalmente fraccionada, como por cromatografía de columna, usando gel de sílice como un medio de adsorción y un disolvente de
9:1 cloroformo: metanol, y las sub-fracciones resultantes pueden ser bioensayadas para determinar su actividad supresora del apetito. Una sub-fracción que exhibe una actividad supresora del apetito puede, si se desea, ser adicionalmente fraccionada y purificada, conveniente usando procedimiento cromatográfico de columna con gel de sílice como el medio de adsorción y un disolvente de 9:1etilacetato: hexano. Las fracciones purificadas resultantes pueden nuevamente ser evaluadas mediante procedimientos de bioensayo adecuados para determinar su actividad supresora del apetito. El solicitante ha descubierto que por lo menos una de dichas fracciones purificadas tiene buena actividad supresora del apetito, y el principio activo en la fracción fue identificado por medio de técnicas químicas convencionales que incluyen resonancia magnética nuclear, y se encontró que era un compuesto de la fórmula estructural
0) De acuerdo a la nomenclatura S.I., el principio activo (1 ) es el compuesto 3-0-[-ß-D-tevetopiranosil-(1 - 4)-ß-D-cimaropiranosil-(1 ?4)-ß-D~ cimaropiranosil]-12ß-O-tigloiloxi-14-hidroxi-14ß-pregn-50-en-20-ona (C47H74?17M+878). De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un proceso para la preparación de un extracto de una planta del género Trichocaulon o del género Hoodia, comprendiendo el extracto un agente supresor del apetito, incluyendo el proceso las etapas de prensar el material de planta recogido para separar savia de material de planta sólido, y recuperar la savia libre del material de planta sólido para formar el extracto. El extracto puede ser secado para remover humedad, por ejemplo, por medio de secado por pulverización, secado por congelamiento, o secado al vacío, para formar un polvo de libre fluido. La invención se extiende a una composición que tiene actividad supresora del apetito, que comprende un extracto como se describe anteriormente. La composición puede mezclarse con un excipiente, diluyente o portador farmacéutico, y opcionalmente se prepara en forma de dosificación de unidad. La invención además se extiende al uso de un extracto como se describe anteriormente, en la fabricación de un medicamento que tiene actividad supresora del apetito, a un extracto como se describe con anterioridad para el uso como un medicamento que tiene una actividad supresora del apetito, y a un método para suprimir el apetito mediante la administración a un humano o animal de una dosificación efectiva de una composición como se describe anteriormente. El compuesto (1 ) es un compuesto nuevo y la invención se extiende al compuesto (1 ) y ciertos análogos o derivados de este trisacárido esteroide que tiene propiedades supresoras del apetito. Las moléculas seleccionadas como los análogos o derivados tienen el propósito de afectar las propiedades del trisacárido esteroide con el propósito de incrementar la actividad del ingrediente activo. Se tomaron en cuenta los siguientes efectos cuando se seleccionaron los análogos:
(i) Interacciones hidrófobas y lipofilicidad Las modificaciones de grupos funcionales de la molécula activa tienen el propósito de cambiar la hidrofobicidad y lipofilicidad de la molécula. La lipofilicidad incrementada ha demostrado correlacionarse con una incrementada actividad biológica, una solubilidad acuosa más pobre, una incrementada lisis de detergencia/ célula, un incrementado almacenamiento en tejidos, metabolismo y eliminación más rápidos, incrementando enlace de proteínas de plasma e índice más veloz de comienzo de acción.
(¡i) Propiedades electrónicas y constantes de ionización La modificación de grupos funcionales de la molécula además tiene el propósito de cambiar la acidez y basicidad que tendrían un importante rol en el control del transporte del compuesto a su sitio de acción y el enlace en este sitio objeto
(iii) Enlace de hidrógeno Las modificaciones de grupos funcionales de grupos carbonilo y carboxilo en la molécula activa el propósito de cambiar las interacciones entre las proteínas en sistemas biológicos y los grupos funcionales químicamente modificados.
(iv) Parámetros estéricos El propósito de cambiar las características estéricas de la molécula es incrementar el enlace a su receptor e incrementar de esa forma su actividad biológica. Las siguientes modificaciones químicas de la molécula tienen el propósito de afectar las propiedades electrónicas de hidrofobicidad y lipofilicidad, el enlace de hidrógeno y los parámetros estéricos sobre la molécula: a) modificación química del grupo C-12 y funcionalidad de éster; b) modificación química del doble enlace 5,6, por ejemplo hidrogenación y migración; c) modificación química del carbonilo C-20 y grupo acetilo C-17; d) modificación química del anillo "D" del esteroide o anillo de aglicón; e) modificación de los carbohidratos de la porción trisacárido.
En consecuencia la invención proporciona un compuesto que tiene la fórmula estructural general
( 2 ) en la cual R= alquilo; R-?= H, alquilo, tigloílo, o cualquier otro grupo éster orgánico; R2= H, o uno o más hidratos de carbono 6-desoxi, o uno o más hidratos de carbono2,6-didesoxi, o moléculas de glucosa, o combinaciones de los mismos; y en la cual las líneas cortadas indica la presencia opcional de otro enlace entre C4-C5, ó C5-C6. La invención además proporciona un compuesto como se describe anteriormente, en donde hay otro enlace entre C5-C6, R= metilo, R?=tigloílo, R2= 3-0-[-ß-D-tevetopiranos¡l-(1?4)-ß-D-cimarop¡ranosil-(1?4)-ß-D-cimaropiranosilo], y que tiene la fórmula estructural
(1 ) Otros derivados o análogos activos del compuesto supresor del apetito (1) de acuerdo con la invención son compuestos que tienen las siguientes fórmulas estructurales:
en la cual R= alquilo; y R?=H, o benzoílo, o tigloíolo, o cualquier otro grupo éster orgánico
fib-_ en la cual R= alquilo; y R-?= H, o tigloílo, o benzoílo, o cualquier otro grupo de éster orgánico
en la cual R= alquilo; y R?= H, o tigloílo, o benzoílo, o cualquier otro grupo de éster orgánico.
en la cual R= alquilo; y R?= H, o tigloílo, o benzoílo, o cualquier otro grupo de éster orgánico.
^ ^^- &2&¡5b>**?á£6&~ ? ^&J^j&r-* ( 7 ) en la cual R= alquilo; y R?= H, o tigloílo, o benzoílo, o cualquier otro grupo de éster orgánico.
en la cual R= alquilo; y R-?= H, alquilo, tigloílo, o benzoílo, o cualquier otro grupo de éster orgánico; R2= H, o uno o más hidratos de carbono 6-desoxi, o uno o más hidratos de carbono 2,6-didesoxi, o moléculas de glucosa, o combinaciones de los mismos; y en la cual las líneas cortadas indican la presencia opcional de otro enlace entre C4-C5, ó C5-C6.
( 9 )
en la cual R= alquilo; y R?= H, alquilo, tigloílo o benzoílo, o cualquier otro grupo de éster orgánico; R2= H, o uno o más hidratos de carbono 6-desoxi, o uno o más hidratos de carbono 2,6-didesoxi, o moléculas de glucosa, o combinaciones de los mismos; y en la cual las líneas cortadas indican la presencia opcional de otro enlace C4-C5, ó C5-C6.
( 10 )
en la cual R= alquilo; y R?= H, alquilo, tigloílo, o benzoílo, o cualquier otro grupo de éster orgánico; R2= H, o uno o más hidratos de carbono 6-desoxi, o uno o más hidratos de carbono 2,6-didesoxi, o moléculas de glucosa, o combinaciones de los mismos; y en la cual las líneas cortadas indican la presencia opcional de otro enlace C4-C5, ó C5-C6.
en la cual R= alquilo; y R?= H, alquilo, tigloílo, o benzoílo, o cualquier otro grupo de éster orgánico; R2= H, o uno o más hidratos de carbono 6-desoxi, o uno o más hidratos de carbono 2,6-didesoxi, o moléculas de glucosa, o combinaciones de los mismos; y en la cual las líneas cortadas indican la presencia opcional de otro enlace C4-C5, C5-C6 ó C14-C15.
en la cual R= alquilo; y R-?= H, alquilo, tigloílo, o benzoílo, o cualquier otro grupo de éster orgánico; R2= H, o uno o más hidratos de carbono 6-desoxi, o uno o más hidratos de carbono 2,6-didesoxi, o moléculas de glucosa, o combinaciones de los mismos; y en la cual las líneas cortadas indican la presencia opcional de otro enlace C4-C5, C5-C6 ó C14-C15.
( 13 )
en la cual R = alquilo; y Ri = H, alquilo, tigloílo, benzoílo, cualquier otro grupo éster orgánico; R2 = H, o uno o más hidratos de carbono 6-desoxi, o uno o más hidratos de carbono 2,6-didesoxi, o moléculas de glucosa, o combinaciones de lo mismos; y en la cual las líneas cortadas indican la presencia opcional de otro enlace entre C4-C5, C5-C6, ó C14-C15; y R3 = H, alquilo, arilo, acilo, o glucoxi.
( 14 ) en la cual R = H, alquilo, arilo o cualquier esteroide que posea un grupo beta hidroxi C14, o una funcionalidad beta hidroxi C12, o un grupo acilo C17, o una olefina C5-C6, o combinaciones de los mismos. La invención además se extiende a un proceso para producir sintéticamente un compuesto que tiene actividad supresora del apetito. El proceso utiliza un esteroide como un material inicial (o intermediario o precursor), teniendo el esteroide la fórmula estructural
( 15 )
El esteroide (15) se puede preparar a partir de un compuesto que tiene la fórmula (22), mediante un proceso que incluye las etapas de (i) tratar progesterona que tiene la fórmula
Con el microorganismo Calonectria decora, para producir un compuesto 12ß, 15a-dihidroxi progesterona de la fórmula
( 17 ) (ii) tratar el compuesto (17) con cloruro de tosilo y piridina, para producir un 10 compuesto 12ß-hidroxi-15 -(p-toluensulfonil)-progesterona de la fórmula
( 18 )
(iii) tratar el compuesto (18) con colidina a 150°C, para producir un compuesto 12ß-hidroxi-? 14-progesterona de la fórmula
( 19 ) ^^e^^ß¡^M¡^^^^^^ (iv) tratar el compuesto (19) con cloruro de acetilo y anhídrido acético a 120°C, para producir un compuesto 3,12ß-diacetoxipregna-3,5,14-trien-20-ona de la fórmula
( 20 )
(v) tratar el compuesto (20) con etilenglicol y una cantidad catalítica de ácido p-toluensulfónico, para producir un compuesto 3,12ß-diacetoxi-20,20-etilendioxipregna-3,5,14-trieno de la fórmula
( 21 ) (vi) tratar el compuesto (21 ) con NaBH4 para producir un compuesto 3ß, 12ß-dihidroxi-20,20-etilendioxipregna-5,14-dieno-12-acetato de la fórmula ( 22 )
En un primer procedimiento alternativo, un proceso para la preparación de esteroide (15) de acuerdo con la invención incluye las etapas de (a) tratar el compuesto (22) con un agente reductor, por ejemplo LiAIH , para producir un compuesto 3ß, 12ß-dihidroxi-20,20-etilendioxipregna-5,14-dieno de la fórmula
( 23 )
(b) tratar un compuesto (23) con N-bromoacetamida (NBA) y una base, por ejemplo piridina, para producir un compuesto 3ß, 12ß-dihidroxi-14,15-epox¡-20,20-etilendioxipregn-5-eno de la fórmula ( 24 ) (c) tratar el compuesto (24) con un agente reductor, por ejemplo LiAIH4, por ejemplo con reflujo, para producir un compuesto 3ß, 12ß-trihidroxi-20,20- etilendioxipregn-5-eno de la fórmula •
( 25 ) y (d) tratar el compuesto (25) con un ácido, por ejemplo, ácido acético, y agua, para producir el intermediario esteroide compuesto 3ß, 12ß, 14ß-trihidrox¡- pregn-5-eno (15). El esquema de reacción A representa el procedimiento para la
preparación del intermediario esteroide (15) a partir del compuesto (22) de acuerdo con "el primer procedimiento alternativo" de la invención (e incluye la preparación del compuesto (22) a partir del compuesto (16) para propósitos ilustrativos).
ESQUEMA DE REACCIÓN A
(16) (17)
(23) (22)
(15) •j- aH1r '^* — ' — En un segundo procedimiento alternativo, un proceso para la preparación del esteroide (15) de acuerdo con la invención incluye las etapas de (a) tratar el compuesto (22) (3ß, 12ß-dihidroxi-20,20-etilendioxipregna- 5,14-dieno-12-acetato) con cloruro de p-toluensulfonilo y una base, por ejemplo, piridina, para producir un compuesto 3ß, 12ß-dihidroxi-20,20- etilendioxipregna-5,14-dieno-3-tosil-12-acetato de la fórmula
( 26 )
(b) tratar el compuesto (26) con acetato de potasio en un disolvente, por
ejemplo, acetona, para producir un compuesto 6ß, 12ß-dihidrox¡-20,2?0- etilendioxi-3,5a-ciclopegna-14-eno-12-acetato de la fórmula
( 27 )
(c) tratar el compuesto (27) con un agente reductor, por ejemplo LiAIH4l y por ejemplo tetrahidrofurano, para producir un compuesto 6ß, 12ß-dihidroxi-20,20-etilendioxi-3,5 -ciclopregna-14-eno de la fórmula
( 28 ) (d) tratar el compuesto (28) con N-bromoacetamida, opcionalmente ácido acético, y una base, por ejemplo, piridina, para producir un compuesto 6ß, 12ß-dihidroxi-20,20-etilendioxi-14,15-epoxi3,5a-ciclopregna de la fórmula
( 29 )
(e) tratar el compuesto (29) con un agente reductor, por ejemplo LiAIH , y por ejemplo tetrahidrofurano, para producir un compuesto 6ß, 12ß, 14ß-trihidroxi-20,20-etilendioxi-3,5a-ciclopregna de la fórmula
&®&& 3 L. y?&it ííXtßSÍZ& :*
( 30 ) y (f) tratar el compuesto (30) con un ácido, por ejemplo, ácido clorhídrico, y disolvente, por ejemplo acetona, para producir un compuesto (15). El esquema de reacción B muestra el procedimiento para la preparación del intermedio esteroide (15) a partir del compuesto (22), de acuerdo con "el segundo procedimiento alternativo" de la ¡nvención.
ESQUEMA DE REACCIÓN B
(26] (29) (30)
(15) Mezcla de epímeros (15a) C-17 beta acetilo (15b) C-17 alfa acetilo
El compuesto (1 ) se puede sintetizar a partir de un primer intermediario hidrato de carbono en forma de una porción cimarosa de monosacárido activada, que se puede preparar a partir de un compuesto que tiene la fórmula (36). El compuesto (36) se puede preparar por medio de un proceso que incluye las etapas (i) tratar metil-a-D-glucosa que tiene la fórmula
( 31 )
con benzaldehído y cloruro de zinc, para producir un compuesto metil-4,6-0-benciliden- -d-glucopiranosida de la fórmula
( 32 ) (ii) tratar el compuesto (32) con cloruro de tosilo y piridina a 0°C, para producir un compuesto metil-4,6-0-benciliden-2-0-tosil-a-D-glucopiranosida de la fórmula
( 33 )
(iii) tratar el compuesto (33) con NaOMe a 100°C, para producir un compuesto metil 4,6-0-benciliden-3-0-metil-a-D-altropiranosida de la fórmula
( 34 )
(iv) tratar el compuesto (34) con N-bromosuccinamida (NBS) para producir un compuesto metil 6-bromo-4-0-benzoil-3-0-metil6-desoxi-a-D-altropiranosida de la fórmula
( 35 )
y (v) tratar el compuesto (35) con NaBH4 y N¡CI2, para producir un compuesto metil 4-0-benzoil-3-0-metil-6-desoxi- -D-altropiranosida de la fórmula
( 36 )
la invención se extiende a un proceso para la preparación de un intermediario hidrato de carbono en forma de una porción cimarosa de monosacárido activada, que incluye las etapas de (i) tratar el compuesto (36) con PhSSiMe3, Znl2 y Bu4+1", para producir un compuesto
( 37 )
é*¿ r-.
(ii) opcionalmente tratar el compuesto (37) con trifluoruro de dietilaminoazufre (DAST), por ejemplo a 0°C, para producir un compuesto 4-0-benzoil-3-0-metil- 2-feniltio-2,6-didesoxi-aß-D-fluorocimaropiranosida que tienen la fórmula
( 38 )
ó (iii) opcionalmente, tratar el compuesto (37) con t-butildimetilsililcloruro e imidazol en un disolvente, por ejemplo, piridina, para producir 4-0-benzoil-3-0- metil-2-O-t-butildimetilsilil-aß-D-feniltioaltrosida que tiene la fórmula
( 39 )
en la cual Z = TBDMS = t-butildimetilsililo 20 y (iv) tratar el compuesto (39) con una base, por ejemplo metóxido de sodio, par producir 3-0-metil-2-0-t-butildimetilsilil-aß-D-feniltioaltrosida que tiene la fórmula
r^Hgag^^^&^s^^
( 40 )
en la cual Z =TBDMS = t-butildimetilsililo. El esquema de reacción C muestra el procedimiento para la síntesis de la porción cimarosa de monosacárido activa (40) a partir del compuesto (36) de acuerdo con la invención (e incluye la preparación del compuesto (36) a partir del compuesto (31 ) para propósito ilustrativos).
