MXPA99005567A - Antigenos de superficie celular de mamifero y reactivos relacionados - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un gen que codifica una proteína de 316 aminoácidos, designada como 499E9, que es expresada en una célula T altamente polarizada Th1. El acoplamiento de 499E9 puede modular la proliferación específica de antígeno y la producción de citocina por parte de células efectoras. La E499E9 es una molécula de superficie celular novedosa que cuando se acopla puede, ya sea potenciar la expansión de la célula inmune o la apoptosis.

Description

ANTIGENOS DE SUPERFICIE CELULAR DE MAMÍFERO Y REACTIVOS RELACIONADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece a composiciones relacionadas con proteínas que funcionan en el control de la activación y expansión de células de mamífero, por ejemplo células del sistema inmune de un mamífero. En particular, provee genes purificados, proteínas, anticuerpos y reactivos relacionados, útiles por ejemplo para regular la activación, desarrollo, diferenciación y función de varios tipos de células que incluyen células hematopoyéticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La activación de células T en reposo es crítica para la mayoría de las respuestas inmunes y permite a estas células ejercer sus capacidades reguladoras o efectoras. Ver Paul (ed; 1993) Fundamental Immunology 3o ed., Raven Press, New York, E.U.A. El incremento en adhesión entre células T y células presentadoras de antígeno (APC) u otras formas de estímulos primarios, por ejemplo anticuerpos monoclonales (mAb) inmovilizados, puede potenciar las señales del receptor de células T. La activación de células T y la expansión de células T, depende del acoplamiento del receptor de células T (TCR) y señales co-estimuladoras provistas por células accesorias. Ver vgr. Jenkins y Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:361-367; Bierer y Hahn (1993) Semin. Immunol. 5:249-261 ; June, y otros. (1990) Immunol. Today 11 :211-216; y Jenkins (1994) Immunity 1 :443-446. Una interacción co-estimuladora mayor y bien estudiada para las células T, implica ya sea CD28 o CTLA-4 sobre células T ya sea con B7 o B70 (Jenkins (1994) Immunitv 1 :443-446). Estudios recientes sobre ratones deficientes de CD28 (Shahinian, y otros (1993) Science 261 :609-612: Green, y otros. (1994) Immunity 1 :501-508) y ratones transgénicos que expresan inmunoglobulina de CTLA-4 (Rónchese, y otros. (1994) J. Exp. Med. 179:809-817), han revelado deficiencias en algunas respuestas de células T, aunque estos ratones tienen respuestas inmunes primarias normales y respuestas de CTL normales para virus de coriomeningitis linfocítica y virus de estomatitis vesicular. Como resultado, estos dos estudios concluyen que otras moléculas coestimuladoras deben estar apoyando la función de células T. Sin embargo, ha sido difícil la identificación de estas moléculas que median distintas señales co-estimuladoras. El factor de necrosis tumoral (TNF) es el miembro prototipo de una familia emergente de citocinas que funcionan como mediadores prominentes en la regulación inmune y en la respuesta inflamatoria. Estos ligandos son típicamente proteínas de membrana del tipo II, con homología en el extremo carboxilo. Se produce frecuentemente una proteína soluble procesada proteolíticamente. Ver, vgr. Smith, y otros. (1994) Cell 76-959-962; Armitage (1994) Current Opinión in Immunoloqy 6:407-413; Gruss y Dower (1995) Blood 85:3378-3404; Wiley, y otros. (1995) Immunitv 3:673-682; y Baker y Reddy (1996) Oncogene 12:1-9. Las funciones cruciales de estos miembros de la familia son puestas en evidencia por varios estudios, y están implicados en la regulación de apoptosis, tolerancia periférica, maduración de Ig y conmutación de isotipo, y funciones en general de células B y células T. Ver vgr., Thomson (ed. 1994) The cvtokine Handbook Academic Press, San Diego, California E.U.A. Esto implica funciones fundamentales en las redes inmunes y del desarrollo. La incapacidad para modular señales de activación evita el control de respuestas de desarrollo o fisiológicas inapropiadas en el sistema inmune. La presente invención provee por lo menos una molécula co-estimuladora alternativa, cuyos agonistas y antagonistas serán de utilidad en la modulación de un gran número de respuestas inmunes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de un antígeno que exhibe homología de secuencia con proteínas que actúan como inductores de apoptosis. En particular, provee un gen que codifica una proteína de 316 aminoácidos, designada como 499E9, que es expresada en una célula T altamente polarizada Th1. El acoplamiento de 499E9 puede modular la proliferación específica de antígeno y la producción de citocina por parte de células efectoras. La E499E9 es una molécula de superficie celular novedosa que cuando se acopla puede, ya sea potenciar la expansión de la célula inmune o la apoptosis. Se describe la modalidad en ratón que hace posible genes, proteínas y anticuerpos de mamífero y usos de los mismos. Están disponibles equivalentes funcionales de otros mamíferos, por ejemplo humano y especies no mamíferas, que exhiben homología de secuencias significativa. Además, el receptor de 499E9 puede funcionar como su socio de unión para estimular otras células que expresen el receptor. Más particularmente, la presente invención provee una composición de materia seleccionada de: una proteína o péptido 499E9 substancialmente puro o recombinante que exhibe por lo menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia sobre una longitud de por lo menos aproximadamente 12 aminoácidos con SEQ ID NO: 2; una 499E9 de secuencia natural de SEQ ID NO: 2; o una proteína de fusión que comprende la secuencia de 499E9. Ciertas modalidades incluyen una proteína aislada o substancialmente pura que comprende un segmento que exhibe identidad de secuencia con una porción correspondiente de una 499E9, en donde: la homología es por lo menos de aproximadamente 90% de identidad y la porción es de por lo menos aproximadamente 9 aminoácidos; la homología es de por lo menos aproximadamente 80% de identidad y la porción es de por lo menos aproximadamente 17 aminoácidos; o la homología es de por lo menos aproximadamente 70% de identidad y la porción es de por lo menos aproximadamente 25 aminoácidos. Otras modalidades incluyen una composición de materia, en donde: la E499E9 comprende una secuencia madura del cuadro 1 ; o proteína o péptido: es de un animal de sangre caliente seleccionado de un mamífero, incluyendo un roedor; comprende por lo menos un segmento polipeptídico de SEQ ID NO: 2; exhibe una pluralidad de porciones que exhiben la identidad; es una variante alélica natural de 499E9; tiene una longitud de por lo menos aproximadamente 30 aminoácidos; exhibe por lo menos dos epítopes no traslapantes que son específicos para una 499E9 de mamífero; exhibe una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente 90% sobre una longitud de por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos con una 499E9 de roedor; exhibe por lo menos dos epítopes no traslapantes que son específicos para una 499E9 de roedor; exhibe una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente 90% sobre una longitud de por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos con una 499E9 de roedor; está glicosilada; es un polipéptido sintético; está unido a un substrato sólido; está conjugada con otra porción química; es una substitución de cinco veces o menos de la secuencia natural; o es una variante de supresión o inserción de una secuencia natural. También se proveen varias composiciones, por ejemplo que comprenden: una proteína o péptido 499E9 estéril; o la proteína o péptido 499E9 y un vehículo, en donde el vehículo es: un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o amortiguador; y/o formuladas para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral. Se proveen proteínas de fusión, que comprenden por ejemplo: la secuencia de proteína madura del cuadro 1 ; una marca de detección o purificación que incluye una secuencia FLAG, His6, o Ig; o secuencia de otra proteína de ligando-TNF. Se proveen modalidades de equipo que comprenden por ejemplo dicha proteína o polipéptido y: un compartimiento que comprende la proteína o polipéptido; y/o instrucciones para el uso o desecho de reactivos en el equipo. Las modalidades de anticuerpo o compuesto de unión incluyen aquellas que comprenden una porción de unión de antígeno a partir de un anticuerpo, que se une específicamente a una proteína 499E9 natural, en donde: la proteína es una proteína de roedor; el compuesto de unión es un fragmento Fv, Fab, o Fab2; el compuesto de unión está conjugado con otra porción química; o el anticuerpo: es desarrollado contra una secuencia peptídica de un polipéptido maduro que comprende la secuencia del cuadro 1 ; es desarrollado contra una 499E9 madura; es desarrollado contra una 499E9 purificada; es inmunoseleccionado; es un anticuerpo policlonal; se une a una 499E9 desnaturalizada; exhibe una Kd para antígeno de por lo menos 30 µM; está unido a un substrato sólido incluyendo un glóbulo o membrana de plástico; está en una composición estéril; o esta marcada detectablemente, incluyendo una marca radioactiva o fluorescente. Otras modalidades incluyen un equipo que comprende el compuesto de unión y: un compartimiento que comprende el compuesto de unión; y/o instrucciones para el uso o desecho de reactivos en el equipo. Otras formas incluyen por ejemplo una composición que comprende: un compuesto de unión estéril; o el compuesto de unión y un vehículo, en donde el vehículo es: un compuesto acuoso incluyendo agua, solución salina y/o amortiguador; y/o está formulada para administración, oral, rectal, nasal, tópica o parenteral. Esto también habilita los métodos de purificación de una proteína o péptido 499E9 de otros materiales en una mezcla, que comprende poner en contacto la mezcla con dicho anticuerpo y separar la 499E9 unida a los otros materiales. Modalidades de ácido nucleico incluyen un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica una proteína o péptido o proteína de fusión, en donde: la proteína 499E9 es de un mamífero, incluyendo un roedor; o el ácido nucleico: codifica una secuencia de péptido antigénico del cuadro 1; codifica una pluralidad de secuencias de péptido antigénico del cuadro 1 ; exhibe por lo menos aproximadamente 80% de identidad con un ADNc natural que codifica el segmento; es un vector de expresión; comprende además un origen de replicación; es de una fuente natural; comprende una marca detectable; comprende secuencia de nucleótido sintética; es de menos de 6 kb, preferiblemente menos de 3 kb; es de un mamífero, incluyendo un roedor; comprende una secuencia codificadora natural de longitud completa; es una sonda de hibridación para un gen que codifica la proteína 499E9; o es un iniciador de PCR, producto de PCR o iniciador de mutagénesis. Una célula o tejido que comprende dicho ácido nucleico recombinante también está abarcado dentro de la invención, por ejemplo en donde la célula es: una célula procariótica; una célula eucariótica; una célula bacteriana; una célula de levadura; una célula de insecto, una célula de mamífero; una célula de ratón, una célula de roedor; o una célula humana. Las formas del equipo incluyen las que comprenden el ácido nucleico y: un compartimiento que comprende el ácido nucleico; un compartimiento que comprende además una proteína o polipéptido 499E9; y/o instrucciones para usar o desechar los reactivos en el equipo. Otras modalidades de ácido nucleico incluyen aquellas en las cuales: hibridan bajo condiciones de lavado de: 30°C y menos de 2 M de sal, 45°C y/o 500 mM de sal, o 55°C y/o 150 mM de sal, con SEQ ID NO: 1 ; o exhibe por lo menos aproximadamente 85% de identidad sobre un tramo de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, por lo menos 90% y/o el tramo es de por lo menos 55 nucleótidos, o por lo menos 95% y/o el tramo es de por lo menos 75 nucleótidos, con una 499E9 de roedor. La invención provee además métodos de modulación de la fisiología y desarrollo de una célula o células de cultivo de tejidos, que comprenden introducir en la célula un agonista o antagonista de 499E9. Otros métodos incluyen modular la fisiología de una célula, que comprenden poner en contacto la célula con: una 499E9 o fragmento de la misma substancialmente pura; un anticuerpo o socio de unión que se une específicamente a 499E9, o un ácido nucleico que codifica una 499E9 o péptido. Preferiblemente, la célula es una célula T y la modulación de fisiología es: apoptosis de la célula T; o activación de la célula T. La invención provee además un método de tratamiento de un paciente que tiene una respuesta inmune anormal, administrando una dosis efectiva de un anticuerpo o socio de unión específica para 499E9; una proteína o polipéptido 499E9; o un ácido nucleico que codifica un péptido 499E9. La respuesta inmune anormal está caracterizada por una deficiencia inmune de células T; inflamación crónica o rechazo de tejido.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Todas las referencias citadas aquí se incorporan como referencia en la misma medida que si fuere indicada específica e individualmente cada publicación o solicitud de patente individual como incorporada como referencia.

