MXPA99004150A - Variantes de subtilasa y composiciones que las contienen - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a enzimas producidas por mutación de genes para diversas subtilasas y que expresan genes mutados en huéspedes adecuados. Las enzimas muestran estabilidad mejorada autoproteolítica en comparación con las enzimas originales de tipo silvestre.

Description

VARIANTES DE SUBTILASA Y COMPOSICIONES QUE LAS CONTIENEN CAMPO TÉCNICO Esta invención se relaciona con enzimas de proteasa mutantes novedosas o variantes de enzima útiles para formular composiciones detergentes y que muestran estabilidad aumentada autoproteolitica; composiciones limpiadoras y de detergente que contienen tales enzimas; genes mutados que codifican para la expresión de tales enzimas cuando se insertan en una célula u organismo huésped adecuado; y tales células huésped transformadas con los mismos y capaces de expresar las enzimas variantes de enzima.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En la industria de los detergentes las enzimas se han implementado durante más de 30 años en las formulaciones de lavado. Las enzimas utilizadas en tales formulaciones comprenden proteasas, lipasas, amilasas, celulasas asi como otras enzimas o mezclas de las mismas. Las enzimas comercialmente más importantes son las proteasas. Aunque se han utilizado las proteasas en la industria de los detergentes durante más de 30 años, se desconoce aún mucho de los detalles de como interactúan estas enzimas con FEF.: 30094 sustratos y/o con otras sustancias presentes, por ejemplo, en las composiciones detergentes. Algunos factores se relacionan con los residuos específicos de las proteasas y la manera en que afectan ciertas propiedades, tales como la estabilidad oxidativa y térmica en general, de las proteasas, pero aún permanece mucho por encontrarse. Además, aún no se conoce exactamente que características físicas o químicas son las responsables para un buen funcionamiento de lavado o estabilidad de una proteasa en una composición detergente específica. Las proteasas utilizadas actualmente se fundan en su mayor parte por proteasas aisladas de la naturaleza y sus pruebas en formulaciones de detergente . Hasta la fecha, se conocen por lo menos las siguientes proteasas las cuales están disponibles comercialmente y muchas de ellas se venden en grandes cantidades en muchos países en el mismo. La subtilisina BPN' o Novo (disponible de, por ejemplo, SIGMA, St. Louis, Estados Unidos) y la subtilisina Carlsberg, ALCALASE (NOVO NORDISK A/S)) y MAXATASE (Genencor) . Una subtilisina de Bacillus lentus, la subtilisina 309, vendida por NOVO NORDISK A/S como SAVINASEMR. Una variante de proteína sometida a ingeniería de esta enzima se vende como DURAZYM™.

Las enzimas que recuerdan cercanamente a SAVINASE™, tales como subtilisina PB92, MAXACAL™ vendida por Genencor Inc. (una variante de proteína sometida a ingeniería de esta enzima se vende como MAXAPEM™) , OPTICLEAN™ vendida por SOLVAY et Cié, y PURAFECT™ vendida por GENENCOR International . Una subtilisina de Bacillus lentus , la subtilisina 147, vendida por NOVO NORDISK A/S como ESPERASE™. Un número cada vez mayor de proteasas utilizadas comercialmente son variantes de proteína sometidas a ingeniería de proteasas de tipo silvestre que se presentan de manera natural, por ejemplo DURAZYM™ (Novo Nordisk A/S) , RELASE™ (Novo Nordiks A/S), MAXAPEM™ (Gist-Brocades N.V.), PURAFECT™ (Genencor International, Inc.). Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar variantes de proteína mejoradas de proteasa sometida a ingeniería, especialmente para uso en la industria de los detergentes .

PROTEASAS Las enzimas que separan los enlaces amida en los sustratos de proteína se clasifican como proteasas o (intercambiablemente) como peptidasas (véase Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms . W.H. Freeman and Company, San Francisco, Capítulo 3) . Las bacterias de la especie Bacillus secretan dos tipos extracelulares de proteasa, proteasas neutras (o metaloproteasas) y proteasas alcalinas entre las cuales la más importante funcionalmente es una serina endopeptidasa y que actualmente se denomina como subtilisina.

SERINAS PROTEASAS Una serina proteasa es una enzima la cual cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos y en la cual existe un residuo serina esencial en el sitio activo (White, Handler, y Smith, 1973 " Principies of Biochemistry, " Quinta edición, McGraw-Hill "Book Company, NY, pp . 271-272) . Las serinas proteasas bacterianas tienen pesos moleculares en el intervalo de 20,000 a 45,000 unidades daltón. Se inhiben por fluorofosfato de diisopropilo. Hidrolizan esteres terminales sencillos y son similares en actividad a la quimiotripsina eucariótica, también una serina proteasa. Un término más estrecho, proteasa alcalina, cubre un subgrupo y refleja el pH óptimo elevado de algunas de las serinas proteasas, de pH 9.0 a 11.0 (para una revisión véase Priest (1977) Bacteriológica! Rev. 41 711-753) .

SUBTILASAS Un subgrupo de las serinas proteasas denominado tentativamente subtilasas se ha propuesto por Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 119 -131 . Se definen por análisis de homología de más de 40 secuencias de aminoácidos de serinas proteasas denominadas previamente como proteasas similares a subtilisina. Una subtilisina se ha definido previamente como una serina proteasa producida por bacterias grampositivas u hongos, y de acuerdo con Siezen et al., ahora es un subgrupo de las subtilasas. Se han identificado una amplia variedad de subtilisinas, y se han determinado la secuencia de aminoácidos de numerosas subtilisinas. Estas incluyen más de seis subtilisinas de las cepas de Bacillus , específicamente la subtilisina 168, la subtilisina BPNd subtilisina Carlsberg, subtilisina Y, subtilisina aminosacarit icus y mesentericopeptidasa (Kurihara et al. (1972) J. Biol . Chem. 247 5629-5631; Wells et al. (1983) Nucleic Acids Res . 11 7911-7925; Stahl y Ferrai (1984) J". Bacteriol . 159 811-819, Jacobs et al. (1985) Nucí . Acids Res . 13 8913-8926; Nedkov et al. (1985) Biol . Chem. Hoppe-Seyler 366 421-430, Svendsen et al. (1996) FEBS Lett . 196 228-232) , una subtilisina de un actinomicetales, termitasa de Thermoactinomyces vulgaris (Meloun et al. (1985) FEBS Lett . 198 195-200) , y una subtilisina micótica, la proteinasa K de Tri tirachium álbum (Jany y Mayer (1985) Biol .

Chem . Hoope-Seyler 366 584-492) , para una referencia adicional se ha reproducido más adelante la tabla I de Siezen et al. Las subtilisinas han sido bien caracterizadas física y químicamente. Además del conocimiento de la estructura primaria (secuencia de aminoácidos) de estas enzimas, se ha determinado una alta resolución de más de 50 estructuras de rayos X de subtilisinas las cuales delinean la unión del sustrato, el estado de transición, los productos, por lo menos tres inhibidores diferentes de proteasa y definen las consecuencias estructurales para variación natural (Kraut (1977) Ann . Rev. Biochem. 46 331-358) . Un subgrupo de las subtilasas, I -SI comprende las subtilisinas "clásicas" tales como la subtilisina 168, la subtilisina BPN' , la subtilisina Carlsberg (ALCALASE™, NOVO NORDISK A/S) , y subtilisina DY. Se reconoce por Siezen et al., ( supra) un subgrupo adicional de las subtilasas I-S2. Las proteasas del subgrupo I-S2 se describen como subtilisinas altamente alcalinas y comprenden enzimas tales como subtilisina PB92 (MAXACAL™, Gist-Brocades NV) , subtilisina 309 (SAVINASE™, NOVO NORDISK A/S) , subtilisina 147 (ESPERASE™, NOVO NORDISK A/S) y elastasa alcalina YaB . Las mutaciones aleatorias y dirigidas hacia un sitio del gen para subtilasa han hecho surgir el conocimiento de las propiedades físicas y químicas de la enzima y han contribuido con información en relación a la actividad catalítica de las subtilasas, especificidad de sustrato, estructura terciaria, etc., (Wells et al. (1987) Proc. Nati . Acad. Sci . E. U.A. 84, 1219-1223; Wells et al. (1986) Phil . Trans . R . Soc . Lond. A. 317 415-423; Hwang y Warshel (1987) Biochem. 26 2669-2673; Rao et al., (1987) Nature 328 551-554. Las publicaciones más recientes que cubren está área son Cárter et al. (1989) Proteins 6 240-248 en relación al diseño de variantes que separan una secuencia objetivo específica en un sustrato (posiciones 24 y 64) ; Graycar et al. (1992) Annals of the New York Academy of Sciences 672 71-79 que discute numerosos resultados publicados previamente; y Takagi (1993) Int . J. Biochem. 25 307-312 que también revisa resultados previos. Especialmente, la mutagénesis dirigida al sitio de los genes para subtilisina ha llamado mucho la atención, y se describen diversas mutaciones en las siguientes solicitudes para patente y patentes : VARIANTES DE PROTEASAS CARACTERIZADAS PREVIAMENTE Numerosas referencias describen construcciones de variantes de proteasa. Con el fin de volver más fácil la adquisición de una revisión del estado de la técnica anterior en general, las referencias se han ordenado en dos secciones.

La sección uno trata con referencias que describen los antecedentes tecnológicos y la identificación de variantes de proteasa que actualmente no se considera que estén relacionados con las variantes descritas en la presente invención. Estas referencias se incluyen principalmente con el fin de resumir el estado dentro del campo de la construcción de variantes de proteasas para propósitos diversos. La sección dos trata con referencias que describen la identificación de variantes de proteasa que se considera que son de cierta relevancia para las variantes de la presente invención.

Resumen de referencias del estado de la técnica (Sección 1) : EP 130756 (GENENTECH) (que corresponde a la patente norteamericana de expedición número 34,606) (GENEMCOR) en relación a mutaciones específicas de sitio o generadas aleatoriamente en "carbonilhidrolasas" y análisis subsecuente de las enzimas mutadas en base a diversas propiedades, tales como la proporción k^/IC-, perfil de actividad de pH y estabilidad ante la oxidación. Esta publicación reivindica mutación específica de sitio de las subtilisinas BPN' en ciertas posiciones especificadas, es decir, _1Tyr, 32Asp, 155Asn, 104Tyr, 22Met, 166Gly, 54His, 169Gly, 189Phe, 33Ser, 221Ser, 217Tyr, 156Glu o 1SAla, para proporcionar enzimas que muestran propiedades alteradas. Puesto que todas estas posiciones excepto la posición -1 se sabe que están involucradas en el funcionamiento de la enzima antes de la presentación de la solicitud, esta solicitud no contribuye a resolver el problema de decidir si se introducen mutaciones con el fin de obtener enzimas con propiedades deseadas específicas. El documento EP 214435 (HENKEL) se relaciona con la clonación y expresión de la subtilisina Carlsberg y dos mutantes de la misma. En esta solicitud no se proporcionan razones para la mutación de 158Asp a 158Ser y 161Ser a 161Asp. En el documento WO 87/04461 (AMGEN) se propone reducir el número de secuencias Asn-Gly presentes en la enzima con el fin de obtener -enzimas mutadas que muestren estabilidades mejoradas ante el pH y el calor, y la solicitud enfatiza remover, mutar o modificar los residuos 109Asn y a la 218Asn en la subtilisina BPN' . No se proporcionan ejemplos de ninguna supresión para modificar los residuos Gly. El documento WO 87/05050 (GENEX) describe la mutación aleatoria y el análisis subsecuente de numerosos mutantes de subtilisina BPN' para propiedades mejoradas. En la solicitud se describen las mutaciones en las posiciones 218Asn, 131Gly, 254Thr, 1S6Gly, 116Ala, 188Ser, 12SLeu y "Ser. El documento EP 260105 (GENENCOR) describe la modificación de ciertas propiedades en las enzimas que contienen una triada catalítica al seleccionar un residuo aminoácido dentro de aproximadamente 15 Á de la triada catalítica y sustituir el residuo aminoácido seleccionado con otro residuo. Las enzimas de la clase subtilasa descritas en la presente especificación se mencionan específicamente como pertenecientes a la clase de enzimas que contienen una triada catalítica. En las subtilisinas están indicadas las posiciones 222 y 217 como posiciones preferidas para sustitución. Además, se ha demostrado por Thomas, Rusell y fersht (1985) Nature 318 375-376 que el intercambio de "Asp en "Ser en subtilisina BPN1 cambia la dependencia de pH de la enzima. En un artículo subsecuente (1987) J. Mol . Biol . 193 803-813, los mismos autores también discuten la sustitución de la 156Ser en lugar de 156Glu. Ambas mutaciones están dentro de una distancia de aproximadamente 15Á del valor 64His. En Nature 328496-500 (1987) Rusell y Fersht discuten los resultados de sus experimentos y presentan reglas para cambiar los perfiles de actividad de pH al mutar una enzima para obtener cambios en la carga de superficie. Los documentos WO 88/08028 (Genex) y WO 88/08033 (Amgen) se relacionan, ambos, con modificaciones de los residuos de aminoácidos en los sitios de unión de calcio de subtilisina BPN' . Se afirma que la enzima es estabilizada al sustituir residuos cargados más negativamente por los originales.

El documento WO 95/27049 (SOLVAY S.A.) describe una proteasa de tipo subtilisina 309 con las siguientes mutaciones: N43R+N116R+N117R (numeración de BPN'). Los datos indican que la variante correspondiente tiene estabilidad mejorada, en comparación con el tipo silvestre. Los documentos WO 95/30011, WO 95/30010 y WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY) describen 6 regiones, específicamente en la posición 199-220 (numeración de BPN' ) tanto en la subtilisina BPN' como en la subtilisina 309, los cuales están diseñados para cambiar (es decir disminuir) la absorción de la enzima a manchas unidas a las superficie. Se sugiere que la absorción disminuida por una enzima a un sustrato resulta en un mejor funcionamiento de limpieza del detergente. No se proporcionan datos o cualquier variante o datos de funcionamiento de lavado de detergente específicos.

Variantes de proteasa caracterizadas previamente que tienen cierta relevancia con la presente invención (sección dos) : En el documento EP 251 446 (GENENCOR) se describe la manera en que se puede aplicar las consideraciones de homología a niveles estructurales tanto primario como terciario para identificar residuos aminoácidos equivalentes, ya sean conservados o no. Se afirma que esta información junto con el conocimiento de los inventores de la estructura terciaria de la subtilisina BPN' lleva a los inventores a seleccionar numerosas posiciones susceptibles de mutación con la esperanza de obtener mutantes con propiedades alteradas. Las posiciones identificadas de esta manera son: 124Met, 222Met, 104Tyr, 152Ala, 1S6Glu, 166Gly, 169Gly, 189Phe, 217Tyr . También 1??Asn, 21Tyr, 22Thr-24Ser, 32Asp, "Ser, 3SAsp, 46Gly, 48Ala, 49Ser, 50Met, "Asn, "Ser, 94Lys, 95Val, 96Leu, 107Ile, 110Gly, 170Lys, 171Tyr, 172Pro, 197Asp, 199Met, 204Ser, 213Lys, y 221Ser, posiciones las cuales se identifican como lugares en los que se espera influir en las diversas propiedades de la enzima. Además, se ejemplifican numerosas mutaciones para apoyar estas sugerencias. Además de las mutaciones únicas en estas posiciones, los inventores también realizaron numerosas mutaciones múltiples. Además, los inventores identificaron 215Gly, S7His, 12SLeu, 135Leu y los residuos aminoácidos dentro de los segmentos 97-103, 126-129, 213-215 y 152-172 como de interés, pero no se ejemplifican mutaciones en ninguna de estas posiciones. Resulta de interés especial para el propósito de la presente invención el que los inventores del documento EP 251 446 sugieren sustituir 170Lys (en la subtilisina BPN' , tipo I-SI) , específicamente sugieren introducir Glu o Arg por el residuo Lys original. Parece que la variante Glu se produjo y que se encontró que es altamente susceptible a degradación autolítica (véanse las páginas 48, 121, 123 (la tabla XXI incluye un error obvio, pero indica una reducción de la vida media de autólisis de 86 a 13 minutos) y la figura 32. En el documento WO 89/06279 (NOVO NORDISK A/S) se indica a la posición 170 como de interés y se sugiere sustituir el residuo existente con Tyr. Sin embargo, no se proporcionan datos con respecto a tal variante. En el documento WO 91/00345 (NOVO NORDISK A/S) se realiza la misma sugerencia, y se demuestra que la variante Tyr de la posición 170 en la subtilisina 309 (tipo I-S2) muestra un funcionamiento mejorado en el lavado en detergentes a un pH de aproximadamente 8 (variante S003, en las tablas III, IV, V, VI, VIII y X) . La misma sustitución en combinación con otras sustituciones en otras posiciones también indica un funcionamiento mejorado de lavado (S004, S011-S014, S022-S024, S019, S020, S203, S225, S227 en la misma tabla y en la tabla VII) todo de acuerdo con el concepto genérico de la solicitud. En el documento EP 525 610 Al (SOLVAY) se sugiere mejorar la estabilidad de la enzima (una subtilasa tipo I-S2 relacionada estrechamente con la subtilisina PB92) hacia tensiuros iónicos al disminuir la hidrofobicidad en ciertas regiones de la superficie de la misma. Se sugiere sustituir Gln por la Arg en la posición 164 (170 si se utiliza la numeración BPN') . En la solicitud no se describen variantes que comprendan esta sustitución.

