MXPA99006105A - Uso de anticuerpos de anti-il-12 en el rechazo detransplantes - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para reducir o mejorar el rechazo crónico de un tejido transplantado mediante la administración de un anticuerpo de anti-IL-12, solo o en combinación con otros agentes terapéuticos efectivos.

Description

USO DE ANTICUERPOS DE ANTML-12 EN EL RECHAZO DE TRANSPLANTES Campo de la Invención La presente invención se refiere al uso de anticuerpos de anti-IL-12 para reducir o mejorar el rechazo crónico de un tejido transplantado en un sujeto mamífero.

Antecedentes de la Invención Las células Th CD4+activadas por antígeno pueden diferenciarse en cuando menos dos fenotipos distintos. Las células Thl producen D -2, IFN-, y TNF- y con frecuencia orquestan los efectos citopáticos dependientes de células T que se notan en ciertos estados autoinmunes, rechazo de aloinjerto y respuestas hipersensibles de tipo tardío. En contraste, las células Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10 y son las células Th2 clásicas para el aprovisionamiento de la ayuda de células B en la producción de Ab (1). De importancia central para esta naturaleza polarizada de las células T CD4+ es el papel de ciertas citocinas que actúan como transreguladores en la diferenciación de Thl y Th2. La IL-12 que es producida principalmente por macrófagos/monocitos activados es una citocina poderosa y probablemente obligatoria en la impulsión de la diferenciación de Thl (2). Verdaderamente, ratones que son deficientes en la IL-12 (3), la IL-12R1 (4), o STAT-4, un componente clave de la señalización de la IL-12, manifiesta respuestas de Thl deterioradas. La diferenciación de las células Th2, sin embargo, requiere de IL-4, la cual es producida por células T y células CD4+NK1.1+ (1). Como el paradigma de la Thl y la Th2 sostiene que el destino final de una respuesta inmune está determinado como una consecuencia de si la Thl o la Th2 tiene el control de la otra, se ha propuesto que una desviación inmune de Thl a Th2 puede ser benéfica en ciertos procesos patológicos mediados por Thl. Verdaderamente, una desviación de Thl a Th2 que se produce por el tratamiento con citocinas de Th2 o mAb de anti-IL-12 es altamente benéfica en varios modelos de autoinmunidad dependiente de células T (6-12), sugiriendo un papel inequívoco para las células Th2 como una población reguladora importante de la inmunidad en esta situación.

El rechazo de aloinjerto en recipientes sin modificar está consistentemente asociado, si bien no en forma universal, con un patrón de Thl de activación de la inmunidad. Más aún, los recipientes de aloinjerto que son tratados con regímenes inmunosupresores tolerantes con frecuencia manifiestan una respuesta de tipo Th2 durante el periodo de tratamiento (13-17). No obstante, los hospederos con deficiencia de la IL-2 rechazan aloinjertos a pesar de una fuerte expresión de IL-4 (18), y los hospederos de aloinjerto que tienen deficiencias de IL-4 y que reciben inmunosupresión potente pueden ser sometidos permanentemente a injertos (19, 20). Además, han fracasado (21, 22) los intentos de inducir la injertación permanente o crear un estado de tolerancia a los injertos a través de la administración de citocinas de Th2 de larga actividad (esto es, proteínas de fusión de IL-lOIg e IL-4Ig) o desviación inmune a través de la aplicación de antagonistas de EL,- 12. Es confuso el porqué el tratamiento de recipientes de aloinjerto con tales estrategias, lo cual es extremadamente efectivo en la disminución de la autoinmunidad (6, 12), no ha probado ser eficaz en los transplantes. En adición a este misterio, los estados de tolerancia neonatal y la "tolerancia infecciosa" a aloantígenos puede quebrantarse a través de la adrninistración de anti-IL-4 (23, 25). Nosotros hemos razonado que las respuestas aloinmunes y autoinmunes dependientes de células T difieren en cuando menos dos formas diferentes e interrelacionadas. Primero, la respuesta del hospedero a aloinjertos desajustados por MHC incluye respuestas a Ags de MHC extraños (donador) presentados directamente (esto es, presentación de Ag directa), en tanto que la inmunidad está caracterizada por la presentación indirecta de autoantígenos sobre moléculas de auto MHC. Segundo, el rechazo de aloinjertos incompatibles por MHC activa más clonas de células T que lo que lo hacen las respuestas autoinmunes típicas. Sería deseable, por lo tanto, el poder determinar si estos factores que se encuentran en el corazón de la paradójica capacidad de desviación inmune reducen la autoinmunidad dependiente de células T en tanto que fracasan en mitigar las respuestas dependientes de células T, a aloinjertos desajustados por MHC. También sería deseable determinar si el antagonismo de la E -12, preferiblemente por un anticuerpo de anti-EL-12, inhibirá el rechazo en el transplante de tejido.