I. Generalidades La presente invención provee secuencias de aminoácidos y secuencias de ADN que codifican varias proteínas de mamífero que son antígenos encontrados en muchos subtipos de células T, por ejemplo, Th1 , Th2, células Th1 polarizadas y células Th2 polarizadas. Entre estas proteínas están antígenos que modulan, por ejemplo, inducen o evitan la proliferación o diferenciación de células de interacción, entre otros efectos fisiológicos. Los antígenos de longitud completa y fragmentos, o antagonistas, serán útiles en la modulación fisiológica de células que expresan contrarreceptores para el antígeno. Las proteínas también serán de utilidad como antígenos por ejemplo inmunógenos, para desarrollar anticuerpos para varios epítopes sobre la proteína, epítopes tanto lineales como conformacionales. La molécula puede ser de utilidad en la definición de subclases funcionales de células T o células NK. Se aisló ADNc que codifica 499E9 de una genoteca de ADNc de células Th1 polarizadas, ver Openshaw, y otros. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367. El ADNc de 499E9 contiene un tramo de aproximadamente 2191 pb de longitud y contiene un marco de lectura abierta grande que codifica una proteína de transmembrana del tipo II. El análisis del transcrito ha identificado múltiple transcritos, siendo el más prevaleciente de 2.1 a 2.3 kb. Las características estructurales incluyen una secuencia de dominio intracelular de aproximadamente 52 aminoácidos, una región extracelular de aproximadamente 246 aminoácidos y una porción que abarca la membrana, presuntamente hidrofóbica, de aproximadamente 20 aminoácidos. Véase el cuadro 1 y SEQ. ID NO: 2. 499E9 exhibe motivos estructurales característicos de un miembro de la familia de ligandos de TNF. Compare por ejemplo con el ligando de CD40, el ligando de OX40, TNF, NGF, y FAS. El cuadro 1 ilustra las secuencias de ácidos nucleicos y la secuencia predicha de aminoácidos para 499E9 de ratón.

CUADRO 1 Secuencia de nucleótidos y secuencia predicha de aminoácidos para 499E9 de ratón La secuencia del dominio intracelular predicho corre alrededor de metí a met49; los residuos 8 y 11 son sitios potenciales de fosforilación de tirosina; una secuencia de transmembrana corre probablemente alrededor de phe50 a Ieu69; y el dominio extracelular corre probablemente alrededor de tyr70 o asp316. Ver SEQ ID NO: 1 Y 2.

GCCAGGACCT CTGTGAACCG GTCGGGGCGG GGGCCGCCTG GCCGGGAGTC TGCTCGGCGG 60 TGGGTGGCCG AGGAAGGGAG AGAACGATCG CGGAGCAGGG CGCCCGAACT CCGGGCGCCG 120 CGCC ATG CGC CGG GCC AGC CGA G?C TAC GGC AAG TAC CTG CGC AGC TCG 169 Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser 1 5 10 15 GAG GAG ATG GGC AGC GGC CCC GGC GTC CCA CAC GAG GGT CCG CTG CAC 217 Glu Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His 20 25 [30 CCC GCG CCT TCT GCA CCG GCT CCG GCG CCG CCA CCC GCC GCC TCC CGC 265 Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg 35 40 45 TCC ATG TTC CTG GCC CTC CTG GGG CTG GGA CTG GGC CAG GTG GTC TGC 313 Ser Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys 50 55 60 AGC ATC GCT CTG TTC CTG TAC TTT CGA GCG CAG ATG GAT CCT AAC AGA 361 Ser lie Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg 65 70 75 ATA TCA GAA GAC AGC ACT CAC TGC TTT TAT AGA ATC CTG AGA CTC CAT 409 lie Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg lie Leu Arg Leu His 80 -85 90 95 GAA AAC GCA GGT TTG CAG GAC TCG ACT CTG GAG AGT GAA GAC ACA CTA 457 Glu Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu 100 105 110 CCT GAC TCC TGC AGG AGG ATG AAA CAA GCC TTT CAG GGG GCC GTG CAG 505 Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln 115 120 125 AAG GAA CTG CAÁ CAC ATT GTG GGG CCA CAG CGC TTC TCA GGA GCT CCA 553 Lys Glu Leu Gln His lie Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro 130 135 140 GCT ATG ATG GAA GGC TCA TGG TTG GAT GTG GCC CAG CGA GGC AAG CCT 601 Ala Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro 145 150 155 GAG GCC CAG CCA TTT GCA CAC CTC ACC ATC A&T GCT GCC AGC ATC CCA 649 5 Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr lie Asn Ala Ala Ser lie Pro 160 165 170 175 TCG GGT TCC CAT AAA GTC ACT CTG TCC TCT TGG TAC CAC GAT CGA GGC 697 Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly 180 185 190 TGG GCC AAG ATC TCT AAC ATG ACG TTA AGC AAC GGA AAA CTA AGG GTT 745 Trp Ala Lys lie Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val -JO 195 200 205 AAC CAA GAT GGC TTC TAT TAC CTG TAC GCC AAC ATT TGC TTT CGG CAT 793 Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn lie Cys Phe Arg His 210 215 220 CAT GAA ACA TCG GGA AGC GTA CCT ACA GAC TAT CTT CAG CTG ATG GTG 841 His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val 225 230 235 5 TAT GTC GT AAA CC AGC ATC AAA ATC CCA AGT TCT CAT AAC-CTG ATG 889 Tyr Val Val Lys Thr Ser lie Lys lie Pro Ser Ser His Asn Leu Met 240 245 250 255 AAA GGA GGG AGC ACG AAA AAC TGG TCG GGC AAT TCT GAA TTC CAC TTT 937 Lys Gly Gly Ser Th'r Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe 260 265 270 TAT TCC ATA AAT GTT GGG GGA TTT TTC AAG CTC CGA GCT GGT GAA GAA 0 "985 Tyr Ser lie Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu 275 280 285 ATT AGC ATT CAG GTG TCC AAC CCT TCC CTG CTG GAT CCG GAT CAA GAT 1033 lie Ser lie Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp 290 295 300 GCG ACG TAC TTT GGG GCT TTC AAA GTT CAG GAC ATA GAC TGAGACTCAT 1082 Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp lie Asp 305 310 315 TTCGTGGAAC ATTAGCATGG ATGTCCTAGA TGTTTGGAAA CTTCTTAAAA AATGGATGAT 1142 GTCTATACAT GTGTAAGACT ACTAAGAGAC ATGGCCCACG GTGTATGAAA CTCACAGCCC 1202 TCTCTCTTGA GCCTGTACAG GTTGTGTATA TGTAAAGTCC ATAGGTGATG TTAGATTCAT 1262 GGTGATTACA CAACGGTTTT ACAATTTTGT AATGATTTCC TAAGAATTGA ACCAGATTGG 1322 GAGAGGTATT CCGATGCTTA TGAAAAACTT ACACGTGAGC TATGGAAGGG GGTCACAGTC 1382 TCTGGGTCTA ACCCCTGGAC ATGTGCCACT GAGAACCTTG AAATTAAGAA GATGCCATGT 1442 CATTGCAAAG AAATGATAGT GTGAAGGGTT AAGTTCTTTT GAATTGTTAC ATTGCGCTGG 1502 GACCTGCAAA TAAGTTCTTT TTTTCTAATG AGGAGAGAAA AATATATGTA TTTTTATATA 1562 ATGTCTAAAG TTATATTTCA GGTGTAATGT TTTCTGTGCA AAGTTTTGTA AATTATATTT 1622 GTGCTATAGT ATTTGATTCA AAATATTTAA AAATGTCTCA CTGTTGACAT ATTTAATGTT 1682 TTAAATGTAC AGATGTATTT AACTGGTGCA CTTTGTAATT CCCCTGAAGG JACTCGTAGC 1742 TAAGGGGGCA GAATACTGTT TCTGGTGACC ACATGTAGTT TATTTCTTTA TTCTTTTTAA 1802 CTTAATAGAG TCTTCAGACT TGTCAAAACT ATGCAAGCAA AATAAATAAA TAAAAATAAA 1862 ATGAATATCT TGAATAATAA GTAGGATGTT GGTCACCAGG TGCCTTTCAA ATTTAGAAGC 1922 TAATTGACTT TAGGAGCTGA CATAGCCAAA AAGGATACAT AATAGGCTAC TGAAAATCTG 1982 TCAGGAGTAT TTATGCAATT ATTGAACAGG TGTCTTTTTT TACAAGAGCT ACAAATTGTA 2042 AATTTTGTTT CTTTTTTTTC CCATAGAAAA TGTACTATAG TTTATCAGCC AAAAAACAAT 2102 CCACTTTTTA ATTTAGTGAA AGTTATTTTA TTATACTGTA CAATAAAAGC ATTGTTTCTG 2162 AATGGCATTT TTTGGTACTT AAAAATGGC 2191 Los miembros de la familia de ligando de TNF tienen un residuo de leucina conservado correspondiente al residuo 205; un residuo de glicina conservado correspondiente al residuo 211 ; un residuo de tirosina conservado correspondiente al residuo 216; un residuo de glicina conservado correspondiente al residuo 277; un residuo de leucina conservado correspondiente al residuo 282; un residuo de fenilalanina conservado correspondiente a 307; y un residuo de glicina conservado correspondiente al residuo 308. El dominio de ligando de TNF parece correr aproximadamente de 205 (leu) a 316 (asp). Los sitios de glicosilación parecen estar en 197 y 262. Esta clona exhibe estrecha homología con una TRAIL de ratón que está implicada en la inducción de apoptosis. Miembros relacionados de la familia incluyen los ligandos para CD40 y FAS, y beta-linfotoxina, factor de necfrosis tumoral etc. Por medio de análisis Southern de ADNc, es claro que 499E9 es expresada en muchas células T, incluyendo Th1 , Th2, células Th1 o Th2 polarizadas de 3 semanas, células T inmaduras, y en genotecas de ADNc de timo carente de Rag. Peudo ser detectada alguna señal débil de células dendríticas. Las células que expresan 499E9 contienen típicamente un transcrito principal de aproximadamente 2.1 a 2.3 kb, pero también contienen otros transcritos. El análisis de distribución en tejido sugiere una señal positiva en cerebro, corazón, hígado, pulmón, bazo y testículo. No se han detectado transcritos para 499E9 en fibroblastos (células L), monicitos (RAW264), células T intactas (células CD4+, MEL14+, Br), células de macrófago, pulmón Ñipo infectado/hígado/bazo, u órganos carentes de Rag (cerebro, corazón, riñon, hígado, pulmón, bazo o testículo). La homología estructural de 499E9 con la familia de ligando de TNF, sugiere la función de esta molécula. 499E9, como una molécula de superficie de células T, probablemente modula respuestas proliferativas específicas de Ag sobre células efectoras, o inducción de apoptosis en estas células. Los agonistas o antagonistas de 499E9 pueden actuar también como una molécula co-estimuladora para la regulación de la activación celular mediada por células T, y de hecho puede causar una desviación de los tipos de células T auxiliadoras, por ejemplo entre Th1 y Th2. De esta manera, 499E9 o sus antagonistas deben ser de utilidad en el tratamiento de trastornos inmunes, por ejemplo deficiencias inmunes de células T, inflamación crónica o rechazo de tejido. Las moléculas de ligando de TNF modulan típicamente la proliferación, la viabilidad y la diferenciación celulares. Por ejemplo, TNF y FAS pueden destruir células que expresan sus receptores específicos incluyendo fibroblastos, células hepáticas y linfocitos. Algunos miembros de esta clase de ligandos exhiben efectos sobre la proliferación celular de células que expresan sus receptores respectivos, por ejemplo células B que expresan CD40. Estos efectos sobre la proliferación también pueden efectuar pasos subsecuentes de diferenciación y pueden conducir de manera directa o indirecta a cambios en los perfiles de la expresión de citocina. Los miembros de la familia de ligando de TNF exhiben también efectos de coestimulación, que pueden regular también diferenciación celular o apoptosis. Las células que expresan receptor pueden ser protegidas de la muerte celular inducida por activación (AICD) o apoptosis. Por ejemplo, el ligando de CD40 puede tener efectos sobre los linfocitos T y B. La modalidad caracterizada aquí es de ratón pero existirán otras variantes de primates, por ejemplo, de humano. También estarán disponibles secuencias adicionales para proteínas en otras especies de mamífero, por ejemplo primates y roedores. Véase más adelante. Las descripciones siguientes están dirigidas, para propósitos ejemplares, a 499E9 de ratón, pero son igualmente aplicables a modalidades relacionadas de otras especies. La proteína 499E9 de ratón es una proteína que exhibe rasgos estructurales característicos de un antígeno de superficie celular, por ejemplo un miembro de la familia de ligando de TNF. La proteína es detectada fácilmente sobre tipos celulares particulares, otras expresan cantidades menores. El antígeno de 499E9 debe estar presente en los tipos de tejido identificados y la interacción del antígeno con su socio de unión debe ser importante para mediar varios aspectos de fisiología o desarrollo celular, tal como se describe.

