MXPA99005977A - Formulaciones de interferon liquidas y estables - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones de interferón líquidas que tienen un pH entre 4.0 y 7.2. Las composiciones comprenden interferón-beta y un agente estabilizante en aproximadamente entre 0.3%y 5%en peso, el cual es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos acídicos, arginina y glicina. Si es necesario, se añade sal para proporcionar suficiente fuerza iónica. La composición líquida no ha sido previamente liofilizada ni ha experimentado previamente cavilación. El líquido de preferencia estácontenido dentro de un recipiente que tiene por lo menos una superficie en contacto con el líquido que estárecubierto con un material inerte a la adsorción de interferón-beta. También se describen un estuche para administración parenteral de una formulación de interferón líquida y un método para estabilizar las composiciones de interferón líquidas.

Description

FOBMULACIONES DE INTERFERON LIQUIDAS Y ESTABLES CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con métodos para estabilizar interferón beta y con formulaciones liquidas de interferón estables. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los interferones son proteínas que tienen una diversidad de actividades biológicas, algunas de las cuales son antivirales, inmunomoduladoras y antiproliferativas . Son polipéptidos de cadena simple, especie-especificas, relativamente pequeñas, producidas por células de mamíferos como respuesta a la exposición de una variedad de inductores como los virus, polipéptidos, mitógenos y lo semejante. Los interferones protegen tejidos animales y células contra el ataque viral y son un importante mecanismo de defensa del hospedero. En la mayoría de los casos, los interferones proporcionan mejor protección a los tejidos y células del tipo a partir del cual se han producido más que a otros tipos de tejidos y células, lo que indica que el interferón derivado de humanos deberá ser más eficaz para tratar las enfermedades humanas que los interferones procedentes de otras especies. Hay varios tipos distintos de interferones humanos, clasificados en general como leucocito (interferón alfa) , fibroblasto (interferón beta) e inmunitario (interferón gama) y una gran diversidad de variantes de los mismos. Se pueden encontrar estudios generales de interferones en diversos textos y monografías entre las que se incluyen: The Interferon System (W. E. Stewart, II, Springer-Verlag, N.Y. 1979); e Interferon Therapy (World Health Organization Technical Reports Series 676, World Health Organization, Ginebra 1982), las cuales se considera forman parte de la presente, como referencia. El método para administrar interferón es un factor de importancia en la aplicación clínica de este importante agente terapéutico. La administración sistémica de interferón ya sea por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea ha sido el que se ha usado con mayor frecuencia con algún éxito para tratar trastornos como leucemia de célula pilosa, Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida (SIDA) y el sarcoma de Kaposi relacionado. Sin embargo, se sabe que las proteínas en su forma purificada son especialmente susceptibles a la degradación. Para el interferón beta, el (los) mecanismo (s) primario (s) de la degradación del interferón en solución son la agregación y desamidación. La falta de estabilidad del interferón en soluciones y en otros productos ha limitado su utilidad hasta ahora. La composiciones farmacéuticas de interferón para P840 uso clínico contienen normalmente el interferón como una preparación liofilizada (por ejemplo, secada por congelamiento) en combinación con excipientes y estabilizantes orgánicos complejos como agentes tensoactivos no iónicos (es decir, surfactantes) , diversos azúcares, polioles orgánicos y/o albúmina sérica humana. Las preparaciones liofilizadas tienen la desventaja de requerir un envasado complejo ya que necesitan el suministro por separado de agua estéril inyectable. Además, las preparaciones liofilizadas requieren varias manipulaciones antes de usarse, aumentando así la posibilidad de pinchazos de aguja y de dejar caer los componentes durante la preparación de la inyección. Estas manipulaciones son especialmente problemáticas para poblaciones de pacientes que presentan debilidad muscular y poca coordinación, como las personas con esclerosis múltiple (MS) . Los pacientes de MS pueden auto administrase interferones por lo que la disponibilidad de una forma de dosis que sea mucho más fácil de administrar que los productos liofilizados actuales representa un importante valor agregado para la población de pacientes blanco. Las formulaciones de interferón líquidas simples son bastante deseables para evitar la reconstitución necesaria cuando se usan las preparaciones liofilizadas. Las formulaciones no liofilizadas líquidas que contienen interferones pueden contener también vehículos complejos como albúmina sérica humana, polioles, azúcares y agentes estabilizantes de tensoactivos aniónicos. Ver, por ejemplo, WO 89/10756 (Hará et al. que contienen poliol y p-hidroxibenceno) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención ha solucionado los problemas anteriores con el descubrimiento de que el interferón beta humano puede ser estabilizado cuando se pone en soluciones amortiguadas que tienen un pH entre aproximadamente 4 y 7.2, las soluciones que contienen un aminoácido como agente estabilizante y en algunos casos una sal (si el aminoácido no contiene una cadena lateral con carga) . El interferón-beta no está liofilizado, pero una vez preparado a partir de las fuentes utilizando los métodos conocidos por técnicos con experiencia ordinaria, es incluido directamente en la formulación de esta invención. Por lo tanto, un aspecto de la invención es una composición líquida que comprende un interferón y un agente estabilizante entre aproximadamente 0.3% y 5% en peso que es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos ácidos, arginina y glicina. La composición líquida no ha sido previamente liofilizada. Además es preferible que la composición líquida esté contenida dentro de un recipiente, como una jeringa, en la que el recipiente tiene una superficie en contacto con el líquido que está recubierta con un material inerte al interferón como silicona o politetrafluoroetileno. Las composiciones preferidas incluyen interferón-beta o un interferón producido en forma recombinante, en un amortiguador que tiene un pH entre aproximadamente 4.0 y 7.2. Otras formulaciones de la invención incluyen: (1) un amortiguador de acetato 20 mM a pH 5.0, el amortiguador no ha sido liofilizado previamente, en la que el amortiguador incluye interferón-beta más ingredientes seleccionados de (a) 150 mM de clorhidrato de arginina; (b) 100 mM de cloruro de sodio y glicina 70 mM; (c) 150 mM de clorhidrato de arginina y 15 mg/ml de albúmina sérica humana; (d) 150 mM de clorhidrato de arginina y 0.1% de Pluronic F-68; (e) 140 M de cloruro de sodio; (f) 140 mM de cloruro de sodio y 15 mg/ml de albúmina sérica humana, y (g) 140 mM de cloruro de sodio y 0.1% de Pluronic F-68. (2) un líquido a pH 5.0 que incluye interferón-beta, 170 mM de ácido L-glutámico y 150 mM de hidróxido de sodio, el líquido no ha sido previamente liofilizado; (3) un amortiguador de 20 mM de fosfato a pH 7.2, el amortiguador no ha sido previamente liofilizado, en el que el amortiguador incluye interferón-beta más ingredientes seleccionados de: (a) 140 mM de clorhidrato de arginina; y (b) 100 mM de cloruro de sodio y 70 mM de glicina . Otra modalidad de la invención es un estuche para administración parenteral de una formulación de interferón líquida. El estuche comprende un recipiente que contiene una formulación líquida a un pH entre 4 y 6, el líquido que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de interferón-beta que no ha sido liofilizada previamente y un agente estabilizante aminoácido en aproximadamente 5% en peso o menos; e instrucciones de uso. Aún otra modalidad de la invención es una composición farmacéutica líquida adecuada para administración parenteral en mamíferos consiste básicamente en una cantidad efectiva de interferón-beta que no ha sido liofilizado previamente en un amortiguador que mantiene el pH dentro del intervalo entre 4.0 y 6.0 y un agente estabilizante aminoácido en una adecuada fuerza iónica. La composición está contenida dentro de un recipiente de almacenamiento como una jeringa. De preferencia el recipiente de almacenamiento carece de una interfaz líquida que contenga oxígeno (es decir, la solución de interferón no se somete a un gas que contenga oxígeno durante la preparación y el almacenamiento) . El interferón-beta básicamente conserva su actividad antiviral durante el almacenamiento a una temperatura aproximadamente 2 y 25 P840 grados centígrados durante un período por lo menos de 3 meses. Un proceso de la invención para estabilizar interferón-beta en composiciones farmacéuticas líquidas de manera que conserve básicamente su estabilidad física durante el almacenamiento a una temperatura entre aproximadamente 2 y 25 grados centígrados durante un período por lo menos de 3 meses, comprende mezclar: a) una cantidad efectiva de interferón-beta; b) un amortiguador que mantiene el pH en el intervalo entre 4.0 y 7.2 en una fuerza iónica adecuada; y c) un agente estabilizante aminoácido, en donde el líquido no ha sido liofilizado previamente y no ha estado sujeto a un gas que contenga oxígeno durante la preparación y el almacenamiento. Las formulaciones líquidas de la invención tienen muchas ventajas con respecto a las formulaciones liofilizadas. Las ventajas incluyen: (i) un volumen inyectable menor requerido para una formulación líquida producirá menos molestia que un volumen mayor; (ii) el remplazo de excipientes complejos con aminoácidos simples hará posible monitorear más de cerca la calidad del producto terminado; (iii) el empaque se simplifica mucho debido a que se elimina la necesidad de un suministro por separado de agua inyectable (WFI) y de jeringa y vial por separado; (iv) la dosificación exacta se puede mejorar debido a menos transferencias de líquidos; y (v) la seguridad del producto se mejora porque la administración simple disminuye la posibilidad de pinchazos con la aguja y de dejar caer los componentes durante la preparación para la inyección. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar una formulación líquida, estable, biológicamente activa de interferón-beta para usarse en aplicaciones inyectables. Otro objeto de esta invención es proporcionar una formulación que no requiere de la liofilización previa de una composición de interferón-beta. Es otro objeto de esta invención impedir la pérdida de estabilidad de una formulación líquida de interferón-beta por medio de: a) evitar cavitación y/o formación de espacio superior durante la preparación de la composición líquida o b) almacenar la formulación líquida con un espacio superior que consiste en un gas inerte como argón o nitrógeno. Aún otro objeto de está invención proporciona una formulación líquida que permite el almacenamiento durante un período de tiempo largo en un estado líquido que facilita el almacenamiento y el embarque antes de la administración. Otro objeto de esta invención es proporcionar una formulación líquida que se elabora y se P840 administra fácilmente en la que se han eliminado los pasos de liofilización y reconstitución. Otro objeto de la invención es el uso de aminoácidos simples como estabilizantes alternos junto con la albúmina sérica comúnmente usada, lo que hace más fácil monitorear la calidad del producto. Todavía otro objeto de esta invención es proporcionar una composición farmacéutica que contiene interferón-beta no liofilizado que puede producirse de manera menos costosa. Otras ventajas de la invención se exponen en parte en la descripción a continuación y en parte serán evidentes a partir de esta descripción o se pueden conocer a partir de poner en práctica esta invención. Los dibujos que adjuntos, los cuales se incorporan y forman parte de la presente especificación, junto con esta descripción ilustran y sirven para explicar el principio de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS O FIGURAS La Figura 1 es una gráfica que muestra el porcentaje de monómero de interferón-beta que queda en el líquido del proceso en masa como una función del porcentaje de oxígeno disuelto en el líquido. La Figura 2 es una gráfica que muestra el porcentaje de concentración de proteína normalizada contra la del material inicial contra tiempo para la formulación líquida BG6589-1. Las muestras marcadas »4°c" (cuadros cerrados) están incubadas entre 2 y 8°C. Otras muestras están incubadas a 25°C (círculos cerrados); 33°C (triángulos cerrados) y 40°C (diamantes cerrados). La Figura 3 es una gráfica que muestra el porcentaje de concentración de proteína normalizado contra el del material inicial contra tiempo para la formulación líquida BG9589-3. Las muestra marcadas "4°C" están incubadas entre 2 y 8°C. Otras muestras están incubadas a 25°C (círculos cerrados); 33°C (triángulos cerrados) y 40°C (diamantes cerrados) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención supera los problemas y desventajas asociadas con las estrategias y diseños actuales y proporciona un método simple para estabilizar interferón y una formulación de interferón simple con estabilidad de almacenamiento aumentada. La invención está basada, en parte, en nuestros descubrimientos de que: a) el interferón-beta es particularmente inestable y se agrega cuando entra en contacto con el oxígeno ya sea el que se burbujea activamente a través del líquido o el que hace contacto estáticamente como en un P840 espacio superior; b) las preparaciones líquidas de interferón-beta que carecen de un vehículo como la albúmina sérica humana son particularmente susceptibles a la adsorción (por ejemplo, ya sea reacción química o unión física) en las superficies de vidrio; y c) el interferón-beta se agrega a fuerzas iónicas bajas, requiriendo un ambiente iónico para la estabilidad en el estado acuoso. La invención está dirigida por lo tanto a los métodos para estabilizar el interferón-beta humano que evitan estas dificultades y a las formulaciones líquidas resultantes de interferón-beta estabilizado.