En el documento WO 94/02618 (GIST-BROCADES N.V. ) se describen diversas variantes de la posición 164 (170 si se utiliza la numeración BPN') de la subtilisina PB92 tipo I-S2.

Se proporcionan ejemplos que muestran la sustitución de Met, Val, Tyr, e lie, por la Arg original. Las pruebas de funcionamiento en lavado en los detergentes en polvo de las variantes indica una ligera mejoría. Especialmente para la variante lie se indica una mejoría en las pruebas de funcionamiento de lavado sobre cacao de aproximadamente 20-30%. No se proporciona "datos de estabilidad. En el documento PCT/DK96/00207 (aún no publicado) se describen numerosas variantes de proteasa con funcionamiento de lavado y/o estabilidad de almacenamiento mejorados. Se ha encontrado que las variantes de subtilasa con funcionamiento de lavado mejorado se pueden obtener al sustituir uno o más residuos de aminoácidos situados en, o en la vecindad de un dominio hidrofóbico de la subtilasas original por un residuo aminoácido más hidrofóbico que el residuo original, el dominio hidrofóbico comprende los residuos que comprenden a los residuos 1165, Y167, Y171 de BLS309 (en la numeración BASBPN) y los residuos en la vecindad del mismo que comprende E136, G159, S164, R170, A194, y G195 de BLS309 (en la numeración BASBPN) (PCT/DK96/00207) . La patente norteamericana número 5,543,302 describe la identificación de un sitio de ruptura autoproteolítico importante en diferentes proteasas de tipo silvestre (MILEZYME™, SAVINASE™ y ESPERASE™) . La presente invención se enfoca sobre variantes especificas de proteasa que afectan la posición de sitios de ruptura autoproteolíticos en un grupo de variantes de proteasa descritos en nuestra solicitud de patente pendiente PCT/DK96/00207. Las variantes de la presente invención se ha encontrado sorprendentemente que muestran un patrón de degradación autoproteolítico alterado en comparación con el patrón de degradación autoproteolítico descrito para las proteasas correspondientes de tipo silvestre en el documento US 5,543,302.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado ahora sorprendentemente que las variantes de subtilasa que tienen modificaciones de uno o más residuos aminoácidos situados en las posiciones que corresponden a los residuos P129, P131, E136, G159, S164, 1165, Y167, R170, Y171 de BLS309 (en la numeración BASBPN) , tienen un patrón alterado de degradación autoproteolítica, en comparación con el tipo silvestre correspondiente. La alteración primaria es un sitio de ruptura autolítico localizado aparentemente entre los residuos 132-133 (en la numeración BASBPN) . Se sabe que SAVINASE™ tiene una especificidad amplia de sustrato y ante incubación extensa se autoseparará asi misma en numerosos sitios. Sin embargo, los 1-5 sitios de ruptura iniciales (sitios primarios) son de más relevancia para aplicaciones industriales de las proteasas de subtilasa. Tales sitios de ruptura autolítica localizados entre los residuos 132-133 actualmente se considera que constituye un sitio de ruptura autoproteolítica primario nuevo. Se considera actualmente que es la primera vez que se ha identificado este sitio de ruptura autoproteolítico, como un sitio de ruptura autoproteolítica primario, en una enzima proteasa subtilasa. Para detalles adicionales se hace referencia a un ejemplo de trabajo en la presente (véase más abajo) . En consecuencia, en su primer aspecto, la presente invención se relaciona con una variante de enzima subtilasa caracterizada porque está derivada de un precursor de enzima subtilasa que tiene un sitio de división autoproteolítico entre los residuos 132 y 133 (en la numeración de BASBPN) , el cual se ha modificado adicionalmente por sustitución, inserción o supresión en o dentro de uno o más de los residuos situados en las posiciones que corresponden a los residuos 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 de BLS309 (en la numeración BASBPN); por lo que la variante muestra estabilidad autoproteolítica aumentada en relación a la enzima subtilasa precursora. En un segundo aspecto, la invención se relaciona con una variante de enzima subtilasa caracterizada porque está derivada de una variante de enzima subtilasa precursora que tiene modificación o modificaciones en uno o más residuos aminoácidos situados en posiciones que corresponden a los residuos G159, S164, 1165, Y167, R170, Y171 de BLS309 (en la numeración BASBPN) ; la cual además se ha modificado por sustitución, inserción o supresión en o dentro de uno o más residuos situados en posiciones que corresponden a los residuos 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (en la numeración BASBPN) ; por lo que las variantes muestran estabilidad autoproteolítica aumentada en relación a la variante de subtilasa precursora la cual no es modificada en ninguna de las posiciones 129-136. El documento US 5,542,302 describe que SAVINASE™ tiene un sitio de ruptura autoproteolítico localizado entre los residuos 192-193 (en la numeración BASBPN) y sugiere realizar modificaciones en una región amplia alrededor de este sitio (entre el residuo 180-210) con el fin de obtener una variante con estabilidad autoproteolítica aumentada. Los presentes inventores han confirmado que este ciclo autoproteolítico entre los residuos 192-193 (en la numeración BASBPN) en tanto en SAVINASE™ como en variantes de SAVINASE™ tienen modificaciones en uno o más residuos aminoácidos situados en posiciones que corresponden a los residuos P129, P131, E136, G159, S164, 1165, Y167, R170, Y171 de BLS309 (en la numeración BASBPN) . Los presentes inventores sugieren modificaciones específicas (mutaciones) en la vecindad del sitio autoproteolítico entre los residuos 192-193 (en la numeración BASBPN) , tal como S190P y G193A (en la numeración BASBPN) . Tales mutaciones específicas no se discuten o indican en el documento US 5,543,302, en donde únicamente se describe una región más bien amplia (entre los residuos 180-210) y no se describen mutaciones específicas que resulten en estabilidad autoproteolítica aumentada en el documento US 5,5453,302. Para detalles adicionales se hace referencia al ejemplo de trabajo en la presente (véase más abajo) . En consecuencia, en un tercer aspecto, la invención se relaciona con una variante de enzima subtilasa caracterizada porque se deriva de una enzima subtilasa precursora que tiene un sitio de división autoproteolítico entre los residuos 192 y 193 (en la numeración BASBPN) , la cual se ha modificado adicionalmente por sustitución, inserción o supresión en o dentro de uno o más de los residuos situados en posiciones que corresponden a , os residuos 189, 190, 191,192, 193, 194, 195, 196 (en la numeración BASBPN) ; por lo que la variante muestra estabilidad autoproteolítica aumentada en relación a la enzima subtilasa precursora. En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con una variante de enzima subtilasa caracterizada porque se deriva de una variante de enzima subtilasa precursora que tiene modificaciones en uno o más residuos aminoácidos situados en posiciones que corresponden a los residuos P129, P131, E136, G159, S164, 1165, Y167, R170, Y171 de BLS309 (en la numeración BASBPN) , lo cual además se modifica adicionalmente por sustitución, inserción o supresión en o dentro de uno o más de los residuos situados en las posiciones que corresponden a los residuos 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 de BSL309 (en la numeración BASBPN) ; por lo que las variantes muestran estabilidad autoproteolítica aumentada en relación a la variante de subtilasa precursora la cual no se modifica en ninguna de las posiciones 189-196. En un aspecto adicional, la invención se relaciona con constructos o construcciones de ADN capaces de expresar las enzimas de la invención, cuando se insertan de una manera adecuada en una célula huésped que posteriormente se lleva a expresión de las enzimas de subtilisina del primer aspecto. En un aspecto adicional, la invención se relaciona con la producción de las enzimas de subtilisina de la invención al insertar un constructo de ADN de acuerdo con el segundo aspecto dentro de un huésped adecuado cultivar el huésped para expresar la enzima subtilasa deseada y recuperar el producto enzimático. La invención se relaciona, en parte, pero no se limita a mutantes de genes que expresen las enzimas subtilasa subgrupo I-S2 y las variantes de enzima correspondientes, como se indica antes . Otras variantes de genes de subtilasa abarcados por la invención son tales como aquellos del subgrupo subtilasa I -SI, por ejemplo subtilisina BPN' y los genes para subtilisina Carlsberg y que proporcionan la variante de subtilisina BPN' , proteinasa K, y las enzimas de subtilisina Carlsberg, las cuales muestran estabilidad mejorada en detergentes líquidos concentrados . Las variantes de gen de subtilasa adicionales abarcadas por la invención son tales que la proteinasa K y otros genes y suministran variantes de proteinasa K, y otras enzimas de subtilasa, las cuales muestran estabilidad mejorada en detergentes líquidos concentrados. Otros ejemplos de enzimas de subtilasa originales que se pueden modificar de acuerdo con la invención se incluyen en la tabla I . Además, la invención se relaciona con el uso de enzimas mutantes en composiciones limpiadoras y composiciones limpiadoras que comprenden a las enzimas mutantes, especialmente composiciones detergentes que comprenden a las enzimas subtilisina mutantes. De acuerdo con la invención, tales composiciones detergentes pueden comprender además una o más enzimas adicionales, tales como lipasas, celulasas, amilasas, etc.

ABREVIATURAS AMINO CIDOS A Ala = Alanina V Val = Valina L - Leu = Leucina I He = Isoleucina P Pro = Prolina F Phe = Fenilalanina W Trp = Triptófano M Met = Metionina G Gly = Glicina S Ser = Serina T Thr = Treonina c Cys = Cisteina Y Tyr = Tirosina N Asn = Asparagina Q Gln = Glutamina D = Asp = Ácido aspártico E = Glu = Ácido glutámico K = Lys = Lisina R = Arg = Arginina H = His = Histidina X = Xaa = cualquier aminoácido BASES DE ÁCIDOS NUCLEICOS A = Adenina G = Guanina C = Citosina T = Timina (únicamente en ADN) U = Uracilo (únicamente en ARN) VARIANTES Al describir las diversas variantes de enzimas producidas o contempladas de acuerdo con la invención, se han adaptado las siguientes nomenclaturas para facilidad de referencia: Posiciones de aminoácidos originales aminoácidos sustituidos . De acuerdo con esta sustitución de ácido glutámico por glicina en la posición 195 se designa como: Gly 195 Glu o G195E una supresión de glicina en la misma posición es Gly 195* o G195* una inserción de un residuo aminoácido es adicional tal como lisina es: Gly 195 GlyLys o G195GK En donde se indica una supresión en comparación con la secuencia utilizada para la numeración, una inserción en tal posición se indica como: 36 Asp o *36D para inserción de un ácido aspártico en la posición 36. Las mutaciones múltiples se separan por signos más, es decir: Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu o R170Y+G195E lo que representan mutaciones en las posiciones 170 y 195 que sustituyen tirosina y ácido glutámico por arginina y glicina, respectivamente .

POSICIONES Al describir las variantes en esta solicitud y en las reivindicaciones anexas se hace uso de la alineación de diversas subtilasas en Siezen et al., supra . En otras publicaciones en relación a subtilasas se han utilizado otras alineaciones con la numeración de enzimas específicas. Es materia habitual para las personas familiarizadas en la técnica establecer la posición de un residuo específico en la numeración utilizada aquí. También se hace referencia a la figura 1 que muestra una alineación de los residuos relevantes de la presente invención a partir de una gran cantidad de subtilasas. También se hace referencia a la tabla I del documento WO 91/00345 que muestra una alineación de residuos relevante para la presente invención de varias subtilasas.

TABLA I Subtilasas actualmente establecidas (de Siezen et al., supra) Gen del organismo ADNc enzima acronimo PROCARIOTAS Bacteria: Gram-positivas Bacillus subtilis 168 apr A subtilisina I168,apr ABSS168 Bacillus amyloliquefaciens apr subtilisinaBPN'(NOVO) BASBPN Bacillus subtilis DY subtilisina DY BSSDY Bacillus licheniformis + subtilisina Carlsberg BLSCAR Bacillus lentus subtilisina 147 BLS147 Bacillus alcalophilus PB92 + subtilisina PB92 BAPB92 Bacillus sp. DSM 4828 proteasa alcalina BDSM48 Bacillus YaB ale elastasa alcalina YaB BYSYAB Bacillus subtilis 168 epr min. extracell. prot. BSEPR Bacillus subtilis bpf bacillopeptidasa F BSBPF Bacillus subtilis IFO3013 ispl intracell.ser. prot.l BSISP1 Bacillus subtilis A50 intracell.ser. prot. BSIA50 Bacillus thuringiensis extracell. ser. prot. BTFINI Bacillus cereus extracell. ser. prot. BCESPR Nocardiopsis dassonvillei alcalina ser. prot. NDAPII Thermoactinomyces vulgaris termitasa TVTHER Enterococcus faecalís cylA componente de citolisina A EFCYLA Staphylococcus epidermidis epiP epidermin lead. prot. SEEPIP Streptococcus pyrogenes scpA peptidasa C5a SPSCPA Lactococcus lactis SK11 prtP SK11 cell wall prot. LLSK11 Bacteria: Gram-negativas Dichelobacter nodosus + proteasa básica DNEBPR Xanthomonas campestris + proteasa extracelular XCEXPR Serratia marcescens + extracell. ser. prot. SMEXSP Thermus aquaticus YT-1 pstl acualisina I TAAQUA Thermus rT41A + proteasa T41A TRT41A Vibrio alginolyticus proA proteasa A VAPROA Streptomyces rutgersensis proteinasa D SRESPD Arquea cepa halofílica 172P1 halophil extra, prot. ARB172 Cianobacteria Anabaena variabilis prcA proteasa Ca dependiente AVPRCA EUCARIOTES INFERIORES Hongos Tritirachium álbum limber + proteinasa K TAPROK Tritirachium álbum + proteinasa R TAPROR Tritirachium álbum proT proteinasa T TAPROT Aspergillus oryzae + proteasa alcalina AOALPR Malbranchea pulchella termom icolina MPTHMY Acremonium chrysogenum alp proteasa alcalina ACALPR Levaduras Kluyveromyces lactis kexl Kexl ser. proteinasa KLKEX1 Saccharomyces cerevisiae kex2 Kex2 ser. proteinase SCKEX2 Saccharomyces cerevisiae prbl proteasa B SCPRB1 Yarrowia lipolytica xpr2 alk.extracell. prot. LXPR2 Organism cDNA, enzyme acronym gene EUCARIOTAS SUPERIORES Gusanos Caenorhabditis elegans bli4 cuticle protease CEBLI4 Insectos Drósophila (mosca de la fruta) furl furin 1 DMFUR1 Drosophila (mosca de la fruta) fur2 furin 2 DMFUR2 Plantas Cucumis meló (melón) cucumisin CMCUCU Mamíferos Humano (también rata, ratón) fur furin HSFURI Humano (también ratón) + insulinoma PC2 prot. HSIPC2 Ratón + pituitary PC3 prot. MMPPC3 H umano + tripeptidyl peptid.II HSTPP Referencias utilizadas para la tabla I Las referencias a las secuencias de aminoácidos (números de acceso de GenBank™/EMBL se muestran entre corchetes : ARB172 Kamekura y Seno, (1990) Biochem . Cell Biol . 68 352-359 (secuenciado de aminoácidos de proteasa madura residuos 1-35; residuo 14 no determinado) . BSS168 Stahl. y Ferrari. (1984) J. Bacteriol . 158, 411-418 (K01988) . Yoshimoto, Oyama et al. (1488) J. Biochem. 103, 1060-1065 (la subtilisina madura de B . sutilis var. amylosacchari ticus difiere en que tiene T130S y T162S) . Svendsen, et al. (1986) FEBS Lett. 196, 228-232 (PIR A23624; secuenciado de aminoácidos; la micropeptidasa alcalina madura de B . mesentericus difiere en que tiene S85A, A88S, S89A. S183A and N259S) . BASBPN Wells, et al. (1983) Nucí . Acids Res . 11 7911-7925 (X00165) . Vasantha et al., (1984) J. Bacteriol. 159 811-814 (K02496) . BSSDY Nedkov et al. (1983) Hoppe-Seyle ' s Z. Physiol . Chem. 364 1537-1540 (PIR A00969; secuenciado de aminoácidos) BLSCAR Jacobs et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13 8913-8926 (X03341) . Smith et al. (1968) J. Blol . Chem. 243 2184-2191 (PIR A00968; secuenciado de aminoácidos; la secuencia de proteasa madura difiere en que tiene T103S, P129A, S158N, N161S and S212N) . BLS147 Hastrup et al. (1989) Solicitud de Patente PCT WO 8906279. Publicada el 13 de julio de 1989. (Esperase™ de B. lentus) . Takami et al. (1990) Appl . Microbiol . Biotechnol . , 33 519-523 (el secuenciado de aminoácidos de la proteasa alcalina madura residuos 1-20 de Bacillus sp. no. AH-101; esta secuencia difiere de BLS147 en que tiene N11S) .