II. 499E9 Purificada La secuencia de aminoácidos de 499E9 de ratón se muestra en SEQ ID NO: 2. Estas secuencias de aminoácidos, provistas de amino a carboxilo, son importantes en la provisión de información de secuencia en el antígeno, permitiendo la distinción de la proteína de otras proteínas y ejemplificando numerosas variantes. Además, las secuencias peptídicas permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos para reconocer dichos segmentos, y las secuencias de nucleótidos permiten la preparación de sondas de oligonucleótido, las dos son estrategias para detección o aislamiento, por ejemplo, clonación de genes o ADNc's que codifican dichas secuencias. Como se usa aquí, el término "499E9 de ratón" debe abarcar cuando se usa en un contexto de proteína, una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, o un fragmento significativo de dicha proteína, u otra proteína altamente homologa derivada de ratón. Estos componentes de unión, por ejemplo anticuerpos, se unen típicamente a 499E9 con alta afinidad, por ejemplo por lo menos aproximadamente 100 nM, usualmente mejor aproximadamente 30 nM, preferiblemente mejor aproximadamente 10 nM, y muy preferiblemente mejor aproximadamente 3 nM. Se encontrarían proteínas homologas en especies de mamífero diferentes de ratón, por ejemplo primates o roedores. Las especies que no son de mamífero también deben poseer genes y proteínas relacionados estructuralmente o funcionalmente, por ejemplo aves o anfibios. El término "polipéptido" como se usa aquí incluye un fragmento o segmento significativo, y abarca un tramo de residuos de aminoácido de por lo menos aproximadamente 8 aminoácidos, por lo general por lo menos aproximadamente 12 aminoácidos, típicamente por lo menos aproximadamente 16 aminoácidos, de preferencia por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos y en modalidades particularmente preferidas, por lo menos aproximadamente 30 aminoácidos o más. El término "composición de unión" se refiere a moléculas que se unen con especificidad a 499E9, por ejemplo en una forma de tipo de apareamiento de adhesión de célula o una interacción antígeno-anticuerpo. También incluye compuestos, por ejemplo proteínas, que se asocian específicamente con 499E9, incluyendo la interacción natural proteína-proteína fisiológicamente relevante, ya sea covalente o no covalente. La molécula puede ser un polímero o reactivo químico. Un análogo funcional puede ser un antígeno con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula que tiene una forma molecular que interacciona con los determinantes de unión apropiados. Los compuestos pueden servir como agonistas o antagonistas de la interacción de unión, véase por ejemplo Goodman, y otros (eds.) (1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8o ed.), Pergamon Press. Substancialmente puro significa típicamente que la proteína está libre de otras proteínas, ácidos nucleicos u otros materiales biológicos contaminantes derivados del organismo fuente original. La pureza puede ser determinada por métodos estándar típicamente en peso, y ordinariamente será de aproximadamente 40%, por lo general por lo menos aproximadamente 50% de pureza, frecuentemente por lo menos aproximadamente 60% de pureza, típicamente por lo menos aproximadamente 80% de pureza, de preferencia por lo menos aproximadamente 90% de pureza, y en modalidades muy preferidas la pureza será de por lo menos aproximadamente 95%. Frecuentemente serán agregados vehículos o excipientes. La solubilidad de un polipéptido o fragmento depende del medio y del polipéptido. Muchos parámetros afectan la solubilidad del polipéptido incluyendo la temperatura, medio electrolítico, características moleculares y de tamaño del polipéptido y naturaleza del solvente. Típicamente, la temperatura a la cual se usa el polipéptido varía de aproximadamente 4°C a aproximadamente 65°C. Usualmente, la temperatura en uso es mayor de aproximadamente 18°C. Para propósitos de diagnóstico, por lo común la temperatura será aproximadamente la temperatura ambiente o más alta, pero menos que la temperatura de desnaturalización de los componentes en la prueba. Para propósitos terapéuticos, la temperatura será usualmente la temperatura corporal, típicamente alrededor de 37°C para humanos y ratones, aunque bajo ciertas situaciones puede elevarse o reducirse la temperatura in situ o in vitro. El tamaño y estructura del polipéptido deberá ser por lo general de un estado substancialmente estable y usualmente no en un estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo para conferir solubilidad, o asociado con lípidos o detergentes de manera que se aproxime a las interacciones de bicapa lipídica natural. El solvente y los electrolitos usualmente serán un amortiguador biológicamente compatible de un tipo usado para la conservación de actividades biológicas y usualmente será cercano a un solvente acuoso fisiológico. Por lo común, el solvente tendrá un pH neutro, típicamente entre alrededor de 5 y 10, y de preferencia alrededor de 7.5. En algunas ocasiones, serán agregados uno o más detergentes, típicamente uno suave no desnaturalizante, por ejemplo CHS (colesterilhemisuccinato) o CHAPS (3-[3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano-sulfonato), o una concentración suficientemente baja para evitar la interrupción significativa de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína.

III. Variantes físicas Esta invención también abarca proteínas o péptidos que tienen identidad substancial de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de 499E9. Las variantes incluyen variantes de especies, polimórficas o alélicas. La homología de secuencia de aminoácidos o identidad de secuencias es determinada optimizando apareamientos de residuos, si es necesario, introduciendo espacios conforme se requiera. Véase también Needleham, y otros, (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, y otros, (1983) Capítulo uno en Time Warps, Strinq Edits. and Macromolecules: The Theorv and Practice of Sequence Comparison. Addison-Wesley, Reading, Mssachusets E.U.A.; y empaques de software de IntelliGenetics, Mountain View, California E.U.A.; y the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, Wisconisn E.U.A.. La identidad de secuencia cambia al considerar substituciones conservativas como apareamientos. Las substituciones conservativas incluyen típicamente substituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Las secuencias de aminoácidos homologas típicamente incluyen variaciones polimórficas o alélicas y entre especies en cada secuencia de proteína respectiva. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán de 25 a 100% de identidad (si pueden introducirse espacios), hasta 50-100% de identidad (si se incluyen substituciones conservativas) con la secuencia de aminoácidos de 499E9. Las medidas de identidad serán por lo menos aproximadamente 35%, por lo general por lo menos aproximadamente 40%, frecuentemente por lo menos aproximadamente 50%, típicamente por lo menos alrededor de 60%, usualmente por lo menos alrededor de 70%, de preferencia por lo menos aproximadamente 80%, y es preferible por lo menos aproximadamente 90%. El ADN aislado de 499E9 puede ser modificado fácilmente mediante substituciones de nucleótido, supresiones de nucleótido, inserciones de nucleótido e inversiones de extensiones de nucleótido. Estas modificaciones dan como resultado secuencias de ADN novedosas que codifican estos antígenos, sus derivados o proteínas que tienen actividad fisiológica, ¡nmunogénica, antigénica u otra actividad funcional similar. Estas secuencias modificadas se pueden usar para producir antígenos mutantes o para incrementar la expresión. La expresión incrementada puede incluir amplificación de genes, transcripción incrementada, traducción incrementada y otros mecanismos. "Mutante 499E9" abarca un polipéptido que de otra manera entra dentro de la definición de identidad de secuencia de la 499E9 como se señaló arriba, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de 499E9 como se encuentra normalmente en la naturaleza, ya sea por medio de supresión, substitución o inserción. Esto incluye por lo general proteínas que tienen identidad significativa con una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, y que comparten varias actividades biológicas, por ejemplo antigénicas o inmunogénicas, con estas secuencias, y en modalidades preferidas contienen la mayor parte de las secuencias descritas de longitud completa. Las secuencias de longitud completa serán preferidas típicamente, aunque también serán de utilidad versiones truncadas, por ejemplo construcciones solubles o dominios intactos, así mismo son más convenientes típicamente genes o proteínas encontrados de fuentes naturales. Conceptos similares se aplican a diferentes proteínas 499E9, particularmente las encontradas en varios animales de sangre caliente, por ejemplo mamíferos y aves. Estas descripciones generalmente significan que abarcan todas las proteínas 499E9, sin limitarse a las modalidades particulares de ratón discutidas específicamente.

La mutagénesis de 499E9 también se puede realizar haciendo inserciones o supresiones de aminoácidos. Pueden hacerse substituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación para llegar a una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones amino- o carboxi- terminales. Se puede realizar mutagénesis al azar en un codón objetivo y los mutantes expresados pueden seleccionarse entonces en cuanto a la actividad deseada. Los métodos para hacer mutaciones de substitución en sitios predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida, son bien conocidos en la técnica, por ejemplo por medio de mutagénesis de iniciador M13 o técnicas de reacción de cadena de polimerasa (PCR). Véase por ejemplo Sambrook, y otros, (1989); Ausubel, y otros, (1987 y Suplementos); y Kunkel, y otros, (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382. La presente invención también provee proteínas recombinantes, por ejemplo proteínas de fusión heteróloga, usando segmentos de estas proteínas. Una fusión heteróloga de proteína es una fusión de proteínas o segmentos que naturalmente no se fusiona de manera normal de la misma forma. Un concepto similar se aplica a las secuencias de ácido nucleico heterólogas. Las proteínas de fusión serán de utilidad como fuentes para escindir, separar y purificar porciones de la misma. Además, pueden hacerse nuevas construcciones combinando dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, segmentos de unión a objetivo u otros segmentos pueden "permutarse" entre diferentes polipéptidos o fragmentos de fusión nuevos. Véase por ejemplo Cunningham, y otros, (1989) Science 243:1330-1336: y O'Dowd, y otros, (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992. El método de fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintético adecuados. Se obtendrá frecuentemente un fragmento de doble cadena ya sea sintetizando la cadena complementaria y fijando la cadena junta bajo condiciones apropiadas, o agregando la cadena complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia de iniciador apropiada, por ejemplo técnicas de PCR.

IV. Variantes funcionales El bloqueo de la respuesta fisiológica a 499E9 puede originarse de la inhibición de la unión del antígeno a su socio de unión, por ejemplo otra de ellas o ella misma, probablemente a través de inhibición competitiva. De esta manera, en pruebas in vitro de la presente invención, frecuentemente se usará la proteína aislada, membranas de células que expresan una 499E9 recombinante asociada a membrana, fragmentos solubles que comprenden segmentos de unión a antígeno de estas proteínas, o fragmentos unidos a substratos de fase sólida. Estas pruebas también permitirán la determinación diagnóstica de los efectos de cualquier mutación y modificación de segmento de unión, o mutaciones y modificaciones de antígeno, por ejemplo análogos de 499E9. Esta invención también contempla el uso de pruebas de selección competitiva de fármacos, por ejemplo, en donde anticuerpos neutralizantes a antígeno o fragmentos de unión compiten con un compuesto de prueba para unirse a la proteína, por ejemplo de secuencia de proteína natural. "Derivados" de antígenos de 499E9 incluyen mutantes de secuencia de aminoácidos a partir de formas de ocurrencia natural, variantes de glicosilación y conjugados covalentes o agregados con otras porciones químicas. Se pueden preparar derivados covalentes mediante enlace de funcionalidades a grupos que se encuentran en cadenas laterales de aminoácidos de 499E9 o en los extremos N o C, por ejemplo por medios estándar. Véase por ejemplo Lundblad y Noyes (1988) Chemical Reaqents for Protein Modification, vols. 1-2, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL; Hugli (ed.) (1989) Techniques in Protein Chemistrv, Academic Press, San Diego, California E.U.A.; y Wong (1991) Chemistry of Protein Coniugation and Cross Linking, CRC Press, Boca Ratón, Florida E.U.A. En particular, están incluidas alteraciones de glicosilación, por ejemplo hechas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en pasos de procesamiento adicionales. Véase por ejemplo Elbein (1987) Ann. Rev. Biochem. 56:497-534. También se incluyen versiones de los péptidos con la misma secuencia primaria de aminoácidos que tienen otras modificaciones menores que incluyen residuos de aminoácido fosforilado, por ejemplo fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina. También se proveen polipéptidos de fusión entre 499E9 y otras proteínas homologas o heterólogas. Muchos receptores de citocina u otras proteínas de superficie son multiméricas, por ejemplo entidades homodiméricas y una construcción de repetición puede tener varias ventajas, incluyendo susceptibilidad reducida a la escisión proteolíta. Los ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido reportero, por ejemplo luciferasa, con un segmento o dominio de una proteína, por ejemplo un segmento de unión a receptor, de tal manera que pueda ser determinada fácilmente la presencia o localización del ligando fusionado. Véase por ejemplo a Dull y otros patente de los Estados Unidos. No 4,859,609. Otros socios de fusión de genes incluyen beta-galactosidasa bacteriana, trpE, proteína A, beta-lactamasa, alfa-amilasa, alcohol deshidrogenasa, factor alfa de igualación de levadura, y marcas de detección o purificación tales como una secuencia FLAG de secuencia His6. Véase por ejemplo Godowski, y otros (1988) Science 241 :812-816. Los péptidos de fusión típicamente serán hechos por cualquier método de ácido nucleico recombinante o por métodos de polipéptido sintético. Las técnicas para manipulación y expresión de ácido nucleico se describen en general por ejemplo en Sambrook, y otros (1989) Molecular Cloninq: A Laboratory Manual (2d ed.), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; y Ausubel, y otros (eds) (1993) Current Protocols in Molecular Baiologv, Greene y Wiley, New York E.U.A. Las técnicas para la síntesis de polipéptidos se describen por ejemplo En Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; Atherton, y otros (1989) Solid Phase Peptide Svnthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; y Gran (1992) Svnthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman, New York.

