MXPA99004200A - Plantas resistentes a herbicidas - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona, inter alia, un polinucleótido que comprende por lo menos una primera región que codifica una primera proteína capaz de conferir en una planta, o tejido que lo comprende, resistencia o tolerancia a un primer herbicida, y, una segunda región que codifica una segunda proteína similar capaz de conferir resistencia a un segundo herbicida, con las condiciones (i) que el polinucleótido no codifica una proteína de fusión que comprende solamente una 5-enol-piruvil-3-fosfoshikimato sintetasa (EPSPS) y una glutationa S transferasa (GST);(ii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifican la superóxido dismutasa (SOD) y glutationa S transferasa (GST);y (iii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifiquen GST y fosfinotricin acetil transferasa (PAT).

Description

PLANTAS RESISTENTES A HERBICIDAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a tecnología de ADN recombinante, y en particular a la producción de plantas transgénicas las cuales exhiben resistencia sustancial o tolerancia sustancial a herbicidas cuando se comparan con plantas similares no transgénicas. Las plantas las cuales son sustancialmente "tolerantes" a un herbicida cuando se someten a este proporcionan una curva de dosis/respuesta la cual se desplaza a la derecha cuando se compran con aquella proporcionada por plantas similares no tolerantes similarmente tratadas. Tales curvas de dosis/respuesta tiene la "dosis" graficada en el eje x y "porcentaje de muerte", "efecto herbicida", etc. graficadas en el eje y. Las plantas tolerantes requerirán más herbicida que las plantas similares no tolerantes con el fin de producir un efecto herbicida dado. Las plantas las cuales son sustancialmente "resistentes" al herbicida exhiben pocas, si las hay, lesiones necróticas, líticas, cloró icas u otras cuando se someten al herbicida a concentraciones y proporciones las cuales se emplean típicamente por la comunidad agroquímica para matar plantas en el campo. Las plantas las cuales son resistentes a un herbicida son también tolerantes al herbicida. Los términos "resistente" y "tolerante" son para ser construidos como "tolerantes y/o resistentes" dentro del contexto de la presente solicitud. De acuerdo a la presente invención se proporciona un polinucleótido que comprende por lo menos una primera región que codifica una primera proteína capaz de conferir en una planta, o tejido que la comprende, resistencia o tolerancia a un primer herbicida, y una segunda región que codifica una segunda proteína similar capaz de conferir resistencia a un segundo herbicida, con las condiciones (i) que el polinucleótido no codifica una proteína de fusión que comprende solamente una 5-enol-piruvil-3-fosfoshikimato sintetasa (EPSPS) y una glutationa S transferasa (GST) ; (ii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifican la superóxido dismutasa (SOD) y glutationa S transferasa (GST) ; y (iii) que el polinucleótido no comprenda solo regioneß que codifiquen GST y fosfinotricin acetil transferasa (PAT) . En una modalidad preferida de la invención las regiones comprendidas por el polinucleótidoestán cada una bajo control de expresión de un promotor y terminador operable vegetal . Tales promotores y terminares son bien conocidos por los hombres expertos que los elegirán de acuerdo a sus necesidades particulares. Por ejemplo, promotores adecuados incluyen los promotores 35S CaMV o FMV, y los promotores arabidopsis y maíz ubiquitin. Preferiblemente, los promotores son constitutivos. Esto evita la necesidad para inducción externa y significa que la planta es permanentemente tolerante de o resistencia a cada herbicida correspondiente. El ADN que codifica los genes de resistencia al herbicida pueden ser incluidos también en un vector de transformación vegetal bajo el control de un promotor inducible, para dar resistencia al herbicida inducible en las plantas transgénicas. Tales promotores incluyen el promotor GST-27 conocido inducido químicamente por el cual la resistencia puede ser cambiada por aplicación de un inductor adecuado (tal como un asegurador químico) . En ciertas circunstancias, puede ser ventajosa la capacidad para expresar o incrementar la resistencia herbicida solamente cuando se requiera. Por ejemplo, durante la rotación de cultivos, pueden crecer individuos de la primera especie de cultivo al año siguiente en el campo a ser cultivado con una segunda especie de cultivo. Puede ser usado un herbicida para destruir estas plantas "voluntarias" no inducidas y todavía susceptibles. La inducción de la expresión del gen de resistencia a herbicida solo cuando se requiere la resistencia al herbicida (es decir, justo antes de la aplicación de un herbicida) puede también ser metabólicamente más eficiente en algunas circunstancias ya que las plantas producen entonces resistencia a polipéptidos solo cuando se requiere. Promotores inducibles adecuados además incluyen el promotor inducible por tetraciclina, el sistema de represor/operador bacteriana lac, el receptor de glucocorticoide, junto con dexametasona, promotores inducibles por ácido salicílico y cobre, promotores en base al receptor de ecdysona, como se describe en la Solicitud de Patente No. PCT/GB96/0119 , y el así llamado promotor Ale, como se describe en la Publicación de Patente Internacional No. 093/21334. En una modalidad particularmente preferida de la invención, por lo menos una de las regiones comprendidas por el polipéptido proporciona resistencia a un herbicida pre emergencia y por lo menos una de las regiones proporciona resistencia a un herbicida post emergencia. Mientras que un experto no necesita una definición de pre emergencia y post mergencia, por "pre emergencia" se entiende aplicado antes de que emerga la semilla de germinación arriba de la superficie de la tierra, es decir antes de que cualquier material vegetal sea visible arriba del suelo. Post emergencia significa aplicado después de que es visible la siembra arriba de la superficie de la tierra. El herbicida pre emergencia puede ser seleccionado del grupo que consiste de un herbicida de dinitroanilina, bromacil, flupoxan, picloram, fluorocloridona, tetrazolinonas incluyendo N-carbamoiltetrazolinonas tales como aquellas descritas en EP-A-612 , 735 , sulcatriona, norflurazona, RP201772, atrazina, iminotiadozol , diflufenicon, sulfonil urea, imidazolinona, tiocarbamato, triazina, uracil, urea, tricetona, isoxazol, acetanilida, oxadiazol, los herbicidas de fosfosulfonato descritos en EP-A-511, 826 , herbicidas del tipo triazinona, sulfonanilida, amida, oxiacetamidas tales como flutiamida, anilida y triazolinona. Ejemplos de herbicidas de tricetona incluyen 2- (2 -Nitro-4-trifluorometilbenzoil) -ciclohexano-1, 3 -diona. 2- (2-cloro-4-metansulfonilbenzoil) -ciclohexano-1 , 3-diona, 2- (2-2-nitro-4-metansulfonilbenzoil) -ciclohexanq-1, 3-diona, [5-ciclopropil-4- (2-metilsulfonil-4-trifluorometilbenzoil) isoxazol, etc. Para evitar la duda, por "herbicida de tricetona" se entiende cualquier compuesto capaz de inhibir una 4-hidroxifenilpiruvato (o ácido pirúvico) dioxigenasa (HPPD) . Dentro del contexto de la presente invención los términos 4-hidroxifenilpiruvato (o ácido pirúvico) dioxigenasa (4-HPPD) y p-hidroxifenilpiruvato (o ácido pirúvico) dioxigenasa (p-OHPP) son sinónimos. El herbicida post emergencia puede ser seleccionado del grupo que consiste de glifosato y sales del mismo, glufosináto, difeniléter, asulam, bentazon, bialafos, bromacil, setoxidim u otra diclohexanodiona, dicamba, fosamina, flupoxam, fenoxipropionato, quizalofop u otro ariloxi-fenoxipropanoato, picloram, fluometron, atrazina u otra triazina, metribuzin, clori uron, clorsulfuron, flumetsulam, halosulfuron, sulfometron, imazaquin, imazetapir, isoxaben, imazamox, metosulam, piritrobac, rimsulfuron, bensulfuron, nicosulfuron, fomesafen, fluroglicon, KIH9201, ET751, carfentrazona, ZA1296, ICIA0051, RP201772, flurocloridona, norflurazon, paraquat, diquat, bromoxinil y fenoxaprop. Combinaciones particularmente preferidas de estos herbicidas para las cuales el polinucleótido de la invención es capaz de conferir resistencia (o para las cuales los plantas de la invención son resistentes o tolerantes) son: (i) herbicidas del tipo glifosato y difenil éter o acetanalida: (ii) herbicidas de tipo glifosato y/o glufosinato y anilida y/o triazolinona; (iii) tricetonas y glifosato y/o glufosinato; (iv) herbicidas del tipo glifosato y/o glufosinato y tricetonas y anilida; (v) glifosato y/o glufosinato y un inhibidor de PDS (tal como los compuestos de las fórmulas I -III representadas posteriormente) . Las proteínas codificadas por las regiones del polinucleótido pueden ser seleccionadas del grupo que consiste de glifosato oxido reductasa (GOX), 5-enol-piruvil-3 -fosfoshikimato sintetasa (EPSPS) , fosfinotricin acetil transferasa (PAT) , hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (pPPD) , glutationa S transferasa (GST), citocromo P450, Acetil-COA carboxilasa (ACC) , acetolactato sintasa (ALS) , protoporfirinogen oxidasa (protox) , dihidropteroato sintasa, proteínas que transportan poliamina, superóxido dismutasa (SOD) , bromoxinil nitrilasa (BNX) , fitoene desaturasa (PDS) , el producto del gen tfdA obtenible de Alcaligenes eu trophus , y mutado o de otra forma variantes modificadas de las proteínas . El producto del gen tfdA es una dioxigenasa la cual es capaz de oxidar los ácidos fenoxicarboxílieos, tales como 2, 4-D al fenol correspondiente. La enzima EPSP puede ser una así llamada clase II EPSPS, como se describe en la Patente Europea No. 546,090. Alternativamente, y/o adicionalmente, ésta puede ser mutada como para comprender sustituciones de aminoácidos en ciertas posiciones las cuales son conocidas para resultar en resistencia incrementada a glifosato (y sales aceptables agrícolamente de las mismas) . Por ejemplo, la EPSPS puede tener por lo menos los residuos Tre, Pro, Gli y Ala en las posiciones que corresponden a 174, 178, 173 y 264 con respecto a la EPSPS representada en la SEQ ID NO. 9 alertada como sigue: (i) Tre 174 - lie (ii) Pro 178 - Ser (iii) Gli 173 - Ala (iv) Ala 264 - Tre En donde (i) Tre 174 se presenta dentro de una secuencia que comprende contiguamente Ala - Gli - Tre - Ala -Met; (ii) Pro 178 se presenta dentro de una secuencia que comprende contiguamente Met - Arg - Pro - Leu - Tre; (iii) Gli 173 se presenta dentro de una secuencia que comprende contiguamente Asn - Ala - Gli - Tre - Ala; y (iv) Ala 264 se presenta dentro de una secuencia que comprende contiguamente Pro - Leu - Ala - Leu - Gli. Adicionalmente, puede ser reemplazado el residuo Gli terminal dentro de la secuencia del motivo Glu - Arg- Pro-AAl-AA2-Leu-Val-AA3-AAA4-Leu-AA5-AA6-AA7-Gli en una región de la enzima EPSPS que corresponde a aquellas posiciones de expansión 192 a 232 en SEQ ID NO : 9 por ya sea un reiduo Asp o Asn. En una modalidad del polinucleótido, la región que codifica la enzima HPPD tiene la secuencia representada en la SEQ ID NO 1 ó 3, o alternativamente es complementaria a una la cual cuando se incuba a una temperatura de entre 60 y 65°C en una solucióh salina amortiguada con citrato concentrado que contiene 0.1% de SDS seguido por enjuagar a la misma temperatura con una solución salina amortiguada con citrato resistente que contiene 0.1% SDS todavía se hibridiza con la secuencia representada en la SEQ ID No. 1 ó 3 respectivamente. Cuando las secuencia de prueba y de inventiva están en cadena doble el ácido nucleico que constituye la secuencia de prueba tiene preferiblemente una TM dentro de 15 °C de aquella de la secuencia SED ID NO. En el caso que las secuencias de prueba y SEQ ID NO 1 (o secuencias de prueba y SEQ ID NO. 3) estén mezcladas juntas y se desnaturalicen simultáneamente, los valores de TM de las secuencias están preferiblemente dentro de 5°C entre sí. Más preferiblemente se realiza la hibridización bajo condiciones relativamente severas, con ya sea las secuencia de prueba o de inventiva que están preferiblemente soportadas. De esta forma ya sea una secuencia de prueba o de inventiva desnaturalizada está enlazada primero preferiblemente a un soporte y se efectúa la hibridización por un periodo especificado de tiempo e una temperatura de entre 60 y 65 °C en una solución salina amortiguada con citrato concentrado que contiene 0.1% de SDs seguido por enjuagar el soporte en la misma temperatura pero con 0.1 de solución salina amortiguada con citrato concentrado. Donde la hibridización implica un fragmento de la secuencia de inventiva, las condiciones de hibridización pueden ser menos severas, así como serán obvias para el hombre experto. Cuando el polinucleótido comprende un gen de HPPD capaz de conferir resistencia a herbicidas de tricetona, el material vegetal transformado con el mismo puede ser sometido a un herbicida de tricetona y se selecciona visualmente en la base de una diferencia de color entre el material transformado y no transformado cuando se somete al herbicida. De esta forma el material no transformado puede llegar a ser y permanecer blanco cuando se somete al procedimiento de selección, mientras que el material transformado puede llegar a ser blanco pero después cambia a verde, o puede permanecer verde, similarmente, cuando se somete al procedimiento de selección. Una modalidad adicional del polinucleótido de la invención incluye una región adicional que codifica una proteína capaz de proporcionar a la planta con resistencia o tolerancia a insectos, desecación y/o infecciones fúngicas, bacteriales o virales. Las proteínas codificadas por tales regiones son conocidas por el hombre experto e incluyen la endotoxina delta de Bacillus thuringiensis y las proteínas de cubierta de los virus, por ejemplo. El poliuretano puede comprender secuencias 5 " de y contiguas con las regiones, las cuales las secuencias codifican (i) un péptido el cual es capaz de objetivar los productos de traducción de las regiones a plástidos tales como cloroplastos, mitocondrias, otros organelos o paredes celulares vegetales; y/o (ii) secuencias de mejora de traducción no traducidas. Secuencias de objetivo adecuadas codifican péptidos temporales de cloroplastos, particularmente en el caso que la región que confiere resistencia al herbicida inmediatamente corriente debajo de estas es una enzima EPSPS o GOX. La expresión de traducción de las secuencias que codifican proteínas contenidas dentro del polinucleótido puede ser mejorada relativamente incluyendo secuencias 5" mejoradoras de traducción no traducibles de las regiones que codifican proteínas. El experto está muy familiarizado con tales secuencias de mejora, las cuales incluyen las secuencias derivadas de TMV conocidas como omega, omega prima, así como también otras secuencias deriables, inter alia, de las regiones 5' de las secuencias que codifican proteína de cubierta viral, tales como la del virus Tobbaco Etch . Puede ser deseable, con respecto a la expresión de secuencias de nucleótidos in plants,, modificar las secuencias que codifican proteínas conocidas capaces de conferir resistencia a herbicidas. Por consiguiente la invención incluye también un polinucleótido como se indica anteriormente, pero el cual es modificado en que se elimina el motivo de inestabilidad del ARNm y/o regiones fortuitas de eliminación de intrones, o se usan codones preferidos vegetales de tal forma que la expresión del polinucleótido modificado en una planta produce proteína sustancialmente similar que tiene una actividad/función sustancialmente similar a aquella obtenida por expresión del polinucleótido no modificado en el organismos en el cual las regiones que codifican proteínas del polinucleótido no modificado son endógenas, con la condición de que si el polinucleótido modificado de esta forma comprende codones vegetales preferidos, el grado de identidad entre las regiones que codifican la proteína dentro del polinucleótido modificado y regiones que codifican proteínas similares contenidas endógenamente dentro de la planta y que codifican sustancialmente la misma proteína sea menor a aproximadamente 70%. La invención además incluye un vector que comprende el polinucleótido. La invención todavía proporciona adicionalmente plantas las cuales comprenden por lo menos dos secuencias de nucleótidos que codifican proteínas capaces de conferir resistencia a por lo menos dos herbicidas y las cuales han sido regeneradas del material el cual ha sido transformado con el polinucleótido o vector de la invención. Las técnicas de transformación son bien conocidas e incluyen transformación mediada por partículas biolísticas, transformación mediada por Agrobacterium, transformación por protoplastos (opcionalmente en la presencia de polietilenglicoles); sonicación de tejidos vegetales, células o protoplastos en un medio que comprende el polinucleótido; microinserción del polinucleótido en material vegetal totipotente (opcionalmente, que emplea técnicas "batidoras" de carburo de silicio conocido) , electroporación y similares. Las plantas de inventiva transformadas incluyen cereales en grano, cultivos de semillas de aceite, plantas de fibra, frutas, vegetales, cultivos de plantaciones y árboles. Particularmente preferidas tales plantas incluyen frijol de soya, algodón, tabaco, remolacha, semilla de colza, cañóla, lino, girasol, papa, tomate, alfalfa, lechuga, maíz, trigo, sorgo, centeno, plátanos, cebada, avena, hierba artificial, forraje, caña de azúcar, chícharo, frijol de campo, arroz, pino, álamo, manzano, uva, plantas cítricas o de nuez y la progenie, semillas y partes de tales plantas. La invención todavía proporciona adicionalmente material vegetal que somprende secuencias de ácido nucleico que comprenden regiones que codifican por lo menos dos proteínas capaces de conferir al material resistencia a por lo menos dos herbicidas, con las condiciones de que el material que el material no contiene un polinucleótido el cual codifica una proteína de fusión que comprende solo una 5-enol-piruvil-3-fosfoshikimato sintetasa (EPSPS) y una glutationa S transferasa (GST) ; (ii) que el material no contenga un polinucleótido el cual comprenda solo regiones que codifican la superóxido dismutasa (SOD) y glutationa S transferasa (GST) ; y (iii) que el material no contenga un polinucleótido el cual comprende solo regiones que codifiquen GST y fosfinotricin acetil transferasa (PAT) ; y (iv) , que cuando la planta de la cual se deriva el material sea remolacha, los genes que confieren resistencia o tolerancia al herbicida los cuales esta comprende no sean solamente EPSPS y PAT. El material puede ser regenerado en plantas enteras fértiles morfológicamente normales, por medios conocidos por el experto. En una modalidad preferida del material, por lo menos una de las regiones codifica una proteína capaz de conferir resistencia a un herbicida del tipo pre emergencia, y por lo menos una de las regiones que codifica una proteína capaz de proporcionar resistencia a un herbicida del tipo post emergencia. Tales regiones que codifican proteína y herbicidas han sido discutidos anteriormente. El experto reconocerá que pueden estar presentes las regiones que confieren resistencia a herbicidas múltiples en plantas (o partes de las mismas) como una consecuencia del cruzamiento de una primera planta que comprende un polinucleótido que codifica una primera proteína capaz de conferir resistencia a un primer herbicida con una segunda planta la cul comprende un polinucleótido que codifica una segunda proteína capaz de conferir resistencia a un segundo herbicida (véase la parte experimental de la solicitud) . Son combinaciones preferidas de genes que confieren resistencia a herbicida (i) un gen HPPD y un gen EPSPS o GOX; (ii) un gen HPPD y un gen PAT; (iii) un gen GST y un gen EPSPS/GOX; (iv) un gen EPSPS/GOX y un gen PAT; (iv) un gen HPPD, un gen GQX y/o EPSPS, y un gen PAT; (v) un gen ACC"ase y un gen PAT y/o EPSPS; (vi) un gen PDS y un gen PAT y/o EPSPS y/o GOX; (vii) , el gen tfdA obtenible de Alcaligenes eutrophus y un gen EPSPS y/o GOX y/o PAT y/o PDS. Además cada una de estas combinaciones puede tener uno o más de los genes herbicidas reemplazados por un gen SOD, protox y/o ALS. Tales plantas se refieren en estas solicitud como plantas de la invención. La invención también incluye un método para controlar selectivamente hierbas en un campo que comprende hierbas y plantas de cultivo, en donde las plantas de cultivo comprenden (i) un polinucleótido que comprende por lo menos una primera región que codifica una primera proteína capaz de conferir en una planta, o tejido que lo comprende, resistencia o tolerancia a un primer herbicida, y una segunda región que codifica una segunda proteína similar capaz de conferir resistencia a un segundo herbicida, con las condiciones (i) que el polinucleótido no codifica una proteína de fusión que comprende solamente una 5-enol-piruvil-3-fosfoshikimato sintetasa (EPSPS) y una glutationa S transferasa (GST) ; (ii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifican la superóxido dismutasa (SOD) y glutationa S transferasa (GST) ; y (iii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifiquen GST y fosfinotricin acetil transferasa (PAT) ; y (iv) , que cuando la planta de cultivo sea remolacha, los genes que confieren resistencia o tolerancia a un herbicida que este comprende no sean únicamente EPSPS y PAT; el método que comprende aplicación al campo de por lo menos uno de los herbicidas en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmente las plantas de cultivo. Los genes que confieren resistencia al herbicida pueden estar presentes en polinucleótidos separados dentro de la planta. En un método preferido la planta contiene genes que codifican una enzima EPSPS y/o GOOX y una enzima HPPD, el método que comprende aplicación al campo del herbicida glifosato y una tricetona en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmente las plantas de cultivo. En una modalidad adicional del método, la planta contiene genes que codifican una enzima EPSPS y/o GOX y una fosfinotricinacetil transferasa, el método que comprende aplicación al campo de glifosato y glufosinato. En una modalidad adicional del método, la planta contiene genes que codifican una enzima EPSPS y/o GOX y una fosfinotricinacetil transferasa y una enzima HPPD, el método que comprende aplicación al campo de glifosato y glufosinato y un herbicida de tricetona. En una modalidad adicional del método, la planta contiene genes que codifican una enzima EPSPS y/o GOX y/o fosfinotricinacetil transferasa y una glutationa S transferasa, el método que comprende aplicación al campo