MXPA99008619A - Metodo in vitro para la construccion de una biblioteca de adn - Google Patents
Metodo in vitro para la construccion de una biblioteca de adnInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para una construcción in vitro de una biblioteca de polinucleotidos homólogos recombinantes a partir de un número de diferentes cebadores y plantillas de ADN de partida al inducir plantillas de desplazamiento durante una síntesis del polinucleotido por lo cual:A cebadores extendidos se sintetizan por A) desnaturalización de las plantillas de ADN B) cebadores extendidos se sintetizan por A9 desnaturalización de las plantillas de ADN, b) cebadores reconocido o de alineamiento a las plantillas c) alargar los cebadores mencionados por el uso de una polimerasa, D9 detener la síntesis, y e) separar los cebadores alargados de las plantillas;B. se induce un deslizamiento de la plantilla por a) el aislamiento de los cebadores alargados de las plantillas y repetición de las etapas A:B:a A.e) usando los cebadores alargados ya sea cono ambos, cebadoresy1 plantillas, o b) repetición de las etapas A.b) a A.e) c.Este proceso se termina despúes de un número apropiado de ciclos de las etapas del proceso A y B.a, AYB.b, o combinaciones de los mismos.Opcionalmente los polinucleoidos son amplificados en una reacción estándar PCR, con cebadores específicos para amplificar selectivamente los polinucleotidos son amplificados en una reacción estándar pcr, son cebadores específicos para amplificar selectivamente los polinucleotidos de interés.
Description
MÉTODO IN VITRO PARA LA CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA DE ftDN
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con la optimización de secuencias de ADN, con el fin de: (a) mejorar las propiedades de una proteina de interés por generación artificial de diversidad genética de un gen que codifica para la proteína de interés mediante el uso de lo que se denomina técnica de redistribución de ADN o de genes para crear una biblioteca grande de "genes" que expresan la biblioteca de genes en un sistema de expresión adecuado y analizar las proteínas expresadas respecto a las características específicas para determinar si tales proteínas muestran las propiedades deseadas o b) para mejorar las propiedades de elementos reguladores tales como promotores o terminadores por generación de una biblioteca de estos elementos, transformar huéspedes adecuados con los mismos en conjunción operable con el gen estructural, expresar el gen estructural y analizar en busca de propiedades deseables en el elemento regulador.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se ha encontrado generalmente que pueden existir diferencias en una proteína que realiza cierta bioactividad y REF: 31384 que muestra cierta variación entre géneros incluso entre miembros de la misma especie. Por supuesto, esta variación es incluso más notable a nivel genómico. Esta diversidad genética natural entre genes que codifican para proteínas que tienen básicamente la misma bioactividad se ha generado en la naturaleza durante miles de millones de años y refleja una optimización natural de las proteínas codificadas con respecto al ambiente del organismo en cuestión. En la sociedad actual, las condiciones de vida están muy alteradas con respecto al ambiente natural -- y se ha encontrado que las moléculas bioactivas que se presentan de manera natural no están optimizadas para los diversos usos para los cuales las han puesto por la humanidad, especialmente cuando se utilizan para propósitos industriales. Por lo tanto, ha sido de interés para la industria identificar tales proteínas bioactivas que muestren propiedades ópticas con respecto al uso para el cual se pretende. Durante muchos años se ha realizado esto al analizar fuentes naturales, o mediante el uso de mutagénesis. Por ejemplo, dentro del campo técnico de enzimas para uso, por ejemplo en detergentes, la capacidad de lavado y/o lavado de trastes, por ejemplo de proteasas, lipasas, amilasas y celulasas que se presentan de manera natural se ha mejorado significativamente mediante modificaciones in vitro de las enzimas . En la mayor parte de los casos estas mejoras se han obtenido por mutagénesis puntual lo que resulta en sustitución, supresión o inserción de residuos aminoácidos específicos los cuales se han elegido ya sea en base a su tipo o en base a su posición en la estructura secundaria o terciara de la enzima madura (véase por ejemplo la patente de los Estados Unidos número 4,518,584). De esta manera, se ha realizado con éxito la preparación de variantes y mutantes de polipéptidos novedosos, tales como enzimas modificadas novedosas con características alteradas, por ejemplo actividad específica, especificidad de sustrato, estabilidad térmica, de pH y salina, pH óptimo, pl, Km, Vmax, etc., para obtener polipéptidos con propiedades mejoradas . Por ejemplo, dentro del campo técnico de enzimas del funcionamiento de lavado y/o lavado de trastes de, por ejemplo, proteasas, lipasas, amilasas y celulasas ha mejorado significativamente. Una solución alternativa para modificar proteínas y enzimas se ha utilizado en mutagénesis aleatoria, por ejemplo, como se describe en los documentos US 4,894,331 y WO 93/01285. Dado que es un proceso problemático y que consume tiempo obtener variantes de polipéptidos o mutantes con propiedades funcionales mejoradas, se han sugerido algunos métodos alternativos para preparación rápida de polipéptidos modificados. Weber et al., (1983), Nucleic Acids Research, vol. 11, 5661, describe un método para modificar genes mediante recombinación in vivo entre dos genes homólogos. Se construye y transfecta una secuencia de ADN lineal que comprende un vector plasmídico flanqueado por una secuencia de ADN que codifica para interferón alfa-l humano en el extremo 5' y una secuencia de ADN que codifica para interferón alfa-2 humano en el extremo 3', en una cepa rec A positiva de E. coli . Los recombinantes se identifican y aislan utilizando un marcador de resistencia. Pompón et al., (1989), Gene 83, p. 15-24, describe un método para redistribución de dominios de genes en citocromo P-450 de mamífero por recombinación in vivo de secuencias parcialmente homologas en Saccharomyces cerevisiae al transformar Saccharomyces cerevisiae con un plásmido linealizado con extremos rellenados, y un fragmento de ADN que es parcialmente homólogo a los extremos de plásmido. En el documento WO 97/07205, se describe un método por el cual se preparan variantes de polipéptido mediante la redistribución de secuencias de nucleótidos diferentes de secuencias homologas de ADN por recombinación en vivo utilizando ADN plasmídico como plantilla.
La patente de los Estados Unidos número 5,093,257
(Cesionario: Genencor Int. Inc.) describe un método para producir polipéptidos híbridos mediante recombinación in vivo .
Las secuencias híbridas de ADN se producen al formar un vector circular que comprende una secuencia de replicación, una primera secuencia de ADN que codifica para la porción aminoterminal del polipéptido híbrido, una segunda secuencia de ADN que codifica para la porción carboxi terminal del polipéptido híbrido. El vector circular se transforma en un microorganismo rec positivo en el cual se amplifica el vector circular. Esto resulta en la recombinación del vector circular mediado por el mecanismo de recombinación que se presenta de manera natural del microorganismo rec positivo, el cual incluye procariotas tales como Bacillus y E. coli , y eucariotas tales como Saccharomyces cerevisiae . Un método para la redistribución de secuencias homologas de ADN ha sido descrito por Stemmer (Stemmer, (1994) , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 10747-10751; Stemmer, (1994), Nature, vol. 370, 381-391) . El método se relaciona con la redistribución de secuencias homologas de ADN mediante la utilización de técnicas de PCR in vi tro . Los geTes recombinantes positivos que contienen secuencias de ADN redistribuidas se seleccionan de la biblioteca ADN en base en la función mejorada de las proteínas expresadas.