BABP92 van der Laan et al. (1991) Appl . Environ . Microbiol . 57 901-909. (Maxacal™). Hastrup et al. (1989) PCT Patent Appl. WO 8906279. Pub. 13 Julio 1989. (subtilisina 309. Savinase™, de B . lentus difiere únicamente en que tiene N87S) . Godette et al. (1991) Abstracts 5th Protein Society Symposium, Junio 6, Baltimore: abstract M8 (una proteasa alcalina alta de B . lentus que difiere en que tiene N87S, S99D, S101R, S103A, V104I y G159S) . BDSM48 Rettenmaier et al. (1990) PCT Patent Appl. WO 90/04022. Publicada el 19 de abril de 1990. BYSYAB Kaneko et al. (1989) J. Bacteriol . 171 5232-5236 (M28537) . BSEPR Sloma et al. (1988) J. Bacteriol . 170 5557-5563 (M22407) . Bruckner (1990) Mol . Gen . Genet . 221 486-490 (X53307) . BSBPF Sloma et al. (1990) J. Bacteriol . 172 170-1477 (M29035; corrected) . Wu et al. (1990) J. Biol . Chem. 265 6845- 6850 (J05400; esta secuencia difiere en que tiene A169V y 586 residuos C terminal menos debido al desplazamiento de marco) . BSISP1 Koide et al. (1986) J. Bacteriol . 167 110-116 (M13760) .

BSIA50 Strongin et al. (1978) ". Bacteriol . 133 1401-1411 (secuenciado de aminoácidos de proteasa madura 1-54; residuos 3, 39, 40 45, 46, 49 y 50 no determinados) .

BTFINI Chestukhina et al. (1985) Biokhimiya 50 1724-1730 (secuenciado de aminoácidos de proteasa madura 1-14 de B. thuringiensis variedad israeliensis, y residuos 1-16 y 223-243 de la variedad fini timus) . Kunitate et al. (1989) Agrie. Biol . Chem . 53 3251-3256 (secuenciado de aminoácidos de los residuos 6-20 de proteasa madura de la variedad kurstaki . BTURS) . BCESPR Chestukhina et al. (1985) Biokhimiya 50 1724-1730 (secuenciado de aminoácidos de proteasa madura 1-16 y 223-243) . NDAPII Tsujibo et al. (1990) Agrie. Biol . Chem. 54 2177-2179 secuenciado de aminoácidos de residuos maduros 1-26) . TVTHER Meloun et al. (1985) FEBS Lett . 183 195-200 (PIR A00973; secuenciado de aminoácidos de residuos de proteasa madura 1-274) . EFCYLA Segarra et al (1991) Infect . Immun . 59 1239-1246. SEEPIP Schnell et al. (1991) personal communication (Siezen et al . ( supra) ) . SPSCPA Chen et al. (1990) J". Biol . Chem. 265 3161-3167 (J05224) .

DNEBPR Kortt et al. (1991) Abstracts 5th Protein Society Symposium, Junio 22-26, Baltimore. abstract S76.

LLSK11 Vos et al. (1989) J". Biol . Chem. 264 13579-13585 (J04962) . Kok et al. (1988) Appl . Environ . Microbiol . 54 231-238 (M24767; la secuencia de la cepa Wg2 difiere en 44 posiciones, que incluyen 18 diferencias en el dominio de proteasa y una supresión de los residuos 1617-1676) . Ki aki et al. (1989) Mol . Microbiol . . 3 359-369 (X14130; la secuencia de la cepa NCD0763 difiere en 46 posiciones, que incluye 22 en el dominio de proteasa, y una supresión de los residuos 1617-1676) XCEXPR Liu et al. (1990) Mol . Gen . Genet . 220 433-440. SMEXSP Yanagida et al. (1986) J". Bacteriol . 166 937-994 (M134 69) . TAAQUA Terada et al. (1990) J. Biol . Chem. 265 6576-6581 (J054I4) TRT41A McHale et al. (1990) Abstracts 5th Eur. Congr. Biotechn. Christiansen , Munck and Villadsen (eds), Munksgaard Int. Publishers, Copenhagen. VAPROA Deane et al. (1989) Gene 76 281-288 (M25499) . SRESPD Lavrenova et al. (1984) Biochemistry USSR. 49 447-454 (secuenciado de aminoácidos de los residuos 1-23; los residuos 13, 18 y 19 no determinados) .

AVPRCA Maldener et al (1991) Mol . Gen . Genet . 225 113-120 (la secuencia publicada tiene 28 residuos inciertos cerca de la posición 200-210 debido a un error de lectura de desplazamiento de marco) . TAPROK Gunkel and Gassen (1989) Eur. J. Biochem. 179 185-194 (X14688/XI4689) . Jany et al . (1986) J. Biol . Chem. Hoppe-Seyler 367 87 (PIR A24541; secuenciado de aminoácidos; la proteasa madura difiere en que tiene S745G, SILST204-208DSL y VNLL264-267FNL. ) . TAPROR Samal et al. (1990) Mol . Microbiol . 4 1789-1792 (X56116) . TAPROT Samal et al. (1989) Gene 85 329-333. AOALPR Tatsumi et al. (1989) Mol . Gen. Genet . 219 33-38. Cheevadhanarah et al. (1991) EMBL Data Library (X54726) . MPTHMY Gaucher and Stevenson (1976) Methods Enzymol . 45 415-433 (secuenciado de aminoácidos de los residuos 1-28 y el hexapéptido LSGTSM con serina en sitio activo) ACALPR Isogai et al. (1991) Agrie . Biol . Chem. 55 471-477. Stepanov et al. (1986) Jnt. J. Bichem. 18 369-375 (secuenciado de aminoácidos en los residuos 1-27: la proteasa madura difiere en que tiene H13[1]Q, R13 [2]N y S13 [6] A) .

KLKEX1 Tanguy-Rougeau, Wesolowski-Louvel and Fukuhara (1988) FEBS lett . 234 96-470 (X07038) . SCKEX2 Mizuno et al. (1988) Biochem . Biophys . Res . Commun . 156 246-254 (M24201) . SCPRB1 Moehle et al. (1987) Mol . Cell . Biol . 7 4390-4399 (M18097) . YLXYPR2 Davidow et al. (1987) J. Bacteriol . 169 4621-4629 (M17741) . Matoba et al. (1988) Mol . Cell Biol . 8 9904-4916 (M23353) . CEBL14 Peters and Rose (1991) The Worm Breeder ' s Gazet te 11 28. DMFUR1 Roebroek et al. (1991) FEBS Le t t . 289 133-137 (X59384) . DMFR2 Roebroek et al. (1992) 267 17208-17215. CMCUCU Kaneda et al. (1984) J. Biochem . 95 825-829 (secuenciado de amonoácidos del octapéptido NIISGTSM con sitio activo serina) HSFURI van den Ouweland et al. (1990) Nucí . Acids Res . 18 664 (X04329) (la secuencia de furina de ratón difiere en 51 posiciones, que incluye 5 en el dominio catalítico: A15E, Y21F, S223F, A232V y N258[2]D) . Misumi et al. (1990) Nucí . Acids Res . 18 6719 (X55660: la secuencia de furina de rata difiere en 49 posiciones, que incluye tres en el dominio catalítico: A15E, Y21F, H24R) .

HSIPC2 Smeekens and Steiner (1990) J". Biol . Chem . 265 2997-3000 (J05252) . Seidah et al. (1990) DNA Cell Biol . 9 415- 424 (la secuencia de la proteasa PC2 de hipofesis de ratón difiere en 23 posiciones, que incluye 7 en el dominio proteasa: I4F, S42[2]Y, E45D, N76S, D133E, V134L y G239[1]D). MMPPC3 Smeekens et al . (1991) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 88 340-344 (M58507) . Seidah et al. (1990) DNA Cell Biol . 9 415-424 (M55668/M55669 ; secuencia parcial) .

HSTPP Tomkinson and Jonsson (1991) Biochemistry 30 168-174 (J05299) .

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra una alineación de diversas subtilasas mencionadas en la tabla I.

DEFINICIONES /Antes de discutir esta invención con mayor detalle, primero se definirán los siguientes términos.

"Estabilidad autolítica alterada" El término "estabilidad autolítica alterada" o "estabilidad autolítica alterante" se pretende que signifique incrementar o disminuir la estabilidad autolítica en comparación con la de la proteasa original.

"Sitio de degradación autoproteolíticos alterados" El término "sitios de degradación autoproteolíticos alterados" se pretende que indique sitios de degradación autoproteolíticos alterados sobre aquellos de la proteasa original. La alteración puede ser una formación de un sitio completamente nuevo o la remoción de un sitio en la proteasa original. El término "sitios de degradación autoproteolíticos alterados" también se pretende que indique alteraciones en donde un sitio autoproteolítico el cual no es, por ejemplo, un sitio de ruptura primario o secundario en la proteasa original después de la alteración del patrón de degradación, se convierte en, por ejemplo, un sitio autoproteolítico primario o secundario.

"Sitio de ruptura autoproteolítica" El término sitio de ruptura autoproteolítica se utiliza para indicar un sitio de la proteasa en donde la autoproteolisis de la proteasa se considera que tiene lugar. Este sitio puede ser definido, por ejemplo, como localizado entre los residuos aminoácidos X e Y. Los sitios de ruptura se pueden identificar al preparar una solución acuosa de una proteasa; inactivar rápidamente la proteasa para evitar la degradación progresiva de fragmentos peptídicos producidos por autolisis; separación de los fragmentos peptídicos bajo condiciones las cuales eviten la reactivación de la proteasa; e identificar los aminoácidos N-terminal de los fragmentos separados. Para detalles adicionales, se hace referencia a un ejemplo de trabajo en la presente (véase más abajo) . El término "sitio de ruptura autoproteolítica" alternativamente se puede denominar "sitio de división autoproteolítica" .

"Sitio de ruptura autoproteolítica primario" El término "sitio de ruptura autoproteolítica primario" se pretende que signifique los primeros 1-5 sitios de ruptura iniciales cuando la proteasa se autodivide a si misma.

"Modificaciones de una variante de subtilasa" El término "modificaciones" se utiliza en relación con una modificación o modificaciones de una variante de subtilasa como se discute en la presente y que se definen para incluir una modificación química asi como manipulación genética para reducir la tasa de degradación autolítica. Las modificaciones pueden ser sustituciones, supxesiones y/o inserciones en o sobre los aminoácidos de interés. Cuando se utiliza el término "modificaciones" en relación con las sustituciones, supresiones o inserciones en o dentro de la vecindad de un sitio autolítíco de ruptura se define para incluir modificaciones para reducir la tasa de degradación autolítica. La modificación puede ocurrir en o dentro de la vecindad de los aminoácidos los cuales comprenden al enlace polipeptídico susceptible de esos aminoácidos. La frase "en la vecindad de" se define en la presente para significar dentro de tres aminoácidos hacia el extremo N terminal o hacia el extremo C terminal de aquellos aminoácidos que forman el enlace susceptible.

"Mutagénesis aleatoria" . El término "mutagénesis aleatoria" se pretende que esté comprendido de una manera convencional, es decir, para indicar una introducción de una o más mutaciones en posiciones aleatorias de la enzima original o la introducción de residuos aminoácidos aleatorios en posiciones seleccionadas o en regiones de la enzima original. La mutagénesis aleatoria normalmente está acompañada por un análisis el cual permite seleccionar enzimas mutadas las cuales, cuando se comparan con la enzima original, tienen propiedades mejoradas. Las técnicas adecuadas para introducir mutaciones aleatorias y el análisis en busca de las propiedades mejoradas se discuten con mayor detalle en la presente.

"Funcionamiento en el lavado" La capacidad de una enzima de catalizar la degradación de varios sustratos que se presenten de manera natural, presentes en los objetos que van a ser limpiados durante, por ejemplo el lavado con frecuencia se denomina como capacidad de lavado, lavabilidad, detergencia o funcionamiento en el lavado. A través de esta solicitud, el término funcionamiento en el lavado se utilizará para abarcar esta propiedad.

"SAVINASE™" SAVINASE™ es vendido por NOVO NORDISK A/S. Es la subtilisina 309 de B. Lentus y difiere de BAP92 únicamente en que tiene N87S (véase tabla I en la presente) .

"Subtilasa precursora" El término "subtilasa precursora" es una subtilasa definida de acuerdo con Siezen et al. (Protein Enginering 4:719-737 (1991)) . Para detalles adicionales véase la sección mencionada "SUBTILASAS" descrita en la presente. Una subtilasa precursora también puede ser una subtilasa aislada de una fuente natural, en donde la modificación subsecuente se ha realizado y al mismo tiempo se ha retenido la característica de una subtilasa.

"Sustrato" El término "sustrato" se utiliza en relación con un sustrato para una proteasa y debe interpretarse en su forma más amplia y está comprendido de un compuesto que contiene por lo menos un enlace peptídico susceptible de hidrólisis por una proteasa de subtilisina.

"Producto" El término "producto" utilizado en creación a un producto derivado de una reacción enzimática de proteasa en el contexto de esta invención se debe interpretar que incluye los productos de una reacción de hidrólisis que involucra una proteasa de subtilisina. Un producto puede ser un sustrato en una reacción de hidrólisis subsecuente.