Resumen de la Invención La presente invención provee un método para la reducción o mejoramiento del rechazo crónico de un tejido transplantado en un sujeto mamífero, el cual comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de anti-IL-12. Preferiblemente, dicho sujeto es humano. En otras modalidades preferidas, el tejido transplantado tiene un desajuste de aloantígenos menores con dicho sujeto. En ciertas modalidades preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo injertado por CDR, un anticuerpo humanizado o fragmentos de ellos que se unen a B -12. Preferiblemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo humano. Modalidades adicionales proporcionan la administración del anticuerpo en combinación con cuando menos algún otro agente terapéutico. Preferiblemente, dicho otro agente es uno que reduce o elimina una señal inmune co-estimulatoria secundaria, tal como, por ejemplo, una forma soluble de CTLA4, un anticuerpo dirigido a B7.1, o un anticuerpo dirigido a B7.2 o un anticuerpo dirigido a CD28. En otras modalidades preferidas, el otro agente terapéutico es un inmunosupresor, tal como, por ejemplo, ciclosporina o rapamicina.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una expresión intrainjerto de transcriptos de gene de Thl (IL-2 e IFN-) y Th2 (IL-4 e IL-10) en aloinjertos de isletas desajustados por MHC. Los aloinjertos de isleta fueron cosechados en el día 8 después del transplante a partir de ratones recipiente sin tratar o tratados con anti-IL-12, y la expresión intrainjerto de los transcriptos de gene de citocina fue determinada mediante QRT-PCR. Los resultados son expresados como picogramos de ADNc del gene objetivo por picogramo de ADNc de GAPDH. Se muestran los datos representativos que fueron detectados en uno de tres animales en cada grupo. La Figura 2 es una expresión intrainjerto de transcriptos de gene de Thl (IL-2 e IFN-) y Th2 (E -4 e IL-10) en aloinjertos de isletas ajustados por MHC pero con múltiple desajustes menores por Ag. Los aloinjertos de isletas fueron cosechados en el día 16 después del transplante a partir de ratones recipiente sin tratar o tratados con anti-IL-12, y la expresión intrainjerto de los transcriptos de gene de citocina fue determinada mediante QRT-PCR. Los resultados son expresados como picogramos de ADNc del gene objetivo por picogramo de ADNc de GAPDH. Se muestran los datos representativos que fueron detectados en uno de tres animales en cada grupo. La Figura 3 ilustra la inducción de tolerancia en recipientes con múltiples desajustes menores por Ag y tratados con anti-IL-12. La nefrectomía del riñon con injerto de isletas en cinco recipientes BALB/c al día 120 después del transplante condujo a un aumento agudo de los niveles de glucosa sanguínea. Ratones BALB/c nefrectomizados aceptaron un segundo aloinjerto de isletas de DBA/2J sin ninguna inmunosupresión. La Figura 4A ilustra la sobrevivencia de aloinjertos de isletas procedentes de ratones C57BL/6 KO de MHC clase II en recipientes BALB/c sometidos a timoctomía y con agotamiento de células T CD8+ que fueron tratados con mAb de anti-IL-12, y la Figura 4B ilustra el análisis de transcripto de gene de Thl (IFN-)/Th2 (B -4) de intrainjerto en recipientes de control tratados con Ab o anti-IL-12. La Figura 5 ilustra el análisis FACS de células T CD4+ y CD8+ en la sangre periférica de ratones de control o ratones recipiente con timoctomía y con agotamiento de CD8, al tiempo del rechazo del aloinjerto. A, teñido de Ab de control de isotipo; B, recipientes BALB/c de control y sin modificar; C, recipientes BALB/c con timoctomía y con agotamiento de CD8.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Como se emplea aquí, el término "anticuerpo de anti-IL-12" incluye, sin limitación, un / anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo injertado por CDR, un anticuerpo humanizado o fragmento de ellos que se unen a IL-12. Dicho término también incluye cualquier otra especie derivada de un anticuerpo o secuencia de anticuerpo que sea capaz de unirse a IL-12. Preferiblemente, dicho anticuerpo de anti-IL-12 es humano. Los anticuerpos de anti-IL-12 pueden ser producidos mediante métodos bastante conocidos por aquellos capacitados en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos de monoclonales de IL-12 pueden ser producidos mediante generación de hibridomas productoras de anticuerpos de acuerdo con métodos conocidos (ver por ejemplo, Goding. 1983. "-"" " ""'^»~'*"a««aaM--B--Ml«M-.IMJMa^^ ..