El método anterior también se describe en _ el documento WO 95/22625. WO 95/22625 se relaciona con un método para redistribuir secuencias homologas de ADN. Una- etapa importante en el método descrito en WO 95/22625 es cortar el polinucleótido de cadena doble plantilla homólogo en fragmentos aleatorios de un tamaño deseado seguido por reensamblado homólogo de los fragmentos en genes de longitud completa. Una desventaja inherente al método de WO 95/22625 sin embargo, es que la diversidad generada mediante ese método está limitada debido al uso de secuencias de genes homologas (como se define en WO 95/22625) . Otra desventaja en el método de WO 95/22625 se encuentra en la producción de fragmentos aleatorios por el corte de la plantilla polinucleotídica de cadena doble. Una referencia adicional de interés es WO 95/17413 que describe un método de recombinación de genes o de ADN por recombinación de secuencias específicas de ADN - denominados elementos de diseño (DE) - ya sea por recombinación de fragmentos sintetizados de cadena doble o por recombinación de secuencias generadas por PCR para producir lo que se denominan elementos funcionales (FE) que comprenden por lo menos dos elementos de diseño. De acuerdo con el método descrito en WO 95/17413, la recombinación se debe realizar entre los elementos de diseño que tengan secuencias de ADN con homología de - 1 ' -secuencia suficiente para permitir la hibridación de las secuencias diferentes que se van a recombinar. El documento WO 95/17413 por lo tanto también implica la desventaja de que la diversidad generada es relativamente limitada. Además, el método descrito consume tiempo, es costoso y no es adecuado para automatización. Pese a la existencia de los métodos anteriores aún existe la necesidad por mejores métodos de recombinación in vi tro iterativos para preparar variantes polipeptídicas novedosas. Tales métodos también deben ser capaces de realizarse en volúmenes pequeños, y deben ser susceptibles de automatización.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona brevemente con la utilización de desplazamiento de plantilla de una cadena de ADN recién sintetizada durante la síntesis de ADN in vi tro con el fin de generar redistribución de ADN. Mediante la utilización de esta técnica es posible obtener resultados de una manera más expedita y, en cierta medida incluso con una variación mayor que en los métodos mencionados antes. El método de la invención también es adecuado para la adaptación y automatización.
En una modalidad preferida, se utiliza la técnica en combinación con una polimerasa susceptible a errores por lo que se introduce una variación incluso mayor en la biblioteca generada . Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para la construcción de una biblioteca de polinucleótidos homólogos recombinados a partir de numerosas plantillas de ADN parentales diferentes iniciales de cadena sencilla o doble y de cebadores mediante desplazamiento de plantillas inducidos durante una síntesis polinucleotídica in vi tro utilizando una polimerasa, por lo que: A. se sintetizan cebadores extendidos o polinucleótidos mediante a) desnaturalización de las plantillas de ADN de cadena doble parentales para producir plantillas de cadena sencilla, b) alineamiento de los cebadores a las plantillas de ADN de cadena sencilla, c) extensión de los cebadores para iniciar la síntesis mediante el uso de polimerasa, d) provocar supresión de la síntesis, y e) desnaturalizar la cadena doble para separar los cebadores extendidos de las plantillas, B, se induce un desplazamiento de plantilla mediante: a) aislamiento de los cebadores extendidos de cadena sencilla recién sintetizados de las plantillas y repetición de las etapas A.b) a A.e) utilizando los cebadores extendidos producidos en (A) tanto en cebadores como en plantillas, o b) repetir las etapas A.b) a A.e), C. el proceso anterior se termina después de un número apropiadodeciclosdeprocesosdelas etapas A. y B.a), A. y B.b), o combinaciones de los mismos, y D. opcionalmente, los polinucleótidos producidos se amplifican en una reacción de PCR estándar con cebadores específicos para amplificar selectivamente los polinucleótidos homólogos de interés. En modalidades especificas, se pueden realizar diversas modificaciones en el proceso de la invención. Por ejemplo, es ventajoso aplicar una polimerasa defectuosa ya sea una polimerasa susceptible a errores para introducir mutaciones, en comparación con las plantillas, o una polimerasa que suspenda la síntesis de polinucleótidos prematuramente para llevar a cabo la supresión de la reacción. Se describen a continuación modificaciones adicionales . En un aspecto adicional, la invención se relaciona con un método para identificar polipéptidos que muestren propiedades mejoradas en comparación con polipéptidos que se presentan de manera natural de la misma bioactividad, por lo que una biblioteca de polinucleótidos homólogos recombinados producidos por el proceso anterior se clonan en un vector apropiado, el vector después se transforma en un sistema huésped adecuado, que se expresa en los polipéptidos correspondientes y se muestra, los polipéptidos después se analizan en un ensayo adecuado y se seleccionan los resultados positivos . Un aspecto adicional de la invención se relaciona con el método para producir un polipéptido de interés identificado en el proceso precedente, por lo que un vector que comprende un polinucleótido que codifica al polipéptido se transforma en un huésped adecuado, el huésped se hace crecer para que exprese el polipéptido, y el polipéptido es recuperado y purificado. Finalmente , en aspectos finales adicionales, la invención se relaciona con una proteína recombinada/redistribuida, la cual es obtenible por cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención, y la cual es una proteína recombinada/redistribuida que comprende las secuencias descritas en la presente (véase antes) . En aquellos aspectos finales de la invención, el término "obtenible" indica que la proteína se obtiene preferiblemente por un método de acuerdo con la invención. Sin embargo, también ' se puede utilizar una técnica de recombinación/redistribución conocida de la técnica anterior tal como la descrita en el documento WO 95/22625 o WO 95/17413, ya sea sola o en combinación con un método de acuerdo con la invención, con el fin de obtener la proteína recombinada. En consecuencia, los aspectos finales adicionales de la invención son: una proteasa recombinada/redistribuida que se puede obtener por cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención, y que comprende una secuencia recombinada, la cual contiene por lo menos dos secuencias parciales diferentes de por lo menos dos proteasas diferentes de tipo silvestre; una lipasa recombinada/redistribuida que se puede obtener por cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención, y que comprende una secuencia recombinada, con la cual contiene por lo menos dos secuencias parciales diferentes de tipo silvestre; lipasas recombinadas/redistribuidas de Pseudomonas que se pueden obtener por cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención, y que comprenden una secuencia recombinada, la cual contiene por lo menos dos secuencias parciales diferentes de por lo menos dos de las lipasas diferentes de pseudomonas de tipo silvestre; una xilanasa recombinada/redistribuida que se puede obtener por cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención, y que comprende una secuencia recombinada, la cual contiene por lo menos dos secuencias parciales diferentes de por lo menos dos xilanasas diferentes de tipo silvestre; una celulasa recombinada/redistribuida que se puede obtener por cualquiera de los nétodos de acuerdo con la invención, y que comprende una secuencia recombinada, la cual contiene por lo menos dos secuencias parciales diferentes de por lo menos dos celulasas diferentes de tipo silvestre; una amilasa recombinada/redistribuida obtenible por cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención y que comprende una secuencia recombinada, la cual contiene por lo menos dos secuencias parciales diferentes de por lo menos dos amilasas diferentes de tipo silvestre; una lacasa recombinada/redistribuida que se puede obtener por cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención y que comprende una secuencia recombinada, la cual contiene por lo menos dos secuencias parciales diferentes de por lo menos dos tipos diferentes de lacasas de tipo silvestre; una fitasa recombinada/redistribuida que se puede obtener por cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención, y que comprende una secuencia recombinada, la cual contiene por lo menos dos secuencias parciales diferentes de por lo menos dos fitasas diferentes de tipo silvestre.