"Variante de subtilasa" En el contexto de esta invención, el término variante de subtilasa o una subtilasa mutada significa una subtilasa que ha sido producida por un organismo el cual expresa un gen mutante derivado de un microorganismo original el cual posee un gen original o primario y el cual produce una enzima original, el gen original ha sido mutado con el fin de producir el gen mutante del cual se produce la proteasa subtilisina montada cuando se exprese en un huésped adecuado .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las variantes subtilasas las cuales tienen un patrón de degradación autoproteolítico alterado: De acuerdo con la invención cualquier subtilasa precursora que tenga un sitio autoproteolítico primario localizado en o cercano a los residuos 132-133 (en la numeración de BASBPN) mostrará estabilidad autolítica aumentada al estar modificada por sustituciones en o dentro de la vecindad (entre el residuo 129-136) del sitio de ruptura autolítico localizado entre los residuos 132-133 (en la numeración BASBPN) . De acuerdo con la invención, una subtilasa precursora que tenga tal sitio de ruptura autolítico primario localizado entre los residuos 132-133 ((en la numeración de BASBPN) puede ser una variante de subtilasa o una subtilasa de tipo silvestre. La subtilasa de tipo silvestre puede ser cualquiera de aquellas indicadas en la tabla I que tenga el sitio de ruptura especificado antes. La variante de subtilasa puede ser, pero no se limita a las variantes discutidas en La tabla II. Actualmente se considera que otras variantes de subtilasa diferentes a las discutidas en la tabla II también pueden tener un sitio de ruptura autolítico primario localizado entre los residuos 132 y 133 (en la numeración de BASBPN) . De acuerdo con, la invención, una variante de subtilasa que tenga modificaciones en uno o más de los residuos aminoácidos mencionados abajo (véase tabla II) resulta en sitios de degradación autoproteolítica alterados, preferiblemente un nuevo sitio autoproteolítico primario localizado en o cercano a los residuos 132-133 (en la numeración de BASBPN) . De acuerdo con la invención, una variante de subtilasa que tenga una o más modificaciones en cualquiera de los residuos aminoácidos mostrados en la tabla II mostrará estabilidad autolítica aumentada también al ser modificada por sustituciones en o dentro de la vecindad (entre el residuo 190-196) del sitio de ruptura autolítico localizado entre los residuos 192-193 (en la numeración de BASBPN) y de acuerdo con la invención se puede obtener un beneficio mutuo al combinar modificaciones en la vecindad o alrededor o tanto en los sitios de degradación de autoproteolíticos entre 132-133 y 192-193.

Tabla II Residuos los cuales, cuando se modifican, dan lugar a una variante de subtilasa con un patrón alterado de degradación autoproteol isa La tabla II se construye utilizando la alineación mostrada en la figura 1. Es obvio que una tabla similar o más grande que cubra otras subtilasas se puede elaborar fácilmente por una persona familiarizada en la técnica. Además, la tabla III ilustra los residuos aminoácidos específicos en la vecindad del sitio de ruptura autolítico mencionado localizado entre los residuos 132-133 (en la numeración de BASBPN) . Es obvio que tales tablas similares o más grandes que cubran otras subtilasas se pueden elaborar fácilmente por una persona familiarizada en la técnica.

Tabla III Residuos en la vecindad del sitio autoproteolitico localizado entre el residuo 132-133 (en la numeración BASBPN) .

Se construye la tabla III utilizando la alineación mostrada en la figura 1. Una tabla similar que ilustra los residuos en la vecindad del sitio autoproteolítico localizado entre residuo 192-193 se puede elaborar fácilmente por una persona familiarizada en la técnica. En consecuencia, la invención se relaciona con variantes de subtilasa que tienen modificaciones en uno o más residuos aminoácidos mostrados en la tabla II en la cual la secuencia de aminoácidos ha sido modificada adicionalmente en uno o más de los residuos aminoácidos en la vecindad del sitio autoproteolítico localizado entre las posiciones 132-133 (en la numeración BASBPN) (es decir, las posiciones 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136); o variantes de subtilasa que tienen modificaciones en uno o más residuos aminoácidos ilustrados en la tabla II los cuales han sido modificados adicionalmente en la vecindad del sitio autoproteolítico localizado entre las posiciones 192-193 (en la numeración BASBPN) (es decir las posiciones 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196); o variantes de subtilasa que tienen modificaciones en uno o más residuos aminoácidos ilustrados en la tabla II los cuales además han sido modificados en la vecindad tanto de los dos sitios autoproteolíticos mencionados inmediatamente antes. De acuerdo con la invención numerosas modificaciones específicas en la vecindad tanto de los sitios autoproteolíticos localizados entre las posiciones 132-133 y 192-193 (en la numeración BASBPN) o cada uno de los sitios proporcionarán estabilidad autoproteolítica aumentada de la subtilasa. En principio, la modificación puede ser una sustitución de un residuo aminoácido localizado en la vecindad del sitio de ruptura con cualquiera de los otros 19 posibles residuos aminoácidos que resultan en una estabilidad autoproteolítica aumentada de la variante resultante. De manera similar, la modificación puede ser una inserción de uno o más de cualquiera de los 20 posibles residuos aminoácidos de la vecindad del sitio de ruptura que resulten en una estabilidad autoproteolítica aumentada de la variante resultante. Además, la modificación puede ser una expresión de cualquiera de los residuos aminoácidos localizados en la vecindad del sitio de ruptura que resulten en una estabilidad autoproteolítica aumentada de la variante resultante. Una estrategia para identificar las modificaciones específicas que dan lugar a estabilidad autoproteolítica aumentada es realizar mutagénesis aleatoria localizada en toda la región en la vecindad de uno de los sitios y/o en los dos sitios (por ejemplo mutagénesis aleatoria localizada en todos los residuos entre 129-136 y/o 189-196) seguido por un ensayo de análisis para identificar las modificaciones específicas que dan lugar a estabilidad aumentada. Para ilustración de esta estrategia se hace referencia a los ejemplos de trabajo en la presente (véase más abajo) . Diversas mutaciones específicas dan lugar a estabilidad autoproteolítica aumentada y se indica en la presente (véase la sección "B" y "C" a continuación) . Por ejemplo, al observar la tabla II o III y al aplicar el principio de la invención se vuelven evidentes numerosos candidatos para variantes de subtilasa con estabilidad autoproteolítica aumentada. Para ambas variantes de subtilasa precursoras de BASBPN y BLSCAR que tienen un sitio de división autoproteolítico entre los residuos 132-133 (en la numeración BASBPN) , es apropiado realizar sustituciones en cualquiera de las posiciones en la vecindad de este sitio autoproteolítico con el fin de hacer variantes con estabilidad autoproteolítica aumentada . En el contexto de esta invención, una subtilasa se define de acuerdo con Siezen et al. supra . En un sentido más estrecho, aplicable a muchas modalidades de la invención, las subtilasas de interés son aquellas que pertenecen a los subgrupos I-SI y I-S2. En un sentido más específico, muchas de las modalidades de la invención se relacionan con serinas proteasas de bacterias grampositivas las cuales se pueden colocar en homología sustancialmente inequívoca en su estructura primaria, con las subtilasas incluidas en la tabla I anterior. La presente invención también comprende cualquiera de una o más sustituciones en las posiciones mencionadas antes en combinación con cualquier otra sustitución, supresión o adición a la secuencia de aminoácidos de la enzima original. Especialmente se consideran combinaciones con otras sustituciones que se sabe proporcionan propiedades mejoradas a la enzima. Tales combinaciones comprenden las posiciones: 222 (mejoramiento de la estabilidad de oxidación) , 218 (mejoramiento de la estabilidad térmica) , sustitución en los sitios de unión de Ca lo que estabiliza la enzima, por ejemplo, la posición 76 y muchas otras evidentes de la técnica anterior.

Además, las combinaciones con los variantes mencionadas en el documento EP 405 901 también se contemplan específicamente .

VARIANTES A: Variantes únicas con un sitio de ruptura autoproteolítico alterado entre las posiciones 132-133 (en la numeración BASBPN) Las variantes únicas comprenden una o más de las mutaciones mencionadas a continuación.

Variantes de subtilisina BPN' , subtilisina Carlsberg, subtilisina 168 y subtilisina DY: A129V, A129I, A129L, A129M, A129F, G131V, G131I, G131L, G131M, G131F, K136V, K136I, K136L, K136M, K136F, S159V, S159I, S159L, S159M, S159F, T164V, T164I, T164L, T164M, T164F, Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F, K170V, K170I, K170L, K170M, K170F, Y171V, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F, Variantes de termitasa A129V, A129I, A129L, A129M, A129F, G131V, G131I, G131L, G131M, G131F, Q136V, Q136I, Q136L, Q136M, Q136F, T159V, T159I, T159L, T159M, T159F, A164V, A164I, A164L, A164M, A164F, Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F, Y171V, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F, Y170V, Y170I, Y170L, Y170M, Y170F, Subtilisina 309, subtilisina 147 y variantes de proteasa de Bacillus PB92 : T129V, T129I, T129L, T129M, T129F, G131V, G131I, G131L, G131M, G131F, E136V, E136I, E136L, E136M, E136F, G159V, G159I, G159L, G159M, G159F, G164V, G164I, G164L, G164M, G164F, (BLS147) S164V, S164I, S164L, S164M, S164F, (BLS309 y BAPB92) Y167A, Y167H, Y167N, Y167P, Y167C, Y167W. Y167Q, Y167S, Y167T, Y167G, Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F R170W, R170A, R170H. R170N, R170P, R170Q, R170S, R170T, R170Y (abandonada para BLS309) , R170V (abandonada para BAPB92) , R170I (abandonada para BAPB92) , R170L, R170M (abandonada para BAPB92) , T170F, R170G, R170C, T171A, T171H, T171N, T171P, T171C, T171W, T171Q, T171S, T171T, T171G, T171V, T171I, T171L, T171M, T171F B : Variantes modificadas en la vecindad del sitio de ruptura autoproteolítico localizado entre las posiciones 132- 133.

Cualquiera de las variantes únicas mencionadas bajo la sección "A" anterior la cual comprende además una o más de cualquiera de las siguientes mutaciones: P129D, P129E, P129A (BLS309) S130D, S130E, S130A (BLS309) P131G, P131D, P131A (BLS309) S132C, S132A, S132P (BLS309) A133P (BLS309) T134C, T134P, T134A (BLS309) L135P, L135A (BLS309) E136A, E136P, E136K (BLS309) V104C+S132C (BLS309) V104C+T134C (BLS309) A108C+T134C (BLS309) C: Variantes modificadas en la vecindad del sitio de ruptura autoproteolítico localizado entre las posiciones 192-193 Cualquiera de las variantes únicas mencionadas bajo la sección "A:" anterior la cual comprende además una o más de cualquiera de las siguientes mutaciones : F189A, F189G, F189D, D189R, F189Y, F189E, F189N (BLS309) S190P, S190D, S190T (BLS309) Q191S, Q191T, Q191N, Q191A, Q191L, Q191D, Q191W (BLS309) Y192A, Y192P, Y192D, Y192E, Y192V (BLS309) G193A, G193N, G193P (BLS309) A194P, A194D (BLS309) C159E (BLS309) L196A (BLS309) D: Variantes modificadas en la vecindad de ambos sitios de ruptura autoproteolíticos localizados entre las posiciones 132-133 V 192-193 Cualquiera de las variantes únicas mencionadas bajo la sección "A: " anterior las cuales comprenden además una combinación de una o más de cualquiera de las mutaciones mencionadas bajo la sección "B" y/o una o más de cualquiera de las mutaciones mencionadas bajo la sección "C" anterior.

E : Variantes de combinación adicionales: Cualquiera de las variantes anteriores mencionadas bajo las secciones "B", "C" y/o "D" se contempla que sean ventajosas si se combinan con otras mutaciones en cualquiera de las posiciones: 27, 36, 57, 76, 97, 101, 104, 120, 123, 206, 218, 222, 224, 235 y 274. Específicamente las mutaciones en las siguientes variantes BLS309 y BAPB92 se consideran apropiadas para combinación: K27R, *36D, S57P, N76D, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, A194P, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L y T274A. Además, tales variantes comprenden cualquiera de uno o dos de los sustituyentes X167V, X167M, X167F, X167L, X167I, X170V, X170M, X170F, X170L, y/o X170I en combinación con cualquier otra más de otras sustituciones, supresiones y/o inserciones mencionadas antes que se consideren ventajosas para combinarse con cualquiera de las mutaciones mencionadas bajo las secciones "A", "B" y/o "C" . Además, las variantes que comprenden cualquiera de las mutaciones V104N+S101G, K27R+V104Y+N123S+T274A o N76D+V104A u otras combinaciones de estas mutaciones (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A) , en combinación con cualquier otra más de las sustituciones, supresiones y/o inserciones y/o inserciones mencionadas antes bajo la sección "A", "B", y/o "C" se considera que muestran propiedades mejoradas. Las combinaciones específicas que se deben mencionar son: A: Y167I + R170L + A133P B: Y167I + R170L + T134P C: Y167I + R170L + A133P + T134P D: Y167I + R1700L + V104C + S132C E: Y167I + R170L + A108C + T134C F: Y167A + R170S + F189A G: Y167A + R170S + Y192A H: Y167A + R170S + Y192P I: Y167A + R170S + Y192A + A194P J: Y167A + R170S + Y192P + A194P K: Y167A + R170S + F189G L: Y167A + R170S + F189E M: Y167A + R170S + F189R N: Y167I + R170L M: Y167I + R170L + A194P O: Y167A + R170S + A194P P: Y167A + R170L + A194P Q: Y167A + R170N + A194P R: V104C + S132C + Y167I + R170L S: A108C + T134C + Y167I + R170L T: V104C + S132C + Y167A + R170S U: V104C + S132C + Y167A + R170L V: V104C + S132C + Y167A + R170N X: A133D + Y167I + R170L Y: P129K + Y167I + R170L Z: A133P + Y167A + R170S + A194P AA: T134P + Y167A + R170S + A194P BB: A133P + T134P + Y167A + R170S + A194P CC: A133P + Y167A + R170N + A194P DD: T134P + Y167A + R170N + A194P EE: A133P + T134P + Y167A + R170N + A194P FF: A133P + Y167A + R170L GG: P129K + P131H + Y167I + R170L HH: A133P + Y167A + R170S II: A133P + Y167A + R170N JJ: Y167A + R170S + F189K KK: V104C + RT34C + Y167A + R170S MÉTODOS PARA PRODUCIR MUTACIONES EN GENES DE SUBTILASA Se conocen en la técnica muchos métodos para introducir mutaciones en los genes. Después de una discusión breve de la clonación de los genes subtilasa, se discutirán los métodos para generar mutaciones en ambos sitios aleatorios y en sitios específicos, dentro del gen para subtilasa.

CLONACIÓN DE UN GEN PARA SUBTILASA Se puede clonar el gen que codifica para una subtilasa a partir de cualquiera de los organismos indicados en la Tabla I, especialmente bacterias grampositivas u hongos, por diversos métodos bien conocidos en la técnica. En primer lugar se debe construir una biblioteca genómica y/o de ADNc del ADN utilizando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la subtilasa que se va a estudiar. Después, si se conoce la secuencia de aminoácido de la subtilasa, se pueden sintetizar homólogos, sondas de oligonucleótidos marcados y se pueden utilizar para identificar clonas que codifican para subtilisina a partir de una biblioteca genómica de ADN bacteriano o de una biblioteca de ADNc. Alternativamente, se puede utilizar una sonda de oligonucleótidos marcada que contiene secuencias homologas para subtilasa a partir de otra cepa de bacterias u organismos como una sonda para identificar las clonas que codifican para subtilasa, utilizando hibridación y condiciones de lavado de restricción menor. Otro método adicional para identificar clonas productoras de subtilasa involucraría insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformar bacterias proteasa negativas con la biblioteca de ADN genómico resultante y después sembrar en placas las bacterias transformadas sobre agar que contenga un sustrato para subtilasa, tal como desnatada. Aquéllas bacterias que contengan plásmidos que presenten subtilasa producirán colonias rodeadas por un halo de agar transparente, debido a la digestión de la leche desnatada por la subtilasa excretada.