A. DEFINICIONES El término "amortiguador" se refiere a soluciones de un ácido débil y una sal que contiene el anión del ácido o soluciones de una base débil y su sal. En particular, el término "acetato" cuando se usa en esta descripción (ver también Tabla I, abajo) se refiere a un sistema amortiguador que de preferencia contiene acetato de sodio y ácido acético y el término "fosfato" se refiere a un sistema amortiguador que de preferencia contiene fosfato de sodio dibásico y monobásico hepta- y monohidrato respectivamente. Además, aquellas soluciones en la Tabla II P840 (abajo) que contiene un aminoácido ácido en combinación con hidróxido de sodio, aunque convencionalmente no se considera que son amortiguadores, como se entiende en el campo de la técnica, sin embargo se incluyen aquí dentro de la definición. El término "excipiente" se refiere a cualquier compuesto añadido durante el procesamiento y/o almacenamiento a una formulación líquida con el propósito de modificar las propiedades a granel, mejorar la estabilidad y/o ajustar la osmolalidad. El término "agente estabilizante" se refiere a un excipiente que mejora o de otro modo aumenta la estabilidad. El término "estabilidad" por necesidad tiene una definición funcional y significa la constancia temporal relativa de la actividad el interferón como la actividad antiviral y/o de la estructura del interferón. El término "ha experimentado cavitación" se refiere a cualquier formulación de interferón líquida que a causa de los cambios en la presión o agitación física, ha entrado en contacto con burbujas que contiene oxígeno (por ejemplo, aire) al menos durante su preparación y almacenamiento. El término "cavitación" también significa que se ha formado una interfaz gas que contiene oxígeno/líquido en algún momento durante la preparación, P840 almacenamiento y uso de la formulación de interferón líquida. El término "que ha experimentado cavitación" también significa que los niveles de oxígeno disuelto en las formulaciones de interferón líquidas exceden aproximadamente 10% de los valores de equilibrio atmosférico a las temperaturas que normalmente se encuentran por lo menos durante la preparación y almacenamiento . El término "parenteral" en el sentido en el que se utiliza en la presente incluye inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, intraperitoneal, oftálmica o intraespinal o técnicas de infusión. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sal de adición orgánica o inorgánica que sea relativamente no tóxica e inocua para un paciente a concentraciones consistentes con la actividad efectiva de manera que los efectos secundarios atribuibles a la sal no invaliden los efectos benéficos del interferón. Una "cantidad efectiva" de un compuesto es la cantidad que produce un resultado o ejerce una influencia en la condición particular que se trata. Una "cantidad efectiva" también significa la cantidad que produce un resultado positivo (por ejemplo, ejerce un efecto antiviral) en la prueba CFE para actividad antiviral. En el sentido en el que se utiliza en la P840 presente, una "cantidad farmacéuticamente efectiva" de un interferón significa una concentración en porcentaje del agente del que en la técnica médica y farmacéutica se sabe que es seguro y efectivo para tratar una condición particular. "Isotónico a la sangre" (usado indistintamente con "isotonicidad") se refiere a una composición de interferón líquida que tiene la concentración suficiente de componentes de manera que su comportamiento osmótico es casi idéntico al de la sangre, es decir, las células en contacto con la formulación prácticamente conservarán su forma y casi no experimentarán transferencia neta de agua por las presiones osmóticas. "Especies poli-iónicas" (usado indistintamente con "especies polielectrolíticas") se refiere a una sustancia de peso molecular elevado que es un electrólito y que cuando se usa en las formulaciones de esta invención, lleva al máximo la fuerza iónica para una osmolalidad dada. Esta definición se basa en nuestro hallazgo de que el interferón-beta se estabiliza mediante fuerza iónica elevada, pero esa fuerza iónica total está limitada por la necesidad de que la solución sea isotónica a la sangre (Ver Ejemplo 7) . Una manera preferida de llevar al máximo la fuerza iónica para una osmolalidad dada es usar un excipiente que es una especie poli-iónica.

P840 Un material que es "inerte al interferón" significa que es un material que tiene por lo menos la propiedad de no reaccionar física y/o químicamente con el interferón.

B. ELABORACIÓN DE INTERFERONES Esta invención por lo general es aplicable a todos los tipos de interferón entre los que se incluyen interferón natural, interferón producido mediante tecnología de ADN recombinante e interferón producido mediante síntesis o modificación química. También la invención se puede usar con interferón crudo, se i-purificado y purificado proveniente de fibroblastos, leucocitos, linfocitos o cualquier otro tejido que contiene o que produce interferón a partir de humanos o de cualquier otra especie adecuada. Con preferencia superlativa, la invención es aplicable al interferón de fibroblasto humano (interferón-beta) . El interferón-beta que más se prefiere es una forma recombinante y son conocidos los métodos de ADN recombinante para producir proteínas entre los que se incluyen los diversos interferones y no están destinados a limitar la invención de ninguna manera. Ver por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 4,399,216, 5,149,636, 5,179,017 (Axel et al); 4,470,461 (Kaufman). Se han P840 producidos formas recombinantes de interferón-beta. Ver, por ejemplo, Patente Europea 0 41313 (Fiers- expresión de interferón-beta); Patente de los Estados Unidos 4,966,843 (McMormick et al. - expresión de interferón en células CHO); Patente de los Estados Unidos 5,326,859 (Sugano et al. - ADN que codifica para interferón-beta); el interferón-beta también se puede modificar, ya sea por vía recombinante o química y se puede producir en medios que contienen sueros o libres de suero. Las formas de interferón-beta pueden incluir variantes como mutantes disminuidas en cisteína (Patente de los Estados Unidos 4,588,585 y 4,737,462: Mark et al.) y mutantes sin metionina (EP 260 350- Wang et al) . La secuencia primaria de aminoácidos de la proteína puede ser aumentada por derivación usando fracciones de azúcares (glicosilación) o mediante otras moléculas suplementarias. Pueden tener lugar otras modificaciones a través de los sistemas de procesamiento post-traducción de la célula hospedera. Los residuos de aminoácidos individuales en la cadena pueden modificarse posteriormente por oxidación, reducción u otra derivación y se la proteína se puede desdoblar para obtener fragmentos activos. La estructura química exacta de un interferón-beta recombinante particular dependerá por lo tanto de varios factores y no pretende limitar el alcance de la invención. Todas estas proteínas interferón-beta P840 incluidas en las formulaciones que se describen en la presente conservarán su bioactividad cuando se pongan en las condiciones ambientales adecuadas. Un método para producir interferón-beta recombinante es cultivar células ováricas de hámster Chino (CHO) transfectadas con el gen de interferón-beta humano. El interferón recombinante es secretado por las células de CHO que crecieron en cultivo en suspensión discontinuo que contiene suero bovino fetal. Las células se pueden cultivar en matraces rotatorios alojados en un incubador con C02 (5% C02) a aproximadamente 35 grados Celcius (en adelante "C") . Matraces rotatorios múltiples se pueden unir e inocular a fermentadores de tamaño creciente si se desea escalamiento. El cultivo en un fermentador dado se lleva a cabo por aproximadamente seis días durante los cuales el producto activo interferón-beta se acumula en el medio de cultivo. El cultivo entonces puede ser cosechado y las células retiradas del medio que contiene al producto, por ejemplo, mediante filtración con flujo tangencial.

C. PURIFICACIÓN DE INTERFERONES Los esquemas de purificación para los interferones están bien caracterizados y se encuentran disponibles para los técnicos con experiencia originaria en la técnica. Tales métodos incluyen procedimientos de un P840 solo paso o de pasos múltiples que implican diversos pasos de separación cromatográfica. Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 5,015,730 (Friesen et al.-cromatografía por afinidad y HPLC); 4,541,952 (Hosoi et al . -cromatografía de quelación). Un método ejemplificativo implica explotar la extraordinariamente hidrofóbica y relativamente básica de la molécula de interferón-beta así como su fuerte afinidad por iones que se unen a metales. Ver, por ejemplo, Knight y Fahey, "Human Fibroblast Inferieron, an Improved Purification", J. Biol. Chem. , 256:3609-3611(1981) y Edy et al., "Purification of Human Fibroblast Inferieron by Zinc Chelate Chromatography", J. Biol. Chem. , 232:5934-5935 (1981) , las cuales se considera forman parte de la presente como referencia. Brevemente, los pasos de captura y purificación incluyen enlazar el interferón-beta en una serie de columnas Sepharose® (fabricadas por Pharmacia Biotech) . La mayor parte de las proteínas restantes presentes en la carga de la columna son de naturaleza más básica que el interferón-beta monomérico y están unidas más fuertemente a la columna de lo que lo está el interferón. El ADN y los virus se separan del interferón-beta en esta columna. La columna se lava entonces con una serie de amortiguadores que contienen cloruro de sodio.