DEFINICIONES
Antes de discutir esta invención con mayor detalle, se definirán los siguientes términos. "Redistribución" : El término "redistribución" significa la recombinación de fragmentos de secuencias nucleotídicas entre dos o más polinucleótidos homólogos lo que resulta en polinucleótidos de salida (es decir, polinucleótidos que se han sometido al ciclo de redistribución) que tienen muchos fragmentos nucleotídicos intercambiados, en comparación con los polinucleótidos de entrada (es decir, polinucleótidos homólogos de punto de inicio) . "Homología de secuencias de ADN o de polinucleótidos" . En el presente contexto, el grado de homología de la secuencia de ADN se determina como el grado de identidad entre dos secuencias que indica una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología puede ser determinada adecuadamente por medio de programas de computadora conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado por el paquete de programa GCG (Program Manual for the Winconsin Package, Versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Groups, 575 Science Drive, Madison, Winconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453) .
"Homólogo" : El término "homólogo" significa que una secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla puede hibridar con una secuencia de ácido nucleico complementaria de cadena sencilla. El grado de hibridación depende de muchos factores que incluyen la cantidad de identidad entre las secuencias y las condiciones de hibridación tales como temperatura y concentración salina, como se discute posteriormente (véase abajo) . Mediante la utilización --del programa de computadora GAP (véase antes) con los siguientes ajustes para comparación de secuencia de ADN: penalidad de creación de GAP de 5.0 y penalidad de extensión de GAP de 0.3, en el presente contexto se considera que dos secuencias de ADN serán capaces de hibridar (utilizando condiciones de hibridación de baja restricción como se definen posteriormente^ si mutuamente muestran un grado de identidad preferiblemente de por lo menos 70%, más preferiblemente de por" lo menos 80% e incluso de manera más preferible de por lo menos 85%. "Heterólogo" : Si dos o más secuencias de ADN muestran mutuamente un grado de identidad el cual es menor que el especificado antes, en el presente contexto se afirma que son "heterólogas" . "Hibridación" : Las condiciones experimentales adecuadas para determinar si dos o más secuencias de ADN de interés hibridizan o no, se define la presente como hibridación de baja restricción, como se describe con detalle en lo siguiente . Las moléculas a las cuales una sonda oligonucleotídica hibridiza bajo estas condiciones se detectan utilizando una película de rayos X o un generador de fosfoimagen . "Cebador":^ El término "cebador" se utiliza en la presente especialmente en relación con una reacción de PCR y es un oligonucleótido (especialmente un "cebador de PCR") definido y construido de acuerdo con las especificaciones estándar generales conocidos en la técnica ("PCR A practical approach" IRL Press, (1991)). "Un cebador dirigido a una secuencia" : El término "un cebador dirigido a una secuencia" significa que el cebador (preferiblemente para ser utilizado en una reacción PCR) se construye para mostrar por lo menos 80% de grado de identidad de secuencia con el fragmento de secuencia de interés, de manera más preferible por lo menos 90% de grado de identidad de secuencia con el fragmento de secuencia de interés, cebador el cual posteriormente es "dirigido a" . El cebador se diseña para específicamente el fragmento de secuencia o la región a la cual está dirigida a una temperatura dada. Especialmente, es esencial la identidad en el extremo 3' del cebador. "Flanqueante". El término "flanqueante" se utiliza en la presente en relación con secuencias de ADN constituidas de un fragmento de PCR significa que las secuencias parciales más exteriores del fragmento de PCR, tanto en los extremos 5 ' como 3 ' del fragmento de PCR. "Polipéptido" . Polímeros de aminoácidos algunas veces denominados como proteínas . La secuencia de aminoácidos determina la conformación plegada que asume el polipéptido, y esto a su vez determina las propiedades biológicas y actividad. Algunos polipéptidos consisten de una cadena polipeptídica única (monoméricos) , mientras otros comprenden varios polipéptidos asociados (multiméricos) . Todas las enzimas y anticuerpos son polipéptidos. "Enzima" . Una proteína capaz de catalizar reacciones químicas. Los tipos específicos de enzimas que se mencionan son amilasas, proteasas, carbohidrasas, lipasas, celulasas, oxidoreductasas, esterasas, etc. De interés específico en relación a la presente invención son las enzimas utilizadas en detergentes tales como proteasas, lipasas, celulasas, amilasas, etc .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona en su primer aspecto con un método para la construcción de una biblioteca de polinucleótidos homólogos recombinados a partir de un número de plantillas de ADN parentales de cadena sencilla o doble iniciales y cebadores mediante desplazamientos de plantilla inducidos durante una síntesis polinucleotídica in vi tro utilizando una polimerasa, por lo que: A. se sintetizan cebadores extendidos o polinucleótidos mediante a) desnaturalización de las plantillas de ADN de cadena doble parentales para producir plantillas de cadena sencilla, b) alineamiento de los cebadores a las plantillas de ADN de cadena sencilla, c) extensión de los cebadores para iniciar la síntesis mediante el uso de polimerasa, d) provocar supresión de la síntesis, y e) desnaturalizar la cadena doble para separar los cebadores extendidos de las plantillas, B) se induce un desplazamiento de plantilla mediante: a) aislamiento de los cebadores extendidos de cadena sencilla recién sintetizados de las plantillas y repetición de las etapas A.b) a A.e) utilizando los cebadores extendidos producidos en (A) tanto en cebadores como en plantillas, o b) repetir las etapas A.b) a A.e) , * - lß - C. el proceso anterior se termina después de un número apropiado de ciclos de etapas A. y B.a) , A. y B.b) , o combinaciones de los mismos, y D. opcionalmente, los polinucleótidos producidos se amplifican en una reacción de PCR estándar con cebadores específicos para amplificar selectivamente los polinucleótidos homólogos de interés. De acuerdo con la invención, 'la polimerasa puede ser una ADN o una ARN polimerasa, las polimerasas específicas que se mencionan son aquellas polimerasas de ADN como polimerasa
T4 , polimerasa T7, polimerasa I de ADN de E. coli o el fragmento Klenow de polimerasa I de ADN, u otras polimerasas termoestables tales como Taq, Amplitaq, Vent, Pwo. Una de las ventajas de la invención es que hace posible controlar la longitud de la extensión de los cebadores en la reacción de una manera conveniente. Esto se puede llevar a cabo por diversos medios tales como la elección de la polimerasa, las condiciones físicas y químicas durante la acción de la polimerasa, por ejemplo pH, temperatura, amortiguador, concentración salina y adición de diversas sustancias químicas. Se sabe que diversas polimerasas llevan a cabo la síntesis de ADN a velocidades diferentes (nucleótidos incorporados por segundo) . Por ejemplo, el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN tiene una " velocidad de extensión limitada en comparación con, por ejemplo, la polimerasa Taq (Sambrook et al. 1989). Las polimerasas también muestran diferencias en la capacidad de procesamiento, el cual es el número promedio de nucleótidos incorporados antes de que la polimerasa se disocie de la plantilla/cebador extendido; nuevamente, la polimerasa Klenow es un ejemplo de una polimerasa con capacidad de procesamiento limitada. Por lo tanto, la elección de la polimerasa es un medio importante para controlar la extensión promedio de los cebadores . Estas condiciones también pueden ejercer una influencia sobre la fidelidad de la polimerasa (la velocidad mediante la cual se introducen mutaciones puntuales; la transcriptasa inversa de VIH es un ejemplo de una polimerasa de baja fidelidad) , un parámetro útil al combinar la redistribución y la mutagénesis. En las modalidades específicas se pueden realizar diversas modificaciones en el proceso de