MXPA99009281A - Sintesis mejorada de oligosacaridos, que usa los derivados de glicosidos activados - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para formar oligosacáridos, que usan derivados de glicosilo activados como azúcares donadoras en la síntesis enzimática de estos oligosacáridos. Las enzimas usadas son típicamente las transferasas de glicosilo. Los azúcares donadores actúan como alternativas a los substratos que ocurren naturalmente, y suministran rutas eficientes de síntesis para una variedad de oligosacáridos importantes comercialmente. También se dan a conocer métodos para formar azúcares de fosfato de nucleótidos.

Description

SÍNTESIS MEJORADA DE OLIGOSACAR1DOS. QUE USA LOS DERIVADOS DE GLICÓSIDOS ACTIVADOS.

CAMPO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, esta invención se refiere a la síntesis de oligosacáridos. En particular, se refiere a la síntesis mejorada de oligosacáridos con el uso de glicósidos que ocurren en forma no natural. Además, esta invención se refiere a métodos para generar in si tu azúcares de fosfato de nucleótidos y sus análogos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los oligosacáridos son compuestos con un potencial considerable, tanto como productos terapéuticos al igual que como reactivos para ensayos clínicos. La síntesis de muchos oligosacáridos de interés potencial es difícil, debido a la naturaleza particular de las subunidades de sacáridos. Una multitud de isómeros potenciales, en los cuales diferentes grupos substituyentes en los azúcares llevan a estar involucrados en la formación de enlaces, junto con la formación potencial de diferentes formas anoméricas, son posibles. Como resultados de estos problemas, no es posible la síntesis química a gran escala de la mayoría de los oligosacáridos, debido a las consideraciones económicas que surgen de los pobres rendimientos de los productos deseados . La síntesis enzimática suministra una alternativa a la síntesis química de los oligosacáridos. Esta síntesis enzimática, que usa glicosidasas, transferasas de glicosilo o sus combinaciones, se han considerado como posibles acercamientos en la síntesis de oligosacáridos. Las glicosidasas catalizan la reacción: y sintetizan los oligosacáridos cuando se lleva a cabo la reacción natural inversa. Los oligosacáridos pueden también ser sintetizados agregando una segunda azúcar a la mezcla de reacción, que compite con el agua, reaccionando en su lugar con la primera azúcar en una reacción de transglicosilación. Mientras las glicosidasas están generalmente disponibles y son fáciles de manejar, las dificultades en controlar la reacción inversa resultan en pobres rendimientos del producto. Adicionalmente, aunque el control estereoquímico (es decir, la formación de sólo un anómero) es bueno, es difícil pronosticar o controlar la regioquímica (es decir, la formación de los enlaces 1-2, versus 1-3, versus 1-4, versus 1-6. Las transferasas de glicosilo catalizan la reacción: Las • transferasas de glicosilo funcionan naturalmente para sintetizar los oligosacáridos. Ellas producen productos específicos con excelente control estereoquímico y regioquímico . Este control procede con rendimiento substancial, debido a que no ocurre la reacción inversa.

Desafortunadamente, debido a que ellos se asocian a menudo con membranas, estas enzimas tienden a ser inestables en solución y son costosas de comprar. Además, los substratos de nucleótidos de azúcar requeridos por estas enzimas son bastante costosos. Asimismo, las transferasas de glicosilo, que poseen la especificidad deseada para obtener muchos oligosacáridos interesantes, no están disponibles comercialmente, El progreso reciente en las técnicas de clonación, sin embargo, han hecho disponibles a varias transferasas de glicosilo, en calidad y cantidad suficientes, haciendo la síntesis de oligosacáridos enzimática más práctica (véase, por ejemplo, Paulson et al., J. Biol . Chem . 264: 17615 (1989)). Para realizar el potencial de la síntesis de oligosacáridos enzimática, por lo tanto, existe una necesidad de un acercamiento sintético que evite los principales inconvenientes de las técnicas conocidas (es decir, el costo de los substratos de nucleótidos del azúcar) . Es un objeto de esta invención suministrar tal técnica que permita la síntesis de una amplia variedad de oligosacáridos con buen rendimiento.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención suministra métodos para preparar oligosacáridos, que usan derivados de glicósidos activados. En un aspecto, esta invención se refiere a un proceso para obtener un aceptor glicosilado, mezclando en un medio acuoso un derivado de glicósido activado, un substrato aceptor, una transferasa de glicosilo y un fosfato de nucleótidos o un fosfato de nucleótido análogo, para formar un aceptor glicosilado. En otro aspecto, esta invención se refiere a un proceso para obtener un glicósido de fosfato de nucleótidos, por la mezcla en un medio acuoso de un derivado de glicósido activado, una transferasa de glicosilo y un fosfato de nucleótido o un análogo de un fosfato de nucleótido, para formar un glicósido de fosfato de nucleótido. En aún otro aspecto, esta invención se refiere a un proceso para obtener sacáridos, oligosacáridos o partes que contienen carbohidratos, que usan un glicósido de fosfato de nucleótido acoplado con una enzima dependiente del azúcar de fosfato de nucleótido.

Los productos de los métodos anteriores típicamente serán aislados o recuperados en seguida de la síntesis enzimática, aunque en algunas modalidades, múltiples reacciones de glicosilación se llevarán a cabo o en un recipiente sencillo de reacción o en múltiples recipientes . En otros aspectos, la presente invención suministra composiciones que son útiles para la formación de enlaces glucosídicos y composiciones que se forman por los métodos aquí descritos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJO Las Figuras 1 y 2 muestran los mecanismos propuestos de inversión y retención para transferir el glicosilo con las transferasas de ß-glicosilo y las transferasas de a-glicosilo (véase, Saxena et al., ".

Bacteriology, 1419 (1995) ) . La Figura 3 muestra el acoplamiento mediado por la transferasa de a-galactosilo (lgtC-18) del fluoruro de galactosilo y cualquiera de la FCHASE-galactosa o FITC-lact.osa, que ocurre en la presencia del UDP.

La Figura 4 muestra los espectros de masa de los productos de reacción obtenidos usando cualquiera de la FCHASE-galactosa o FITC-lactosa, como aceptores para la reacción mediada por enzima de la Figura 3. La Figura 5 muestra la evidencia de la cromatografía HPLC para la formación del disacárido por la lgtC-19 que usa el fluoruro de galactosilo como tanto el donador como un substrato aceptor. La Figura 6 muestra el mecanismo de la reacción de acoplamiento de la UDP-galactosa-4-epimerasa : UPD-glucosa-deshidrogenasa . La Figura 7 muestra la correlación lineal entre ? ? A34o (v_bS) Y Ia concentración lgtC-19 para el ensayo de la UDP-galactosa-4-epimerasa: UDP-glucosa-deshídrogenasa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención suministra métodos para formar oligosacáridos que usan derivados de glicosilo activados como azúcares donadoras en la síntesis enzimática de los oligosacáridos por las transferasas de glicosilo.