P840 El producto interferón se unirá ahora a una columna Sepharose® (Pharmacia Biotech) que ha sido cargada previamente con cinc. Ver Edy et al., arriba. Esta columna se hace funcionar en atmósfera libre de oxígeno para proteger el grupo sulfhidrilo libre en la molécula, así como los pasos subsecuentes. El interferón purificado se acidifica y se mantiene a pH bajo para inactivar cualquier virus restante. Después de la neutralización, el interferón se concentra utilizando filtración con flujo transversal y después intercambiado con el amortiguador en una solución amortiguador neutral. El proceso de intercambio con el amortiguador disminuye las concentraciones de cinc y de compuestos orgánicos. Después de esto, el interferón a granel se puede almacenar a -70 °C antes de los pasos de formulación.

D. FORMULACIÓN DE INTERFERONES En el método de purificación ejemplificativo que se describe arriba y después del primer proceso de intercambio de amortiguador, se inicia un segundo proceso de intercambio de amortiguador excepto que la solución amortiguador neutral se reemplaza con una solución amortiguador con un pH entre 4 y 7.2 que contiene un agente estabilizante, que se describe con más detalle abajo. La formulación resultante que contiene interferón se denomina P840 "intermediario de proceso" y puede congelarse para almacenamiento. Ver también Ejemplo 7. Si se almacena en estado congelado (en una atmósfera de gas inerte como argón o nitrógeno) , después puede descongelarse y bombearse a través de un filtro de 0.22 mieras en un recipiente tarado, de preferencia de acero inoxidable, en el que el intermediario de proceso se combina con diluyente previamente esterilizado por filtración hasta que se logra el peso del producto final deseado. El diluyente está constituido por el mismo amortiguador que se utilizó en el segundo proceso de intercambio de amortiguador. El producto final líquido se esteriliza por filtración con procedimientos asépticos, utilizando por ejemplo, dos filtros de 0.22 mieras en serie y preparadas en un recipiente sellado, de preferencia de acero inoxidable, que contiene una entrada de gas inerte, una combinación válvula degasificadora/filtro y un tubo de inmersión de carga/descarga. El producto final se bombea a través del tubo de inmersión y al recipiente sellado. Usando un gas inerte como nitrógeno, el producto final se transfiere a presión a la bomba principal de un dispositivo que tiene la capacidad de llenar de manera aséptica las jeringas estériles. Se encuentran disponibles varios métodos para llenar las jeringas estériles de manera aséptica y el P840 método particular que se use no tiene el propósito de limitar el alcance de la presente invención. Un método ejemplificativo incluye el uso de un llenador de jeringas susceptible de someterse a autoclave HYPAK® (Becton Dickinson Pharmaceutical Systems, Franklin Lakes, NJ) . Las jeringas se someten a la autoclave con las tapas en su lugar. Por lo general, los dispositivos de este tipo incorporan una cámara de vacío que contiene a las jeringas que se van a llenar con la formulación de interferón. La cámara se coloca en un ambiente aséptico. Cada jeringa se pone verticalmente en la cámara con un extremo abierto, que se acoplará a una varilla émbolo, adaptada para ajustarse en el extremo abierto del barril de la jeringa. La varilla está diseñada para introducir un tapón en el barril para retener al líquido dentro de él. Se deja un pequeño espacio superior en la jeringa después de la introducción. La cámara se evacúa y se lava con un gas inerte, libre de oxígeno (por ejemplo, argón, nitrógeno) varias veces y cuando se logra el vacío final, las varillas entran mecánicamente en los barriles de las jeringas abiertas a corta distancia y los tapones son introducidos automáticamente en las jeringas. La cámara es entonces ventilada con aire filtrado para regresar la presión dentro de la cámara a los niveles atmosféricos. La cantidad de vacío determinará el tamaño del espacio superior que P840 contiene el gas inerte. En el sistema particular que usamos, las jeringas están orientadas verticalmente y se mantienen en su lugar mediante una rueda dentada sobre un disco rotatorio. Las jeringas se colocan primero bajo una aguja que se introduce en la jeringa. La aguja limpia el interior de la jeringa con un gas inerte (por ejemplo, nitrógeno, argón) . La aguja se retrae entonces hacia afuera de la jeringa. La jeringa se coloca entonces bajo una segunda aguja que se introduce dentro de la jeringa. La aguja está unida a una bomba que distribuye el producto dentro de la jeringa. La segunda aguja se retrae entonces hacia afuera de la jeringa. La jeringa se coloca entonces bajo una tercera aguja que se introduce en la jeringa. Un émbolo (sometido previamente a autoclave) se introduce a la jeringa con un gas inerte libre de oxígeno (por ejemplo, nitrógeno, argón), la aguja se retrae entonces haca afuera de la jeringa. El émbolo está colocado para dejar un espacio superior de gas inerte entre la parte superior del líquido y el fondo del émbolo. 1. El Excipiente El excipiente es de preferencia una especie poli-iónica que lleva al máximo la fuerza iónica para una osmolalidad dada, como por ejemplo, un polielectrólito que puede incluir heparina u otras especies poliméricas. Como P840 se analiza en el Ejemplo 4, el interferón-beta se estabiliza mediante fuerza iónica elevada, pero la fuerza iónica total está limitada por la necesidad de que la solución sea isotónica con la sangre. Una manera preferida para llevar al máximo la fuerza iónica para una osmolalidad dada es usar especies poli-iónicas. Las soluciones de interferón-beta de la invención son isotónicas a la sangre (aproximadamente 290 miliosmoles/kilogramo) . El agente estabilizante que más se prefiere para la presente invención es un aminoácido que puede incluir uno de los siguientes: algún aminoácido acídico (por ejemplo, ácido glutámico, ácido aspártico) o un aminoácido seleccionado entre arginina y glicina. Con mayor preferencia, el agente aminoácido estabilizante es arginina incorporada en su forma acida (clorhidrato de arginina) en soluciones con pH 5.0. Un aminoácido ácido preferido es el ácido L-glutámico. Sin que se desee vincularlo con la teoría, el hecho de que los excipientes poli-iónicos se prefieran es probablemente porque la arginina y la lisina (con 3 grupos con carga) estabilizan al interferón mejor que la glicina (con 2 grupos con carga) , que a su vez estabiliza mejor que cualquiera de las especies sin carga que se probaron. Si el excipiente es clorhidrato de arginina, su concentración variará entre 0.5% (p/v) y 5% y con P840 preferencia superlativa 3.13% (equivalente a 150 mM de clorhidrato de arginina) . Si ele excipiente es glicina, su concentración variará entre 0.50% (p/v) y 2.0% y con preferencia superlativa 0.52% (equivalente a 66.7 mM y 266.4 mM y con preferencia superlativa 70 mM) . Si el excipiente es ácido glutámico, su concentración variará entre 100 mM y 200 mM y con preferencia superlativa 170 mM (equivalente a un porcentaje p/v que variará entre 1.47% y 2.94% y con preferencia superlativa 2.5%). Analizamos diferentes excipientes como agente estabilizante para las formulaciones líquidas de interferón-beta usando el sistema amortiguador de pH de 50mM de acetato de sodio y ácido acético glacial en combinación con 100 mM de cloruro de sodio, pH 5.0. Las muestras de interferón líquido o bien se someten a tensión térmicamente por incubación a 37 grados C por aproximadamente entre 1 y 3 semanas o se colocan en un rotor entre 1 y 3 días para tensión mecánica. Las muestras tratadas se evalúan para determinar la estabilidad del interferón-beta mediante los métodos que se describen en el Ejemplo 1. Según se describe con mayor detalle en el Ejemplo 7, las formulaciones reguladas a pH 5.0 con acetato de sodio que contienen un excipiente constituido por aminoácido (y que en forma opcional contiene cloruro de sodio) muestran mejor estabilidad.

P840 2. El Inferieron El interferón preferido es el interferón-beta de fibroblasto, con mayor preferencia como interferón-beta humano recombinante producido a partir de células de mamíferos. El interferón-beta humano recombinante puede contener un sulfhidrilo libre y por lo menos un enlace disulfuro. Una molécula preferida en particular contiene un sulfhidrilo libre en la posición 17 y un enlace disulfuro entre las posiciones 31 y 141 por molécula. Como es sabido para el caso del IFN-beta humano natural, la N-glicosilación se espera en Asn-80. El intervalo de concentración es las formulaciones líquidas de la invención es entre aproximadamente 30 ug/ml y 250 ug/ml. Un intervalo de concentración preferido es entre 48 y 78 ug/ml y la concentración más preferida es de aproximadamente 60 ug/ml. En términos de valores de Patrones Internacionales, el patrón interno Biogen ha sido normalizado conforme al Patrón Internacional de la OMS para Inferieron, Natural #Gb-23-902-531, de manera que el intervalo de concentración en Ul (para un volumen inyectable de 0.5 ml) es entre 6 MUÍ y 50 MUÍ y la concentración que mas se preiiere es 12 MUÍ. 3. El Amortiguador Los amortiguadores de ácidos orgánicos y de P840 íosíato que se usan en la presente invención para mantener el intervalo de pH entre aproximadamente 4.0 y 7.2 y de preierencia entre aproximadamente 4.5 y 5.5 y con preierencia superlativa en 5.0, pueden ser los amortiguadores convencionales de ácidos orgánicos y sales de los mismos como los amortiguadores de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc) , amortiguadores de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc) , amortiguadores de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), amortiguadores de íumarato (por ejemplo, mezcla de ácido íumárico-iumarato monosódico, mezcla de ácido íumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), amortiguadores de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.) amortiguadores de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, P840 etc.), amortiguadores de lactato (por ejemplo, ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, ácido láctico-lactato de potasio, etc.) amortiguadores de fosfato (fosfato monobásico de sodio/fosfato dibásico de sodio) y amortiguadores de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.). En los Ejemplos descritos abajo, usamos diferentes concentraciones del amortiguador y diferentes pHs de fosfato de sodio, citrato de sodio, succinato de sodio, carbonato de sodio y acetato de sodio para evaluación del amortiguador más adecuado. Las muestras de interferón-beta se colocan o bien a 37 grados C por un período de 6 días a 2 semanas o bien en un rotor entre 7 y 9 horas para acelerar el proceso de degradación. Las propiedades químicas de las muestras se determinan entonces. Las muestras se analizan por medio de densidad óptica, mapa de péptidos, HPLC de Exclusión por Tamaño, transferencias SDS-PAGE/Western reducidas y no reducidas y transferencias enfoque isoeléctrico/Western (IEF) , descritas en el Ejemplo 1. Todas las muestras de interferón-beta experimental se comparan con el material interferón-beta de partida o con las muestras de interferón-beta colocadas entre 2 y 8 grados C. Nuestros datos indican que el pH es el factor principal que P840 determina la estabilidad de nuestras muestras de interferón-beta y que las muestras entre pH 4.0 y 5.0 son más estables que aquéllas de pH 7.0 o mayor. Ver Ejemplo 2. Sin embargo, pudimos desarrollar varias formulaciones de interferón-beta a pH fisiológico (pH 7.2). Ver Ejemplo 6. 4. Cavitación La mayoría de los residuos sulfhidrilos en el interferón-beta experimentan oxidación a pH elevado (pH> 8.0), pH en el que los enlaces disulfuros experimentan rearreglo. Hemos detectado algo de agregación del interferón-beta en nuestro intermediario a granel mediante cromatografía por exclusión de tamaño, SDS-PAGE no reducido y barrido láser. Posteriormente hemos descubierto que la formación de interferón-beta agregado puede depender del nivel de oxígeno disuelto. El criterio de proceso que hemos desarrollado para asegurar que las formulaciones de interferón-beta líquidas no han experimentado cavitación incluyen: (a) si es posible, no debe estar presente inerfaz gas que contenga oxígeno/líquido durante la preparación y el almacenamiento; y/o (b) no debe haber fromación de burbujas durante la preparación y el almacenamiento; y/o (c) los niveles de oxígeno disuelto en la formulación se deben mantener por debajo de 10% del equilibrio atmosférico a la temperatura de preparación y almacenamiento. Ver P840 Ejemplo 3.