Monoclonal antibodies: principies and practice. Academic Press Inc., New York, Yokoyama. 1992. "Production of Monoclonal Antibodies" in Current Protocols in Immunology. Unit 2.5. Greene Publishing Assoc. And John Wiley & Sons). Los sueros policlonales y los anticuerpos para la EL- 12 pueden ser producidos mediante inoculación de un sujeto mamífero con IL-12 o fragmentos de ésta de acuerdo con métodos conocidos. Los fragmentos de anticuerpos, receptores u otros péptidos reactivos pueden ser producidos a partir de anticuerpos correspondientes mediante división y recolección de los fragmentos deseados de acuerdo con métodos conocidos (ver por ejemplo, Goding, supra; Andrew et al., 1992, "Fragmentation of Immunoglobulins" in Current Protocols in Immunology. Unit 2.8. Greene Publishing Assoc. And John Wiley & Sons). Los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos de una sola cadena también pueden ser producidos de acuerdo con métodos recombinantes conocidos (ver por ejemplo, 5,169,939; 5,194,594 y 5,576,184). Los anticuerpos humanizados también pueden ser producidos a partir de correspondientes anticuerpos de murino de acuerdo con métodos bastante conocidos (ver por ejemplo, Patentes de los E.U.A. Nos. 5,530,101; 5,585,089 y 5,693,762). El anticuerpo de anti-IL-12 también puede ser administrado en combinación con otros agentes terapéuticos que provea beneficios en el transplante de tejidos, tales agentes que proveen inmunosupresión o que de alguna otra forma hiporegulan la inmunorespuesta normal concomitante a los transplantes desajustados (tales como antagonistas de señales co-estimulatorias inmunes, secundarias). Una amplia variedad de tales agentes ya son conocidos para aquellos capacitados en la técnica y están comercialmente disponibles, tal como, por ejemplo, ciclosporina, rapamicina y compuestos relacionados. Ejemplos de antagonistas de señales co-estimulatorias inmunes y secundarias incluyen, sin limitación, formas solubles de CTLA4, anticuerpos dirigidos a B7.1, anticuerpos dirigidos a B7.2 y anticuerpos dirigidos a CD28. Las composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo de anti-IL-12 que son útiles en la práctica de los métodos de la presente invención también pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables, diluyentes, rellenadores, sales, reguladores, estabilizadores y/u otros materiales bastante conocidos en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del(los) ingrediente(s) activo(s) y que no es tóxico para el hospedero al cual es administrado. Las características del portador u otro material dependerán de la ruta de administración. Actualmente se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas deben contener aproximadamente 0.1 microgramos a aproximadamente 1 miligramo por mililitro del anticuerpo de anti-IL-12. La administración puede ser llevada a cabo en una variedad de formas convencionales. La inyección intraperitoneal es el método preferido de administración del anticuerpo de anti-IL-12. También pueden emplearse las inyecciones intravenosa, cutánea o sub-cutánea. Para inyección, el anticuerpo de anti-IL-12 preferiblemente será administrada en la forma de soluciones acuosas libres de pirógenos y parenteralmente aceptables. La preparación de tales soluciones de proteína parenteralmente aceptables, teniendo debida consideración respecto al pH, isotonicidad, estabilidad y similares, está dentro de los conocimientos de la técnica. La cantidad de anticuerpo de anti-TL-12 usada para el tratamiento dependerá de la severidad de la condición, la ruta de administración, la reactividad del anticuerpo con la EL- 12 o la actividad del anticuerpo, y finalmente será decisión del proveedor del tratamiento. En la práctica de los métodos de tratamiento de esta invención se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de anti-EL-12. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad total de cada componente activo del método o composición que sea suficiente para demostrar un beneficio significativo del paciente (por ejemplo, curación, mejoramiento, retraso o prevención del comienzo, prevención de la reaparición o recaída). Una técnica común para determinar una cantidad terapéuticamente efectiva para un paciente dado consiste en administrar dosis crecientes periódicamente hasta que se observa un beneficio significativo del paciente por la persona que está proveyendo el tratamiento. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que resulta en el efecto terapéutico, sea que se administre en combinación, en serie o simultáneamente. Una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de anti-DL-12 en esta invención se contempla que esté en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, preferiblemente aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, más preferiblemente aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. El número de administraciones puede variar, dependiendo del paciente individual y la severidad de la condición autoinmune.

Se administran agentes terapéuticos adicionales con el anticuerpo de anti-IL-12 de acuerdo con métodos conocidos para su administración, tales como, por ejemplo, instrucciones distribuidas con productos comercialmente disponibles. Tales agentes terapéuticos adicionales pueden ser administrados al mismo tiempo que, antes o después del tiempo de la administración del anticuerpo de anti-IL-12. Dichos agentes adicionales también pueden ser administrados por la misma o diferente ruta de administración que el anticuerpo de anti-IL-12.

Ejemplo El siguiente ejemplo demuestra que el tratamiento de ratones recipientes de aloinjerto de isletas, con mAb de anti-IL-12 es altamente efectivo en la producción de desviación inmune de Thl a Th2 en varios sistemas modelo (esto es, barreras totalmente por MHC, parcialmente por MHC, o por múltiples Ag menores). No obstante, el anti-IL-12 fracasó en prolongar la injertación del aloinjertos de isletas desajustados totalmente por MHC. Sin embargo, recipientes tratados con anti-IL-12 que portaban aloinjertos ajustados por MHC pero con múltiples desajustes menores por Ag, experimentaron una injertación prolongada; se alcanzó con frecuencia tolerancia a aloinjerto en la combinación de cepas DBA/2J (H-2d) a BALB/c (H-2d). En otro modelo, en el que la respuesta del hospedero fue dominada por células T CD4+ que respondían a alopéptidos del donador presentados en APCs del hospedero en el contexto de moléculas de auto MHC clase II, el tratamiento con anti-IL-12 probó ser extremadamente potente. De esta forma, la desviación inmune de Thl a Th2 produce injertación prolongada en comparación con recipientes de aloinjertos desajustados por MHC cuando el rechazo depende de los péptidos alogénicos presentados en forma indirecta y de una masa reducida de células T aloreactivas de respuesta.

Materiales y Métodos Reactivos Un Hibridoma de célula B produciendo un CD8 de anti-ratón de rata de agotamiento (2.43, IgG2a) fue adquirido de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VAA). Se prepararon ascitos en ratones desnudos y se usaron en el estudio. Genetics Institute (Cambridge, MA) amablemente proporcionó un mAb (C17.15, IgG2a) de IL-12 de anti-ratón de rata, de neutralización, que reconocía un epítope en la subunidad p40 de la IL-12. Se utilizó IgG2a de rata como un Ab de control de isotipo.

Animales Nosotros obtuvimos ratones macho B10.BR (H-2k), CBA/ca (H-2k), DBA/2 J (H-2d), B10.D2 (H-2d) y B6AF1 (H-2b/k.d) de 8 a 10 semanas de edad, procedentes del Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Ratones BALB/c (H-2d) machos fueron adquiridos en Harían Sprague-Dawley (Indianapolis, IN). Ratones deficientes en MHC clase II (C57BL/6Ab-/-) fueron obtenidos de Taconic (Germantown, NY). Todos los animales fueron alojados bajo condiciones estándar.