ESQUEMA DE REACCIÓN C (31 ) (32)
(33) (34;
(35) (36)
(38) (37)
(40) (39) Z=t-butildimetilsililo La síntesis del compuesto (1 ) además puede involucrar un segundo intermediario hidrato de carbono en forma de una porción tevetosa de monosacárido activada, que se puede preparar a partir de un compuesto que tiene la fórmula (47). El compuesto (47) se puede prepara por medio de un proceso que incluye las etapas de (i) tratar a -D-glucosa que tiene la fórmula.
con acetona y ácido sulfúrico, para producir un compuesto 1 ,2 5,6-di-o-isopropiliden-a-D-glucofuranosa de la fórmula
( 42 )
(ii) tratar el compuesto (42) con NaH y Mel, para producir un compuesto 1 ,2 5,6-Di-0-isopropiliden-3-0-metil-a-D-glucofuranosa de la fórmula (43)
(iii) tratar el compuesto (43) con ácido acético para producir un compuesto 3- O-metil-aß-D-glucopiranosa de la fórmula
(44)
(¡v) tratar el compuesto (44) con metanol y ácido clorhídrico, para producir un
compuesto 3-0-metil- ß-D-glucopiranosida que tiene la fórmula
(45)
(v) tratar el compuesto (45) con benzaldehído y cloruro de zinc, para producir un compuesto metil 4,6-0-benciliden-3-0-metil-aß-glucopiranosida que tiene la fórmula
( 46 )
_* (vi) tratar el compuesto (46) con N-bromosuccinimida, cloruro de níquel y
borohidruro de sodio, para producir un compuesto metil 4-0-benzoill-3-0-metil- 6-desoxi-aß-glucopiranosida que tiene la fórmula
( 47 ) La invención además de extiende a un proceso para la preparación de una porción tevetosa de un monosacárido activada, que incluye las etapas de (i) tratar el compuesto (47) con feniltiotrimetilsilano y
trimetilsililtrifluorometanosulfonato, para producir un compuesto 4-0-benzoil-3- 0-metil1-feniltio-6-desoxi-aß-glucopiranosida que tiene la fórmula
( 48 ) (ii) tratar el compuesto (48) con cloruro de pivaloílo y un disolvente, por ejemplo, piridina, para producir un compuesto 4-0-benzoil-3-0-metil-2-0-pivaloil-1-feniltio-6-desoxi-aß-glucopiranosida que tiene la fórmula
( 49 )
y (iii) tratar el compuesto (49) con un agente bromante, por ejemplo, N-bromosuccinimida, y trifluoruro de dietilaminoazufre, para producir un compuesto 4-0-benzoil-3-0-metil-2-0-pivaloil-1-fluoro-6-desoxi-ß-glucopiranosida, produciéndose como estereoisómeros que tienen la fórmula
El Esquema de Reacción D muestra el procedimiento para la síntesis de la porción tevetosa de monosacárido activada (50 (A) y 50 (B)) a partir del compuesto (48), de acuerdo con la invención (e incluye la preparación a partir del compuesto (47) a partir del compuesto (41 ) para propósitos ilustrativos).
..iy r.-.yy^.i.
ESQUEMA A DE REACCIÓN D
(45)
(48) (49)
(50B; (50A) De acuerdo con aún otro aspecto de la invención, se proporciona un proceso para producir sintéticamente un compuesto de la fórmula (1 ) y análogos y derivados del mismo, que incluye las etapas de sintetizar un intermediario esteroide adecuado o precursor, y copular el número requepdo de monoscáridos adecuados con el intermediario esteroide. La invención además proporciona un proceso para copular una cimarosa de monosacárido con el intermediario esteroide, que incluye las etapas de (i) hace reaccionar una porción cimarosa (38) con un intermediario esteroide (15), por ejemplo, a -15°C, y en presencia de un cloururo de estaño, en un disolvente, por ejemplo éter, para producir un compuesto 3-0[4-0-benzoil-2-feniltio-ß-D-cimaropiranosil]-12,14-ß-dihidroxi-pregn-5-en-20-ona de la fórmula
( 51 ) <g- .~v-y<--a& y (ii) tratar el compuesto (51 ) con cloruro de ácido tíglico en piridina, y luego con una base, por ejemplo, NaOMe, para producir un compuesto 3-0-[-2- feniltio-ß-D-c?maropiranosil]-12ß-tiglo?loxi-14-hidroxi-14ß-pregn-5-eno- de la fórmula
( 52 )
La invención se extiende a un proceso que incluye copular una 15 porción cimarosa de monosacárido a una porción tevetosa de monosacárido, y copular el disacárido resultante con el producto esteroide combinado (52), para formar el compuesto (1 ). El proceso de copular la porción cimarosa de monosacárido a la porción tevetosa de monosacárido y copular el disacárido resultante al 20 producto esteroide combinado (52) puede incluir las etapas de (i) copular una porción cimarosa selectivamente protegida (40) y una porción tevetosa selectivamente protegida (50 A) usando el cloruro de estaño (SnCI2)
Ssaate5£^ 8.*~js^s^ y trifluorometanosulfonato de plata, por ejemplo a -15°C, para producir un compuesto de la fórmula
( 53 )
en la cual Z = TBDMS = t-butildimetilsililo (ii) tratar el compuesto (53) con tetrabutilamoniofluoruro, para producir un compuesto de la fórmula
( 54 ) (iii) tratar el compuesto (54) con trifluoruro de dietilaminoazufre, por ejemplo a 0°C. para producir un compuesto de la fórmula
r te~ ( 55 ) (iv) hacer reaccionar el compuesto (55) con el compuesto (52) para producir un compuesto de la fórmula
y (v) tratar el compuesto (56) en una reacción de Níquel Raney, y luego con una base, por ejemplo NaOMe, para producir el compuesto (1 ) como se 20 describe anteriormente. El Esquema de Reacción E muestra el procedimiento para la síntesis de los intermediarios (52) y (55) y la copulación de los mismos para formar el compuesto (56).
ESQUEMA DE REACCIÓN E (15) (38)
(52) (54) (53) De acuerdo con la invección, se proporciona un proceso alternativo que incluye copular porciones cimarosa y tevetosa para formar un trisacárido, y copular el trisacárido en un derivado esteroide para formar un compuesto de la fórmula (1 ). El proceso de formación de trisacárido y copulación del trisacárido resultante a un derivado esteroide puede incluir las etapas de (í) copular un porción cimarosa selectivamente protegida (40) y el compuesto (45) usando cloruro de estaño (II), AgOTf, Cp2ZrCI2, para producir un compuesto de la fórmula
( 57 )
en la cual Z = TBDMS = t-butildimetilsililo (ii) tratar el compuesto (57) con tetrabutilamoniofluoruro y trifluoruro de dietilaminoazufre, para producir un compuesto trisacárido que tiene la fórmula ( 58 )
y (iii) copular el trisacárido (58) con un intermediario de la fórmula
( 59 )
usando cloruro de estaño (II), AgOTf, Cp2ZrCI2, para producir el compuesto
(1 )- El intermediario esteroide (59) se puede producir tratando el
esteroide (15) con cloruro de ácido tíglico. El Esquema de Reacción F muestra el procedimiento para la síntesis del trisacárido (58) y la síntesis del compuesto (1 ) copulando el trisacárido (58) y la síntesis del compj ¡|l> (1 ) copulando el trisacárido (58) con el intermediario esteroide (59). ESQUEMA DE REACCIÓN F
Z * t - butildimetilstlilo _± **, Los intermediarios (23), (24). (25), (27), (28), (29), (30), (37), (38), (39), (40), (48), (49), (50), (51), (53), (54), (55). (56), (57) y (58) que se describen anteriormente son compuestos nuevos y la invención se extiende a estos compuestos como tales. El compuesto (1 ), 3-0-[-ß-D-tevetopiranosil-(1?-4)-ß-D-cimaropiranosil-(1?4)-ß-D-cimaropiranosil]-12ß-0-t?gloiloxi-14hodroxi-14ß-pregn-5-en-20-ona, y varios análogos y derivados del mismo, han demostrado tener actividad supresora del apetito. La invención se extiende además a una composición o formulación que tiene actividad supresora del apetito, en la cual el ingrediente activo es un extracto que se obtiene de una planta del género Trichocaulon o del género Hoodia. El ingrediente activo puede ser un compuesto de la formula (1 ), extraído de una planta del género Trichocaulon u Hoodia. o un derivado del mismo. La planta puede ser de la especie Trichocaulon officinale o
Trichocaulon piliferum, o la especie Hoodia currorii, Hoodia gordonii, u Hoodia lugardii. La invención también se extiende a una composición o formulación que tiene actividad supresora del apetito, en la cual el ingrediente activo es un compuesto de la fórmula (1 ) producido en forma sintética, o un derivado o análogo del mismo, como se expone anteriormente con referencia a los compuestos (2) a (14).
De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un método para suprimir el apetito mediante la administración a un humano o animal, de una dosificación adecuada cíe un agente supresor del apetito que comprende un extracto de una planta del género Trichocaulon u Hoodia. El extracto puede ser incorporado a una composición o formulación que además incluye otros ingredientes farmacéuticamente aceptables. El agente supresor del apetito puede ser un químico natural aislado o un compuesto químico sintético de la fórmula
(1 ) o derivados o análogos del mismo, como se expone anteriormente. La composición o formulación supresora del apetito puede consistir del agente supresor del apetito en mezcla con un excipiente,
diluyente o portador farmacéutico. Se pueden agregar otros aditivos adecuados, que incluyen un estabilizador y otros dichos ingredientes como fuera deseado.
La invención se extiende. É? uso del compuesto (1 ) o sus derivados o análogos como se expone anteriormente, para el uso como un medicamento que tiene actividad supresora del apetito. La invención además se extiende al compuesto (1 ), o sus derivados o análogos como se expone anteriormente, para el uso como un medicamento que tiene actividad supresora del apetito. Además se proporciona un método para suprimir el apetito mediante la administración a un humano o un animal, de un dosificación efectiva de una composición como se describe anteriormente. Se ha descrito en la presente un método para extraer un glicósido esteroide que tiene actividad supresora del apetito, de material de planta del género Trichocaulon u Hoodia. La ¡nvención de esta forma se extiende a un extracto obtenido de material de planta del género Trichocaulon u Hoodia, y que contiene glicósido esteroide sustancialmente puro de fórmula (1 ). La invención además se extiende a un material alimenticio o bebida que contiene una cantidad efectiva del glicósido esteroide de la fórmula (1 ), o sus derivados o análogos como se expone anteriormente, para tener un efecto supresor del apetito cuando se ingiere. Los estudios genéticos moleculares han conducido a un considerable incremento en la comprensión de la regulación del apetito, saciedad y peso corporal. Estos estudios han revelado numerosos caminos reguladores centrales, mediados por un número de neuropéptidos. El
-*. -n?^ íSe?SSSSí&A.
mantenimiento de un peso corporal normal se logra mediante un complicado equilibrio entre la ingesta de energía, consumo de alimentos, y gastos de energía. La homeostasis de energía es sujeto de una amplia gama de influencias, controladas en última instancia por el cerebro. Las diferentes señales incluyen cosas tales como el sentido del olfato y del gusto, y señales gastrointestinales como distensión del tracto gastrointestinal, señales químicas a la mucosa gástrica y metabolitos transportados por la sangre como ácidos grasos y glucosa. Centralmente, el neuropéptido "Y" (NPY) que es regulado negativamente por leptina, ha sido establecido como uno de los reguladores positivos de la conducta alimentaria. La expresión del antagonista endógeno para receptores de melanocortina también ha demostrado se la base para la obesidad en un modelo particular (el ratón ob/ob). De hecho, la deficiencia en el receptor de melanocortina MC4 duplica completamente el síndrome de obesidad. Otros mediadores que han demostrado tener roles en el equilibrio de la energía incluyen bombesina, galonina y péptido-1 del tipo glucagón. Sin limitarnos por la teoría, el solicitante cree que el compuesto
(1 ) y sus análogos o derivados anteriores actúan como un agonista del receptor de melanocortina 4. El efecto de ésto es regular NPY, pero también incrementar la colecistoquinina. El efecto de la colecistoquinina entre otras cosas es inhibir el vaciamiento gástrico.
En consecuencia, la ¡nvención se extiende a una composición que tiene actividad supresora del apetito, que comprende un agonista de receptor de melanocortina 4. El agonista puede ser un extracto o compuesto como se describe 5 anteriormente, en particular el compuesto de fórmula (1 ). La composición se puede mezclar con un excipiente, diluyente o portador farmacéutico, y opcionalmente se prepara en forma de dosificación de unidad. La invención aún también se extiende al uso de un agonista de receptor de melanocortina 4 en la fabricación de un medicamento que tiene
actividad supresora del apetito, a un agonista de receptor de melanocortina 4 para el uso como un medicamento que tiene actividad supresora del apetito, a un método para suprimir el apetito mediante la administración a un humano o animal, de una dosificación efectiva de una composición que comprende un agonista de melanocortina 4 como se describe anteriormente, y al uso de un 15 agonista de receptor de meinocortina 4 para suprimir el apetito y/o para combatir la obesidad en un humano o animal. Ahora se describirán adicionalmente la invención y su eficacia, sin limitaición del alcance de la invención, con referencia a los siguientes ejemplos y dibujos. 20 En los dibujos, La figura 1 muestra un diagrama de proceso del método general para extraer un primer extracto supresor del apetito crudo y un extracto
-afc g^ay ^ gg¡¡ g supresor del apetito purificado de material de planta del género Trichocaulon y,. Hoodia; La figura 2 muestra una re^^entación gráfica de un bioensayo llevada a cabo en ratas usando un extracto de metanol parcialmente 5 purificado de Trichocaulon piliferum; Las figuras 3 y 4 juntas muestran una representación esquemática de una realización preferida del proceso de la ¡nvención para producir un extracto de material de planta del género Trichocaulon u Hoodia; y Las figuras 5 y 6 muestran una representación gráfica del
• 10 porcentaje de cambio de masa corporal de ratas para diferentes grupos, para los días -7 a 7 y los días 0 a 7, respectivamente, en un estudio de dosis de repetición usando un extracto de savia y un extracto de savia secado por pulverización de material de planta de la especie Hoodia gordonii.
EJEMPL0 1 •
El método general para extraer un primer extracto supresor del apetito crudo y un extracto supresor del apetito purificado de material de planta del género Trichocaulon o del género Hoodia, se ilustra por medio del 20 diagrama de proceso de la figura 1.
» EJEMPLO2
Los bioensayos llevados a cabo en ratas usando un extracto de metanol parcialmente purificado obtenido de la forma que se ilustra en el ejemplo 1 , indicaron que el extracto de hecho sí exhibe actividad supresora del apetito. La actividad supresora del apetito del extracto activo se puede ilustrar por medio de un ejemplo típico del efecto del extracto de metanol de Trichocaulon piliferum en ratas, por medio de la representación gráfica de la figura 2. Será evidente de la figura 2 que el grupo de evaluación de ratas dosificado con el extracto el día 5 exhibió una ingesta de alimentos substancialmente disminuida durante los próximos dos días, mientras que un grupo de control no reveló una ingesta e alimentos reducida comparable. La ingesta de alimentos del grupo de evaluación volvió a normal, y de hecho incrementó, desde el día 8 en adelante.
EJEMPLO 3
Una realización preferida de un proceso de acuerdo con la invención para producir un extracto que tiene actividad supresora del apetito se ilustra en forma esquemática a modo de ejemplo en las figuras 3 y 4, cuyas dos figuras juntas ilustran el proceso en su totalidad. Sin embargo, se pueden usar otros varios procedimientos, como lo entenderán aquellas personas especializadas en el arte. Con referencia a la figura 3, material de planta del género
Trichocaulon o del género Hoodia es alimentado en un mezclador 3, por 5 ejemplo un mezclador Waring, por medio de la línea de alimentación 1 , con un disolvente en forma de una solución de cloruro de metileno / metanol introducida por la línea de alimentación 2. El producto homogeneizado es alimentado mediante la línea 4 a una etapa de separación 5, por ejemplo en forma de un filtro o centrífuga, y el material de planta residual es removido
• 10 mediante la línea 27. La mezcla de disolvente / extracto alimentada mediante la línea 6 a una etapa de evaporación 7, donde el disolvente es removido, por ejemplo por medio de un evaporador de rotor. El extracto crudo seco es alimentado mediante la línea 8 a otra etapa de extracción 9, con el agregado de una 15 solución de cloruro de metileno / agua introducida mediante la línea de alimentación 29 para extracción adicional, y luego a una etapa de separación 13 por medio de la línea 11 , donde la fracción de agua es removida mediante la línea 31. La fracción de extracto disuelto es alimentada mediante la línea 15 a una etapa secadora 7, donde el disolvente es evaporado, por ejemplo, 20 mediante un evaporador de rotor. Con referencia a la figura 4, el extracto seco es alimentado mediante la línea 10 a una etapa de extracción 12. Una solución de metanol / hexano también es alimentada mediante la línea 14 a la etapa de extracción
yrS^??^-.-S?Íu^i.-, 12 para purificación adicional y extracción del extracto seco. La mezcla de extracto / metanol / hexano es alimentaláfffnediante la línea 16 a una etapa de separación 18, la fracción de hexano es removida mediante la línea 20, y la mezcla de metanol / extracto es luego alimentada mediante la línea 22 a una 5 etapa de secado 24. En la etapa de secado 24, el disolvente es removido, por ejemplo por evaporación en un evaporador de rotor. El extracto seco, parcialmente purificado es alimentado mediante la línea 26 y con el agregado de metanol mediante la línea 28, a una etapa de solución 30, y la fracción disuelta es alimentada por medio de la línea 36 a
• 10 una columna de cromatografía 38. En la columna 38 la fracción soluble en metanol es adicionalmente fraccionada usando gel de sílice y disolvente de cloroformo / 30% metanol, en diferentes fracciones indicadas en forma esquemática como las fracciones I a V. De acuerdo con un procedimiento de fraccionamiento real f 15 llevado a cabo por el solicitante, el procedimiento de fraccionamiento produjo los siguientes pesos de fracción: I (3.9 g); II (2.6 g); lll (2.1 g); IV (1.1 g) y (2.0 g). Estas fracciones se evalúan individualmente por medio de u procedimiento de bioensayo adecuado (en una etapa que no se expone) y aquellas fracciones identificadas como las fracciones I y II que exhiben una notable 20 actividad supresora del apetito, son alimentadas por medio de las líneas de alimentación 40 y 42 a las columnas 44 y 46 respectivamente, donde son adicionalmente fraccionadas y purificadas por cromatografía de columna, nuevamente usando gel de sílice y un sistema de cloroformo : metanol 9:1.