Esta invención también contempla el uso de otros derivados de 499E9, aparte de las variaciones en la secuencia o glicosilación de aminoácidos. Dichos derivados pueden incluir asociación covalente o agregativa con porciones químicas. Los derivados covalentes o agregativos serán útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos o en métodos de purificación tales como purificación por afinidad de socios de unión, por ejemplo otros antígenos. Una 499E9 puede ser inmovilizada por unión covalente a un soporte sólido tal como SEPHAROSE activada por bromuro de cianógeno, por métodos que son bien conocidos en la técnica, o puede absorberse sobre superficies de poliolefina, con o sin entrelazamiento de glutaraldehído, para usar en la prueba o purificación de anticuerpos contra 499E9 o una composición de unión alternativa. Las 499E9 también se pueden marcar con un grupo detectable, por ejemplo para usar en pruebas de diagnóstico. La purificación de 499E9 puede ser realizada por medio de un anticuerpo inmovilizado o socio de unión complementario. Una 499E9 o fragmento solubilizado de esta invención puede usarse como un inmunógeno para la producción de antisuero o anticuerpos específicos para unirse al antígeno o fragmentos del mismo. El antígeno purificado puede ser usado para seleccionar anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno, abarcando fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos naturales, vgr., Fab, Fab1, F(ab)2, etc. La 499E9 purificada también se pueden usar como un reactivo para detectar anticuerpos generados en respuesta a la presencia de niveles elevados del antígeno o fragmentos celulares que contienen el antígeno, ambos de los cuales pueden ser diagnóstico de una condición anormal o condición patológica o fisiológica específica. Esta invención contempla anticuerpos desarrollados contra secuencias de aminoácidos codificadas por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 , o fragmentos de proteínas que lo contienen. En particular, esta invención contempla anticuerpos que tienen afinidad de unión para, o que son desarrollados contra, fragmentos específicos que se predice que están fuera de la bicapa lipídica, tanto extracelular como intracelular. La presente invención contempla el aislamiento de variantes de especies adicionales muy relacionadas. El análisis Southern y Northern blot debe establecer qué entidades genéticas similares existen entre otros mamíferos. Es probable que 499E9 esté extendida ampliamente en variantes de especies, por ejemplo roedores, Lagomorpha, carnívoros, artiodáctilos, perisodáctilos y primates. La invención también provee medios para aislar un grupo de antígenos relacionados que exhiben tanto distinción como similitud en estructura, expresión y función. La elucidación de muchos de los efectos fisiológicos de las moléculas será desarrollada en gran medida mediante el aislamiento y caracterización de variantes de especies distintas adicionales de los mismos. En particular, la presente invención provee sondas útiles para identificar entidades genéticas homologas adicionales en diferentes especies. Los genes aislados permitirán la transformación de células que carecen de expresión de una 499E9 correspondiente, por ejemplo cualquier tipo de especie o célula que carezca de antígenos correspondientes y exhiba actividad basal negativa. Esto debe permitir el análisis de la función de 499E9 en comparación con células de control no transformadas. Es posible la disección de elementos estructurales críticos que afectan las varias funciones de activación o diferenciación mediadas a través de estos antígenos utilizando técnicas estándar de biología molecular moderna, particularmente en la comparación de miembros de clases relacionadas. Véase por ejemplo la técnica de mutagénesis de barrido de homología descrita en Cunningham, y otros (1989) Science 243:1339-1336; y los enfoques usados en O'Dowd, y otros (1988) J. Biol. Chem. 263:15985; y Lechleites, y otros (1990) EMBO J. 9:4381-4390. Las funciones intracelulares implicarían probablemente segmentos del antígeno que normalmente son accesibles al citosol. Sin embargo, puede ocurrir intemalización de proteína bajo ciertas circunstancias, y pueden ocurrir interacciones entre componentes intracelulares y segmentos "extracelulares". Los segmentos específicos de la interacción de 499E9 con otros componentes intracelulares, pueden ser identificados por mutagénesis o medios bioquímicos directos, por ejemplo métodos de entrelazamiento o afinidad. También será aplicable el análisis estructural por métodos cristalográficos u otros métodos físicos. La investigación adicional del mecanismo de la traducción de señal incluirá el estudio de componentes asociados que pueden ser aislables por métodos de afinidad o por medios genéticos, por ejemplo análisis de complemento de mutantes.

Se continuará el estudio adicional de la expresión y control de 499E9. Los elementos de control asociados con los antígenos deben exhibir patrones fisiológicos diferenciales, de desarrollo, específicos de tejido u otros patrones de expresión. Son de interés las regiones genéticas hacia el extremo 3' o hacia el extremo 5', por ejemplo elementos de control. En particular, se han encontrado variantes fisiológicas o de desarrollo, por ejemplo múltiples formas procesadas alternativamente del antígeno. Véase por ejemplo SEQ ID NO:1. De esta manera, la edición diferencial del mensaje puede conducir a una clasificación de formas unidas a membrana, formas solubles y versiones modificadas de antígeno. Estudios estructurales de los antígenos conducirán al diseño de antígenos nuevos, particularmente análogos que exhiben propiedades agonistas o antagonistas en la molécula. Esto se puede combinar con los métodos de selección previamente descritos para aislar antígenos que exhiben el espectro de actividades deseado.

V. Anticuerpos Se pueden desarrollar anticuerpos para varias 499E9, incluyendo variantes de especies, polimórficas o alélicas, y fragmentos de las mismas, tanto en sus formas de ocurrencia natural como en sus formas recombinantes. Adicionalmente, se pueden desarrollar anticuerpos para 499E9 en cualquier forma activa o en sus formas inactivas, incluyendo versiones naturales o desnaturalizadas. También se contemplan anticuerpos anti-ideotípicos.

Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión y versiones de una sola cadena, contra fragmentos predeterminados de los antígenos, se pueden desarrollar por inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas inmunogénicas. Se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se pueden seleccionar para unión a 499E9 normal o defectuosa, o seleccionarse para actividad agonista o antagonista, por ejemplo mediada a través del antígeno o su socio de unión. Los anticuerpos pueden ser agonistas o antagonistas, por ejemplo bloqueando estéricamente la unión del ligando. Estos anticuerpos monoclonales usualmente se unirán por lo menos con una KD de aproximadamente 1 mM, usualmente por lo menos aproximadamente 300 µM, típicamente por lo menos aproximadamente 100 µM, más típicamente por lo menos aproximadamente 30 µM de preferencia aproximadamente 10 µM, y es muy preferido por lo menos aproximadamente 3 µM o mejor. Los anticuerpos de esta invención también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, pueden seleccionarse por su capacidad de unirse a los antígenos sin inhibir la unión por medio de un socio. Como anticuerpos neutralizantes, pueden ser útiles en pruebas de unión competitiva. También serán de utilidad en la detección o cuantificación de proteína 499E9 o sus socios de unión. Véase por ejemplo Chan (ed.) (1987) Immunology: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, Florida, E.U.A.; Price y Newman (eds.) (1991) Principies and Practice of Immunoassav, Stockton Press, New York E.U.A.; y Ngo (ed.) (1988) Noisotopic Immunoassay, Plenum Press, New York. Absorciones cruzadas u otras pruebas identificarán los anticuerpos que exhiben varios espectros de especificidades, por ejemplo especificidades únicas o compartidas de especie. Además, los anticuerpos, que incluyen fragmentos de unión de antígeno de esta invención pueden ser potentes antagonistas que se unen al antígeno e inhiben la unión funcional o inhiben la capacidad de un socio de unión para provocar una respuesta biológica. También pueden ser de utilidad como anticuerpos no neutralizantes y pueden acoplarse a toxinas o radionúclidos de tal manera que cuando el cuerpo se une al antígeno, es destruida una célula que lo expresa, por ejemplo sobre su superficie. Además estos anticuerpos se pueden conjugar con fármacos u otros agentes terapéuticos ya sea de manera directa o indirecta por medio de un enlazador, y pueden efectuar dirección del fármaco. Los fragmentos del antígeno pueden unirse a otros materiales, particularmente polipéptidos, como polipéptidos fusionados o unidos covalentemente para usar como ¡nmunógenos. Un antígeno y sus fragmentos se pueden fusionar o unir covalentemente a una variedad de ¡nmunógenos, tales como hemocianina de lapa, seroalbúmina de bovino, toxoide del tétanos, etc. Véase Microbiology, Hoeber Medical División, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions. Dover Publications, New York; Williams, y otros (1967) Methods in Immunology and Immunochemistrv. vol. 1 , Academic Press, New York; y Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, New York E.U.A. para descripciones de métodos de preparación de antisuero policlonal.

En algunos casos es conveniente preparar anticuerpos monoclonales a partir de varios hospederos mamíferos tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc. Puede encontrarse una descripción de las técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales por ejemplo en Stites, y otros (eds.) Basic and Clinical Immunoloqy (4o y otros, Lange Medical Publications, Los Altos, California E.U.A., y referencias ahí citadas; Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual. CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2d ed.), Academic Press, New York, E.U.A.; y particularmente en Kohler y Milstein (1975) en Nature 256:495-497, que discute un método de generación de anticuerpos monoclonales. Otras técnicas adecuadas incluyen la exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos o alternativamente a la selección de colecciones de anticuerpos en fago o vectores similares. Véase, Huse, y otros, (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246:1275-1281 ; y Ward, y otros, (1989) Nature 341 :544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos serán marcados por unión, ya sea de manera covalente o no covalente, a una substancia que provee una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación y se reportan extensamente en la literatura tanto científica como de patentes. Las marcas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de dichas marcas incluyen las patentes de E.U.A. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 y 4,366,241. También se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes, véase Cabilly, patente de EU.A. No. 4,816,567; Moore y otros, patente de E.U.A. No. 4,642,334; y Queen, y otros, (1989) Proc. Nat'1 Acad. Sci. E.U.A. 86:10029-10033. Los anticuerpos de esta invención también se pueden usar para cromatografía de afinidad en el aislamiento de la proteína. Se pueden preparar columnas en las cuales los anticuerpos se unen a un soporte sólido. Véase por ejemplo Wilchek y otros, (1984) Meth. Enzymol. 104:3-55. Los anticuerpos desarrollados contra cada 499E9 también serán de utilidad para desarrollar anticuerpos anti-idiotípicos. Estos serán de utilidad en la detección o diagnóstico de varias condiciones ¡nmunológicas relacionadas con la expresión de los antígenos respectivos.