Transplante de isletas El transplante de isletas fue realizado como se describió anteriormente (18) con algunas modificaciones. Páncreas de donadores fueron sometidas a penetración de líquido in situ con 3.5 mi de colagenasa tipo IV en HBSS (2 mg/ml; Worthington, Biochemical, Freehold, NJ) a través del conducto biliar normal. Los páncreas fueron cosechados después de la penetración de líquido e incubados a 37 °C durante 40 minutos. etas crudas fueron liberadas del páncreas mediante vórtice suave y se purificaron adicionalmente en gradientes discontinuos de Percoll. Brevemente, la preparación de isletas crudas fue resuspendida en 4 mi de Percoll al 25%, y colocada en capas sobre la parte superior con 2 mi de Percoll al 23% seguido de 2 mi de gradientes de Percoll al 21% y 2ml al 11%. Después de centrifugación a 1800 rpm durante 10 minutos, las isletas fueron cosechadas de la interface de gradientes de 21/11% y lavadas dos veces en HBSS. Un total de 300 a 400 isletas fueron transplantadas bajo la cápsula renal de cada recipiente que había sido hecho diabético mediante una sola inyección i.p. de estreptozotocina (225 mg/kg; Sigma, St. Louis, MO). La función del aloinjerto fue monitoreada mediante mediciones de la glucosa sanguínea usando un monitor de glucosa sanguínea Accu-Check IJJ (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). La función primaria del injerto fue definida como un nivel de glucosa sanguínea de <200 mg/dl en el tercer día después del transplante, y el rechazo del injerto fue definido como un aumento en el nivel de glucosa sanguínea de >300 mg/dl en seguida a un periodo de la función primaria del injerto.

Histopatología El riñon izquierdo poseyendo transplantes de isletas fue retirado de los ratones recipientes en varios momentos después del transplante, se fijó en formalina al 10%, y se embebió en parafina. Secciones de tejido en serie (5 µm) fueron cortadas y montadas en portaobjetos de cristal Superfrost Plus (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), fijadas en metanol, y teñidas en hematoxilino y eoisino para la identificación de la composición de los infiltrados celulares.

Timoctomía y agotamiento de células T CD8+ La timoctomía fue realizada en ratones recipientes adultos BALB/c usando una técnica de succión por pipeta. Brevemente, los ratones BALB/c padecieron esternotomía media superior bajo anestesia general, y el timo fue retirado mediante aspiración suave. La piel fue entonces cerrada con suturas interrumpidas. A los 7 a 10 días después de la timotomia, los ratones fueron tratados con un mAb de anti-CD8 de agotamiento (2.43; ATCC) que fue administrado i.p. (0.2 mg) en los días 6, 3 y 1, antes del transplante como se describió anteriormente (26).

Citometría de flujo Se realizó el teñido de célula en dos colores. Brevemente, leucocitos de sangre periférica (1 x 106) fueron teñidos con mAb de CD4 de anti-ratón de rata biotinilado (GK1.5) sobre hielo durante 45 minutos, seguido de teñido con estreptavidino conjugado con FITC (PharMingen, San Diego, CA). Las células fueron lavadas dos veces en PBS-05% BSA y teñidas adicionalmente con un mAb de CD8 de anti-ratón de rata conjugado con picoeritrino (53-6.7; PharMingen). Se utilizaron como controles mAbs de anti-2,4,6-trinitrofenilo conjugado con fluorescente y ajustado por isotipo (PharMingen). Las células fueron lavadas posteriormente en PBS y analizadas usando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Extracción de ARN Muestras de tejido fueron homogeneizadas y se extrajo ARN celular total usando un equipo de aislamiento de ARN Qiagen (Chatsworth, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN fue transcrito en forma inversa en ADNc en una mezcla de reacción de 40µl conteniendo regulador de primera cadena (Tris-HCl 10 mM, KC1 15 mM y MgC12 0.75 mM), mezcla de trifosfato de deoxinucleósido 10 mM, DTT 100 mM, 5 U de inhibidor de RNasa (31U/µl RNasino; Pharmacia, Uppsala, Suecia), 1 µg/µl de BSA, 500 µg/ml de primarios aleatorios y 200 U de transcriptasa inversa de virus de leucemia de murino Moloney (Life Technologies, Grand Island, NY). La mezcla de reacción fue incubada a 37 °C durante 1 hora, terminada con inactivación por calentamiento a 65 °C durante 10 minutos y almacenada a-20 °C.

RT-PCR Cuantitativa (ORT-PCR Se realizó QRT-PCR como se reportó anteriormente (27) con algunas modificaciones. Brevemente, 1 µl de ADNc transcripto en forma inversa fue co-amplificado con una concentración conocida de un modelo competitivo específico de gene en un volumen de reacción de 50 µl conteniendo 10 mM de trifosfato de deoxinucleósido, 100 ng de primarios de sentido y antisentido, y 0.25 U de polimerasa Taq (Promega, Madison, WT) Los primarios específicos para ADNc de IL-2 de murino, EL-4, EL- 10, IFN-, y dehidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) fueron usados como se reportó previamente (18). Los competidores de ADN específicos de gene (poseyendo un deleción de 60-80 bp procedente de ADNc de tipo silvestre (wt)) fueron generados a partir de leucocitos de bazo estimulados con Con A utilizando primarios de doble sentido especialmente diseñados. Todos los competidores fueron clonados en un vector de clonación TA (Invitrogen, San Diego, CA), transfectados en células DH5 (Life Technologies), purificados, y cuantificados con un espectrómetro (Beckman, Columbia, MD).