GENERACIÓN DE MUTACIONES ALEATORIAS EN EL GEN PARA SUBTILASA Una vez que se ha clonado el gen para subtilasa en un vector adecuado, tal como un plásmido, se pueden utilizar diversos métodos para introducir mutaciones aleatorias dentro del gen. Por ejemplo, se puede realizar la mutagénesis aleatoria mediante el uso de un agente mutagenizante físico o químico adecuado, mediante el uso de un oligonucleótido adecuado, o al someter la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, se puede realizar la mutagénesis aleatoria mediante el uso de cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes . El agente mutagenizante puede ser, por ejemplo, uno de los cuales induce transiciones, transversiones, inversiones, scrambling, supresiones y/o inserciones. Los ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para el presente propósito incluye irradiación ultravioleta (UV) , hidroxilamina, N-metil-N' -nitro-N-nitrosuguanidina (MNNG) , O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, sulfonato de etilmetano (EMS) , bisulfito de sodio, ácido fórmico y análogos de nucleótidos. Cuando se utilizan tales agentes, la mutagénesis típicamente se realiza al incubar la secuencia de ADN que codifica para la enzima original que va a ser mutagenizada en presencia del agente mutagenizante de elección, bajo condiciones adecuadas para que tenga lugar la mutagénesis, y selección del ADN mutado que tenga las propiedades deseadas. Cuando la mutagénesis se realiza mediante el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser adicionado o se puede agregar una sustancia conocida con 3 nucleótidos no originales durante la síntesis del oligonucleótido en posiciones que se desee cambiar. El adicionado o agregado de sustancia conocida se puede realizar de manera que se eviten codones para aminoácidos no deseados. El oligonucleótido adicionado o agregado con sustancia conocida se puede incorporar en el ADN que codifica para la enzima proteasa por cualquier técnica publicada utilizando, por ejemplo, PCR, LCR o cualquier polimerasa y ligasa de ADN. Cuando se utiliza mutagénesis generada por PCR ya sea un gen tratado o no tratado químicamente que codifique para una enzima proteasa original y se somete a PCR bajo condiciones que incremente la incorporación equivocada de nucleótidos (Deshler 1992, Leung et al. 1989) .

Se puede utilizar una cepa mutadora de E. coli (Fowler et al. 1974) , S. cerevisiae o cualquier otro organismo microbiano para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica para la enzima proteasa mediante, por ejemplo, transformación de un plásmido que contenga a la enzima original dentro de la cepa mutadora, hacer crecer la cepa mutadora con el plásmido y aislar el plásmido mutado de la cepa mutadora. El plásmido mutado subsecuentemente se puede transformar en el organismo de expresión. La secuencia de ADN que va a ser mutagenizada convenientemente puede estar presente en una biblioteca genómica o de ADNc preparada a partir de un organismo que ofrece la enzima proteasa original. Alternativamente, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, el cual como tal puede ser incubado por o se puede exponer de alguna otra manera al agente mutagenizante. El ADN que va a ser mutagenizado también puede estar presente en una célula huésped ya sea al estar integrado en el genoma de la célula o bien, al estar presente en un vector albergado en la célula. Finalmente, el ADN que va a ser mutagenizado puede estar en forma aislada. Preferiblemente, la secuencia de ADN que se va a someter a mutagénesis aleatoria es una secuencia de ADNc o de ADN genómico. Ventajosamente, la mutagénesis aleatoria se puede localizar hacia una parte de la proteasa original en cuestión.

Por ejemplo, puede ser ventajoso cuando ciertas región de la enzima se ha identificado que es de particular importancia para una propiedad dada de la enzima y la cual, cuando se modifica, se espera que resulte en una variante que tenga propiedades mejoradas. Tal región normalmente puede ser identificada cuando se ha dilucidado la estructura tercera de la enzima original y se ha relacionado con la función de la enzima. La mutagénesis aleatoria localizada se realiza convenientemente mediante el uso de técnicas de mutagénesis generadas por PCR como se describe en lo anterior o cualquier otra técnica adecuada conocida en el arte. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica para parte de la secuencia de ADN que se va a modificar puede aislarse, por ejemplo, al insertarse en un vector adecuado, y tal parte posteriormente se puede someter a mutagénesis mediante el uso de cualquiera de los métodos de mutagénesis discutidos en lo anterior. Se puede llevar a cabo la mutagénesis aleatoria localizada en una o más de estas regiones, y preferiblemente se realiza en por lo menos dos de las regiones.

GENERACIÓN DE MUTACIONES DIRIGIDAS A SITIO EN EL GEN PARA SUBTILASA Una vez que se ha clonado el gen para subtilasa, y se han identificado los sitios deseables para mutación y se ha decidido el residuo por el cual sustituir los originales, estas mutaciones se pueden introducir utilizando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias nucleotídicas que flanquean a los sitios de mutación deseados. Los nucleótidos mutantes se insertan durante la síntesis de oligonucleótidos. En un método preferido, la mutagénesis dirigida al sitio se realiza mediante "sitio único de eliminación (USE) " o la técnica de "Uracilo-USE" descritas, respectivamente, por Deng et al. (Anal. Biochem. 200:81-88 (1992)) y Markvardsen et al. (BioTechniques 18 (3) : 371-372 (1995) ) .

VECTORES DE EXPRESIÓN RECOMBINANTES Un vector recombinante que comprenda un constructo o construcción de ADN que codifique para la enzima de la invención puede ser cualquier vector el cual pueda ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector con frecuencia dependerá de la célula huésped dentro de la cual se va a introducir. Por lo tanto, el vector puede ser un vector que se replica de manera autónoma, es decir, un vector el cual existe como una entidad extracromosómica, la replicación de la cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped en parte o en su totalidad y se replica junto con el cromosoma o cromosomas dentro de los cuales se ha integrado . Preferiblemente, el vector es un vector de expresión en el cual la secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención se une operablemente a segmentos adicionales necesarios para la transcripción del ADN. En general, el vector de expresión se deriva del ADN plasmídico o viral, o puede contener elementos de ambos. El término "enlazado operablemente" indica que los segmentos están dispuestos de manera que funcionan de manera concertada para su propósito propuesto, por ejemplo, la transcripción inicia en un promotor y procede a través de la secuencia de ADN que codifica para la enzima. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN la cual muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y se puede derivar de genes que codifiquen para proteínas ya sea homologas o heterólogas para la célula huésped. Los ejemplos de promotores adecuados para uso en células huésped bacterianas incluyen el promotor del gen para amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus , el gen para alfa-amilasa de Bacillus licheniformis , el gen para alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens, el gen para proteasa alcalina de Bacillus subtilis o el gen para xilosidasa de Bacillus pumilus, o los promotores PR o PL del fago Lambda o los promotores lac, trp o tac de E. coli. La secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención también se puede conectar operablemente, si es necesario, a un terminador adecuado. El vector recombinante de la invención puede comprender adicionalmente una secuencia de ADN que permita al vector replicarse en la célula huésped en cuestión. El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo un gen, el producto del cual complementa un defecto en la célula huésped, o un gen que codifica para resistencia a, por ejemplo, antibióticos, como canamicina, cloramfenicol, eritromicina, tetraciclina, espectinomicina o similares, o resistencia a metales pesados o herbicidas. Para dirigir una enzima de la presente invención a la vía secretora de las células huésped, se puede proporcionar una secuencia de señal secretora (también conocida como una secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) en el vector recombinante. La secuencia de señal secretora se une a la secuencia de ADN que codifica para la enzima en el marco de lectura correcto. Las secuencias de señal secretora comúnmente se colocan 5 ' respecto a la secuencia de ADN que codifica para la enzima. La secuencia de señal secretora puede ser aquélla que normalmente se asocia con la enzima o puede ser de un gen que codifique para otra proteína secretada. Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifican para la presente enzima, el promotor y opcionalmente la secuencia de señal terminadora y/o secretora, respectivamente o para ensamblar estas secuencias por esquemas adecuados de amplificación por PCR y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para replicación o integración, son bien conocidos por aquéllas personas familiarizadas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., op . cit . ) .

CÉLULA HUÉSPED La secuencia de ADN que codifica para la presente enzima introducida en la célula huésped puede ser homologa o heteróloga al huésped en cuestión. Si es homologa a la célula huésped, es decir, producida por la célula huésped en la naturaleza, típicamente se conectará operablemente a otra secuencia promotora o, si es aplicable, a otra secuencia de señal secretora y/o secuencia terminadora que esté en su ambiente natural. Se pretende que el término "homólogo" incluya una secuencia de ADN que codifique para una enzima nativa al organismo huésped en cuestión. Se pretende que el término "heterólogo" incluya una secuencia de ADN que no se exprese por la célula huésped en la naturaleza. Por lo tanto, la secuencia de ADN puede ser de otro organismo, o puede ser una secuencia sintética. La célula huésped dentro de la cual se introduce el constructo o construcción de ADN o el vector recombinante de la invención puede ser cualquier célula la cual sea capaz de producir la presente enzima e incluye bacterias, levaduras, hongos y células eucarióticas superiores. Los ejemplos de células huésped bacterias las cuales, al cultivarlas, son capaces de producir la enzima de la invención, son bacterias grampositivas tales como cepas de Bacillus, tales como cepas de B. subtilis, B. licheniformis , B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus , B. alkalophilus , B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. Lautu , B. megatherium o B. thuringiensis, o cepas de Streptomyces tales como S. lividans o S. murinus o bacterias gramnegativas tales como Echerichia coli . La transformación de la bacteria se puede llevar a cabo por transformación de protoplastos, electroporación, conjugación o mediante la utilización de células competentes de una manera conocida per se (cf . Sambrook et al . , supra) . Cuando se expresa la- enzima en una bacteria tal como E. coli , la enzima puede ser retenida en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles (conocidos como cuerpos de inclusión) , o se puede dirigir al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se lisan y los granulos se recuperan y desnaturalizan después de lo cual la enzima se renaturaliza al diluir el agente desnaturalizante. En el último caso, la enzima se puede recuperar del espacio periplásmico por ruptura de las células, por ejemplo, por sonicación o choque osmótico, para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la enzima. Cuando la enzima se expresa en bacterias grampositivas tales como las cepas de Bacillus o Streptomyces, la enzima se puede retener en el citoplasma o se puede dirigir al medio extracelular por una secuencia de secreción bacteriana. En este último caso, la enzima se puede recuperar del medio como se describe en lo siguiente.

MÉTODO PARA PRODUCIR SUBTILASA La presente invención proporciona un método para producir una enzima aislada de acuerdo con la invención, en donde se ha transformado una célula huésped adecuada con una secuencia de ADN que codifica para la enzima, y que se cultiva bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante se recupera del cultivo.

Como se define en la presente, un polipéptido aislado (por ejemplo una enzima) es un polipéptido el cual está esencialmente libre de otros polipéptidos diferentes a subtilasa, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 20% pura, preferiblemente por lo menos aproximadamente 40% pura, de manera más preferible aproximadamente 60% pura, incluso de manera más preferible aproximadamente 80% pura y de manera más preferible aproximadamente 90% pura, y de manera incluso mucho más preferible aproximadamente 95% pura, determinado por SDS-PAGE. El término "polipéptido aislado" se puede denominar alternativamente "polipéptido purificado" . Cuando un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica para la enzima se transforma en una célula huésped heteróloga, es posible permitir la producción recombinante heteróloga de la enzima de la invención. Por lo tanto, es posible realizar una composición de subtilasa altamente purificada, caracterizada porque está libre de impurezas homologas. En este contexto, las impurezas homologas significa cualquier impureza (por ejemplo otros polipéptidos diferentes al de la enzima de la invención) los cuales se originan a partir de las células homologas desde donde se obtiene la enzima de la invención originalmente. El medio utilizado para cultivar las células huésped transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer las células huésped en cuestión. La subtilasa expresada convenientemente puede ser secretada en el medio de cultivo y puede ser recuperado del mismo por procedimientos bien conocidos que incluyen separar las . células del medio por centrifugación o filtración, precipitar los componentes proteinaceos del medio por medio de una sal tal como sulfato de amonio, seguido por procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o similares.

COMPOSICIONES DETERGENTES QUE COMPRENDEN A LAS ENZIMAS MUTANTES La presente invención también comprende el uso de enzimas mutantes de la invención en composiciones limpiadoras y de detergentes y tales composiciones comprenden a las enzimas de subtilisina mutantes. Tales composiciones limpiadoras de detergentes se describen en detalles adicionales en lo siguiente.

DESCRIPCIÓN DE DETERGENTES Y EJEMPLOS Sistema surfactante Las composiciones detergentes de acuerdo con la presente invención comprenden un sistema surfactante o tensioactivo, en donde el surfactante se puede seleccionar de surfactantes no iónicos y/o aniónicos y/o catiónicos y/o anfolíticos y/o zwiteriónicos y/o semipolares. El surfactante típicamente está presente a una concentración desde 0.1% hasta 60% en peso. El surfactante preferiblemente se formula para ser compatible con componentes enzimáticos presentes en la composición. En composiciones líquidas o en gel, el surfactante se formula más preferiblemente de manera tal que promueva, o al menos no degrade la estabilidad de cualquier enzima en estas composiciones . Los sistemas preferidos para ser utilizados de acuerdo con la presente invención comprenden como un surfactante 1 o más de los surfactantes no iónicos y/o aniónicos descritos en la presente. Los condensados ~ de óxido de polietileno, polipropileno y polibutileno de alquilfenoles son adecuados para uso como el surfactante no iónico de los sistemas surfactantes de la presente invención prefiriéndose los condensados de óxido de polietileno. Estos compuestos incluyen los productos de condensación de alquilfenoles que tienen un grupo alquilo que contiene desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 14 átomos de carbono, preferiblemente desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 14 átomos de carbono ya sea en una configuración de cadena lineal o de cadena ramificada, con el óxido de alquileno. En una modalidad preferida, el óxido de etileno está presente en una cantidad igual a desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 25 moles, de manera más preferible desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 15 moles de óxido de etileno por mol de alquilfenol. Los surfactantes no iónicos disponibles comercialmente de este tipo incluyen Igepal™ CO-630, vendido por GAF Corporation; y Tritón™ X-45, X-114, X-100 y X-102, todos vendidos por Rohm & Haas Company. Estos surfactantes se denominan comúnmente como alcoxilatos de alquilfenol (por ejemplo etoxilatos de alquilfenol) . Los productos de condensación de alcoholes alifáticos primarios y secundarios con aproximadamente 1 a aproximadamente 25 moles de óxido de etileno son adecuados para uso como el surfactante no iónico de los sistemas surfactantes no iónicos de da presente invención. La cadena alquilo del alcohol alifático puede ser lineal o ramificada, primaria o secundaria y generalmente contiene desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 22 átomos de carbono. Se prefieren los productos de condensación de alcoholes que tengan un grupo que contiene desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 20 átomos de carbono, de manera más preferible desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono, con desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 moles de óxido de etileno por mol de alcohol. Están presentes en los productos de condensación desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 7 moles de óxido de etileno y de manera más preferible desde aproximadamente 2 hasta 5 moles de óxido de etileno por mol de alcohol. Los ejemplos de surfactantes no iónicos disponibles comercialmente de este tipo incluyen tergitol™ 15-S-9 (El producto de condensación de alcohol lineal de C?;L-C15 con 9 moles de óxido de etileno) , Tergitol™ 24-L-6 NMW (el producto de condensación de alcohol primario de C1X-C14 con 6 moles de óxido de etileno con una distribución de peso molecular estrecha) , ambos vendidos por Union Carbide Corporation; Neodol™ 45-9 (el producto de condensación de alcohol lineal de C14-C15 con 9 moles de óxido de etileno) , Neodol™ 23-3 (el producto de condensación de alcohol lineal de C12-C13 con 3.0 moles de óxido de etileno), Neodol™ 45-7 (el producto de condensación de un alcohol lineal de C14-C15 con 7 moles de óxido de etileno) , Neodol™ 45-5 (el producto de condensación de alcohol lineal de C14-C15 con 5 moles de óxido de etileno) vendido por Shell Chemical Company, Kyro™ EOB (el producto de condensación de alcohol de C^- ^ con 9 moles de óxido de etileno) , vendido por Procter & Gamble Company, y Genapol LA 050 (el producto de condensación de alcohol de C12-C14 con 5 moles de óxido de etileno) vendido por Hoechst. El intervalo preferido de HLB en estos productos es desde 8-11 y de manera más preferida desde 8-10.