A3? -sí H. -^^ ^^í^ik^i ^^^ Las sub-fracciones II (A) - (C) obtenidas de la columna 44, cuando se ensayan, no muestran una actividad supresora del apetito notable, y pueden ser recicladas para otra cromatografía. Las sub-fracciones I (A)- (L) obtenidas de la columna 46 también 5 son evaluadas (por medio de una etapa de ensayo que no se expone), y se encuentra que la sub-fracción I (C) tiene una marcada actividad supresora del apetito. La sub-fracción I (C) es alimentada por medio de la línea 48 a la columna 50 para fraccionamiento y purificación adicionales, usando gel de
sílice y un eluente de acetato : hexano 9:1. De las fracciones purificadas resultantes, se encuentra que la fracción I (C) (ii), después del ensayo, posee una marcada actividad supresora del apetito. El producto prurificado es identificado por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (como se indica en las tablas 1 y 2 a f 15 continuación) como el compuesto (1 ). Cuadro 1 : Información 1H (300.13 MHz) r.m.n. para el compuesto (1 ) CDC
^^^^^^^^^^>^g^^«*^^^^^g^^^^^^[^^^^^^A^^^^^j^^^ Cofhp?rffesto (l )
• Átomo de hidrógeno J(HH)/Hz dH/p.p.m. Aglicón-3 - 3.522 m 6 - 5.381 m 12 11.5, 4.1 4.607 dd 17 9.3, 9.3 3.157 dd 18 - 1.029 s 19 - 0.951 s 2 *1 - 2.164 s 3 7.1 ,1.5 6.888 qq 4* 7.1 ,1.2 1.806 dq 5* 1.6,1.2 1.853 dq • Cim -.y 9.4,2.1 4.816 dd 10 2' 13.8, 3.7, 2.1 2.055 ddd i.ac 13.8, 9.4, 2.6 1.552 ddd 3,,ax 3.7, 2.9,2.6 3.776 ddd 4' 9.4, 2.9 3.179 dd 5' 6.3, 9.4 3.821 dd 6' 6.3 1.279 da 3'-OMe _ 3.408 sd 1" 9.4, 2.1 4.730 dd
4" 9.4, 2.9 3.239 dd 5" 6.3, 9.4 3.898 dd 6" 6.3 1.243 db 3"-OMe - 3.392 se Tev-.-r- 7.7 4.273 d lll 7.7, 8.0 3.469 dd 3"' 8.0, 2.9 3.099 dd "' 9.3, 2.9 3.179 dd 20 5'" 6.3, 9.3 3.351 dd 6'" 6.3 1.183 d,c 3"'-OMe - 3.622 s
^> *- « t? M a, b, c en cada columna pueden ser intercambiables, d, e en cada columna pueden ser intercambiables, * Se refiere a los átomos del grupo tigloato CUADRO 2: Información r. m. n. 13C (75.25 MHz) de importancia para el compuesto (1 ) en CDC
*Se refiere a los átomos del grupo tigloato
f Compuesto (1 ) Información IR:3440 c?tf1 (OH), 2910 cm'1 (CH), 1700 crn"1 (C = 0) [aD]20 589 = 5 12.67° (C = 3, CHCI3) p.f. 147°C-152°C Los ejemplo 4 a 13 ilustran los procedimientos sintéticos por los cuales se pueden preparar los compuestos intermediarios y esteroide (15) de acuerdo con "el primer procedimiento alternativo". • 10 EJEMPLO 4 12ß, 15a-Dihidrox¡ proqesterona (17)
Se preparan cultivos de Calonectria decora (ATCC 14767) por 15 medio de la inoculación de un medio de cultivo compuesto de sacarosa (900 g), K2HPO4 (30 g), concentrado Czapek (300 ml), licor de maíz macerado (300 ml) y agua destilada (30 l)(recipientes de 150 x 500 ml). Después de 5 días de agitación a 26°C, se agrega progesterona (16) (150 g) en una suspensión de Tween 80 (0.1 % sol., 1.5 I) a los recipientes. Los cultivos son incubados 20 durante 5 días adicionales y luego son trabajados por centrifugación, decantación, extracción del medio con cloroformo, y luego evaporación, para producir la dihidroxi progesterona (17) (75 g, 45%). 1H RMN (CDCI3):5.71 (1 H, s, H-4); 4.12-4.22 (1 H, m, H-15)
^s^^ sr, 4.43 (1 H, br, s, OH); 3.4§ 53 (1 H, dd, j = 4.6 Hz, H-12); 2.16 Hz (3H, s, H-21); 1.18 (3H, s, H-19); 0.74 (3H, s, H-18)
^r EJEMPLO 5 12ß-Hidro"i- 15a-(p-toluen sulfonil) progesterona (18)
La dihidroxi progesterona (17) (75 g, 0.22 mol) es disuelta en piridina seca (300 ml) y enfriada hasta 0°C. Se agrega por goteo cloruro de p- toluensulfonilo (46 g, 0.24 mol) en priridina seca (200 ml) a la mezcla de
reacción a 0°C. La reacción es agitada durante la noche a 0°C, y templada mediante el agregado de H2O (500 ml). El estrato de agua es extraído con etil acetato (1 I), y el extracto orgánico es lavado con ácido clorhídrico (6 M, 3 X 1 I), bicarbonato de sodio saturado acuoso (500 ml), cloruro de sodio saturado acuoso (500 ml), y agua (500 ml). El estrato orgánico es secado (MgSO ),
filtrado y evaporado, para producir progesterona sulfonada de p-tolueno (18) (98 g, 92%) como un aceite amarillo oscuro viscoso. 1H RMN (CDCI3): 7.7 (2H, d j = 14 Hz, H-2.6); 7.34 ((2H, d, j = 8.4 Hz, H-3.5); 5.67 (1 H, s, H-4); 4.86-4.93 (1 H, m, H-15); 3.45-3.50 (1 H, dd, j = 4.6 Hz, H- 12); 2.44 (3H, s, H-4Me); 2.15 (3H, s, H-21 ) 1.13 Q(3H, s, H-19); 0.74 (3H, s,
H-18).
«ai-g&-á=-¿l>5 aa^l^L- -.
EJEMPLO 6 • Una solución de la progesterona tosilada (18) (98 g, 0.19 mol) en 5 2,4,6-trimetil colidina (500 ml) es reflujada a 150°C durante 3 horas. La mezcla de reacción es enfriada y volcada en agua (500 ml). El estrato de agua es extraído con etil acetato (1 I), después de lo cual el estrato orgánico es lavado con ácido clorhídrico (6 M, 3 X 1 I), bicarbonato de sodio saturado acuoso (500 ml), cloruro de sodio saturado acuoso (500 ml), y agua (500 ml). 10 Después del secado (MgSO4) y filtrado, el etil acetato es evaporado y la mezcla cruda es purificada por cromatografía de gel de sílice, eluyendo con acetona: cloroformo (1 :10) para lograr ?14- progesterona (19) (50 g, 78 %) como un aceite rojo oscuro. 1H RMN (CDCI3): 5.73 (2H, s, H-4), 5.28 ((2H, dd, j = 2.2 Hz, H-15), 4.41 (1 H, f 15 br, s, OH), 3.49-3.52 (1 H, dd, j = 4.3 Hz, H-12), 2.80-2.84 (1 H, dd, j = 9.2 Hz, H-17), 2.14 (3H, s, H-21 ), 1.19 (3H, s, H-19) 0.89 (3H, s, H-18).
EJEMPLO 7 3. 12ß-Diacetoxipreqna-3,5.14-trien-20-ona (20) 20 Una solución de ?14-progesterona (19) (50 g, 0.15 mol) en cloruro de acetilo (1.5 I) y anhídrido acético (750 ml) es reflujada durante 2 horas. La mezcla de reacción es volcada en etil acetato frío (1 I) y se agrega
bicarbonato de sodio saturado acuoso con agitación hasta que la efervescencia cesa. El estrato del etil acetato es separado del estrato de bicarbonato de sodio y lavado con otras porciones de bicarbonato de sodio acuoso (3 X 700 ml), después con cloruro de sodio saturado acuoso (700 ml) y finalmente con agua (700 ml). El estrato orgánico es secado (MgSO4), filtrado y evaporado, para lograr la 3, 12ß-diacetoxipregna-3,5,14-trien-20-ona (20) (60 g, 93 %) como un aceite anaranjado. 1H RMN (CDCI3): 5.68 (2H, s, H-4), 5.44 (1 H, m, H-6), 5.31 (1 H, dd, J =2.2 Hz, H-15), 4.82-4.86 (1 H, dd, J = 4.5 Hz, H-12), 3.10-3.18 (1 H, t, J = 9.5 Hz, H-17), 2.18 (3H, s, 3-Ac), 2.11 (3H, s, 12-Ac) 2.08 (3H, s, H-21 , 1.02 (3H, s, H-19), 1.01 (3H, s, H-18).
EJEMPLO 8 3. 12ß-DiacTtoxi-20.20-etilendioxipreqna-3,5.14-trieno (21)
El compuesto de diacetoxi (20) (60 g, 0.14 mol) es disuelto en benceno (1 I) y se agrega etilenglicol (60 ml) y ácido p-toluensulfónico (1 g). (El benceno es previamente reflujado con un sifón Dean-Stark). La mezcla es reflujada con agitación y remoción azeotrópica de agua durante 16 horas. Se agrega solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso (500 ml) a la solución enfriada. Luego ésto es lavado con salmuera (500 ml) y con agua (500 ml), y secado (MgSO4). El disolvente es evaporado y la mezcla cruda es purificada por cromatrografía de columna de gel de sílice, eluyendo con etil
r^^ m ^^^^ acetato : hexano (2:8), para producir el etilendioxipregna- 3,5,14-trieno (21 ) (35 g, 53 %). f 1H RMN (CDCI3): 5.68 (1 H, s, H-4), 5.45 (1 H, m, H-6), 5.31 (1 H, dd, J =2.2 Hz,
H-15), 4.73-4.85 (1 H, dd, j = 4.4 Hz, H-12), 3.78-3.98 (4H, m, etilendioxi), 2.16 5 (3H, s, 3-Ac), 2.04 (3H, s, 12-Ac) 1.29 (3H, s, H-21 ), 1.12 (3H, s, H-19), 1.02 (3H, s, H-18).
EJEMPLO 9 3ß, 12ß-Diacetoxi-20.20-eti lendioxi preqna-5,14-dieno-12-acetato (22)
• 10 El dienolacetato (21 ) (35 g, 0.077 mol) es supendido en etanol (500 ml) y borohidruro de sodio (2.8 g, 0.074 mol) es agregado a 0°C. La mezcla se deja entibiar hasta temperatura ambiente y se agita durante la noche. La mayoría del disolvente es removido in vacuo, y la mezcla es diluida f 15 con agua (500 ml) y extraída con etil acetato (500 ml). El trabajo seguido por cromatografía sobre gel de sílice con acetona / cloroformo (1 :10) produce el 3ß-alcohol (22) (25 g, 80%). 1H RMN (CDCI3): 5.41 (1 H, s, H-6), 5.28 (1 H, dd, J = 2.2 Hz, H-15), 4.72-4.81 (1 H, dd, J =4.4 Hz, H-12), 3.82-4.02 (4H, m, etilendioxi), 3.45-3.59 (1 H, m, H- 20 3), 2.03 (3H, s, 12-Ac), 1.28 (3H, s, H-12) 1.10 (3H, s, H-19), 1.01 (3H, s, H- 18).
El 3ß-alcohol (22) (25 g, 60.2 mol) en tetrahidrofurano seco (300 5 ml) es agregado por goteo a una suspensión de hidruro de aluminio de litio (2.7 g 72.2 mol) en tetrahidrofurano seco (500 ml). La mezcla de reacción es agitada a temperatura ambiente durante 24 horas, después de lo cual se agrega agua (2.7 ml) cuidadosamente y se agita durante otros 10 minutos.
Luego se agrega hidróxido de sodio (15 % sol, 2.7 ml) y la suspención se agita. Después de 10 minutos, se agrega agua (8.1 ml) y la suspención se agita durante 10 minutos, se filtra, se seca (MgSO ) y el disolvente se evapora, para lograr el 3ß, 12ß dihidroxipregna-dieno (23) (20 g, 90 %). 1H RMN (CDCI3): 5.36 (1 H, m, H-6), 5.23 (1 H, dd, J = 2.2 Hz, H- 15 15), 3.94-4.06 (4H, m, etilendioxi), 3.41 -3.52 (1 H, m, H-3), 3.32-3.36 (1 H, dd, J = 4.3 Hz, H-12), 1.31 (3H, s, H), 1.01 (3H, s, H-19), 0.96 (3H, s, H-18). 13C RMN (CDCI3): 152.4 (c-14), 140.2 (c-5), 121.1 (c-15), 119.7 (c-6), 111.1 (C-20), 79.8 (C-12), 71.6 (C-3), 63.7 y 63.6 (etilendioxi), 58.8 (C- 17), 19.0 (C-19), 11.9 (C-18).
•j&iiígX&ihSiÁr * fe ^^^^u^ ^^^^ ^ ^^bk^^^ 3ß. 12ß-D¡hidroxi-14,15-epox¡-20,20^ endioxipreqn-5-eno; 3ß. 12ß-Dihidroxi- 5,6-epoxi-20,20-etilendioxipreqn-14-eno f Se agrega N-bromoacetamida (211 mg, 1.5 mmoles) a una solución agitada del 5,14-dieno (23) ( ;QG mg, 1.34 mmoles) en acetona (100
ml), ácido acético (2.5 ml), y agua (5 ml) a 0°C. Después de 15 minutos se agrega sulfito de sodio (5 % sol., 50 ml) a la mezcla de reacción. La acetona es evaporada, y el estrato acuoso es extraído con diclorometano (3 x 50 ml). El estrato orgánico es secado (MgSO ), filtrado y evaporado. Se agrega piridina (1 ml) al producto, se agita durante 0.5 horas. Luego se agrega
• 10 diclorometano (100 ml) a la mezcla de reacción, y el diclorometano es lavado con ácido cítrico (5 % sol., 3 x 100 ml), bicarbonato de sodio saturado (50 ml), y agua (50 ml). El estrato orgánico es secado (MgSO ), filtrado y evaporado, para dar la mezcla de 14,15- y 5,6-epóxidos (360 mg, 69%) como una espuma blanca. La mezcla de epóxidos no pudo ser separada por cromatografía de f 15 columna de gel de sílice.
EJEMPLO 11 3ß. 12ß. Dihidroxi-14,15-epoxi-20,20-etilendioxipreqn-5-eno (24)
La mezcla de 14,15-epóxidos y 5,6-epóxidos (14.4 g, 37.0 mmoles) en tetrahidrofurano seco (200 ml) es agregada a una suspención de hidruro de aluminio de litio (1.69 g, 44.4 mmoles) en tetrahidrofurano seco (300 ml). La mezcla de reacción es agitada a temperatura ambiente durante 24 horas, después de lo cual es trabajada como se describe anteriormente mediante el agregado de agua (1.69 ml) e hidróxido de sodio (15 % sol., 1.69 ml). Después de la filtración y evaporación del disolvente, el producto crudo es purificado por cromatografía de columna de gel de sílice, usando metanol/cloroformo (1 :9) como disolvente para dar el 14,15 epoxi-20,20-etilendioxipregn-5-eno (24) no reaccionado (300 mg, 2.1 %). 1H RMN (CDCI3): 5.31 (1 H, m, H-6), 3.82-3.98 (4H, m, etilendioxi), 3.43-3.52 (1 H, m, H-3), 3.41 (1 H, s, H-15), 3.31-3.35(1 H, dd, J = 4.3 Hz, H-12), 1.29 (3H, s, H-21 ), 1.17 (3H, s, H-19), 1.02 (3H, s, H-18). 13C RMN (CDCI3): 139.8 (C-5), 120.8 (C-6), 112.1 (C-20), 77.2(C- 12), 75.4 (C-14), 61.0(C-15), 22.3 (C-21 ), 19.2 (C-19), 9.5 (C-18).
EJEMPLO 12 3ß, 12ß. 14ß, Trihidroxi-20.20-etilendioxipreqn-5-eno (25)
El 14,15-epóxido (24) (300 mg, 0.77 mmoles) en tetrahidrofurano seco (10 ml) es agregado a una suspensión de hidruro de aluminio de litio (300 mg, 7.89 mmoles) en tetrahidrofurano, y la reacción es reflujada durante 48 horas. Después del agregado de agua (0.3 ml), hidróxido de sodio (15 % sol, 0.3 ml) y la filtración como se describe anteriormente, la mezcla es purificada por cromatografía de columna de gel de sílice usando metanol: cloroformo (1 :9) como disolvente, para dar el trihidroxi pregneno (25) (250 mg, 83 %).
1H RMN (CDCb): 5.38 tt f», H-6), 3.98 (4H, m, etilendioxi), 3.43-3.53 (1 H, m, H-3), 3.25-3.32 (1 rf dd, J = 4.1 Hz, H-12), 1.32 (3H, s, H-21 ), 1.01 (3H, s, H-19), 0.98 (3H, s, H-18). 13C RMN (CDCI3): 139.1 (C-6), 122.1 (C-6), 112.2 (C-20), 85.1 (C-14), 75.1 (C-12), 71.6 (C-3), 23.4 (C-21 ), 19.4 (C-19), 8.9 (C-18).
EJEMPLO 13 3ß, 12ß. 14ß-Trihidroxi-preqn-5-eno (15)
El etilendioxipregneno (25) (250 mg, 0.64 mmoles) es disuelto en ácido acético (13.4 ml) y agua, lo cual después del secado por congelamiento logra el trihidroxi esteroide (15) (200 mg, 89%), p.f.: 228°C - 235°C (lit 225°C -235°C), M + 348, [aD]20 + 35° (lit[aD]20+29°). 1H RMN (CDCI3): 5.39 (1 H, m, H-6), 3.56-3.62 (1 H, t, J = 8.1 Hz, H-17), 3.42-3.51 (1 H, m, H-3), 3.28-3.39 (1 H, dd, J = 4.3 Hz, H-12), 2.23 (3H, s, H-21 ), 1.01 (3H, s, H-19), 0.90 (3H, s, H-18). 13C RMN (CDCI3): 217.7 (C-20), 138.9 (C-5), 112.2 (C-6), 85.5 (C-14), 73.6 (C-12), 71.6 (C-3), 57.0 (C-17), 55.1 (C-13), 43.6 (C-9), 42.1 (C-4), 37.3 (C-1 ), 36.8 (C-10), 35.9 (C-8), 34.5 (C-15), 32.9 (C-21 ), 31.5 (C-16), 30.1 (C-2), 27.4 (C-7), 24.4 (C-11 ), 19.4 (C-19), 8.3 (C-18). Los ejemplos 14 a 19 ¡lustran los procedimientos sintéticos por los cuales se pueden preparar los compuestos intermediarios y esteroide (15) de acuerdo con "el segundo procedimiento alternativo".
:.- L*»abMB»?adte<a» ^s 12ß-ol (26)
Una solución de cloruro de p-toluensulfonilo (650 mg, 3.4 mmoles) en piridina (10 ml) fue agregada por goteo a una mezcla del 20,20-etilendioxipregna-5,14-dieno-3ß, 12ß-diol 12-acetato (22) (1.3 g, 3.1 mmoles) en piridina (15 ml) a 0°C. La mezcla de reacción se dejó agitándose a temperatura ambiente durante 24 horas, después de lo cual se agregó agua a la mezcla de reacción. La solución fue extraída con etil acetato (2 X 50 ml), el estrato de etil acetato fue lavado con ácido cítrico (5 X 50 ml), solución de bicarbonato de sodio saturado (100 ml), solución de cloruro de sodio saturado (100 ml) y agua (100 ml). El etil acetato fue secado (MgSO ), filtrado, y evaporado y purificado por cromatografía de columna instantánea, usando hexano- etil acetato (8 : 2 v/v) como el eluente, para dar el ß-O-tosil esteroide (26), (1.5 g, 84%) como un aceite amarillo (M hallado 570.271 , C32H42O7S ' requiere: M 570.273). dH 1.021 (3H, s, 19-H), 1.131 (3H, s, 18-H), 1.282 (3H, s, 21-H), 2.021 (acetatoOCH3), 2.431 (3H, s, Ar-CH3), 3.883 (4H, m, OCH2CH2O), 4.750 (1 H, dd, 3 J 10.8 Hz, 5.2 Hz, 12-H), 4.890 (1 H, m, 30H), 5.281 (1 H, dd, 3 J 4.2 Hz, 2.1 Hz, 15-H), 5.388 (1 H, m, 6-H), 7.341 (2H, d, 3 J 8.2 Hz, ArH), 7.746 (2H, d, 3 J 8.2 Hz, ArH).
dc 13.493Q (C-i ), 19.002Q (C-19), 21.612Q (Ar-metilo)*, 21.671Q (C-21 )*, 24.175Q (aclljjo jnetilp), 63.401T (etilendioxi), 63.498T (etilendioxi), 71.531 S (C-13), 80.912D (C-12), 82.531 D (C-3), 111.363S (C- 20), 120.881 D (C-15), 121.461 D (C-6), 123.715-133.917 (aromático), 139.903S (C-14), 151.722S (C-5), 170.819S (éster carbonilo). * puede ser intercambiado.