Estas azúcares donadoras actúan como alternativas a los substratos que ocurren naturalmente. En forma normal, estas enzimas utilizan difosfoazúcares de nucleótidos o monofosfoazúcares de nucleótidos, en las cuales el fosfato de nucleótido es un enlace a a la posición 1 del azúcar. El producto formado es un glicósido de glicosilo ß-enlazado o a-enlazado, en seguida de la transferencia a un sacárido aceptor apropiado . Las transferasas que forman los productos ß-enlazados son llamadas transferasas de ß-glicosilo y se cree actúan por medio de un mecanismo de inversión, en tanto aquéllas que forman productos a-enlazados son transferasas de a-glicosilo y se enseña operan por medio de un mecanismo que implica la retención de la configuración en el centro reactivo. El mecanismo actual de estas reacciones es especulativo y se basa primariamente en estudios realizados usando glicosidasas. Fuentes abundantes de transferasas de glicosilo se han desarrollado sólo recientemente usando técnicas recombinantes. Consecuentemente, el estudio amplio de esta clase está en su infancia. Hasta ahora, no se han publicado estructuras de cristales de rayos x para cualquier transferasas de glicosilo dependiente de fosfoazúcar de nucleótido. Los métodos de la presente invención se pueden usar para obtener una amplia variedad de oligosacáridos, Oligosacáridos particularmente útiles que se pueden obtener por este método incluyen las imitaciones de antígenos encontradas sobre las superficies de las células. Estos oligosacáridos de las superficies de las células son importantes para el reconocimiento de célula por célula y se han implicado como sitios receptores para las toxinas bacteriales, tal como aquéllas de la familia de toxinas Shiga, que se unen a antígenos que tienen la estructura de a-gal (1,4) -ß-gal- (1,4) -ß-glc-lipopolisacárido . Estas toxinas, por ejemplo E. coli 0157, están implicadas en la colitis hemorrágica y el síndrome urémico hemolítico. El uso de un oligosacárido sintético para unir/neutralizar estas toxinas se ha probado y parece trabaja en estudios de animales. Sin embargo, el enlace a-gal ha probado ser difícil de preparar usando métodos sintéticos convencionales. Con el empleo de los métodos suministrados aquí, la formación de este enlace puede ser llevado a cabo en una sola etapa, para proporcionar productos puros. Según se usa aquí, los azúcares tienen sus abreviaturas estándar, que incluyen: Ara = arabinosilo; Fru = fructosilo; Fue = fucosilo; Gal = galactosilo; GalNAc = N-acetilgalacto; Glc = glucosilo; GlcNAc = N-acetilgluco; IdA = ácido idurónico; Man = manosilo; y NeuAc = sialilo (N-acetilneuraminilo) .

Modalidades dß la Invención En un aspecto, esta invención se refiere a un proceso para obtener un aceptor glicosilado, mezclando en un medio acuoso un derivado de glicósido activado, un substrato aceptor, una transferasa de glicosilo, y una cantidad catalítica de un fosfato de nucleótido o un fosfato de nucleótido análogo, para formar un aceptador glicosilado. En una modalidad preferida, esta invención se refiere a un proceso para obtener un aceptador glicosilado, el cual comprende : (a) mezclar en un medio acuoso un derivado de glicósido activado, una transferasa de glicosilo, un substrato aceptor y una cantidad catalítica de un fosfato de nucleótido o un análogo de fosfato de nucleótido, para formar una mezcla de reacción acuosa; y (b) mantener la mezcla acuosa de reacción a un valor del pH de aproximadamente 5 hasta 10, y a una temperatura aproximada de 0 a 40 °C, por un período de tiempo suficiente para que ocurra la glicosilación del substrato aceptor, y formar un aceptor glicosilado. En ciertas modalidades preferidas, este aspecto de la invención además comprende la etapa de: (c) recuperar el aceptor glicosilado. Los derivados de glicósido activados que son útiles en la presente invención son típicamente glicósidos que se han alterado sintéticamente para incluir un grupo de salida activado. Según se usa aquí, el término de "grupo de salida activado" se refiere a aquellas partes que se desplazan fácilmente en las reacciones de substitución nucleofílicas reguladas por enzimas. Ejemplos de tales grupos incluyen: flúor, cloro, bromo, éster de tosilato, éster de mesilato, éster de triflato y similares. Una restricción en los grupos de salida activados, para su uso en la presente invención, es que no deben estorbar estéricamente la transferencia enzimática del glicósido al aceptor. Por lo tanto, las modalidades preferidas de los derivados de glicósidos activados incluyen los fluoruros de glicosilo y mesilatos de glicosilo, con los fluoruros de glicosilo siendo particularmente preferidos. Entre los fluoruros de glicosilo, más preferidos son el fluoruro de a-galactosilo, fluoruro de a-manosilo, fluoruro de a-glucosilo, fluoruro de a-flucosilo, fluoruro de a-xilosilo, fluoruro de a-sialilo, fluoruro de a-N-acetilglucosaminilo, fluoruro de a-N-acetilgalactosaminilo, fluoruro de ß-galactosilo, fluoruro de ß-manosilo, fluoruro de ß-glucosilo, fluoruro de ß-flucosilo, fluoruro de ß-xilosilo, fluoruro de ß-sialilo, fluoruro de ß-N-acetilglucosaminilo y fluoruro de ß-N-acetilgalactosaminilo. Los fluoruros de glicosilo se pueden preparar del azúcar libre por acetilar primero este azúcar y luego tratándola con HF/piridina. Esto generará el anómeros más estable termodinámicamente del fluoruro de glicosilo protegido (acetilado) (es decir el fluoruro de a-glicosilo) . Si se desea el anómero menos estable (es decir, el fluoruro de ß-glicosilo) , se puede preparar convirtiendo el azúcar peracetilado con HBr/HOAc o con HCl, para generar el bromuro o cloruro anomérico. Este producto intermedio se hace reaccionar con la sal de fluoruro, tal como el fluoruro de plata, para generar el fluoruro de glicosilo. Fluoruros de glicosilo acetilados pueden ser desprotegidos por la reacción con una base moderada (catalítica) en metanol (por ejemplo, NaOMe/MEOH) . Además, muchos fluoruros de glicosilo están disponibles comercialmente. Otros derivados de glicosilo activados pueden ser preparados usando métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, los mesilatos de glicosilo pueden ser preparados por el tratamiento de la forma de semiacetal completamente bencilada del azúcar con el cloruro de mesilo, seguido por la hidrogenación catalítica para remover los grupos de bencilo. Los substratos aceptores usados en los presentes métodos pueden ser esencialmente cualquiera de los monosacáridos u oligosacáridos que tienen un residuo de sacárido terminal para el cual la transferasa de glicosilo particular exhibe especificidad. El substrato aceptor puede ser substituido en la posición de su extremo no reductor. Así, el aceptor de glicósido puede ser un monosacárido, un oligosacárido, un sacárido rotulado fluorescente o un derivado de sacárido, tal como un antibiótico de aminoglicosido. En un grupo de modalidades preferidas, el aceptor de glicósido es un derivado de sacárido, preferiblemente un aminoglicósido. En otro grupo de modalidades preferidas, el derivado de glicósido es un oligosacárido, preferiblemente la lactosa, Galß (1-3) GlcNAc, Galß (1-4) GlcNAc, Gal (1-3) GalNAc, Gal (1-4) GalNAc, lactosa de sialilo, Galß (1-3) GalNAcß (1-4) , GalNAcß (1-4) -lactosa, Gangliósidos GMl, GM2 , GM3 , GD3 , GlcNAcß (1-3) lactosa; GlcNAcß (1-3 ) galactosa; Galß ( 1-4) GlcNAcß (1-2 ) galactosa; Galß(l-4)GlcNAcß(l-3) lactosa; L-IdAß (1-4) glucosamina; Glucosamina-a (1-4) Ida; Gala (1-4) lactosa; GlcNAcß (1-3) Gal-a (1-4) -lactosa; Gal (1-3 ) GalNAcß (1-3 ) Gal-a (1-4) lactosa; GalNAcß (1-3) Gala (1-4) lactosa; GlcNAcß (1-3) Gal; Galß(l- 3 ) GlcNAcß (1-3) Gal; Fuca (1-2 ) Galß (1-3 ) GfIcNacß (1.3) Gal ; Fuca ( 1 - ) GlcNAcß (1 -3) Gal ; Fuca(l-4) -Galß (1-3) GlcNAc-ß(l-3) Gal; Fuca (1 -3 ) GlcNAc ; Fuca (1-3 ) -GlcNAc-Galß (1-4) ; Galß(l-3) GlcNAcß (1-3) Gal; y los glicósidos de ceramida de los anteriores. En aún otras modalidades preferidas, el aceptor de glicósido es un sacárido rotulado, más preferiblemente un sacárido rotulado fluorescente, especialmente preferido la FITC-lactosa, FCHASE-lactosa, FITC-galactosa, FCHASE-galactosa, glucósido de p-nitrofenilo y maltohexósido de p-nitrofenilo. Un número de oigosacáridos y derivados importantes comercial y/o terapéuticamente, se pueden preparar usando los métodos aquí descritos. Por lo tanto, ejemplos de substratos aceptores que se pueden glicosilar para proporcionar oligosacáridos y derivados terapéuticamente útiles incluyen, por ejemplo, la lactosa y otros miembros de la pista suministrada anteriormente. Los oligosacáridos se consideran tienen un extremo reductos y un extremo no reductor, cuando o no el sacárido en el extremo reductor es de hecho un azúcar reductora. De acuerdo con la nomenclatura aceptada, los oligosacáridos se ilustran aquí con el extremo no reductor a la izquierda y el extremo reductor a la derecha. Todos los oligosacáridos aquí descritos tienen el nombre o abreviatura para el sacárido no reductor (por ejemplo, Gal), seguido por la configuración del enlace glicosídico (a ó ß) , el enlace de anillo, la posición del anillo del sacárido reductor implicado en el enlace, y luego el nombre o abreviatura del sacárido reductor (por ejemplo, GlcNAc) . El enlace entre dos azúcares se puede expresar, por ejemplo, como 2-3, 2—3, (2-3) o (2,3). Cada sacárido es una piranosa. Un componente adicional presente en las mezclas de reacción es un fosfato de nucleótido (que incluye los mono-, di- ó tri-fosfatos de nucleótidos) o sus análogos.