la invención. Por ejemplo, es ventajoso aplicar una polimerasa defectuosa ya sea una polimerasa susceptible a errores para introducir mutaciones en comparación con las plantillas, o una polimerasa que suspenda la síntesis polinucleotídica prematuramente para llevar a cabo la supresión de la reacción. Tales polimerasas defectuosas que se pueden mencionar está la polimerasa Klenow, que tiene baja capacidad de procesamiento. En otra modalidad de la invención, se agregará una polimerasa después de cada ciclo, si la polimerasa utilizada no es termoestable . De acuerdo con la invención, las plantillas parentales de cadena sencilla o doble iniciales pueden ser diferentes en la medida en que contengan mutaciones puntuales diferentes en el mismo polinucleótido (gen) nativo o pueden ser polinucleótidos (genes) homólogos aislados de la naturaleza, los cuales, se pueden amplificar por PCR, o pueden ser combinaciones de los mismos. Las plantillas utilizadas en el proceso de la invención por lo tanto 3on homologas y muestran" -una identidad a nivel de ADN de, por ejemplo, más" de 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% o incluso más de 50% de identidad. Puede ser ventajoso utilizar plantillas preseleccionadas que comprendan mutaciones con propiedades mejoradas de interés. El presente método de recombinación de la invención por lo tanto recombinará las mutaciones mejoradas para análisis subsecuente para mejoramiento adicional de las propiedades de interés . Tales plantillas preseleccionadas con propiedades mejoradas _de interés pueden ser identificadas por procedimientos estándar en la técnica que comprende, por ejemplo: i) PCR de plantillas de interés, susceptibles a error seguido por ii) análisis/selección de plantillas con características mejoradas de interés. La frecuencia de mutagénesis (frecuencia de mutagénesis baja o alta) de la etapa de PCR y susceptible a error preferiblemente se ajusta en relación a la capacidad de análisis subsecuente, es decir, si la capacidad de análisis es limitada, la frecuencia de PCR susceptible a error preferiblemente es baja (es decir, una o dos mutaciones en cada plantilla) (véase el documento WO 92/18645 para detalles adicionales) . La supresión de la reacción de polimerasa en la etapa
A.d) puede obtenerse, como se indica antes, de diferentes maneras, por ejemplo al incrementar la temperatura, o al agregar reactivos específicos como se describe en el documento WO 95/17413. Cuando se eleva la temperatura para, este propósito, se prefiere utilizar temperaturas entre 90°C y 99°C. Cuando se utilizan agentes químicos, una posibilidad es DMSO. Los procedimientos apropiados se mencionan, por ejemplo, en el documento WO 95/17413. El proceso de la invención utiliza el alineamiento de los cebadores a las plantillas en la etapa l.b. En este contexto, el alineamiento puede ser aleatorio o especifico, lo que significa que puede ser en cualquier parte del polinucleótido o en una posición especifica, en base en la naturaleza del cebador. Además, los cebadores para ser utilizados pueden ser cebadores completamente aleatorios (Nisps-TSITSINNNNNN) (N significa una mezcla de las cuatro bases (A, T, G, C) y se utiliza en una posición particular en el cebador durante la síntesis) , cebadores semialeatorios o cebadores específicos. Si los cebadores extendidos producidos van a ser separados de los cebadores durante el proceso, es conveniente utilizar plantillas marcadas con el fin de proporcionar un medio sencillo de separación, un marcador preferido es biotina o digoxigenina . De acuerdo con la invención, el número de ciclos necesarios será menor de 500, en la mayor parte de los casos menor de 200 y habitualmente menor de 100 ciclos. En una modalidad de la invención, la redistribución in vi tro anterior se combina con la redistribución in vivo subsecuente por métodos como los descritos en el documento WO
97/07205. En su segundo aspecto, la invención se relaciona con un método 'para identificar polipéptidos que muestren propiedades mejoradas en comparación con polipéptidos que se presenten de manera natural de la misma bioactividad, cuando una biblioteca de polinucleótidos homólogos recombinados producidos por el proceso anterior se clonan en un vector apropiado, el vector después se transforma en un sistema de huésped adecuado, para ser expresado en los polipéptidos correspondientes, los polipéptidos después se analizan en un ensayo adecuado, y se seleccionan polipéptidos positivos. En una modalidad, se contempla que los polipéptidos de interés codificados por la biblioteca redistribuida se expresen como una proteína de fusión adecuada (por ejemplo como un híbrido con gilí de bacteriófago M13/fd) con el fin de mostrar el polipéptido recombinado sobre la superficie del fago o bacteria. En un tercer aspecto, la invención se relaciona con un método para producir un polipéptido de interés identificado en el proceso "precedente, por lo que un vector que comprende un polinucleótido y que codifica para un polipéptido es transformado en un huésped adecuado, el huésped se hace crecer para que exprese al polipéptido y el polipéptido se recupera y purifica. El uso de cebadores - aleatorios parciales
(semialeatorios) o cebadores completamente aleatorios (mezclas de bases en una cantidad seleccionada de todas las posiciones en el cebador) como punto de inicio para la síntesis de ADN proporciona ciertas posibilidades novedosas para el uso combinado de redistribución y mutagénesis aleatoria. Con frecuencia se asocia con dificultades para obtener una recombinación in vi tro de polinucleótidos que muestren una homología relativamente limitada. Mediante el uso de una modalidad de la invención, incluso polinucleótidos muy diferentes se pueden obligar a que se recombinen. De acuerdo con esa modalidad, se aplican por lo menos dos plantillas (o dos concentrados de plantillas diferentes) . La síntesis novedosa de un polinucleótido se basa entonces únicamente en una cadena (es decir, la cadena directa o la antisentido) , y la síntesis del otro polinucleótido se basa en la cadena opuesta. Esto se puede llevar a cabo al aislar cadenas complementarias de las dos plantillas, por ejemplo, al tener estas cadenas etiquetadas con biotina. La síntesis de ADN se inicia por alineamiento de cebadores ya sea específicos, parcialmente aleatorios o completamente aleatorios a estas plantillas, y agregar una polimerasa adecuada. Esto se puede llevar a cabo ya sea como reacciones separadas para las diferentes plantillas o en una sola reacción. Preferiblemente, la síntesis se realiza bajo condiciones que favorecen la producción de fragmentos nuevos relativamente cortos. Estos fragmentos posteriormente se pueden aislar de las plantillas en base en la etiqueta de afinidad. Se lleva a cabo una reacción de PCR en estos fragmentos como el material inicial que se origina de dos cadenas diferentes, los fragmentos recién sintetizados se deben recxnbinar con el fin de producir productos de PCR de longitud completa - una clase de recombinación forzada. Además, para esta modalidad una PCR rápida con extensión de tiempo corta o nula se puede aplicar ventajosamente con el fin de mejorar la recombinación especialmente si los acumulados de plantillas se utilizan para dos cadenas . La longitud del cebador y la temperatura de alineación utilizada en el proceso determina si los cebadores aleatorios se alinearán y el número de malos pareamientos entre la plantilla y el cebador que se pueden acomodar. Al variar la longitud del cebador y la temperatura de alineación, el método de la invención proporciona un medio para obtener mutagénesis aleatoria dentro de cierto intervalo de nucleótidos que representa la longitud del cebador. Por lo tanto, el método de la invención proporciona beneficios sustanciales en comparación con otros enfoques de mutagénesis aleatoria, especialmente la probabilidad elevada de varias sustituciones de bases cercanas entre si en la secuencia primaria, es decir, el uso de una cadena de 20' unidades completamente aleatoria (mezcla de los cuatro nucleótidos en las 20 posiciones completas) de acuerdo con la teoría bajo condiciones experimentales dadas, tomando en consideración cierta probabilidad razonablemente elevada para obtener varias sustituciones de bases cercanas entre si.