. Adsorción del Inter erón en la Superficies También determinamos que el interferón se adsorberá en ciertas superficies y que su almacenamiento en un recipiente de vidrio requiere que por lo menos una superficie del recipiente en contacto con el interferón sea recubierta con un material que impedirá o casi eliminará la adsorción. Los materiales ejemplificativos para este propósito son conocidos por aquéllos con experiencia ordinaria en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, silicona atomizada u horneada, polipropileno o politetrafluoroetileno (PTFE) . Tomamos nuestras formulación líquidas de 60 ug/ml preferidas (BG9589-1, 2, 3 y 4: resumidas en la Tabla 1, bajo) y las vaciamos en jeringas de vidrio Tipo I de 1 ml de largo recubiertas con silicona atomizada (Beckon Dickinson) y en viales de vidrio Tipo I de 0.75 ml. Las muestras se analizaron entonces mediante HPLC de fase inversa (rpHPLC) para la determinación de la concentración de proteína. Los datos indican que hubo menos proteína en "solución en aquellas muestras que se vaciaron en los viales de vidrio en comparación con las jeringas recubiertas con silicona antes del llenado. Ver Ejemplo 5.

P840 6. Formulaciones Preferidas Realizamos análisis cinético de la estabilidad de la proteína usando las cuatro formulaciones líquidas cuyas concentraciones finales se muestran en la Tabla 1, cada una con un contenido de 60 ug/ml de interferón-beta. Las formulaciones alternas, algunas que contienen tensoactivos como Pluronic F-68 (fabricado por BASF) se dan en la Tabla 2.

Tabla 1 : Formulaciones Preferidas SISTEMA de pH EXCIPIENTE pH FINAL Todos los constituyentes de las formulaciones son materiales grado USP. Las composiciones detalladas son las siguientes : P840 BG9589-1 Ingrediente (como materias primas) Cantidad Clorhidrato de arginina, USP 15.8 mg Acetato glacial ácido, USP 0.167 mg Acetato de sodio trihidrato, USP 0.972 mg Interferón-beta 30 ugm Agua Inyectable, USP 0.5 ml BG9589-2 Ingrediente (como materias primas) Cantidad Clorhidrato de arginina, USP 2.628 mg Acetato glacial ácido, USP 0.185 mg Acetato de sodio trihidrato, USP 0.932 mg Interferón-beta-la 30 ugm Agua Inyectable, USP 0.5 ml Cloruro de sodio 2.922 mg BG9589-3 Ingrediente (como materias primas) Cantidad Clorhidrato de arginina, USP 14.725 mg Fosfato dibásico de sodio-7H20 2.332 mg Fosfato monobásico de sodio-1 H20 0.359 mg ínterferón-beta-la 30 ugm Agua Inyectable, USP 0.5 ml 40 BG9589-4 Ingrediente (como materias primas) Cantidad Fosfato dibásico de sodio-7H20 1.984 mg Fosfato monobásico de sodio-1 H20 0.359 mg ínterferón-beta-la 30 ugm Glicina 2.628 mg Cloruro de Sodio 2.922 mg Agua Inyectable, USP 0.5 ml Tabla 2 : Formulaciones Alternas SISTEMA de pH EXCIPIENTE pH FINAL P840 Se pueden incorporar otros materiales a las formulaciones de esta invención. Estas pueden incluir los siguientes conservadores, en las que todos los porcentajes preferidos son p/v: fenol (aproximadamente 0.2%); metilparabeno (0.08%); propilparabeno (0.008%); m-cresol (0.1%); clorobutanol (0.25%); alcohol bencílico (0.1%); y timerosal (0.1%). Con base en análisis para determinar la agregación y desamidación de la proteína (no se presentan datos) , los conservadores que más se prefieren son el clorobutanol y el alcohol bencílico. 7. Estuches para Administración Parenteral Las modalidades preferidas de la invención incluyen un estuche empacado para administración parenteral de las formulaciones líquidas presentes. El paquete puede P840 contener jeringas previamente llenadas con las formulaciones líquidas de la invención, varios hisopos con alcohol, por lo menos una aguja, una o más vendas adhesivas y direcciones de uso. También se observará que las formulaciones líquidas presentes de la invención se pueden usar con los sistemas de inyección sin aguja convencionales .