Importantemente, se ha encontrado que los presentes métodos se pueden conducir en la presencia de cantidades catalíticas de un fosfato de nucleótido o sus análogos. Los monofosfatos de nucleótidos que son adecuados para el uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, el monofosfato de adenosina (AMP) , monofosfato de citidina (CMP) , monofosfato de uridina (UMP) , monofosfato de guanosina (GMP) , monofosfatode inosina (IMP) y monofosfato de timidina (TMP) .

Trifosfatos de nucleótidos adecuados para el uso de acuerdo con la presente invención incluyen el trifosfato de adenosina (ATP) , trifosfato de citidina (CTP) , trifosfato de uridina (UTP) , trifosfato de adenosina (ATP) , trifosfato de inosina (ITP) y trifosfato de timidina (TIP) . Un trifosfato de nucleótido preferido es el UTP. Preferiblemente, el fosfato de nucleótido es un difosfato de nucleótido, po ejemplo el difosfato de adenosina (ADP) , difosfato de citidina (CDP) , difosfato de uridina (UDP) , difosfato de guanosina (GDP) , difosfato de inosina (IDP) , y difosfato de timi-dina (TDP) . Un difosfato de nucleótido preferido es el UDP. Como se mencionó antes, la presente invención puede también ser practicada con un análogo de los fosfatos de nucleótidos. Análogos adecuados incluyen, pero no se limita a, los sulfatos y sulfonatos de nucleótidos. Aún otros análogos incluyen los fosfatos sencillos, por ejemplo, el pirofosfato. Las transferasas de glicosilo que son útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo, la a-sialil-transferasas , a-glucosil-transferasas, a-xilosil-transferasas, a-N-acetil-hexosaminl-transferasas, ß-sialil-transferasas , ß-glucosil -transferasas , ß-galactosil-transferasas, ß-fucosil-transferasas, ß-manosil-transferasas, ß-xilosil-transferasas y ß-N-acetil-hexosaminil-transferasas, tal como aquéllas de Neisseria meningi tidis, u otras fuentes de bacterias, y aquéllas de fuentes de ratas, ratones, conejos, vacas, cerdos, y humanas. Preferiblemente, la transferasa de glicosilo es una enzima de transferasa de glicosilo mutante, en la cual se ha suprimido el dominio de la unión de membrana. Galactosil-transferasas ejemplares incluyen la a (1, 3) galactosiltransferasa (E.C. No. 2.4.1.151, véase, por ejemplo, Dabkowski et al., Transplant Proc. 25:2921 (1993) y Yamamoto et al., Nature 345:229-233 (1990)) y a(l,4-galactosiltransferasa (E.C. No. 2.4.1.38) . Un número de fucosiltransferasas se conocen por los expertos en la materia. Fucosiltransferasas adecuadas luego incluyen la ßGal (l?3,4)ßGlcNAc a (l-»3 , 4) fucosiltransferasa (FTIII E.C. No. 2.4..1.65), que se obtiene de la leche humana (véase Palcic et al., Carbohydrate Res . 190:1-11 (1989); Prieels et al., J. Biol . Chem. 256:10456-10463 (1981); y Nunez et al., Can J. Chem . 59:2086-2095 (1981)) y las ßGal (1?4) ßGlcNAc a(l?-3) fucosiltransferasas (FTIV, FTV, FTVI y FTVII, E.C. Mno. 2.4.1.65) que se encuentran en el suero humano. Una forma recombinante de la ßGal (l-»3 , 4) ßGlcNAc a (1—»3 , 4) fucosiltransferasa está también disponible (véase, Dumas et al., Bioorg. Med. Letters 1:425-428 (1991) Kukowska-Latallo et al., Genes and Development 4:1288-1303 (1990) ) . Otras fucosiltransferasas ejemplares incluyen la al, 2-fucosiltransferasa (E.C. No. 2,4.1 69). La fucosilación enzimática puede ser llevada a cabo por los métodos descritos en Mollicone et al., Eur. J. Biochem. 191:169-176 (1990) o la patente de E.U.A., No. 5,374,655. Un experto en la materia comprenderá que otras glicosiltransferasas pueden ser substituidas en los presentes métodos, tal como una sialiltransferasa. Aún otras glucosiltransferasas incluyen la glicosiltransferasa que puede también ser, por ejemplo, Alg8 (Staglijov et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 91:5977 (1994) o Alg5 (Heesen et al., Eur J. Biochem. 224:71 (1994)). N-acetilgalactosaminiltransferasas adecuadas incluyen la a(l,3 N-acetilgalactosaminiltransferasa, ß(l,4) N-acetilgalactosaminiltransferasas (Nagata et al., J". Biol . Chem. 267:12082-12089 (1992) y Smith et al., J. Biol . Chem. 269:151162 (1994)) y la N-acetilgalactosaminiltransferasa de polipéptido (Homa et al., J". Biol . Chem . 268:12609 (1993)).

N-acetilglucosaminiltransferasas adecuadas incluyen la GnTI (2.4.1.101, Hull let al., BBRC 176:608 (1991)). GnTII y GnTIII (Ihara et al. _J. Biolchem. 113:692 (1993)). GnTV (Shoreiban et al., ". Biol . Chem. 268:15381 (1993)), N-acetilglucosaminiltransferasa enlazada a O (Bierhuizen et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 89:9326 (1992)). N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa (Rajput et al., Biochem J. 285:985 (1992) y sintasa de hialuronan.