VI. Ácidos nucleicos Las secuencias peptídicas descritas y los reactivos relacionados son de utilidad en la detección, aislamiento o identificación de una clona de ADN que codifica 499E9, por ejemplo de una fuente natural. Típicamente será de utilidad en el aislamiento de un gen de mamífero, y procedimientos similares se aplicarán para aislar genes de otras especies, por ejemplo animales de sangre caliente tales como aves y mamíferos. La hibridación cruzada permitirá el aislamiento de 499E9 de otras especies. Estarían disponibles varios enfoques diferentes para aislar exitosamente una clona adecuada de ácido nucleico. La proteína purificada o los péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos por medio de los métodos estándar, como se describió arriba. Los péptidos sintéticos o la proteína purificada pueden presentarse a un sistema inmune para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase por ejemplo Cligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; y Harlow y Lañe (1989) Antibodies: A Laboratorv Manual Cold Spring Harbor Press. Alternativamente, la 499E9 puede usarse como un reactivo de unión específico, y puede tomarse ventaja de su especificidad de unión, mucho como se usaría un anticuerpo. Por ejemplo, la composición de unión específica podría usarse para seleccionar una genoteca de expresión hecha de una línea celular que exprese una 499E9. La selección puede ser tinción estándar del antígeno expresado en superficie o por separación. La selección de expresión intracelular puede realizarse también por medio de varios procedimientos de tinción o de inmunofluorescencia. Las composiciones de unión podrían usarse para purificar por afinidad o clasificar células que expresan la proteína. También se pueden usar segmentos de péptido para predecir los oligonucieótidos apropiados a seleccionar de una genoteca. El código genético se puede usar para seleccionar oligonucleótidos apropiados útiles como sondas para selección. Ver v.gr., SEQ ID NO:1. En combinación con técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR), los oligonucleótidos sintéticos serán de utilidad en la selección de clonas correctas de una genoteca. Secuencias complementarias también se usarán como sondas, iniciadores o cadenas de antisentido. En base a la identificación del probable dominio extracelular, varios fragmentos serían particularmente útiles, por ejemplo junto con técnicas de vector anclado o PCR de poli-A complementario o con ADN complementario de otros péptidos. Esta invención contempla el uso de ADN aislado o fragmentos para codificar un polipéptido 499E9 correspondiente biológicamente activo. Además, esta invención cubre ADN aislado o recombinante que codifica una proteína biológicamente activa o polipéptido que es capaz de hibridarse bajo las condiciones apropiadas con las secuencias de ADN aquí descritas. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo puede ser un antígeno intacto o fragmento, y tiene una secuencia de aminoácidos que se describe por ejemplo SEQ ID NO: 1. Además, esta invención cubre el uso de ADN aislado o recombinante, o fragmentos del mismo, que codifican proteínas que son homologas a 499E9, o que fue aislado usando ADNc que codifica una 499E9 como una sonda. El ADN aislado puede tener las secuencias reguladoras respectivas en los extremos 5' y 3', v.gr., promotores, mejoradores, señales de adición poly-A y otros. El ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, v.gr., un ARN, ADN o un polímero mezclado, que es separado substancialmente de otros componentes que acompañan naturalmente una secuencia nativa, por ejemplo, ribosomas, polimerasas y/o secuencias genómicas de flanqueo de las especies originadoras. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que ha sido removida de su ambiente natural, e incluye aislados de ADN recombinantes o clonados y análogos químicamente sintetizados o análogos biológicamente sintetizados por sistemas heterólogos. Una molécula substancialmente pura incluye formas aisladas de la molécula. En general, el ácido nucleico estará en un vector o fragmento de menos de aproximadamente 50 kb, normalmente menos de aproximadamente 30 kb, típicamente menos de aproximadamente 10 kb y preferiblemente menos de aproximadamente 6 kb. Un ácido nucleico aislado será generalmente una composición homogénea de moléculas, pero, en algunas modalidades contendrá una heterogeneidad menor. Esta heterogeneidad se encuentra típicamente en los extremos del polímero o porciones no críticas para una función o actividad biológica deseada. Un ácido nucleico "recombinante" es definido ya sea por su método de producción o por su estructura. En referencia a su método de producción, por ejemplo, un producto hecho mediante un procedimiento, el procedimiento hace uso de técnicas de ácido nucleico recombinante, por ejemplo, incluyendo la intervención humana en la secuencia de nucleótidos, típicamente investigación o producción. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico hecho generando una secuencia que comprenda la fusión de dos fragmentos que no sean naturalmente contiguos uno al otro, pero se intenta excluir productos de naturaleza, por ejemplo, mutantes que ocurran naturalmente. De esta manera, por ejemplo, se abarcan los productos hechos transformando células con cualquier vector que no ocurra naturalmente, como son los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia derivada usando cualquier procedimiento de oligonucleótidos sintético. Esto se hace comúnmente para reemplazar un codón con un codón redundante que codifique para el mismo o un aminoácido conservador, introduciendo o removiendo típicamente al mismo tiempo un sitio de reconocimiento de secuencia. Alternativamente, esto se lleva a cabo para unir segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas para generar una sola entidad genética que comprenda una combinación deseada de funciones no encontradas en las formas naturales disponibles comúnmente. Los sitios de reconocimiento de enzima de restricción son comúnmente el objetivo de dichas manipulaciones artificiales, pero otros objetivos específicos de sitio, por ejemplo, promotores, sitios de replicación de ADN, secuencias de regulación, secuencias de control u otras características útiles pueden incorporarse por designio. Un concepto similar está diseñado para un polipéptido recombinante por ejemplo, de fusión. Se incluyen específicamente los ácidos nucleicos sintéticos que, mediante redundancia de código genético, codifican para polipéptidos similares a fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias de varias variantes de especies diferentes. Un "fragmento" significativo en un contexto de ácido nucleico es un segmento contiguo de por lo menos aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente por lo menos aproximadamente 22 nucleótidos, normalmente por lo menos alrededor de 29 nucleótidos, muy comúnmente por lo menos aproximadamente 35 nucleótidos, típicamente por lo menos alrededor de 41 nucleótidos, normalmente por lo menos aproximadamente 47 nucleótidos, preferiblemente por lo menos aproximadamente 55 nucleótidos y en modalidades particularmente preferidas será de por lo menos aproximadamente 60 o más nucleótidos. Un ADN que codifique para una proteína 499E9 será particularmente útil para identificar genes, ARNm y especies de ADNc que codifiquen para proteínas relacionadas u homologas, así como ADNs que codifiquen para proteínas homologas de especies diferentes. Hay homólogos posibles en otras especies, incluyendo primates, roedores y aves. Varias proteínas 499E9 deben de ser homologas y son abarcadas en la presente. Sin embargo, incluso los genes que codifican para proteínas que tienen una relación evolutiva más distante al antígeno pueden aislarse fácilmente bajo condiciones adecuadas usando estas secuencias si son lo suficientemente homólogos. Las proteínas 499E9 de primate son de particular interés. Las clonas recombinantes derivadas de las secuencias genómicas, por ejemplo, que contienen intrones, serán útiles para estudios transgénicos, incluyendo, por ejemplo, células y organismos transgénicos, y para terapia de genes. Véase, por ejemplo Goodnow (1992) "Transgenic Animals"en Roitt (ed.) Encvclopedia of Immunoloqv, Academic Press, San Diego, pp. 1502-1504; Travis (1992) Science 256:1392-1394; Kuhn y otros (1991) Science 254:707-710; Capecchi (1989) Science 244:1288; Robertson (1987) (ed.) Teratocarcinomas v Embrvoníc Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; y Rosenbreg (1992) J. Clinical Oncoloqy 10:180-199. La homología substancial en el contexto de comparación de la secuencia de ácido nucleico significa que ya sea los segmentos o sus cadenas complementarias, cuando se comparan, son idénticos cuando están alineados óptimamente, con inserciones o deleciones de nucleótidos adecuadas, en por lo menos aproximadamente 50% de los nucleótidos, generalmente por lo menos aproximadamente 58%, normalmente por lo menos alrededor de 65%, comúnmente por lo menos alrededor de 71 %, típicamente por lo menos aproximadamente 77%, normalmente por lo menos alrededor de 85%, preferiblemente por lo menos alrededor de 95 a 98% o más, y en modalidades particulares, tanto como aproximadamente 99% o más de los nucleótidos. Alternativamente, existe homología substancial cuando los segmentos se hibridarán bajo condiciones de hibridación selectiva, a una cadena, o su complemento, usando típicamente una secuencia de 499E9, por ejemplo, en SEQ ID NO: 1. Típicamente, la hibridación selectiva ocurrirá cuando haya por lo menos aproximadamente 55% de homología sobre un tramo de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferiblemente por lo menos alrededor de 75% sobre un tramo de aproximadamente 25 nucleótidos y más preferiblemente por io menos alrededor de 90% sobre aproximadamente 20 nucleótidos. Véase, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213. La longitud de la comparación de homología, según se describe, puede ser sobre tramos más largos, y en ciertas modalidades será sobre un tramo de por lo menos aproximadamente 17 nucleótidos, normalmente por lo menos alrededor de 28 nucleótidos, típicamente por lo menos alrededor de 40 nucleótidos y preferiblemente por lo menos alrededor de 75 a 100 o más nucleótidos. Las condiciones rigurosas, en referencia a la homología en el contexto de hibridación, serán condiciones combinadas rigurosas de sal, temperatura, solventes orgánicos y otros parámetros, típicamente aquellos controlados en reacciones de hibridación. Las condiciones de temperatura rigurosas normalmente incluirán temperaturas de más de aproximadamente 30°C, normalmente de más de alrededor de 37°C, típicamente más de aproximadamente 55°C, preferiblemente más de aproximadamente 70°C. Las condiciones de sal rigurosas normalmente serán de menos de aproximadamente 1000 mM, normalmente menos de aproximadamente 400 mM, típicamente menos de alrededor de 250 mM, preferiblemente menos de aproximadamente 150 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medición de cualquier parámetro individual. Véase, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370. 499E9 de otras especies de mamíferos puede ser clonado y aislado mediante hibridación de especie cruzada de especies estrechamente relacionadas. La homología puede ser relativamente baja entre especies distantemente relacionadas, y por lo tanto es aconsejable la hibridación de especies relacionadas en forma relativamente estrecha. Alternativamente, la elaboración de una preparación de anticuerpos que exhiba menos especificidad de especie puede ser útil en enfoques de clonación de expresión.

VIL Fabricación de 499E9; miméticos El ADN que codifica para 499E9 o fragmentos del mismo puede obtenerse mediante síntesis química, investigando genotecas de ADNc, o investigando genotecas genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas de células o muestras de tejido. Véase, por ejemplo, Okayama y Berg (1982) Mol. Cell. Biol. 2:161-170; Gubler y Hoffman (1983) Gene 25:263-269; y Glover (ed.) (1984) DNA Cloninq: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. Como alternativa, las secuencias provistas en la presente proveen iniciadores de PCR útiles o permiten la preparación sintética o de otro tipo de genes adecuados que codifiquen para 499E9; incluyendo las modalidades que ocurren naturalmente. Este ADN puede ser expresado en una amplia variedad de células hospederas para la síntesis de un 499E9 de longitud completa o fragmentos que puedan a su vez, v.gr., usarse para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para la construcción y expresión de moléculas modificadas y para estudios de estructura/función. Los vectores, según se usan aquí, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables y otros vehículos que hagan posible la integración de fragmentos de ADN en el genoma del hospedero. Véase, por ejemplo, Pouwels y otros (1985 y complementos) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y. y Rodríguez y otros (1988) (eds.) Vectors: A Survery of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA. Para los propósitos de esta invención, las secuencias de ADN están enlazadas operablemente cuando se relacionan funcionalmente entre sí.

Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está enlazado operablemente a un polipéptido si éste es expresado como una preproteína o participa en la dirección del polipéptido a la membrana de la célula o en la secreción del polipéptido. Un promotor está enlazado operablemente a una secuencia de codificación si éste controla la transcripción del polipéptido; un sitio de unión de ribosoma está enlazado operablemente a una secuencia de codificación si está colocado para permitir la traducción. Normalmente, enlazado operablemente significa contiguo y en marco de lectura, sin embargo, ciertos elementos genéticos tales como genes represores no están enlazados contiguamente pero sí se unen a secuencias operadoras que a su vez controlan la expresión. Véase, por ejemplo, Rodríguez y otros, Capítulo 10, pp. 205-236; Balbas y Bolívar (1990) Methods in Enzymology 185:14-37 y Ausubel y otros (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, NY. Ejemplos representativos de vectores de expresión adecuados incluyen pCDNAl ; pCD, véase Okayama y otros. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMCIneo Poly-A, véase Thomas y otros (1987) Cell 51 :503 y un vector de baculovirus tal como pAC 373 o pAC 610. Véase, v.gr., Miller (1988) Ann. Rev. Microbio!. 42:177-199. Comúnmente se deseará expresar un polipéptido 499E9 en un sistema que provea un patrón de glucosilación específico o definido. Véase, por ejemplo, Luckow y Summers (1988) Bio/Technology 6:47-55 y Kaufman (1990) Meth. Enzvmol. 185:487-511.

El 499E9, o un fragmento del mismo, puede ser manipulado para ser fosfatidil inositol (Pl) enlazado a una membrana de célula, pero puede ser removido de las membranas mediante tratamiento con una enzima de corte de fosfatidil inositol, por ejemplo, fosfatidil inositol fosfolipasa-C. Esta libera el antígeno en una forma biológicamente activa, y permite la purificación mediante procedimientos normales de química de proteínas. Véase, por ejemplo, Low (1989) Biochim. Biophvs. Acta 988.427-454; Tse y otros. (1985) Science 230:1003-1008 y Brunner y otros. (1991 ) J. Cell Biol. 114:1275-1283. Ahora que el 499E9 ha sido caracterizado, los fragmentos o derivados del mismo pueden ser preparados mediante procedimientos convencionales para sintetizar péptidos. Estos incluyen procedimientos tales como los descritos en Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Svnthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Syntesis, Springer-Verlag, Nueva York; Bodanszky (1984) The Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York y Villafranca (ed.) (1991) Techniques in Protein Chemistry II, Academic Ppress, San Diego, Ca.

VIII. Usos La presente invención provee reactivos que encontrarán uso en aplicaciones de diagnóstico como las descritas en muchas partes de la presente, por ejemplo, en la descripción general para condiciones mediadas por células T, o abajo en la descripción de equipos para diagnóstico.