E. USO de INTERFERONES Las formulaciones de interferón de esta invención tienen actividad antiviral. Ver Ejemplo 7. Para uso clínico, la cantidad de interferón que se administra en un caso particular, así como la frecuencia con la cual se administra el interferón, depende de factores como el tipo de interferón que se usa, la enfermedad que se va a tratar y la respuesta del paciente al tratamiento con interferón. Un uso preferido para las composiciones líquidas de la invención es para el tratamiento de esclerosis múltiple recurrente. Se han administrado formulaciones líquidas liofilizadas (por ejemplo, reconstituidas) de interferón-beta natural e interferón-beta recombinante a pacientes que padecen de esclerosis múltiple recurrente. Ver Jacobs et al., Annals of Neurology 39:285-294 (Marzo 1966) y las referencias citadas en esa y Jacobs y Munschauer, "Treatment of múltiple sclerosis with P840 interferons" (p. 223-250) en Treatment of múltiple sclerosis: trial design, results and future perspectives, (R.A. Rudnick et al., eds), London: Springer, 1992. El uso de las formulaciones descritas aquí para tratar la esclerosis múltiple sigue los mismos protocolos y mediciones y las mismas variables de resultados primarios que las que se describen en el artículo de Jacobs et al., arriba. Una manera de evaluar la utilidad de las formulaciones líquidas presentes es realizar un estudio de toxicología y evaluar la irritación del tejido asociada con la administración de la formulación líquida. Hemos realizado un estudio de toxicología de las formulaciones líquidas presentes en conejos. Ver Ejemplo 8. Los siguientes ejemplos se dan para ilustrar las modalidades de la invención, pero no deben considerarse como limitaciones al alcance de la invención. EJEMPLO 1 Métodos de Ensayo Se usan varios métodos bien caracterizados para determinar las propiedades fisicoquímicas del interferón-beta en nuestras formulaciones líquidas y se pueden usar estos métodos para monitorear también las propiedades de otros interferones. La presencia/ausencia de agregados se monitorea midiendo la absorbancia a 320 nm y la transmitancia a 580 P840 nm. La concentración de la proteína soluble se determina ya sea mediante la mediación de la absorbancia a 278-280 nm (con un coeficiente de extinción de 1.5) o mediante cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (HPLC) usando concentraciones conocidas de interferón-beta añadidas en la formulación del amortiguador como estándar. Las muestras de la formulación líquida se centrifugan antes de la prueba. El porcentaje de agregados solubles se determina separando los agregados del monómero de interferón-beta por cromatografía de exclusión por tamaño en una columna TSK-Gel® G2000SWXL (Toso Haas, Montgomeryville, PA) . Las áreas pico monitoreadas a 280 nm se usan para calcular el porcentaje de agregado soluble. La estabilidad de la estructura del péptido se confirma por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE) . El interferón-beta se reduce con mercaptoetanol en presencia de dodecilsulfato antes de que se someta a electroforesis en un gel gradiente 10-20% (MiniPlus Sepragel®, Integrated Separation Systems, Natick, MA) . Las proteínas se transfieren entonces mediante electroforesis a una membrana de nitrocelulosa y se revelan por inmunodetección usando anticuerpo anti-interferón-beta y anticuerpo anti-ratón de cabra acoplado a una peroxidasa de rábano. Ver, por ejemplo, Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach, 2nd ed. , B.D. Hames and P840 D.Rickwood, IRL Press. El cambio en la carga superficial neta, causado por la desamidación y otros cambios químicos, se monitorea por enfoque isoeléctrico en un gel de poliacrilamida (IEF 3-10 MiniPlus Sepragel®) , Integrated Separation Systems) . Ver, Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach, id. La oxidación de metionina, la desamidación de asparagina ' y otros cambios químicos posibles también se monitorean mediante mapa de péptidos. El interferón-beta se somete a digestión con Endoproteinasa Lys-C (Wako Puré Chemicals) en presencia de ditiotreitol y los fragmentos de péptido resultante se separan mediante HPLC de fase inversa. Ver en general, Kalgahtgi, K. , & Horvat, C. "Rapid Peptide Mapping by High Performance Liquid Chromatography", J. Chromatography 443, 343-354 (1988) . El perfil del oligosacárido N-enlazado se determina usando un sistema Fluorophore-Assisted-Carbohydrate-Electrophoresis (Electroforesis de Carbohidratos Auxiliada con Fluoróforo) (FACE® system de Glyko, Inc. (Novato, CA) . Los oligosacáridos enlazados a asparagina (N-enlazados) son liberados de la glicoproteína utilizando la enzima Péptido N-glicosidasa F, marcados entonces con un fluoróforo en las terminales reductoras mediante aminación reductora, separados y cuantificados en P840 un gel de poliacrilamida. La actividad antiviral de los interferones se determina mediante diversos métodos como aquéllos descritos en forma más completa en: W.E. Stewart II, The Interferon System, Springer-Verlag (2nd Ed. 1981) . La Prueba de Inhibición del Efecto Citopático (CPE) es particularmente útil para determinar la actividad antiviral del interferón. Nuestro método preferido se describe en WHO Technical Report Series No.725, Annex 1, (1985), el cual se considera forma parte de la presente, como referencia. Brevemente, este método CPE se inicia preparando un patrón de interferón-beta de reserva para trabajo que previamente ha sido calibrado contra un patrón de referencia WHO. Esta reserva preparada en medio D-MEM+ que contiene 10% de suero bovino fetal y 4 mM de L-glutamina en una concentración de 10,000 unidades (U) por ml . En el día del ensayo, el patrón, el control y las muestras se diluyen en D-MEM+ en tres series de dilución por separado: a) comenzando a 32 U/ml seguidas de diluciones al doble; b) comenzando en 12 u/ml seguidas de diluciones al 1.5; y c) comenzando a 6 U/ml seguidas de diluciones al 1.2. Cincuenta microlitros de las diluciones se adicionan en columnas a las cavidades de placas de microtitulación de 96 cavidades, una placa por serie de dilución. Después, se añaden células A549 (ATCC Número de Catálogo CC1-185, Rockville, MD) en D-MEM+ en P840 cada cavidad a 5 x 105 células/ml, 50 microlitros por cavidad, efectuando una dilución al doble tanto de las células como del interferón-beta. Las células y el interferón se incuban a 37 grados C en dióxido de carbono 5% entre 15 y 20 horas. Los contenidos de las placas se agitan en una cubeta de blanqueo y se añaden en cada cavidad 100 microlitros de virus EMC (encefalomiocarditis) a dilución adecuada en el medio. Los virus y las células se incuban a 37 grados C y dióxido de carbono 5% por 30 horas. Los contenidos de las placas se agitan en una cubeta de blanqueo y se añade colorante violeta de metilo 0.7% a las placas. Después de 5 o 10 minutos, las placas se lavan con agua destilada y se dejan secar. Cada placa de prueba incluye cavidades de control de crecimiento celular que no contienen interferón ni EMC, cavidades de control de virus que contienen EMC y células pero no interferón y una serie de diluciones de interferón patrón. Las placas se examinan en forma visual para determinar la última cavidad en cada columna con células viables (>25% tinción púrpura confluente) . El límite de detección se determina como la concentración más baja del patrón que protege contra citotoxicidad por virus. La dilución de la muestra en la última cavidad positiva se multiplica por el límite de detección determinado para el patrón y el factor de dilución de la muestra para obtener la actividad del interferón (MU/ml) en la muestra. Los resultados de cada placa se transforman a unidades logarítmicas para la determinación de la media geométrica y el cálculo de intervalos de 95% de confianza. EJEMPLO 2: Elección del Sistema Amortiguador Preparamos tres grupos de amortiguadores que contienen entre nueve y 10 diferentes componentes para cada grupo. El grupo I contiene una serie de soluciones de fosfato de sodio y/o cloruro de sodio 100 mM entre pH 4.0 y 7.2. El grupo II contiene una serie adicional de amortiguadores de citrato de sodio entre pH 4.0 y 7.0. El grupo III contiene una serie de soluciones amortiguador de succinato de sodio, acetato de sodio y carbonato de sodio, todas combinadas con cloruro de sodio 100 mM, que tienen valores de pH que varían entre 4.0 y 7.2. Otras dos soluciones sustituyen el cloruro de sodio con sulfato de sodio 50 mM a un pH entre 4.0 y 7.2. El interferón-beta a granel descongelado, se dializa en los diferentes amortiguadores durante la noche entre 2 y 8 grados C con dos intercambios de amortiguadores, por lo menos, después se filtran en ambiente estéril antes de usarse. Las concentraciones de proteína se determinan por absorbancia a 278 nm (con coeficiente de extinción de 1.5 mg-1 ml.cpf1) y todas las muestras contenían 140 ug/ml o 150 ug/ml de interferón- P840 beta. Las muestras se filtran y se dividen en cuatro grupos llenando parcialmente tubos eppendorf de 2.2 ml . Un grupo se colocó entre 2 y 8 grados C; un grupo se colocó a 37 grados C de 6 días a dos semanas; otro grupo se colocó en un rotor entre 7 y 9 horas; y el grupo final se uso como control para tiempo cero. El porcentaje de pérdida de proteína debido a agregados insolubles se calcula por la pérdida de la concentración de proteína durante los diversos tratamientos dividida entre la concentración inicial. Resultados : El porcentaje de pérdida de proteína por los agregados insolubles se calcula como la pérdida de concentración de proteína divida entre la concentración de proteína inicial. Un análisis estadístico de todos los datos indica que la muestras de interferón en amortiguadores con pH entre 4.0 y 5.0 tuvieron un porcentaje de pérdida de proteína debida a la agregación menor que aquéllos con pH mayor. Las muestras de interferón incubadas a 37 grados C y pH entre 4.0 y 5.0 perdieron entre aproximadamente 10% y 15% debido a la agregación. A valores de pH mayores a 6.0, las pérdidas aumentaron hasta 40-50%. También determinamos que las muestras de interferón tienen más agregados solubles a valores de pH mayores a 6.0. además, hemos determinado mediante mapa de péptidos que a medida que aumenta el pH de 4.0 a 7.2, hay un incremento prácticamente lineal en la cantidad de interferón que está desamidado; a pHs de 7.0 y mayores, más de 85% del interferón es desamidado durante el estudio. Medimos el punto isoeléctrico (pl) de las especies proteicas en la muestras (es decir, el pH al cual la proteína no migra en un campo eléctrico y la carga media de la proteína es cero) con transferencias IEF/Western y las transferencias muestran bandas pl adicionales para las muestras en citrato de sodio y un desplazamiento de la intensidad de la banda para las muestras en succinato de sodio. El fosfato no tiene capacidad amortiguadora a pH 5.0. El acetato de sodio con cloruro de sodio a pH 5. o no mostró cambio en el patrón o intensidad de bandeo.

Ejemplo 3: El Efecto de Cavitación Durante nuestros experimentos de cribado de pH descritos en el Ejemplo 2, descubrimos que el espacio superior de los tubos de almacenamiento parece ser crítico para la pérdida de proteína de algunas de las muestras. Con 1.5 ml de las muestras en tubos de 2.2 ml de volumen, no se observó pérdida de proteína. Al contrario, 1.2 ml de muestra produce aumento significativo de agregados. Esto es consistente con nuestras observaciones de que la formación de agregados de interferón-beta durante el paso de P840 inactivación viral en el proceso de purificación depende del nivel de oxígeno disuelto en este paso. En breve, el paso de Inactivación viral implica ajustar el pH del eluato de Sepharose quelante (ver Sección C) de 7.85 +/-0.25 a un intervalo entre 2.5 y 3.5 con ácido fosfórico 15% que mantiene el eluato acidificado por 120-135 minutos y reajustando el pH a 6.7 +/-0.7 con hidróxido de sodio 0.5 N. Todos los pasos se realizan entre 2 y 8 grados C. Diseñamos un estudio para determinar si existe una relación entre la formación de agregados de interferón-beta en este paso y la cantidad de oxígeno disuelto. Materiales y Métodos El eluato de la columna de Sepharose quelante se divide en alícuotas de 50 ml o 100 ml y se colocan en matraces rotatorios de 100 ml. A cada matraz, se añade 1 m de ácido fosfórico al 15% burbujeado con argón. El matraz se agita suavemente por aproximadamente 2 minutos y se mantiene sin agitar por aproximadamente 2 horas entre 2 y 8 grados C. Después de este período, se añaden 6.5 ml de hidróxido de sodio burbujeado con argón y la muestra se analiza por cromatografía de exclusión por tamaño a diferentes tiempos. El oxígeno disuelto dentro del líquido se mide continuamente con una sonda de oxígeno (Orion, Modelo 860) y se registra el tiempo al momento de la adición de la base. Para muestras con niveles de oxígeno P840 disuelto iguales o menores a 10%, es difundido a través del espacio superior del recipiente de reacción. Resultados: Los datos se presentan en la Figura 1 los cuales revelan una clara relación entre la cantidad de oxígeno disuelto presente en el momento de la adición de hidróxido de sodio y el rendimiento de monómero de interferón-beta en el paso de inactivación de virus. Los valores de rendimiento obtenidos a concentraciones de oxígeno disuelto menores o iguales a 10% son significativamente diferentes de los otros rendimientos a otras concentraciones de oxígeno. También caracterizamos el agregado (los datos no se presentan aquí) y determinamos que su actividad específica se disminuye aproximadamente 30-40 veces con respecto al intermediario a granel. También determinamos que más de 90% del agregado es resistente a la desnaturalización SDS en condiciones no reductoras, lo que sugiere un enlace cruzado covalente. En condiciones reductoras (beta-mercaptoetanol al 2%) el agregado se desintegra para dar el monómero, lo que sugiere un enlace cruzado que implica enlaces disulfuros.

Ejemplo 4: Elección de Excipiente Una serie de formulaciones de interferón-beta (60 ug/ml) que contienen diferentes excipientes se preparan en un amortiguador preferido pH 5.0 que contiene acetato de P840 sodio 50 mM y cloruro de sodio 100 mM. Los excipientes incluyen glicina, clorhidrato de arginina, clorhidrato de lisina, sacarosa, glicerina, PEG3350, glutatión y Pluronic F-68. El intermediario a granel de interferón-beta se dializa en acetato de sodio 50 mM y cloruro de sodio 100 mM, pH 5.0 durante la noche entre 2 y 8 grados C con un intercambio de dos amortiguadores, por lo menos, se filtra entonces antes de usarse. Las concentraciones de interferón-beta se determinan por absorbancia a 278 nm restando el fondo. Todas las muestras se diluyen a concentraciones de interferón finales de aproximadamente 60 ug/ml. Todas las muestras que se prepararon se filtran, dos mililitros se transfieren a viales de vidrio de 4 ml (sin silicona) , el espacio superior se burbujea con argón y los viales se sellan. Los grupos de muestras se colocan entre 2 y 8 grados C y 37 grados C por períodos hasta de dos semanas. Otras muestras se someten a tensión mecánica haciéndolas girar a temperatura ambiente por 3 días. Las muestras se analizan según el procedimiento del Ejemplo 1. Además, el porcentaje de oxígeno disuelto en las formulaciones se mide con un analizador de gases en sangre Ciba-Corning Modelo 248. El valor "experimental" es la presión parcial de oxígeno (mm Hg) de las muestras menos la del blanco de amortiguador purgado con nitrógeno y el valor "control" es la presión parcial de oxígeno en el P840 blanco del amortiguador almacenado a temperatura ambiente menos la presión parcial de oxígeno del blanco del amortiguador purgado con nitrógeno. El porcentaje de oxígeno disuelto ("experimental"/"control") siempre es menor a 30%.

Resultados : Las transferencias IEF/Western y las transferencias SDS-PAGE de las muestras incubadas a 37 grados C por dos semanas indican desplazamiento de bandas y pérdida de intensidad así como la presencia de multímeros de interferón en muestras que contienen PEG3350 y glutatión. Después de una semana adicional a 37 grados C, el excipiente de glicerina muestra una banda adicional en nuestras transferencias. El excipiente de sacarosa muestra pérdida en la intensidad de la banda. Este procedimiento inicial de cribado nos permite considerar con mas detalle clorhidrato de arginina, glicina, cloruro de sodio y manitol para estudios posteriores.