EJEMPLO 15 20.20-Etilendioxi-3a.5-ciclo-5a--preqn-14-eno-6ß. 12ß-diol-12-acetato (27)
Una solución de 3ß-toluen-p-sulfoniloxi-pregn-5,14-dieno (26) (1.2 g, 2.1 mmoles) y acetato de potasio (2.2 g, 22.4 mmoles) en agua (250 ml) y acetona (500 ml) fue reflujada a 60°C durante 16 horas. La acetona fue evaporada y el agua fue extraída con etil acetato (200 ml). El etil acetato fue secado (MgSO ), filtrado, y evaporado. La separación cromatográfica instantánea de la mezcla usando cloroformo-acetona (9:1 v/v) como el eluente dio el derivado 3a,5-ciclo (27) (530 mg, 61 %) como un aceite amarillo, (M Hallado 416.262, C25H36O5 requiere: M 416.263). dH 0.288 (1 H, dd, 3 J 8.1 Hz, 4.9 Hz, 4-Ha), 0.477 (1 H, dd, 3 J 4.4 Hz, 4.4 Hz, 4-Hb), 1.025 (3H, s, 19-H), 1.121 (3H, s, 18-H), 1.256 (3H, s, 21-H), 1.989 (3H, s, acetato CH3), 3.302 (1 H, dd, 3 J 2.8 Hz, 2.8 Hz, 6-H), 3.784-3.947 (4H, m, OCH2CH2O), 4.721 (1 H, dd, 3 J 8.5 Hz, 5.6 Hz, 12-H), 5.232 (1 H, dd, 3 J 3.9 Hz, 19 Hz, 15-H).
dc 11.678T (C-4), 12.298Q (C-18), 19.971 Q (C-19), 23.623Q (C- 21 ) 24.153Q (acetato metilo), 63.700T (etilendioxi), 63.788T (etilendioxi), f 73.591 D (C-6), 80.551 D (C-12), 111.126S (C-20), 118.778D (C-15), 152,959S (C-14), 170.991 S (éster carbonilo). 5 EJEMPLO 16 20,20-Etilendioxi-3a.5-ciclo-5a-preqn-14-eno-6ß,12-diol (28)
Una solución del derivado 3a,5-ciclo (27) (500 mg, 1.2 mmoles) 10 en tetrahidrofurano (20 ml) fue agregada por goteo a una suspención de hidruro de aluminio de litio (50 mg, 1.3 mmoles) en tetrahidrofurano (10 ml). La mezcla de reacción fue agitada durante 4 horas y templada mediante el agregado de agua (50 µl). Después de 30 minutos, se agregó hidróxido de sodio (solución 15%, 50 µl) y continuó la agitación durante otros 30 minutos. 15 Se agregó agua (150 µl) y la mezcla de reacción fue filtrada. El tetrahidrofurano fue secado (MgSO4), filtrado y evaporado, y la purificación cromatográfica instantánea usando cloroformo-acetona (8:2 v/v) como el eluente dio el diol (28) (370 mg, 83%) como un aceite (M hallado 374.250, C23H34O4 requiere: M 374.252). 20 dH 0.298 (1 H, dd, 3 J 8.1 Hz, 4.9 Hz, 4-H2), 0.510 (1 H, dd3, J 4.4 Hz, 4.4 Hz, 4-Hb), 0.985 (3H, s, 19-H), 1.055 (3H, s, 18-H), 1.325 (3H, s, 21- H), 3.318 (1 H, dd3, J 3.0 Hz, 3.0 Hz, 6-H), 3.363 (1 H, dd3, J 11.4 Hz, 4.2 Hz,
laar^ aa s, OH), 5.255 (1 H, dd3# J 3.9 Hz, f dc 11.681T (C-4), 12.243Q (C-18), 19.844Q (C-19), 23.604Q (C- 21 ) 63.620T (etilendioxi), 63.733T (eti §tf?dx¡), 73.569D (C-6), 77.478D (C- 5 12), 11.125S (C-20), 118.702D (C-15), 152.912S (C-14).
EJEMPLO 17 20.20-Etilendioxi-14,15ß-epoxi-3a.5-ciclo-5a,14-preqnano-6ß, 12ß-díol (29)
N-bromoacetamida (150 mg, 1.1 mmoles) fue agregada a una solución del 20,20-etilendioxi-3ß,5-ciclo-5ß-pregn-14-eno-6ß,12ß-diol (28) (340 mg, 0.91 mmoles) en acetona (20 ml), agua (0.25 ml) y ácido acético (0.25 ml) a 0°C. Después de 15 minutos, se agregó sulfito de sodio (solución 5%, 20 ml) a la mezcla de reacción. La acetona fue evaporada bajo presión reducida, y la 15 solución restante fue extraída con diclorometano (3 X 30 ml). El estrato de diclorometano fue secado (MgSO ), filtrado y evaporado a un volumen concentrado (50 ml). Se agregó piridina (0.5 ml) a la mezcla y se agitó durante otra hora, después de lo cual el estrato de diclorometano fue lavado con una solución de ácido cítrico (5%, 3 x 30 ml), solución de bicarbonato de sodio 20 saturado (30 ml), y agua (30 ml). El estrato de diclorometano fue secado (MgSO ), filtrado y evaporado y purificado por cromatografía de columna instantánea usando cloroformo-metanol (9.5: 0.5 v/v) como el eluente, para
^ - .y-,~y,..y... ..... ,W J^f^^^^fc-^^á^^^^^^^^Á^ ^. ^^ ff^^ dar el epóxido (29) (180 mg, 51 % corgj ína espuma, (M hallado 390.245, C23H34O2 requiere: M 390.247). f dH 0.287 (1 H, dd3, J 8.1 Hz, 4.9 Hz, 4-Ha), 0.501 (1 H, dd3, J 4.4
Hz, 4.4 Hz 4-Hb), 0.978 (3H, s, 19-H), 1.048 (3H, s, 18-H), 1.321 (3H, s, 21-H), 5 3.318 (1 H, dd3, J 3.1 Hz, 3.1 Hz, 6-H), 3.355 (1 H, dd3, J 11.2 Hz, 4.1 Hz, 12- H), 3.491 (1 H, s, 15-H), 4.001 (4H, m, OCH2Ch2O), 4.901 (1 H, s, OH). dc 11.668T (C-4), 11.973Q (C-18), 19.515Q (C-19), 23.519Q (C- 21), 59.91 OD (C-15), 63.601 T (etilendioxi), 63.713T (etilendioxi), 72.501 S (C- f 14), 73.571 D (C-6), 77.471 D (C-12), 11.085S (C-20). 10 EJEMPLO 18 20.20-Etilend¡oxi-6ß.12ß.14-trihidroxi-3a.5-ciclo-5a.14ß-preqnano (30)
Una solución del epóxido (29) (170 mg, 0.44 mmoles) en f 15 tetrahidrofurano (10 ml) fue agregada a una suspención de hidruro de aluminio de litio (20 mg, 0.53 mmoles) en tetrahidrofurano (5 ml). La mezcla de reacción fue reflujada durante 2 horas, después de lo cual se agregó agua (20 µl) y se continuó la agitación durante 0.5 horas. Se agregó solución de hidróxido de sodio (15%, 20 µl) y se continuó la agitación durante otras 0.5 20 horas. Se agregó otra cantidad de agua (60 µl), y la suspención fue agitada durante 1 hora. Después de la filtración, la suspención fue secada (MgSO4), filtrada y el tetrahidrofurano fue evaporado. La separación cromatográfica instantánea de la mezcla resultante, eluyendo con cloroformo - metanol (9:1
^Mi^^ ^g^¿£^^.^Agl^^^^^LSj? -> íaüs, v/v) dio el triol requerido (30), 0 mgt 53%) como un aceite 392.261 , C23H38O5 requiere: M 39*63).
• dH 0.287 (1 H, dd3, J 8.1 Hz, 4.9 Hz, 4-H2), 0.510 (1 H, dd3, J 4.4 Hz, 4.4 Hz, 4-Hb), 0.971 (3H, s, 19-H), f§f2 (3H, s, 18-H), 1.319 (3H, s, 21- H), 3.321 (1 H, dd3, J 3.0 Hz, 3.0 Hz,1 H), 3.321 (1 H, dd3, J 11.1 Hz, 3.9 Hz, 12-H), 3.561 (1 H, s, OH), 4.084 (4h, m, OCH2Ch2O), 4.671 (1 H, s, OH). dc 11.668T (C-4), 11.971Q (C-18), 19.511Q (C-19), 23.520Q (C- 21 ) 63.612T (etilendioxi), 63.711T (etilendioxi), 73.483D (C-6), 70.051 D (C- 12), 84.307S (C-14), 111.099S (C-20). • 10 EJEMPLO 19 3ß.12ß.14-Trihidroxi-14ß-preqn-5-en-20-ona (15)
Una mezcla de triol (30) (80 mg, 0.20 mmoles) en acetona (20 f 15 ml) y ácido clorhídrico (1 M, 10 ml) fue reflujada a 60°C durante 2 horas. La mezcla de reacción fue enfriada y se agregó solución de bicarbonato de sodio saturado (20 ml). La acetona fue evaporada y el estrato acuoso fue extraído con cloroformo (3 X 20 ml), el estrato de cloroformo fue secado (MgSO ), filtrado y evaporado, para dar los trihidroxi esteroides epiméricos (15a, 15b) 20 (42 mg, 61 %). La separación de la mezcla epimérica (15a, 15b) (15 mg) se logró por separación cromatográfica instantánea usando cloroformo: metanol (9:1 v/v) como eluente, para dar el 17ß-epímero puro (15a), (10 mg), p.f. 224- 229°C (acetona), (lit. 226-223°), (M hallado 348.234, C; 72.32, H, 9.21 % C2?H32O4 requiere: C, 72.38, H 9.26 %, M 348.236), y el 17a-epímero (15B) (3 mg), p.f. 183-191 °C (acetona), (lit 184-t96°C).
3ß,12ß,14-Trih¡droxi-14ß-preqn-5-en-20-ona (15a): dH 0.963 (1 H, s, 19-H), 1.192 (3H, s, 18-H), 2.236 (3H, s, 21-H), 3.325 (1 H, dd3, J 11.2 Hz, 3.9 Hz, 12-H), 3.464 (1 H, s, OH), 3.5140 (1 H, m, 3-H), 3.598 (1 H, dd, 3 J 9.6 Hz, 9.6 Hz, 17-H), 4.255 (1 H, s, OH), 5.383 (1 H, m, 5-H) dc 8.275Q (C-18), 19.414Q (C-19), 24.400T (C-11 ), 24.581T (C-16), 27.443T (C-7) 30.062T (C-2), 32.972Q (C-21 ), 34.543T (C-15), 35.864D (C-8), 36.975S (C-10), 37.337T (C-1 ), 42.144T (C-4), 43.565D (C-9), 55.101 S (C-13), 57.038D (C-17), 71.597 (C-3), 73.558D (C-12), 85.566S (C-14), 122.223D (C-6), 138.932S (C-5), 217.011S (C-20).
3ß.12ß.14-Trih¡drox¡-14ß-preqn-5-en-20-ona (15b): dH 0.996 (1 H, s, 19-H), 1.144 (3H, s, 18-H), 2.221 (3H, s, 21-H),
3.339 (1H, dd3, J 9.4 Hz, 9.4 Hz, 17-H), 3.492 (1 H, m, 3-H), 3.629 (1H, dd3, J
11.1 Hz, 3.9 Hz, 12-H), 3.712 (1 H, s, OH), 4.325 (1 H, s, OH), 5.383 (1 H, m, 5- H). Los ejemplos 20 a 28 ilustran los procedimientos por los cuales se pueden preparar los compuestos intermediarios para formar el primer monosacárido (40).
EJEMPLO 20 Metil-4,6-0-benciliden-a-D-qlucopiranosida (32)
Una mezcla de metil-a-D-glucopiranosida (30 g, 0.15 moles), 5 benzaldehído (70 ml) y cloruro de zinc (20 g) es agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. El producto de reacción es volcado en agua de hielo y la agitación continúa durante 15 minutos. El precipitado blanco se filtra y se lava con dietil éter. El material sólido es agitado con una solución de metabisulfito de sodio (10% sol.) durante 15 minutos, es filtrado y lavado con 10 agua. El material sólido es cristalizado a partir de cloroformo y éter para producir el producto de bencilideno (32) (31 g, 72%).
EJEMPLO 21 Metil-4,6-0-benciliden-2-0-tosil-a-D-qlucopiranosida (33) • 15 Cloruro de p-toluensulfonilo (25 g, 1.2 eq.) en piridina (100 ml) es agregado por goteo a una solución de la bencilideno glucosa (32) (31 g, 0.12 moles) en piridina (100 ml) a 0°C. La reacción es agitada a temperatura ambiente durante 48 horas. Se agrega hielo a la mezcla de reacción. El 20 material sólido blanco resultante es lavado con agua y recristalizado a partir de etanol caliente, para producir la glucosa tosilada (33) (28 g, 60%).
EJEMPLO 22 Metil-4,6-0-benciliden-3-0-metil-a-D-altropiranosida (34)
El tosilato (33) (28 g, 64 mmoles) en una solución de sodio (7 g) 5 en metanol (150 ml) es calentada a 110°C durante 48 horas en un autoclave. El recipiente de reacción es enfriado y se agrega dióxido de carbono sólido a la mezcla de reacción. Después de la filtración, el metanol es evaporado y el material sólido luego es tomado en agua. El estrato acuoso es extraído con cloroformo (X3). El cloroformo es secado (MgSO4), filtrado y evaporado. La
• 10 mezcla cruda es purificada por cromatografía de columna de gel de sílice eluyendo con cloroformo: acetona (9:1 ), para producir la altrosida (34) (10 g, 52%).
EJEMPLO 23 f 15 Met¡l-6-bromo-4-0-benzoil-3-0-met¡l-6-desoxi-a-D-altropiranosida (35)
La altrosida de bencilideno (34) (10 g, 33 mmoles) es agregada a una solución de N-bromosuccinimida (7.6 g) y carbonato de bario (20 g) en tetracloruro de carbono y la mezcla de reacción es reflujada a 75°C durante 3 20 horas. La mezcla de reacción es filtrada y el estrato de tetracloruro de carbono es lavado con agua. El estrato orgánico es secado (MgSO ), filtrado y evaporado, para producir 6-bromo-altrosida (35) (9 g, 69%).
EJEMPLO 24 Metil-4-0-benzoil-3-0-metil-6-desoxi-a-D-altropiranosida (36)
Borohidruro de sodio (18 g) en agua (30 ml) es agregado por goteo a una solución de la bromoaltrosida (35) (9 g, 23 mmoles) y cloruro de níquel (18 g) en etanol (300 ml) a 0°C. La mezcla de reacción es reflujada a 75°C durante 1 hora y luego es filtrada. El etanol es evaporado y el estrato acuoso restante es extraído con cloroformo (X 3). El cloroformo es secado (MgSO ), filtrado y evaporado, para producir la 6-desoxi-altrosida (36) (5 g, 72%).
EJEMPLO 25 4-0-Benzoil-3-0-metil-6-desoxi-aß-D-feniltiopiranos¡da (37)
Feniltiotrimetilsilano (5 ml) y trimetilsililtrifluorometano sulfonato
(2 ml) son agregados a 0°C a una solución de la 6-desoxi-altrosida (36) (5 g, 17 mmoles) en diclorometano (200 ml). La mezcla de reacción es agitada a temperatura ambiente durante 6 horas. Se agrega bicarbonato de sodio saturado a la mezcla de reacción. El estrato de diclorometano es secado (MgSO ), filtrado y evaporado. La mezcla cruda es purificada por cromatografía de columna de gel de sílice, eluyendo con cloroformo: acetona (9:1 ), para producir la aß-feniltioaltrosida (37) (4 g, 63%).
EJEMPLO 26 4-0-Benzoil-3-0-metil-2-fen¡lt¡o-2,6-d¡désoxi-aß-D-fluorocimaropiranosida (38)
Dietilaminosulfurtrifluoruro (0.65 g) es agregado rápidamente a una solución de la ß-feniltioaltrosida (37) (0.5 g, 1.33 mmoles) en diclorometano a 0°C. La reacción es agitada durante 0.5 horas a 0°C y luego se agrega bicarbonato de sodio saturado. El diclorometano es separado del estrato acuoso, secado (MgSO ), filtrado y evaporado, para producir la aß-fluorocimarosa (38) (450 mg, 90%).
EJEMPLO 27 4-0-Benzoil-3-0 -metil-2 -O-t-butildimetilsilil-aß-D-feniltio-altrosida (39)
La 6-desoxi altrosida (37) (5 g) es sililada usando t-butildimetilsililcloruro (3 g) e imidazol (3 g) en piridina (50 ml). La reacción es trabajada mediante extracción con etil acetato, lavado del etil acetato con ácido clorhídrico (6 N), luego con bicarbonato de sodio, y finalmente con agua. El estrato de etil acetato es secado (MgSO ), filtrado y evaporado, para producir la feniltioaltrosida de benzoílo sililada (39) (80%).
EJEMPLO 28 3-0-metil-2-0-t-butild¡metilsilil-aß-D-fen¡ltioaltrosida (40)
La feniltioaltrosida de benzoílo sililada (39) (6 g) es tratada con metóxido de sodio (100 ml) durante 4 horas. El metanol es evaporado y se agrega agua a la reacción. El estrato de agua es acidificado (pH 5, ACOH) y extraído con etil acetato. El etil acetato es lavado con agua, secado (MgSO ), filtrado y evaporado, para producir feniltioaltrosida de metilo sililada (40) (75%). Los ejemplos 29 a 37 ilustran los procedimientos sintéticos por los cuales se pueden preparar los compuestos intermediarios para formar el segundo monosacárido (50).