Manosiltransferasas adecuadas incluyen la c.1,2) manosiltransferasa, (1, 3) manosiltransferasa, ß (1, 4) manosil-transferasa, Dol-P-Man sintasa, Ochl y Pmtl. Será fácilmente aparente a los expertos en la materia que las transferasas de glicosilo pueden ser mutadas o alteradas para lograr mejores propiedades. Estas alteraciones incluyen, pero no se limitan a, la mutagénesis específica del sitio, evolución dirigida, supresión del dominio de unión de membrana y similares. Así, la presente invención incluye todas estas mutaciones alteraciones y modificaciones . . Además, la presente invención incluye transferasas de glicosilo que, en su estado nativo, son incapaces de utilizar un derivado de glicósido activado como u substrato, sin embargo, por alguna mutación, o evolució dirigida, la enzima se puede usar como un glicósido activad como un substrato. La generación y prueba de los varios mutantes d una glicosiltransferasa se describen generalmente e akarchuk, W. W. , Cunningham, A. -M. , atson, D.C. y Young, N. M. , "Papel de los Residuos Básicos en Parejas en l Expresión de las Galactosiltransferasas Recombinante Activas del Patógeno Bacterial Neisseria memingi tidis (1998) Protein Engineering, Tn Press . En otras modalidades, la presente invenció incluye substituciones conservativas a las transferasas d glicosilo listadas. Una substitución conservativa, cuand describe una proteína, se refiere a un cambio en l composición de aminoácidos de la proteína, que no alter substancialmente la actividad de la proteína. Así, variaciones modificadas conservativamente de una secuenci particular de aminoácidos se refiere a substituciones d aminoácidos de esos aminoácidos que no son críticos para l actividad de la proteína o la substitución de aminoácidos con otros aminoácidos que tengan propiedades similares (por ejemplo, acidez, basicidad, cargados positiva o negativamente, polares o no polares, etc.) de modo que las substituciones de aún aminoácidos críticos no altere substancialmente la actividad. Las tablas de substituciones conservativas proporcionan funcionalidades similares de aminoácidos, bien conocidas en la técnica (Véase Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company) . Además, substituciones, supresiones o adiciones individuales que alteren, agreguen o supriman un aminoácido sencillo o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada, son también variantes modificadas conservativamente . En otra modalidad, esta invención se refiere a un proceso para obtener un glicósido de fosfato de nucleótido, mezclando en un medio acuoso un derivado de glicósido activado, tal como aquéllos descritos aquí, con una transferasa de glicosilo y un fosfato de nucleótido o un análogo del fosfato de nucleótido, para formar un glicósido de fosfato de nucleótido. La transferasa de glicosilo acoplará el derivado de glicósido activado y el fosfato de nucleótido o análogo de fosfato de nucleótido, para formar un glicósido de fosfato de nucleótido. En una modalidad particularmente preferida, este método se usa para formar un azúcar de fosfato de nucleótido in si tu, que se usará con una enzima dependiente del azúcar de fosfato de nucleótido. El fosfato de nucleótido (que incluye los mono-, di- o trifosfatos de nucleótido) o sus análogos, se han definido previamente. En modalidades especialmente preferidas, los azúcares de fosfato de nucleótidos generados in si tu incluyen las UDP-hexosas, tal como UDP-galactosa, y la UDP-glucosa. En otra modalidad, el azúcar de fosfato de nucleótido generado in si tu, es producido en una concentración de estado estable, que luego será usada por una enzima dependiente del azúcar de fosfato de nucleótido (en otra reacción enzimática) . Enzimas dependientes del azúcar de fosfato de nucleótido adecuadas incluyen, pero no se limitan a, una segunda transferasa de glicosilo, una epimerasa, una deshidrogenasa, una pirofosforilasa y una transferasa de ribosilo de difosfato de nucleótido.

Las enzimas dependientes del azúcar de fosfato de nucleótido se pueden usar en reacciones catalizadas enzimáticas para una variedad de substratos aceptores. Estos substratos aceptores incluyen, pero no se limitan a, la nicotinamida-adenina-dinucleótido, nicotnamida-adenina-dinucleótidofosfato, glucosa, un glucósido, galactosa, un galactósido, mañosa, un manósido, fucosa, un fucósido, ácido N-acetilneuramínico, una N-acetilneuraminida, xilosa, un xilósido, N-acetilglucosamina, una N-acetilglucosaminida, N-acetilgalactosamina, una N-acetilgfalactosaminida, arabinosa, un arabinósido, una agíicona antibiótico, una aglicona detergente, un lípido, una sapogenina, un oligosacárido, un monosacárido, un sacárido rotulado fluorescente y un derivado de sacárido. En una modalidad particularmente preferida, las enzimas de "síntesis" que no se pueden usar para un derivado de glicosilo activado directamente, pueden usar un azúcar de fosfato de nucleótido o un análogo, el cual se ha generado in si tu por una "enzima de acoplamiento." De esta manera, el medio de reacción contiene un azúcar de fosfato de nucleótido, tal como la UDP-galactosa, que se ha generado por una enzima de acoplamiento in si tu . En el mismo medio de reacción, una "enzima de síntesis", que usa el azúcar de fosfato de nucleótido, tal como la UDP-galactosa, cataliza una reacción subsecuente con al menos un substrato aceptor. La enzima de síntesis puede ser, por ejemplo, una enzima dependiente del azúcar de fosfato de nucleótido, tal como una epimerasa. Esta epimerasa se cataliza por la epimerización del substrato aceptor, mientras utiliza el azúcar de fosfato de nucleótido, suministrada por la enzima de acoplamiento. De esta manera, la enzima de acoplamiento y la enzima de síntesis trabajan en tándem. La enzima de acoplamiento suministra un azúcar de fosfato de nucleótido necesaria a la enzima de síntesis, la cual puede catalizar una reacción en el substrato aceptor. En otras modalidades, más de una enzima de acoplamiento y más de una enzima de síntesis están presentes en el medio de reacción. Para esas modalidades en las cuales el método se va a practicar a un escala comercial, puede ser ventajoso inmovilizar la transferasa de glicosilo u otras enzimas sobre un soporte. Esta inmovilización facilita la remoción de la enzima del lote del producto y la reutilización subsecuente de la enzima. La inmovilización de las transferasas de glicosilo, por ejemplo, puede ser lograd removiendo de la transferasa su dominio de unión de membrana, y uniendo en su lugar un dominio de unión d celulosa. Un experto en la materia comprenderá que otros métodos de inmovilización pueden también ser usados y s describen en la literatura disponible. Para las mezclas de reacción de l glicosíltransferasa anteriores, las concentraciones cantidades de los varios reactivos usadas en los procesos depende de numerosos factores, que incluyen las condiciones de reacción, tal como la temperatura y el valor del pH, y l selección y cantidad de los substratos aceptores que se va a glícosilar. En general, el límite superior para las concentraciones de los reactivos que puede ser usado, d acuerdo con el método de la presente invención, se determin por la solubilidad de tales reactivos. Preferiblemente, las concentraciones de los derivados de glicósido activados, el substratos aceptor, l transferasa de glicosilo y el fosfato de nucleótido o sus análogos, se seleccionan de modo que la glicosilació proceda hasta que se consuma el reactivo más costoso (substrato aceptor o derivado de glicósido activado) . La cantidad de la transferasa de glicosilo que está presente en el medio de reacción es típicamente una cantidad catalítica. La cantidad catalítica de una enzima particular varía de acuerdo con la concentración de se substrato de la enzima, al igual que las condiciones de la reacción, tal como la temperatura, tiempo y valor del pH. Los recursos para determinar la cantidad catalítica para una enzima dada bajo las concentraciones del substrato preseleccionadas y las condiciones de reacción son bien conocidas por los expertos en la materia. Los ingredientes anteriores se combinan mezclando en un medio acuoso de reacción (solución) . Ese medio tiene un valor del pH de aproximadamente 5 a 10. El medio carece de queladores que unen los cofactores de la enzima, tal como el Mg+2 ó Mn+2. La selección del medio se basa en la habilidad de este medio en mantener el valor del pH al nivel deseado. Así, en algunas modalidades, el medio se regula a un valor del pH de aproximadamente 7.5, preferiblemente con HEPES. Si nos se usa un regulador, el pH del medio debe ser mantenido en alrededor de 6 a 8.5, preferiblemente alrededor de 7.2 7.8, por la adición de una base. Una base adecuada es el NaOH, preferiblemente el NaOH 6M. El medio de reacción puede también comprende detergentes solubilizadores (por ejemplo el Tritón® o SDS) solventes orgánicos, tal como el metanol o etanol, si fuer necesario. Además, las enzimas son utilizadas preferiblemente libres en solución, pero se pueden unir a u soporte, tal como un polímero (por ejemplo la celulosa) . La temperatura a la cual se lleva a cabo el proceso anterior puede variar desde justamente arriba del punto de congelación a la temperatura a la cual s desnaturaliza la enzima más sensible. Ese intervalo d temperatura está preferiblemente entre alrededor de 0 y 40° y más preferiblemente entre alrededor de 20 y 30°C. La mezcla de reacción, así formada, se mantiene por un período de tiempo suficiente para que el substrato aceptor sea glicosilado para formar un producto deseado. Algo de ese producto puede a menudo ser detectado después de unas cuantas horas, con cantidades recuperables usualmente siendo obtenidas dentro de 24 horas. Es preferido optimiza el rendimiento del proceso y el tiempo de mantenimiento e usualmente de alrededor de 36 a 240 horas. Los productos obtenidos por los proceso anteriores se pueden usar sin purificación. Sin embargo, s prefiere usualmente recuperar el producto. Se usan técnica estándar, bien conocidas, para la recuperación de lo sacáridos glicosilados, tal como la cromatografía de cap delgada o gruesa o la cromatografía de intercambio de iones. Adicionalmente, una o más técnicas cromatográficas d columna se pueden usar para la recuperación del producto. Usando estas técnicas, los sacáridos preparados por lo métodos anteriores de la invención pueden ser producidos una pureza esencial del 100% por el espectro NMR de protone y la cromatografía TLC. En un grupo de modalidades, el derivado d glicósido activado y el substrato aceptor se combinan en u regulador acuoso (por ejemplo 100 mM del regulador HEPES, p de 7.5) en una relación molar (aceptor/donador) d aproximadamente 1 a 5, junto con una cantidad catalítica d UDP (es decir, alrededor de 1 mM) y transferasa de glicosil (es decir, alrededor de 1.5 mg/ml) e incubar a unos 25 °C po un período de tiempo suficiente para producir rendimientos significantes del producto, por ejemplo, 1 hora a 3 días, dependiendo de la escala de la reacción. Para remover el reguiador del producto, cuando se usa el regulador HEPEs, la mezcla de reacción se combina con 25 volúmenes de agua desionizada, se carga en un cartucho Sep-Pack™ 18C (acondicionado previamente con acetonitrilo y luego con agua) y enjuagado con agua. El producto se eluyó con 50% de acetonitrilo y se concentró al vacío. La solución concentrada luego se caracterizó por una cromatografía TLC espectroscopia de masa. En otro aspecto, la presente invención suministra composiciones que son útiles para la formación de enlaces glicosídicos. Las composiciones contienen típicamente en mezcla un derivado de glicósido activado, una transferasa de glicosilo, un substrato aceptor y una cantidad catalítica de un fosfato de nucleótido o un análogo del mismo. Estos componentes, que incluyen las modalidades preferidas, son esencialmente aquéllos que se han descrito anteriormente.