La PCR susceptible a error (= PCR con frecuencia de mutagénesis elevada) no proporciona esta posibilidad. La PCR susceptible a error proporciona una probabilidad muy baja de tener más de una sustitución de una base dentro de un codón (codificación para un aminoácido en un polipéptido traducido) . Evidentemente la sustitución de únicamente una base dentro de un codón no proporciona una mutagénesis aleatoria total (a nivel de proteína) pues únicamente se limita a un conjunto de sustituciones de aminoácidos que se pueden obtener por sustitución de una base a nivel de ADN (por ejemplo, metionina codificada por el codón ATG requieren una sustitución de tres bases para volver TGT o TGC, un codón que codifica cisteína) . En una modalidad de la invención, el proceso se realiza por lo tanto mediante la utilización de cebadores aleatorios o semialeatorios que tienen una longitud de 6 a
200 pb, preferiblemente de 10 a 70 pb, y mejor de 15 a 40 pb. Una de las ventajas en el método de la invención es su robustez. En algunas modalidades, la presencia constante de la plantilla de longitud completa proporciona una ventaja adicional que evita problemas de contaminación de PCR. Además, es mucho menos laborioso, menos complicado en comparación con otros métodos descritos y proporciona excelentes posibilidades de autornatización.
Cebadores de PCR:
Los cebadores de PCR se construyen de acuerdo con las descripciones estándar o convencionales en la técnica. Normalmente son de 10-75 pares de bases (pb) de largo. Sin embargo, para la modalidad específica que utiliza cebadores aleatorios o semialeatorios, la longitud puede ser sustancialmente mayor a la indicada antes.
Reacciones de PCR:
Si no se menciona de otra manera, la reacción de PCR se realiza de acuerdo con la invención y se lleva a cabo de acuerdo con protocolos estándar conocidos en la técnica. Se pretende que el término "aislamiento de fragmento de PCR" abarque de manera amplia y sencilla y una alícuota que contenga al fragmento de PCR. Sin embargo, preferiblemente el fragmento de PCR se aisla hasta el grado en el cual se remueven los excedentes de cebadores, nucleótidos, plantillas, etc. En una modalidad de la invención, el fragmento o fragmentos de ADN se preparan bajo condiciones que resultan en una frecuencia de mutagénesis aleatoria baja, media o alta. Para obtener una frecuencia de mutagénesis baja, la secuencia o secuencias de ADN (que comprenden al fragmento o fragmentos de ADN) se pueden preparar por un método de amplificación estándar por PCR (documento US 4,683,202 o Saiki et al., (1988), Science 239, 487 - 491). Una frecuencia de mutagénesis media o elevada se puede obtener al llevar a cabo amplificación por PCR bajo condiciones las cuales incrementen la incorporación equivocada de nucleótidos, por ejemplo como se describe por Deshler,
(1992), GATA 9(4), 103-106; Leung et al., (1989), Technique,
Vol. 1, No. 1, 11-15. También se contempla de acuerdo con la invención combinar la amplificación por PCR (es decir, de acuerdo con esta modalidad también mutación de frecuencias de ADN) con una etapa de mutagénesis utilizando un agente mutagenizante físico o químico adecuado, por ejemplo, uno que induzca transiciones, transversiones, inversiones, codificado, supresiones y/o inserciones.
Expresión de la proteína recombinante a partir de las secuencias redistribuidos recombinantes
La expresión de la proteína recombinante codificada por la secuencia redistribuida de acuerdo con el segundo y tercer aspecto de la presente invención se puede llevar a cabo mediante el uso de vectores de expresión estándar y sistemas de expresión correspondientes conocidos en la técnica.
Análisis y selección
En el contexto de la presente invención, el término "variantes polipeptídicas positivas" significa variantes polipeptídicas resultantes que poseen propiedades funcionales las cuales han mejorado en comparación con los polipéptidos producibles a partir de las secuencias de ADN introducidas correspondientes. Los ejemplos de tales propiedades mejoradas pueden ser tan diferentes como, por ejemplo, mejoramiento o disminución de actividad biológica, capacidad de lavado aumentada, termoestabilidad, estabilidad ante la oxidación, especificidad de sustrato, resistencia a antibióticos, etc. En consecuencia, el método de análisis que se va a utilizar para identificar variantes positivas dependerá de la propiedad que se desee cambiar en el polipéptido en cuestión, y en la dirección en la que se desee el cambio. En la técnica se han descrito muchos sistemas adecuados de análisis o selección para analizar o seleccionar la actividad biológica deseada. Los ejemplos son: Strauberg et al., (Biotechnology 13: 669-673 (1995) describe un sistema de análisis para" variantes de subtilisina que tienen estabilidad independiente a calcio; Bryan et al., (Proteins 1:326-334 (1986)) describe un ensayo de análisis para proteasas que tienen estabilidad térmica mejorada; y el documento PCT/DK96/00322 describe un ensayo de análisis para lipasas que tienen un funcionamiento de lavado mejorado en detergentes de lavado. Una modalidad de la invención comprende el análisis o selección de proteína o proteínas recombinantes, en donde la actividad biológica deseada es el funcionamiento en detergentes de lavado de trastes o de lavandería. Los ejemplos de detergentes adecuados para lavado de trastes o lavandería se describen en PCT-DK96/ 00322 y WO 95/30011. Por ejemplo, si el polipéptido en cuestión es una enzima y la propiedad funcional mejorada es el funcionamiento en el lavado, el análisis convenientemente se puede realizar mediante el uso de un ensayo de filtro basado en el siguiente principio : La célula huésped de recombinación se incuba sobre un medio adecuado y bajo condiciones adecuadas para que se secrete la enzima, se proporciona al medio con un filtro doble que comprende un primer filtro que une proteínas en la parte superior de un segundo filtro que muestra una capacidad baja de unión de proteínas . a recombinación de células huésped se localiza sobre el segundo filtro. Después de la incubación, el primer filtro que comprende la enzima secretada de la célula huésped de recombinación se separa y el segundo filtro que comprende tales células. El primer filtro se somete a análisis en búsqueda de la actividad enzimática deseada y se identifican las colonias microbianas correspondientes presentes en el segundo filtro. El filtro utilizado para unir la actividad enzimática puede ser cualquier filtro de unión de proteína, por ejemplo nylon o nitrocelulosa. El filtro superior que soporta a las colonias y al organismo de expresión puede ser cualquier filtro que no tenga afinidad o que presente una afinidad baja para unión de proteínas, por ejemplo acetato de celulosa o Durapore1®. El filtro puede ser pretratado con cualquiera de los acondicionadores que se van a utilizar para análisis o se puede tratar durante la detección de actividad enzimática. La actividad enzimática se puede detectar por un colorante, fluorescencia, precipitación, indicador de pH, absorbancia de IR o por cualquier otra técnica conocida para la detección de actividad enzimática. El compuesto de detección puede ser inmovilizado por cualquier agente inmovilizante, por ejemplo agarosa, agar, gelatina, poliacrilamida, almidón, papel filtro, tela; o cualquier combinación de agentes inmovilizantes. Si la propiedad funcional mejorada del polipéptido no es lo suficientemente buena después de un ciclo de redistribución, el polipéptido se puede someter a otro ciclo. En una modalidad de la invención en donde los polinucleótidos homólogos que representan varias de las mutaciones del mismo gen se utilizan como plantilla, por lo menos un ciclo de redistribución es un ciclo de retrocruce con el fragmento de ADN utilizado inicialmente, el cual puede ser un fragmento de ADN de tipo silvestre. Esto elimina las mutaciones no esenciales. Las mutaciones no esenciales también se pueden eliminar mediante el uso de fragmentos de ADN de tipo silvestre como se utiliza inicialmente en el material de ADN de entrada . También se contempla que se encuentra dentro de la invención polipéptidos que tengan actividad biológica tales como insulina, ACTH, glucagon, somatostatina, somatotropina, timosina, hormona paratiroidea, hormonas hipofisarias, somatomedina, eritropoyectina, hormona luteinizante, gonadotropina coriónica, factores de liberación hipotalámicos, hormonas antidiuréticas, hormona estimulante de la tiroides, relaxina, interferón, trombopoyetina (TPO) y prolactina. Un requerimiento para las secuencias de ADN parentales iniciales, que codifican para el polipéptido o polipéptidos que van a ser redistribuidos, es que sean homólogos en por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%. Las secuencias de ADN que tienen una menor homología tendrán menos inclinación a interactuar y recombinarse . También se contemplan de acuerdo con la invención, redistribuir polinucleótidos parentales que son homólogos como se indica antes, que se originan de organismos de tipo silvestre de diferentes géneros.