EJEMPLO 29 1 ,2:5,6-Di-0-isopropiliden-a-D-glucofuranosa (42)
Se agrega ácido sulfúrico (40 ml) por goteo a una solución de a-D-glucosa (41 ) (50 g, 0.28 mol) en acetona (1 I) a 0°C. La mezcla de reacción es agitada durante 24 horas, y luego es neutralizada usando hidróxido de sodio (6 M). La acetona es evaporada y el estrato acuoso es extraído con cloroformo (X2). El cloroformo es secado (MgSO ), filtrado y evaporado. La cristalización a partir de ciciohexano produjo la di-isopropilidenglucosa (42) (41 g, 57%).
^^^^— - j^aaj^^ EJEMPLO 30 1 ,2:5,6-Di-0-isopropiliden-3-0-metil-a-D-qlucofuranosa (43)
La a-glucofuranosa (42) (41 g, 0.16 mol) en tetrahidrofurano (300 ml) es agregada por goteo a una suspensión de hidruro de sodio (5 g) en tetrahidrofurano (200 ml). Después de 0.5 horas, se agrega yoduro de metilo (25 g) en tetrahidrofurano (100 ml) por goteo a la mezcla de reacción, la que luego es agitada durante 24 horas. Se agrega agua a la mezcla de reacción, la que luego es extraída con éter (X 3). El estrato de éter es secado (MgSO ), filtrado y evaporado, para producir la glucosa protegida de metilo (43) (38 g, 83%).
EJEMPLO 31 3-0-Metil-aß-D-qlucopiranosida (44)
El compuesto de diisopropilideno de metilo (43) (38 g, 0.14 mol) es disuelto en ácido acético (50%, 700 ml), y la solución es reflujada durante 18 horas. Después de enfriar el ácido acético es evaporado. El producto crudo es purificado por cromatografía de columna eluyendo con cloroformo: metanol: acetona: agua (70: 27: 2: 1), para producir 3-0-metil-aß-glucopiranosida (44) (13 g, 50%).
EJEMPLO 32 Metil 3-0-metil-aß-D-qlucopiranosida (45)
La 3-0-met?l-aß-glucopiranosida (44) (10 g) es disuelta en metanol (50 ml) y HCl (conc.) (1 ml), y reflujada durante la noche. Se agrega NaHCO3 sólido y la reacción es filtrada. El metanol es evaporado para dar 1 ,3-di-O-metil-aß-D-glucopiranosida (45), (95%).
EJEMPLO 33 Metil 4,6-0-benciliden-3-0-metil-aß-glucopiranos¡da (46)
La glucopiranosida (45) (8 g) es agitada a temperatura ambiente en una solución de benzaldehído (20 ml) y cloruro de zinc (5 g). Después de 24 horas, se agrega hielo y el estrato acuoso es extraído con cloroformo. El estrato de cloroformo es secado (MgSO ), filtrado y evaporado. El benzaldehído es removido por destilación al vacío y el producto es purificado por cromatografía de columna de gel de sílice, eluyendo con acetona: cloroformo (0.5:9.5), para producir benciliden- ß-glucopiranosida (46) (60%).
^?^t mS^SÉ ii^á EJEMPLO 34 Metil 4-0-benzoil-0-metil-6-desoxi-aß-glucopiranosida (47)
El compuesto de bencilideno (46) (5 g) es reflujado a 80°C en una mezcla de N-bromosuccinimida (3.7 g) y carbonato de bario (4 g) en tetracloruro de carbono. Después de 4 horas, la reacción es filtrada y el tetracloruro de carbono es lavado con agua, secado (MgSO4), filtrado y evaporado, para dar el compuesto de bromo (70%). El compuesto de bromo (4.3 g) es disuelto en una solución de etanol (300 ml) y cloruro de níquel (8.6 g) a 0°C. A esta solución, se agrega borohidruro de sodio (8.6 g) en agua (50 ml) por goteo durante un periodo de 15 minutos. La mezcla de reacción es reflujada a 100°C durante 45 minutos, enfriada, filtrada y evaporada. Se agrega cloroformo, y el estrato de cloroformo es lavado con agua, secado (MgSO4), filtrado y evaporado, para dar el azúcar 6-desox¡ (47) (70%).
EJEMPLO 35 4-0-Benzo¡l-3-0-met¡l-1-fenilt¡o-6-desoxi-aß-glucopiranosida (48)
La 6-desoxi glucopiranosida (47) (3 g) es disuelta en diclorometano (50 ml). A esta solución, se agregan feniltiotrimetilsilano (2 g) y trimetilsililtrifluorometanosulfonato (0.2 ml). La solución es agitada a temperatura ambiente durante la noche, después de lo cual se agrega bicarbonato de sodio saturado. El estrato de diclorometano es secado (MgSO ), filtrado y evaporado. El producto es purificado por cromatografía de columna de gel de sílice, eluyendo con etil acetato: hexano (2:8), para dar el compuesto (48) (60%). 5 EJEMPLO 36 4-0-Benzo¡l-3-0-metil-2-0-p¡valoil-1-fenilt¡o-6-desoxi-aß-glucopiranos¡da
A una solución de la glucopiranosida (48) (2 g) en piridina (20 10 ml), se agrega cloruro de pivaloílo (2 ml). La solución es agitada a temperatura ambiente durante la noche, después de lo cual se agrega agua. El estrato acuoso es extraído con etil acetato, y el estrato orgánico es lavado con HCl (6 N). El estrato orgánico es secado (MgSO4), filtrado y evaporado, para dar el éster de pivaloílo (49) (80%). 15 EJEMPLO 37 4-0-Benzoil-3-0-met¡l-2-0-p¡valoil-1-fluoro-6-desoxi-ß-glucopiranos¡da (50)
N-Bromosuccinimida (1.2 g) y dietilaminoazufre trifluoruro (1.2 g) 20 son agregados a una solución del éster de pivaloílo (49) (2 g) en diclorometano (100 ml) a 0°C. Después de 1 hora, se agrega bicarbonato de sodio saturado. El estrato de diclorometano es secado (MgSO ), filtrado y evaporado. La ß-fluoropiranosida (50) es purificada por cromatografía de
fefifeMfeaaa... ^j^^^j^^^^^jg columna de gel de sílice, eluyendo con etil acetato: hexano (2:8), (rendimiento 45%). El ejemplo 38 ¡lustra el procedimiento sintético por el cual se puede preparar el compuesto 3-0-[4-0-benzoil-2-feniltio-ß-D-cimaropiranosil]-12,14ß-dihidroxi-pregnan-5-eno-20-ona (51 ).
EJEMPLO 38 3-0-r4-0-benzoil-2-fenilt¡o-ß-D-cimaropiranos¡n-12,14ß-d¡hidroxi-pregn-5- en-20-ona (51)
Se agrega cloruro de estaño (190 mg, 1 mmol) a una solución de 3,12,14 ß-trihidroxi pregnan-5-eno-20-ona (15) (100 mg, 0.28 mmol) y la fluorocimaropiranosida (38) (210 mg, 0.56 mmol), en dietil éter seco y tamices moleculares de 4 Á a-15°C. La mezcla de reacción se mantiene a -15°C durante 3 días. Se agrega bicarbonato de sodio saturado a la mezcla de reacción. El estrato de éster es secado (MgSO ), filtrado y evaporado. El producto es purificado por cromatografía de columna de gel de sílice, eluyendo con cloroformo: metanol (9.5:0.5), para producir el glicósido (51 ) (30 mg, 15%). Los ejemplos 39 a 41 ilustran los procedimientos sintéticos por los cuales se pueden copular las porciones cimarosa y tevetosa.
EJEMPLO 39 Disacárido tevetosa - cimarosa (53)
Una solución de tevetosa (50 A) (1.5 g), cimarosa (40) (1.3 g) y tamices moleculares 4 Á en diclorometano es agitada a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción es enfriada hasta -15°C, y se agregan cloruro de estaño (II) (0.8 g) y trifluorometanosulfonato de plata (1.1 g). La mezcla es agitada a -15°C durante 16 horas, después de lo cual se agrega trietilamina (0.5 ml). El producto de reacción es filtrado y el diclorometano es evaporado. El disacárido (53) es purificado por cromatografía de columna de gel de sílice, eluyendo con etil acetato: hexano (2:8), rendimiento 15%.
EJEMPLO 40 Disacárido tevetosa - cimarosa (54)
A una solución del disacárido (53) (200 mg) en tetrahidrofurano (20 ml), se agrega fluoruro de tetrabutilamonio (0.4 ml). La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 1 hora, después de lo cual se agrega bicarbonato de sodio saturado. La mezcla de reacción es extraída con etil acetato y el estrato de etil acetato es secado (MgSO4), filtrado y evaporado. El disacárido (54) es purificado por cromatografía de columna de gel de sílice (acetona: cloroformo, 0.5:9.5), rendimiento 60%.
a?¿&fc&¿arffflB«Mr-a EJEMPLO 41 Disacárido tevetosa - cimarosa (55)
• A una solución del disacárido (54) (80 mg) en diclorometano (10 5 ml), se agrega trifluoruro de dietilamino azufre (80 µl) a 0°C. Después de agitar a 0°C durante 0.5 horas, se agregan bicarbonato de sodio saturado y más diclorometano. El diclorometano se seca (MgSO4), se filtra y evapora. La purificación por cromatografía de columna de gel de sílice (etil acetato:hexano,
• 10 1 :9), proporciona el disacárido (55) en un rendimiento del 65%.
EJEMPLO 42
Los resultados de los siguientes tres bioensayos sobre el 15 supresor del apetito se exponen a continuación, a saber a) Test de Irwin; b) Test de Toxicidad Aguda; y c) Test Anorético de Dosis Oral
a) Test de Irwin El propósito de este test fue evaluar el supresor del apetito de la invención producido a partir de un extracto de planta como se describe en la presente, de acuerdo con el test de Irwin de animal reducido para acción sedante y tranquilizante.
** Procedimiento Experimental 5 El supresor del apetito fue extraído de material de planta por el solicitante, mediante el método que se describe en la presente anteriormente, y fue administrado a dos de cuatro grupos de tres animales cada uno; un grupo no recibió tratamiento, un grupo recibió el disolvente dimetiisulfóxido (DMSO), un grupo recibió la muestra del test a 50 mg/kg, y un grupo recibió la 10 muestra del test a 300 mg/kg. El tratamiento se llevó a cabo por inyección intraperitoneal, y las observaciones se hicieron a intervalos específicos hasta cinco horas post-tratamiento. Sólo se usaron los síntomas que no eran los observados en los animales tratados con DMSO, en la interpretación de los resultados. 15 Resultados Resultó claro que el disolvente, DMSO, tuvo un notable efecto en los animales, especialmente en el mecanismo regulador del calor. Las temperaturas corporales de todos los animales tratados con el disolvente, solo 20 o junto con la muestra del test, mostraron una marcada caída. Los animales en el grupo de la dosis baja mostraron una disminuida dispersión en la jaula y una disminuida actividad locomotora, como en todos los otros grupos, incluyendo el grupo de control. La apatía se
^^^ ^ms ^s^^S^^&?^^^f^^^^^Á^^^^^. ^ observó en el mismo grado que en el grupo tratado con DMSO. Se observó una disminuida respiración 15-60 minutos después del tratamiento. También se observó ptosis (cierre de los párpados) a un grado mayor que en el grupo de DMSO. Además se observó una respuesta de pinna (oreja), así como 5 también una respuesta de dedo positiva, indicando miedo. La temperatura corporal cayó a 32.7°C después del tratamiento. Los animales en el grupo de la dosis alta mostraron, como en los otros grupos, una dispersión inicial disminuida en la jaula y una disminuida actividad locomotora, pero exhibieron una incrementada dispersión y actividad
• 10 locomotora antes de la muerte, lo que sucedió aproximadamente 1 hora después del tratamiento. Se produjeron convulsiones simétricas clónicas severas 30 minutos después del tratamiento. La respiración disminuyó inicialmente, pero incrementó antes de la muerte. Una respuesta de pinna
(oreja) fue demorada, y se observó una respuesta de dedo positiva, indicando f 15 miedo, ambas como se observaron en los animales en el grupo de la dosis baja. La temperatura corporal cayó a 30.7°C después del tratamiento. Se observó una incrementada pasividad posicional, así como también un disminuido tono corporal. Se observó una rotación de limbo anormal, la fuerza de asimiento disminuyó, no estuvo presente ninguna respuesta de dolor y se
produjo la pérdida de reflejo de enderezamiento.
^ritwSfrtrih».
Discusión Cuando se compararon con los animales de control y los tratados con DMSO, los animales que recibieron la dosis baja (50 mg/kg) sólo mostraron una respiración disminuida y un grado incrementado de ptosis. Los animales que recibieron la dosis alta (300 mg/kg) de la muestra del test reaccionaron en forma muy intensiva mostrando convulsiones y muerte. Todas las otras observaciones hechas en estos animales pueden ser atribuidas a que los animales estaban con convulsiones y muriéndose. No se observaron signos sugestivos de acciones tranquilizantes y sedantes como
• 10 por ejemplo, una marcada dispersión disminuida en las jaulas, una disminuida actividad y apatía motora en los grupos de prueba que podría deberse a la muestra de prueba. Por lo tanto, puede concluirse que la muestra de prueba es letal en los ratones de 300 mg/kg y que tiene efectos supresores de la respiración
en los ratones de 50 mg/kg, cuando se administra intraperitonealmente con
• DMSO como solvente.
b) Prueba de toxicidad aguda El propósito de esta prueba fue obtener información sobre la 20 toxicidad de la muestra de prueba.
Proceso experimental Se preparó un extracto de planta de acuerdo con la invención de la manera descripta anteriormente, y teniendo una acción supresora del apetito se purificó y se probó una muestra de prueba en dosis en aumento por 5 medio del tratamiento oral en ratones. Se utilizaron dos animales por grupo de dosis, excepto en el grupo de dosis mayor en el que se trató sólo un animal. Los animales fueron examinados en su salud y se determinaron las masas corporales el día del tratamiento. Las dosis estaban dentro de un rango entre 100 mg/kg hasta
• 10 2.028.5 mg/kg. La dosis se calculó y se mezcló en almidón de para preparado, de manera tal que cada animal recibiera una dosis total de 0.2 ml. El animal 13 recibió 0.25 ml. El almidón de papa se preparó mezclando 20 g de almidón en un volumen pequeño de agua fría, y agregándolo al agua hirviendo, para preparar un volumen de 1 litro. La suspensión se dejó enfriar a temperatura 15 ambiente antes de dosificar. • Los animales en grupos de 1 y 2 se trataron el mismo día. Se observaron durante 24 horas y si no desarrollaban signos de toxicidad, se trataba al próximo grupo. Lo mismo se realizó hasta tratar a todos los animales. Este esquema se siguió para asegurar que los animales no eran 20 tratados innecesariamente cuando se había alcanzado una dosis tóxica aguda en el grupo anterior. Se observó a los animales en sus signos clínicos de toxicidad inmediatamente (1-2 horas) después del tratamiento y luego diariamente. La masa corporal se determinó una vez a la semana y se midieron las tomas totales de comida y agua de cada animal. f| Se practicó la eutanasia con los animales sobrevivientes por medio de una inyección intraperitoneal de pentobarbitone sodio 5 (comercialmente disponible con el nombre comercial Euthanaze, CentaurR) el día 14 del experimento se realizó un examen post-mortem en estos animales, así como también sobre el animal que murió durante el experimento. Se recogieron las muestras para histopatología.
• 10 Resultados Grupo 1 (Grupo de Control) No se observaron signos clínicos de toxicidad durante el periodo de observación de 14 días. Las tomas de comida y agua estaban dentro de los parámetros normales. Los cambios en la masa corporal también estaban 15 dentro de los parámetros normales. No se registraron cambios histopatológicos en las muestras del hígado.
Grupo 2 (100 mq/kq) No se observaron signos clínicos de toxicidad durante el periodo 20 de observación. Las tomas de comida y agua fueron normales y los cambios en la masa corporal durante el periodo de observación también fueron normales.
Sá?^^MÜH-ü No se observó ninguna patología macroscópica ni cambios morfológicos en las muestras de hígado.
Grupo 3 (200 mq/kq) Los animales en este grupo no mostraron síntomas clínicos de toxicidad durante el experimento. Las tomas de comida y agua fueron normales, así como también el cambio en la masa corporal. No se observó ninguna patología macroscópica, pero los hígados mostraron cambios histopatológicos al examinarlos. La hinchazón oscura de los hepatocitos fue suave en el animal 6, pero moderada en el animal 5. También ocurrió una degeneración hidrópica moderada en los hepatocitos del animal 5.
Grupo 4 (400 mq/kq) No se observaron signos clínicos de toxicidad durante el periodo de observación y ninguna patología macroscópica se observó durante el examen post-mortem. La hinchazón oscura moderada y los cambios leves hidrópicos de los hepatocitos se observaron en la histología. Las tomas de agua y comida y el aumento en la masa corporal en el animal 7 fueron normales. El animal 8 consumió casi el doble de la toma total de comida del animal 7 (144.6 g y 73.9 g, respectivamente), pero el aumento en la masa corporal fue de sólo 0.81 g comparados con 2.7 g.
Grupo 5 (800 mq/kq) Un animal (el animal 10) murió tres horas después de la dosis sin f mostrar ningún signo específico. El otro animal (animal 9) sobrevivió al periodo de observación completo sin signos de toxicidad. La toma de agua en
el animal sobreviviente fue normal (42.42 ml), mientras que la toma de comida fue alta (134.2 g). La masa corporal aumentó en 2.85 g que fue la mayor en todos los animales en el experimento. En el examen post-mortem del animal 10, que murió poco después de la dosis oral, los pulmones estaban congestionados. No hubo 10 ninguna reacción corporal extraña que podría haber indicado la presencia inhalación del material de prueba. No se observó ninguna patología macroscópica en el animal 9. Se encontró una vacuolización citoplásmica leve (degeneración hidrópica) en el animal 10, pero moderada en el animal 9. El aspecto citoplásmico glandular del hígado fue clasificado como moderado en 15 ambos animales.
Grupo 6 (1 ,600 mq/kq) Ninguno de los animales presentó signos clínicos de toxicidad durante la duración del experimento. No se observó ninguna patología 20 macroscópica en el examen post-mortem, pero se observaron cambios degenerativos moderados en el hígado del animal 11 en el examen histopatológico. El animal 12 mostró una hinchazón oscura y cambios hidrópicos leves de los hepatocitos. Las tomas de comida y agua fueron
á normales, ya que se produjo un aumento en la masa corporal durante el período experimental.