En aún otro aspecto, la presente invención suministra composiciones que se preparan por los procesos anteriores . Se ofrecen los siguientes ejemplos solamente para fines de ilustración y los cuales no intentan limitar o definir la invención.

EJEMPLOS Materiales y Métodos Se realizaron las separaciones de cromatografía en capa delgada (TLC) usando placas analíticas Merck Kieselgel 60 F254. Los compuestos se detectaron visualmente por chamuscar con 5% de ácido sulfúrico en metanol. La cromatografía en columna se realizó usando una columna de gel de sílice de Kieselgel 60 (malla de 230-400) . Los solventes fueron de cualquier grado reactivo, certificado o de grado especial. El metanol seco se destiló del metóxido de magnesio preparado in si tu por la reacción del metanol con partículas de magnesio en la presencia de yodo. Los espectros 19F y de resonancia magnética nuclear XH (NMR) se registró en un aparato Bruker AC-200 de 2000 MHz. Los desplazamientos químicos se listaron en la escala delta (d) . Los compuestos se operaron en CDCl3, con referencia contr las señales de deuterio internas. La HF-piridina se compró de Aldrich. Todos los otros productos químicos fueron de Sigma y se usaron sin purificación ulterior. L espectroscopia de masa se realizó usando un espectrómetro de masa de electroscopia Perkin-Elmer triple cuádruple LC/MS/MS.