Esta invención provee también reactivos con valor terapéutico significativo. El 499E9 (natural o recombinante), fragmentos del mismo y anticuerpos para el mismo, junto con compuestos identificados como teniendo afinidad de unión a 499E9, deben de ser útiles en el tratamiento de condiciones asociadas con fisiología o desarrollo anormales, incluyendo la proliferación anormal, por ejemplo, condiciones cancerosas o condiciones degenerativas. En particular, la modulación del desarrollo de células linfoides se logrará mediante tratamiento terapéutico adecuado usando las composiciones provistas en la presente. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociados con la expresión anormal o la señalización anormal por un 499E9 debe de ser un objetivo para una agonista o antagonista del antígeno. El antígeno juega un papel en la regulación o el desarrollo de células hematopoyéticas, v.gr., células linfoides, que afectan las respuestas inmunológicas, por ejemplo, los trastornos autoinmunes. En particular, el antígeno proveerá una señal coestimuladora para la activación de la célula. De esta manera, el 499E9 modulará las interacciones mediadas por célula T con otros tipos de células, por ejemplo, células que posean un receptor para la misma. Estas interacciones llevarían, en contextos particulares, a la modulación del crecimiento de la célula, a la síntesis de citocinas por esas u otras células o al desarrollo de células efectoras particulares. Más aún, el 499E9 o antagonistas podrían redirigir las respuestas de las células T, por ejemplo, entre la polarización de Th1 y Th2, o con células ThO. Entre estos agonistas deben de estar varios anticuerpos que reconozcan los epítopes adecuados, por ejemplo, que simulen la unión de 499E9 a su receptor. Como alternativa, se pueden unir a epítopes que puedan bloquear estéricamente la unión al receptor. También pueden ser útiles los antagonistas de 499E9, tales como la forma secretada que ocurre naturalmente de 499E9 o anticuerpos de bloqueo. Pueden proveer una vía selectiva y poderosa para modular respuestas inmunes en situaciones anormales, por ejemplo, trastornos autoinmunes, incluyendo artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso (LSE), tiroiditis autoinmune de Hashimoto, así como respuestas inflamatorias agudas y crónicas en las cuales la activación y expansión de células T y/o la memoria de células T inmunológicas jueguen un papel importante. Véase también Samter y otros, (eds) Immunological Diseases vols. 1 y 2, Little, Brown y Co. Se puede llevar a cabo la regulación de la activación y expansión de las células T y/o la liberación de citocina por la forma secretada que ocurre naturalmente de 499E9, o un antagonista para el mismo. Además, pueden ser útiles ciertas composiciones en combinación con otros moduladores de señalización de células T. Esas otras moléculas de señalización incluyen reactivos de TcR, CD40, CD40L, CTLA-8, CD28, SLAM, FAS y sus antagonistas respectivos. Se conocen varias condiciones anormales en cada uno de los tipos de células que muestran poseer ARNm de 499E9 mediante análisis de Northern blot. Véase Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis y Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn y otros. Harrison's Principies of Internal Medicine. McGraw-hill, N.Y. y Weatherall y otros, (eds.) Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Muchas otras condiciones y enfermedades médicas incluyen las células T o son mediadas por células T, y muchas de estas responderán al tratamiento por un agonista o antagonista provisto en la presente. Véase, por ejemplo, Stites y Terr (eds; 1991 ) Basic y Clinical Immunoloqy Appleton y Lange, Nowalk, Connecticut y Samter y otros (eds) Immunoloqical Diseases Little, Brown y Co. Estos problemas deben ser susceptibles a la prevención o tratamiento usando las composiciones provistas en la presente. Los anticuerpos de 499E9 pueden ser purificados y después administrados a un paciente, veterinario o humano. Estos reactivos pueden ser combinados para uso terapéutico con ingredientes activos o inertes adicionales, v.gr., en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, por ejemplo, adyuvantes inmunógenos, junto con estabilizadores, excipientes o conservadores fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden ser filtradas estérilmente y colocadas en formas de dosificación tal como mediante liofilización en frascos de dosificación o almacenamiento en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención contempla también el uso de anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos, incluyendo formas que no sean de unión de complemento. La investigación de fármacos usando 499E9 fragmentos del mismo puede llevarse a cabo para identificar compuestos que tengan afinidad de unión a, u otros efectos biológicos relevantes en funciones de 499E9, incluyendo aislamiento de componentes asociados. Después se pueden utilizar pruebas biológicas subsecuentes para determinar si el compuesto tiene actividad estimulante intrínseca o si es un bloqueador o antagonista porque bloquee la actividad del antígeno, por ejemplo, antagonistas de muteína. Así mismo, un compuesto que tenga actividad estimulante intrínseca puede activar la trayectoria de señal y es de esta manera una agonista porque estimula la actividad de 499E9. Esta invención contempla además el uso terapéutico de anticuerpos de bloqueo a 499E9 como antagonistas y de moléculas estimuladoras, por ejemplo, muteínas, como agonistas. Este enfoque debe ser particularmente útil con otras variantes de especies de 499E9. Las cantidades de reactivos necesarias para una terapia efectiva dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. De esta manera, las dosis de tratamiento deberán ser tituladas para optimizar la seguridad y eficacia. Típicamente, las dosis usadas in vitro pueden proveer una guía útil en las cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. Las pruebas con animales de dosis efectivas para el tratamiento de trastornos particulares proveerán una indicación predictiva adicional de la dosis para humanos. Se describen varias consideraciones, por ejemplo, en Gilman y otros (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacoloqical Bases of Therapeutics, 8va Ed., Pergamon Press y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ma ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Los métodos para la administración se describen ahí y abajo, por ejemplo, para la administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, la difusión transdérmica y otros. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, reguladores de pH y otros compuestos descritos, por ejemplo, en the Merck Index, Merk & Co., Rahway, Nueva Jersey. Normalmente se espera que las escalas de dosificación sean en cantidades inferiores a concentraciones de 1 mM, típicamente, concentraciones de menos de aproximadamente 10 µm, normalmente menos de aproximadamente 100 nM, preferiblemente menos de aproximadamente 10 pM (picomoiar) y más preferiblemente menos de aproximadamente 1 fM (femtomolar), con un vehículo adecuado. Las formulaciones de liberación prolongada, o un aparato de liberación prolongada, se utilizarán normalmente para la administración continua o a largo plazo. Véase, por ejemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533. El 499E9, fragmentos del mismo y anticuerpos para éste o sus fragmentos, antagonistas y agonistas, pueden administrarse directamente al hospedero que será tratado o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugarlos a proteínas portadoras tales como ovalbúmina o albúmina de suero antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas pueden administrarse en muchas formulaciones de dosis convencional. Aunque es posible que el ingrediente activo sea administrado solo, se prefiere presentarlo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden típicamente por lo menos un ingrediente activo, como el definido arriba, junto con uno o más vehículos aceptables para el mismo. Cada vehículo debe ser tanto farmacéutica como fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes y no dañino para el paciente. Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica farmacéutica. Véase, por ejemplo, Gilman y otros, (eds.) (1990) Goodman y Gilman's: The Phamacoloqical Bases of Therapeutics, 8va Ed., Pergamon Pergamon Press y Reminqton's Pharmaceutical Sciences, 17ma ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis y otros, (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosaqe Forms: Parenteral Medications, Dekker, Nueva York; Lieberman y otros (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosaqe Forms: Tablets, Dekker, Nueva York y Lieberman y otros (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosaqe Forms: Disperse Systems, Dekker, Nueva York. La terapia de esta invención puede combinarse con, o usarse en asociación con otros agentes, por ejemplo, otros moduladores de activación de células T, por ejemplo, CD40, ligando CD40, CD28, CTLA-4, B7, B70, SLAM, entidades de señalización del receptor de células T o sus antagonistas respectivos. Tanto la forma que ocurre naturalmente como la recombinante de los 499E9s de esta invención son particularmente útiles en equipos y métodos de prueba que son capaces de investigar compuestos para actividad de unión a las proteínas. Se han desarrollado en años recientes varios métodos para automatizar las pruebas, para permitir la investigación de cientos de miles de compuestos en un corto periodo. Véase, por ejemplo, Fodor y otros. (1991) Science 251 :767-773, que describe medios para probar la afinidad de unión mediante una pluralidad de polímeros definidos sintetizados sobre un substrato sólido. El desarrollo de pruebas adecuadas puede ser ampliamente facilitado mediante la disponibilidad de grandes cantidades de 499E9 soluble y purificado como el provisto por esta invención. Se pueden usar otros métodos para determinar los residuos críticos en las interacciones 499E9-receptor de 499E9. Se puede llevar a cabo el análisis mutacional, por ejemplo, véase Somoza y otros (1993) J. Exptl. Med. 178:549-558, para determinar residuos específicos críticos en la interacción y/o señalización. Ambos dominios extracelulares, implicados en la interacción homofílica, o dominio intracelular, el cual provee interacciones importantes en la señalización intracelular. Por ejemplo, se pueden encontrar normalmente antagonistas una vez que el antígeno ha sido definido estructuralmente, por ejemplo, mediante datos de estructura terciarios. Las pruebas de análogos de interacción potenciales son ahora posibles gracias al desarrollo de métodos de prueba altamente automatizados usando un 499E9 purificado. En particular, se descubrirán nuevos agonistas y antagonistas usando técnicas de investigación descritas en la presente. De particular importancia son los compuestos que se ha encontrado tienen una afinidad de unión combinada para un espectro de moléculas de 499E9, por ejemplo, compuestos que pueden servir como antagonistas para variantes de especie de 499E9.

Un método para la investigación de fármacos utiliza células hospederas eucarióticas o procarióticas que son transformadas establemente con moléculas de ADN recombinante que expresan un 499E9. Se pueden aislar células que expresen un 499E9 en aislamiento de otras moléculas. Dichas células, ya sea en forma viable o fija, pueden usarse para pruebas estándar de unión de socio de unión. Véase también, Parce y otros (1989) Science 246:243-247 y Owicki y otros (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 87:4007-4011 , que describen métodos sensibles para detectar respuestas celulares. Otra técnica para la investigación de fármacos incluye un enfoque que provee investigación de alta velocidad para compuestos que tengan afinidad de unión adecuada a un 499E9 y se describe en detalle en Geysen, solicitud de patente europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. Primero, se sintetizan grandes números de diferentes compuestos de prueba de péptidos pequeños sobre un substrato sólido, por ejemplo, espigas de plástico o alguna otra superficie adecuada, véase Fodor y otros. (1991). Después todas las espigas son hechas reaccionar con 499E9 solubilizado, impurificado o solubilizado, purificado y lavadas. El siguiente paso incluye detectar 499E9 unido. El diseño de fármaco racional también puede basarse en estudios estructurales de las formas moleculares del 499E9 y otros efectores o análogos.

Los efectores pueden ser otras proteínas que medien otras funciones en respuesta a la unión, u otras proteínas que interactúen normalmente con 499E9.

Un medio para determinar qué sitios se interactúan con otras proteínas específicas es una determinación de la estructura física, por ejemplo, cristalografía de rayos X o técnicas de RMN de dos dimensiones. Estas proveerán una guía en cuanto a cuáles residuos de aminoácidos forman regiones de contacto molecular. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas, véase, por ejemplo, Blundell y Johnson (1976) Protein Cristalloqraphv, Academic Press, Nueva York.