de un glifosato y/o glufosinato y un herbicida de anilida tal como acetoclor, por ejemplo. En una modalidad adicional del método, la planta contien genes que codifican una enzima ACC'asa y un PAT y/o EPSPS, el método que comprende aplicación al campo de un herbicida del tipo fluazifop y glufosinato y/o glifosato. En una modalidad todavía adicional del método, la planta contiene genes que codifican el producto del gen tfd (opcionalmente codón optimizado) obtenibles de Alcaligenes eu trophus y una enzima EPSPS y/o GOX y/o PAT y/o PDS, el método que comprende aplicación al campo de 2,4 D y glifosato y/o glufosinato y/o un inhibidor de herbicida de la fitoeña desaturasa. Además cada una de estas combinaciones puede tener reemplazado uno o más de los genes de herbicida por un gen SOD, protox y/o ALS. En una modalidad particularmente preferida de este método de inventiva, se aplica una cantidad pesticidamente efectiva de uno o más de un insecticida, fungicida, bacteriocida, nematicida y antiviral al campo ya sea a?tes o después de la aplicación al campo de uno o más herbicidas. La presente invención además proporciona un método para producir plantas las cuales son sustancialmente tolerantes o sustancialmente resistentes a dos o más herbicidas, que comprende las etapas de : (i) transformar material vegetal con el polinucleótido o vector de la invención; (ii) seleccionar el material de esta forma transformado; y (iii) regenerar el material de esta forma seleccionado en plantas enteras fértiles morfológicamente normales. Las plantas de la invención pueden ser obtenidas opcionalmente por un proceso el cual implica transformación de un primer material vegetal con una primera secuencia que confiere resistencia a herbicida, y transformación de un segundo material vegetal con una segunda secuencia que confiere resistencia al herbicida, regeneración del material transformado de esta forma en plantas enteras fértiles y polinización cruzada de las plantas para resultar en progenie que comprende tanto el primer y segundo genes de resistencia a herbicida. Opcionalmente el primer y/o segundo material puede haber sido transformado anteriormente con polinucleótidos que comprende regiones que codifican uno o más de una proteína que confiere resistencia a un herbicida, una proteína insecticida, una proteína anti fúngica, una proteína anti viral, y/o proteína capaz de conferir a una planta tolerancia de desecación de la planta. La invención todavía proporciona adicionalmente el uso del polinucleótido o vector de la invención en la producción de tejidos vegetales y/o plantas enteras fértiles morfológicamente normales (i) las cuales son sustancialmente tolerantes o sustancialmente resistentes a dos o más herbicidas . La invención todavía además proporciona el uso del polinucleótido o vector de la invención en la producción de un objetivo herbicida para la examinación in vitro de alta productividad de herbicidas potenciales. Las regiones que codifican proteína del polinucleótido pueden ser expresadas heterólogamente en E. coli o levadura. La invención todavía además incluye tejido vegetal transformado con un polinucleótido que comprende la secuencia representada en SEq Id NO. 1 y que codifica una dioxigenasa. Este puede ser solo el gen que confiere resistencia al herbicida dentro del material. El material puede ser regenerado en plantas fértiles morfológicamente normales usando medios conocidos. En una modalidad particularmente preferida del tejido transformado, el polinucleótido el cual codifica una proteína que tiene una actividad sustancialmente similar a aquella codificada por la SEQ ID NO. 1, es complementaria a una la cual cuando se incuba a una temperatura de entre 60 y 65 °C en solución salina amortiguada con citrato concentrada 0.3 0.1% de SDS seguido por enjuagar en la misma temperatura con solución salina amortiguada con citrato concentrada que contiene 0.1% SDS todavía se hibridiza con la secuencia representada en SE Q ID NO. 1. La invención además será aparente de la siguiente descripción tomada en conjunto con las figuras asociadas y la lista de secuencias. La SEQ ID No. 1 muestra una secuencia de ADN, aislada de Synechocys tis sp, la cual codifica una enzima (representada como SEQ ID No. 2) que tiene la actividad de una ácido p-hidroxifenilpirúvico dioxigenasa . La SEQ ID No. 3 muestra una secuencia de ADN, aislada de Pseudomonas spp . 87/79, en la cual los nucleótidos 1217 a 2290 codifica una enzima (representada como SEQ ID No . 4) que tiene la actividad de una ácido p-hidroxifenilpirúvico dioxigenasa . Las SEQ ID No 5 y 6 representan una forma de los promotores de RCP sintéticos mínimamente redundantes (véase referencia a HPPD-P4 y HPPD-REV1 posterior) los cuales se usan para aislar SEQ ID No. 3 del genoma bacteriano. Las SEQ ID No . 7 y 8 son también promotores de RCP sintéticos los cuales se usan para modificar la secuencia SEQ ID No . 3 de tal forma que pueden ser incorporados en los vectores de transformación de planta deseada. La SEQ Id No. 9 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima EPSPS (incluyendo péptido de señal de cloroplasto) de la petunia. Las SEQ Id No. 10-32 son los promotores de RCP o polienlazadores los cuales se insertan en plásmidos restringidos para permitir la producción de construcciones que comprenden genes múltiples capaces de conferir resistencia a los herbicidas . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del clon que comprende la secuencia representada en la SEQ ID No . 3, en la cual se identifican las tres estructuras de lectura abiertas: la primera que inicia en el nucleótido 15 y que termina en el nucleótido 968; la segunda que inicia en el nucleótido 215 y que termina en el nucleótido 1066 y la tercera que inicia en el nucléotido 1217 y que termina en el nucleótido 2290 en la SEQ Id No. 3. La Figura también muestra los sitios de restricción contenidos dentro de la secuencia los cuales se maquinan por uso de los promotores designados como SEQ ID No. 7 y 8. La Figura 2 representa esquemáticamente la producción de un cásete de expresión vegeta que contiene 4 -HPPD en el cual se restringe el fragmento de ADN editado por RCP de la Figura 1 con las enzimas Ncol y Kpnl, después se liga en un vector (pMJBl) también restringido con Ncol y Kpnl. La Figura 3 es una representación esquemática que muestra cómo el vector binario de transformación vegetal pBin 19 es maquinado para contener el cásete de expresión 4 -HPPD de la Figura 2. La Figura 4 muestra un diagrama esquemático del clon que comprende la secuencia representada en la SEQ ID No . 1. La Figura 5 representa esquemáticamente la producción de un cásete de expresión vegetal que contiene 4 -HPPD en el cual se restringe un fragmento de ADN editado por RCP de la Figura 4 con las enzimas Ncol y Kpnl, después se liga en un vector (pMJBl) también restringido con Ncol y Kpnl. La Figura 6 muestra esquemáticamente la construcción de un vector de plásmido, usado en transformación con Agrobacterium y también incluye mapas de plásmidos pJRIRi upGST-27Bin; La Figura 7 muestra actividad de GST en tabaco transformado sometido a cuatro herbicidas. La Figura 8 es una gráfica que compara daña a plantas del tipo silvestre y una línea GST-27 después del tratamiento con metolaclor en 1400 g/ha por 3 semanas; La Figura 9 es un mapa del plásmido pDV3-pue; La Figura 10 es un mapa del plásmido pDV6-Bin; La Figura 11 es un mapa del plásmido pUB-1 que contiene el fragmento del promotor Ubiquitin PCRed del maíz, se clona un fragmento 2Kb en pUC19 y se secuencian las uniones para confirmar la presencia del promotor Ubiquitin; La Figura 12 es un mapa del plásmido pIE98; La Figura 13 es un mapa del plásmido pIGPAT; La Figura 14 es un mapa del plásmido pCATIO; La Figura 15 es un mapa del plásmido pCATll; La Figura 16 es un mapa del plásmido pPG16; La Figura 17 representa parte del plásmido pMVl . EJEMPLO 1 Clonación del gen 4-HPPD de Pseudomonas spp , transformación del gen en material vegetal y la producción de plantas resistentes a herbicidas de tricetona Es conocida la secuencia de aminoácidos de -HPPD purificado de Pseudomonas fl uorescens PJ-874, crecido en tirosina como la única fuente de carbono. (Ruetschi et al., Eur. J. Biochem 1992 202 (2) : 459-466) . Al usar esta secuencia se diseñan promotores de RCP mínimamente redundantes con los cuales se amplifican un segmento grande pero segmento incompleto del gen 4 -HPPD del ADN genómica de una cepa bacteriana diferente (cepa Pseudomonas fluorescente 87-79) . El experto reconoce que se entiende por el término "promotores mínimamente redundantes" , redundancia que está representado por corchetes en las secuencias representadas posteriormente. Se da un ejemplo de cada uno de los promotores respectivos (que corresponden a una ubicación 5" a 3" dentro del gen de HPPD) en cada una de las SEQ Id No. 3 y 4. Se diseña el promotor 1 (Seq ID No. 5) el cual es un 17 mer del conocimiento de la secuencia de aminoácidos 4-9 de la secuencia de proteína publicada (véase posteriormente) y el promotor 2 (SEQ ID No. 6) , similarmente un 17 mer, es diseñado de un conocimiento de residuos 334 a 339. El promotor 1 (HPPD-P4) tiene la secuencia 5"TA[T/C]GA[G/A]AA[T/C]CC[T/C/G/A] ATG GG y el promotor 2 (HPPD-REV1) tienen la secuencia 'GC[T/C]TT[G/A]AA[G/A]TT[T/C/G/A]CC[T/CjTC. Se preparan 100 ng de ADN genómica de Pseudomonas 87-79 usando protocolos estándar y se mezclan con 100 pmol de cada promotor. La mezcla se amplifica por RCP (35 ciclos) usando una Taq polimerasa y otros reactivos estándar bajo la siguiente síntesis de ADN y condiciones de disociación: 94°C x 1.5 min 55°C x 2 min 74°C x 3 min El fragmento amplificado comprende una región que contiene 3 codones del extremo 5 " , y aproximadamente 30 cadones del extremo 3" de la región de codificación del gen 4HPPD. El producto de RCP es clonado con extremo romo en el vector de reordenamiento pGEM3Z-f (+) usando procedimientos estándar. La secuenciación parcial confirma que el fragmento RCP clonado es 4 -HPPD específico. La secuencia amino derivada contiene varias discrepancias comparadas con la secuencia publicada con respecto de la enzima Pseudomonas fluorescens PJ-874. Este fragmento parcial del gen 4 -HPPD da señales de hibridización negativas en análisis Southern blots genómico en ADN vegetal bajo condiciones de baja hibridización/lavado severas. Se escinde un fragmento de 900 pb EcoRl/EcoRl del centro del gen parcial previamente clonado para usar com,o una sonda. Se hibridizan Southern blots, usando una variedad de enzimas para restringir el ADN genómico, con el fragmento radiomarcado . El ADN restringido con Bell da una banda positiva simple de aproximadamente 2.5 kb la cual es suficiente para contener el gen entero mas regiones de flanqueo de ADN no traducido. Se restringe el ADN genómico con Bell y se lleva a electroforesis en un gel de agarosa preparativo. La región de fragmentos que contienen ADN digerido en el intervalo de rango 2 - 3 Kb se corta y se electroeluye el ADN. Se clona el ADN recuperado en el sitio BamHl (el cual es compatible con Bel 1) de pUC18. Se sondean las colonias blot con un fragmento de 900 pb y se aislan 12 positivas. Se hacen minipreparaciones de estas, y se cortan con EcoRl para observar la banda 900 p.b. de diagnóstico. De las 12 colonias, 7 forman un pigmento café cuando se hace crecer durante la noche en LB para hacer las minipreparaciones, 5 de estas son positivas para la banda de 900 p.b, las otras 5 minipreparaciones son negativas y no producen el pigmento café. La formación del "pigmento café" se asocia con la expresión heteróloga de un gen 4 -HPPD. El análisis de restricción muestra que el inserto clonado tiene 2.5 kb de longitud con aproximadamente ADN de 1.2 kb corriente arriba del gen 4 -HPPD y 400 p.b. corriente abajo. Los extremos del gen son secuenciados usando promotores apropiados y promotores de pUC18. Tal secuenciación prueba que el gen esté intacto y presente en ambas orientaciones con respecto al sitio polienlazador pUC18. SDS-PAGE en lisados celulares bacterianos muestra que está presente una nueva proteína con un tamaño de 40 kDa, lo cual es correcto para un 4 -HPPD. Está presente una banda grande en extractos de células que tienen el gen insertado en una primera orientación de tal forma que se expresa el gen del promotor lac en el vector. No es obviamente visible ninguna banda de 40 kD cuando se obtiene el lisado de las células en las cuales el gen está en la orientación opuesta, aunque ambos clones producen el pigmento café sugiriendo la presencia de la proteína activa en ambos tipos de células. La proteína recombinante de 40 kDa está presente en la fracción de proteína soluble más que la insoluble. El clon en el cual el gen está en la segunda orientación se somete a análisis de secuencia de ADN automatizada para revelar la secuencia representada en SEQ ID No. 3. Esta secuencia es editada para introducir varios sitios de restricción únicos para faciliatr su ensamble en un vector adecuado para trabajar la transformación vegetal. Los pligonucleótidos de edición, los cuales se representan en SEQ Id No. 7 y 8 son los promotores (HPPDSYN1) 5 " -GTTAGGTACCAGTCTAGACTGACCATGGCCGACCAATACGAAAACC-3' y el promotor 4 (HPPDSYN2 ) 5 "TAGCGGTACCTGATCACCCGGGTTATTAGTCGGTGGTCAGTAC-3 " - Expresión del gen 4 -HPPD de Pseudomonas en tabaca transgénico Se restringe el ADN editado por RCP con las enzimas Ncol y Kpnl, después se liga en un vector (pMJBl) también restringido con Ncol y Kpnl . PMJB es un plásmido derivado de pUC19 el cual contiene el promotor CaMV35S doble; un mejorador omega TMV y el terminador de transcripción NOS. Se muestra una representación esquemática del plásmido resultante en la Figura 2. Todas las manipulaciones de ADN usan protocolos estándar conocidos por el hombre experto en la técnica de biología molecular vegeta. Se aisla ADN voluminoso y se escinde el cásete de expresión 4-HPPD (es decir de 2x35S al terminador nos 3 " ) , por una EcoRl de restricción parcial y después se somete a restricción completa con Hind3. Esto es parar evitar cortar en el sitio EcoRl dentro del gen 4 -HPPD. Después de la electroforesis en gel de agarosa, se recupera el fragmento de ADN requerido por electro elución. Se liga entonces el cásete de expresión 4 -HPPD en el vector binario pBin restringido con Hind3 y EcoRl . Se muestra la estructura del plásmido resultante esquemáticamente en la Figura 3. Se aisla y se usa el ADN para transformar LBA44Q4 de Agrobacterium tumefaciens para resistencia a kanamicina otra vez usando procedimientos estándar. Discos/rebanadas de hojas de Nicotiana plumbaginifolia var Samsun se someten a transformación mediada por Agrobacterium usando procedimientos estándar. Los retoños transformados son regenerados de. los callos resistentes a Kanamicina. Se llevan los brotes a agar MS que contiene kanamicina. Las explantas sembradas sobrevivientes son cultivadas para proporcionar 80 plantas de tabaco transformadas resistentes a kanamicina. Se verifica la presencia del gen 4-HPPD (usando promotores EDIT pre existentes) por RCP. Aproximadamente 60 plantas son positivas a RCP. Se colocan las explantas (es decir una hoja mas un segmento corto del tallo que contiene el brote axilar) en agar MS (+3% de sacarosa) que contiene varias concentraciones de ZA1206 (un herbicida de tricetona) de 0.02 a 3 ppm. Las explantas de tabaco no transformadas son totalmente blanqueadas en 0.02 ppm. Las mismas no se recuperan después de la exposición prolongada al herbicida. En estos experimentos particulares, solo el retoño que se desarrolla del brote es blanqueado, la hoja en el tejido explantado permanece verde. Aproximadamente 30 de las plantas transformadas RCP+ve toleran 0.1 ppm de ZA1296 (aproximadamente 5x el µivel el cual provoca síntomas en el tabaco del tipo silvestre) sin indicación de blanqueamiento. Las mismas crecen normalmente y son fenotípicamente indistinguibles de las plantas no transformadas. Un sub grupo de las transformantes es tolerante a 0.2 ppm y una cuantas transformantes toleran concentraciones de hasta 0.5 - 1 ppm. Otra vez estas plantas parecen normales y retoñan bien en la presente del herbicida. Algunas de las plantas transformadas pueden ser blanqueadas inicialmente cuando se someten al herbicida en las concentraciones más altas, pero en exposición prolongada son progresivamente "verdes" y se "recuperan" . Se trata un sub grupo de las plantas transgénicas resistentes a herbicida Isoxaflutol [5-ciclopropil-4- (2-metilsulfonil-4-trifluorometilbenzoil) isoxazol o RPA 210772]. Tales plantas son incluso más resistentes a este herbicida que cuando lo son designadas como ZA1296 indicando de esta forma claramente que las plantas tiene resistencia cruzada a clases múltiples del inhibidor 4 -HPPD. EJEMPLO 2 Clonación del gen 4-HPPD de Synechocystis en material vegetal y regeneración del material para producir plantas resistentes a herbicida de tricetona El genoma de Synechocystis sp, PCC6803 ha sido secuenciado. Con el fin de introducir sitios de restricción únicos para facilitar su ensamble en un vector adecuado para trabajo de transformación vegetal se prepara 100 ng de ADN genómico de Synechocys tis sp . Usando protocolos estándar y se mezcla con 100 pmoles de dos promotores adecuados para la amplificación por RCP (35 ciclos) de la secuencia especificada en SEQ ID No. 1, usando una ADN polimerasa termoestable preferiblemente con actividad de lectura de prueba y otros reactivos estándar bajo síntesis de ADN apropiada y condiciones de disociación, lo siguiente que es típico: 94°C x 1.5 min 55°C x 2 min 74°c x 3 min El fragmento amplificado comprende una región que contiene la región de codificación del gen 4 -HPPD. El producto de RCP es clonado en extremo romo en un vector de reorganización estándar, tal como, por ejemplo, pGEM3Z-f (+) usando procedimientos estándar. El análisis de secuencia de ADN automatizado confirma que el producto de RCP clonado es 4 -HPPD específico. Algunas de las colonias transformadas que alojan el gen 4 -HPPD clonado forman un pigmento café cuando se hacen crecer durante la noche en L.B. La formación del "pigmento café" se asocia con la expresión heteróloga de un gen 4-HPPD (Denoya et al 1994 J. Bacteriol. 176:5312-5319). SPS-PAGE en lisados celulares bacteriales muestra que contienen una nueva proteína que tiene el peso molecular esperado para el producto de gen 4 -HPPD. En una modalidad preferida la proteína recombinante está ya sea presente en la fracción de proteína soluble más que insoluble, o es manipulado para estar presente. El clon se somete preferiblemente a análisis de secuencia de ADN automatizada para confirmar la ausencia de artefactos derivados de RCP. Expresión heteróloga del gen 4-HHPP Synechocystis sp. PCC6803 en E. coli Se restringe el fragmento de ADN editado por RCP con enzimas adecuadas tales como Ncol y Kpnl, por ejemplo después se liga en un vector de expresión de E. coli (tal como la serie pET conocida) apropiadamente restringido. Todas las manipulaciones de ADN usan protocolos estándar conocidos por el experto en la técnica de biología molecular. Cepas huésped adecuadas tales como BL21 (DE3) u otros lisogenos DE3 que alojan el vector expresan cantidades de la enzima HPPD suficiente para proporcionar su uso en concentración a través de evaluación de entrada para identificar inhibidores 4 -HPPD alternativos. Puede ser usada HPPD purificada de la cepa huésped transformada en la provisión de antisuero para el análisis de plantas transformadas con un polinucleótido que codifica 4 -HPPD. Expresión heteróloga del gen 4-HPPD de Synechocystis sp . en plantas transgénicas. El ADN editado por RCP es restringido con enzimas adecuadas tales como Ncol y Kpnl, por ejemplo después se liga en un vector de alojamiento adecuado, tal como pMHBl, para generar un cásete de expresión el cual contiene un promotor operable apropiado y terminador. PMJBl es un plásmido derivado de pUC19 el cual contiene el promotor CaMV35S doble; un incrementador omega TMV y el terminador de transcripción nos. Se muestra una representación esquemática del plásmido resultante en la Figura 4. Se liga entonces el cásete de expresión 4 -HPPD en el vector binario pBinl9 restringido con Hind3 y EcoRl. Se muestra la estructura del plásmido resultante esquemáticamente en la Figura 5. Se aisla el ADN y se usa para transformar LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens para resistencia a kanamicina otra vez usando procedimientos estándar. Se somete el tejido de papa y tomate a transformación mediada por Agrobacterium usando procedimientos estándar. Se regeneran brotes transformados de callo resistente a kanamicina. Se llevan los brotes a agar MS que contiene kanamicina. Las explantas en brote sobrevivientes son cultivadas para proporcionar 80 plantas de tabaco transformadas resistentes a kanamicina. Se verifica la presencia del gen 4 -HPPD (usando promotores EDIT pre existentes) por RCP. Se selecciona un número sustancial de plantas positivas a RCP por análisis adicional. Se colocan las explantas (es decir una hoja mas un segmento corto del tallo que contiene el brote axilar) en agar MS (+3% de sacarosa) que contiene varias concentraciones de ZA1206 (un herbicida de tricetona) de 0.02 a 3 ppm. Las explantas de tabaco no transformadas son totalmente blanqueadas en 0.02 ppm. Las mismas no se recuperan después de la exposición prolongada al herbicida. En estos experimentos particulares, solo el retoño que se desarrolla del brote es blanqueado, la hoja en el tejido explantado permanece verde. Aproximadamente 30 de las plantas transformadas RCP+ve toleran 0.1 ppm de ZA1296 (aproximadamente 5x el nivel el cual provoca síntomas en el tabaco del tipo silvestre) sin indicación de blanqueamiento. Las mismas crecen normalmente y son fenotípicamente indistinguibles de las plantas no transformadas. Un sub grupo de las transformantes es tolerante a 0.2 ppm y una cuantas transformantes toleran concentraciones de hasta 0.5 - 1 ppm. Otra vez estas plantas parecen normales y retoñan bien en la presente del herbicida. Algunas de las plantas transformadas pueden ser blanqueadas inicialmente cuando se someten al herbicida en las concentraciones más altas, pero en exposición prolongada son progresivamente "verdes" y se "recuperan" . Se trata un sub grupo de las plantas transgénicas resistentes a herbicida Isoxaflutol [5-ciclopropil-4 - (2-metilsulfonil-4-trifluorometilbenzoil) isoxazol o RPA 210772] . Tales plantas son incluso más resistentes a este herbicida que cuando lo son designadas como ZA1296 indicando de esta forma claramente que las plantas tiene resistencia cruzada a clases múltiples del inhibidor 4 -HPPD.