Además, las plantillas parentales iniciales que van a ser redistribuidas preferiblemente tienen una longitud desde aproximadamente 50 pb a 20 kb, preferiblemente de aproximadamente 100 pb a 10 kb, y de manera más preferible de aproximadamente 200 pb a 7 kb, especialmente de aproximadamente 400 pb a 2 kb. Las secuencias de ADN parentales puede ser cualquier secuencia de ADN, incluyendo secuencias de ADN de tipo silvestre, secuencias de ADN que codifican para variantes o mutantes, o modificaciones de los mismos, tales como secuencias de ADN extendidas o alargadas, y también pueden ser el resultado de secuencias de ADN que se han sometido a uno o más ciclos de redistribución (es decir, secuencias de ADN de salida) de acuerdo con el método de la" invención, o cualquier otro método (por ejemplo, cualquiera de los métodos descritos en la sección de la técnica anterior) . Cuando se utiliza el método de la invención, los polinucleótidos homólogos recombinados resultantes (es decir, secuencias de ADN redistribuidas) que han experimentado un intercambio numeroso de fragmentos nucleotídicos . Esto resulta en la sustitución de por lo menos un aminoácido dentro de la variante polipeptídica, si se compara con el polipéptido parental . Se debe entender que también se contemplan intercambios silenciosos (es decir, intercambio de nucleótidos los cuales no resultan en cambios en la secuencia de aminoácidos) .
MATERIALES Y MÉTODOS
El método específico utilizado en los ejemplos es:
A) Se mezcla ADN que codifica para diferentes variantes de enzima del mismo gen o de enzimas diferentes que tienen el mismo tipo de actividad codificada por genes homólogos. El ADN se proporciona ya sea como fragmentos de PCR, plásmido, fago o ADN genómico . B) El acumulado resultante de ADN se mezcla con ADN polimerasa, dNTP, un amortiguador adecuado y cebadores (que pueden ser oligómeros aleatorios) con una longitud de 6-30 nucleótidos) u oligómeros específicos (con una longitud de 6-50 nucleótidos) o una combinación de ambos tipos) . C) La mezcla de PCR se pone en un termociclador PCR (caliente o frío) en un tubo adecuado. cl) El termociclador se calienta a una temperatura de 90-100°C durante un período de tiempo (típicamente 1-10 min) con el fin de desnaturalizar las plantillas de ADN. c2) Posteriormente se sigue el siguiente procedimiento (ciclo) (repetido) . La plantilla se desnaturaliza
(típicamente 90-100°C durante 0-5 minutos) . Después se disminuye la temperatura (típicamente a un valor entre 10°C y 90 °C durante 0-5 minutos) para permitir el alineamiento del cebador con la plantilla de cadena sencilla. Ahora se incrementa nuevamente la temperatura hasta la temperatura de desnaturalización (90-100°C) (lo que permite una extensión pequeña de cebador que se va a sintetizar por la ADN polimerasa durante el cambio paulatino) . Alternativamente, se puede introducir un período de extensión corto (típicamente 0-30 segundos a 70-75°C) para permitir que se generen extensiones más grandes de los cebadores . Cuando la temperatura alcanza un valor en el que tiene lugar la desnaturalización, los cebadores extendidos y _ las plantillas se separan nuevamente. Este procedimiento se puede repetir (típicamente entre 1 y 99 ciclos) . D) Al haber realizado la cantidad deseada de ciclos, los polímeros de ADN pequeños que se han generado se pueden purificar de los oligómeros utilizados como cebadores. Una manera es aislar y clonar una banda amplificada específica que contenga el gen que codifica para el polipéptido de interés en un vector adecuado. Esto se puede llevar a cabo ya sea en gel de agarosa (típicamente aislando fragmentos de entre 50 y 1000 pares de bases) por medio de esferas (utilizando una •etiqueta de afinidad sobre las plantillas o los cebadores) o a través de columnas . E) Después los polímeros de ADN purificados (o no purificados) se pueden ensamblar en una reacción de PCR estándar (por ejemplo 94 °C, 5 minutos, (94°C, 30 segundos; 55°C, 30 segundos; 72°C, 2 minutos)* 25, 72°C 5 minutos, 4°C) . Los cebadores específicos o los polímeros de ADN generados por cebadores específicos se pueden agregar con el fin de generar un polímero de ADN específico que contenga el gen de _interés. Como se menciona en el punto D, este es un polímero de ADN que puede ser purificado y clonado en un vector de interés .
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Método 1
La gran ventaja del método ejemplificado aqui es la robustez y carencia de problemas de contaminación por PCR, debido a la presencia constante de la plantilla parental. Además, este método es menos laborioso que los métodos descritos en la técnica anterior, por lo que proporciona excelentes posibilidades de automatización. Se mezclan en cantidades equimolares nueve plásmidos diferentes que contienen secuencias de ADN que codifican para 9 variantes diferentes del gel para lipasa de H. lanuginosa .
Las variantes de genes contienen de dos a siete mutaciones dispersas a través del gen. La secuencia de ADN del gen para lipasa de H. lanuginosa y la secuencia de aminoácidos de la lipasa se describen en el documento EP 0 305 216. Las variantes se indican de acuerdo con la terminología estándar como se describe en por ejemplo, EP 0 396 608 y WO 97/07202. Se distribuyen los siguientes 9 genes variantes:
. N94K+D96L+E99K . SPPRRP+N94K+D96L+T231R+N233R+D234R+Q249R . SPPRRP+A19C+C36A+N94K+D96L+Q249R . STPRRP+N94R . SCIRR+N94K+D96L+3239C+Q249R . D137G+D167G+E210V . D96L+E99K+V187A . SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Q249R . N94R+F95L
Los siguientes componentes se mezclan en un microtubo: 2 µl de mezcla de plásmido (0.15 µg/µl), cebadores específicos que flanquean al gen (1 pmol/µl) , 2 µl de dNTP 2.5 mM, MgCl2 2.5 mM, 2 µl de amortiguador Taq 10* (Perkin Elmer) , 0.5 µl de enzima Taq en un volumen total de 20 µl . El tubo se coloca en un termociclador Perkin Elmer 2400. Se desarrolla el siguiente programa de PCR: (94°C, 5 minutos) 1 ciclo: (94°C, 30 segundos, 70°C, 0 segundos) 99 ciclos (72°C, 2 minutos, 4°C indefinido) 1 ciclo. La reacción de PCR se lleva a cabo en un gel de agarosa de 1.5%. Se retira por corte una banda de ADN "del tamaño esperado específico del gel de agarosa y se purifica utilizando JETsorb (de GENOMED Inc.). El producto PCR purificado se clona en un vector TA (de Invitrogen (el equipo de clonación original TA) . El producto ligado se transforma en una cepa estándar de Escherichia coli (DH5a) . Se secuencian completamente 20 transformantes para la determinación del gen de interés .