EJEMPLO 1 Este ejemplo ilustra la síntesis del fluoruro de a-D-galactosilo. 1. 1 Preparación de la 1 , 2 , 3 , 4 , 6 -penta-O- acetil -a-B-galactopir añosa La galactosa (60 g) se disolvió en piridina sec (420 ml) y luego se enfrió a 0°C. Se agregó lentamente el anhídrido acético (285 ml) , con agitación, y la mezcla se dejó agitar durante 5 días a la temperatura ambiente. La reacción se enfrió por la adición de agua de hielo (1.5 1) . El producto se extrajo en acetato de etilo (500 ml) y el extracto orgánico se lavó con 10% de HCl hasta un pH < 6, se lavó con una solución de bicarbonato de sodio al 5% hasta ser básico al tornasol, luego con NaCl saturado. El solvente se removió al vacío para dar un sólido blanco, con rendimiento del 88% (114 g) . El producto se recristalizó de etanol al 95% (punto de fusión de 109-110°C, teoría, 112-113°C) . 1.2 Preparación del fluoruro de 2, 3 , 4 , 6- tetra-O-acetilo -D-galacosilo El compuesto del título se preparó por el método de Hayashi et al., Chem. ett. 1747 (1984). En breve, la 1 , 2 , 3 , 4 , 6-penta-acetil a-D-galactopiranosa (5 g) se disolvió en 70% de fluoruro de hidrógeno - piridina (4 ml/mg de glicósido) y se dejó a 0°C durante 24 horas, en dicho tiempo la reacción fue completa por cromatografía TLC. La mezcla de reacción se agregó a agua de hielo (200 ml) y CHCL3 (200 ml) . La capa orgánica se removió y la solución acuosa se extrajo con CHC13 (5 x 50 ml) . El extracto orgánico agrupado se lavó con agua de hielo (200 ml) , luego con una solución de bicarbonato de sodio (200 ml) , después de lo cual la capa acuosa permaneció básica, luego con agua (50 ml) . La capa orgánica se secó sobre MgS04, se filtro y el solvente se removió al vacío para dar una goma incolora. Se agregó tolueno (3 x 100 ml) durante la remoción del solvente, para remover azeotrópicamente cualquier piridina remanente. El producto fue de una mezcla de fluoruros de a- y ß-galactosilos peracetilados . Ellos se separaron por la cromatografía en columna (120 g de gel de sílice, columna de 5 cm de diámetro, 30% de acetato de etilo / 70% de hexanos) . Las fracciones de columna que contienen sólo el fluoruro de 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetilo a-D-galactosilo se agruparon y el solvente se removió al vacío para suministrar un aceite claro. XH NMR (CDC13) : d 5.82 (dd, ÍH J1/P 53.0 Hz, J1>2 2.8 Hz,H-l), 5.55 '(dd, ÍH , J4>5 1.8 Hz, J3/4 H-4) , 5.50 (dd, 1H, JH3?4 2.3 Hz, J2/3 10.0 Hz, H-3)., 5.27 (dd, ÍH, J2 P 21.8 Hz, J2/3 10.0 Hz, Jlj2 2.9 Hz, H-2), 4.34 (td, 1H, J45 1.8 Hz) , J5.6 Hz, J5/6 7.3 H-5) , 4.10 (m, 2H, H-6, H-6'), 1.97, 2.25, 2.40, 2.50 (4s, 12H, OAc). 19F NMR (CDC13, desacoplado): d-74.74 (s, a-fluoruro) . 1, 3 Preparación del fluoruro de a-D-galactosilo El compuesto acetilado anterior (0.428 g) se desacetiló con metóxido de sodio / metanol, luego se neutralizó pasándolo sobre un tapón de sílice, usando metanol seco. El solvente se removió al vacío para dar un aceite claro. Éste se secó por congelación a un sólido blanco (0.221 g) en 95% de rendimiento, que fue puro por la cromatografía TLC: EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra la síntesis de un oligosacárido rotulado fluorescentemente, con el uso del fluoruro de a-galactosilo. En un frasco Eppendord se agregaron 3 µl de 115 mM de fluoruro de a-galactosilo (0.35 µmoles) m, 3 µl de 100 mM de UDP (0.3 µmoles), 5 µl de 5 mM de aceptor (0.025 µmoles, FCHASE-galactosa = sistema #1 o FITC-lactosa = sistema #2) y 4 µl de 500 mM del regulador HEPES (pH de 7.5), que contiene 50 M de MnCl2 y 25 mM de DTT. La reacción se inició por la adición de 5 µl del material de transferasa de a-galactosilo (lGtC-18,6 mg/ml). Las reacciones se realizaron concurrentemente con controles tanto positivos (que contienen 6 µl de 3.5 mM de UDP-galactosa en lugar del fluoruro de a-galactosilo y UDP) como negativos (que contienen o UDP-galactosa o fluoruro de a-galactosilo y UDP, pero no enzima) . EL curso de la reacción se vigiló por TLC (sistema de solventes de 7:2:1:0.2, acetato de etilo, metanol, agua, ácido acético) . Después de 1 hora, la reacción de control positivo para ambos sistemas fue del 95% completa, pero aquélla de la reacción de prueba fue sólo del 20 o 10% completa para los sistemas 31 y #2, respectivamente. Las reacciones se dejaron a la temperatura ambiente durante 17.5 horas y luego se comprobaron por cromatografía TLC. En este momento, ambas reacciones de prueba parecieron ser completas. Los valores de Rf para cada componente de reacción fueron como sigue: aceptor de FCHASE-galactosa Rf = 0.6, producto de FCHASE-lactosa Rf = 0.5, aceptor de FITC-lactosa Rf = 0.4, produsto de FITC-trisacárido R£ = 0.25, donador de fluoruro de a-galactosilo Rf = 0.37 Las placas se leyeron usando luz UV de onda larga para visualizar los compuestos rotulados fluorescentes y se sumergieron en ácido sulfúrico al 5% en metanol y se chamuscaron para observar la posición del fluoruro de a-galactosilo. Los productos de reacción se aislaron (cartucho Sep Pack 18C, se lavaron con 10 ml de agua, se eluyeron con 2 ml de acetonitrilo al 50% y se analizaron por la espectroscopia de masa de electropulverizado. m/z /arau) de los productos fueron como sigue: sistema #1 - FCHASE-galactosa estándar, 743.2; (-) reacción de control usando el donador de UDP-galactosa, 743.2; (-) reacción de control usando el donador de fluoruro de a-galactosilo, 743.2; (+) control de reacción usando el donador de UDP-galactosa, 905.4; reacción de prueba usando el donador de fluoruro de galactosilo, 905.4. sistema #2 - FITC-lactosa estándar, 823.2; (-) reacción de control usando el donador de UDP-galactosa, 823.2; (-) reacción de control usando el donador de fluoruro de a-galactosilo, 823.2; (+) reacción de control usando el donador de UDP-galactosa, 985.2; reacción de prueba usando el donador de fluoruro de galactosilo, 985.2.

EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra que el fluoruro de galactosilo puede actuar como un donador y aceptor del glicosilo. Es posible que, en la ausencia de un substrato aceptor agregado, la transferasa de glicosilo pueda generar el fluoruro de Gal a (1—4) galactosilo, usando el fluoruro de a-galactosilo como tanto el donador como el aceptor del glicosilo. Para determinar que una enzima es capaz de usar el fluoruro de galactosilo en la capacidad de un aceptor, se realizó el siguiente experimento. En tres frascos se colocaron 400 mM de fluoruro de galactosilo, 3 mM de UDOP, 5 mM de DTT, 15 mM de MnCl2 y 100 mM de regulador Tris (pH de 7.5) . El primer frasco sirvió como un control negativo y se agregaron 50 mM de lactosa. La enzima lgtC-19 (0.8 mg) se agregó al segundo frasco. El tercer frasco sirvió como un control positivo, que contiene tanto el lgtC-19 como la lactosa. Si el fluoruro de a-galactosilo actúa como un aceptor, el producto de transferencia sería el disacárido, Gala (l-4) Gal-F. Después de 22 horas, las mezclas de reacción se analizaron por la cromatografía TLC y se obtuvo la evidencia de la formación del disacárido a partir del fluoruro de a-galactosilo y los resultados se tabulan en la Tabla 1.

Tabla 1; Resultados de la cromatografía TLC de las reacciones de transferencia catalizadas con lgtC-19. Determinado en 4:2:1:0.1 (acetato de etilo / metanol / agua / ácido acético) , 22 horas después del inicio. (V indica que está presente el componente; X indica que está ausente el componente . ) Este experimento sugiere que la enzima es capaz de usar el fluoruro de a-galactosilo tanto como el aceptor como el donador. El producto es Galaa (1—»4) Gal-F, como se muestra en la reacción de prueba con un Rf de 0.48 (Tabla 1) . Con el fin de confirmar que la enzima es capaz de usar el fluoruro de a-galactosilo como tanto un donador como un aceptor del glicosilo, se realizó una nueva mezcla de reacción y después de 11 minutos, la reacción se detuvo por la inmersión en un baño de agua hirviendo. Esto promovió la hidrólisis de cualquier fluoruro de glicosilo. Esta vez las mezclas de reacción se sometieron al análisis de la cromatografía HPLC. Cuando se compararon los trazos de la cromatografía HPLC antes y después del tratamiento térmico, apareció una nueva cresta de disacárido (TR = 9.5 min), que indicó que el Gala (1—3>4) Gal-F es el producto de disacárido inicial formado (véase la Figura 5) . Habiendo determinado que el fluoruro de a-galactosilo fue capaz de actuar tanto como un donador como un aceptor en la transferencia del galactosilo catalizada por lgtC, se determinó la relación kcat / K,,, de la pendiente de la línea tangente a la parte inicial de la curva descrita por v0 versus la concentración del fluoruro de a-galactosilo. Las constantes cinéticas para el fluoruro de a-galactosilo y el UDP se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 : Constantes cinéticas obtenidas usando el fluoruro de a-galactosilo como el substrato donador para la transferencia del galactosilo catalizada con lgtC-19 a la lactosa, medida a un pH de 7.5, con 100 M de lactosa y 15 M de MnCl2, a 30 °C a Determinado en 2 mM de UDP. b Determinado en 107 mM de fluoruro de a-galactosilo c Calculado con base en la kcat determinada para UDP. La dependencia del régimen de reacción en las concentraciones del UDP, siguiendo la cinética de Michaelis- Menten, permite determinar los valores aparentes de tanto kcat como de K,,, para UDP. Una K^ estimada se puede obtener suponiendo que kcat= 1.3 min"1 (el valor aparente observado bajo estas condiciones cuando la concentración del fluoruro de a-galactosilo permaneció fijo en 107 mM) . Usando este valor y la relación medida de k^/K,,. ap de 6.0 x 10"3 min"1 mM"1 a K^ap de 220 mM se calculó para el . fluoruro de a- galactosilo. Aunque esta estimación del K^ ap para el fluoruro de a-galactosilo puede ser levemente menor que el valor real de esta constante cinética, suministrará una estimación razonable del valor verdadero (dentro de un factor de dos) . Esta determinación no puede hacerse directamente de los datos experimentales debido al error grande asociado con Vmax en esos resultados. Adicionalmente, es importante notar que -el UDP necesita sólo estar disponible en la reacción en pequeñas cantidades y que su función sea catalítica en naturaleza. El UDP no se consumió por la reacción.