EJEMPLO 3 Clonación del gen GST en material vegetal y la generación de plantas resistentes a herbicida tipo anilida y difeniléter Plantas Se mantiene provisiones de Nicotiana tabacum en medio Musharige y Skoog ('medio MS : sales MS (4.6 g/1) complementado con 3% de sacarosa y 0.8% de Bactoagar, pH 5.9) .

Se hacen crecer estas plantas, explantas para el ensayo de retoño y las semillas para las pruebas de germinación en cultivo ambiente a 25°C con 16 horas de luz. Cuando se hace crecer en invernadero, las plantas se transfieren en composta (composta John Innes número 3, productos Minster Brand) . Cepas bacterianas cepa Escherichia coli DH5 (GIBCO BRL), es: F, 80 dlacZ M15, (lacZYAargF) U169 , deoR, recAl, endAl, hsdR17 (r"?, m+?) , supE44, thi-gyrA96relAl . Se usa la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens, para transformar hojas de tabaco. Plásmidos Se inserta ADN de GST-27 en pBluescript® II SK (+/-) fagémido designado pIJ21-3A (Jepson et al 1994) de 2.961 kb. PJRIRi es un plásmido de 12.6 kb . El plásmido pJRIRi contiene un marcador resistente a kanamicina bacteriano (KAN) . Este posee las dos secuencias repetitivas de 25 p.b. : los bordes derecha (RB) y el izquierdo (LB) . El T-DNA contiene un gen marcador rsistente a kanamicina accionado por el promotor NOS. La secuencia que codifica la proteína GST-27 se expresa bajo el control del promotor CaMV 35S.