Ejemplo 5: Adsorción de Inferieron Interíerón-beta a granel descongelado se dializa en BG9589-1, 2, 3 y 4 (ver Tabla 1) durante la noche entre 2 y 8 °C con dos intercambios de amortiguadores, por lo menos, después se ultra antes de usarse. Las P840 concentraciones de proteínas se determinan por absorbancia a 280 nm (con coeíiciente de extinción de 1.5 mg ml . cm ) . Todas las muestras se diluyen a concentraciones íinales de aproximadamente 60 ug/ml. Las muestras diluidas se íiltran y se llenan con 0.5 ml de cada una por triplicado, jeringas BD (de vidrio Tipo I) atomizadas con silicona, de 1.0 ml de largo con espacio superior lavado con nitrógeno o 0.75 ml por triplicado en viales de vidrio Tipo I de 0.75 ml con espacio superior lavado con argón. Las concentraciones de proteína se determinan por HPLC de íase inversa (Ejemplo 1) . Resultados: La Tabla 3 abajo menciona las concentraciones de proteína que se determinaron por HPLC de fase inversa. Los datos indican que hay menos proteína para las muestras que se vaciaron en los viales de vidrio en comparación con las jeringas previamente llenadas recubiertas con silicona. Así que, las jeringas siliconadas son usadas para la formulación líquida de interferón-beta.

P840 Tabla 3 Ejemplo 6. Formulaciones a pH Fisiológico Fuerza Iónica/Fosfato. Llevamos a cabo estudios iniciales en fosfato/cloruro de sodio, sistemas amortiguador pH 7.2 de concentraciones de componente amortiguador variables en las que la concentración de fosfato varía entre 10, 50 y 75 mM con una fuerza iónica (definida por I=ScIzI , en donde c? y z son las concentraciones molares y la carga de la valencia de las especies iónicas I, respectivamente) de 0.2, 0.4 y 0.6, ajustadas por adición de cloruro de sodio. Usamos un diseño factorial total en las variables de concentración de fosfato (10, 50 y 75 mM) y fuerza iónica (I = 0.2, 0.4 y 0.6). Las composiciones de fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio y cloruro de sodio (para lograr la fuerza iónica deseada) en los amortiguadores se calculan usando una hoja de cálculo P840 adaptada de Ellis y Morrison, "Amortiguadores of Constant Ionic Strenght for Studying pH-dependent Processes", Methods Enzymol . 87:405-426(1982). Las ecuaciones permiten la determinación de las cantidades requeridas de cada componente de amortiguador para el pH especificado, la concentración de fosfato y la fuerza iónica. Cada una de las nueve soluciones usadas en el experimento factorial se obtiene por intercambio de amortiguador del intermediario a granel de interferón-beta través de columnas de desalinización Pharmacia PD-10. Los pHs de todas las soluciones resultantes son de 7.20 +/- 0.15. Las concentraciones se analizan por absorbancia a 280 nm y se diluyen entonces a 150 ug/ml de interferón-beta con el amortiguador adecuado. Las soluciones resultantes se filtran en condiciones estériles en atmósfera de argón a través de filtros de 0.22 mieras y alícuotas de 1.3 ml se vacían en viales de vidrio de 5 ml con un espacio superior de argón. Las muestras se incuban a 37 grados C por 6 días y se corren por triplicado. Las muestras se analizan por el por ciento de transmitancia a 580 nm, por ciento de proteína recuperada y transferencias IEF-PAGE/ Western.

Resultados : El análisis del porcentaje de transmitancia con respecto a la fuerza iónica variable muestra una tendencia P840 hacia el aumento en la transmitancia (es decir, cantidades decrecientes de agregados de proteína insoluble) con el aumento de la fuerza iónica. Los datos del por ciento de recuperación de proteína muestran una tendencia semejante aunque las transferencias IEF-PAGE/ Western no muestran tendencia a la desamidación con la variación de la fuerza iónica de manera que todas las muestras se desamidan igualmente. Así, después del almacenamiento por seis días a 37 grados C, las muestras tienden a mostrar menos agregación con la concentración decreciente de fosfato y con el aumento de la fuerza iónica. Los resultados de los experimentos sobre el porcentaje de transmitancia y el por ciento de recuperación como una función de la concentración variable de fosfato (no presentados aquí) muestran una débil tendencia hacia el % de transmitancia decreciente con el aumento en la concentración de fosfato, aunque un análisis de varianza muestra que no hay una diferencia significativa en las medias de las muestras con diferentes concentraciones de fosfato. Los datos de porcentaje de recuperación muestran recuperación mejorada de la proteína para las concentraciones menores de fosfato (una diferencia significativa en el nivel de confianza de 94%) . Las transferencias IEF-PAGE/Western muestran que no hay una tendencia perceptible en la desamidación con las concentraciones variables de fosfato.

P840 Relación Excipiente/Sal. Los estudios preliminares (no se muestran) indican que algunos excipientes pueden requerir sales (por ejemplo, cloruro de sodio) para mantener la fuerza iónica elevada y para presentar un efecto estabilizante a pH de 7.2. Diseñamos un estudio factorial usando excipientes (glicina, lisina, arginina, sacarosa y manitol) y una fracción de cloruro de sodio que contribuye a la isotonicidad (fsal = 0, 0.25, 0.75 y 1.0) . La fracción se calcula por: fsal = Osal/ (Osal + Oexcipiente) r en donde Osal y Oexcipiente son las osmolalidades en mOsm/kg (miliosmoles/kg) de cloruro de sodio y excipiente, respectivamente, en la solución. La fracción de sal proporciona un medio para comparar los efectos de la sal en los diferentes excipientes. Todas las muestras contenían aditivos para isotonicidad, con relaciones variables de excipiente : sal (como se define por fsal) . Se preparan soluciones de reserva al diez por ciento (p/v) de cada excipiente en fosfato 20 mM, pH 7.2, se desgasifican y se burbujean con argón. Se prepara una solución de reserva de cloruro de sodio 250 mM, fosfato 20 mM, pH 7.2, se desgasifica y se burbujea con argón. El intermediario a granel de interferón-beta se somete a diálisis en forma extensiva contra un amortiguador de fosfato 20 mM, pH 7.2 burbujeado con argón. La solución resultante se analiza para determinar por absorbancia a 280 P840 nm la concentración de interferón-beta y se diluye con amortiguador de fosfato y las soluciones de reserva respectivas de excipiente y sal para llegar a 60 ug/ml de interferón-beta y las condiciones de sal y excipiente finales deseadas. Las muestras resultantes se esterilizan por filtración (0.22) y se vacían a jeringas de vidrio Tipo I, Becton Dickinson atomizadas con silicona de 1.0 ml (volumen de llenado 0.5 ml) con espacio superior de nitrógeno. Las muestras se almacenan a 40 grados C. A los 6 días, las muestras de arginina, glicina y sacarosa se analizan por absorbancia a 320 y 280 nm, tanto antes como después de filtrarlas a través de filtros de 0.22 mieras. A las 2 semanas, las muestras de arginina, lisina y manitol se analizan de manera semejante, junto con IEF-PAGE, SDS-PAGE reductor y no reductor. Las muestras de control se almacenaron entre 2 y 8 grados C y se analizaron en forma semejante. Resultados : La recuperación de Interferón-beta la (como porcentaje de control) aumenta cuando aumenta fsal para sacarosa y manitol, llegando a un máximo de recuperación en fsal = 1 (cloruro de sodio 130 mM) . Para arginina y lisina, la recuperación disminuye cuando aumenta fsa?- La recuperación máxima para las formulaciones de glicina a pH 7.2 se logra en aproximadamente fsal = 0.75.

P840 Este estudio de cribado de excipientes utilizando un amortiguador de fosfato de pH de 7.2 con diversos excipientes como glicina, lisina, arginina, manitol y sacarosa añadidos para isotonicidad, mostraron baja recuperación para todos los excipientes sin carga. El grado de desamidación no se afectó por estos aditivos. Por ejemplo, las SDS-PAGE reductora y no reductora indicaron pérdida de especies de interferón-beta no glicosilado en todas las formulaciones y transferencias de multímeros más gruesas para cloruro de sodio isotónico solo y manitol. En resumen, hay así una fuerte correlación entre el carácter iónico del excipiente y su capacidad para estabilizar al interferón-beta contra la agregación en estos sistemas de amortiguador a pH fisiológico. Los aditivos no iónicos como la sacarosa y el manitol parecen no ofrecer protección o pueden promover realmente la pérdida de proteína a pH fisiológico. El cloruro de-- sodio con una sola carga por especie soluble, funciona mejor que el manitol o la sacarosa. Los aminoácidos contienen dos cargas por molécula a pH fisiológico. En el caso de la glicina, la naturaleza zwitteriónica de la molécula en sí no parece ser suficiente para estabilizar al interferón-beta. La arginina y la lisina que contienen cada una tres cargas por molécula, estabilizan al interferón-beta mejor que el cloruro de sodio solo o que las formulaciones glicina/cloruro de P840 sodio.