También son útiles como el surfactante no iónico de los sistemas surfactantes de la presente invención los alquilpolisacáridos descritos en el documento US 4,565,647 que tienen un grupo hidrofóbico que contiene desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 30 átomos de carbono, preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 16 átomos de carbono y un polisacárido, por ejemplo, un poliglicósido, un grupo hidrofílico que contiene desde aproximadamente 1.3 hasta aproximadamente 10, preferiblemente desde aproximadamente 1.3 hasta aproximadamente 3, de manera más preferible desde aproximadamente 1.3 hasta aproximadamente 2.7 unidades de sacáridos. Se puede utilizar cualquier sacárído reductor que contenga 5 ó 6 átomos de carbono, por ejemplo, las porciones de glucosa, galactosa y galactosilo pueden estar sustituidas por las porciones glucosilo (opcionalmente, el grupo hidrofóbico está unido en las posiciones 2-, 3-, 4-, etc. y de esta manera se proporciona una glucosa o galactosa en oposición a un glucósido o galactósido) . Los enlaces intersacáridos pueden estar, por ejemplo, entre una posición de las unidades sacárido adicionales y las posiciones 2-, 3-, 4-, y/o 6- de las unidades de sacárido precedentes . Los alquilpoliglicósidos preferidos tienen la fórmula R20 (CnH2n0) t (glicosilo) . en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de alquilo, alquilfenilo, hidroxialquilo, hidroxialquilfenilo y mezclas de los mismos en las cuales los grupos alquilo contienen desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18, preferiblemente desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 14 átomos de carbono; n es 2 ó 3, preferiblemente 2; t es desde 0 hasta aproximadamente 10, preferiblemente 0; y x es desde aproximadamente 1.3 hasta aproximadamente 10, preferiblemente desde aproximadamente 1.3 hasta aproximadamente 3 , y de manera más preferible desde aproximadamente 1.3 hasta aproximadamente 2.7. El glicosilo se deriva preferiblemente de glucosa. Para preparar estos compuestos, el alcohol o alquilpolietoxialcohol se forma primero y después se hace reaccionar con glucosa o una fuente de glucosa, para formar el glucósido (unión en la posición 1) . Las unidades glicosilo adicionales se pueden unir posteriormente entre su posición 1 y las unidades glicosilo precedentes en las posiciones 2-, 3-, 4-, y/o 6-preferiblemente de manera predominante en la posición 2. Los productos de condensación de óxido de etileno con una base hidrofóbica formada por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol también son adecuados para uso como sistemas surfactantes no iónicos adicionales de la presente invención. La porción hidrofóbica de estos compuestos preferiblemente tendrá un peso molecular desde aproximadamente 1500 hasta aproximadamente 1800 y mostrará insolubilidad en agua. La adición de las porciones polioxietileno a esta porción hidrofóbica tiende a incrementar la solubilidad en agua de la molécula en su totalidad, y se retiene el carácter líquido del producto hasta el punto en el que el contenido de polioxietileno es de aproximadamente 50% del peso total del producto de condensación, lo cual corresponde con la condensación de hasta aproximadamente 40 moles de óxido de etileno. Los ejemplos de compuestos de este tipo incluyen ciertos surfactantes disponibles comercialmente como Pluronic™, vendido por BASF. Además, son adecuados para uso como el surfactante no iónico el sistema surfactante no iónico de la presente invención los productos de condensación de óxido de etileno con el producto que resulta de la reacción de óxido de propileno y etilendiamina. La porción hidrofóbica de estos productos consiste del producto de reacción de etilendiamina y óxido de propileno en exceso, y generalmente tiene un peso molecular desde aproximadamente 2500 hasta aproximadamente 3000. Esta porción hidrofóbica se condensa con óxido de etileno hasta el grado de que el producto de condensación contiene desde aproximadamente 40% hasta aproximadamente 80% en peso de polioxietileno y tiene un peso molecular desde aproximadamente 5,000 hasta aproximadamente 11,000. Los ejemplos de este tipo de surfactante no iónico incluyen ciertos compuestos de los disponibles comercialmente denominados Tetronic™, vendidos por BASF. Se prefiere para uso como el surfactante no iónico de los sistemas surfactantes de la presente invención los condensados de óxido de polietileno de alquilfenoles, productos de condensación de alcoholes alifáticos primarios y secundarios con desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 25 moles de óxido de etileno, alquilpolisacáridos y mezclas de los mismos. Los más preferidos son etoxilados de alquilfenol de C8-C14 que tienen de 3 a 15 grupos etoxi y etoxilados de alcohol de C8-C18 (preferiblemente C10 en promedio) que tienen desde 2 hasta 10 grupos etoxi y mezclas de los mismos. Los surfactantes no iónicos altamente preferidos son surfactantes de amida de ácido polihidroxi graso de la fórmula R2 - C - N - Z, O R1 en la que R1 es H, o R1 es hidrocarbilo de ^, 2 -hidroxietilo, 2 -hidroxipropilo o una mezcla de los mismos, R2 es hidrocarbilo de C5_31 y Z es un polihidroxihidroxicarbilo que tiene una cadena hidrocarbilo lineal con por lo menos 3 hidroxilos conectados directamente a la cadena, o un derivado alcoxilado del mismo. Preferiblemente, R1 es metilo, R2 es alquilo de CX1.15 lineal o alquilo de C16_18 o una cadena alquenilo tal como alquilo de coco o mezclas de los mismos, y Z se deriva de un azúcar reductor tal como glucosa, fructosa, maltosa o lactosa, en una reacción de aminación reductiva. Los surfactantes aniónicos altamente preferidos incluyen surfactantes de sulfato de alquilo alcoxilado. Los ejemplos de los mismos son sales o ácidos solubles en agua de la fórmula RO (A) mS03M en donde R es un grupo alquilo, de C10-C-24 no sustituido o un grupo hidroxialquilo que tiene un componente alquilo de C10-C24, preferiblemente un alquilo o hidroxialquilo de C12-C20, de manera más preferible un alquilo o hidroxialquilo de C12-C18, A es una unidad etoxi o propoxi, m es mayor de cero, típicamente entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 6, de manera más preferible entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 3, y M es H o un catión el cual puede ser, por ejemplo, un catión metálico (por ejemplo sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, etc.), amonio o un catión de amonio sustituido. Los sulfatos de alquilo etoxilados así como los sulfatos de alquilo propoxilados están contemplados en la presente. Los ejemplos específicos de cationes de amonio sustituidos incluyen cationes de metilo, dimetilo y trimetilamonio y cationes de amonio cuaternarios tales como cationes tetrametilamonio y dimetilpiperidinio y aquéllos derivados de alquilaminas tales como etilamina, dietilamina, trietilamina y mezclas de los mismos, y similares. Los surfactantes ejemplares son sulfato de polietoxilato de alquilo de C12-C18 (1.0) (C12-C18E(1.0)M) , sulfato de polietoxilato de alquilo de C12-C18 (2.25) (C12-C18 (2.25) M, y sulfato de polietoxilato de alquilo de C12-C18 (3.0) (C12-C18E (3.0) M) , y sulfato de polietoxilato de alquilo de C12-C18 (4.0) (C12-C18E(4.0)M), en donde M se selecciona convenientemente de sodio y potasio. Los surfactantes aniónicos adecuados para ser utilizados son surfactantes de sulfonato de éster de alquilo que incluyen esteres lineales de ácidos carboxílicos de C8-C20 (es decir, ácidos grasos) los cuales están sulfonados con S03 gaseoso de acuerdo con "The Journal of the American Oil Chemists Society", 52 (1975), pp . 323-329. Los materiales iniciales adecuados pueden incluir sustancias grasas naturales tales como derivadas de sebo, aceite de palma, etc. Los surfactantes de sulfonato de éster de alquilo preferido especialmente para aplicaciones en lavandería comprenden surfactantes de sulfonato de éster de alquilo de la fórmula estructural : O R3 - CH - C - OR4 S03M en donde R3 es un hidrocarbilo de C8-C20, preferiblemente un alquilo, o combinación de los mismos, R4 es un hidrocarbilo de C1-C6, preferiblemente un alquilo o combinación de los mismos y M es un catión el cual forma una sal soluble en agua con el sulfonato de éster de alquilo. Los cationes formadores de sal adecuados incluyen metales tales como sodio, potasio y litio y cationes de amonio sustituidos o no sustituidos tales como monoetanolamina, dietanolamina y trietanolamina. Preferiblemente, R3 es alquilo de C10-C16, y R4 es metilo, etilo o isopropilo. Se prefieren especialmente los sulfonatos de éster de metilo en donde R3 es alquilo de C10-C1S. Otros surfactantes aniónicos adecuados incluyen los surfactantes de sulfato de alquilo los cuales son sales solubles en agua o ácidos de la fórmula R0S03M en donde R preferiblemente es un hidrocarbilo de C10-C24, preferiblemente un alquilo o hidroxialquilo que tiene un componente alquilo de C10-C20, de manera más preferible un alquilo o hidroxialquilo de Ci2~C18, Y M es H ° un catión, por ejemplo, un catión de metal alcalino (por ejemplo sodio, potasio, litio) , o amonio o amonio sustituido (por ejemplo los cationes metil-, dimetil- y trimetilamonio y cationes de amonio cuaternarios tales como tetrametilamonio y cationes dimetilpiperidinio y cationes de amonio cuaternarios derivados de alquilaminas tales como etilamina, dietilamina, trietilamina y mezclas de los mismos, y similares) . Típicamente, se prefieren las cadenas alquilo de ci2_ci6 para temperaturas de lavado inferiores (por ejemplo inferiores a aproximadamente 50°C) y se prefieren cadenas alquilo de C16-C18 para temperaturas de lavado superiores (por ejemplo superiores a aproximadamente 50 °C) . También se pueden incluir en las composiciones detergentes de lavandería de la presente invención otros surfactantes aniónicos útiles para propósitos detersivos. Estos pueden incluir sales (que incluyen, por ejemplo, sales de sodio, potasio, amonio y de amonio sustituido tales como sales de mono-, di- y trietanolamina) de jabón, alcanosulfonatos primarios o secundarios de C8-C22, olefinsulfonatos de C8-C24, ácidos policarboxílicos sulfonatados preparados por sulfonación del producto pirolizado de citratos de metal alcalinotérreo, por ejemplo como se describe en la especificación de patente británica número 1,082,179, alquilpoliglicolétersulfatos de C8_C24 (que contiene hasta 10 moles de óxido de etileno) ; sulfonatos de alquilglicerol, sulfonatos de acilglicerol graso, sulfatos de oleilglicerol graso, sulfatos de alquilfenol óxido de etileno éter, sulfonatos de parafina, fosfatos de alquilo isetionatos tales como los isetionatos de acilo, lauratos de N-acilo, succinamatos de alquilo y sulfosuccinatos, monoésteres de sulfosuccinatos (especialmente monoésteres de C12-C18 saturados o insaturados) y diésteres de sulfosuccinatos (especialmente diésteres de C6-C12 saturados e insaturados) , sarcosinatos de acilo, sulfatos de alquilpolisacáridos tales como los sulfatos de alquilpoliglucósido (los compuestos no surfactados no iónicos se describen posteriormente) , sulfatos de alquilo primarios ramificados y polietoxicarboxilatos de alquilo tales como aquellos de fórmula RO (CH2CH20) k-CH2COO~M+ en donde R es un alquilo de C8-C22, k es un número entero de 1 a 10 y M es un catión formador de sal soluble. Los ácidos de resina y los ácidos de resina hidrogenados también son adecuados tales como colofonia, colofonia hidrogenada y ácidos de resina y ácidos de resina hidrogenada presentes en o derivados de aceite de tall. Se prefieren altamente los sulfonatos de alquilbenceno. Se prefieren especialmente los sulfonatos de alquilbenceno lineales (de cadena lineal) (LAS) en donde el grupo alquilo preferiblemente contiene desde 10 hasta 18 átomos de carbono . Los ejemplos adicionales se describen en "Surface Active Agents and Detergents" (Col. I y II por Schwartz, Perry y Berch) . Una variedad de tales surfactantes también se describen generalmente en el documento US 3,929,678 (columna 23, línea 58 a columna 29, línea 23, incorporado en la presente como referencia) . Cuando se incluyen en la presente, las composiciones detergentes de lavandería de la presente invención típicamente comprenden desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 40%, preferiblemente desde aproximadamente 3% hasta aproximadamente 20% en peso de tales surfactantes aniónicos.

Las composiciones de detergente de lavandería de la presente invención también pueden contener surfactantes catiónicos, amfolíticos, zwiteriónicos y semipolares así como los surfactantes no iónicos y/o aniónicos diferentes a los ya descritos en la presente. Los surfactantes detersivos catiónicos para uso en las composiciones detergentes de lavandería de la presente invención son aquellos que tienen un grupo hidrocarbilo de cadena larga. Los ejemplos de tales surfactantes catiónicos incluyen los surfactantes de amonio tales como halogenuros de alquiltrimetilamonio, y aquellos surfactantes que tienen la fórmula: [R2(OR3)y] [R4(OR3)y]2R5N+X- en donde R2 es un grupo alquilo o alquilbencilo que tiene desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono en la cadena alquilo, cada R3 se selecciona del grupo que consiste de -CH2CH2-, -CH2CH (CH3) - , -CH2CH (CH2OH) - , -CH2CH2CH2- y mezclas de los mismos; cada R4 se selecciona del grupo que consiste de alquilo de Cx-C4, hidroxialquilo de Cx-C4, estructuras de anillo bencilo formadas por unión de los dos grupos R4, -CH2CHOHCHHOHCOR6CHOHCH2OH, en donde R6 es cualquier hexosa o polímero de hexosa que tenga un peso molecular menor de aproximadamente 1000, e hidrógeno cuando Y no es 0; R5 es igual a R4 o es una cadena alquilo, en donde el número total de átomos de carbono o R2 más R5 es no mayor de aproximadamente 18; cada y es desde 0 hasta aproximadamente 10, y la suma de los valores de y es desde 0 hasta aproximadamente 15; y X es cualquier anión compatible. Los surfactantes catiónicos altamente preferidos son compuestos de amonio cuaternarios solubles en agua útiles en la presente composición que tiene la fórmula: R1R2R3R4N+X" (i) en donde Rx es alquilo de C8-C16, cada uno de R2, R3 y R4 es independientemente alquilo de C-L-Cí , hidroxialquilo de d-d, bencilo y -(C2H40)XH en donde x tiene un valor de 2 a 5 y x es un anión. No más de uno de R2, R3 o R4 debe ser bencilo. La longitud preferida de la cadena alquilo para Rx es C12-C15, particularmente cuando el grupo alquilo es una mezcla de longitudes de cadena derivadas de grasa de coco o de núcleo de palma o se deriva sintéticamente por acumulación de olefina o síntesis de alcoholes 0X0. Los grupos preferidos para R2, R3 y R4 son grupos metilo e hidroxietilo y el anión X se puede seleccionar de iones haluro, metosulfato, acetato y fosfato. Los ejemplos de compuestos de amonio cuaternarios adecuados de fórmulas (i) para uso en la presente son: cloruro o bromuro de coco trimetilamonio; cloruro o bromuro de coco metildihidroxietilamonio; cloruro de deciltrietilamonio; cloruro o bromuro de decildimetilhidroxietilamonio; cloruro o bromuro de dimetilhidroxietilamonio de -12-15 l cloruro o bromuro de dimetilhidroxietilamonio de coco; metilsulfato de miristiltrimetilamonio; cloruro o bromuro de laurildimetilbencilamonio; cloruro o bromuro de laurildimetil (etenoxi)4 amonio; esteres de colina (compuestos de fórmula (i) en donde Rx es CH2-CH2-O— C— C12-14 alquilo y R2R3R4 son metilo) O dialquilimidazolinas [compuestos de fórmula (i) ] . Otros surfactantes catiónicos útiles en la presente también se describen en el documento US 4,228,044 y en EP 000 224. Cuando se incluyen en la presente, las composiciones detergentes de lavandería de la presente invención típicamente comprenden desde 0.2% hasta aproximadamente 25%, preferiblemente desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 8% en peso de tales surfactantes catiónicos.