El esquema de amplificación de PCR consistía en los siguientes componentes de ciclo: desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto, recocido a 55 °C durante 45 s, y extensión a 72 °C durante 1 minuto para cada ciclo en un termociclizador (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) por un total de 40 ciclos. Se incluyeron un control positivo y un control negativo para cada amplificación PCR. Los controles negativos fueron realizados omitiendo el ADNc inicial en la mezcla de reacción PCR. Como un control positivo se utilizó, ADNc procedente de leucocitos mononucleares de bazo estimulados con Con A. Además, la amplificación del gene de GAPDH expresado constitutivamente sirvió para cor-firmar el aislamiento exitoso y la transcripción inversa del ARN celular total. Los productos de PCR fueron analizados en gel de agarosa tenido al 2% con bromuro de etidio y fotografiado con películas Polaroid positiva/negativa (Polaroid 55, Cambridge, MA) bajo luz ultravioleta. Los resultados de PCR en la película negativa fue escaneada en una computadora usando un escaner de escritorio, y la densidad de las bandas del ADNc wt y del competidor específico de gene fue analizada usando el programa de computación ImmunoQuan (Versión 1.1, Hércules, CA). La magnitud de la expresión del gene objetivo es calculada y expresada como picogramos de ADNc del gene objetivo por picogramo de ADNc de GAPDH en cada muestra.

Ensayo de isotipo de IgG de suero Se utilizó un emparedado ELISA para valorar titulaciones de IgGl o IgG2a de suero. Brevemente, placas de 96 pozos fueron recubiertas con IgG de anti-ratón de conejo a 5 µg/ml (50 µ/pozo) a 4 °C durante toda la noche y subsecuentemente bloqueadas con BSA al 0.5% en PBS a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS-Tween 20 y posteriormente incubadas con suero diluido en serie (50 µl/pozo) a 4 °C durante toda la noche. Después del lavado en PBS-Tween 20, se agregó Ab de anti-ratón de rata específico de isotipo (5 µg/ml en regulador de bloqueo, 50 µl/pozo, Zymed Laboratories, Palo Alto, CA), y las placas fueron incubadas a 4 °C durante toda la noche, seguido de lavado por tres veces en PBS-Tween 20. Se agregó un IgG (1:1000 diluciones) de anti-rata de cabra conjugado con fosfatasa alcalina y se incubó adicionalmente a 4 °C durante 2 horas. La reacción se desarrolló mediante la adición de substrato de fosfatasa alcalina y se cuantificó en un lector de ELISA a 405 nm.

Estadísticas La sobrevivencia del injerto fue analizada usando la prueba de rango logarítmico; p < 0.05 fue considerado como importante.

Resultados mAb de anti-IL-12 indujo a desviación inmune de Thl a Th2 en ratones recipientes Para determinar si el tratamiento de ratones recipientes con un mAb de anti-DL-12 al momento del transplante de isletas puede inducir desviación inmune de Thl a Th2, se transplantaron aloinjertos de isletas crudas en ratones recipientes totalmente desajustados por MHC o ajustados por MHC pero con múltiple desajuste por Ag de histocompatibilidad. A los ratones recipientes les fue administrado i. p. 1 mg de mAb de anti-DL-12 en los días 0, 1 y 7 después del transplante, y la expresión intrainjerto de los genes de Thl (EL-2 e IFN-) y Th2 (II-4 e EL- 10) fue analizada por QRT-PCR. Los puntos de tiempo seleccionados para este análisis se correlacionaron con el tiempo de máxima infiltración de leucocitos en los injertos de recipientes sin tratamiento, según se valoró por histología (esto es, ocho días después del transplante en injertos desajustados por MHC y al día 16 en injertos con desajustes menores por Ag). Como se muestra en la Figura 1, se detectó una expresión vigorosa de IL-2 e IFN- en el rechazo de aloinjertos de isletas de B10.BR (H-2k) desajustadas por MHC por recipientes BALB/c (H-2d), mientras que los transcriptos de EL-4 fueron escasamente detectables. En recipientes tratados con IL-12, sin embargo, la expresión intrainjerto de DL-4 e EL-10 estaba marcadamente incrementada, y la expresión de EL-2 e IFN- fue proporcionalmente hipo-regulada. De esta forma, la desviación de Thl a Th2 fue manifestada en seguida al tratamiento con anti-EL-12. De manera similar, el rechazo de aloinjertos menores de isletas de DBA/2J (H-2d) con desajustes menores por Ag por recipientes BALB/c (H-2d) también estaba asociada con una expresión intrainjerto fuerte de EL-2 e DFN-, en tanto que el tratamiento con anti-IL-12 produjo una expresión aumentada de EL-4 e EL- 10 y una disminución proporcional de la expresión de BL-2 e IFN- (Figura 2). Un análisis de isotipo de IgG de suero también demostró una titulación incrementada de IgGl, lo cual con frecuencia está asociado con una respuesta inmune de Th2, a los 14 días después del tratamiento con anti-EL-12 en ratones recipientes (datos no mostrados). De esta forma, el anti-DL-12 es altamente efectiva en la inducción de una desviación inmune de Thl a Th2, así como de un cambio del isotipo de IgGl de la producción de Ab en ratones recipientes que reciben aloinjertos ya sea desajustados por MHC o ajustados por MHC pero con desajustes menores por Ag.

El tratamiento con anti-IL-12 resultó en injertación prolongada de aloiniertos de isletas ajustados por MHC y múltiples desajustes menores por Ag pero no desajustados por MHC. La Tabla I resume los tiempos de sobrevivencia de injerto de aloinjertos de isletas que fueron transplantados a través de barreras de histocompatibilidad mayores o menores.