Resultados :
Se encontraron las siguientes 20 variantes:
1. D137G+D167G+E210V+Y213C 2. SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Q249R 3. N94R+F95L 4. SPPRRP+D137G*D167G+E210V 5. N94K+D96L+E99K+V187A+T267I 6. D137G+D167G+E210V 7. N94K+D96L+E99K+V187A 8. D57G+N94R+F95L+Q249R 9. N94K+D96L+E99K+E210V 10. SPPRRP+A19C+C36A+N94K+D96L 11. N94R+F95L 12. D137G+D167G+E210V 13. N94K+D96L+Q249R 14. SPPRRP+Q15P+A119+C36A+N94K+D96L " ~— 15. SPPRRP+N94K+D96L+T231R+N233R+D234R+Q249R 16. D137G+D167G+E210V 17. SCIRR+N94K+D96L+Q249R 18. N94K+D96L+E99K 19. N9"4R+F95L 20. SPPRRP+N94R+F95L+F113S+Q249R
Casi todas las mutaciones están representadas (19 de 20) indicando una desviación ligera para plantillas específicas.
Estadística:
Sin redistribución 10 Redistribución en por lo menos 3 plantillas Redistribución en por lo menos 3 plantillas
- Las secuencias redistribuidas después se pueden subclonar del vector TA de E. coli en el vector de levadura pJS026 como úñ fragmento BamHI-Xbal (véase el documento WO 97/07205), y por ejemplo se pueden analizar para nuevas secuencias redistribuidas con desempeño mejorado en detergentes (véase el documento WO 97/07205) .
EJEMPLO 2
Método 2 :
T" Se generaron productos de PCR de 10 genes variantes de lipasa diferentes como en lo anterior y se acumularon en cantidades equimolares.
Se redistribuyeron los siguientes 10_genes mutantes.
1'. D137G+D167G+E210V 2'. D96L+E99K+V187A 3' . N94K+D96L+E99K 4'. SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Q249R 5'. D111N+F211A+G225P 6' . SPPRRP+N94K+D96L+T231R+N233R+D234R+Q249R 7' . SPPRRP+A19C+C36A+N94K+D96L+Q249R 8 ' . STPRRP+N94R 9 ' . N94R+F95L 10'. SCIRR+N94K+D96L+E239C+Q249R
Se generó la siguiente mezcla en un tubo adecuado: 1 µl de mezcla PCR (0.1 µg) , cebador aleatorio decamérico (300 pmoles) , 2 µl de amortiguador Klenow 10* (Promega), dNTP 0.25 mM, MgCl2 2.5 mM en un volumen total de 20 µl. La mezcla se coloca en un termociclador PE2400 en donde se lleva a cabo el siguiente programa: 96 °C, 5 minutos, 25°C 5 minutos, 0.5 ml de enzima Klenow se agregan, 25°C, 60 minutos, 35 °C, 90 minutos. Este procedimiento genera un número elevado de polímeros de ADN pequeños que se originan de todas las partes del gen. Se extraen 10 µl de la prueba en gel de agarosa. Se agregan 10 µl de la mezcla de PCR (dNTP 0.25 mM, 10 µl de amortiguador Taq 10* (Perkin Elmer) , MgCl2 2.5 mM, 0.5 µl de enzima Taq) a los 10 µl en el tubo en el termociclador. Después se corre el siguiente programa de PCR estándar: (94°C, 5 minutos) 1 ciclo (94°C, 30 segundos, 45 °C, 30 segundos, 72 °C, 30 segundos) 25 ciclos, 72°C, 7 minutos, 4°C indefinido. Los productos de PCR se corren en un gel de agarosa a 1.5%. Se observa una banda no desviada transparente. Se aisla del gel el ADN entre 400 y 800 pb. La mitad del producto de PCR purificado se mezcla en un tubo con dos cebadores específicos (40 pmol) que flanquean al gen de interés, dNTP 0.25 mM, 2 µl de amortiguador Taq 10*, MgCl2 2.5 mM. Después se desarrolla el siguiente programa de PCR estándar: (94°C, 5 minutos) 1 ciclo, (94°C, 30 segundos, 50°C, 30 segundos, 72°C, 30 segundos) 25 ciclos, 72°C, 7 minutos, 4°C indefinido. El producto de PCR se corre en un gel de agarosa
1.5%. Se aislan una banda débil aunque específica del tamaño esperado. Se "corre un PCR adicional utilizando cebadores específicos (como se menciona antes, con el fin de amplificar el producto PCR antes de la clonación. El producto de PCR y el vector deseado se cortan en las enzimas de restricción apropiadas (BamHI/XhoI) . El vector y el producto de PCR se corren en un gel de agarosa 1.5% y se purifican del gel . El producto de PCR cortado y el vector cortado se mezclan en un amortiguador de ligasa con ADN ligasa T4 (Promega) . Después de ligación durante la noche a 16 °C, la mezcla se transforma en E. coli cepa DH5a.
Se secuencian completamente 19 clonas en la búsqueda del gen:
Resultados :
Se encontraron las 19 variantes siguientes:
1. STPRRP+N94R+N233R+D234R+Q249R 2. SPPRRP+N233R+D234R+Q249R 3. D96L+DI67G+Q249R 4. N94R 5. D167G 6. SPPRRP+A19C+A28T+N94K+D96L+D111N+E239C 7. SPPRRP+A19C+C36A+N94K+D96L+Q249R 8. N94K+D96L 9. N25T+D57G+N94R+E99K+D167G+T231R+N233R+D234R+Q249R 10. N94R+Q249R 11. D167G 12. D167G 13. T32I+N94R+F95L+D167G+Q249R 14. E87K+N94K+D96L 15. N94R+F95L+Q249R 16. N94K+D96L+D111N 17. STPRRP+S17T 18. N94K+D96L+V187A 19. SPPRRP+D57G+N94K+D96L+D111N+L151S
Todas las variantes de plantillas se representan indicando poca desviación para plantillas específicas. Aparentemente no hay puntos calientes con respecto al intercambio de mutación y parece estar distribuida uniformemente a lo largo del gen.
Estadística:
Sin redistribución 1 Redistribución en por lo menos 2 plantillas 10 Redistribución en por lo menos 3 plantillas 6 Redistribución en por lo menos 4 plantillas 1 Redistribución en por lo menos 5 plantillas 0 Redistribución en por lo menos 6 plantillas 1
Las secuencias redistribuidas después se subclonan del vector TA de E. coli en el vector de levadura pJS026 como un fragmento BamHI-Xbal (véase el documento WO 97/07205) , y por ejemplo, se analizan para secuencias redistribuidas nuevas con desempeño mejorado en detergentes (véase el documento WO 97/07205) .
Ej emplo 3
Redistribución de variante de amilasa:
En el ejemplo 1, se ha demostrado la manera en que se redistribuyen una gran cantidad de variantes múltiples de lipasa de H. lanuginosa . De una manera similar, se pueden distribuir las variantes de a-amilasas de Bacillus . Las solicitudes de patentes anteriores han identificado variantes de diversas oc-amilasas de la especie Bacillus mejoradas para propiedades particulares, por ejemplo termoestabilidad, estabilidad bajo condiciones con baja concentración de calcio, funcionamiento mejorado para lavado, etc., (véanse los documentos WO95/10603, W096/23874, W096/23873; y PCT/DK97/00197) . Las variantes de a-amilasa amyL de B . li cheniformis se pueden redistribuir como sigue. Todas las variantes se localizan en el vector de expresión de B . subtilis pDN1528 descrito en el documento WO95/10603. El experimento se lleva a cabo bajo las mismas condiciones exactas que en el ejemplo 1, excepto que los cebadores flanqueantes de 27 unidades utilizados para iniciar la síntesis de ADN son diferentes. La banda amplificada por PCR de aproximadamente 1500 pb se purifica a partir de un gel de agarosa y se clona como se describe en el ejemplo 1. Alternativamente, los sitios de restricción localizados dentro del gen amyL se pueden utilizar para clonar la biblioteca de genes redistribuidos en el plásmido de Bacillus pDN1528 o un vector de E. coli que contiene el gen amyL tipo silvestre, por ejemplo pJeENl descrito en el documento W096/23874.