Grupo 7 (3,028.5 mq/kq) Sólo un animal se trató con esta dosis. Este animal no mostró signos de toxicidad durante el período de observación y no se observó ninguna patología macroscópica. En el examen histopatológico, se observó una hinchazón oscura moderada y una degeneración hidrópica de los hepatocitos. El animal mostró una pérdida de masa corporal durante el período de observación (-0.82 g), pero las tomas de comida y agua fueron normales.
Explicación Como se utilizó una cantidad muy pequeña de animales en cada grupo de dosis, es difícil sacar conclusiones. El hecho de que sólo un animal murió con una dosis baja, sin mostrar síntomas, podría indicar que la muerte no estaba relacionada con la muestra de prueba, sino con la tensión durante y/o después del tratamiento. Ningún animal de los grupos de dosis mayores murió o mostró algún signo de toxicidad, hecho que además sostiene esta presunción. La toma de comida aumentada observada en el animal 8 podría posiblemente deberse a un derramamiento excesivo de comida ya que se vio reflejado en un pequeño aumento en la masa corporal. Debe tenerse en
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cuenta que todos los animales en este experimento sólo se trataron una vez y que, es improbable que el supresor de apetito hubiera tenido una influencia f marcada sobre las tomas de comida o agua, o la masa corporal durante un período de 14 días, como sucedió en este experimento. 5 Del examen histopatológico de la muestra de hígado, fue claro que los cambios patológicos estaban relacionados con la dosis, con los animales que reciben dosis mayores que muestran cambios extensivos. La patología observada no era metabólica por naturaleza, sino que posiblemente A estaba inducida por la muestra de prueba. Los cambios eran sólo 10 degenerativos y por lo tanto reversibles. No se observaron signos de cambios hepatocelulares irreversibles. Por lo tanto, puede concluirse que sólo un animal murió con una dosis menor (800 mg/kg), pero la muerte posiblemente no estuviera relacionada con la muestra de prueba. Ninguno de los otros animales en f 15 cualquiera de los grupos de dosis mostró signos de toxicidad durante el período de observación de 14 días después del tratamiento, o murió como resultado del tratamiento. Una dosis oral simple de la muestra de prueba indujo cambios hepatocelulares reversibles relacionados con la dosis.
c) Prueba anoréxica de la dosis oral El propósito de esta prueba era determinar la actividad de un extracto de planta preparado de acuerdo con la invención, y la dosis mínima efectiva y, al mismo tiempo investigar cualquier efecto lateral posible como por
üy¡ ejemplo, supresión respiratoria, como se experimentó en la Prueba Irwin (referida anteriormente).
• Proceso experimental 5 Los animales fueron ubicados en grupos de tratamiento usando tablas aleatorias. Cada grupo de tratamiento estaba formado por tres animales, con 6 animales en el grupo de control. La muestra de prueba fue dosificada para ratas hembra jóvenes con un peso corporal de 100-150 g durante el período de adaptación, durante tres días consecutivos. Los
• 10 animales se identificaron por medio de etiquetas metálicas en las orejas y marcas en la piel con KMnO4 para su identificación fácil. Los animales se hospedaron individualmente en jaulas para roedores de policarbonato estándar, y se les suministró ad libitum pellets para roedores disponibles comercialmente. Las tomas de agua y comida se midieron y calcularon para
cada día. Para poder encontrar la dosis mínima efectiva de la muestra de prueba, se probaron cinco dosis. El tratamiento fue por cebadura oral, con la muestra de prueba suspendida en el almidón de papa. La substancia de prueba era el compuesto (1 ), un polvo granulado blanco preparado con un extracto de un material de planta de acuerdo con la invención, y la cantidad
medida de la muestra de prueba se mezcló con almidón de papa preparado y dosificado. El mezclado con el almidón de papa tuvo lugar inmediatamente antes de la dosificación de cada día. Antes de retirar el volumen de dosis para
cada animal, se mezclaron cuidadosamente las suspensiones utilizando un Vórtice, f Se probó un rango de cinco dosis, con un grupo de control que recibía sólo la substancia portadora. Las dosis se eligieron sobre la base de 5 los efectos observados en la Prueba Irwin anteriormente descripta y fueron: Grupo 1 : 0,00 mg/kg (grupo de control) Grupo 2: 6.25 mg/kg Grupo 3: 12.50 mg/kg ^ Grupo 4: 25.00 mg/kg 10 Grupo 5: 37.50 mg/kg Grupo 6: 50.00 mg/kg
Resultados El tratamiento no afectó la salud de los animales durante el
? 15 período de estudio. Los animales tratados con la muestra de prueba en todos estos grupos de dosis, mostró una ganancia de masa corporal media significativamente reducida durante el período de estudio total, y los animales en tres de cinco grupos de tratamiento realmente perdieron masa corporal. Las tomas de comida media para todos los grupos de 20 tratamiento se redujeron durante el período de estudio. Los animales de grupos de dosis más altas mostraron una aumentado consumo de agua. No se vio afectada la velocidad respiratoria en ninguno de los animales de ningún grupo de dosis.
Los animales en todos los grupos de dosis presentaron hígados desmenuzables en el examen post-mortem, pero no se observó ninguna f patología macroscópica.
Explicación Los datos recogidos durante el período de adaptación confirmaron que todos los animales incluidos en el experimento estaban saludables y se comparó la ganancia de masa corporal entre los animales.
• La reducción, y en algunos animales la pérdida de la ganancia
de masa corporal, en combinación con la toma de comida reducida es fuertemente indicativa de la supresión del centro del apetito. La toma de comida reducida y la ganancia de masa corporal reducida se experimentó incluso con el grupo de dosis menor (6.25 mg/kg). La pérdida total en la masa corporal se experimentó en el grupo de 12.50 mg/kg. f 15 Es importante notar que todos los grupos de tratamiento tuvieron un consumo de agua aumentado cuando disminuía el consumo de alimentación (figura 2), esto se debería a un efecto diurético de la muestra de prueba, o a la estimulación del centro de la sed en el cerebro. El hecho de que no ocurría supresión respiratoria como se había
observado en la prueba de toxicidad aguda referida anteriormente, con la vía intraperitoneal, es considerado un aspecto positivo. Esto podría deberse a una absorción reducida del tracto gastrointestinal, con una consecuente biodisponibilidad reducida. La biodisponibilidad de las dosis orales probadas fue, sin embargo, suficiente para que la muestra de prueba sea efectiva. Una leve reducción en la velocidad respiratoria 1 hora después del tratamiento en la mayoría de los grupos se debe al llenado del estómago con el volumen de la dosis y la consecuente pasividad de los animales. 5 Los hígados desmenuzables observados en los grupos de tratamiento podrían deberse aun cambio en el metabolismo de energía secundario a la toma de comida reducida, provocando un metabolismo de grasas aumentado y una sobrecarga sobre el hígado. Si este era el caso, se podría posiblemente considerar a estos cambios como transitorios que se
recuperarían con el tiempo después de haber alcanzado un estado estable, o después de la remoción de la muestra de prueba. El efecto posible sobre el hígado también necesita otra investigación. Como este estudio estaba orientado primariamente como prueba de clasificación, se utilizaron pequeños grupos de animales de prueba. Esto
hace que la interpretación estadística de los datos sea difícil, especialmente cuando los animales individuales reaccionan totalmente de manera diferentes. Sin embargo, los datos indican que la muestra de prueba tiene una acción supresora del apetito, incluso en la dosis menor probada (6.25 mg/kg). No ocurrieron signos de supresión respiratoria en las dosis probadas.
^^^^^^^^^^^t^^ S^.^^^mgm^gm^mgm^]^^á^^^S^ss^S iá^^^ EJEMPLO 43
Las plantas Hoodia cosechadas recibas tanto el entorno natural como a través de un programa de cultivo se almacenan primero a 4°C durante 5 un máximo de 48 horas. Las plantas se lavaron con agua corriente y luego se cortaron en tiras de ± 1 cm. Las tiras se combinaron y luego se prensaron por medio de una prensa hidráulica a 300 bar de presión durante un mínimo de 0.5 horas por cada prensado. Durante el prensado se recogió separadamente la savia de la planta. La savia se almacenó a -18°C hasta el próximo
• 10 procesamiento. La savia se secó por pulverización bajo condiciones adecuadas para obtener un polvo de libre fluido.. El contenido de humedad en el polvo preferentemente era menor al 5% después de secar por pulverización y, si fuera necesario se secó en un horno de vacío o utilizando un secado de lecho
fluido. • Tanto la savia como el material secado por pulverización demostraron ser efectivos como supresor del apetito en los ensayos biológicos en las ratas.
Parte experimental 50 kg de plantas de Hoodia gordonii se lavaron con agua de la canilla y luego se cortaron en rodajas de 1 cm. Las plantas cortadas luego se prensaron por medio de una prensa hidráulica a 300 bar durante un mínimo
.Mft?tj ^^^^^^^^^ tasa» y T^^e^? de 0.5 horas por lote. Se recogió la savia y la masa fue de 10 kg cuando se utilizaron las plantas de Hoodia gordonii del entorno, y de 20 kg cuando se usaron las plantas de Hoodia gordonii del programa de cultivo. La savia (500 g) se secó por pulverización usando las siguientes condiciones: Velocidad de fluido 2.85 ml/min Temperatura de entrada : 110°C Temperatura de salida 70°C Temperatura de cámara : 78°C El polvo secado por pulverización obtenido fue un polvo de libre fluido (22 g) con un contenido de humedad del 6.9%. El polvo secado por pulverización se analizó para la concentración de ingrediente activo usando las técnicas HPLC. La concentración del activo se determinó en 13 g/kg del polvo secado por pulverización.
Método de análisis HPLC Eluyente Acetonitrilo ¡socrático: agua (7:3), Columna fase inversa C-18 Absorbencia de UV 225 nm Velocidad de fluido 1 ml/min Volumen de inyección 10µl
Método Se disolvió el polvo secado por pulverización (10 mg) en agua (0.5 ml) y acetonitrilo (0.5 ml), 10 µl de esta solución se inyectaron en el HPLC y la concentración del compuesto activo (1 ) fue determinada usando una 5 curva estándar que se preparó del compuesto puro (1 ).
EJEMPLO 44
Los resultados de un estudio diseñado para clasificar los efectos
• 10 anoréxicos posibles del compuesto (1) en la rata se presentan más adelante. A continuación, las muestras probadas son de savia pura (muestra 1 ), savia secada por pulverización (muestra 2) y una porción activa (muestra 3). Las muestras 1 y 2 son de savia y de savia secada por pulverización respectivamente, como describimos en el ejemplo 43 anterior. La muestra 3 15 es un compuesto extraído del solvente (1 ) de una pureza de = 95%. • Las muestras 1 a 3 fueron cada una administrada como dosis oral simple a las ratas macho Winstar. Dos grupos de control adicionales recibieron un vehículo (agua destilada o DMSO). Se incluyó la fenfluramina administrada oralmente (7.5 mg/kg) como estándar de referencia. 20 La muestra 1 (savia pura) administrada oralmente, produjo reducciones dependientes de la dosis en el consumo de comida que fueron estadísticamente significativas en dosis de 1.600 mg/kg y mayores cuando se las comparó con los controles tratados con vehículos. Las reducciones
--$> * concomitantes en el peso corporal (o velocidad de crecimiento) también se registraron. El día de la dosis, se registraron aumentos estadísticamente f significativos en el consumo de agua 3 horas después de la dosis (6.400 y 10.00 mg/kg) y 6 horas después de la dosis (10.000 mg/kg). Se registraron, 5 entre 24 y 48 horas después de la dosis, reducciones estadísticamente significativas en el consumo de agua en dosis de 3.200 mg/kg y mayores. La muestra 2 (savia secada por pulverización) administrada oralmente a 76 mg/kg también produjeron reducciones estadísticamente significativas en el consumo de agua y en el peso corporal cuando se la
• 10 compara con los animales tratados con un vehículo. No se registraron efectos estadísticamente significativos en el consumo de agua. La muestra 3 (porción activa) produjo reducciones estadísticamente significativas en el consumo de comida a una dosis oral de 5.0 mg/kg. No se produjeron efectos estadísticamente significativos sobre los 15 pesos corporales por medio de la porción activa a pesar de que el examen de los datos reveló un leve retardo en el crecimiento cuando se los comparó con los animales de control tratados con un vehículo. No se registraron efectos estadísticamente significativos en el consumo de agua. El estándar de referencia, la fenfluramina (7.5 mg/kg); produjo
reducciones estadísticamente significativas en el consumo de comida 6 y 24 horas después de la dosis cuando se lo comparó con el grupo de control tratado con un vehículo relevante. No se registraron efectos estadísticamente significativos en el consumo de agua o peso corporal.
No se registraron efectos relacionados con el tratamiento en los
hígados.
• SUBSTANCIA DE PRUEBA
Proceso experimental 15 Se utilizaron cincuenta y cinco ratas macho Wistar para el estudio. Se registraron los pesos corporales, el consumo de comida (peso del tanque alimentador) y el consumo de agua (peso de la botella) diariamente al mismo tiempo cada día desde el día de llegada hasta la 20 culminación del estudio. El primer día, las ratas recibieron una dosis oral simple (cebadura) de acuerdo con la siguiente tabla: •
Los grupos 1-8 fueron dosificados usando un volumen de dosis 10 constante de 10 ml/kg y los grupos 9-12 fueron dosificados usando un volumen de dosis de 1 ml/kg. También se midió el consumo agua a la primer, tercer y sexta hora después de la dosificación del día 1. Luego de las mediciones del día 8, se mató a los animales por 15 medio de la asfixia con dióxido de carbono, y se seccionaron los hígados y se
• colocaron en formalina regulada al 10%, antes de la histología. Las secciones de cera de parafina de cada hígado se tomaron a 4-5 µm y se tiñeron con hemotoxilina y eosina. Las secciones adicionales se cortaron sobre un crióstato a 12 µm y se mancharon con Rojo Aceitoso O 20 (ORO) para grasa.
Análisis de datos Las mediciones del consumo de comida y agua post-dosis y los pesos corporales en cada punto en el tiempo para los animales tratados con P57, se compararon con aquellos del grupo de control tratado similarmente con el vehículo usando el análisis de variación seguido por la prueba de Williams para realizaron comparaciones con los controles. Los datos para los animales tratados con fenfluramina se comparó con los datos del grupo de control tratado con un vehículo usando la prueba Student.
Resultados Los resultados se resumieron en las tablas. La muestra 1 (savia pura) administrada oralmente produjo reducciones marcadas relacionadas con la dosis en el consumo de comida diario. La duración y amplitud de estas reducciones en el consumo de comida dependían de la dosis. A las 24 horas después de la dosis, la muestra 1 (savia pura) produjo reducciones estadísticamente significativas en el consumo de comida en dosis de 1 ,600 mg/kg y mayores cuando se la compara con los controles tratados con vehículos. La dosis mayor de la muestra 1 (savia) (10,000 mg/kg) produjo reducciones estadísticamente significativas en el consumo de comida sobre una base diaria hasta 5 días después de la dosis. La muestra 2 (savia secada por pulverización) y la muestra 3 (porción activa) produjo reducciones marcada, estadísticamente significativas en el consumo de comida en dosis orales de 76 y 5.0 mg/kg, respectivamente. En ambos casos los efectos duraron 48 horas después de la dosis. El estándar de referencia, la fenfluramina (7.5 mg/kg, p.o) produjo reducciones estadísticamente significativas en el consumo de comida 5 a 6 y 24 horas después de la dosis cuando se lo comparó con el grupo de control tratado con vehículo (grupo 12). La muestra 2 (savia secada por pulverización) y la muestra 23
(porción activa) no produjo efectos marcados, relacionados con la dosis sobre
A el consumo de agua. El día de la dosis, la savia pura produjo aumentos
estadísticamente significativos en el consumo de agua 3 horas después de la dosis (6,400 y 10,000 mg/kg) y 6 horas después de la dosis (10,000 mg/kg). Dos días después de la dosis, sin embargo, se registraron aumentos estadísticamente significativos en el consumo de agua en los animales que recibieron la muestra 1 (savia) a 3,200, 6,400 y 10,000 mg/kg. Estas f 15 reducciones, sin embargo, no estaban claramente relacionadas con la dosis y sólo ocurrieron entre 1 y 2 días después de la dosis. La importancia biológica de estos efectos por lo tanto, permanece poco clara. La muestra 1 (savia pura) produjo efectos estadísticamente significativos relacionados con la dosis sobre los pesos corporales cuando se 20 la compara con el grupo de control tratado con vehículo (grupo 1 ). Cuando se administra oralmente en dosis de 3.200 mg/kg o mayores, la muestra 1 (savia pura) produjo reducciones estadísticamente significativas en el peso corporal o velocidades de crecimiento disminuidas cuando se la compara con los
"á^-tí*- : ifeiafaL^a-y- animales tratados con un vehículo. Estos efectos fueron estadísticamente significativos desde las 48 horas después de la dosis hasta el final del estudio. La muestra 2 (savia secada por pulverización) que se administro oralmente a 76 mg/kg también produjo reducciones estadísticamente significativas en el crecimiento de los animales cuando se la comparó con el grupo de control tratado con vehículo (grupo 1 ). Estos efectos fueron estadísticamente significativos el día 3 (48 horas post-dosis) y 5 inclusive. A pesar de que la muestra 3 (porción activa) pareció retardar el crecimiento de los animales con la dosis mayor (5.0 mg/kg) cuando se comparó con el grupo de control tratado con vehículo (grupo 12), este efecto no fue estadísticamente significativo. La fenfluramina, (7.5 mg/kg) no produjo efectos marcados o estadísticamente significativos sobre el consumo de agua o los pesos corporales cuando se la comparó con el grupo de control tratado con vehículo (grupo 12). No se registraron efectos relacionados con el tratamiento en los hígados.
áSsárf ^ ^j ^ ^^«j«j ¡ ^g g£& CUADRO 1a Efectos de la administración oral en el consumo de comida en las ratas (datos diarios pre-dosis) o vO ds Desviación estándar
•
CUADRO 1b Efectos de la administración oral en el consumo de comida en las ratas (datos diarios post-dosis)
ds Desviación estándar Los grupos 2-8 se compararon con el grupo 1 con vehículo: *Pt < 0.05J** Pt<0.01. Los grupos 9-11 se compararon con el grupo 12 con vehículo: *Pt < 0.05J** Pt<0.01.