Aloinjertos de isletas de B10.BR (H-2k) totalmente desajustados por MHC fueron rechazados por recipientes BALB/c (H-2d) con un tiempo de sobrevivencia medio (MST) de 15 días (15 ± 2, n = 5). El tratamiento con anti-IL-12 fracasó en prolongar la sobrevivencia de aloinjerto (MST = 13 ± 3, n = 5) a pesar de desviación inmune a una respuesta de aloinjerto dominada por Th2 (Figura 1). Aloinjertos de isletas de DBA/2J (H-2d) parcialmente desajustados por MHC fueron rechazados por recipientes B6AF1 (H-2b/k.d) tratados con Ab de control de isotipo con una MST de 17 días (17 ± 5, n = 6). El tratamiento con mAb de anti-IL-12, el cual indujo una desviación de Thl a Th2 en ratones recipientes según se valoró mediante expresión de gene de intrainjerto para EL-4 e IFN- (datos no mostrados), produjo una prolongación modesta de aloinjertos de isletas de DBA/2J (25 ± 6, n = 6) (p < 0.0.5), pero la totalidad de los aloinjertos de isletas fueron rechazados eventualmente (Tabla I).

( O Tabla I. Sobrevivencia de aloinjertos de isletas a través de barreras3 de histocompatibilidad de MHC o menores Donador Recipiente n Barreras Tratamiento Sobrevivencia (días) MST BALB/c BALB/c Singeneica Ninguno >120, >120, >120, >120 >120 BIOBR BALB/c 5 MHC Ninguno 12, 14, 15, 17, 17 15 BIOBR BALB/c 5 MHC+b Ab de Control 14, 15, 17, 17, 17 17 BIOBR BALB/c 5 MHC+b Anti-IL-12 12, 12, 13, 13, 17 13 DBA/2J B6AF1 6 MHC+b Ab de Control 14, 16, 17, 18, 20, 20 17 DBA/2J B6AF1 6 MHC Parcial Anti-IL-12 20, 22, 22, 26, 28, 35 25 B10.BR CBA/ca 4 MHC Parcial Ninguno >120, >120, >120, >120 >120 B10.D2 BALB/c 5 Menor Ninguno 15, 16, 17, 19, 21 17 B10.D2 BALB/c 6 Menor Amti-IL-12 20, 23, 25, 28, 35, >100 38 DBA/2J BALB/c 6 Menor Ninguno 20, 22, 26, 27, 30, 31 26 DBA/2J BALB/c 6 Menor Ab de Control 21, 22, 28, 28, 31, 34 28 DBA/2J BALB/c 10 Menor Anti-IL-12 68, 70, 82„ >120, >120, >120, >120 >120, >120, >120, >120 ' Sobrevivencia de aloinjertos de isletas que fueron transplantados a través de barreras de histocompatibilidad. Isletas crudas de ratones donadores (300-400 isletas) fueron transplantadas bajo la cápsula renal en recipientes que habían sido hechos diabéticos mediante una sola inyección i.p. de streptozotocina a los 5 a 7 días antes del transplante. Grupos de ratones recipientes no recibieron tratamiento o fueron tratados con Anti-IL-12 o Ab de control (1 mg i.p. en los días 0, 1 y 7 después del transplante). b MHC+ = barreras de histocompatibilidad de MHC o menor.

El rechazo de aloinjertos de isletas ajustados por MHC pero con múltiples desajustes menores por Ag presentó variación sobresaliente entre diferentes combinaciones de cepas. Los aloinjertos de isletas de B10.BR (H-2k) fueron aceptados permanentemente por recipientes CBA/ca (H-2k) sin ninguna intervención terapéutica (> 120 días, n = 4), aunque los injertos de piel son vigoramente rechazados en esta combinación de cepa (24). En contraste, los aloinjertos de isletas de DBA/2J (H-2J) fueron rechazados por recipientes BALB/c (H-2d) con una MST de 26 días (26 ± 4, n = 6). De manera interesante, los recipientes BALB/c (H-2d) rechazaron isletas de B10.D2 (H-2d) con múltiples desajustes menores por Ag con un vigor importante (MST = 17 ± 3, n = 5) (Tabla I). En contraste al efecto del tratamiento con anti-IL-12 sobre la sobrevivencia de aloinjertos desajustados por MHC, el tratamiento con mAb de anti-EL-12 de recipientes BALB/c hizo posible una injertación prolongada de aloinjertos de isletas de B10.D2 con múltiples desajustes menores por Ag (MST > 38 días, n = 6) y la sobrevivencia indefinida de aloinjertos de isletas de DBA/2J. En efecto, 7 de 10 ratones recipiente BALB/c con isletas de DBA/2J sobrevivieron por > 120 días, mientras que otros 3 ratones fueron rechazados en los días 68, 70 y 82 después del transplante, respectivamente. Los recipientes de control BALB/c tratados con mAb rechazaron los aloinjertos de isletas de DBA/2J en los 28 días (28 ± 6, n = 6). El examen histológico de los aloinjertos de isletas que fueron cosechados a los 120 días después del transplante mostraron infiltración esporádica linfocítica focal circundante pero sin invadir los aloinjertos de isleta; este hallazgo está en contraste impresionante con los ratones de control tratados con Ab, en los que la invasión linfocítica y la destrucción de isletas fue masiva (datos no mostrados). La nefrectomía fue realizada (se colocaron aloinjertos de isletas de DBA/2J bajo la cápsula renal) en cinco ratones recipientes BALB/c a los 120 días después del transplante para determinar si la tolerancia es evidente en ratones recipiente tratados con anti-IL-12 y que poseían aloinjertos de larga sobrevivencia, ajustados por MHC pero con desajuste menor por Ag. Como se muestra en la Figura 3, la remoción del riñon izquierdo que poseía los aloinjertos de isleta de DBA/2J resultó en un aumento pronunciado en los niveles de glucosa en sangre; estos niveles fueron > 350 mg/dl después de 2 días, demostrando que la euglicemia de estos ratones fue mantenida por los aloinjertos de isleta. Los ratones BALB/c sometidos a nefrectomía aceptaron un segundo aloinjerto de isletas de DBA/2J sin ninguna inmunosupresión, indicando un estado de tolerancia.