IX. Equipos Esta invención contempla también el uso de proteínas 499E9, fragmentos de las mismas, péptidos y sus productos de fusión en una variedad de equipos y métodos de diagnóstico para detectar la presencia de otra 499E9 o socio de unión. Típicamente, el equipo tendrá un compartimento que contenga ya sea un péptido o segmento de gen definido de 499E9 o un reactivo que reconozca uno o el otro, por ejemplo, fragmentos o anticuerpos de 499E9. Un equipo para determinar la afinidad de unión de un compuesto de prueba a un 499E9 comprenderá típicamente un compuesto de prueba; un compuesto marcado, por ejemplo socio de unión o anticuerpo que tenga afinidad de unión conocida para 499E9; una fuente de 499E9 (que ocurra natrualmente o recombinante); y un medio para separar compuestos marcados unidos de libres, tal como una fase sólida para inmovilizar la molécula. Una vez que los compuestos sean investigados, aquellos que tengan afinidad de unión adecuada al antígeno pueden ser evaluados en pruebas biológicas adecuadas, como las bien conocidas en la técnica, para determinar si actúan como agonistas o antagonistas a la trayectoria de señalización de 499E9. La disponibilidad de polipéptidos 499E9 recombinantes también provee parámetros bien definidos para calibrar dichas pruebas. Un equipo que se prefiere para determinar la concentración de, por ejemplo, un 499E9 en una muestra comprendería típicamente un compuesto marcado, por ejemplo, socio o anticuerpo de unión, que tuviera afinidad de unión conocida para el antígeno, una fuente de antígeno (natural o recombinante) y un medio para separar al compuesto marcado unido del libre, por ejemplo, una fase sólida para inmovilizar el 499E9. Se proveerán normalmente compartimentos que contengan reactivos e instrucciones. Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión de antígeno, específicos para el 499E9 o fragmentos son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de 499E9 y/o sus fragmentos. Dichas pruebas de diagnóstico pueden emplear lisados, células vivas, células fijas, inmunofluorescencia, cultivos de células, fluidos del cuerpo y además pueden incluir la detección de antígenos relacionados con el antígeno en el suero, o similares. Las pruebas de diagnóstico pueden ser homogéneas (sin un paso de separación entre el reactivo libre y el complejo de antígeno-socio de unión) o heterogéneas (con un paso de separación). Existen varias pruebas comerciales, tales como radioinmunoensayo (RÍA), prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ELISA), inmunoensayo de enzima (EIA), técnica de inmunoensayo multiplicada con enzimas (EMIT), ¡nmunoensayo fluorescente de substrato marcado (SLFIA) y similares. Véase, por ejemplo, Van Vunakis y otros (1980) Meth Enzymol. 70:1-525; Harlow y Lañe (1980) Antibodies: A Laboratorv Manual, CSH Press, NY y Coligan, y otros (eds.) (1993) Current Protocols in Immunology, Greene y Wiley, NY. Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden tener un uso similar a la presencia de diagnóstico de anticuerpos contra un 499E9, ya que pueden ser el diagnostico de varios estados anormales. Por ejemplo, la sobreproducción de 499E9 puede dar como resultado la producción de varias reacciones inmunológicas que pueden ser el diagnóstico de estados fisiológicos anormales, particularmente en condiciones de células proliferativas tales como cáncer o activación o diferenciación anormal. Frecuentemente, los reactivos para pruebas de diagnóstico se proveen en equipos, para optimizar la sensibilidad de la prueba. Para la presente invención, dependiendo de la naturaleza de la prueba, del protocolo y del marcador, se provee un anticuerpo o socio de unión ya sea marcado o no marcado, o 499E9 marcado. Este está normalmente en conjunto con otros aditivos, tales como reguladores de pH, estabilizadores, materiales necesarios para la producción de señales tales como substratos para enzimas y similares. Preferiblemente, el equipo contendrá también instrucciones para el uso adecuado y desecho de los contenidos después del uso. Típicamente, el equipo tiene compartimentos para cada reactivo útil. Deseablemente, los reactivos se proveen como un polvo liofilizado seco, en donde los reactivos pueden ser reconstituidos en un medio acuoso proveyendo concentraciones adecuadas de reactivos para llevar a cabo la prueba.

Muchos de los constituyentes anteriormente mencionados de la investigación de fármacos y de las pruebas de diagnóstico pueden usarse sin modificación, o pueden modificarse de una variedad de formas. Por ejemplo, se puede lograr el marcado uniendo covalente o no covalentemente una porción que provea directa o indirectamente una señal detectable. En cualquiera de estas pruebas, el socio de unión, compuesto de prueba, 499E9 o anticuerpos para los mismos puede ser marcados ya sea directa o indirectamente. Las posibilidades para el marcado directo incluyen grupos marcadores: marcadores radioactivos tales como 125l, enzimas (patente de E.U. No. 3,645,090) tales como peroxidasa y alcalino fosfatasa, y marcadores fluorescentes (patente de E.U. No. 3,940,475) capaces de monitorear el cambio en la intensidad de la fluorescencia, el desplazamiento de la longitud de onda o la polarización de la fluorescencia. Las posibilidades para el marcado indirecto incluyen la biotinilación de un constituyente seguida por la unión a avidina acoplada a uno de los grupos marcadores anteriores. También existen numerosos métodos para separar al 499E9 unido del libre, o alternativamente el compuesto de prueba unido del libre. El 499E9 puede ser inmovilizado sobre varias matrices seguido por el lavado. Las matrices adecuadas incluyen plástico tales como una placa de ELISA, filtros y esferas. Véase, por ejemplo, Coligan y otros, (eds.) (1993) Current Protocols in Immunoloqy, Vol. 1 , Capítulo 2, Greene y Wiley, NY. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de partícula magnetizable de anticuerpo de fluoresceína descrito en Rattle y otros (1984) Clin, Chem. 30:1457-1461 , y la separación de partículas magnéticas de anticuerpos dobles como la descrita en la patente de E.U. No. 4,659,678. Los métodos para enlazar proteínas o sus fragmentos a los diferentes marcadores han sido reportados extensamente en la literatura y no requieren de una descripción detallada aquí. Muchas de las técnicas incluyen el uso de grupos carboxilo activados ya sea a través del uso de carbodiimida o esteres activos para formar uniones de péptido, la formación de tioéteres mediante la reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado tal como cloroacetilo, o una olefina activada tal como maleimida, para el enlace, o similares. También serán útiles en estas aplicaciones las proteínas de fusión. Otro aspecto de diagnóstico de esta invención incluye el uso de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos tomadas de la secuencia de un 499E9. Estas secuencias pueden usarse como sondas para detectar niveles del mensaje de 499E9 en muestras de pacientes que se sospeche tengan una condición anormal, por ejemplo, cáncer o problema de desarrollo. Ya que el antígeno es un marcador para la activación, puede ser útil para determinar los números de células T activadas para determinar, por ejemplo, cuando una supresión adicional pueda necesitarse. La preparación de ambas secuencias de nucleotidos de ARN y ADN, el marcado de las secuencias y el tamaño preferido de las secuencias han recibido amplia descripción en la literatura. Véase, por ejemplo, Langer-Safer y otros (1982) Proc. Nat'l. Acad, Sci. 79:4381-4385; Caskey (1987) Science 236:962-967 y Wilchek y otros (1988) Anal. Biochem. 171 :1-32.

Igualmente se contemplan equipos de diagnóstico que también pueden probar la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. La diagnosis o prognosis puede depender de la combinación de indicaciones múltiples usadas como marcadores. De esta manera, los equipos pueden probar combinaciones de marcadores. Véase, por ejemplo, Viallet y otros (1989) Proqress in Growth Factor Res. 1 :89-97. Se pueden usar otros equipos para evaluar los subconjuntos de células T.

X. Métodos para aislar socios de unión específicos de 499E9 La proteína 499E9 debe interactuar con un receptor en base, por ejemplo, a su similaridad en estructura y función con otros antígenos de superficie de células que exhiben estructura similar y especificidad de expresión del tipo de célula. Los métodos para aislar un receptor se hacen disponibles por la capacidad de hacer 499E9 purificada para programas de investigación. Las construcciones solubles o de otro tipo que usen las secuencias de 499E9 provistas aquí permitirán investigar o aislar receptores específicos de 499E9. Existen muchos métodos para la clonación de expresión, visualización, afinidad de aislamiento u otros medios para identificar un receptor. Muchas modificaciones y variaciones de esta invención pueden hacerse sin alejarse de su espíritu y alcance, como será aparente para aquellos expertos en la técnica. Las modalidades específicas descritas en la presente se ofrecen a manera de ejemplo únicamente, y la invención deberá ser limitada sólo por los términos de las reinvindicaciones anexas, junto con el alcance completo de equivalentes que dichas reivindicaciones cubren.

EJEMPLOS Métodos generales Algunos de los métodos estándar se describen o mencionan, por ejemplo, en Maniatis y otros (1982) Molecular Cloninq, A. Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook y otros (1989) Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual (2d ed.) vols. 1-3, CSH Press, Ny; Ausubel y otros, Bioloqy Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY o Ausubel y otros (1987 y suplementos) Current Protocols in Molecular Biologv, Greene and Wiley, Nueva York; Innis y otros (eds.) (1990) PCR Protocols: A guide to Methods y Applications, Academic Press, N.Y. Los métodos para la purificación de proteínas incluyen métodos tales como precipitación de sulfato de amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización y otros. Véase, por ejemplo, Ausubel y otros (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" en Methods ¡n Enzymology vol. 182, y otros volúmenes de esta serie; y en literatura del fabricante acerca del uso de productos de purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, N.J. o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permitirá la fusión a segmentos adecuados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o un equivalente que pueda ser fusionado por medio de una secuencia removible por proteasa. Véase, por ejemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) Genetic Enqineerinq, Principie and Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe y otros (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA. Se describen técnicas de cultivo de células en: Doyle y otros (eds.) (1994) Cell and Tissue Culture: Laboratorv Procedures, John Wiley and Sons, NY. Se describen análisis FACS en Melamed y otros (1990) Flow Cvtometrv and Sortinq Wilev-Liss, Inc., Nueva York, NY; Shapiro (1998) Practical Flow Cvtometrv Liss, Nueva York, NY y Robinson y otros (1993) Handbook of Flow Cvtometrv Methods Wiley-Liss, Nueva York, NY. Se llevó a cabo el marcado flourescente de reactivos adecuados mediante métodos normales.

EJEMPLO 1 Clonación de 499E9 de ratón La producción de células Thl o Th2 3W se describe en Openshaw y otros (1995) J. Exp. Med 182:1357-1367. Brevemente, se derivaron poblaciones de Th1 o Th2 de células CD4+T estimuladas con antígeno y células que presentaban antígenos en presencia de IL-12 o. IL4. Las células fueron estimuladas una vez a la semana durante 3 semanas, después cosechadas y reestimuladas, por ejemplo, con PMA y ionomicina durante 4 h. Véase, Murphy y otros (1996) J. Exp. Med. 183:901-913.

El ARN total puede ser aislado, por ejemplo, usando el procedimiento de gradiente de tiocianato de guanidina/CsCI como el descrito por Chirgwin y otros (1978) Biochem. 18:5294-5299. Se aisla ARN de Poly (A)+ usando, por ejemplo, el equipo de aislamiento de ARNm OLIGOTEX (QIAGEN). Dicho ARN de estas células se usa para sintetizar primero ADNc de cadena, por ejemplo, usando iniciador Notl/Oligo-dT (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). El ADNc de doble cadena se sintetiza, se liga con adaptadores BstXI, se digiere con Notl, se fracciona en tamaño para pares de > 0.5 kilobase (kb) y se liga en los sitios Notl/BstXI de pJFE-14, un derivado del vector pCDSRa. Véase, Takebe y otros (1985) Mol. Cell Biol. 8:466-472. Se usan células DH10a de E.Coli. electrocompetentes (Gibco-BRL) para la transformación. Clonas independientes fueron escogidas al azar e investigadas mediante hibridación usando un cóctel de ADNc's de citocina conocidos. Se prepararon ADN's plasmídicos de clonas que no hibridaban a las sondas de citocina. Estas clonas fueron agrupadas por tamaño de inserto y caracterizadas adicionalmente por medio de determinación de secuencia de ADN. Se aislaron las clonas que correspondían a la 499E9.

EJEMPLO 2 Expresión celular de 499E9 de ratón Una sonda específica para ADNc que codifica para 499E9 de ratón se usa para determinar la distribución en el tejido del mensaje codificando para el antígeno. Se pueden usar sondas de hibridación normales para llevar a cabo un análisis Northern de ARN de fuentes adecuadas, ya sea células, por ejemplo, estimuladas o en varios estados fisiológicos, en varios tejidos, por ejemplo, de bazo, hígado, timo, pulmón, etc., o en varias especies. Los análisis Southern de genotecas de ADNc también pueden proveer información de distribución valiosa. Los blots de tejidos normales o blots de especies están disponibles comercialmente. Técnicas similares serán útiles para evaluar diagnósticos o condiciones médicas que puedan correlacionarse con la expresión en varios tipos de células. También puede usarse el análisis de PCR usando iniciadores adecuados. Se puede usar el análisis de anticuerpos, incluyendo inmunohistoquímica o FACS, para determinar la distribución celular o en tejidos.

EJEMPLO 3 Purificación de proteína 499E9 Se investigan líneas de células transfectadas múltiples para detectar una que exprese el antígeno, formas unida a la membrana o solubles, a un alto nivel en comparación con otras células. Se investigan varias líneas de células y se seleccionan por sus propiedades favorables en el manejo. 499E9 natural puede ser aislada de fuentes naturales o mediante la expresión a partir de una célula transformada usando un vector de expresión adecuado. La purificación de la proteína expresada se logra mediante procedimientos normales, o puede combinarse con medios manipulados para una purificación efectiva de alta eficiencia a partir del lisados o sobrenadantes de células. Se pueden usar segmentos FLAG o His6 para dichas características de purificación.

EJEMPLO 4 Aislamiento de genes de 499E9 homólogos Se puede usar el ADNc de 499E9 como una sonda de hibridación para investigar una genoteca de una fuente deseada, por ejemplo, una genoteca de ADNc de célula de primate. Pueden investigarse varias especies diferentes tanto para la rigurosidad necesaria para una fácil hibridación, como para presencia usando una sonda. Se usarán condiciones de hibridación adecuadas para seleccionar clonas que exhiban especificidad de hibridación cruzada. La investigación mediante hibridación o PCR usando sondas degeneradas en base a las secuencias de péptidos también permitirá el aislamiento de clonas adecuadas. Como alternativa, el uso de iniciadores adecuados para la investigación por PCR proveerá el enriquecimiento de clonas de ácido nucleico adecuadas. Métodos similares son aplicables para aislar ya sea especies, variantes polimórficos o alélicos . Las variantes de especie se aislan usando técnicas de hibridación de especie cruzada en base al aislamiento de un aislado o fragmento de longitud completa de una especie como una sonda.