Marcadores de tamaño : se usa una hélice de ADN 1 kb como un marcador de ADN (Bethesda Research Laboratories Life Technologies, Inc) cuando se checan productos de digestiones y RCP (reacción' de cadena polimerasa) en un gel de agarosa. Los marcadores de peso molecular de proteína Rainbo (Amersham) se cargan en geles de poliacrilamida para los análisis Wegtern, como se conoce por el experto. Químicos los ingredientes activos acetoclor, alaclor y metolaclor se producen en ZENECA Agrochemicals (UK) , Jealott's Research Station. Se formulan los ingredientes técnicos en etanol y se usan en el ensayo de HPLC, el ensayo de retoño y la prueba de germinación (véase posteriormente) . Construcción del plásmido El plásmido pIJ21-3A que contiene el gen de ADN de GST-27 se digiere por la enzima de restricción EcoRl (Pharmacia) en amortiguador 1 x Tris acetato (TA) . Se checan las digestiones en el gel de agarosa 0.8%. Se ligan los fragmentos digeridos EcoRl en el sitio Sma 1 (Pharmacia) de pJRIRi (Figura 6) después de llenar los extremos de proyección con la Klenow ADN polimerasa (Pharmacia) . La enzima de ternera alcalina fosfatasa (C.A.P.) evita la autoligación de pJRIRi antes de la ligación del gen GST. Se transforman las células de E. coli competentes (DH5) con el plásmido por un método de choque por calor. Se hacen crecer las placas L-agar y kanamicina. Se checan las colonias positivas por RCP o por hibridización durante la noche a 42°C con sondas marcadas (a-32P dNTP) . Se define la temperatura de fusión (Tm) de las sondas agregando 2°C por cada A o T y 4°C por cada G o C. Se realiza la reacción en Tm-5 más baja con la Taq polimerasa (Ampli-Taq ADN polimerasa, Perkin Elmer Cetus) de acuerdo a los protocolos del fabricante. Se fijan las condiciones de RCP por 35 ciclos como a continuación: desnaturalización de ADN a 94 °C por 48 segundos, destemplado en la Tm más baja por 1 minuto y extesnión a 72 °C por 2.5 minµtos . Antes del primer ciclo, la reacción inicia a 85°C. Se eligen ocho colonias positivas y se hacen crecer a 37°C en un caldo L en agitación durante la noche y cultivo de kanamicina. Se extrae el ADN de este cultivo celular y después se purifica de una ultracentrifugación a 50,000 rpm en un gradiente de CsCl . Se checa la orientación del inserto en pJRIRi secuenciando la región entre el promotor 35S y el gen GST, de acuerdo al método Sanger, usando la Sequenase® (versión 2.0, United States Biochemical Corporation) siguiendo los protocolos del fabricante. Se introduce el plásmido resultante (pGST-27Bin) (Figura 6) en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens , usando el método de congelación descongelación descrito por Hostlers et al. 1987. Transformación de hojas por Asrobacterium Se realiza la transformación de pGST-27Bin en tabaco de acuerdo al método descrito por Bevan 1984. Se usan cultivo estéril de 3-4 semanas de edad de tabaco (Nicotiana tabacum var Samsum) , se hace crecer en MS para la transformación. Se incuban las hojas en medio NBM (medio MS complementado con 1 mg/l de 6-bencilaminopurina (6-BAP) , 0.1 mg/l de ácido naftalenacético (ANA) ) y kanamicina por 1 día. Este medio permite el crecimiento de retoño de la hoja. Un día posterior, se cortan los bordes de las hojas y se deja cortar en piezas. Después se incuba con las células transformadas de Agrobacterium, que contiene el plásmido pJRIRI con el inserto (pGST-27pin) , suspensión (cepa LA 4404) por 20 minutos. Se regresan las piezas a las platas que contienen el medio NBM después de esto. Después de 2 días, se transfieren las explantas a macetas de cultivo que contiene el medio NBM complementado con carbenicilina (500 mg/l) y kanamicina (100 mg/l) . Cinco semanas después, se transfiere 1 retoño por disco de hoja en medio de NBM complementado con carbenicilina (200 mg/l) y kanamicina (100 mg/l) . Después de 2-3 semanas, se transfieren los retoños con brotes a medio fresco. Se transfieren 2 cortes de cada retoño a macetas separadas. Una se mantiene como una provisión de cultivo de tejido, la otra se transfiere a tierra para crecimiento en el invernadero después del retoño. Se transfieren 42 transformantes independientes que portan la construcción GST-27 al invernadero. Extracción de ADN de hoja por reacciones de RCP Se verifica la presencia del transgen en los transformantes putativos por RCP. Se toman las muestras de hoja de plantas de 3-4 semanas de edad crecidas en condiciones estériles. Se crecen los discos de hoja de aproximadamente 5 mm en diámetro por 30 segundos en 200 µl de amortiguador de extracción (sulfato de dodecil sódico 0.5%), 250 nM NaCl , 100 mM Tris HCl (pH 8). Se centrifugan las muestras por 5 minutos a 13,0Q0 rpm y después de esto se agrega 150 µl de isopropanol al mismo volumen de la capa superior. Las muestras se dejan en hielo por 10 minutos, se centrifuga por 10 minutos a 13,000 rpm y se deja secar. Después se vuelven a resuspender en 100 µl de agua deionizada, 15 µl de la cual se usa para la reacción de RCP. Se realiza la RCP usando las condiciones descritas por Jepson et al. (1991) . Se analizan las plantas transformadas con ADN GST-27 con el promotor GST II/7 (AACAAGGTGGCGCAGTT) (SEQ ID NQ . 10) específico a la región 3 " de la región GST-27 y NOS 3 (CATCGCAAGACCGGCAACAG) (SEQ ID No. 11) específico para el terminador NOS. 39 de - los 42 transformantes primarios proporcionan un fragmento de 310 p.b. por RCP. Análisis Western blot Para verificar la expresión heteróloga de GST-27 en tabaco se realiza el análisis Western blot. Se hacen crecer 120 mg de hoja de plantas de 3-4 semanas de edad crecidas en condiciones estériles a 4°C en 0.06 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) para absorber compuestos fenólicos y en 0.5 ml de amortiguador de extracción (1 M Tris HCl, 0.5 M EDTA (etilendiamintetraacetato) , 5 mM DTT (ditiotretitol) , pH 7.8) . Se agrega entonces 200 µl adicionales de amortiguador de extracción. Se mezclan las muestras y después se centrifuga por 15 minutos a 4°C. Se elimina el sobrenadante, la concentración de proteína que es estimada por ensayo Bradford usando BSA como el estándar. Se mantiene las muestras a -70°C hasta que se requiera. Se cargan las muestras de 5 µg de proteína con 33% de tinte Laemmli (v/v) (amortiguador de Laemmli 97.5% (62.5 mM Tris HCl, 10% (p/v) de sacarosa, 2% de p/v SDS, pH 6.8), 1.5% de pironina y y 1% de mercaptoetanol) en gel de SDS poliacrilamida (17.7%, 30:0.174 acrilamida :bisacrilamida) , después de 2 minutos de ebullición Se separan los extractos de proteína electroforéticamente en el siguiente amortiguador (14.4% p/v de glicina, 1% de p/v SDS, 3% p/v Tris Base) . Después se transfieren en nitrocelulosa (Hybond-C, Amersham) usando un procedimiento de electroblotting (unidad Biorad) en el siguiente amortiguador de blotting (14.4% p/v de glicina, 3% p/v Tris Base, 0.2% p/v SDS, 20% v/v metanol) a 40 mV durante la noche. Se checan cargas iguales de proteínas teniendo la nitrocelulosa recientemente en blotting en 0.05% de CPTS (ácido tetrasulfónico ftalocianina cobre, sal de tetrasodio) y 12 mM HCl. Se destiñen las pruebas blot por 2-3 enjuagues en una solución de 12 mM HCl y se elimina el exceso de tinte por solución de 0.5 M NaHC03 por 5-10 minutos seguido por enjuagues en agua deionizada. Se bloquean los filtros por 1 hora con TBS-Tween (2.42%, p/v Tris HCl, 8% p/v NaCl, 5% Tween 20 (polixietilensorbitan monolaurato), pH 7.6) que contiene 5% p/v BSA. Se lavan los mismos por 20 minutos en TBS-Tween complementado con 2% p/v BSA. Se realizan las inmunodetecciones indirectas con una dilución 1:1000 de un antisuero anti borrego de conejo como segundo anticuerpo, asociado con la peroxidasa de rábano (HRP) . Se lava cualquier exceso del antisuero con TBS-Tween complementado con 2% de p/v BSA. Se realiza la detección ECL (quimioluminiscencia incrementada) usando los protocolos descritos por Amersham. Se elimina cualquier fondo por lavados adicionales de las membranas en la solución mencionada anteriormente. Se realiza la estimación del nivel de expresión del gen GST en el densitómetro de láser Ultroscan XL LKB 2222-020 (Pharmacia) . El análisis Western revela que 8 de los transformantes primarios positivos RCP no muestran expresión de GST-27 detectable. Los restantes 31 muestran niveles de expresión que varían de insignificantemente detectables a altos niveles que igualan a 1% de la proteína soluble total como se determina de las señales detectadas con muestras GST II de maíz puro . Análisis Southern blot Se verifica el patrón de integración de transgenes por análisis Southern blot. Se comprimen 2.5 g de hoja de tabaco fresco tomada de plantas crecidas en invernadero, colocada en bolsa plástica que contiene 0.75 ml de amortiguador de extracción (0.35 M sorbitol, 0.1 M Tris HCl, 0.005 M EDTA, 0.02 M metabisulfito de sodio, pH 7.5), colocando a través de rodillos de una "máquina de pasta" . Se centrifugan los extractos extraídos por 5 minutos a 6000 rpm a temperatura ambiente. Después de descargar el sobrenadante, se vuelve a suspender el granulo en 300 µl de amortiguador de extracción y 300 µl de amortiguador de lisis de núcleos (2% p/v CTAB), 0.2 M Tris HCl, 0.05 M EDTA, 2 M NaCl , pH 7.5) . Se agrega 120 µ de 5% de Sarkosyl y se colocan las muestras en un baño de agua de 65°C por 15 minutos. Se centrifugan los extractos por 5 minutos a 6000 rpm agregando después 600 µl 24:1 cloroformo : alcohol isoamílico. Se agrega 700 µl de isopropanol en el mismo volumen del sobrenadante y se centrifuga por 10 minutos a 13,000 rpm. Se lava entonces el granulo con etanol al 70% y se deja secar al aire. Se deja el granulo durante la noche a 4°C en 30 µl TE (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA) para resuspender. Se mantienen las muestras a 20°C hasta que se requiera. Se digiera ADN de hoja total por 6 horas a 37°C con las siguientes enzimas de restricción Sacl y Xbal en amortiguador 1 x Phor-one-all (Tris acetato 20 mM, acetato de magnesio 20 mM, acetato de potasio 100 mM, Pharmacia) para los extractos de las plantas que contienen el gen GST-27. Se fracciona el ADN en un gel de agarosa 0.8%, desnaturalizado agitando suavemente en 0.5 M NaOH, 1.5 NaCl por 30 minutos y se neutraliza el gen agitando en Tris HCl 0.5 M, NaCl 1.5 M por 75 minutos. Después se transfiere el ADN en Hybond-N (Amersham) membrana de nylon por blotting capilar en 20 x SSC (3 M NaCl, 0.3 M citrato de Na3) . Se fija el ADN a membranas usando una combinación de enlace de estrato UV (Stratagene) y horneando por 20 minutos a 80 °C. Se escinden las sondas de plásr?idos, usadas para transformación de Agrobacterium, que contienen el gen GST-27 por digestión con EcoRI . Se marca la sonda con a-32 P dNTP (3,000 Ci/mM) usando el equipo Prime-a-Gene (Promega), protocolo de promoción aleatoria descrito por Feinberg y Vogelstein. Se preparan los controles positivos por digestión de pIJ21-3a con Sacl y EcoRI . Se realizan las prehibridizaciones en 5 x SSPE (NaCl 0.9 M, fosfato de sodio 0.05 M, EDTA 0.005 M, pH 7.7). SDS 0.5%, Marvel 1% p/v (polvo de leche seca), 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado por 3-4 horas a 65°C. Se realizan las hibridizaciones en el mismo amortiguador pero sin el último ingrediente. Se lavan las membranas por 30 minutos a 65°C en 3 x SSC, 0.5% de SDS, y dos veces en 1 x SSC, 0.1% de SDS por 20 minutos antes de la autoradiografía a -70 °C. Ensayo de HPLC Para verificar las plantas que expresan GST-27 que muestran actividad de GST contra substratos de herbicidas se realiza un ensayo de herbicida in vitro usando HPLC. Se toma 1 g de tejido de hoja de plantas de tabaco floreciendo de 3-4 meses de edad creciendo en el invernadero, y se hace crecer en nitrógeno líquido y 7 ml de amortiguador de extracción (50 mM glicilglicina, 0.5 Mm edta, 1 Mm dtt, Ph 7.5) . Se transfieren extractos a tubos de centrífuga que contienen 0.1 g de PVPP y se centrifuga a 16,500 rpm por 30 minutos a 4o. Se carga 2.5 ml del sobrenadante en una columna de Sephadez G-25 (PD10) (Pharmacia) y se eluye con 3.5 ml de amortiguador de osfato de sodio (50 mM, pH 7.0) que contiene EDTA 1 mM y 1 mM DTT. Se realiza la estimación de la proteína por el método Bradford usando BSA como el estándar. Se dividen los extractos en alícuotas y se mantienen a -70 °C hasta que se requiera. Se realizan ensayos HPLC en una columna de Spherisorb 5 µ ODS2 (25 cm*4.6 mm d. I. Fabricante: Hichrom) usando fase móvil de ácido fosfórico acuoso al 1%: acetonitrilo 35:65 en la proporción de 1.5 ml/min. Se realiza la detección de los compuestos en un detector UV LC-6a Schimadzu (longitud de onda 200 nm) . Se realizan las reacciones en viales de HPLC de 0.8 ml a temperatura ambiente (20-25°C) . Se agregan 15-94% en volumen del extracto vegetal al amortiguador de fosfato de sodio (pH 7) , 5 mM glutationa o homoglutationa y 2 ó 20 ppm del compuesto (2 ppm para fluorodifen, 20 ppm por acetoclor, alaclor y metolaclor) . Se fijan también los controles en las mismas proporciones pero los extractos se reemplazan por el amortiguador de fosfato de sodio. Se inician las reacciones por adición del herbicida usado como un substrato. Se monitorea la reactividad del compuesto por un máximo de 9-19 horas. Se calculan los tiempos de retención específicos y áreas del pico por el paquete de sistema de datos JCL 600 de cromatografía (Jones chromatography) . Se miden el área del pico en HPLC contra perfiles de tiempo, en base a 7-11 puntos de tiempo, para cada compuesto. Se obtiene los datos constantes de vida media y pseudo de primer orden de fijaciones exponenciales de área de pico corregido contra datos de tiempo. Se masterizan estos datos con la versión del paquete FIT 2.01. Usando la metodología descrita anteriormente, se ensaya la actividad de GST de las plantas transformadas contra diferentes substratos de herbicidas. Estos herbicidas consisten de 3 dicloroacetanilidas (acetoclor, alaclor, metolaclor) y difenil éter (fluorodifen) . Se conocen estos químicos para ser conjugados a glutationa, en particular dicloroacetanilidas. Se realizan las extracciones en la presencia de PVPP y a una temperatura baja para limitar la desnaturalización de proteínas. Estudios en la estabilidad de GST muestran que la actividad GST de maíz se reduce por 73% en extractos sin purificar cuando se almacenan a -20 °C. Por lo tanto se decide dividir extractos en alícuotas. Las mismas se mantienen a - 70 °C hasta que se requiera. Se descongela cada muestra solo una vez, durante la noche en hielo. Se realiza el ensayo dentro de 2 semanas después de la extracción.

Se fijan las concentraciones del herbicida en los viales de HPLC de acuerdo a sus límites de solubilidad. Se ensayan el acetoclor, alaclor y metolaclor a 20 ppm y fluorodifen a 2 ppm. Se corre el ensayo por 9-19 horas de acuerdo a la reactividad del herbicida. Se ensaya el metolaclor por un periodo grande de teimpo, ya que su vida media es alta bajo estas condiciones. Se realiza la detección de los compuestos en un detector UV a 200 ppm. Se monitorean tiempos de retención específicos y área de picos para el herbicida. Se calcula la actividad GST en la base de 7-11 puntos de tiempo. La conjugación enzimática sigue una curva disminuida exponencial. Se usa la disminución del área de pico del herbicida ensayado para el cálculo de la actividad de GST. Se calculan también la vida media y la velocidad de primer orden constate. Se ensayan las líneas de cinco tabacos incluyendo líneas del tipo silvestre de 4-GST-27 (control negativo) 5, 6, 12 y 17. Las mismas se eligen debido a su alta expresión como se determina por análisis western. Para limitar cualquier conjugación rápida antes del monitoreado, se agrega por último el herbicida. Se ensaya también la línea 17 GST-27 por conjugación del acetoclor a homoglutatina. Se reportan los resultados en la Figura 7 y muestran que las plantas que expresan GST-27 exhiben actividad contra herbicidas de cloroacetanilida in vitro.

En resumen: pueden ser distinguidas plantas de tabaco transgénicas que expresan la proteína GST-27 y estas plantas por sus actividades relativas in vitro contra substratos de herbicida. Análisis in vivo - ensayo de enraizamiento las líneas GST-27 tienen actividad significativa in vitro contra por lo menos 3 cloroacetanilidas . Por otra parte, la mayoría de los herbicidas de esta clase son conocidos para inhibir la elongación de raíz. Por lo tanto, se decide hacer una prueba de enraizamiento en acetoclor, alaclor y metolaclor. Se hace un experimento piloto para encontrar las concentraciones más efectivas. Se elige un intervalo de 7 concentraciones: 0, 1, 5, 10, 20, 40 y 100 ppm. Se prueban dos líneas transformadas (GST-27 líneas 6 y 17) y un tabaco del tipo silvestre en alaclor. Se eligen las líneas 6 y 17 ya que representan las plantas de expresión más baja y más alta, en base al análisis western blot. Se transfieren tres explantas, que consisten de una hoja unida a una pieza de brote a medio MS complementado con el herbicida. Se observa el crecimiento de raíz después de 2 semanas (Figura 8) . En el aspecto general de las plantas, es observable un efecto del herbicida en el tipo silvestre de la concentración 1 ppm, las hojas son más amarillas y más pequeñas. Con el incremento de las concentraciones, estos efectos son mayores y se reduce el número de hojas nuevas. De 10 ppm, las plantas no producen hojas nuevas. En contraste, con respecto a las líneas transformadas, es observable el efecto del herbicida de la concentración 20 ppm para la línea 2 y 40 ppm para línea 6. Entre estas concentraciones, las hojas parecen más pequeras y su número ligeramente reducido, pero todavía son verdes. Segundo, el tipo silvestre produce algunas raíces hasta 5 ppm, pero su longitud disminuye dramáticamente entre las concentraciones 0 y 5 ppm. Con respecto a las líneas 2 y 6, las raíces son respectivamente producidas hasta 10 ppm y 20 ppm, con la disminución de su longitud para concentración inferior. Bajo estas condiciones y después de 2 semanas, es notable que la concentración que limita en enraizamiento esté entre 20 y 40 ppm para la "mejor" línea probada en esta etapa de este experimento . Se realiza un experimento subsecuente para un 4 GST- 27 tipo silvestre (control) , (líneas 5, 6, 12 y 17) . Se ensayan estas plantas en acetoclor, alaclor y metolaclor en las proporciones siguientes: 0, 10, 20, 40 ppm para el acetoclor y metolaclor mencionado como herbicida, y 0, 20, 40, 100 ppm para alaclor. Se eligen estas concentraciones ya que en HPLC las plantas muestran la actividad más baja contra el acetoclor y metolaclor. Se usan las mismas condiciones: 3 explantas por concentración y por línea transferida en medio MS complementado con herbicida. Se toman las observaciones del crecimiento de raíz 3 semanas después de iniciar el ensayo.