Los surfactantes anfolíticos también son adecuados para uso en las composiciones de detergente de lavandería de la presente invención. Estos surfactantes se pueden describir ampliamente como derivados alifáticos de aminas secundarias o terciarias, o derivados alifáticos de aminas secundarias y terciarias heterocíclicas en las cuales el radical alifático puede ser una cadena lineal o ramificada. Uno de los sustituyentes alifáticos contiene por lo menos aproximadamente 8 átomos de carbono, típicamente desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono, y por lo menos uno contiene un grupo aniónico solubilizante en agua, por ejemplo carboxi, sulfonato, sulfato. Véase el documento US 3,929,678 (columna 19, líneas 18-35) para ejemplos de surfactantes anfolíticos. Cuando se incluyen en la presente, las composiciones de detergente de lavandería de la presente invención típicamente comprenden desde 0.2% hasta aproximadamente 15%, de manera preferible desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 10% en peso de tales surfactantes anfolíticos. Los surfactantes zwiteriónicos también son adecuados para uso en las composiciones de detergente de lavandería. Estos surfactantes se pueden describir ampliamente como derivados de aminas secundarias y terciarias, derivados de aminas heterocíclicas secundarias y terciarias, o derivados de compuestos de amonio cuaternario, de fosfonio cuaternario o de sulfonio terciario. Véase el documento US 3,929,678 (columna 19, línea 38 a columna 22, línea 48) para ejemplos de surfactantes switeriónicos . Cuando se incluyen en la presente, las composiciones de detergente de lavandería de la presente invención típicamente comprenden desde 0.2% hasta aproximadamente 15%, preferiblemente desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 10% en peso de tales surfactantes switeriónicos. Los surfactantes no iónicos semipolares son una categoría especial de surfactantes no iónicos los cuales incluyen óxidos de amina soluble en agua que contienen una porción alquilo desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono y dos porciones que se seleccionan del grupo que consiste de grupos alquilo y grupos hidroxialquilo que contienen desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono; óxidos de fosfina solubles en agua que contienen una porción alquilo desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono y dos porciones que se seleccionan del grupo que consiste de grupos alquilo y grupos hidroxialquilo que contienen desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono; y sulfóxidos solubles en agua que contienen una porción alquilo desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono y una porción que se selecciona del grupo que consiste de porciones alquilo e hidroxialquilo desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono. Los surfactantes detergentes no iónicos semipolares incluyen los surfactantes de óxido de amina que tiene la fórmula : O 3 í 4 5 v R (OR )xN(R )2 en donde R3 es un grupo alquilo, hidroxialquilo o alquilfenilo, o mezclas de los mismos que contienen desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 22 átomos de carbono; R4 es un grupo alquileno o hidroxialquileno que contiene desde 2 hasta aproximadamente 2 o aproximadamente 3 átomos de carbono o mezclas de los mismos; x es desde 0 hasta aproximadamente 3: y cada R5 es un grupo alquilo o hidroxialquilo que contiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono o un grupo de óxido de polietileno que contiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 grupos de óxido de etileno. Los grupos R5 se pueden unir entre si, por ejemplo, a través de un átomo de oxígeno o de nitrógeno, para formar una estructura de anillo. Estos surfactantes de óxido de amina en particular incluyen óxidos de alquildimetilamina de C10-C18 y óxidos de alcoxietildihidroxietilamina de C8-C12.

Cuando se incluyen en la presente, las composiciones de detergente de lavandería de la presente invención típicamente comprenden desde 0.2% hasta aproximadamente 15%, preferiblemente desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 10% en peso de tales surfactantes no iónicos semipolares.

Sistema aglutinante Las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden comprender además un sistema aglutinante. Cualquier sistema aglutinante convencional es adecuado para uso en la presente e incluye materiales de aluminosilicato, silicatos, policarboxilatos y ácidos grasos, materiales como etilendiaminatetraacetato, secuestrantes de iones metálicos tales como aminopolifosfonatos, particularmente ácido etilendiaminotetrametilenfosfónico y ácido dietilentriamino-pentametilenfosfónico. Aunque menos preferido por razones obvias, también se pueden utilizar en la presente acumuladores de fosfato. Los acumuladores adecuados pueden ser un material de intercambio iónico inorgánico, comúnmente un material de alúmina silicato hidratado inorgánico, más particularmente una zeolita sintética hidratada tal como zeolita hidratada A, X, B, HS o MAP.

Otro material agluinante inorgánico adecuado es silicato estratificado, por ejemplo SKS-6 (Hoechst) . SKS-6 es un silicato estratificado cristalino que consiste de silicato de sodio (Na2Si205) . Los policarboxilatos adecuados que contienen un grupo carboxi incluyen ácido láctico, ácido glicólíco y derivados de éter de los mismos como se describen en las patentes belgas números 831,368, 821,369 y 821,370. Los policarboxilatos que contienen dos grupos carboxi incluyen las sales solubles en agua de ácido succínico, ácido malónico, ácido (etilendioxi) diacético, ácido maleico, ácido diglicólico, ácido tartárico, ácido tartrónico y ácido fumárico así como los carboxilatos de éter descritos en la Germán Offenle-enschrift 2,446,686 y 2,446,487 y el documento US 3,935,257 y los carboxilatos de sulfinilo descritos en la patente belga número 840,623. Los policarboxilatos que contienen tres grupos carboxi incluyen, en particular, citratos solubles en agua, aconitratos y citraconatos así como derivados de succinato tales como los carboximetiloxisuccinatos descritos en la patente británica número 1,379,241, lactoxisuccinatos descritos en la solicitud de los países bajos y los materiales de oxipolicarboxilato tales como tricarboxilatos de 2-oxa-l , 1 , 3 -propano descritos en la patente británica número 1,387,447. Los policarboxilatos que contienen cuatro grupos carboxi incluyen oxidisuccinatos descritos en la patente británica número 1,261,829, 1, 1 , 2 , 2-etanotetracarboxilatos, 1, 1, 3 , 3-propanotetracarboxilatos que contienen sustituyentes sulfo que incluyen los derivados de sulfisuccinato descritos en las patentes británicas números 1,398,421 y 1,398,422 y en el documento US 3,936,448, y los citratos pirolizados sulfonatados descritos en la patente británica número 1,082,179, mientras que los policarboxilatos que contienen sustituyentes fosfona se describen en la patente británica número 1,439,000. Los policarboxilatos alicíclicos y heterocílicos incluyen ciclopentano-cis, cis-cis-tetracarboxilatos , ciclopentadienopentacarboxilatos, 2,3,4, 5-tetrahidrofuran-cis, cis, cis-tetracarboxilatos, 2 , 5-tetrahidrofuran-cis, discarboxilatos , 2,2,5, 5 -tetrahidrofuran-tetracarboxilatos , l, 2, 3 , 4, 5, 6-hexano-hexacarboxilatos y derivados de carboximetilo de alcoholes polihídricos tales como sorbitol, manitol y xilitol. Los policarboxilatos aromáticos incluyen ácido melifico, ácido piromelítico y los derivados de ácido ftálico descritos en la patente británica número 1,425,343. De los anteriores, los policarboxilatos preferidos son hidroxicarboxilatos que contienen hasta tres grupos carboxi por molécula, más particularmente citratos. Los sistemas aglutinantes preferidos para uso en las presentes composiciones incluyen una mezcla de un aglutinante de aluminosilicato insoluble en agua tal como zeolita A o de un silicato estratificado (SKS-6) , y un agente quelante de carboxilato soluble en agua tal como ácido cítrico. Un quelante adecuado para inclusión en las composiciones de detergente de acuerdo con la invención es ácido etilendiamina-N,N' -disuccínico (EDDS) o las sales de metal alcalino, metal alcalinotérreo, amonio o amonio sustituido de las mismas, o mezclas de las mismas. Los compuestos de EDDS preferidos son la forma de ácido libre y la sal de sodio o de magnesio del mismo. Los ejemplos de tales sales de sodio preferidas de EDDS incluyen Na2EDDS y Na4EDDS . Los ejemplos de tales sales de magnesio preferidas de EDDS incluyen MgEDDS y Mg2EDDS . Las sales de magnesio son las más preferidas para inclusión en las composiciones de acuerdo con la invención. Los sistemas aglutinantes preferidos incluyen una mezcla de un aglutinante de aluminosilicato insoluble en agua tal como zeolita A y un agente quelante de carboxilato soluble en agua tal como ácido cítrico. Otros materiales aglutinantes que pueden formar parte del sistema aglutinante para uso en las composiciones granulares incluyen materiales inorgánicos tales como carbonatos, bicarbonatos, silicatos de metal alcalino y materiales orgánicos tales como los fosfonatos orgánicos, aminopolialquilenofosfonatos y aminopolicarboxilatos .

Otras sales orgánicas solubles en agua adecuadas son los ácidos homo- o co-poliméricos en las cuales el ácido policarboxílico comprende por lo menos dos radicales carboxilo separados entre si por no más de dos átomos de carbono. Los polímeros de este tipo se describen en GB-A-1, 596, 756. Los ejemplos de tales sales son poliacrilatos de peso molecular 2000-5000 y sus copolímeros con anhídrido maleico, tales como polímeros tienen un peso molecular desde 20,000 hasta 70,000, especialmente de aproximadamente 40,000. Las sales aglutinantes de detergencia normalmente se incluyen en cantidades desde 5% hasta 80% en peso de la composición. Las concentraciones preferidas de aglutinante para detergentes líquidos son desde 5% hasta 30%.

Enzimas Las composiciones detergentes preferidas, además de la preparación de enzima de la invención, comprenden otras enzimas las cuales proporcionan un funcionamiento limpiador y/o beneficios para el cuidado de las telas. Tales enzimas incluyen proteasas, lipasas, cutinasasa, amilasasa, celulasas, peroxidasas y oxidasas (por ejemplo lacasas) .

Proteasas : Se puede utilizar cualquier proteasa adecuada para uso en soluciones alcalinas. Las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Se incluyen mutantes modificados química o genéticamente. La proteasa puede ser una serina proteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa similar a tripsina. Los ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus , por ejemplo subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en el documento WO 89/06279) . Los ejemplos de proteasa similares a tripsina son la tripsina (por ejemplo de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrito en el documento WO 89/06270. Las enzimas de proteasa disponibles comercialmente preferidas incluyen aquellas vendidas bajo los nombres comerciales Alcalase, Savinase, Primase, Durazym y Esperasede Novo Nordisk A/S (dinamarca) , aquellas vendidas bajo los nombres comerciales Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect y Purafec OXP por Genencor International, y aquellas vendidas bajo los nombres comerciales Opticlean y Optimase por Solvay Enzymes. Las enzimas proteasa se pueden incorporar en las composiciones de acuerdo con la invención a una concentración desde 0.00001% hasta 2% de proteína de enzima en peso de la composición, preferiblemente a una concentración desde 0.0001% hasta 1% de proteína de enzima en peso de la composición, de manera más preferible una concentración desde 0.001% hasta 0.5% de proteína de enzima por peso de la composición, incluso de manera más preferible a una concentración desde 0.01% hasta 0.2% de proteína de enzima por peso de la composición.

Lipasas : Se puede utilizar cualquier lipasa adecuada para uso en soluciones alcalinas. Las lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o micótico. Se incluyen mutantes modificados química o genéticamente. Los ejemplos de lipasas útiles incluyen una lipasa de Humicola lanuginosa por ejemplo como se describe en los documentos EP 258 068 y EP 305 216, una lipasa de Rhizomucor miehei por ejemplo, como se describe en el documento EP 238 023, una lipasa de Candida tal como la lipasa de C. antárctica, por ejemplo la lipasa A o B de C. antárctica descrita en el documento EP 214 761, una lipasa de Pseudomonas tal como una lipasa de P. alcaligenes y P. pseudoalcaligenes por ejemplo como se describe en el documento EP 218 272, una lipasa de P. cepacia por ejemplo como se describe en el documento EP 331 376, una lipasa de P. stutzeri por ejemplo como se describe en el documento GB 1,372,034, una lipasa de P. fluorescens, una lipasa de Bacillus , por ejemplo una lipasa de B. subtilis (Dartois et al., (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260) , una lipasa de B. stearothermophilus (JP 64/744992) y una lipasa de B . pumilus (WO 91/16422) . Además, pueden ser útiles numerosas lipasas clonadas que incluyen la lipasa de Penicillium camembertii descrita por Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61-67), la lipasa de Geotricum candidum (Schimada, Y. et al., (1989), J. Biochem., 106, 383-388), y diversas lipasas de Rhizopus tales como la lipasa de R. delemar (Hass, M.J et al., (1991), Gene 109, 117-113), y la lípasa de R . niveus (Kugimiya et al., (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716-719) y una lipasa de R. oryzae . Otros tipos de enzimas lipolíticas tales como cutinasas también pueden ser útiles, por ejemplo, una cutinasa derivada de Pseudomonas mendocina como se describe en el documento WO 88/09367, una cutinasa derivada de Fusarium solani pisi (por ejemplo descrita en el documento WO 90/09446) . Las lipasas especialmente adecuadas son lipasas tales como MI Lipase™, Luma fast™ y Lipomax™ (Genencor) , Lipolase™ y Lipolase Ultra™ (Novo Nordisk A/S) y Lipase P "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.) . Las lipasas normalmente se incorporan en la composición de detergente a una concentración desde 0.00001 hasta 2% de proteína de enzima en peso de la composición, preferiblemente a una concentración desde 0.0001% hasta 1% de proteína de enzima en peso de la composición, de manera más preferible a una concentración desde 0.001% hasta 0.5% de proteína de enzima en peso de la composición, incluso de manera más preferible a una concentración desde 0.01% hasta 0.2% de proteína de enzima en peso de la composición.

Amilasas: Se puede utilizar cualquier amilasa ( y/o ß) adecuada para uso en soluciones alcalinas. Las amilasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o micótico. Se incluyen los mutantes modificados química o genéticamente. Las amilasas incluyen, por ejemplo a-amilasas obtenidas de una cepa especial de B. licheniformis descrita con mayor detalle en el documento GB 1,296,839. Las amilasas disponibles comercialmente sin Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™, y BAN™ (disponibles de Novo Nordisk A/S) y Rapidase™ y Maxamyl P™ (disponible de Genencor) . Las amilasas normalmente se incorporan en la composición de detergente a una concentración desde 0.00001% hasta 2% de la proteína de enzima por peso de la composición, preferiblemente a una concentración desde 0.0001% hasta 1% de la proteina de enzima, por peso de la composición, de manera más preferible a una concentración desde 0.001% hasta 0.5% de proteína de enzima por peso de la composición, incluso de manera más preferible a una concentración desde 0.01% hasta 0.2% de proteína de enzima por peso de la composición.