El tratamiento con anti-IL-12 indujo injertación prolongada de aloiniertos de isletas procedentes de donadores C57BL/6 deficientes en MHC clase EL en recipientes BALB/c sometidos a timoctomía v con agotamiento de células CD8+. Claramente, una desviación inmune de Thl a Th2 induce una injertación prolongada de aloinjertos de isletas que han sido transplantados a través de múltiples barreras menores de histocompatibilidad, pero no mayores. En virtud de que el rechazo de aloinjertos ajustados por MHC pero con múltiples desajustes menores por Ag está mediado principalmente por la presentación indirecta de aloantígenos vía una masa más pequeña de clonas de células T de respuesta que de aloinjertos desajustados por MHC (28, 29), nosotros razonamos que el reconocimiento de los aloinjertos MHC del donador en el contexto de "auto" MHC también puede hacer posible que la tolerancia se estabilice vía una desviación inmune en este modelo. En esta circunstancia de presentación de Ag indirecta, el número de clonas de células T que proliferan en la respuesta del aloinjerto es mucho menor que aquella en respuesta a moléculas de MHC extrañas, intactas, que se presentan en forma directa. Como una prueba estricta de esta hipótesis, los aloinjertos de isletas procedentes de ratones C57BL/6 (H-2b) knockout (KO) de MHC clase II fueron transplantados en ratones recipiente BALB/c (H-2d). Los ratones recipientes fueron sometidos a timoctomía y se agotaron sus células CD8+. De esta forma, la activación de las células T CDA+ de los recipientes en este modelo está dominada por un reconocimiento indirecto de los aloantígenos del donador presentados por los APCs de los recipientes. Como se muestra en la Figura 4A, los ratones de control tratados con Ab rechazaron los aloinjertos de isletas a los 28 días (MST = 28 + 12, n = 5), confirmando que la presentación indirecta de Ag no juega un papel importante en el rechazo del aloinjerto de isletas (30). El análisis FACS de sangre periférica al momento de la pérdida del injerto demostró un agotamiento completo de células T CD8+, en tanto que la composición de las células T CD4+ en los ratones recipiente no se alteró (Figura 5). La adrrúnistración de anti-IL-12, la cual es muy efectiva en la inducción de una desviación inmune de Thl a Th2 en este modelo (Figura 4B), induce una injertación prolongada de los aloinjertos de isletas deficientes en MHC clase EL Tres de cinco aloinjertos de isletas sobrevivió más de 100 días; los dos restante fueron rechazados a los días 52 y 66 después del transplante, respectivamente (Figura 4A). En contraste, isletas procedentes de donadores C57BL/6 wt fueron rechazados en forma vigorosa por ratones recipientes BALB/c sin modificar que habían sido tratados con anti-IL-12 (11 ± 2, n = 4) o por recipientes BALB/c sometidos a timoctomía, sin agotamiento de CD8 que habían sido tratados con anti-IL-12 (12 ± 4, n = 6).

Discusión Desde el descubrimiento de los fenotipos de Thl y Th2 de trans-regulación y la aclaración de los efectos inmunoreguladores de la Th2 en la autoinmunidad y en enfermedades infecciosas, ha habido una gran anticipación de que una desviación inmune de Thl a Th2 puede ser crítica en la adquisición de tolerancia a los transplantes. Si bien la terapia de tolerización en algunos modelos de animales con frecuencia falsea la activación inmune hacia una respuesta dominada por Th2 (13, 14), los estudios profundos y exhaustivos han demostrado en forma repetida que una desviación inmune de Thl a Th2 no permite en forma uniforme la adquisición de tolerancia a los transplantes (31, 32). En el presente estudio, nosotros hemos buscado el determinar la base del fracaso frecuente de la desviación inmune de Thl a Th2 y de las citocinas de Th2 para reducir la severidad del rechazo a aloinjertos a pesar del hecho de que tales medidas han probado ser altamente efectivas en el tratamiento de muchos estados autoinmunes dependientes de células T (6, 8, 33). Nosotros hemos razonado que la aloinmunidad y la autoinmunidad difieren en términos de la naturaleza de la presentación de Ag y del tamaño clonal de las células T de respuesta (29). La respuesta del hospedero a aloinjertos desajustados por MHC abarca una población inusualmente grande de clonas de células T. Más aún, el reconocimiento directo de MHC extraño durante la respuesta del aloinjerto no tiene contraparte en estados autoinmunes, en los que los antígenos son procesados por auto APCs y se presenta en el contexto de auto MHC. Nosotros hemos buscado el determinar si estas facetas más bien únicas de la respuesta de aloinjerto son responsables del fracaso en la prevención del rechazo a aloinjerto a través de desviación inmune de Thl a Th2.