Ejemplo 4
La redistribución de los dos genes que codifican para a-amilasas homologas: amyL y la amilasa identificada por la SEC. DE IDENT. NO : 2 (aminoácido) y la SEC. DE IDENT. NO : 5 (ADN) descrita en el documento W096/23873. La cadena directa (idéntica al ARNm) de amyL se puede amplificar en una PCR utilizando condiciones estándar. La cadena directa se separa de la cadena inversa en base en su afinidad a esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina y desnaturalización en las dos cadenas con NaOH. De manera similar, la cadena inversa (complementaria a ARNm) de la amilasa codificada por la SEC. DE IDENT. NO : 5
(W096/23873) se puede amplificar y aislar. Se utilizan dos cadenas de cebador como plantillas en una PCR: (94°C 5 minutos) + 99 ciclos de (94°C, 30 segundos; 60°C, 0 segundos) + (72°C, 5 minutos) utilizando cebadores aleatorios de diversas longitudes, polimerasa Taq y condiciones de amortiguador estándar como se describe en el ejemplo 1. El producto resultante de aproximadamente 1500 pb se clona ya sea como clonación TA como se describe en el ejemplo 1 (para verificación de la secuencia de la clona resultante) o en el vector de Bacillus pTVBHO utilizando sitios de restricción Sfil y PstI. La plantilla original se puede remover de PCR en cualquier etapa (por ejemplo después de 5 , 10 ó 20 ciclos) en base en la etiqueta de biotina) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere .
Claims (27)
1. Un método para la construcción de una biblioteca de polinucleótidos homólogos recombinados a partir .de muchas plantillas de ADN parental de cadena sencilla o doble de inicio diferente y cebadores al inducir desplazamientos de plantilla durante una síntesis polinucleotídica in vi tro utilizando -una polimerasa, por lo que A. se sintetizan cebadores extendidos o polinucleótidos mediante a) desnaturalización de las plantillas de ADN de cadena doble parentales para producir plantillas de cadena sencilla, b) alineamiento de los cebadores a las plantillas de ADN de cadena sencilla, c) extensión de los cebadores para iniciar la síntesis mediante el uso de polimerasa, d) provocar supresión de la síntesis, y e) desnaturalizar la cadena doble para separar los cebadores extendidos de las plantillas, B) se induce un desplazamiento de plantilla mediante: a) aislamiento de los cebadores extendidos de cadena sencilla recién sintetizados de las plantillas y repetición de las etapas A.b) a A.e) utilizando los cebadores extendidos producidos en (A) tanto en cebadores como en plantillas, o b) repetir las etapas A.b) a A.e) , C. el proceso anterior se termina después de un número apropiado de ciclos de etapas A. y B.a) , A. y B.b) , o combinaciones de los mismos, y D. opcionalmente, los polinucleótidos producidos se amplifican en una reacción de PCR estándar con cebadores específicos para amplificar selectivamente los polinucleótidos homólogos de interés.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la polimerasa es una polimerasa ADN termoestable, tal como Taq, Amplitaq, Vent y Pwo .
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la polimerasa es una ADN polimerasa tal como polimerasa T4, polimerasa T7, ADN polimerasa I de E. coli o un fragmento Klenow de ADN polimerasa I, y la polimerasa se agrega a la mezcla de reacción después de cada ciclo.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la polimerasa es una ARN polimerasa.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la polimerasa es una polimerasa susceptible a errores, tal como una transcriptasa inversa como las transcriptasas inversas de VIH.
6. El método de conformidad con "cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las plantillas parentales de cadena sencilla o doble iniciales son diferentes a las que contienen mutaciones puntuales diferentes en el mismo polinucleótido (gen) nativo o son polinucleótidos (genes) homólogos aislados de la naturaleza.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las plantillas parentales de cadena sencilla o doble iniciales muestran una identidad a nivel de ADN de, por ejemplo, más de 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 60%, 65%, 60%, 55% o incluso más de 50% de identidad.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la supresión de la reacción de polimerasa y la tapa A.d) se obtiene al incrementar la temperatura.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la temperatura se incrementa a un valor entre 90°C y 99°C, preferiblemente 94°C.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la supresión de la reacción de polimerasa en la etapa l.d se obtiene al agregar reactivos específicos, tales como DMSO.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque los cebadores comprenden una población de cebadores completamente aleatorios.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque los cebadores comprenden una población de cebadores semialeatorios.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque los cebadores comprenden una población de cebadores específicos.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 , caracterizado porque los cebadores están etiquetados, preferiblemente con biotina o digoxigenina.
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 o 14, caracterizado porque los cebadores aleatorios o semialeatorios tienen una longitud desde 6 hasta 500 pb, preferiblemente desde 15 hasta 300 pb y mejor desde 25 hasta 150 pb .
16. ~ El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, caracterizado porque los cebadores tienen desde 6 hasta 75 pb de longitud.
17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque las plantillas de ADN parental iniciales son por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 95% homologas.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque las plantillas de ADN parental iniciales se originan de organismos de tipo silvestre de diferentes géneros.
19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado porque las plantillas parentales originales tienen una longitud desde aproximadamente 50 pb hasta 20 kb, preferiblemente desde aproximadamente 100 pb hasta 10 kb y de manera mucho más preferible desde aproximadamente 200 pb hasta 7 kb, especialmente de aproximadamente 400 pb a 2 kb.
20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque las plantillas parentales iniciales son fragmentos de ADN lineal generados por una reacción por PCR.
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque las plantillas parentales iniciales se clonan en vectores adecuados, tales como un plásmido .
22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque las plantillas parentales iniciales representan un polinucleótido que codifica para una enzima, tal como una carbonilhidrolasa, carbohidrasa, o esterasa, tal como una proteasa, lipasa, amilasa, celulasa, oxidasa, óxido reductasa, etc.
23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque las plantillas parentales iniciales representan un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene actividad biológica, tal como insulina, ACTH, glucagon, somatostatina, somatotropina, timosina, hormona paratiroidea, hormonas hipofisarias, somatomedina, eritropoyectina, hormona luteinizante, gonadotropina coriónica, factores de liberación hipotalámicos, hormonas antidiuréticas, hormona estimulante de la tiroides, relaxina, interferón, trombopoyetina (TPO) y prolactina.
24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque las plantillas iniciales parentales representan un polinucleótido que contiene una función biológica tal como un inicio de transcripción (promotor) o terminación, inicio de traducción, sitios operadores relacionados con la expresión de los genes.
25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque el número de ciclos es menor de 500, 200 o menor de 100 ciclos.
26. Un método para identificar un polipéptido de interés que muestra propiedades mejoradas en comparación con polipéptidos que se presentan de manera natural u otros polipéptidos conocidos de la misma actividad, por lo que se produce una biblioteca de polinucleótidos homólogos recombinados por un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 que se clonan en un vector apropiado, el vector se transforma en un sistema huésped adecuado, para ser expresado dentro de los polipéptidos correspondientes y se exhibe, el polipéptido es analizado en un ensayo adecuado, y se seleccionan los polipéptidos positivos.
27. Un método para producir un polipéptido de interés identificado de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque un vector que comprende un polinucleótido que codifica para el polipéptido identificado se transforma en un huésped adecuado, el huésped se hace crecer para expresar el polipéptido y el polipéptido se recupera y purifica.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK0307/97 | 1997-03-18 | ||
DK0434/97 | 1997-04-17 | ||
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