Como para el experimento piloto la respuesta de la explanta en cada maceta es generalmente uniforme. En acetoclor, las explantas del tipo silvestre o muestran ningún enraizamiento o cualquier producción de hojas nuevas en la presencia del herbicida. Pero las líineas GST-27 6 y 17 producen pocas raíces en 10 y 20 ppm y hojas pequeñas también. Las líneas 5 y 12 no son resistentes como estas dos líneas. En alaclor, el tipo silvestre no produce ninguna raíz para las proporciones probadas, pero algunas hojas a 20 ppm. Las líneas 6 y 17 producen raíces hasta la concentración de 40 ppm/ en las cuales las raíces parecen no ser afectadas por el herbicida. El número de raíces parece disminuir con concentraciones incrementadas del herbicida. Parra estas líneas, el límite de concentración de enraizamiento está entre 40 y 100 ppm bajo estas condiciones y después de tres semanas. Las líneas 9 y 10 no producen ninguna raíz pero hojas muy pequeñas a 20 y 40 ppm del herbicida. En metolaclor, el tabaco del tipo silvestre produce raíces muy pequeñas y pocas a 10 y 20 ppm. Las líneas 6 y 17 producen raíces corta, pero no tantas como se producen en alaclor. Para este herbicida, el límte de concentración de enraizamiento está entre 20 y 40 ppm para la línea 6 y más de 40 ppm para la línea 17. Tratamiento de plantas con herbicida Para demostrar que las plantas transgénicas que expresan GST-27 confieren resistencia al tratamiento con herbicida, se realizan prµebas pre o post emergencia de herbicida en el invernadero. Se realizan las pruebas pre emergencia sembrando aproximadamente 50 semillas por línea por cada proporción de herbicida en tierra (25% tierra tamizada, 75% en grifo, fertilización de liberación lenta) . Se tratan cuatro replicaciones para cada proporción química. Se aplica herbicida (0,300 y 350 g/ha), formulado en 5% de JF 5969 (905.6 g/1 ciciohexanona, 33.3 g/1 sinperonic NPE1800 y 16.7 g/1 Tween 85) a cubetas de siembra usando un aspersor de seguimiento. Los resultados para alaclor muestran que las plantas transgénicas son resistentes a la aplicación pre emergencia del herbicida. Se obtienen resultados similares para el acetoclor, metolaclor y EPTC (12000g/ha) . Se realizan las pruebas post emergencia sembrando 28 semillas por línea y por proporción de herbicida en composta. Después de 16 días las plantas de tabaco (1 cm de alto) son esparcidas con alaclor en formulación de 5% JF 5969 usando un aspersor. Se clasifica el daño 3 semanas después del tratamiento de aspersión usando tamaño de la plantas, necrosis, condición del ápice, morfología de las hojas con relación a control no rociado. Una clasificación del 100% de daño significa que la planta ha sido muerta por el herbicida y una clasificación de 0% significa que la planta se asemeja a un control no tratado. Los resultados post emergencia para alaclor demuestran que las plantas transgénicas son reistentes a este herbicida. Se registra el daño para plantas del tipo silvestre y una línea GST-27 de segregación, gráficamente en la Figura 9 después del tratamiento con metolaclor a 1400 g/ha. Se realizan estudios similares con acetoclor a 2000 g/ha dando resultados similares. EJEMPLO 4 Clonación de genes con resistencia a glifosato en material vegetal y la generación de plantas resistentes a glifosato Se muestra un resumen de los casetes y construcciones de transformación vegetal específicos usados en este ejemplo en las Figuras de la Solicitud de Patente Europea No. EP Al 536330. Vector Dicot 1 el vector 1 es un plásmido de control constitutivo que contiene el gen de glifosato oxidasa (GOX) fusionado a la secuencia temporal de cloroplasto (CTP) 1 del gen Rubisco de Arabidopsis accionado por el promotor CaMV 35S mejorado. La construcción contiene el incrementador de traducción omega 5" de la secuencia de codificación de CTP. El vector 1 utiliza el terminador NOS. Se sintetiza la construcción CTP-GOX de acuerdo a la secuencia descrita en WO92-00377 con la adición de un sitio Ncol en el inicio de traducción ATG, y Kpn I en el extremo 3 " . Se aisla la secuencia CTP-GOX como un fragmento Neo I Kpn I y se liga usando técnicas de clonación molecular estándar en pMJBl cortado con Neo I Kpn I , un plásmido en base a pIBT211 que contiene el promotor CaMV35 con secuencia incrementadora de traducción del virus del mosaico del tabaco la cual reemplaza el líder no traducido 5" del virus de tabaco etch, y terminado con el terminador NOS. Se aisla un cásete que contiene el promotor CaMV35S mejorado mejorador Omega CTP GOX Nos como un fragmento Hind III EcoRI y se liga en un vector de transformación vegetal e? base a pBin 19, pJRli cortado con Hind III EcoRI . Vector dicot 2 Se sintetiza CP4 -EPSPS (el cual es una clase II EPSPS) fusionado a un péptido temporal de cloroplasto de Petunia de acuerdo a la secuencia representada en WO92-04449 con un sitio Ncol en el inicio de traducción ATG. Se silencia un sitio Sph I interno en la EPSPS sin cambio en la secuencia de la proteína. Se aisla un fragmento que contiene la secuencia CTP-EPSPS sintética como un fragmento Ncol Sac I y se liga en pMJBl. Se coloca esta secuencia bajo control de expresión de un promotor 35S mejorado y terminador NOS con un fragmento omega que está colocado 5" de las regiones que codifican la proteína y se aisla como un frgmento EcoRI Hind III el cual se clona en pJRli para dar el vector dicot 2. Vector dicto 3 se construye el vector de control con ambos genes EPSPS y GOX cortando el vector dicot 2 con EcoRI e insertadno un enlazador EcoRI - Sph I - EcoRl . Se corta el vector resultante con Sph I para liberar un cásete ("B"), el cual se clona en un sitio Sph 1 en el vector dicot 1, 5" al promotor para formar pDV3puv (Figura 9) . Las regiones de codificación, que incluyen promotores y terminadores derivados de vectores (1) y (2) se escinden entonces de pDV3puc como un fragmento Hind III y EcoRI y se clonan en pJRli. Se introduce el plásmido pDV3 en el vector binario pJRli en tabaco para transformación mediada por Agrobacterium usando técnicas conocidas. Se eliminan 270 brotes de los callos obtenidos del material transformado de esta forma, 77 de los cuales retoñan. Para confirmar la presencia de los genes EPSPS y GOX en los retoños de esta forma enraizados, se preparan los extractos de ADN de plantas pDV3 y se analizan por RCP usando los siguientes promotores : Gen EPSPS extremo 3 " GATCGCTACTAGCTTCCCA (SEQ ID NO. 12) EPSPS 2 Gen GOX extremo 5' AATCAAGGTAACCTTGAATCCA (SEQ ID NO. 13) GOX 1 Las reacciones de RCP proporcionan una banda de. 1.1 kb si están presentes ambos genes. Para confirmar la funcionalidad de los genes pDV3 con tolerancia a glifosato se transfieren las explantas de cultivo de tejido a medios MS que contienen 0.01 mM y 0.05 mM de glifosato. Se analizan las líneas resistentes, las cuales crecen exitosamente en medios que contiene herbicida, por Western usando antisuero incrementado en conejos contra GOX y EPSPS purificados. Se preparan extractos de ADN de hoja de cada transformante primario y se usan para reacciones de RCP para confirmar la presencia del vector. Se realiza el análisis western blot en cada planta pDV3 positiva a RCP para verificar la expresión heteróloga de GOX y EPSPS, usando los métodos descritos anteriormente. Se mantiene plantas de un locus para producción homocigota. Los datos que confirman que las plantas transformadas con la construcción pDV3 son resistentes a glifosato son encontrados en el Ejemplo 8. EJEMPLO 5 Produccción de plantas las cuales son resistentes a herbicidas del tipo anilida y glifosato Las líneas de tabaco heterocigotas y homocigotas que expresan la GOX y EPSPS son polinizadas por cruzamiento en líneas de tabaco homocigotas que expresan GST-27. Las semillas generadas en esta cruza son sembradas y se toma material dehoja para análisis western, usando los procedimientos descritos anteriormente. Los extractos de proteína de plantas positivas a western GST-27 son entonces analizadas con el anticuerpo GOX/EPSPS para seleccionar líneas que expresan ambas GST-27, GOX y EPSPS. Estas líneas son usadas entonces en aspersiones de herbicidas pre emergencia con acetoclor, alaclor, metolaclor y EPTC. Subsecuentemente, las plantas pueden ser rociadas en una forma post emergencia con glifosato formulado. EJEMPLO 6 Producción de plantas las cuales son resistentes a ambos herbicidas tipo anilida y glifosato por un proceso que no implica polinización cruzada Se corta el vector pDV3puc con EcoRI, fenol cloroformo , se extrae y se precipita. Se calienta un enlazador delta EcoRI-HindIII-EcoRI MKOL3 5 'AATTACGGAAGCTTCCGT3 " (SEQ ID NO. 14) A 70 °C y se enfría a temperatura ambiente permitiendo que destemple. En enlazador de destemple es ligado entonces en pDV3puc cortado con EcoRI . Se analizan los recombinantes putativos con MK0L3 oligonucléotido marcado en extremo. Se aisla el ADN de plásmido de las colonias positivamente hibridizadas . La digestión de restricción con HindIII libera un fragmento de 5.4 kb que contiene el promotor 35 S CaMV que acciona la expresión del promotor omega-CTP2-EPSPS-NOS y 35S CaMV que acciona la expresión del Omega-CTPl-GOX-NOS . Se clona este fragmento en pGST-27 Bin cortado con HindIII y desfosforilado con CIP. Se seleccionan las recombinantes usando una sonda de inserto. Se verifica el vector resultante pDV6-Bin (Figura 10) por análisis de secuencia apropiada. Se transforma el plásmido resultante en tabaco vía Agrobacterium usando técnicas conocidas. Se recuperan 270 brotes después de la transformación, 80 de los cuales son enraizados. Se preparan los extractos de ADN de hoja de cada transformante primario y se usa en las reacciones de RCP para confirmar la presencia en la hoja de las regiones que codifican la proteína de 1 vector. Los promotores son como se indica anteriormente (SEQ ID No. 12 y 13) . Para confirmar la funcionalidad de los transgenes, se evalúan transformantes primarios de pDV6-Bin en 0, 0.01 mM y 0.05 mM de glifosato y 10 ppm y 40 ppm alaclor en medio de cultivo de tejido. Un número de transgénicos crece exitosamente en ambos medios bajo condiciones en las cuales los controles del tipo silvestre fallan. Se realiza el análisis Western blot en cada planta positiva a RCP para verificar la expresión heteróloga de GOX y EPSPS y GST-27, usando los métodos descritos anteriormente. Se usan entonces estas líneas en rociados de herbicida pre emergencia con acetoclor, alaclor, metolaclor y EPTC. Subsecuentemente, las plantas pueden ser esparcidas en una forma post emergencia con glifosato formulado . La Tabla 1 posterior da los datos para los tratamientos pre post herbicida de plantas DV6 es decir plantas que expresan tanto genes de resistencia aglifosato y GST. La parte superior media de la tabla muestra las proporciones en las cuales se aplican los herbicidas pre emergencia y su estado continuo en la ausencia de la aplicación de herbicida post emergencia. La parte inferior media de la tabla superior da el daño incurrido después del tratamiento con glifosato de 800 g/Ha . La tabla inferior muestra las clasificaciones replicadas para daño infligido en las plantas no sometidas a un tratamiento pre emergencia como un resultado del tratamiento de glifosato post emergencia. Todas las replicaciones de las plantas del tipo silvestre clasifican similarmente mientras que las clasificaciones transgénicas reflejan el hecho que esta es una población de segregación es decir las plantas azigotas que no expresan transgenes son capaces de ir a través de la prueba de rociado post emergencia.

Tabla I Datos medios para tratamiento de herbicida post y pre emergencia FOE 5043 es una oxiacetamida conocida como flutiamida EJEMPLO 7 Producción de maíz el cual es resistente a herbicidas del tipo glufosinato y anilina Se genera un vector de transformación de monocotiledonea (maíz, trigo) que contiene GST-27, que confiere resistencia a herbicidas pre emergencia, y fosfinotricinacetil transferasa (PAT) , que confiere resistencia a glufosinato herbicida post emergencia como a continuación: Etapa 1 Se digiere pUBl (un vector a base de pUC que contiene el promotor ubiquitin de maíz e intrones) (Figura 11) con Hind III. Se inserta en el espacio producido por la digestión un enlazador Hind III -Age I-HindIII (5 "AGCTTGTACACCGGTGTACA 3' (SEQ ID NO. 15)). Se designa el vector recombinante resultante como pUB2. Etapa 2 Se escinde el ADNc GST-27 de pIJ21-3A usando Kpn I y Bam Hl y se clona en pUB3 cortado con BamHl y Kpn I para formar pUB3. Etapa 3 Se auto destempla el enlazador Kpnl-Pac I-Kpnl (5' CGGACAATTAATTGTCCGGTAC 3 ' (SEQ ID NO. 16) y se clona en pUB3 cortado con Kpnl para formar pUB4. Etapa 4 se aisla el terminador NOS como fragmento Smal de pIE98 (Figura 12) , y se clona en extremo romo en pUB4 cortado con EcoRV para formar pUB5. Se confirma la orientación del terminador NOS en pUB15 por digestión de restricción con EcoRI y BamHl. Se secuencian las uniones para confirmar la inserción correcta de los varios componentes de construcción. Etapa 5 Se elimina el cásete GST-27 NOS ubiquitin presente en pUB15 de por digestión con Age I y Pací y se clona en el vector pIGPAT menos ampicilina (Figura 13) el cual contiene el gen PAT bajo el control del promotor 35S-CaMV. Se detectan los recombinantes por hibridización de colonia con un inserto de ADNc EcoRI de pIJ21-3A. Se detectan los recombinantes por hibridización de colonia con inserto EcoRi ADNc de pIJ21-3A. Se orientan las recombinaciones con digestión de restricción Neo I para formar pCATIO (Figura 14) . Etapa 6 se elimina el cásete 35S-PAT-NOS por digestión con el cásete ubiquitin-PAT-NOS AscI y AscI de pPUN14 para formar pCATll (Fig. 15) . Se transforma el pCATll en trigo y maíz usando agitadores conocidos y tecnología de bombardeo de partículas. Se transfieren entonces las células en medios que contiene bialofos para seleccionar materia calloso el cual expresa el gen PAT. Los callos que crecen en medios que contiene este herbicida son entonces sometidos a RCP usando los promotores siguientes (SEQ ID No. 33 y 34 respectivamente) para confirmar la presencia en los callos del gen GST-27. 5"CCAACAAGGTGGCGCAGTTCA3" (SEQ ID NO. 33) 5 'CATCGCAAGACCGGCAACAG3 " (SEQ ID NO. 34) Se transfieren los callos que contienen el cásete de expresión GST-27 a medios de regeneración vegetales y se recuperan las plantas de maíz. Se confirman las plantas de maíz transformadas - por Western blots de extractos de proteínas totales de hojas - para expresar constitutivamente el gen GST en altos niveles. Tales plantas son polinizadas por cruza con una línea de reproducción de maíz élite y se recupera la semilla. Para confirmar la tolerencia incrementada de las plantas al acetoclor herbicida se plantan las semillas en suelo en el cual ha sido aplicado entre 2,000 y 8,000 gramos por hectárea del herbicida. Se permite que las semillas germinen y crezcan por 7 días después de lo cual se evalúa una muestra de reproducciones resultantes para daño provocado por el químico y se compara con las reproducciones (si las hay) las cuales resultan de siembra de semillas no transgénicas sembradas bajo condiciones idénticas. Las siembras "transgénicas" y siembras no transgénicas de control crecidas en suelto tratado con el herbicida y un asegurador correspondiente exhibe poco, si hay daño, mientras que siembras no transgénicas crecidas en tierra las cuales contienen herbicida en ausencia del asegurador muestran muy poco daño. Las siembras las cuales sobreviven al primer tratamiento de herbicida son permitidas para crecer por unos 20 días adicionales o más, y después se rocía con una mezcla comercial de glufosinato a varias concentraciones en el intervalo de aproximadamente 0.1 a 1% del ingrediente activo. Las siembras que contiene el gen PAT (expresión del cual se determina por el método descrito por De Block M. et al (The EMBO Journal 6 (9) : 2513-2518 (1987)) son ya sea completamente resistentes a glufosinato, o son relativamente tolerantes del herbicida después de la concentración aplicada cuando se compara con siembras que no contiene el gen. EJEMPLO 8 Producción de plantas (mono y dicotiledóneas) las cuales son resistentes a ambos glifosato y glufosinato Este ejemplo demuestran la producción de plantas que son resistentes a ambos glufosinato y glifosato. Esta resistencia a herbicida múltiple resulta del cruzamiento de una primera planta la cual ha sido maquinada para ser resistente a glufosinato con una segunda planta la cual ha sido maquinada para ser resistente a glifosato. Producción de una construcción pPG6 de resistencia a glufosinato PPG6 es un vector a base de Bin 19 derivado de pBin 19RÍPAT, y contiene un cásete que contiene el promotor 35S CaMV accionando el gen GUS. Insertado entre el promotor y GUS es el segundo intrón del gen ST-LS1. Esta secuencia tiene 189 p.b. tiene un contenido A/T de 80%, uniones de eliminación de intron típicas y codones de detención en todas las tres estructuras de lectura. La presencia .del intrón evita la expresión de GUS en Agrobacterium ya que la eliminación de intrones no ocurre en procariotes. Este también contiene un cásete que porta el promotor 35S CaMV accionando la expresión del gen PAT. La Figura 16 muestra un mapa de pPG6. Construcciones de resistencia de glifosato Se producen los vectores 1-3 dicot como se indica anteriormente en el Ejemplo 4. Vector 1 monocot El vector 1 monocot es un plásmido que contiene ambos CTPl GOX y CTP2 EPSP, ambos accionados por el promotor poliubiquibitin de maíz por el intrón 1 de poliubiquitin de maíz, en un plásmido deerivado de pUC. Este también contiene un cásete que confiere tolerancia a fosfinotrICINA. Plásmido 1 : Se digiere el vector pUBl con Kpn 1 y un enlazador Kpn-INotl-Kpnl insertado, (secuencia 5 " CAT TTG CGG CCG CAA ATG GTA C 3 - SEQ ID NO. 17) . Se inserta un enlazador EcoRl-Notl-EcoRl (5" AAT TCA TTT GCG GCC GCA AAT G 3 ' (SEQ ID NO. 18) EN EL SITIO eCOrl DE dvl-Puc. Se CORTA EL PLÁSmido resultante con Ncol y la extremidad 5" llenada usando el fragmento de Adn polimerasa 1 Klenow. Se digiere entonces el vector lineal con fragmento Notl y Notl romo aislado. Este fragmento, que contiene las secuencias CTPl-GOX y NOS se liga en pUBl modificado digerido con Smal-Notl. Se inserta un enlazador HindIII-Notl-HindIII (secuencia 5' AGC TTG CAG CGG CCG CTG CA 3' (SEQ ID NO. 19)) en el plásmido para dar el plásmido 1 resultante. Plásmido 2: Se inserta un enlazador EcoRl-Notl-EcoRl (5 " AAT TCA TTT GCG GCC GCA AAT G 3 " (seq id no . 20)) en el sitio EcoRl de DV2-pUC (se aisla otro clon el cual no contiene el enlazador mencionado anteriormente, permitiendo de esta forma esta estrategia de clonación) . Se digiere el plásmido resultante con Ncol y el extremo 5 " llenado usando el fragmento ADN polimerasa 1 klenow. El vector lineal es cortado entonces con Nct 1 y se clona el fragmento resultante en el mismo vector como se describe inmediatamente anteriormente (pUBl modificado) , para generar el plásmido 2. El cásete marcador seleccionable PAT, que comprende un gen de promotor 35S CaMV, Adh 1 intrón, fosfinotricin acetil transferasa (PAT) y terminador nos se escinde de pIE108 y se clona en el sitio HindIII del plásmido 2 para dar el cásete 2. Se usa el análisis de restricción de diagnóstico para confirmar que el cásete PAT está en la misma orientación como el cásete CTP2 EPSPS. Se escinde el cásete que porta el promotor polibuquitin e intrón, CTPl GOX y terminador del plásmido 1 en un fragmento Notl en el cásete 2 cortado con Not 1 para dar el vector 1 monocot, pMV 1 (Fig. 17) . Transformación de tabaco Se transfieren los plásmidos para transformación dicot a LBA4404 Agrobacterium tumefaciens usando el método de congelamiento descongelamiento de Holsters et al (1978) . Se transforma la Nicotiana tabaccum var Samsun usando un método de disco de hoja descrito por Bevan et al (1984) . Se regeneran los brotes en medio que contiene 100 mg/l de kanamicina. Después del enraizamiento y selección transfieran las plantas a un invernadero y se hacen crecer bajo régimen de luz 16 horas y 8 horas oscuridad. Las transformantes de pPG6 son nombradas como líneas 35S-PAT. Transformación de maíz Se realiza la transformación de maíz usando el método de bombardeo de partículas como se describe por Klein et al (1988) . La selección del material transformado es en 1 mg/l de bialofos. ANÁLISIS DE PLANTAS Rep Se realiza este análisis en todas las líneas de tabaco las cuales se enraizan en cultivo de tejido y callos de maíz. Se extrae el ADN por medios conocidos por el experto. Se analizan los transformantes primarios usando los siguientes oligonucleótidos : pDVl TMV1 + GOX1, GOX3 + nos 1 pDV2 TMV1 + EPSPS1, EPSPS1 + nosl pDV3 EPSPS3 + GOX3 pPG6 35S + BARJAP2R pMVl GOX 4 + GOX 5 EPSPS4 + EPSPS5 35S + BARJAP2R Las secuencias de los oligonucleótidos son: TMV1 5'CTCGAGTATTTTTACAACAATTACCAAC (SEQ ID NO . 1) GOX1 5 "AATCAAGGTAACCTTGAATCCA (SEQ ID NO. 22) GOX3 5 •'ACCACCAACGGTGTTCTTGCTGTTGA (SEQ ID NO. 23) NOS1 5 " GCATTACATGTTAATTATTACATGCTT (SEQ ID NO . 24) EPSPS1 5'GTGATACGAGTTTCACCGCTAGCGAGAC (SEQ ID NO.