Ejemplo 7: Estudios de Estabilidad y Cinética Las formulaciones se llenan asépticamente en atmósfera inerte, las jeringas se incuban en un intervalo de temperaturas por períodos de tiempo variables y se analizan los contenidos de las jeringas. En breve, el interferón-beta a granel, descongelado se somete a diálisis en BG9589-1, -2, -3 y -4 durante la noche entre 2 y 8 grados C con dos intercambios de amortiguador, por lo menos. Las concentraciones de proteína se determinan por absorbancia a 280 nm con un coeficiente de extinción de 1.5 ml/mg/cm. Todas las muestras se diluyen a una concentración final de interferón-beta-la de aproximadamente 60 ug/ml. Las cuatro formulaciones de interferón-beta-la de la Tabla 1 se filtran y se distribuyen en 0.5 ml a jeringas Becton Dickinson (BD) , de 1 ml de largo, cuyas superficies interiores fueron recubiertas con silicona horneada o atomizada. Las muestras se analizaron por OD (densidad óptica) , HPLC de exclusión por tamaño (SEC) , transferencias electroforesis en gel con enfoque isoeléctrico (IEF) /Western, transferencias electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio reducido (SDS-PAGE) /western, mapas de péptidos, electroforesis de carbohidratos auxiliada con fluoróforo (FACE) y bioensayo P840 CPE. El espacio superior en la jeringa es gas nitrógeno. Las jeringas se incuban entre 2 y 8 grados C, 25 grados C, 33 grados C y 40 grados C hasta por noventa días. Las muestras se analizaron según los métodos del Ejemplo 1. Resultados: Analizamos las concentraciones de proteína de nuestras muestras, normalizadas con respecto a las del material de partida por períodos hasta de noventa días en una diversidad de temperaturas. La Figura 2 ilustra que BG9589-1 mostró completa estabilidad de la proteína (sin pérdida de proteína) después de 3 meses de incubación a temperaturas que varían entre 2 y 8 grados C (en promedio 4 grados C) hasta 25 grados C. A una temperatura de almacenamiento (33 grados C) que se aproxima a la temperatura del cuerpo, aproximadamente 18% de la proteína se degradó. A una temperatura de almacenamiento (40 grados C) que excede la temperatura del cuerpo, aproximadamente treinta por ciento de la proteína se degradó al final de los 3 meses. Se obtuvieron resultados casi idénticos para BG9589-2 (no se muestran) . La Figura 3 ilustra los resultados de pruebas de almacenamiento de 2 meses con BG9589-3. La degradación de la proteína fue mínima de 4 a 25 grados C pero fue rápida a temperaturas más altas. Los resultados para BG9589-4 son casi idénticos a los de las Figuras 2 y 3. Estos datos se confirmaron utilizando P840 transferencias SDS-PAGE/Western reducida. En las jeringas "horneadas", durante el período de este estudio no hay agregados solubles detectables. No se observaron cambios significativos en la concentración de proteína, ensayo CPE, por ciento AP6 Oxidado y perfiles de carbohidratos. No hay cambios observables en las muestras como se vio mediante transferencia SDS-PAGE/Western reductora y transferencia IEF/Western. Hay algo de aumento en el por ciento de desamidación cuando se compara con el punto de tiempo inicial. Sin embargo, el intermediario a granel que se usó para llenar estas jeringas tiene 37% de desamidación, que es mayor que el valor de 33.8% del material después de que se vació a las jeringas. Este valor bajo último puede deberse a la variablilidad del ensayo. En las jeringas "atomizadas" durante el período de este estudio, tampoco hay agregados solubles detectables. No se observaron cambios significativos en la concentración de proteína, ensayo CPE, por ciento de desamidación, por ciento AP6 Oxidado y perfiles de carbohidratos. No hay cambios observables en las muestras como se vio mediante transferencia SDS-PAGE/Western reductora y transferencias IEF/Western. En breve, hasta aquí los resultados han demostrado que el producto final BG9589-1 es estable hasta por 3 meses entre y 8 grados C en las jeringas de "silicona horneada" y 6 meses entre 2 y 8 grados en P840 jeringas de "silicona atomizada". Realizamos en ensayo CPE antiviral en las formulaciones BG9589-1 y BG9589-2 (ver Tabla 1) después de que las jeringas fueron llenadas en forma aséptica. Los valores de actividad reportados tanto para BG9589-1 como para BG9589-2 son 12.0 MU/ml. El ensayo CPE antiviral se repitió después del almacenamiento de las muestras hasta por 3 meses entre 2 y 8 grados C. Los valores de actividad reportados para BG9589-1 son de 11.6 MU/ml (n=8) con un intervalo de confianza de 95% de 10.2-13-3 MU/ml. También medimos la estabilidad del material intermediario a granel de BG9589-1 a 2-8 grados C por 5 meses y -70 grados C por 6 meses. Las muestras de BG9589-1 de los estudios de diafiltración pilotos se analizaron mediante los métodos del Ejemplo 1. Hasta aquí los resultados han demostrado que el material en proceso de BG9589-1 es estable entre 2 y 8 grados C por 5 meses y a -70 grados C por 6 meses. En el período de este estudio particular, no hubo agregados solubles detectables. No se observaron cambios significativos para el por ciento de desamidación y los perfiles de carbohidratos (Las diferencias en por ciento de desamidación están dentro de la variabilidad del ensayo) . No hay cambios observables en las muestras como se vio mediante transferencia SDS-PAGE/Western reductora y P840 transferencia IEF/ Western. Hay una ligera disminución en la concentración de proteína. La disminución en la concentración de proteína para los -70 grados C puede deberse a que la muestra pasa por una ciclo de congelado/descongelado. La disminución de la concentración de proteína está todavía dentro del 15% de concentración inicial .

Ejemplo 8: Estudios Preclínicos Se realizó un estudio de tolerancia local a una dosis simple intramuscular (IM) en conejos que evaluó la toxicidad local del interferón cuando se administra en varias formulaciones nuevas. Las reacciones en el lugar de la inyección debidas a la administración del formulación liquida presente o con las formulaciones de interferón liofilizado y reconstituido son comparables a aquéllas que se presentan después de la administración de salina normal. 1. Estudio de Irritación/Biodisponibilidad Después de la Administración de una Dosis Simple MI de Cuatro Formulaciones de interferón-beta en Conejos Veinte conejos blancos de Nueva Zelanda machos recibieron una inyección intramuscular (MI) simple de 30 ug de Interferón-beta-la como una de cinco formulaciones: BG9589-1 (pH 5.0, amortiguador de acetato, estabilizante P840 arginina, 0.5 ml/dosis) ; BG9589-2 (pH 5.0, amortiguador de acetato, estabilizante glicina/NaCl, 0.5 ml/dosis); BG9589-3 (pH 7.2, amortiguador de fosfato, estabilizante arginina, 0.5 ml/dosis); BG9589-4 (pH 7.2, amortiguador de fosfato, estabilizante glicina/NaCl, 0.5 ml/dosis); y una formulación de interferón-beta liofilizado a pH 7.2 que contiene 1.5% de HSA, 1.0 ml/dosis (Ver Jacobs et al, arriba) . Cuatro animales recibieron cada tratamiento. Los animales que recibieron BG9589-1 o la formulación liofilizada recibieron también una inyección de volumen equivalente de salina normal en un lugar contralateral como control negativo. Se colectaron muestras de sangre en las 72 horas post-dosis para el análisis de actividad de interferón-beta sérica. Las evaluaciones dérmicas macroscópicas para eritema, formación de cicatrices y edema se realizaron a las 6, 12, 24, 48 y 72 horas post-dosis. Después de la recolección a las 72 horas post-dosis los animales se sacrificaron, los lugares de inyección se inspeccionaron macroscópicamente para detectar signos de lesiones en el tejido y después se fijaron en formalina amortiguada neutra al 10%. Las muestras de músculo (tres/lugar de inyección) se examinaron microscópicamente para detectar inflamación, necrosis, hemorragia y lesiones. Cuando se clasificó por medio de las P840 calificaciones de índice de Irritación Primaria (Sistema de Clasificación Dérmica EPA) , se determinó que ninguna de las formulaciones líquidas de arriba era más que un ligero irritante para la piel. La inspección macroscópica del lugar de inyección de BG9589-4 en un animal indicó irritación ligera (hemorragia) ; sin embargo la investigación microscópica reveló que no había signos de hemorragia y se determinó que la observación macroscópica era un artefacto. En breve, los exámenes microscópicos revelan que las reacciones en el lugar de inyección de las formulaciones líquidas del artículo de prueba fueron en forma consistente de mínimas a moderadas y que no hubo reacción mas severa que aquélla que se indujo por la administración de la formulación liofilizada o de salina normal. Además, la irritación dérmica en conejo posterior a las administraciones repetidas de las formulaciones líquidas puede analizarse fácilmente utilizando grupos múltiples de conejos que reciban inyecciones intramusculares de formulaciones líquidas o de salina normal cada tercer día durante ocho días (cinco dosis en total) . Las dosis se administran en un área predefinida en el lomo de cada animal para llevar al máximo la exposición local del artículo de prueba. Las evaluaciones dérmicas macroscópicas se realizan a las 4-6 horas después de cada P840 administración y a las 24 horas después de la última administración para cada grupo de tratamiento. Diariamente se hicieron observaciones gruesas en el tiempo de cada evaluación dérmica. Después del examen macroscópico a las 24 horas post-dosis, los animales se sacrificaron, los lugares de inyección se inspeccionaron para detectar signos de lesión en tejido y los tejidos se fijaron en formalina amortiguada al 10%. Los tejidos conservados se examinaron microscópicamente para detectar inflamación, necrosis, hemorragia y lesiones. Las muestras de sangre también se recolectaron inmediatamente antes de la administración inicial del artículo de prueba y al tiempo de sacrificarlos para las evaluaciones de hematología y de química sérica. Ejemplo 9: Estudios Clínicos Las formulaciones líquidas presentes son significativamente distintas de las formulaciones de interferón previas. Para cualquier indicación clínica, hay la posibilidad de un cambio en el comportamiento farmacocinético y farmacodinámico del interferón cuando se administra a humanos. Desafortunadamente, las actividades del interferón-beta son bastante específicas con respecto a la especie y la información farmacológica más pertinente se deriva de estudios en células humanas en cultivo, en humanos y en menor grado en monos rhesus. Una forma preferida de probar el cambio farmacológico, si hay alguno, P840 es realizar una prueba de bioequivalencia en humanos. Los niveles antivirales séricos de interferón-beta se pueden cuantificar utilizando un bioensayo de efecto citopático (CPE) , tal como se describe por ejemplo en el Ejemplo 1. Un estudio de bioequivalencia en humanos se puede realizar con cualquier número de -formulaciones de interferón líquidas y liofilizadas. A través del análisis del suero, el área bajo la curva (AUC) y los parámetros de actividad Cmax, alguien con experiencia ordinaria en la técnica puede determinar si las formulaciones liofilizada y líquida son bioequivalentes . Como un ejemplo del protocolo de un estudio de bioequivalencia, describimos brevemente un estudio, doble ciego, de dosis simple, transversal para demostrar la bioequivalencia de una formulación líquida de la invención y un producto de interferón-beta liofilizado en voluntarios sanos.

Diseño. Cada sujeto recibe la misma dosis (por ejemplo, 60 ug/12 MU) de formulaciones de interferón-beta en un ensayo doble ciego, transversal de dos períodos (Tabla 4) . Los sujetos tienen edades entre 18 y 45 años, inclusive y dentro de 15% del intervalo de peso corporal normal para la estatura y la complexión. Las muestras de sangre para hematología, química, actividad sérica de interferón-beta y perfiles farmacodinámicos se toman inmediatamente antes de P840 cada dosis y a varios tiempos después de cada dosis, a través de 144 horas post-dosis. También se siguió la evaluación del dolor de la inyección y de las reacciones en el lugar de la inyección.

Realización del Estudio. Como profilaxis contra el síndrome de catarro asociado con el interferón, todos los sujetos recibirán acetaminofen inmediatamente antes y a través de los períodos de dosificación.

Farmacocinética Determinaciones de interferón-beta sérico. Los niveles séricos se miden como unidades de actividad antiviral mediante un ensayo (CPE) . Los niveles antivirales séricos se analizan para determinar AUC, Cmax y Tmax. Los valores AUC se calcularán a partir del tiempo de la dosificación hasta el último nivel detectable (AUC0_T) y a través de 144 horas post-dosis (AUCO-144). El análisis descriptivo estándar de los datos de tratamiento se realiza utilizando SAS (versión 6.08, SAS Institute, Cary, North Carolina) .