Claramente, el tratamiento con mAb de anti-IL-12 al tiempo del transplante en este modelo de aloinjerto de isletas es altamente efectivo en la inducción de una respuesta de tipo Th2, sin importar barreras de histocompatibilidad (esto es, barreras totalmente de MHC, parcialmente de MHC o múltiples Ag menores (Figuras 1 y 2). Mientras el impacto de la anti- IL-12 sobre el patrón de la expresión de citocina era consistente, se notaron diferencias sorprendentes en el impacto de dicha terapia sobre la duración de la injertación en condiciones desajustadas por MHC contra ajustadas por MHC pero con múltiples desajustes menores por Ag. De acuerdo con las observaciones de Piccotti et al. usando un modelo de aloinjerto de corazón (22), el tratamiento con anti-IL-12 fue totalmente inefectivo en prolongar la injertación de aloinjertos de isletas desajustadas por MHC (Tabla I). Con relación al modelo de presentación de Ag y el tamaño clonal de células T de respuesta, la respuesta de aloinjerto a aloinjertos ajustados por MHC pero con desajuste menor por Ag puede asemejarse más cercanamente la respuesta a autoantígenos que la respuesta a injertos desajustados por MHC. De forma diferente las respuestas a aloinjertos desajustados por MHC, péptidos extraños son presentados en moléculas de MHC de auto genotipo. De esta forma, la presentación de Ag, como en el caso de reacciones autoinmunes, es indirecta. Más aún, una gran masa clonal de células T es estimulada por aloinjertos desajustados por MHC que por aloinjertos con desajustes menores por Ag. En consecuencia, nosotros estábamos fascinados al saber que la mayoría de los recipientes tratados con anti-EL-12 portaban aloinjertos ajustados por MHC pero con múltiples desajustes menores por Ag experimentaban una injertación prolongada; la tolerancia a aloinjerto fue lograda frecuentemente en la combinación de cepa DBA/2J a BALB/c (Tabla I y Figura 3). Consistente con el fracaso de la anti-IL-12 para producir beneficios entre recipientes de aloinjerto desajustado por MHC y para producir la adquisición de tolerancia en recipientes tratados en forma similar de aloinjertos ajustados por MHC pero con desajustes menores por Ag, recipientes tratados con anti-IL-12 de aloinjertos desajustados por MHC experimentaron un modesto aunque importante incremento en la duración de la injertación (Tabla I). Para probar adicionalmente la hipótesis de que el modo de presentación de Ag (directa vs indirecta) y/o el tamaño de la masa de células T de respuesta soporta el fracaso de la anti-IL-12 u otros modos de producción de desviación inmune de Thl a Th2 para el beneficio de los recipientes de aloinjertos desajustados por MHC, nosotros estudiamos el impacto del tratamiento con anti-IL-12 en un inusual modelo de aloinjerto desajustado por MHC. Se utilizaron como donadores ratones C57BL/6 (H-2b) KO de MHC clase EL y ratones BALB/c (H-2d) sometidos a timoctomía y desajustados por MHC, que habían sido tratados con un protocolo de agotamiento de anti-CD8, fueron usados como recipientes. Como consecuencia, la respuesta del hospedero debía ser dominada por células CD4 que respondían a los alopéptidos del donador que estaban presentes durante los APCs del hospedero en el contexto de moléculas de auto MHC clase EL El impacto del tratamiento de anti-IL-12 en el modelo se pareció muy cercanamente a los potentes efectos que fueron notados en recipientes de aloinjerto ajustados por MHC pero con múltiples desajustes menores por Ag (Figura 4A). En un experimento de control aloinjertos de donador de C57BL/6 wt positivos a MHC clase II fueron rechazados rápidamente por hospederos BALB/c sin modificar (sin someter a timoctomía y sin agotamiento de CD8) que habían sido tratados con mAb de anti-DL-12. En consideración de nuestros resultados, el más claro ejemplo de tolerancia de aloinjerto dependiente de IL-4 (tolerancia infecciosa) se obtuvo en un modelo usando aloinjertos de piel (24) ajustados por MHC con múltiples desajustes menores por Ag. De esto, nosotros concluimos que la desviación inmune de una respuesta de Thl a Th2 no mitiga umversalmente las reacciones inmunes dependientes de células T citopáticas. Más bien, características únicas de la respuesta dependiente de células T a aloinjertos desajustados por MHC tornan a la respuesta aloinmune resistente a los efectos tolerizantes frecuentemente observados de la desviación inmune de Thl a Th2 (por ejemplo, autoinmunidad y tolerancia neonatal) (23, 24). La implicación de estos resultados sobre las estrategias clínicas parece auto-evidente, aunque el mecanismo preciso para la falla de la desviación inmune de Thl a Th2 para "controlar el rechazo de aloinjerto en recipientes de aloinjerto desajustados por MHC requerirá de investigación adicional.

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Claims (12)

1. Novedad de la Invención 1. Un método para reducir o mejorar el rechazo crónico de un tejido transplantado en un sujeto mamífero, el cual comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de anti-IL- 12.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho sujeto es un humano.
3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho tejido tiene un desajuste de aloantígenos menores con dicho sujeto.
4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo es administrado en combinación con cuando menos otro agente terapéutico.
5. 5. El método de la reivindicación 4, en donde dicho otro agente terapéutico reduce o elimina una señal inmune co-estimulatoria secundaria.
6. 6. El método de la reivindicación 5, en donde dicho agente terapéutico se selecciona del grupo consistente en una forma soluble de CTLA4, un anticuerpo dirigido a B7.1 , un anticuerpo dirigido a B7.2 y un anticuerpo dirigido a CD28.
7. 7. El método de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo consistente en un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de una sola cadena, un anticuerpo injertado por CDR, un anticuerpo humanizado y fragmentos de ellos que se unen a EL- 12.
8. 8. El método de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humano.
9. 9. El método de la reivindicación 4, en donde dicho otro agente terapéutico es un inmunosupresor.
10. 10. El método de la reivindicación 9, en donde dicho inmunosupresor es seleccionado del grupo consistente en ciclosporina y rapamicina.
11. 11. El método de la reivindicación 1, en donde dicho tejido transplantado es tejido pancreático.
12. 12. El método de la reivindicación 11, en donde dicho tejido transplantado comprende tejido de isletas.