EJEMPLO 4 Este ejemplo ilustra que el fluoruro de a-galactosilo transfiere su residuo de azúcar al propio UDP, que forma la UDP-galactosa in si tu .

Un Ensayo Acoplado Continuo para la Detección de la UDP-Galactosa Se desarrolló un ensayo acoplado continuo para medir cualquier UDP-galactosa formada del fluoruro de a-galactosilo y UDP en la presencia de la enzima lgtC-19. Este sistema implicó dos enzimas de acoplamiento: UDP-galactosa 4 -epimerasa y deshidrogenasa de UDP-glucosa (véase la Figura 6) .

Se espera se forme el siguiente equilibrio: fluoruro de a-galactosilo + UDP + E <-» UDP-galactosa + E + F (donde E = lgtC-19) . Como un substrato natural para lgtC-19, la UDP-galactosa se une fuertemente a la enzima. Así, la inhibición del producto fuerte (UDPP-galactosa) se espera detendrá esta reacción de proceder en forma muy prolongada. El sistema de ensayo acoplado aquí descrito, alivia esto consumiendo la UDP-galactosa conforme se libera de ligtC-19. Conforme la UDP-glucosa formada de la UDP-gal-4 -epimerasa se convierte al ácido UDP-glucurónico, un cambio en absorbencia se midió a 340 nm, que corresponde al régimen de reacción, con 2 moles de NAD convertidos a NADH para cada mol de UDP-galactosa que se forma. De esta manera, se puede medir el régimen de la producción de la UDP-galactosa. El fluoruro de a-galactosilo y el UDP sirven juntos como un análogo de la UDP-galactosa para la reacción de transferencia de galactosilo catalizada por lgtC-19. Así, es posible que las enzimas de acoplamiento, la 4-epimerasa de la UDP-galactosa y la deshidrogenasa de la UDP-glucosa, puedan también utilizar estos substratos. Para asegurar que esto no fue posible, se ensambló una reacción de control, en la cual todos los componentes del ensayo, excepto el lgtC-19 se agregaron. Esta mezcla de reacción no mostró un cambio en la absorbencia apreciable (340 nm) en un período de 10 minutos. La adición de la UDP-galactosa (0.04 mM) a la mezcla de ensayo produjo un aumento agudo en la absorbencia (?A340 = 0.5) que se atribuyó directamente al substrato agregado. Así, el sistema de acoplamiento funcionó, pero no utilizó el fluoruro de a-galactosilo y el UDP como substratos . En seguida, el efecto de variar las concentraciones del lgtC-19 agregado se determinó. Como se muestra en la Figura 7, se ve una correlación lineal entre el régimen del cambio de absorbencia a 340 nm y la cantidad de lgtC-19 agregado a la mezcla de ensayo. Esto indicó que la UDP-galactosa se produjo por la transferencia, catalizada con lgtC-19, de la galactosa desde el fluoruro del a-galactosilo al UDP y que el sistema de acoplamiento de la 4-epimerasa de la UDP-galactosa / deshidrogenasa de la UDP-glucosa fue capaz de medir exactamente el régimen de la reacción.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación, se incorporan aquí como referencia en la especificación en tal extensión como si cada publicación, patente o solicitud de patente individuales se indicara específica e individualmente, estar incorporada aquí como referencia. Aunque la invención anterior se describió en detalle como ilustración y ejemplo para fines de claridad de entendimiento, será obvio que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del ámbito de las reivindicaciones anexas .

Claims (46)