CUADRO 2a Efectos de la administración oral en el consumo de comida en las ratas (datos diarios post-dosis) ds desviación estándar
CUADRO 2b Efectos de la administración oral en el consumo de comida en las ratas (datos diarios post-dosis)
N5
ds Desviación estándar Los grupos 2-8 se compararon con el grupo 1 con vehículo: *Pt < 0.05 Los grupos 9-11 compararon con el grupo 12 con vehículo (sin diferencias significativas)
CUADRO 3a Efectos de la administración oral en el consumo de comida en las ratas (datos diarios post-dpsis)
? ds Desviación estándar
CUADRO 3B Efectos de la administración oral en el peso corporal en las ratas (datos diarios post-dosis)
ds Desviación estándar Los Grupos 2-8 se compararon con el Grupo 1 con vehículo: *Pt << 0.05, 0.01
Los Grupos 9-11 se compararon con el Grupo 12 con vehículo (sin diferencias significativas)
Ol
Informe de hispatoloqía El examen histopatológico se restringió al hígado. No se detectaron cambios relacionados con el tratamiento para la Muestra 1 (líquido), la Muestra 2 (savia secada por pulverización), Muestra 3 (porción activa), fenifluramina o grupo de control DMSO. Los hallazgos registrados eran de incidencia similar a los grupos de control y los grupos tratados.
CUADRO
Resumen de incidencia patalógica microscópica
CUADRO CONTINUACIÓN
03
CUADRO CONTINUACIÓN
vO
EJEMPLO 45
A continuación se describe otro bioensayo, que se utiliza en las mismas muestras de prueba a las descritas en el Ejemplo 44. Los animales de 5 este estudio recibieron una dieta restringida por ejemplo, los animales sólo recibieron comida entre las 12:00 y las 3:00 p.m. diariamente. Esto es diferente de todos los otros ensayos biológicos llevados a cabo hasta aquí, en los que la comida estaba disponible para las ratas at. lib. Los animales se ^ aclimataron durante un período de siete días (días-7 hasta-1 ), la dosis se dio 10 desde el día 0 hasta el día 6 a las 9:00 por medio de la cebadura oral. El período de recuperación fue de entre 7 y 13 días. Los grupos de dosis se describen en el Cuadro 1 más adelante. Debe notarse que el grupo de control real está etiquetado como Grupo 09. El grupo 5 es un grupo controlado que recibió una dieta equivalente a la del Grupo 4. El propósito de este grupo fue f 15 evaluar el efecto que tiene una dieta restringida sobre la vida de los animales.
Resultados Los resultados generados durante el estudio mostraron que el período de adaptación era demasiado corto. Las ratas se alimentaban 20 principalmente durante la noche y tenían un cambio repentino con un acceso restringido a la alimentación durante 3 horas al día. La toma diaria de alimentación era incluso mayor en la mayoría de los grupos al final del período de adaptación cuando se iniciaba la dosis con los productos de prueba. Como
k^s^^^g^^^^^^^feSg ^^^^^^^^gí^g^^^ resultado de esto, el efecto de los materiales de prueba no afectaron significativamente la toma de alimentos de las ratas durante el período de dosificación. Las masas corporales medias para los diferentes grupos desde 5 el día-7 hasta el día-1 y para los días 0 hasta 6 se ilustran en el Cuadro D1 y en el Cuadro D2. El efecto de las diferentes dosis de la savia y de la savia secada por pulverización se ilustra en los gráficos que acompañan a esta descripción como un cambio porcentual en la masa corporal desde el día 0 hasta 7 (Figura 5), y cambio porcentual en la masa corporal el día-7 al 7 10 (Figura 6). La pérdida en la masa corporal está claramente relacionada con la dosis especialmente con las dosis mayores. El examen hidropatológico de los hígados no mostraron ninguna patología significativa en los grupos que reciben a los productos de prueba.
Comida • El consumo de comida se midió diariamente, durante la adaptación y durante el estudio. La comida está disponible durante un período de alimentación de 3 horas diarias, comenzando a las 12:00 y terminando a las 15:00. Los animales ayunaron durante el resto del tiempo. Los animales
en el Grupo 5 recibieron comida en cantidades medidas en el Día 1 , equivalente al consumo alimentario promedio del Grupo 4 en el Día 0. Este diseño de alimentación controlada para el Grupo 5, determinado del consumo
^*^^^^^^^^^^^^fe^« ^^-^^^^^^^^ i&^&^^.^ de comida promedio del Grupo 4 del día anterior, se siguió durante los Días 1- 7.
• Agua 5 Se proporcionó agua en envases estándar. El agua (Magalies
Water Board Tap Water, adecuada para el consumo humano) estaba disponible ad libitum. El consumo de agua se midió una vez por día, a la misma hora cada día, después de la determinación del consumo de comida.
• 10 Adaptación Los animales se adaptaron durante siete días antes del inicio del estudio, tiempo durante el cual se determinó el consumo de comida y agua como describimos anteriormente. Las masas corporales se determinaron sobre una base diaria durante este período.
•
Diseño y procesos del estudio
"Hf CUADRO 1 DISEÑO DEL ESTUDIO
Vía de administración 15 Los productos de prueba se administraron sobre la base diaria
• durante siete días, usando una aguja intragástrica. Los animales ayunaron durante 18 horas antes de la administración del producto (comenzando a las 09:00).
Duración del tratamiento Los animales se trataron durante siete días consecutivos (desde el día 0 - día 6). Tres animales de cada grupo fueron sacrificados 24 horas después de la última dosis. (Día 7). Los tres animales restantes se sacrificaron
-^--^^•^ 7 días después del último tratamiento (Día 13). Este proceso se siguió para todos los grupos excepto el Grupo 5 en el que se sacrificaron tres animales 24 horas después de la última alimentación controlada (Día 8), los tres animales restantes se sacrificaron 7 días después del último tratamiento (Día 5 13).
Masas corporales Las masas corporales se determinaron diariamente, a aproximadamente el mismo momento cada día durante la duración del 10 estudio, incluyendo el período de adaptación.
Eutanasia Se sacrificaron tres animales de cada grupo 24 horas después de la última dosis (Día 7). f 15 Los tres animales restantes se sacrificaron 7 días después del último tratamiento. Este proceso se siguió para todos los grupos excepto para el Grupo 5 en el que se sacrificaron tres animales 24 horas después de la última alimentación controlada (Día 8), se sacrificaron los tres animales restantes 7 días después del último tratamiento (Día 13). Se les practicó la 20 eutanasia a los animales al final del período de estudio con gas de CO2
¿^¡M^É Exámenes oftalmoscópicos Los exámenes oftalmoscópicos, usando un oftalmoscopio, se hicieron antes de la primer administración del producto de prueba y al final, en todos los animales de todos los grupos. 5 Patología macroscópica Se realizó un examen completo post mortem de cada animal al que se le practicó la eutanasia al final del período de estudio.
Histopatoloqía Se realizó el examen de histopatología en el hígado de cada uno de los animales.
•
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^I^^^^^^^g^^^^g^^^^^^^^^^ CUADRO D1 MASAS CORPORALES MEDIAS/GRUPO/SEMANA K3 o
CUADRO D2 MASAS CORPORALES MEDIAS/GRUPO/SEMANA (CONTINUACIÓN)
CUADRO D3 MASAS CORPORALES MEDIAS/GRUPO/SEMANA (CONTINUACIÓN) 00
Muestra 1
GRUPO 5: CONTROL: OPCIÓN ELGA 4 AGUA PURIFICADA: TOMA DE COMIDA RESTRINGIDA
Leyendas: C: Congestión HHD: hinchazón de célula hidrotópica difusa HHF: hinchazón de célula hidrotópica focal SLP: sin lesiones parenquimales MLM: moretón linfocitico mínimo 1 + = leve 2+ = moderado 3+ = severo
^^^g¡teg g| i CUADRO 2 EVALUACIÓN HISTOLOGÍA DE LAS SECICONES DE HÍGADO DE RATAS
• MACHO Muestra 2
•
•
GRUPO 9: CONTROL OPCIÓN OLGA 4 AGUA PURIFICADA
Leyendas:
C: Congestión
0 HHD: hinchazón de célula hidrotópica difusa
HHF: hinchazón de célula hidrotópica focal
SLP: sin lesiones parenquimales
MLM: moretón linfocito mínimo
1 + = leve
2+ = moderado
3+ = severo
No se registraron lesiones específicas en las secciones del hígado de las ratas experimentales que recibieron la savia congelada así como también la savia secada por pulverización que pudieran ser atribuidas a 0 la administración oral de los químicos anteriores mencionados. La hinchazón
?* gs ^¿íá¡¡^M¡ celular hidrópica registrada tanto en las ratas de control como en las ratas experimentales pueden indicar una hinchazón celular metabólica y cambios anóxicos normales. El foco mínimo de moretón perivascular linfocítico se encontró en algunos animales y, más probablemente sería una observación incidental. En algunas pocas ratas, estaba presente una congelación leve en las sinusoides hepáticas y esto debe considerarse como una observación incidental.
Una caracteristicas importante de la ¡nvención ilustrada por los resultados de este estudio es que no se desarrolló ninguna tolerancia a cualquiera de las muestras durante el periodo de prueba, esto puede proporcionar un beneficio considerable, particularmente con respecto al uso de los compuestos, y composiciones de la invención en le tratamiento de la obesidad.
Mientras que los compuestos y composiciones de la invención han sido primariamente descritas con respecto a sus propiedades como supresores del apetito, debe notarse que esta expresión -"supresor del apetito" - se usa aquí para denotar una actividad que tiende a limitar el apetito y/o aumento de la sensación de saciedad, y de esta manera, tiende a reducir la toma de calorías totales; esto a su vez, tiende a contrarrestar la obesidad. De acuerdo con esto, la invención se extiende a un método para tratar, prevenir o cambiar la obesidad en humanos o animales no humanos que comprende administrar dicho humano o animal no humano una cantidad para el tratamiento, prevención o para combatir la obesidad del compuesto de la
s&»« fórmula (2). Una realización preferida de este aspecto de la invención utiliza una composición o un extracto que contiene un compuesto de la fórmula (1). f El término "animal" tal como se usa aquí se extiende a, pero no está restringido a, animales de compañía1, por ejemplo, mascotas hogareñas y 5 animales domesticados; los ejemplos no limitantes de estos animales incluyen a ganado, ovejas, hurones, cerdos, camellos, caballos, pollos, peces, conejos, cabras, perros y gatos. Como agente anoréxico o para el tratamiento o prevención de la obesidad en un humano, un compuesto de la fórmula (2), preferentemente de
• 10 la fórmula (1 ), o la composición definida en cualquiera de las Reivindicaciones
9 y 25-31 , se administra ventajosamente a dicho humano en una cantidad de dosis de entre alrededor de 0.01 mg/kg/día hasta alrededor de 10 mg/kg/día. Una dosis preferida está dentro del rango entre 0.05 mg/kg/día. Cuando se usa la forma en polvo secado por pulverización del extracto de esta invención, 15 el rango de dosis preferido es entre 0.1 mg/kg/día hasta 20 mg/kg/día; especialmente preferido es el rango entre 0.5 mg/kg/día.
Claims (4)
- NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un procedimiento para preparar un extracto de una planta del género Trichocaulon o del género Hoodia, el extracto comprende un agente supresor del apetito, caracterizado porque incluye los pasos de tratar el material recogido de la planta con un solvente para extraer una fracción que tiene una actividad supresora del apetito, separa la solución de extracción y recuperar al extracto. 2.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque la planta del género Trichocaulon se selecciona de las especies Trichocaulon piliferum y Trichocaulon officinale y la planta del género Hoodia se selecciona de las especies Hoodia currorii, Hoodia gordonii y Hoodia lugardii. 3.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , o la Reivindicación 2 que incluye el paso de concentrar el agente activo en el material extraído por medio de otra extracción con un solvente. 4.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , la Reivindicación 2 o la Reivindicación 3 caracterizado porque el solvente en el paso o pasos de extracción del solvente es un o más de: cloruro de metileno, agua, hexano, etil acetato o sus mezclas. j¡g»^^^í¡g¡¡^^^^^^i^^ ^ ^¡^^^^^ 5.- Un procedimiento de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4 inclusive que incluye el paso de concentrar el agente f activo en el material extraído por medio de separación cromatográf ica. 6.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 5 5 caracterizado porque la separación cromatográfica utiliza uno o más de: cloroformo, metanol, etil acetato, hexano o sus mezclas como un eluyente. 7.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 5 o la Reivindicación 6 caracterizado porque incluye llevar a cabo la separación A cromatográfica en una columna, recogiendo el eluato en fracciones de la 10 columna, evaluando las fracciones para determinar su actividad supresora del apetito, y seleccionando al menos una fracción que contiene al agente supresor del apetito. 8.- Un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque el extracto está procesado 15 para formar un polvo de libre fluido. 9.- Un extracto caracterizado porque comprende un agente supresor del apetito cuando se produce por medio de un procedimiento de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes. 10.- Una composición que tiene una actividad supresora del 20 apetito caracterizada porque comprende al extracto reivindicado en la Reivindicación 9. j»-<s.. &&¡¡waasfc 11.- Una composición de conformidad con la reivindicación 10 caracterizada porque se mezcla con un excipiente farmacéutico, diluyente o portador. 12.- Una composición de conformidad con la reivindicación 10 o en la Reivindicación 11 caracterizada porque se prepara en una forma de dosis unitaria. 13.- El uso de un extracto de conformidad con la reivindicación 9 que tiene una actividad supresora del apetito en la fabricación de un medicamento para suprimir el apetito en un humano o animal. 14.- El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 10, reivindicación 11 , o reivindicación 12 en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito en un humano o animal. 15.- Un procedimiento para preparar un extracto de una planta del género Trichocaulon o del género Hoodia, el extracto comprende un agente supresor del apetito, caracterizado porque incluye los pasos de prensar el material de la planta para separar la savia del material de planta sólido y recuperar la savia libre del material de planta sólido para formar el extracto. 16.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 15 caracterizado porque el extracto se secó para formar un polvo de libre fluido. 17.- Un extracto que comprende a un agente supresor del apetito cuando se produce por medio de un procedimiento de conformidad con la reivindicación 15 o en la Reivindicación 16. *-*--*—•*» — - fetasiaáiife^^ 18.- Una composición que tiene actividad supresora del apetito que comprende al extracto de conformidad con la reivindicación 17. 19.- Una composición de conformidad con la reivindicación 18 caracterizada porque se mezcla con un excipiente farmacéutico, diluyente o portador. 20.- Una composición de conformidad con la reivindicación 18 o en la Reivindicación 19 caracterizada porque se prepara en una forma de dosis unitaria. 21.- El uso de un extracto de conformidad con la reivindicación 18 que tiene actividad supresora del apetito en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito en un humano o animal. 22.- Un extracto de conformidad con la reivindicación 17 caracterizado porque tiene actividad supresora del apetito. 23.- El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 18, reivindicación 19, o reivindicación 20 en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito en un humano o animal. 24.- Un extracto que se obtiene de una planta del género Trichocaulon o del género Hoodia caracterizado porque comprende a un agente supresor del apetito que tiene la fórmula .j^^.,^ . .*,. ,,. - . , ^ - _ .„„. A&3 i¡SaÉÉ¡g^iiBha ^ (D 25.- Un extracto de conformidad con la reivindicación 24 caracterizado porque la planta del género Trichocaulon se selecciona de las 10 especies Trichocaulon piliferum y Tnchocaulon officinale y la planta del género Hoodia gordonii y Hoodia lugardii. 26.- Un extracto de conformidad con la reivindicación 25 caracterizado porque han sido removidas sustancialmente todas las impurezas no-activas. 15 27.- Un extracto de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 24 hasta 26 inclusive caracterizado porque ha sido procesado hasta un polvo de libre fluido. 28.- Una composición que tiene actividad supresora del apetito caracterizada porque comprende el extracto de conformidad con cualquiera 20 de las Reivindicaciones 24 hasta 27 inclusive. 29.- Un extracto de conformidad con la reivindicación 28 caracterizado porque está mezclada con un excipiente farmacéutico, diluyente o portador. 30.- Una composición de conformidad con la reivindicación 28 o la Reivindicación 29 caracterizada porque se prepara en forma de dosis unitaria. 31.- El uso de un extracto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 hasta 27 en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito en un humano o animal. 32.- El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 28, la Reivindicación 29 o la Reivindicación 30 que tiene actividad supresora del apetito en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito en un humano o animal. 33.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural general ( 2 ) en la que R = alquilo; Ri = H, alquilo, tigloilo, benzoilo, o cualquier otro grupo éster orgánico; R2 = H, o uno o más de carbohidratos 6-deoxi, o uno o más de carbohidratos 2,6-dideoxi, o moléculas de glucosa, o sus combinaciones; y en la que las líneas de puntos indican la presencia opcional de otro enlace entre C4-C5 o C5-C6. *- ^g- fa&^^j^^sas 34.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 33 caracterizado porque existe un enlace entre C5-C6, R = metilo, Ri = tigloilo, R2 = 3-0[-ß-Dtevetopiranosil-(1 ?4)-ß-D-cimaropiranosil-(1 ?4)-ß-D- cimaropiranosil], el compuesto tiene la fórmula estructural (1 ) 35.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural general: 20 en la que R = alquilo; y Ri = H, alquilo, benzoilo o cualquier otro grupo éster orgánico. 36.- Un compuesto que tiene la formula estructural general Mt¿??fft'Tr»-'»-*™- -" -'--JTtfíimi?ftiTi'fT-f*--'-'--* ---*- •"- •^.^^^^^r^t^^^^^g^^ ^^,. en la que R = alquilo; y Ri = H, alquilo, tigloilo, benzoilo o cualquier otro grupo éster orgánico. 37.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural general: en la que R = alquilo; y Ri = H, alquilo, tigloilo, benzoilo, o cualquier otro grupo de éster orgánico. 38.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural general: en donde R = alquilo; y R1 = H, alquilo, tigloilo, benzoilo, o cualquier otro grupo éster orgánico. 10 39.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural general: 15 ( 7 ) en la que R = alquilo; y Ri = H, alquilo, tigloilo, benzoilo, o cualquier otro grupo de éster orgánico. 40.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural general: ^^^^^-^^^^s^^^.^^^¿^^al&^^?^^^^ en la que R = alquilo; y Ri = H, alquilo; tigloilo, benzoilo, o cualquier otro grupo de éster orgánico. R2 = H, o uno o más de carbohidratos 6-deoxi, o uno o más de carbohidratos 2,6-dideoxi, o moléculas fe" glucosa, o sus combinaciones y en la que las líneas de puntos indican la presencia opcional de otro enlace entre C4-C5-C6. 