) EPSPS3 5'TACCTTGCGTGGACCAAAGACTCC (SEQ ID NO. 26) EPSPS4 5' ATGGCTTCCGCTCAAGTGAAGTCC (SEQ ID NO. 27) EPSPS5 5'CGAGACCCATAACGAGGAAGCTCA (SEQ ID NO . 28) GOX4 5' ATTGCGTGATTTCGATCCTAACTT (SEQ ID NO . 29) GOX5 5'GAGAGATGTCGATAGAGGTCTTCT (SEQ ID NO . 30) 35S 5' GGTGGAGCACGACACACTTGTCTA (SEQ ID NO . 3 BARJAP2R 5'GTCTCAATGTAATGGTTA (SEQ ID NO. 32) Se seleccionan Rep +VE plantas para análisis adicional . Selección en glifosato Se construye una curva de muerte para crecimiento de tabaco en cultivo de tejido en medio que contiene glifosato. Esto se hace insertando un segmento de talla de aproximadamente 6 mm de largo y que portan el nodo de hoja en medio MS que contiene un intervalo de concentraciones de glifosato e isopropilamina. Se usan cuatro/cinco segmentos de tallos para cada concentración. Se clasifican los resultados después de dos semanas y se muestran en la Tabla 2. Tabla 2 : curva de muerte de glifosato en tabaco del tipo silvestre Se seleccionan las transformantes primarias de pDVl,2 y 3 creciendo en medio que contiene 0.01 y 0.05 mM de sal glifosato isopropilamina como se describe anteriormente. Se muestran los resultados en la Tabla 3. Tabla 3 : selección de líneas tolerantes a glifosato en cultivo de tejido Selección en PAT Se prueban callos regenerantes en 1 mg/l bialofos Análisis Western Se realiza la sobre expresión de proteínas GOX y EPSPS y generación de anticuerpo por medios conocidos por el experto. Se analizan las transformante primarias de tabaco como sigue. Se agrega -100 mg de PVPP al fondo del tubo Eppendorf. Se cosecha el material de hoja (cuatro discos de hoja obtenidos usando la boca del tuco como cortador) en hielo. Se agrega 0.5 ml de amortiguador de extracción (50 mM Tris HCl pH 7.8 , 1 mM de EDTA sal de sodio, DTT 3 mM) y 2 µl 100 mM PMSF. Se hacen crecer las muestras en un cuarto frío usando un molinillo eléctrico. Se continúa con el molido por 10 segundos, se coloca de nuevo el material no molido en el tubo y se continua el molido por otros 10-15 segundos hasta que la muestra esté homogénea. Se centrifugan las muestras por 15 minutos en el cuarto frío, se llevan los sobrenadantes y se congelan a -70°c hasta que se requieran. Se determinan las concentraciones de proteínas usando el método conocido de Bradford. Se fraccionan 25 µg de proteína por SDS PAGE y Blotting durante la noche a 40 mA en membrana Hybond-N. Se retira el filtro del aparato de blotting y se coloca en solución salina al 5% Tris 1 X 100 ml y se agita a temperatura ambiente por 45 minutos. Se lava el filtro por agitación a Temperatura ambiente en solución salina Tris IX al 0.1% Tween 20 primero lavado 5 minu. , segundo lavado 20 min. Se usa el anticuerpo primario a dilución 1:10000 en solución salina Tris IX 0.02% de Tween 20. Se incuba la membrana con el anticuerpo primario a temperatura ambiente 2 horas o durante la noche a 4°C. Se lava la membrana en IX T-S 0.1% Tween a temperatura ambiente por 10 minutos después por una hora. Se usa el segundo anticuerpo (conjugado de peroxidasa iGG anti conejo) a una dilución 1:10000, la incubación con la membrana es por 1 hora a temperatura ambiente . El lavado es como se describe anteriormente. Se realiza la detección usando el equipo de detección Amersham ECL. Se observa un intervalo de niveles de expresión de proteína en pPVl y en dos líneas en base a los resultados de Western. Los niveles de expresión de GOX y EPSPS en pDV3 muestran poca variación en la cantidad de GOX que es expresada pero variación incrementada en la cantidad de EPSPS. Se seleccionan las líneas que expresan ambos genes para análisis adicional. Se analizan los callos de maíz en la misma forma, se regeneran callos que expresan GOX y EPSPS en plantas enteras y se analiza el material de hoja otra vez para expresión de ambos genes . Ensayos de actividad de fosfinotrici?acetil transferasa Se mide la actividad de PAT usando el acetil Co A marcada con 14C. Se transfiere el grupo acetilo marcado al substrato fosfinotricin (PPT) por el Pat en extractos de hojas. PPT acetilado y 14C migran en diferentes proporciones en una placa de CCF, y puede ser visualizado por autoradiografía. Se prepara el amortiguador de extracción de hoja usando amortiguador 10X T50E2 (TE) - 50 ml de Tris HCl pH 7.5, 4 ml 0.5 M EDTA y 46 ml de agua destilada. Se hace la leupeptina hasta una proporción de 15 mg/ml en IX TE. Se hace la provisión de PMSF en metanol a 30 mg/ml. Se hace la solución de provisión de BSA a 30 mg/ml en TE, y se usa DTT en 1 M PPT como una solución 1 mM en TE. El acetil CoA 14C es 51.1 mCi/mmol . (Amersham). Se hace el amortiguador de extracción combinando 4315 µl de agua destilada, 500 µl de 10X TE, 50 µl de provisión de leupeprin, 25 µl de provisión PMSF, provisión BSA 100 µl y 10 µl de provisión de DTT (volumen final 5000 µl) . Se cosechan las muestras de hojas en tubos Eppendorf en hielo usando la tapa como navaja. Las muestras (tres piezas) son molidas en 100 µl de amortiguador de extracción usando un molino eléctrico en un cuarto frío. Se centrifugan las muestras por 10 minutos y se retiran 50 µl a un tubo fresco en hielo. Se almacenan las muestras a -70 °C hasta uso. Se usa el análisis Bradford para cuantificar la proteína presente en los extractos. Se prepara la solución de substrato mezclando 5 volúmenes de acetil CoA marcada con 3 volúmenes de solución 1 mM PPT. Se agrega a una muestra de proteína de hoja total -25 µg (~2µg/µl) 21 de solución de substrato, se incuba la muestra a 37°C por 30 min. después se lleva a hielo para detener la reacción. Se coloca una muestra de 6 µl en un gel de sílice de placa de CCF (Sigma T-6770) . Se realiza la cromatografía ascendente en una mezcla 3:2 de isopropanol y solución de amoniaco al 25%, por 3 horas. Se cubren las placas en película de plástico y se exponen o/n a película Kodak XAR-5. Se evalúan todas las 26 transformantes primarias para actividad PAT usando este método de análisis. La Tabla 4 posterior da detalles del resultado de este análisis. Tabla 4 : Datos de actividad PAT Actividad PAT Línea pPG6 Alta 1, 9 , 11, 12, 14, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 30, 32 Media 5, 7, 10, 15, 19, 20 Baja 6 , 2, 8 Tinción de la hoja con herbicida se prueban las transformantes primarias 35S-PAT que muestran un intervalo de actividad PAT y plantas de control teniendo de Challenge en hojas individuales. Ambas superficies de hojas marcadas son pintadas con una solución 1% y 0.2% de la solución de provisión (150 g/1) en agua. Se realiza la clasificación después de 48 horas y una sema y se toman muestras de hojas para ensayo de PAT. La Tabla 5 muestra los resultados de tinción de hoja.

Prueba de rociado con herbicida Glufosinato (challenge o basta) Se establece una curva de respuesta a dosis para el efecto del Challenge en tabaco del tipo silvestre. Se usan cinco plantas en cada tratamiento, se realiza la clasificación después de 14 días. Después de la construcción de curva de muerte, se "someten las líneas 35SPAT seleccionadas a pruebas de rociado usando Challenge, en las mismas proporciones de aplicación. La Tabla 6 muestra estos datos, para dos líneas, #12 y 27. Las plantas transgénicas no muestran daño en estas proporciones.

Tabla 6: Resultados de la prueba de rociado en transformantes primarias 35S Proporción de basta Tipo 35SPAT#12 35SPAT #27 silvestre % de daño % de daño % de daño 200 g/ha 30 0 0 400 g/ha 40 0 0 600 g/ha 40 0 0 900 g/ha 80 0 0 Se establece una curva de muerte para el efecto del glifosato del tabaco tipo silvestre. Se sub cultiva el tabaco tipo silvestres creciendo en cultivo de tejido tomando segmentos de tallo y creciendo en un medio fresco para generar 20 plantas nuevas. Estos se hacen crecer en cultivo de tejido por un mes antes de transferir a macetas de 3 pulgadas (7.62 cm) en composta John Innes No. 3. Se hacen crecer inicialmente en lana para protegerlos. Después de descubrirlos se permiten que se aclimaten por cuatro días antes de ser rociados. Después de rociar agua esto solamente en los platillos es decir no se permite que el agua toque las hojas por cinco días. Se hace la clasificación por 8 días y 28 días después del tratamier2.to. La Tabla 7 muestra el daño en porcentaje medio (tres repeticiones por tratamiento) en un intervalo de concentraciones de aplicaciones . Tabla 7: curva de respuesta a dosis del tabaco del tipo silvestre tratado con glifosato en las proporciones indicadas .

Después de la construcción de la curva de muerte de glifosato, se prueban por rociado un número de pDVl , líneas 1, 2 y 3 con proporciones apropiadas de glifosato. La Tabla 8 muestra los resultados para pDV3 , los resultados para las líneas pDVl y pDV2 son similares a aquellas de pDV3. Tabla 8 : dosis/respuesta de transformantes primarias pDV3 tratados con glifosato Análisis de segregación Se esterilizan la semillas de cada transformante primaria (pPG6, pDVl, pDV2 y pDV3 en 10% de Domestos por veinte minutos . Después de varios lavados en agua estéril, se colocan 100 semillas de cada transformante primario en medio 0.5XMS (2.3 g/1 MS sales, 1.5% de sacarosa, 0.8% de bactoagar, pH 5.9) que contiene 100 mg/l de kanamicina. Se clasifican las reproducciones después de tres semanas de crecido en 26°C bajo 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Se asume que las líneas de segregación en una proporción de 3:1 tienen inserciones de transgen individuales. En el caso de las líneas pPG6 , #12, 20, 27 segregadas en la proporción deseada. En el caso de las líneas pDV3 , #14, 19, 21, 31, 34, 43 y 45 segregadas en la proporción deseada. Generación de líneas homocigotas Se transfieren de las pruebas de segregación 10 reproducciones no blanqueadas (heterocigoto u homocigoto) a medio fresco en tubos y se hace crecer en dos a tres semanas. Después de este tiempo se transfieren a Jl No composta en 31 macetas para florecer. Se vuelven a probar las semillas en Km que contienen 0.5XMvS para identificar líneas homocigotas. Cruzamiento de líneas de tabaco las líneas homocigotas que contienen pDVl, pDV2 , y pDV3 es decir explantas que expresan GOX, EPSPS y GOX/EPSPS respectivamente son polinizadas por cruzamiento en una línea pPG6 homocigota que expresa el gen PAT, línea #27. Se realiza también la polinización usando las líneas pPG6 como la línea macho. Análisis de líneas de maíz transgénicas Se prueban los callos de regeneración por RCP usando los oligonucleótidos descritos anteriormente es decir 35S-AlcR, AlcA-GOXl, y oligonucleótido interno para GOX y EPSPS. Se realiza también el análisis Western en los callos RP +ve para seleccionar aquellas que expresan GOX y EPSPS. Se regeneran aquellos callos y se vuelven a analizar las plantas resultantes por RCP. Se vuelven a cruzar las plantas y se siembran. Análisis de progenie de tabaco Expresión de GOX, EPSPS y PAT Toda la progenie es homocigota para ambos genes. Se siembran las semillas de cada cruzamiento y semillas de cada homocigoto progenitor y se cosecha material de hoja de un número de plantas para análisis. Se analizan los extractos de proteína por western blotting y después por mediciones de actividad PAT como se describe previamente. Se encuentra que el nivel de expresión de GOX y EPSPS y actividad PAT es similar entre sí dentro de una cruza particular y a aquellos del progenitor homocigoto. Las plantas se clasifican por apariencia, altura, vigor de crecimiento, etc . Trtamientos de herbicida Se diseñan estos experimentos amplios: 1.35S-PAT cf pDVl cf pDVl-PAT 2.35S-PAT cf pDV2 cf pDV2-PAT 3.35S-PAT cf pDV3 cf pDV3-PAT se tratan las líneas 35S-PAT con glufosinato en un intervalo de concentraciones y las proporciones en las cuales ocurren grados particulares de daño se identifican, en diferentes puntos de tiempo. Se tratan las líneas DV con glifosato en un intervalo de concentraciones y se identifica la proporción del daño. Se tratan entonces las líneas DV-PAT con mezclas de los dos herbicidas en diferentes proporciones y se evalúa el nivel de daño. Se tratan cada una de las aplicaciones en el estado de hojas 5-6 (5 repeticiones por tratamiento) . Resistencia al ataque de patógeno Se exponen las líneas 35S-PAT, DV1, 2 y 3 que expresan buenos niveles de cada proteína y que muestran buenas tolerancias de herbicida a un número de patógenos fúngicos y se clasifica y compara el nivel de infección. Análisis de progenie de maíz Se usa la semilla resultante del cruzamiento de los transformantes primarios para generar plantas a partir de las cuales se seleccionan las mejoras líneas de expresión. Esto se hace por experimentos análisis western de niveles de expresión de GOX, EPSPS y por actividad de PAT como se describe anteriormente. Se realizan experimentos similares para determinar tolerancia al herbicida glifosato y glufosinato, ya sea aplicado individualemente o en varias combinaciones. EJEMPLO 9 Producción de plantas tolerantes a herbicidas blanqueadores pre emergencia por ejemplo fluorocloridona, norflurazon, fluridona, flurtamona y diflufenican y a glifosato Los inhibidores de fitoena desaturasa (PDS) por ejemplo flurocloridona y norflurazon son un grupo de herbicidas los cuales bloquean la biosíntesis de carotenoide y dan origen a sintomatología de blanqueador. El gen PDS (crtl) es clonado de Erwinia uredovora, una bacteria de putrefacción fitopatogénica no verde, y sobre expresado en tabaco transgénico (y tomate) usando un plásmido que contiene el promotor CaMV 35S y péptido tempoeral de cloroplasto (pYPIET4) (Misawa et al 1993) . Se obtiene semilla homocigota de la línea ET4-208 de planta de tabaco la cual sobre expresa el gen crtl así como son plantas de tomate que contiene la misma construcción . Pruebas de tolerancia de herbicida Se prueban los compuestos de las fórmulas (I), (II) y (III) (véase posteriormente) . Se siembra semilla de tomate transgénica y del tipo silvestre (cv Ailsa Craig) en macetas de 3 pulgadas (7.62 cm) de JIP 3, tres semillas por maceta. Se formula cada compuesto en 4% de JF5969 (aparte de compuesto I el cual es una formulación comercial) y se rocia en las unidades en el aspersor de trazo en 200 1/ha. Se evalúa la prueba a 13 , 20 y 27 DAT (días después del tratamiento) . Hay respuestas a dosis claras de todos los tratamientos en el tomato del tipo silvestre, con la mayor proporción en todos los casos dando 87-100% de fitotoxicidad. Los tomates transgénicos son altamente tolerantes de todos los inhibidores de PDS probados, por lo menos 1 kg/ha de compuestos II y III y hasta 9 kg/ha del compuesto I (véase la Tabla 9) . Se obtienen resultados similares para tabaco transgénico.

Tabla 9: Fitotoxicidad a 27 PAT DV3 #43B (una línea resistente a glifosato que comprende los genes EPSPS y GOX - véase Ejemplo 4) se poliniza por cruzamiento en el homocigoto ET4-208 y viceversa en la forma usual. Se recolecta la semilla y se usa en pruebas de herbicida similares a aquellas descritas anteriormente. Se siembra la semilla de tabaco en líneas en unidades pequeñas el día antes del tratamiento. Se formula cada compuesto en JF5969 al 4% (aparte de Racer el cual es una formulación comercial) y se rocía en las unidades con el rociador de trazo a 200 1/ha. Se evalúa la prueba a 13 , 20 y 27 DAT. Las reproducciones que son tolerantes a herbicidas blanqueadores se transfieren después de la evaluación final en composta fresca John Innes 111 en macetas de 3 pulgadas (7.62 cm) . Después de dos semanas se someten a herbicida de glifosato aplicado a 500 y 800 g/ha. Se realiza la clasificación 14 y 28 DAT. Las plantas resultantes son resistentes a ambas clases de herbicida, y s herede la resistencia en una forma Mendeliana. Compuesto de la Fórmula I : Compuesto de la Fórmula II: Compuesto de la Fórmula III EJEMPLO 10 Generación de plantas tolerantes a tricetonas, acetanilidas y glifosato pDV6 #71G y pDV3 # 19J son polinizados por cruzamiento en una línea tolerante a tricetona homocigota y viceversa como se describe posteriormente. Se recolectan las semillas y se usan en pruebas de herbicidas como se describe posteriormente. Se siembran las semillas de tabaco obtenidas de la cruza de DV6/HPPD en líneas en unidades pequeñas el día antes del tratamiento. Se tratan algunas unidades con acetoclor (75 g/ha) , algunas con alaclor (300 g/ha) y otras con ZA1296 (100 y 300 g/ha) . La evaluación es en el 21Dat. Se dan las clasificaciones posteriormente para la evaluación 23.DAT y representan fitotoxicidad.

Las reproducciones que sobreviven el tratamiento 300 g/ha de ZA1296 son rociadas con 800 g/ha de glifosato y demuestran tolerancia a esta.