1. REIVINDICACIONES 1. Un proceso para obtener un aceptor glicosilado, este proceso comprende : mezclar, en un medio acuoso, un derivado de glicósido activado, un substrato aceptor, una transferencia de glicosilo dependiente de nucleótido y un miembro seleccionado del grupo que consta de una cantidad catalítica de un fosfato de nucleótido y un análogo de fosfato de nucleótido, para formar el aceptor glicosado, en que el derivado de glicósido es una alternativa a un substrato que ocurre naturalmente de la transferasa de glicosilo.
2. 2. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en que la mezcla acuosa de reacción tiene un valor del pH de aproximadamente 5 a 10, y una temperatura de aproximadamente 0 a 40°C.
3. 3. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en que el derivado de glicósido activado es un fluoruro de glicosilo .
4. 4. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en que el derivado de glicósido activado es un mesilato de glicosilo.
5. 5. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende la etapa de recuperar el aceptor glicosilado.
6. 6. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en que la transferasa de glicosilo es un miembro seleccionado del grupo que consta de: transferasas de a-sialilo, transferasas de a-glucosilo, transferasas de a-galactosilo, transferasas de a-fucosilo transferasas de a-manosilo, transferasas de a-xilosilo, transferasas de a-N-acetil-hexosaminilo, transferasas de ß-sialilo, transferasas de ß-glucosilo, transferasas de ß-galactosilo, transferasas de ß-fucosilo, transferasas de ß--manosilo, transferasas de ß-xilosilo, transferasas de ß-N-acetil-hexosaminilo.
7. 7. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en que el medio acuoso es un medio acuoso regulado.
8. 8. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en que el substrato aceptor se selecciona del grupo que consta de un oligosacárido, un monosacárido, un sacárido rotulado fluorescente y un derivado de sacárido.
9. 9. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 8, en que el derivado de sacárido es un antibiótico de aminoglicósido.
10. 10. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 8, en que el oligosacárido es la lactosa.
11. 11. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 8, en que el sacárido rotulado fluorescente se selecciona del -grupo que consta de una FTTC-lactosa, FCHASE-lactosa, FITC-galactosa y FCHASE-galactosa.
12. 12. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en que el derivado de glicósido activado es un miembro seleccionado del grupo que consta de un fluoruro de a-galactosilo, fluoruro de a-manosilo, fluoruro de a-glucosilo, fluoruro de a-fucosilo, fluoruro de a-xilosilo, fluoruro de a-sialilo, fluoruro de a-N-acetilglucosaminilo, fluoruro de a-N-acetilgalactosaminilo, fluoruro de ß-galáctosilo, fluoruro de ß-manosilo, fluoruro de ß-glucosilo, fluoruro de ß-fucosilo, fluoruro de ß-xilosilo, fluoruro de ß-sialilo, fluoruro de ß-N-acetilglucosaminilo, fluoruro de ß-N-acetilgalactosaminilo.
13. 13. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en que la transferasa de glicosilo es un miembro seleccionado del grupo que consta de: transferasas de a-sialilo, transferasas de a-glucosilo, transferasas de a-galactosilo, transferasas de a-manosilo, transferasas de a-fucosilo, transferasas de a-xilosilo, transferasas de a-N-acetil-hexosaminilo, transferasas de ß-sialilo, transferasas de ß-glucosilo, transferasas de ß-galactosilo y transferasas de ß-N-acetil-hexosaminilo,
14. 14. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en que la transferasa de glicosilo se inmoviliza sobre un soporte sólido.
15. 15. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en que la transferasa de glicosilo es una transferasa de galactosilo, el derivado de glicósido activado es el fluoruro de a-D-galactosilo y el substrato aceptor es un disacárido.
16. 16. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 1, en que la transferasa de glicosilo es una transferasa de galactosilo, el derivado de glicósido activado es un fluoruro de a-D-galactosilo y el substrato aceptor es la lactosa.
17. 17. Una composición para formar un aceptor glicosilado, que comprende una mezcla de un derivado de glicósido activado, una transferasa de glicosilo, un substrato aceptor y una cantidad catalítica de un fosfato de nucleótido o un análogo de fosfato de nucleótido.
18. 18 Una composición, de acuerdo con la reivindicación 17, en que la transferasa de glicosilo es una transferasa de galactosilo, el derivado de glicósido activado es un fluoruro de a-D-galactosilo y el substrato aceptor es un disacárido.
19. 19. Una composición, de acuerdo con la reivindicación 17, en que la transferasa de glicosilo es una transferasa de galactosilo, el derivado de glicósido activado es un fluoruro de a-D-galactosilo y el substrato aceptor es la lactosa.
20. 20. Una composición preparada de acuerdo con el proceso de la reivindicación 1
21. 21. Una composición preparada de acuerdo con el proceso de la reivindicación 1, en que el derivado de glicósido activado es un fluoruro de glicosilo, el substrato aceptor se selecciona del grupo que consta de un oligosacárido, un monosacárido, un sacárido rotulado fluorescente y un derivado de sacárido, y la transferasa de glícosilo es un miembro seleccionado del grupo que consiste de transferasas de a-sialilo, transferasas de a-glucosilo, transferasas de a-galactosilo, transferasas de a-fucosilo transferasas de a-manosilo, transferasas de a-xilosilo, transferasas de a-N-acetil-hexosaminilo, transferasas de ß-sialilo, transferasas de ß-glucosilo, transferasas de ß-galactosilo y transferasas de ß-N-acetil-hexosaminilo,
22. 22. Una composición preparada de acuerdo con la reivindicación 14.
23. 23. Un proceso para obtener un glicósido de fosfato de nucleótido, este proceso comprende: mezclar en un medio acuoso un derivado de glicósido activado, una primera transferasa de glicosilo dependiente de nucleótido, y un miembro seleccionado del grupo que consta de una cantidad catalítica de un fosfato de nucleótido y un análogo de fosfato de nucleótido, para formar el glicósido de fosfato de nucleótido, en que el derivado de glicósido es una alternativa a un substrato que ocurre naturalmente de la transferasa de glicoslo.
24. 24. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 23, que además comprende la etapa de: mezclar, en el medio acuoso, una enzima, dependiente de azúcar, de fosfato de nucleótido.
25. 25. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 24, en que la enzima, dependiente de azúcar, de fosfato de nucleótido, se selecciona del grupo que consta de una segunda transferasa de glicosilo, una epimerasa, una deshidrogenasa, una pirofosforilasa y una transferasa de ribo'silo de difosfato de nucleótido.
26. 26. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 24, que además comprende al menos un substrato aceptor para formar un producto.
27. 27. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 26, en que este al menos un substrato aceptor es un miembro seleccionado del grupo que consta del dinucleótido de adenina de nicotinamida, fosfato de dinucleótido de adenina de nicotinamida, glucosa, un glucósido, galactosa, un galactósido, mañosa, un manósido, fucosa, un fucósido, ácido N-acetilneuramínico, una N-acetilneuraminida, xilosa, un xilósido, N-acetilglucosamina, una N-acetilglucosaminida, N-acetilgalactosamina, una N-acetilgalactosaminida, arabinosa, un arabinósido, una aglicona antibiótica, una aglicona detergente, un lípido, una sapogenina, un oligosacárido, un monosacárido, un sacárido rotulado fluorescente y un derivado de sacárido.
28. 28. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 23, en que el medio acuoso tiene un valor del pH de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10, y una temperatura de aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 40°C.
29. 29. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 23, en que el derivado de glicósido activado es un fluoruro de glicosilo.
30. 30. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 23, en que el derivado de "glicósido activado es un mesilato de glicosilo.
31. 31. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 23, que además comprende la etapa de recuperar el glicósido de -fosfato de nucleótido.
32. 32. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 26, que además comprende la etapa de recuperar el producto.
33. 33. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 23, en que la primera transferasa de glicosilo es un miembro seleccionado del grupo que consta de transferasas de a-sialilo, transferasas de a-glucosilo, transferasas de a-galactosilo, transferasas de a-fucosilo transferasas de a-manosilo, transferasas de a-xilosilo, transferasas de a-N-acetil-hexosaminilo, transferasas de ß-sialilo, transferasas de ß-glucosilo, transferasas de ß-galactosilo, transferasas de ß-fucosilo, transferasas de ß--manosilo, transferasas de ß-xilosilo, transferasas de ß-N-acetil-hexosaminilo .
34. 34. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 24, en que la enzima dependiente del azúcar, de fosfato de nucleótido, es un miembro seleccionado del grupo que consta de: transferasas de a-sialilo, transferasas de a-glucosilo, transferasas de a-galactosilo, transferasas de a-fucosilo transferasas de a-manosilo, transferasas de a-xilosilo, transferasas de a-N-acetil-hexosaminilo, transferasas de fisialilo, transferasas de ß-glucosilo, transferasas de fi-galactosilo, transferasas de ß-fucosilo, transferasas de fi--manosilo, transferasas de ß-xilosilo, transferasas de ß-N-acetil-hexosaminilo .
35. 35. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 23, en que el medio acuoso es un medio acuoso regulado.
36. 36. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 27, en que el derivado de sacárido es un antibiótico de aminoglicósido .
37. 37. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 27, en que el oligosacárido es la lactosa.
38. 38. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 27, en que el sacárido rotulado fluorescente se selecciona del grupo que consta de la FITC-lactosa, FCHASE-lactosa, FITC-galactosa y FCHASE-galactosa.
39. . 39. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 23, en que el primer derivado de glicosilo es un miembro seleccionado del grupo que consta del fluoruro de a-galactosilo, fluoruro de a-manosilo, fluoruro de a-glucosilo, fluoruro de a-fucosilo, fluoruro de a-xilosilo, fluoruro de a-sialilo, fluoruro de a-N-acetilglucosaminilo, fluoruro de a-N-acetilgalactosilo, fluoruro de ß-galactosilo, fluoruro de fi-manosilo, fluoruro de ß-glucosilo, fluoruro de ß-fucosilo, fluoruro de ß-xilosilo, fluoruro de ß-sialilo, fluoruro de ß-N-acetilglucosaminilo, fluoruro de ß-N-acetilgalactosilo.
40. 40. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 23, en que la transferasa es un miembro seleccionado del grupo que consta de: transferasas de a-sialilo, transferasas de a-glucosilo, transferasas de a-galactosilo, transferasas de a-manosilo, transferasas de a-fucosilo, transferasas de a-xilosilo, transferasas de a-N-acetil-hexosaminilo, transferasas de ß-sialilo, transferasas de ß-glucosilo, transferasas de ß-galactosilo y transferasas de ß-N-acetil-hexosaminilo,
41. 41. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 23, en que la transferasa de glicosilo se inmoviliza sobre un soporte sólido.
42. 42. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 23, 'en que la transferasa de glicosilo es una transferasa de galactosilo y el derivado de glicósido activado es el fluoruro de a-D-galactosilo.
43. 43. Una composición para formar un glicósido de fosfato de nucleótido, que comprende una mezcla de un derivado de glicósido activado, al menos dos transferasas de glicosilo, un substrato aceptor y un fosfato de nucleótido o un análogo de un fosfato de nucleótido.
44. 44. Una composición, de acuerdo con la reivindicación 43, en que una de estas al menos dos transferasas de glicosilo es una transferasa de galactosilo, el derivado de glicósido activado es un fluoruro de a-D-galactosilo y el substrato aceptor es un disacárido.
45. 45. Una composición, de acuerdo con la reivindicación 43, en que una de al menos estas dos transferasas de glicosilo es una transferasa de galactosilo, el derivado de glicósido activado es un fluoruro de a-D-galactosilo y el substrato aceptor es la lactosa.
46. 46. Una composición preparada de acuerdo con el proceso de la reivindicación 1.