41. - Un compuesto que tiene la fórmula estructural general ( 9 ) en la que R = alquilo; y Ri = H, alquilo, tigloilo, benzoilo, o cualquier otro grupo 15 de éster orgánico; R2 = H, o uno o más 6-deoxi carbohidratos, o uno o más 2,6-dideoxi carbohidratos, o moléculas de glucosa, o sus combinaciones de las mismas; Y en el cual líneas punteadas indican la presencia otros enlaces entre C4-C5 o C5-C6. 42.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural general: gaa ( 10 ) en la que R = alquilo; y Ri = H, alquilo, tigloilo, benzoilo, o cualquier otro grupo 10 de éster orgánico; R2 = H, o uno o más 6-deoxi carbohidratos, o uno o más 2,6-dideoxi carbohidratos, o moléculas de glucosa, o sus combinaciones de las mismas; Y en el cual líneas punteadas indican la presencia otros enlaces entre C4-C5 o C5-C6. 43 - Un compuesto que tiene la fórmula estructural general: ( 11 ) en la que R = alquilo; y Ri = H, alquilo, tigloilo, benzoilo, o cualquier otro grupo de éster orgánico; R2 = H, o uno o más 6-deox? carbohidratos, o uno o más 2,6-dideoxi carbohidratos, o moléculas de glucosa, o sus combinaciones de las mismas; Y en el cual líneas punteadas indican la presencia otros enlaces entre C4-C5, C5-C6 o C14-C15. 44.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural general: ( 12 ) en la que R = alquilo; y Ri = H, alquilo, tigloilo, benzoilo, o cualquier otro grupo de éster orgánico; R2 = H, o uno o más de carbohidratos 6-deoxi, o uno o más de carbohidratos 2,6-dideoxi, o moléculas de glucosa, o sus combinaciones; Y en la que las líneas de puntos indican la presencia opcional de otro enlace entre C4-C5, C5-C6 o C14-C15. 45.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural general: ( 13 ) i. jte- fe-jjjag= en la que R = H, alquilo, tigloilo, benzoilo, o cualquier otro grupo de éster^ orgánico. R2 = H, o uno o más de carbohidratos 6-deoxi, o uno o más de carbohidratos 2,6-dideoxi, o moléculas de glucosa, o sus combinaciones; Y en el cual líneas de puntos indican la presencia opcional de otro enlace entre C4- C5, C5-C6 o C14-C15; y R3 = H, aquilo, arilo, acilo o glucoxi. 46.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural en la que R = H, alquilo, arilo o cualquier esteroide que posee una funcionalidad de grupo beta hidroxi C14, beta hidroxi C12, un grupo acilo C17, una oleofina C5-C6, o sus combinaciones. 47.- Un procedimiento para la preparación de un intermediario de esteroide de la fórmula ( 15 ) Caracterizado porque incluye los pasos de (a) tratar el compue o ( 22 ) con un agente reductor para producir un compuesto 3 ß, 12ß-dihidroxi-20,20-et?lendioxipregna-5,14-dieno de la fórmula ( 23 ) (b) tratar el compuesto (23) con N-bromoacetamida (NBA) y una base para producir un compuesto 3 ß, 12ß-dihidroxi-14, 15-epox?-20,20-etilendioxipregn-5-eno de la fórmula (24 ) (c) tratar el compuesto (24) con un agente reductor para producir un compuesto 3 ß, 12ß, 14ß-trihidroxi-20,20-etilendioxipregn-5-eno de la • fórmula ( 25 ) 10 y (d) tratar el compuesto (25) con un ácido y agua para producir al compuesto (15). 48.- Un procedimiento para la preparación del compuesto (15) caracterizado porque incluye los pasos de (a) tratar el compuesto (22) con cloruro de p-toluensosulfonilo y una base para producir un compuesto 3ß, 12ß- 15 dihidroxi-20,20-etilendiox¡pregna-5,14-dieno-3-tosil-12-acetato de la fórmula ( 26 ) (b) tratar el compuesto (26) con agu to de potasio en un solvente para producir un compuesto 6ß, 12ß-dihidroxi-20,20-etilendioxi-3,5a-ciclopregnan- • 14-eno-12-acetato de la fórmula ( 27 ) 10 (c) tratar el compuesto (27) con un agente reductor para producir un compuesto 6ß, 12ß-dihidroxi-20,20-etilendioxi-3,5a--ciclopregnan14-eno de la fórmula 20 ( 28 ) (d) tratar el compuesto (28) con N-bromoacetamida, y una base para producir un compuesto 6ß,12ß-dihidroxi-20,20-etilendioxi-14,15-epoxi-3,5a- ciclopregnano de la fórmula ( 29 ) (e) tratar el compuesto (29) con un agente reductor para producir un compuesto 6ß, 12ß, 14ß-trihidroxi-20,20-etilendioxi-3,5a-c¡clopregnano de la fórmula ( 30 ) y (f) tratar al compuesto (30) con un ácido y un solvente para producir el compuesto (15). 49.- Un procedimiento para la preparación de un intermediario de carbohidrato con la forma de una porción cimarosa de monosacárido caracterizado porque incluye los pasos de: (i) tratar al compuesto de la fórmula ( 36 ) con PhSSiMe3, Znl2 y Bu4+I" para producir un compuesto 4-0-benzo?l-3-0-metil-6-deoxi-aß-D-feniltrioaltrosido de la fórmula ( 37 ) (ii) opcionalmente tratar el compuesto (37) con dietilaminoazufre trifluoruro (DAST) para producir un compuesto 4-0-benzoil-3-0-metil-2-feniltio-2,6-dideoxi-aß-D-fluorocimapiranosido que tiene la fórmula ( 38 ) o (iii) opcionalmente, tratar el compuesto (37) con t-butildimetilsililcloruro e ¡midazol en un solvente para producir 4-0-benzoil-3-0-metil-2-0-t- f butildimetilsilil-aß-D-feniltioaltrosido que tiene la fórmula ( 39 ) en la que Z = TBDMS = t-butildimetilsilil; y (iv) tratar al compuesto (39) con 10 una base para producir el monosacárido 3-0-metil-2-0-t-butildimetilsilil-aß-D- feniltioaltrosido que tiene la fórmula ( 40 ) en la que Z = t-butildimetilsilil. 50.- Un procedimiento para la preparación de un intermediario de 20 carbohidrato con la forma de una porción de tevetosa activada caracterizado porque incluye los pasos de: (i) tratar el compuesto ( 47 ) con feniltiotrimetilsilano y trimetilsililtrifluoromettanosulfonato para producir un compuesto 4-0-benzoil-3-0-metil-1 -feniltio-6-deoxi-aß-glucopiranosido que tiene la fórmula ( 48 ) (ii) tratar el compuesto (48) con cloruro de pivaloil y un solvente para producir 15 el compuesto 4-0-benzoil-3-0-metil-2-0-pivaloil-1-feniltio-6-deoxi-aß- glucopiranosido que tiene la fórmula i=lfi feaa¿e^ ^ s^1^^.,-r -r^;^^f> ¿^ ^y.+^^ffiSffiffif lffifífa^' y (iii) tratar el compuesto (49) con un agente brominante y dietilaminoazufre trifluoruro para producir un compuesto de monosacárido 4-0-benzoil-3-0-met.il-f 2-0-pivaloil-1-fluoro-6-deoxi-ß-glucopiranosido que ocurre como estereoisómeros que tienen la fórmula ( 50A ) ( 50B ) 10 51.- Un intermediario de esteroide de la fórmula (15) caracterizado porque se produce por medio del proceso de conformidad con la reivindicación 47 o la reivindicación 48. 52.- Un intermediario de carbohidrato de la fórmula (40) caracterizado porque se produce por medio de un proceso de conformidad 15 con reivindicación 49. 53.- Un intermediario de carbohidrato de la fórmula (50A) o de la fórmula (50B) caracterizado porque se produce por medio de un proceso de conformidad con la reivindicación 50. 54.- Un proceso para enlazar una cimarosa de monosacárido a 20 un intemediario de esteroide, caracterizado poque incluye los siguientes pasos: (i) hacer reaccionar una porción de cimarosa de la fórmula (38) con un intermediario de esteroide de la fórmula (1 ) de conformidad con la reivindicación 51 ante la presencia de cloruro de estaño en un solvente para producir un compuesto 3-0[4-0-benzqil-2-feniltio-ß-dihidroxi-pregnan-5-eno-20-ona de la fórmula ( 51 ) y (ii) tratar el compuesto (51) con un cloruro de ácido tíglico en piridina y luego con una base para producir un compuesto 3-0-[4-0-benzoil-2-feniltio-ß-D-cimaropiranoisl]-12ß-tigloil-14ß-hidroxi-pregnan-5-eno-20-ona de la fórmula: ( 52 ) 55.- Un compuesto de la fórmula (52) caracterizado porque se produce por medio de un proceso de conformidad con la reivindicación 54. 56.- Un procedimientoo para enlazar una porción cimarosa de monosacárido con una porción de tevetosa de monosacárido y enlazar al disacárido resultante con el compuesto de la fórmula (52) de conformidad con la reivindicación 57 caracterizado porque incluye los pasos de: i) enlazar una porción de cimarosa selectivamente protegida de la fórmula (40) de conformidad con la reivindicación 54 y una porción de tevetosa de monosacárido de la fórmula (50A) de conformidad con la reivindicación 55 • 10 usando cloruro de estaño (SnCI2) y trifluorometanosulfonato de plata para producir un compuesto de la fórmula: ( 53 ) en la que Z = TBDMS = t-butildimetilsililo ii) tratar al compuesto (53) con tetrabutilamoniofluoruro para producir un compuesto de la fórmula ( 54 ) ^^^^^¡^^^^^^¡^^^^^ iii) tratar al compuesto (54) con dietilamínoazufre trifluoruro para producir un compuesto de la fórmula ( 55 ) iv) hacer reaccionar al compuesto (55) con un compuesto (52) de conformidad 10 con la reivindicación 55 para producir un compuesto de la fórmula: 20 y (v) tratar al compuesto (56) en una reacción Ranye-Nickel y luego con una base para producir el compuesto (1 ) de conformidad con la reivindicación 34. 57.- Un procedimiento para formar un trisacárido y enlazar el trisacárido resultane con un intermediario de esteroide, caracterizado porque incluye los pasos de i) enlazar una porción de cimarosa selectivamente protegida de la fórmula (40) de conformidad con la reivindicación 55 y el compuesto (45) usando cloruro de estaño (ii), AgOTf, Cp2ZrCI2 para producir el compuesto de la fórmula en la que Z = TBDMS = t-butildimetilsililo, ii) tratar el compuesto (57) con fluoruro de tetrabutilamonio y dietilaminoazufre trifluoruro para producir un compuesto de trisacárido que tiene la fórmula B-^ y iii) enlazar al trisacárido de la fórmula J|8)-con un intermediario de esteroide de la fórmula ( 59 ) usando cloruro de estaño (II), AgOTf, Cp2ZrCI2 para producir el compuesto (1 ) de conformidad con la reivindicación 34. 58.- Una composición que tiene actividad supresora del apetito caracterizado porque comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 hasta 46 inclusive. 59.- Una composición de conformidad con la reivindicación 58 caracterizada porque el compuesto es el compuesto de la fórmula (1 ) de conformidad con la reivindicación 34. 60.- Una composición de conformidad con la reivindicación 58 o la reivindicación 59 caracterizada porque se mezcla con un excipiente farmacéutico, diluyente o portador farmacéuticos. 61.- Una composición de conformidad con la reivindicación 58, la reivindicación 59, o la reivindicación 60 caracterizado porque se prepara en la forma de una dosis unitaria. 62.- El uso de un compues||íie conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 46 en lá abricación de un medicamento para f suprimir apetito en un humano o animal. 63.- El uso de conformidad con la reivindicación 62 que es el 5 compuesto de la fórmula (1 ) de conformidad con la reivindicación 34. 64.- El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 46 inclusive que tiene actividad supresora de apetito en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito en un humano o animal. 10 65.- El uso del compuesto de conformidad con la reivindicación 64 que es el compuesto de la fórmula (1 ) de conformidad con la reivindicación 34. 66.- El uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58 hasta 61 inclusive que tiene actividad supresora de 15 apetito en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito en un humano o animal. 67.- Un alimento o bebida caracterizado porque comprende una cantidad efectiva de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 hasta 46 inclusive para obtener un efecto supresor del 20 apetito cuando se ingiere. 68.- Un alimento o bebida de conformidad con la reivindicación 67 caracterizado porque el compuesto es el compuesto de la fórmula (1 ) de conformidad con la reivindicación 34. 69.- El uso de un compuesto de la fórmula (1 ) que tiene actividad supresora del apetito de conformidad' con la reivindicación 34 aislado de una f planta del género Trichocaulon o del género Hoodia en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito en un humano o animal. 5 70.- El uso de acuerdo con la reivindicación 69 en donde el compuesto se aisla de las especies Trichocaulon piliferum o Trichocaulon officinale o de las especies Hoodia currorii, Hoodia gordonii u Hoodia lugardii. 71.- Una composición que tiene una actividad supresora del A apetito caracterizado porque comprende un compuesto de la formula (1 ) 10 aislado de una planta del género Trichocaulon o del género Hoodia. 72.- Una composición de conformidad con la reivindicación 71 caracterizado porque el compuesto se aisla y/o purifica de una planta de las especies Trichocaulon piliferum o Trichocaulon offícinale o de las especies Hoodia currorii, Hoodia gordonii u Hoodia lugardii. f 15 73.- Una composición de conformidad con la reivindicación 71 caracterizada porque el compuesto se aisla y/o purifica de un extracto derivado de una planta de las especies Trichocaulon piliferum o Trichocaulon officinale o de las especies Hoodia currorii, Hoodia gordonii u Hoodia lugardii. 74.- Una composición de conformidad con la reivindicación 71 , la 20 reivindicación 72, o la reivindicación 73, que se mezcla con un excipiente, diluyente o portador farmacéutico. 75.- Una composición de conformidad con la reivindicación 74 que se prepara en forma de dosis unitaria. 76.- El uso de un compuestede la formula (1 ) de conformidad con la reivindicación 33 aislado de uita planta del género Trichocaulon o del género Hoodia en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito en un humano o animal. 5 77.- El uso del compuesto de conformidad con la reivindicación 76 en donde el compuesto se aisla de una planta de la especie Trichocaulon piliferum o Trichocaulon officinale o de Hoodia currorii, Hoodia gordonii u Hoodia lugardii. 78.- El uso de una composición de conformidad con cualquiera 10 de las reivindicaciones 71 a 75 que tiene actividad supresora del apetito en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito en un humano o animal 79.- Una composición que tiene actividad supresora del apetito que comprende un agonista del receptor melancortina 4. 80.- Una composición de conformidad con la reivindicación 79 f 15 caracterizada porque el antagonista es un extracto de conformidad con la reivindicación 9, la reivindicación 17 o la reivindicación 24, o un compuesto como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 33 a 46 inclusive. 81.- Una composición de conformidad con la reivindicación 79 o la reivindicación 80 caracterizada porque el compuesto es un compuesto de la 20 fórmula (1 ) de conformidad con la reivindicación 34. 82.- Una composición de conformidad con la reivindicación 79, la reivindicación 80 o la reivindicación 81 caracterizada porque está mezclada con un excipiente, diluyente o portador farmacéutico. 83.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 79 a 82 inclusive, que está preparada en forma de dosis <f unitaria. 84.- El uso de un antagonista del receptor melanocortina 4 que 5 tiene actividad supresora del apetito en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito en un humano o animal. 85.- El uso de conformidad con la reivindicación 84 en donde el agonista es un extracto de conformidad con la reivindicación 9, la reivindicación 17 o la reivindicación 24, o un compuesto como se reivindica • 10 en cualquiera de las reivindicaciones 33 a 46 inclusive. 86.- El uso de conformidad con la reivindicación 85 que es el compuesto de la formula (1 ) de conformidad con la reivindicación 34. 87.- Un agonista del receptor melanocortina 4 que tiene actividad supresora del apetito. f 15 88.- Un agonista del receptor melanocortina 4 de conformidad con la reivindicación 87 que es un extracto de conformidad con la reivindicación 9, la reivindicación 17 o la reivindicación 24, o un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 46 inclusive. 89.- Un receptor de melanocortina 4 de conformidad con la 20 reivindicación 88 que es un compuesto de la fórmula (1 ) de conformidad con la reivindicación 34. 90.- El uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 79 a 83 inclusive que tiene actividad supresora de apetito en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito en un humano o animal 91.- El uso de un agonista del receptor de melanocortina 4 que tiene actividad supresora de apetito en la fabricación de un medicamento para suprimir apetito y/o combatir la obesidad en un humano o animal. 92.- El uso de conformidad con la reivindicación 91 en donde el agonista es un extracto de conformidad con la reivindicación 9, la reivindicación 17 o la reivindicación 24, o un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 46 inclusive. 10 93.- El uso de conformidad con la reivindicación 92 que es el compuesto de fórmula (1 ) de conformidad con la reivindicación 34. 94.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural ( 23 ) 95.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: ( 24 ) 96.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (25) 97.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (27) 15 98.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (28) .Aii^^^^a^^^_^;«wAaaa^^^_ a L^tfAfcateJÉ 99.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (29) 100.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: 15 (30) 101.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (37) 102.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (38) 103.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (39) 104.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (40) 105.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (48) 106.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (49) 107.- Un compuesto que ocurre como estereoisómeros con la siguiente fórmula estructural: (50A) (50B) 20 108.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (51 ) 109.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (52) 110 - Un compuesto que tiene la fórmula estructural: m**?. ^^ (53) en la que Z= TBDMS = t-butildimetilsililo. 111.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (54) 15 112.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: • 20 (55) 113.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: 114.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: (57) 115.- Un compuesto que tiene la fórmula estructural: 116.- El uso de un extracto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9, 24, 25, 26, o 27 que tiene actividad supresora del apetito en la fabricación de un medicamento para combatir la obesidad en un humano o animal. 5 117.- El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 10 que tiene actividad supresora del apetito en la fabricación de un medicamento para combatir la obesidad en un humano o animal. 118.- El uso de un compuesto de conformidad con la reivindicación 33 o 34 en la fabricación de un medicamento para combatir la 10 obesidad en un humano o animal. 119.- Una estructura de la fórmula 3-O-ß-D-teverosil-(1?4)-ß-D- cimaropiranosil-(1- 4)-ß-D-cimaropíranósido-12ß-O-t¡gloil-14ß-hidroxi- pregnano-5-eno-20-ona. ^^^^^^^^^^^^^^^^^ - - - - -- ¡U á e **^* *** Una composición farmacéutica que contiene un extracto que se obtiene de una planta del genero Trichocaulon u Hoodia que contiene un (D también se provee un procedimiento para obtener el extracto y un procedimiento para sintetizar el compuesto y sus análogos y derivados; la invención también se extiende al uso de dichos extractos y al compuesto y sus análogos para la fabricación de medicamentos que tienen actividad supresora de apetito; la invención proporciona adicionalmente nuevos intermediarios para la síntesis del compuesto. U-D&L/todas* P99/1188F ¡ ^^^^agg^gij
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