P840 Tabla 5 Esquema de dosis para el Estudio Ejemplificativo Grupo de Ruta Dosis (MU) Período de Período de Dosis Tratamiento : Tratamiento: 1 2 IM 12 Liofilizado Líquido (60 mcg) (60 mcg) IM 12 Líquido Liofilizado (60 mcg) (60 mcg) Farmacodinámia . Se ha caracterizado el marcador biológico neopterina, un producto de la enzima GTP ciclohidrolasa inducida por interferón que refleja activación de macrófagos y células T (C. Huber et al., J. Exp. Med. 1984; 160:310-314; september 20, 1996; D.Fuchs et al., Immunol. Today 9: 150-155, 1988) . Tanto en estudios no clínicos como clínicos del interferón-beta humano recombinante, la inducción de neoptrina se~ correlaciona con los niveles séricos de actividad posteriores a la administración de diversos tratamientos con interferón-beta humano recombinante . La neopterina se mide por medio de procedimientos estándar de laboratorio. El perfil farmacodinámico del interferón-beta se describe de una manera cuantitativa mediante el cálculo de tres parámetros séricos de P840 neopterina. El primer parámetro, EAUC, es el área bajo la curva de neopterina vs tiempo normalizada a nivel de la línea base. El segundo parámetro es Emax; este parámetro es la diferencia entre el nivel pico de neopterina observado y el nivel de neopterina de línea base. El tercer parámetro es la relación de inducción, IR; este parámetro está calculado como el nivel pico de neopterina dividido entre el nivel de neopterina de la línea base.

Estadistica. Se usa el procedimiento de pruebas de dos lados y de un lado de Wilcoxon-Mann-Whitney en AUC para determinar equivalencia. Para estimar la biodisponibilidad relativa del interferón proveniente de la formulación líquida con relación a la formulación liofilizada y sus límites de confianza de 90%, el AUC se somete a análisis de varianza (ANOVA) después de transformación logarítmica. A partir de la variación "entre-sujeto", se aislan la secuencia y géneros. A partir de la variación "intersujetos", se aislan los componentes debidos a los períodos y tratamientos.

EQUIVALENTES Otras modalidades y usos de la invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de examinar la descripción y poner en práctica la invención P840 expuesta aquí. Es la intención que la descripción y los ejemplos se consideren solamente como ejemplificativos, junto con el verdadero alcance y espíritu de la invención que se indica por la siguientes reivindicaciones.

P840

Claims (43)

1. REIVINDICACIONES : 1. Una composición líquida que comprende un interferón y un agente estabilizante en aproximadamente entre 0.3% y 5% en peso el cual es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos ácidos, arginina y glicina, en donde la composición líquida no ha sido previamente liofilizada.
2. 2. La composición líquida según la reivindicación 1, que además comprende un recipiente que contiene la composición líquida, el recipiente tiene por lo menos una superficie recubierta con un material inerte al interferón.
3. 3. La composición líquida según la reivindicación 1, en donde el interferón es un interferón-beta, o un interferón producido en forma recombinante. 4. La composición líquida según la reivindicación 1, que tiene un pH entre aproximadamente 4.0 y 7.2. 5. La composición líquida según la reivindicación 4, que tiene un pH entre
4. 4.8 y
5. 5.2.
6. 6. La composición líquida según la reivindicación 5, que tiene un pH de 5.0.
7. 7. La composición líquida según la reivindicación 5, en donde el aminoácido acídico es ácido glutámico.
8. 8. La composición líquida según la P840 reivindicación 1, en donde la arginina es clorhidrato de arginina.
9. 9. La composición líquida según la reivindicación 1, que tiene una concentración de interferón entre aproximadamente 6 MUI/ml y 50 MUI/ml.
10. 10. La composición líquida según la reivindicación 2, en donde la por lo menos una superficie del recipiente está recubierta con un material seleccionado del grupo que consiste de silicona politetrafluoroetileno.
11. 11. La composición líquida según la reivindicación 10, en donde el recipiente es una jeringa.
12. 12. Un amortiguador de acetato 20 mM a pH 5.0 que incluye interferón-beta mas un agente estabilizante seleccionado del grupo que consiste de (a) arginina 150 mM; (b) cloruro de sodio 100 mM y glicina 70 mM; (c) arginina 150 mM y 15 mg/ml de albúmina sérica humana; (d) arginina 150 mM y un tensoactivo; (d) cloruro de sodio 140 mM; (e) cloruro de sodio 140 mM y 15 mg/ml de albúmina sérica humana; (f) cloruro de sodio 140 mM y un tensoactivo, en donde el amortiguador no ha sido previamente liofilizado.
13. 13. El amortiguador según la reivindicación 12, en donde el tensoactivo es Pluronic F-68 0.1% (p/v).
14. 14. El amortiguador según la reivindicación 12, en donde la arginina es clorhidrato de arginina.
15. 15. El amortiguador según la reivindicación 12, P840 que además comprende un recipiente que contiene el amortiguador, en donde por lo menos una superficie del recipiente en contacto con el amortiguador está recubierta con un material seleccionado del grupo que consiste de silicona y politetrafluoroetileno.
16. 16. El amortiguador según la reivindicación 15, en donde el recipiente es una jeringa.
17. 17. Una composición líquida a pH 5.0 que comprende interferón-beta y ácido L-glutámico 170 M, el líquido no ha sido previamente liofilizado.
18. 18. La composición líquida según la reivindicación 1, que comprende el aminoácido glicina y que además comprende una sal.
19. 19. La composición líquida según la reivindicación 17, que además incluye ingredientes seleccionados del grupo que consiste de 15 mg/ml de albúmina sérica humana y 0.1% (p/v) de Pluronic F-68.
20. 20. Un amortiguador de fosfato 20 M a pH 7.2 que incluye interferón-beta más un agente estabilizante seleccionado del grupo que consiste de: (a) arginina 140 mM; y (b) cloruro de sodio 100 mM combinado con glicina 70 mM, en donde el amortiguador no ha sido previamente liofilizado.
21. 21. La composición líquida según la reivindicación 20, que además comprende un recipiente que P840 contiene el líquido, en donde por lo menos una superficie del recipiente en contacto con el líquido está recubierta con un material seleccionado del grupo que consiste de silicona y politetrafluoroetileno.
22. 22. La composición líquida según la reivindicación 20, en donde el recipiente es una jeringa.
23. 23. Una composición farmacéutica líquida contenida dentro de un recipiente de almacenamiento, el líquido adecuado para la administración parenteral en mamíferos y que comprende una cantidad efectiva de interferón-beta, un amortiguador que mantiene el pH dentro del intervalo entre 4.0 y 6.0 y un agente estabilizante aminoácido, en donde el interferón-beta no ha sido sometido a liofilización previa y en donde el recipiente de almacenamiento tiene por lo menos una superficie del mismo en contacto con la composición líquida que está recubierta con un material seleccionado del grupo que consiste de silicona y politetrafluoroetileno.
24. 24. La composición líquida según la reivindicación 23, en donde el recipiente de almacenamiento carece de una interfaz que contiene oxígeno/líquido.
25. 25. La composición líquida según la reivindicación 23, en donde el interferón-beta básicamente conserva su actividad antiviral durante el almacenamiento a una temperatura entre aproximadamente 2 grados C y 25 P840 grados C por un período de por lo menos 2 meses.
26. 26. La composición líquida según la reivindicación 23, en donde el interferón-beta no ha experimentado cavitación previa.
27. 27. La composición líquida según la reivindicación 23, en donde el amortiguador es un amortiguador de ácido orgánico seleccionado del grupo que consiste en amortiguador de citrato, succinato, tartrato, fumarato, gluconato, oxalato, lactato y acetato.
28. 28. La composición líquida según la reivindicación 23, en donde el agente estabilizante aminoácido es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos ácidos, glicina y arginina.
29. 29. La composición líquida según la reivindicación 28, en donde el aminoácido se adiciona en una cantidad de aproximadamente entre 0.3% y 0.5% en peso con base en la composición.
30. 30. La composición líquida según la reivindicación 23, en donde el pH de la composición líquida está en el intervalo entre 4.0 y 5.5.
31. 31. La composición líquida según al reivindicación 30, en donde el pH de la composición líquida es 5.0.
32. 32. La composición líquida según la reivindicación 23, la cual es estéril. P840
33. 33. La composición líquida según la reivindicación 23, que es isotónica a la sangre.
34. 34. La composición líquida según la reivindicación 23, en donde el interferón-beta es interferón-beta recombinante humano.
35. 35. La composición líquida según la reivindicación 34, en donde la actividad del interferón-beta recombinante humano está en el intervalo entre 6 y 50 MUI/ml de proteína.
36. 36. Una composición líquida congelada que comprende un interferón y un agente estabilizante en aproximadamente entre 0.3% y 3.13% en peso, el cual es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos ácidos, arginina y glicina, en donde la composición no ha sido previamente liofilizada.
37. 37. Un estuche para administración parenteral de una formulación de interferón líquida, en donde el estuche comprende: a) un recipiente que contiene una formulación líquida a un pH entre 4 y 6, el líquido que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de interferón-beta que no ha sido previamente liofilizado y un agente estabilizante aminoácido en menos de aproximadamente 3.1% en peso; y b) instrucciones para el uso del mismo.
38. 38. El estuche según la reivindicación 37, que además comprende: c) un hisopo con alcohol; d) una aguja; y P840 por lo menos una venda adhesiva.
39. 39. El estuche según la reivindicación 37, en donde el recipiente es una jeringa que tiene por lo menos una superficie en contacto con la formulación líquida, la superficie recubierta con un material seleccionado del grupo que consiste de silicona y politetrafluoroetileno.
40. 40. El estuche según al reivindicación 39, en donde el recipiente es una jeringa y la formulación líquida contenida en la jeringa carece de una interfaz que contiene oxígeno/líquido.
41. 41. Un proceso para estabilizar interferón-beta en composiciones farmacéuticas líquidas de manera que conserva básicamente su actividad antiviral durante el almacenamiento a una temperatura entre aproximadamente 2 y 25 grados C por un período de por lo menos 3 meses, que comprende mezclar: a) interferón-beta; b) un amortiguador que mantiene el pH dentro del intervalo entre 4.0 y 7.2; y c) un agente estabilizante aminoácido, en donde el líquido no ha sido previamente liofilizado y no ha experimentado cavitación.
42. 42. El proceso según la reivindicación 42, que además comprende mezclar una sal para proporcionar una fuerza iónica adecuada.
43. 43. El proceso según la reivindicación 42, en donde la sal es cloruro de sodio. P840