Como alternativa, los anticuerpos desarrollados contra 499E9 de ratón se usarán para investigar células que expresen proteínas reactivas cruzadas a partir de una genoteca, v.gr., de ADNc, adecuada. La proteína purificada o péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos mediante métodos normales como los descritos arriba. Péptidos sintéticos o proteínas purificadas se presentan a un sistema inmune para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene y Harlow y Lañe (1989) Antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Press. Los anticuerpos resultantes se usan, por ejemplo, para investigación, visualización o clasificación.

EJEMPLO 5 Preparación de anticuerpos específicos para 499E9 Péptidos sintéticos o proteínas purificadas se presentan a un sistema inmune para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene y Harlow y Lañe (1989) Antibodies: A Laboratorv Manual Cold Spring Harbor Press. Se pueden preparar suero policlonal o hibridomas. En situaciones adecuadas, el reactivo de unión es marcado como se describió arriba, por ejemplo, mediante fluorescencia o de otra manera, o es inmovilizado a un substrato para métodos de visualización.

EJEMPLO 6 Aislamiento de un receptor para 499E9 Se puede usar un producto de expresión de construcción de 499E9 como un reactivo de unión específico para identificar su socio de unión, por ejemplo, receptor, sacando ventaja de su especificidad de unión, preferiblemente se podría usar un anticuerpo. Un reactivo de 499E9 es marcado como se describió arriba, por ejemplo, mediante fluorescencia o de otra manera, o es inmovilizado a un substrato para métodos de visualización. La composición de unión se usa para investigar una genoteca de expresión hecha de una línea de células que exprese un socio de unión, es decir, receptor. Se usan técnicas de tinción normales para detectar o clasificar receptor intracelular o expresado en superficie, o se investigan mediante _ visualización células transformadas de expresión en superficie. La investigación de la expresión intracelular se lleva a cabo mediante varios procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Véase también, McMahan y otros (1991) EMBQ J. :2821-2832 Como alternativa, se usan reactivos de 499E9 para purificar por afinidad o clasificar células que expresen un receptor. Véase, por ejemplo, Sambrook y otros o Ausubel y otros. Otra estrategia es la de investigar para un receptor unido a membrana mediante visualización. El ADNc que contiene ADNc del receptor se construye como se describió arriba. El ligando puede ser inmovilizado y usarse para inmovilizar células de expresión. La inmovilización se puede lograr mediante el uso de anticuerpos adecuados que reconozcan, por ejemplo, una secuencia FLAG de una construcción de fusión de 499E9, o mediante el uso de anticuerpos desarrollados contra los primeros anticuerpos. Los ciclos recursivos de selección y amplificación llevan al enriquecimiento de las clonas adecuadas y al eventual aislamiento de clonas de expresión de receptor. Las genotecas de expresión de fago pueden ser investigadas por 499E9. Las técnicas de marcación adecuadas, por ejemplo, anticuerpos anti-FLAG, permitirán la marcación específica de clonas adecuadas. Todas las citas de la presente se incorporan aquí a manera de referencia como si cada publicación individual o solicitud de patente estuviera indicada específica o individualmente como incorporada a manera de referencia. Se pueden hacer muchas modificaciones y variaciones a esta invención sin alejarse de su espíritu y alcance, como será aparente para aquellos expertos en la técnica. Las modalidades específicas descritas en la presente se ofrecen únicamente a manera de ejemplo, y la invención deberá ser limitada por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance completo de los equivalentes que dichas reivindicaciones cubren.

PRESENTACIÓN DE SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ácido nucleico de 499E9 de ratón. SEQ ID NO: 2 es una secuencia de aminoácidos de 499E9 de ratón. (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Schering Corporation (¡i) TITULO DE LA INVENCIÓN: Antígenos de superficie de células de mamífero y reactivos relacionados. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Schering-Plough Corporation (B) CALLE: 2000 Galloping Hill Road (C) CIUDAD: Kenilworth (D) ESTADO: Nueva Jersey (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 07033-0530 (v) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: Apple Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: Macintosh 7.5.3 (D) SOFTWARE: Microsoft Word 6.0 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 12-DIC-1997 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A): NUMERO DE SOLICITUD: US 60/0.32,846 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 13-DIC-1996 (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE (A) NOMBRE: Thampoe, Immac J. (B) NUMERO DE REGISTRO: 36,322 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: DX0686 PCT (ix) INFORMACIÓN POR TELECOMUNICACIÓN (A) TELEFONO: (908) 298-5061 (B) FAX: (908) 298-5388 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 2191 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 125..1072 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1 : GCCAGGACCT CTGTGAACCG GTCGGGG GGGCCGCCTG GCCGGAGTC TGCTCGGCGG 60 TGGGTGGCCG AGGAAGGGAG AGAACGATCG CGGAGCAGGG CGCCCGAACT CCGGGCGCCG 120 CGCC ATG CGC CGG GCC AGC CGA GAC TAC GGC AAG TAC CTG CGC AGC TCG 169 Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser 1 5 10 15 GAG GAG ATG GGC AGC GGC CCC GGC GTC CCA CAC GAG GGT CCG CTG CAC 217 Glu Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His 20 25 30 CCC GCG CCT TCT GCA CCG GCT CCG GCG CCG CCA CCC GCC GCC TCC CGC 265 Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg 40 45 TCC ATG TTC CTG GCC CTC CTG GGG CTG GGA CTG GGC CAG GTC GTC TGC 313 Ser Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gin Val Val Cys 50 AGC ATC GCT CTG TTC CTG TAC TTT CGA GCG CAG ATG GAT CCT AAC AGA 361 Ser He Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gm Met Asp Pro Asn Arg 65 70 75 ATA TCA GAA GAC AGC ACT CAC TGC TTT TAT AGA ATC CTG AGA CTC CAT 409 lie Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg He Leu Arg Leu His 80 85 90 95 GAA AAC GCA GGT TTG CAG GAC TCG ACT CTG GAG AGT GAA GAC ACA CTA 457 Giu Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu 100 105 110 CCT GAC TCC TGC AGG AGG ATG AAA CAA GCC TTT CAG GGG GCC GTG CAG 505 Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gin Ala Phe Gin Gly Ala Val Gin 115 120 125 Lys Glu Leu Gin His lie Val Gly Pro Gin Arg Phe Ser Gly Ala Pro 130 135 140 GCT ATG ATG GAA GGC TCA TGG TTG GAT GTG GCC CAG CGA GGC AAG CCT 601 Ala Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro 145 150 155 GAG GCC CAG CCA TTT GCA CAC CTC ACC ATC AAT GCT GCC AGC ATC CCA 649 Glu Ala Gin Pro Phe Ala His Leu Thr lie Asn Ala Ala Ser lie Pro 160 165 170 175 TCG GGT TCC CAT AAA GTC ACT CTG TCC TCT TGG TAC CAC GAT CGA GGC 697 Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly 180 185 190 lie Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val 195 200 205 AAC CAA GAT GGC TTC TAT TAC CTG TAC GCC AAC ATT TGC TTT CGG CAT 793 Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn lie Cys Phe Arg His 210 215 220 CAT GAA ACA TCG GGA AGC GTA CCT ACA GAC TAT CTT CAG CTG ATG GTG 841 His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gin Leu Met Val 225 230 235 TAT GTC GTT AAA ACC AGC ATC AAA ATC CCA AGT TCT CAT AAC CTG ATG 889 Tyr Val Val Lys Thr Ser lie Lys lie Pro Ser Ser His Asn Leu Met TAT GTC GTT AAA ACC AGC ATC AAA ATC CCA AGT TCT CAT AAC CTG ATG 889 Tyr Val Val Lys Thr Ser lie Lys lie Pro Ser Ser His Asn Leu Met 240 245 250 255 AAA GGA GGG AGC ACG AAA AAC TGG TCG GGC AAT TCT GAA TTC CAC TTT 937 Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe 260 265 270 TAT TCC ATA AAT GTT GGG GGA TTT TTC AAG CTC CGA GCT GGT GAA GAA 985 Tyr Ser lie Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu 275 280 285 ATT AGC ATT CAG GTG TCC AAC CCT TCC CTG CTG GAT CCG GAT CAA GAT 1033 He Ser lie Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp 290 295 300 GCG ACG TAC TTT GGG GCT TTC AAA GTT CAG GAC ATA GAC TGAGACTCAT 1082 Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp He Asp 305 310 315 TTCGTGGAAC ATTAGCATGG ATGTCCTAGA TGTTTGGAAA CTTCTTAAA AATGGATGAT 1142 GTCTATACAT GTGTAAGACT ACTAAGAGAC ATGGCCCACG GTGTATGAAA CTCACAGCCC 1202 TCTCTCTTGA GCCTGTACAG GTTGTGTATA TGTAAAGTCC ATAGGTGATG TTAGATTCAT 1242 GGTGATTACA CAACGGTTTT ACAATTTTGT AATGATTTCC TAAGAATTGA ACCAGATTGG 1322 GAGAGGTATT CCGATGCTTA TGAAAAACTT ACACGTAGC TATGGAAGGG GGTCACAGTC 1382 TCTGGGTCTA ACCCCTGGAC ATGTGCCACT GAGAACCTTG AAATTAAGAA GATGCCATGT 1442 CATTGCAAAG AAATGATAGT GTGAAGGGTT AAGTTCTTTT GAATTGTTAC ATTGCGCTGG 1502 GACCTGCAAA TAAGTTCTTT TTTTCTAATG AGGAGAGAAA AATATATGTA TTTTATATATA 1562 ATGTCTAAAG TTATATTTCA GGTGTAATGT TTTCTGTCGCA AAGTTTTGTA AATTATATTT 1622 TTAAATGTAC AGATGTATTT AACTGGTGCA CTTTGTAATT CCCCTGAAGG TATCTCGTAGC 1742 TAAGGGGGCA GAATACTGTT TCTGGTGACC ACATGTAGTT TATrTCTTTTA TTCTTTTTAA 1802 CTTAATAGAG TCTTCAGACT TGTCAAAACT ATGCAAGCAA AATAAATAAA TAAAAATAAA 1862 ATGAATATCT TGAATAATAA GTAGGATGTT GGTCACCAGG TGCCTTTCAA ATTTAGAAGC 1922 TAATTGACTT TAGGAGCTGA CATAGCCAAA AAGGATACAT AATAGGCTAC TGAAAATCTG 1982 TCAGGAGTAT TTATGCAATT ATTGAACAGG TGTC I I I I I I TACAAGAGCTT ACAATTGTA 2042 AATTTTGTTTT CTTTTTTTTC CCATAGAAAA TGTACTATAG TTTATCAGCC AAAAAACAAT 2102 CCACTTTTTTA ATTTAGTGAA AGTTATTTTA TTATACTGTA CAATAAAAGC ATTGTTTTCTG 2162 AATGGCATTT TTTGGTACTT AAAAATGGC 2191 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 316 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D)TOPOLOGIA: lineal (iii)TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2: Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro 20 25 30 Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser 35 40 45 Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser 50 55 60 lie Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg He 65 70 75 80 Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg lie Leu Arg Leu His Glu 85 90 95 Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro 100 105 110 Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys GIn Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys 115 120 125 Glu Leu Gln His He Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala 130 135 140 Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu 145 150 155 160 Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr He Asn Ala Ala Ser He Pro Ser 165 170 175 Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp 180 185 190 Ala Lys He Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn 195 200 205 Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn lie Cys Phe Arg His His 210 215 220 Lys Thr Ser lie Lys lie Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys 245 250 255 Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr 260 265 270 Ser He Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Glu lie 275 280 285 Ser He Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala 290 295 300 Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp lie Asp 305 310 315

Claims (11)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un polipéptido substancialmente puro o recombinante que exhibe por lo menos 85% de identidad de secuencia sobre una longitud de por lo menos aproximadamente 12 aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

2.- Una proteína de fusión que comprende un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.

3.- Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 2.

4.- Un ácido nucleico aislado que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1.

5.- Un ácido nucleico que: a) híbrida bajo condiciones de lavado de 30°C y menos de 2M de sal con SEQ ID NO: 1 o b) exhibe por lo menos 85% de identidad sobre un tramo de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos con un ácido nucleico que codifica un polipéptido 499E9.

6.- Un vector recombinante que comprende ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5.

7.- Una célula hospedera que comprende un ácido nucleico o vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-6.

8.- Un método para hacer un polipéptido o proteína de fusión, que comprende cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 7 bajo condiciones en las cuales el ácido nucleico sea expresado.

9.- Un compuesto de unión que comprende un fragmento de unión de anticuerpo o antígeno que se une específicamente a un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.

10.- Una composición que comprende un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 2.

11.- Un equipo que comprende: a) un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o una proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 2; b) un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o c) un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4 ó 5.