ENLISTADO DE SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Zeneca Ltd (B) CALLE: 15 Stanhope Gate (C) CIUDAD: Londres (E) PAÍS: Inglaterra (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : W1Y 6LN (G) TELEFONO: 0171-304 5000 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Plantas resistentes a herbicida (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS : 32 (iv) FORMA LEÍBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1020 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: desconocida (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO; NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Synechocystis sp . PCC6803 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) UBICACIÓN: 1..1020 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 : ATG GAA TTC GAC TAT CTT CAT TTA TAC GTT GAC GAT TAT CAG TCA GCT 48 Met glu fen asp tir leu his leu tir val asp asp tir gln ser ala 5 5 10 15 CAT CGT TGT TAT CAA CGT CAA TGG GGT TTC ACT TGC GTA AAT AAA ATT 96 His arg cis tir gln arg gln trp gli fen tre cis val asn lis ile 20 25 30 ATT ACT GAC CAA GGA ATT ACT GGC ATC TAC CAA CAG GGG CAA ATA CTT 144 lie tre asp gln gli ile tre gli ile tir gln gln gli gln ile leu 35 40 45 CTG CTA ATT TCG GCA TCG GAA TCT AGT TTG AGT AGA TAT GCC GAC TAT 192 Leu leu ile ser ala ser glu ser ser leu ser arg tir ala asp tir 50 55 60 CTC CAG AAA CAT CCC CCC GGC GTA GGT GAA GTC GCT TGG CAG GTG GCC 240 Leu gln lis his pro pro gli val gli glu val ala trp gln val ala 65 70 75 80 AAT TGG CAA AAA ATT CAG CAT CAA TTA TCA GAA TTA CAG ATA GAA ACC 288 Asn trp gln lis ile gln his gln leu ser glu leu gln ile glu tre 85 90 95 ACÁ CCA GTT ATT CAT CCT CTG ACT AAA GCA GAA GGA TTA ACT TTT TTG 336 Tre pro val ile his pro leu tre lis ala glu gli leu tre fen leu 100 105 110 CTC TGG GGA GAT GTG CAC CAT AGC ATT TAT CCT GTT CGT TCT GAG CTA 384 Leu trp gli asp val his his ser ile tir pro val arg ser glu leu 115 120 125 AAT CAG AAT AAA AC TTG CAT GGT GTT GGT TTA ACG ACC ATC GAC CAT 432 Asn gln asn lis tre leu his gli val gli leu tre tre ile asp his 130 135 140 GTG GTG CTA AAC ATT GCC GCC GAT CAA TTT ACC CAG GCT TCC CAA TGG 480 Val val leu asn ile ala ala asp gln fen tre gln ala ser gln trp 145 150 155 160 TAT CAA CAG GTG TTT GGC TGG TCG GTG CAG CAG AGT TTT ACT GTC AAT 528 Tir gln gln val fen gli trp ser val gln gln ser fen tre val asn 165 170 175 ACG CCC CAT TCT GGT CTG TAT AGC GAA GCC CTG GCC AGT GCC AAT GQG 576 Tre pro his ser gli leu tir ser glu ala leu ala ser ala asn gli 180 185 190 AAA GTC CAA TTT AAC CTC AAT TGT CCC ACC AAT AAC AGT TCC CAA ATT 624 Lis val gln fen asn leu asn cis pro tre asn asn ser ser gln ile 195 200 205 CAA ACT TTT TTA GCC AAT AAC CAT GGG GCT GGT ATT CAA CAT GTC GCT 672 Gln tre fen leu ala asn asn his gli ala gli ile gln his val ala 210 215 220 TTT TCC ACT ACG AGT ATT ACG CGA ACT GTG GCT CAT CTG CGG GAA AGG 720 Fen ser tre tre ser ile tre arg tre val ala his leu arg glu arg 225 230 235 240 GGC GTA AAT TTT TTA AAA ATC CCC ACT GGC TAT TAT CAA CAG CAA AGA 768 Gli val asn fen leu lis ile pro tre gli tir tir gln gln gln arg 245 250 255 AAC AGT AGC TAT TTT AAT TAT GCA AGT TTG GAT TGG GAT ACC TTA CAG 816 Asn ser ser tir fen asn tir ala ser leu asp trp asp tre leu gln 260 265 270 TGC CTA GAA ATT TTG CTG GAT GAT CAA GAT AAT ACG GGG GAG CGA A 864 Cis leu glu ile leu leu asp asp gln asp asn tre gli glu arg leu 275 280 285 CTG CTA CAA ATT TTT AGT CAG CCT TGC TAT GGA GTA GGC ACT CTA TTT 912 Leu leu gln ile fen ser gln pro cis tir gli val gli tre leu fen 290 295 300 TGG GAA ATT ATT GAA CGC CGC CAC CGG GCA AAA GGA TTT GGT CAA GGA 960 Trp glu ile ile glu arg arg his arg ala lis gli fen gli gln gli 305 310 315 320 AAC TTT CAA GCT CTC TAT GAA GCG GTG GAG ACT TTA GAA AAA CAG T 1008 Asn fen gln ala leu tir glu ala val glu tre leu glu lis gln leu 325 330 335 GAA GTG CCA TAA 1020 Glu val pro (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 339 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (A) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : Met glu fen asp tir leu his leu tir val asp asp tir gln ser ala 5 5 10 15 His arg cis tir gln arg gln trp gli fen tre cis val asn lis ile 20 25 30 lie tre asp gln gli ile tre gli ile tir gln gln gli gln ile leu 35 40 45 Leu leu ile ser ala ser glu ser ser leu ser arg tir ala asp tir 50 55 60 Leu gln lis his pro pro gli val gli glu val ala trp gln val ala 65 70 75 80 Asn trp gln lis ile gln his gln leu ser glu leu gln ile glu tre 85 90 95 Tre pro val ile his pro leu tre lis ala glu gli leu tre fen leu 100 105 110 Leu trp gli asp val his his ser ile tir pro val arg ser glu leu 115 120 125 Asn gln asn lis tre leu his gli val gli leu tre tre ile asp his 130 135 140 Val val leu asn ile ala ala asp gln fen tre gln ala ser gln trp 145 150 155 160 Tir gln gln val fen gli trp ser val gln gln ser fen tre val asn 165 170 175 Tre pro his ser gli leu tir ser glu ala leu ala ser ala asn gli 180 185 190 Lis val gln fen asn leu asn cis pro tre asn asn ser ser gln ile 195 200 205 Gln tre fen leu ala asn asn his gli ala gli ile gln his val ala 210 215 220 Fen ser tre tre ser ile tre arg tre val ala his leu arg glu arg 225 230 235 24Q Gli val asn fen leu lis ile pro tre gli tir tir gln gln gln arg 245 250 255 Asn ser ser tir fen asn tir ala ser leu asp trp asp tre leu gl? 260 265 270 Cis leu glu ile leu leu asp asp gln asp asn tre gli glu arg leu 275 280 285 Leu leu gln ile fen ser gln pro cis tir gli val gli tre leu fen 290 295 300 Trp glu ile ile glu arg arg his arg ala lis gli fen gli gln gli 305 310 315 32Q Asn fen gln ala leu tir glu ala val glu tre leu glu lis gln leu 325 330 335 Glu val pro (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2582 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pseudomonas fluorescens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1217..2290 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 : ATTAGTCGAA GAATATGCCC ATCCTGTCGC CTGTCGAGCA ACTGCTAATG CAACCTCCGT 60 CTGATCGCCT CACCTACCTG AAGCTGGCCG CTGTGACCAT GATTTGGGGT GGCACTTTTG 120 TCGCCGGACG TTACCTGACC AATCAAGTCG ACCCGCTGCT GGCCGCCAGC CTGCGGTTTA 180 TCCTGGCCAG CCTGGCGCTG CTGCTGTTTA TGCTGTGTGC ACGCATCCCG CTGGCGCGGC 240 CACGTCCCCG GCAACTGCTG CATCTGGCGG TGCTGGGGTT TTTCGGGATC TTTTTCTACA 300 ACCTGTGTTT TTTCTACGGC CTGCAGTACA TCAACGCCTC GCGCGCTTCG TTGATCGTGG 360 CGTTGAATCC GGCGGTGATC GGCCTGGCTT CCTGGTGGTT GTTCAAAGAG CGCCTCGGCA 420 CTGCCAGGGT GCTGGGTATC GCGTTGTGCC TGGCCGGCGC TGCGACGGTG ATCGTCAGTC 480 GCAACCCGCA GTTGCTGCAA GGTGCATCGA GTACCTGGCA GGGCGACCTG CTGGTGTTCG 540 GCTGTGTGCT GGGGTGGGGG ATTTACTCGT TGTTTTCCCG CGCATTGAAT CAAAGCCTGG 600 GGCCGTTGCA AACGGTCACC TGGTCAGTGC TGCTGGGCAC CCTGATGCTG ACGGCTQTCA 660 CCGCGCTCGC CGGGCGCTTC ACGCTTGCAG GGCTTGGCAG CCTGCACCTG CCGCAGGTTG 720 TGAGCCTGTT GTATTTGGGC GTGCTCGGCT CCGCGCTGGC GTACATCGGC TATTACGATG 780 GCATCCGGCG TATCGGCGCG ACCCGCGCAG GCGTGTTTAT CGCGCTGAAC CCGCTGACGG 840 CGGTGATCTG CGGCGCGCTG CTGCTTGGCG AACAGCTAAC GTTACCCATG GCGCTCGGCG 900 GCGCGGTGAT CCTGTTGGGC ATCTATCTGT GCAACAAACC CCTTGCGCAG CCCAGCQCAA 960 TAGGGATTTG ATGAGAGTGC GGACAAATAC TGTTACGCTG TGTAGAATCG ATTTACQCAT1020 ACAAGAATAT GGACTTGCGC TCACGCAAGC CTCGGCCGTC AGAGACTGAT GTAATCATGAl080 AGCTACTCGG CTCCCCCCTG ATCTTTGGTG ACTTCCTCGC GCGCAGCGTG CGGGGTCTCT1140 CGTGCGCGCC ACCCTGCAAC CTCATCCTTG CCTGTAATTG ACTGCTTGCT ACTTACAAGA1200 ATGATGAGGT GCCGA ATG GCC GAC CAA TAC GAA AAC CCA ATG GGC CTG 1249 Met ala asp gln tir glu asn pro met gli leu 1 5 10 ATG GGC TTT GAA TTT ATT GAA TTC GCA TCG CCG ACT CCG GGC ACC CTG 1297 Met gli fen glu fen ile glu fen ala ser pro tre pro gli tre leu 15 20 25 GAG CCG ATC TTC GAG ATC ATG GGC TTC ACC AAA GTC GCG ACC CAC CGC 1345 Glu pro ile fen glu ile met 35i fen tre lis val ala tre his arg 30 20 40 TCC AAG AAT GTG CAC CTG TAC CGC CAG GGC GAG ATC AAC CTG ATC CTC 1393 Ser lis asn val his leu tir arg gln gli glu ile asn leu ile leu 45 50 55 AAC AAC CAG CCC GAC AGC CTG GCC TCG TAC TTC GCC GCC GAA CAC GGC 1441 Asn asn gln pro asp ser leu ala ser tir fen ala ala glu his gli 60 65 70 75 CCT TCG GTG TGC GGC ATG GCG TTC CGG GTC AAA GAC TCG CAG CAG GCT 1489 Pro ser val cis gli met ala fen arg val lis asp ser gln gln ala 80 85 90 TAC AAC CGC GCG TTG GAA CTG GGC GCC CAG CCG ATT CAT ATC GAA ACC 1537 Tir asn arg ala leu glu leu gli ala gln pro ile his ile glu tre 95 100 105 GGC CCG ATG GAA CTC AAC CTG CCG GCC ATC AAG GGC ATC GGC GGT GCG 1585 Gli pro met glu leu asn leu pro ala ile lis gli ile gli gli ala 110 115 120 CCG CTG TAC CTG ATC GAC CGC TTC GGT GAA GGC AGC TCG ATA TAT GAC 1633 Pro leu tir leu ile asp arg fen gli glu gli ser ser ile tir asp 125 130 135 ATC GAC TTC GTG TAC CTC GAA GGT GTC GAC CGC AAC CCG GTA GGC GCG 1681 lie asp fen val tir leu glu gli val asp arg asn pro val gli ala 140 145 150 155 GGC CTC AAG GTC ATC GAC CAC CTG ACC CAC AAC GTG TAT CGC GGC CGC 1729 Gli leu lis val ile asp his leu tre his asn val tir arg gli arg 160 165 170 ATG GCC TAC TGG GCC AAC TTC TAC GAG AAA CTG TTC AAC TTC CGT GAA 1777 Met ala tir ala asn fen tir glu lis leu fen asn fen arg glu 175 180 185 GCA CGC TAC TTC GAT ATC AAG GGC GAA TAC ACC GGC CTT ACG TCC AAG 1825 Ala arg tir fen asp ile lis gli glu tir tre gli leu tre ser lis 190 195 200 GCC ATG AGT GCC CCG GAC GGC ATG ATC CGC ATC CCG CTG AAC GAG GAA 1873 Ala met ser ala pro asp gli met ile arg ile pro leu asn glu glu 205 210 215 TCG TCC AAG GGC GCC GGC CAG ATC GAA GAG TTC CTG ATG CAG TTC AAC 1921 Ser ser lis gii ala gli gln ile glu glu fen leu met gln fen asn 220 225 230 235 GGC GAG GGC ATC CAG CAC GTG GCG TTC CTC ACC GAA GAC CTG GTC AAG 1969 Gli glu gii ile gln his val ala fen leu tre glu asp leu val lis 240 245 250 ACC TGG GAT GCG TTG AAG AAG ATC GGC ATG CGC TTC ATG ACC GCG CCG 2017 Tre trp asp ala leu lis lis iel gli met arg fen met tre ala pro 255 260 265 CCG GAC ACC TAC TAC GAA ATG CTC GAA GGC CGC CTG CCA AAC CAC GGC 2065 Pro asp tre tir tir glu met leu glu gli arg leu pro asn his gli 270 275 280 GAG CCG GTG GAC CAA CTG CAG GCG CGC GGT ATT TTG CTG GAC GGC TCC 2113 Glu pro val asp gln leu gln ala arg gli ile leu leu asp gli ser 285 290 295 TCG ATC GAG GGC GAC AAG CGC CTG CTG CTG CAG ATC TTC TCG GAA ACC 2161 Fen val ser asp ser ser ser leu ser gli gli fen fen gli pro lis 300 305 310 315 CTG ATG GGC CCG GTG TTC TTC GAA TTC ATC CAG CGC AAA GGC GAC GAT 2209 Leu met gil pro val fen fen glu fen ile gln arg lis gli asp asp 320 325 330 GGG TTT GGC GAG GGC AAC TTC AAG GCG CTG TTC GAG TCG ATC GAG CQC 2257 Gli fen gli glu gli asn fen lis ala leu fen glu ser ile glu arg 335 340 345 GAC CAG GTA CGT CGC GGT GTA CTG ACC ACC GAC TAAGCGTCAG CAACAAAAAA2310 Asp gln val arg arg gli val leu tre tre asp 350 355 AGCCCGGCGA GAAGGTTTTC AGCCGGGCTT TTTAGTGCCT GCACGTTTTA AGCTTTGCGC2370 TGACGCACCA AATGTTTGAA GCCTTCATAC ACCAGCACCA TCACGGCCAG CCAGATCGGG2430 ATATACGTCA GCCATTGCCC GCCCTTGATG CCTTCGCCCA ACAACAAGGC CACAAAGACC2490 AGTAATACCG GCTCCACATA GCTGAGCAAC CCGAACAGGC TAAGGCCA TAACGGCTG 550 GCGATGATGT AGCTCACCAG CGCTGAAGCA CT (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 358 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (A) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 4 Met ala asp gln tir glu asn pro met gli leu 1 5 10 Met gli fen glu fen ile glu fen ala ser pro tre pro gli tre leu 15 20 25 Glu pro ile fen glu ile met 35i fen tre lis val ala tre his arg 30 20 40 Ser lis asn val his leu tir arg gln gli glu ile asn leu ile leu 45 50 55 Asn asn gln pro asp ser leu ala ser tir fen ala ala glu his gli 60 65 70 75 Pro ser val cis gli met ala fen arg val lis asp ser gln gln ala 80 85 90 Tir asn arg ala leu glu leu gli ala gln pro ile his ile glu tre 95 100 105 Gli pro met glu leu asn leu pro ala ile lis gli ile gli gli ala 110 115 120 Pro leu tir leu ile asp arg fen gli glu gli ser ser ile tir asp 125 130 135 lie asp fen val tir leu glu gli val asp arg asn pro val gli ala 140 145 150 155 Gli leu lis val ile asp his leu tre his asn val tir arg gli arg 160 165 170 Met ala tir ala asn fen tir glu lis leu fen asn fen arg glu 175 180 185 Ala arg tir fen asp ile lis gli glu tir tre gli leu tre ser lis 190 195 200 Ala met ser ala pro asp gli met ile arg ile pro leu asn glu glu 205 210 215 Ser ser lis gli ala gli gln ile glu glu fen leu met gln fen asn 220 225 230 235 Gli glu gli ile gln his val ala fen leu tre glu asp leu val lis 240 245 250 Tre trp asp ala leu lis lis iel gli met arg fen met tre ala pro 255 260 265 Pro asp tre tir tir glu met leu glu gli arg leu pro asn his gli 270 275 280 Glu pro val asp gln leu gln ala arg gli ile leu leu asp gli ser 285 290 295 Fen val ser asp ser ser ser leu ser gli gli fen fen gli pro lis 300 305 310 315 Leu met gli pro val fen fen glu fen ile gln arg lis gli asp asp 320 325 330 Gli fen gli glu gli asn fen lis ala leu fen glu ser ile glu arg 335 340 345 Asp gln val arg arg gli val leu tre tre asp 351 355 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 5 : TATGAGAATC CTATGGG 17 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 6 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (E) TIPO: ácido nucleico (B) CADENA: una (C) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 6 : GCTTTGAA GTTTCCCTC 17 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 7 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 46 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 7 : GTTAGGTACC AGTCTAGACT GACCATGGCC GACCAATACG AAAACC 46 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 8 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 43 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 8 TAGCGGTACC TGATCACCCG GGTTATTAGT CGGTGGTCAG TAC 43 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 9 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 516 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 9 Met ala gln ile asn asn met ala gln gli ile gln tre leu asn pro 5 5 10 15 asn ser asn fen his lis pro gln val pro lis ser ser ser fen leu 20 25 30 val fen gli ser lis lis leu lis asn ser ala asn ser met leu val 35 40 45 leu lis lis asp ser ile fen met gln lis fen cis ser fen arg ile 50 55 60 ser ala ser val ala tre ala gln lis pro ser glu ile val leu gln 65 70 75 80 pro ile lis glu ile ser gli tre val lis leu pro gli ser lis ser 85 90 95 leu ser asn arg ile leu leu leu ala ala leu ser glu lgi tre tre 100 105 110 val val asp asn leu leu ser ser asp asp ile his tri met leu gli 115 120 125 ala leu lis tre leu gli leu his val glu glu asp ser ala asn gln 130 135 140 arg ala val val glu gli cis gli gli leu fen pro val gli lis glu 145 150 155 160 ser lis glu glu ile gln leu fen leu gli asn ala gli tre ala met 165 170 175 arg pro leu tre ala ala val tre val ala gli gli asn ser arg tir 180 185 190 val leu asp gli val pro arg met arg glu arg pro ile ser asp leu 195 200 205 val asp gli leu lis gln leu gli ala glu val asp cis fen leu gli 210 215 220 tre lis cis pro pro val arg ile val ser lis gli gli leu pro gli 225 230 235 240 gli lis val lis leu ser gli ser ile ser ser gln tir leu tre ala 245 250 255 leu leu met ala ala pro leu ala leu gli asp val glu ile glu ile 260 265 270 ile asp lis leu ile ser val pro tir val glu met tre leu lis leu 275 280 285 met glu arg fen gli ile ser val glu his ser ser ser trp asp arg 290 295 300 fen fen val arg gli gli gln lis tir lis ser pro gli lis ala fen 305 310 315 320 val glu gli asp ala ser ser ala ser tir fen leu ala gli ala ala 325 330 335 val tre gli gli tre ile tre val glu gli cis gli tre asn ser leu 340 345 350 gln gli asp val lis fen ala glu val leu glu lis met gli ala glu 355 360 365 val tre trp tre glu asn ser val tre val lis gli pro pro arg ser 370 375 380 ser ser gli arg lis his leu arg ala ile asp val asn met asn lis 385 390 395 40Q met pro asp val ala met tre leu ala val val ala leu tir ala asp 405 410 415 gli pro tre ala ile arg asp val ala ser trp arg val lis glu tre 420 425 430 glu arg met ile ala ile cis tre glu leu arg lis leu gli ala tre 435 440 445 val glu glu gli pro asp tir cis ile ile tre pro pro glu lis leu 450 455 460 asn val tre asp ile asp tre tir asp asp his arg met ala met ala 465 470 475 480 fen ser leu ala ala cis ala asp val pro val tre ile asn asp pro 485 490 495 gli cis tre arg lis tre fen pro asn tir fen asp val leu gln gln 500 505 510 tir ser lis his 515 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (E) CADENA: una (F) TOPOLOGÍA: desconocida (v) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (vi) HIPOTÉTICA: NO (vii) ANTISENTIDO; NO (vii) FUENTE ORIGINAL: (B) ORGANISMO: promotor (xii) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: AACAAGGTGG CGCAGTT 17 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (E) TIPO: ácido nucleico (F) CADENA: una (G) TOPOLOGÍA: DESCONOCIDA (v) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (vi) HIPOTÉTICA: NO (vii) ANTISENTIDO: NO (vii) FUENTE ORIGINAL: (B) ORGANISMO: promotor (xii) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: CATCGCAAGA CCGGCAACAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (F) TIPO: ácido nucleico (G) CADENA: una (H) TOPOLOGÍA: desconocida (iii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (B) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (v) HIPOTÉTICA: NO (vi) ANTISENTIDO: NO (vii) FUENTE ORIGINAL: (B) ORGANISMO: promotor (xii) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 12 GATCGCTACT AGCTTCCCA 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 13 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (I) TIPO: ácido nucleico (D) CADENA: una (E) TOPOLOGÍA: desconocida (iii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (B) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (v) HIPOTÉTICA: NO (vi) ANTISENTIDO: NO (vii) FUENTE ORIGINAL: (B) ORGANISMO: promotor (xii) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 13 AATCAAGGTA ACCTTGAATC CA 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 14 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de bases (E) TIPO: ácido nucleico (F) CADENA: una (G) TOPOLOGÍA: desconocida (iii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (B) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (v) HIPOTÉTICA: NO (vi) ANTISENTIDO: NO (vii) FUENTE ORIGINAL: (B) ORGANISMO: promotor (xii) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 14 : AATTACGGAA GCTTCCGT 18 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (E) TIPO: ácido nucleico (F) CADENA: una (G) TOPOLOGÍA: desconocida (iii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (B) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (v) HIPOTÉTICA: NO (vi) ANTISENTIDO: NO (vii) FUENTE ORIGINAL: (B) ORGANISMO: promotor (xii) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15 AGCTTGTACA CCGGTGTACA 20 2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (G) CADENA: una (H) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO; NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO : promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:16: CGGACAATTA ATTGTCCGGT AC 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 17 : (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: DESCONOCIDA (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: CATTTGCGGC CGCAAATGGT AC 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: AATTCATTTG CGGCCGCAAA TG 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: AGCTTGCAGC GGCCGCTGCA 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:20: AATTCATTTG CGGCCGCAAA TG 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: CTCGAGTATT TTTACAACAA TTACCAAC 28 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO; NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 22 AATCAAGGTA ACCTTGAATC CA 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: DESCONOCIDA (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:23: ACCACCAACG GTGTTCTTGC TGTTGA 26 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 24 GCATTACATG TTAATTATTA CATGCTT 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida ( Ü : TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:25: GTGATACGAG TTTCACCGCT AGCGAGAC 28 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 26 TACCTTGCGT GGACCAAAGA CTCC 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (B) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 27: ATGGCTTCCG CTCAAGTGAA GTCC 24 INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO; NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 28 CGAGACCCAT AACGAGGAAG CTCA 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: DESCONOCIDA (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 29: ATTGCGTGAT TTCGATCCTA ACTT 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 30: GAGAGATGTC GA AGAGGTC TTCT 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 31: GGTGGAGCAC GACACACTTG TCTA 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: una (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "promotor" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: promotor (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 32 GTCTCAATGT AATGGTTA 18

Claims (30)

1. REIVINDICACIONES 1. Un polinucleótido caracterizado porque comprende por lo menos una primera región que codifica una primera proteína capaz de conferir en una planta, o tejido qµe la comprende, resistencia o tolerancia a un primer herbicida, y una segunda región que codifica una segunda proteína similar capaz de conferir resistencia a un segundo herbicida, con las condiciones (i) que el polinucleótido no codifica una proteína de fusión que comprende solamente una 5-enol-piruvil-3 -fosfoshikimato sintetasa (EPSPS) y una glutationa S transferasa (GST) ; (ii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifican la superóxido dismutasa (SOD) y glutationa S transferasa (GST) ; y (iii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifiquen GST y fosfinotricin acetil transferasa (PAT) .
2. 2. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cada una de las regiones está bajo el control de expresión de un promotor y terminador operable vegetal .
3. 3. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el primer herbicida es un herbicida post emergencia y el segundo herbicida es un herbicida pre emergencia.
4. 4. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las proteínas se selecciona del grupo que consiste de glifosato oxido reductasa, 5-enol-piruvil-3-fosfoshikimato sintetasa, fosfinotricin acetil transferasa, hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, glutationa S transferasa citocromo P450, i^cetil-COA carboxilasa, acetolactato sintasa, protoporfirinogen oxidasa, dihidropteroato sintasa, proteínas que transportan poliamina, superóxido dismutasa, bromoxinil nitrilasa, fitoene desaturasa, el producto del gen tfdA obtenible de Alcaligenes eutrophus, y mutado o de otra forma variantes modificadas de las proteínas.
5. 5. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque además comprende una región que codifica una proteína capaz de proporcionar a la planta la resistencia o tolerancia a insectos, desecación y/o infecciones fúngicas, bacterianas o virales .
6. 6. Un polinucleótido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende las secuencias 5 ' de y contiguas con las regiones, las cuales las secuencias codifican (i) un péptido el cual es capaz de objetivar los productos de traducción de las regíoiies a plástidos tales como cloroplastos, mitocondrias, otros organelos o paredes celulares vegetales; y/o (ii) secuencias de mejora de traducción no traducidas.
7. 7. Un polinucleótido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque es modificado en se eliminan los motivos y/o regiones de eliminación de intrones fortuitos de inestabilidad de ARNm, o se usan codones preferidos de plantas de tal forma que la expresión del polinucléotido modificado de esta forma produce en una planta proteína sustancialmente similar que tiene una actividad/función sustancialmente similar a aquella obtenida por expresión del polinucleótido no modificado en el organismos en el cual las regiones que codifican proteínas del polinucleótido no modificado son endógenas, con la condición de que si el polinucleótido modificado de esta forma comprende codones vegetales preferidos, el grado de identidad entre las regiones que codifican la proteína dentro del polinucleótido modificado y regiones que codifican proteínas similares contenidas endógenamente dentro de la planta y que codifican sustancialmente la misma proteína sea menor a aproximadamente 70%.
8. 8. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizado porque el herbicida pre emergencia se selecciona del grupo que consiste de un herbicida de dinitroanilina, difenil éter, sulfonil urea, fosfosulfonatos, oxiacetamidas, tetrazolinonas y N-carbamoiltetrazolinonas imidazolinona, tiocarbamto, triazina, triazolopirimidinas, uracil, una fenilurea, tricetona, isoxazol, acetanilida, oxadiazol, triazinona, sulfoanilidad, amida, anilida, RP201772, flruocloridona, norflurazon, y herbicida del tipo triazolinona y el herbicida post emergencia se selecciona del grupo que consiste glifosato y sales del mismo, glufosinato, asulam, bentazon, bialafos, bromcacil, setoxidim u otra ciclohexadiona, dicamba, fosamina, flupoxam, fenoxipropionato, quizalof u otro ariloxi fenoxipropanoato, picloram, fluormetron, atrazina, quizalofop u otra triazina, metribuzin, clorimuron, clorsulfuron, flumetsulam, halosulfuron, sulfometron, imazaquin, imazetapir, isoxaben, imazamox, metosulam, piritrobac, rimsulsufuron, bensulfuron, nicosulfuron, fomesafen, fluroglicofen, KIH9201, ET751, carfentrazona, ZA1296, sulfcotriona, paraquat, diaquat, bromoxinil y fenoxaprop.
9. 9. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque el el herbicida pre emergencia se selecciona del grupo que consiste de acetanilidas, tricetonas, PDS inhibidores, tiocarbamatos, tetrazolinonas, y el herbicida post emergencia se selecciona del grupo que consiste glifosato, glufosinato, paraquat, y bialafos.
10. 10. Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a 9.
11. 11. Plantas caracterizadas porque comprenden un polinucleótido que comprende por lo menos una primera regió que codifica una primera proteína capaz de conferir en una planta, o tejido que la comprende, resistencia o tolerancia a un primer herbicida, y una segunda región que codifica una segunda proteína similar capaz de conferir resistencia a un segundo herbicida, con las condiciones (i) que el polinucleótido no codifica una proteína de fusión que comprende solamente una 5-enol-piruvil-3-fosfoshikimato sintetasa (EPgPS) y una glutationa S transferasa (GST) ; (ii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifican la superóxido dismutasa (SOD) y glutationa S transferasa (GST) ; y (iii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifiquen GST y fosfinotricin acetil transferasa (PAT) ; y (iv) que cuando la planta sea remolacha, los genes que confieren resistencia o tolerancia al herbicida que esta comprende no sean únicamente EPSPS y PAT.
12. 12. Plantas de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizadas porque el primer herbicida es un herbicida post emergencia y el segundo herbicida es un herbicida pre emergencia.
13. 13. Plantas que incluyen partes, semillas y progenie de las mismas caracterizadas porque son resisterjtes a por lo menos dos herbicidas y las cuales han sido obtenidas de material el cual ha sido transformado con el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el vector de conformidad con la reivindicación 10.
14. 14. Las plantas de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizadas porque se seleccionan del grupo que consiste de cereales de grano pequeño, siembras de semillas de aceite, plantas de fibras, frutas, vegetales, cultivos de plantaciones y árboles.
15. 15. Las plantas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizadas porque se seleccionan del grupo que consiste de frijol de soya, algodón, tabaco, remolacha, semilla de colza, cañóla, lino, girasol, papa, tomate, alfalfa, lechuga, maíz, trigo, sorgo, centeno, plátanos, cebada, avena, hierba artificial, forraje, caña de azúcar, chícharo, frijol de campo, arroz, pino, álamo, manzano, uva, plantas cítricas o de nuez y la progenie, semillas y partes de tales plantas .
16. 16. Un método para controlar selectivamente las hierbas en un campo que comprende hierbas y plantas de cultivo, en donde las plantas de cultivo comprenden (i) un polinucleótido que comprende por lo menos una primera región que codifica una primera proteína capaz de conferir en una planta, o tejido que lo comprende, resistencia o tolerancia a un primer herbicida, y una segunda región que codifica una segunda proteína similar capaz de conferir resistencia a un segundo herbicida, con las condiciones (i) que el polinucleótido no codifica una proteína de fusión que comprende solamente una 5-enol-piruvil-3-fosfoshikimato sintetasa (EPSPS) y una glutationa S transferasa (GST) ; (ii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifican la superóxido dismutasa (SOD) y glutationa S transferasa (GST) ; y (iii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifiquen GST y fosfinotricin acetil transferasa (PAT) ; y (iv) , que cuando la planta de cultivo sea remolacha, los genes que confieren resistencia o tolerancia a un herbicida que este comprende no sean únicamente EPSPS y PAT; o (ii) un polinucleótido que comprende por lo menos una primera región que codifica una primera proteína capaz de conferir en una planta, o tejido que lo comprende, resistencia o tolerancia a un primer herbicida, y un polinucleótido que comprende una segunda región que codifica una segunda proteína similar capaz de conferir resistencia a un segundo herbicida, con las condiciones (i) que el polinucleótido no codifica una proteína de fusión que comprende solamente una 5-enol-piruvil-3-fosfoshikimato sintetasa (EPSPS) y una glutationa S transferasa (GST) ; (ii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifican la superóxido dismutasa (SOD) y glutationa S transferasa (GST) ; y (iii) que el polinucleótido no comprenda solo regiones que codifiquen GST y fosfinotricin acetil transferasa (PAT) ; y (iv) , que cuando la planta de cultivo sea remolacha, los genes que confieren resistencia o tolerancia a un herbicida que este comprende no sean únicamente EPSPS y PAT; el método que comprende la aplicación al campo de por lo menos uno de los herbicidas en una cantidad suficiente para controlar las semillas sin afectar sustancialmente las plantas de cultivo.
17. 17. Un método de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque las plantas de cultivo comprenden un gen que codifica una enzima EPSPS y un gen que codifica una enzima GST, el método que comprende aplicación al campo de glifosato y acetanilida en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmentp las plantas de cultivo.
18. 18. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las plantas de cultivo comprenden un gen que codifica una enzima HPPD y un gen que codifica una enzima PAT, el método que comprende aplicación al campo de tricetona y glufosinato en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmente las plantas de cultivo.
19. 19. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las plantas de cultivo comprenden un gen que codifica una enzima PAT y un gen que codifica una enzima GST, el método que comprende aplicación al campo de glufosinato y acetanilida, tiocarbamato y/o tetrazolinona en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmente las plantas de cultivo.
20. 20. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las plantas de cultivo comprenden un gen que codifica una enzima EPSPS y/o enzima GOX y un gen que codifica una enzima HPPD, el método que comprende aplicación al campo de glifosinato y una tricetona en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmente las plantas de cultivo.
21. 21. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las plantas de cultivo comprenden un gen que codifica una enzima PDS y un gen que codifica una enzima EPSPS y/o una enzima GOX, el método que comprende aplicación al campo de un inhibidor PDS y glifosinato en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmente las plantas de cultivo.
22. 22. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las plantas de cultivo comprenden un gen que codifica una enzima EPSPS y/o una enzima GOX y un gen que codifica una enzima PAT, el método que comprende aplicación al campo de glifosinato y glufosinato en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmente las plantas de cultivo, con la condición de que las plantas no sean remolacha.
23. 23. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las plantas de cultivo comprenden un gen que codifica una enzima PDS y un gen que codifica una enzima PAT, el método que comprende aplicación al campo de un inhibidor de PDS y glufosinato en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmente las plantas de cultivo.
24. 24. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las plantas de cultivo comprenden un gen que codifica una enzima PDS y un gen que codifica una enzima GST, el método que comprende aplicación al campo de un inhibidor PDS y herbicida acetanilida, en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmente las plantas de cultivo.
25. 25. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-24, caracterizado porque las plantas de cultivo además contienen un gen que codifica ALS, SOD o BNX el método que comprende aplicación al campo de un herbicida sulfonil urea, paraquat o bromoxinil en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmente las plantas de cultivo.
26. 26. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, caracterizado porque además comprende aplicación al campo de una cantidad pesticidamente efectiva de uno o más insecticidas, fungicidas, bacteriocidas, nematicidas y antivirales.
27. 27. Un método para producir plantas las cuales son sustancialmente tolerantes o sustancialmente resistentes a dos o más herbicidas, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) transformar el material vegetal con el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el vector de la reivindicación 10; (ii) seleccionar el material transformado de esta forma; y (iii) regenerar el material selecciona de esta forma en plantas enteras fértiles morfológicamente normales.
28. 28. El uso del polinucléotido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el vector de la reivindicación 10, en la producción de tejidos vegetales y/o plantas enteras fértiles morfológicamente normales (i) las cuales son sustancialmente tolerantes o sustancialmente resistentes a dos o más herbicidas.
29. 29. El uso del polinucleótido de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a 9, o el vector de la reivindicación 10, en la producción de un herbicida objetivo para la evaluación in vitro de alta productividad de herbicidas potenciales .
30. 30. El uso de conformidad con la reivindicación precedente, en donde la las regiones que codifican proteína del polinucleótido son expresadas heterólogamente en E. coli o levadura.