Celulasas : Se puede utilizar cualquier celulasa adecuada para uso en soluciones alcalinas. Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o micótico. Se incluyen los mutantes modificados química o genéticamente. Las celulasas adecuadas se describen en el documento US 4,435,307 la cual describen celulasas micóticas producidas a partir de Humicola insolens . Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas que tienen beneficios para el cuidado del color. Los ejemplos de tales celulasas con las celulasas descritas en la solicitud para patente europea número 0 495 257. Las celulasas disponibles comercialmente incluyen Celluzyme™ producido por una cepa de Humicola insolens, (Novo Nordisk A/S), y KAC-500(B)™ (Kao Corporation). Las celulasas normalmente se incorporan en la composición de detergente a una concentración desde 0.00001% hasta 2% de proteína de enzima por peso de la composición, preferiblemente una concentración desde 0.0001% hasta 1% de proteína de enzima por peso de la composición, y de manera más preferible a una concentración desde 0.001% hasta 0.5% de proteína de enzima por peso de la composición, incluso de manera más preferible a una concentración desde 0.01% hasta 0.2% de proteína de enzima por peso de la composición.

Peroxidasas/Oxidasas : Las enzimas peroxidasas se utilizan en combinación con peróxido de hidrógeno o una fuente del mismo (por ejemplo un percarbonato, perborato o persulfato) . Las enzimas oxidasa se utilizan en combinación con oxígeno. Ambos tipos de enzimas se utilizan como "solución blanqueadora", es decir, para evitar la transferencia de un colorante textil desde una tela teñida a otra tela cuando las telas se lavan juntas en un líquido de lavado, preferiblemente junto con un agente mejorador tal como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 94/12621 y WO 95/01426. Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o micótico. Se incluyen mutantes modificados química o genéticamente . Las enzimas peroxidadas y/u oxidadas normalmente se incorporan en la composición detergente a una composición desde 0.00001% hasta 2% de proteína de enzima por peso de la composición, preferiblemente a una concentración desde 0.0001% hasta 1% de proteína de enzima por peso de la composición, de manera más preferible a una concentración desde 0.001% hasta 0.5% de proteína de enzima por peso de la composición, incluso de manera más preferible a una concentración desde 0.01% hasta 0.2% de proteína de enzima por peso de la composición. Las mezclas de las enzimas mencionadas antes están abarcadas en la presnete, en particular una mezcla de una proteasa, una amilasa, una lipasa y/o una celulasa. La enzima de la invención, o cualquier otra enzima incorporada en la composición de detergente, normalmente se incorpora en la composición de detergente a una concentración desde 0.00001 hasta 2% de proteína de enzima por peso de la composición, preferiblemente a una composición desde 0.0001% hasta 1% de proteína de enzima por peso de la composición, de manera más preferible a una concentración desde 0.001% hasta 0.5% de proteína de enzima por peso de la composición, incluso de manera más preferible a una concentración desde 0.01% hasta 2% de proteína de enzima por peso de la composición. Agentes blanqueadores: Los ingredientes de detergente opcionales adicionales que se pueden incluir en las composiciones de detergente de la presente invención incluyen agentes blanqueadores tales como PB1, PB4 y percarbonato con un tamaño de partícula de 400-800 micrómetros. Estos componentes de agente blanqueador pueden incluir uno o más agentes blanqueadores de oxígeno y, dependiendo del agente blanqueador elegido, uno o más activadores de blanqueado. Cuando están presentes, los compuestos blanqueadores de oxígeno típicamente están presentes a concentraciones desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 25%. En general, los compuestos blanqueadores son componentes agregados opcionales en formulaciones no líquidas, por ejemplo detergentes granulares . El componente de agente blanqueador para uso en la presente puede ser cualquiera de los agentes blanqueadores útiles para composiciones detergentes que incluyen blanqueadores de oxígeno así como otros conocidos en la técnica. El agente blanqueador adecuado para la presente invención puede ser un agente blanqueador activado o no activado. Una categoría de agente blanqueador de oxígeno que puede ser utilizada abarca agentes blanqueadores de ácido percarboxílico y sales de los mismos. Los ejemplos adecuados de esta clase de agentes incluyen monoperoxiftalato de magnesio hexahidratado, sal de magnesio de ácido metacloroperbenzoico, ácido 4 -nonilamino-4 -oxoperoxibut í rico y ácido diperoxidodecanodioico. Tales agentes de blanqueado se describen en los documentos US 4,483,781, US 740,446, EP 0 133 354 y US 4,412,934. Los agentes blanqueadores altamente preferidos también incluyen al ácido 6-nonilamino-6-oxoperoxicaproico como se describe en el documento US 4,634,551. Otra categoría de agentes blanqueadores que pueden ser utilizados abarca los agentes blanqueadores de halógeno. Los ejemplos de agentes blanqueadores de hipoalito, por ejemplo incluyen ácido tricloroisocianúrico y los dicloroisocianuratos de sodio y de potasio y las N-cloro y N-alcanosulfonamidas . Tales materiales normalmente se abrigan a 0.5-10% en peso del producto terminado, preferiblemente 1-5% en peso.

Se pueden utilizar los agentes liberadores de peróxido de hidrógeno en combinación con activadores de blanqueador tales como tetraacetilendiamina (TAED) , nonaoiloxibencensulfonato (NOBS, descrito en el documento US 4,412,934), 3 , 5-trimetil-hexanoloxibencensulfonato (ISONOBS, descrito en el documento EP 120 591) o pentaacetilglucosa (PAG) , los cuales son perhidrolizados para formar un perácido como la especie blanqueadora activa, lo que lleva a un efecto blanqueador mejorado. Además, son muy adecuados los activadores de blanqueador C8 (6-octanamido-caproil) oxibencen-sulfonato, C9 (6-nonanamido caproil) oxibencensulfonato y CIO (6-decanamido caproil) oxibencensulfonato o mezclas de los mismos. Además, otros activadores adecuados son esteres de citrato acilados tales como los descritos en la solicitud para patente europea No. 91870207.7. Los agentes blanqueadores útiles, que incluyen peroxiácidos y sistemas blanqueadores que comprenden activadores de blanqueador y compuestos blanqueadores de peroxígeno para uso en composiciones limpiadoras de acuerdo con la invención se describen en la solicitud USSN 08/136,626. El peróxido de hidrógeno también esta presente al agregar un sistema enzimático (es decir, una enzima y un sustrato para el mismo) el cual es capaz de generación de peróxido de hidrógeno al principio o durante el lavado y/o el proceso de enjuagado. Tales sistemas enzimáticos se describen en la solicitud para patente europea EP 0 537 381. También se conocen en la técnica agentes blanqueadores diferentes a agentes blanqueadores de oxígeno y se pueden utilizar en la presente. Otro tipo de agente blanqueador que no es de oxígeno de interés particular incluye agentes blanqueadores fotoactivados tales como las ftalocianinas sulfonadas de zinc y/o de aluminio. Estos materiales se pueden depositar sobre el sustrato durante el proceso de lavado. Ante la irradiación con luz, en presencia de oxígeno, por ejemplo cuando se cuelga la ropa para secarla a la luz del día, la ftalocianina de zinc sulfonada es activada y en consecuencia, el sustrato se blanquea. La ftalocianina de zinc preferida y un proceso blanqueador fotoactivado se describen en el documento US 4,033,718. Típicamente, la composición de detergente contendrá desde aproximadamente 0.025% hasta aproximadamente 1.25% en peso de la ftalocianina de zinc sulfonada. Los agentes blanqueadores también pueden comprender un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede ser, por ejemplo, uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching" , Nature 369 , 1994, pp. 637-639.

Supresores de agua jabonosa: Otro ingrediente opcional es un supresor de agua jabonosa, ejemplificado por siliconas, y mezclas de sílice-silicona. Las siliconas generalmente se pueden representar por materiales alquilados de polisiloxano, en donde el sílice normalmente se utiliza en forma finamente dividida ejemplificado por aerogeles y xerogeles de sílice y sílices hidrofóbicas de diversos tipos. Estos materiales se pueden incorporar como particulados, en los cuales el supresor de agua jabonosa se incorpora liberablemente de manera ventajosa en un portador impermeable detergente soluble en agua o dispersable en agua, sustancialmente no tensioactivo. Alternativamente, el supresor de agua jabonosa puede disolverse o dispersarse en un portador líquido y se puede aplicar por aspersión sobre uno o más de los demás componentes. Un agente controlador de agua jabonosa de silicona preferido se describe en el documento US 3,933,672. Otros supresores de agua jabonosa particularmente útiles son los supresores de agua jabonosa de silicona autoemulsificables descritos en la solicitud de patente alemana DTOS 2,646,126. Un ejemplo de tal compuesto es DC-544 disponible comercialmente de Dow Corning, el cual es un copolímero de xilosano-glicol . Los agentes controladores de agua jabonosa especialmente preferidos son el sistema supresor de agua jabonosa constituido , de una mezcla de aceites de silicona y 2-alquil-alcanoles . Los 2-alquil-alcanoles adecuados son 2-butil-octanol el cual está disponible comercialmente bajo el nombre comercial Isofol 12 R. Tal sistema supresor de agua jabonosa se describe en la solicitud de patente europea EP 0 593 841. Los agentes controladores de agua jabonosa de silicona especialmente preferidos se describen en la solicitud de patente europea No. 92201649.8. Tales composiciones pueden comprender una mezcla de silicona/sílice en combinación con sílice no porosa ahumada tal como Aerosil™. Los supresores de agua jabonosa descritos antes normalmente se utilizan a concentraciones desde 0.001% hasta 2% en peso de la composición, preferiblemente desde 0.01% hasta 1% en peso.

Otros componentes : Otros componentes utilizados en las composiciones de detergente que se pueden utilizar como agentes para suspender la mugre, agentes liberadores de mugre, abrillantadores ópticos, abrasivos, bactericidas, inhibidores de manchas, agentes colorantes y/o perfumes encapsulados o no encapsulados. Los materiales encapsulantes especialmente adecuados son cápsulas solubles en agua las cuales consisten de una matriz de polisacárido y compuestos polihidroxi tal como se describe en el documento GB 1,464,616.

Otros materiales encapsulantes solubles en agua adecuados comprenden dextrinas derivadas de esteres de ácido de almidón no gelatinizado de ácidos dicarboxílicos sustituidos tales como los descritos en el documento US 3,455,838. Estas dextrinas de ácido-éster, preferiblemente se preparan a partir de almidones tales como maíz ceroso, sorgo ceroso, sago, tapioca y papa. Los ejemplos adecuados de tales materiales de encapsulación incluyen N-lok fabricado por National Starch. El material encapsulante N-lok consiste de un almidón de maíz modificado y glucosa. El almidón se modifica al agregar grupos sustituidos monofuncionales tales como anhídrido de ácido octenilsucsínico . Los agentes contra la redeposición y la suspensión de la mugre adecuados en la presente incluyen derivados de celulosa tales como metilcelulosa, carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa, y ácidos homo- o co-polimérico policarboxílicos o sus sales. Los polímeros de este tipo incluyen los poliacrilatos y los copolímeros de anhídrido maleico-ácido acrílico mencionados previamente como aglutinantes, así como polímeros de anhídrido maleico con etileno, metilviniléter o ácido metacrílico, el anhídrido maleico constituye por lo menos 20% molar del copolímero. Estos materiales normalmente se utilizan a concentraciones desde 0.5% hasta 10% en peso, de manera más preferible desde 0.75% hasta 8%, y de manera mucho más preferible desde 1% hasta 6% en peso de la composición. Los abrillantadores ópticos preferidos son de carácter no iónico, los ejemplos de los cuales son 4, 4 '-bis- (2-dietanolamino -4 -anilino-s -triazin-6- i lamino) estilben-2 :2 'disulfonato disódico, 4, -4 'bis (2-morfolino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino-estilben-2:2 ' -disulfonato disódico, 4,4 ' -bis- (2 , 4-dianilino-s-triazin-6-ilamino) estilben-2 : 2 ' -disulfonato monodisódico , 4' ,4' '-bis- (2,4 -dianilino- s-tri-azin-6-ilamino) estilben-2-sulfonato disódico, 4 , 4 ' -bis- (2-anilino-4- (N-metil-N-2-hidroxietilamino) -s-triazin-6-ilamino) estilben- 2,2 ' -disulfato disódico, 4,4 ' -bis- (4 -fenil-2, 1, 3-triazol-2-il) -estilben-2, 2 ' -disulfonato disódico, 4 , 4 'bis (2-anilino-4- (1-metil-2-hidroxietilamino) -s-triazin-6-ilamino) estilben-2 , 2 ' -disulfonato disódico, 2- (estilbil-4 ' ' - (nafto-1' ,2':4,5)-l,2,3-triazol-2 ' ' -sulfonato y 4, 4 ' ' -bis (2-sulfostiril) bifenilo. Otros materiales poliméricos útiles son los polietilenglicoles, particularmente aquéllos de peso molecular 1000-10,000, de manera más particular de 2,000 a 8000 y de manera más preferible de aproximadamente 4,000. Estos se utilizan a concentraciones desde 0.20% hasta 5%, de manera más preferible desde 0.25% hasta 2.5% en peso. Estos polímeros y las sales de policarboxilato homo- o copoliméricas mencionadas previamente son útiles para mejorar el mantenimiento de la blancura, la deposición de ceniza en la tela y el funcionamiento de limpieza sobre arcilla, manchas proteinasas u oxidables en presencia de impurezas de metales de transición. Los agentes de liberación de mugre útiles en composiciones de la presente invención convencionalmente son copolímeros o terpolímeros de ácido tereftálico con unidades de etilenglicol y/o propilenglicol en diversas composiciones.

Los ejemplos de tales polímeros se describen en los documentos US 4,116,885 y 4,711,730 y EP 0 272 033. Un polímero preferido particular de acuerdo con el documento EP 0 272 033 tiene la fórmula: (CH3 (PEG) 43) 0.75 (POH) 0.25 [T-PO) 2.8 (T-PEG) 0.4] T (POH) 0.25 ( (PEG) 43CH3) 0.75 en donde PEG es -(0C2H4)0-, PO es (OC3H60) y T es (pOOCsH4CO) .

Además, son muy útiles los poliésteres modificados como copolímeros aleatorios de tereftalato de dimetilo, sulfoisoftalato de dimetilo, etilenglicol y 1, 2 -propanodiol, los grupos de extremo consisten principalmente de sulfobenzoato y en segundo lugar de monoésteres de etilenglicol y/o 1,2-propanodiol. El objetivo es obtener un polímero rematado en ambos extremos por grupos sulfobenzoato, "principalmente", en el presente contexto la mayor parte de los copolímeros en la presente estarán rematados en el extremo por grupos sulfobenzoato. Sin embargo, algunos copolímeros estarán menos que completamente rematados, y por lo tanto sus grupos de extremo pueden consistir de monoéster de etilenglicol y/o 1,2-propanodiol, y por lo tanto consisten "secundariamente" de tales especies. Los poliésteres seleccionados en la presente contienen aproximadamente 46% en peso de ácido dimetiltereftálico, aproximadamente 16% en peso de 1,2-propanodiol, aproximadamente 6% en peso de etilenglicol, aproximadamente 13% en peso de ácido dimetilsulfobenzoico y aproximadamente 15% en peso de ácido sulfoisoftálico, y tiene un peso molecular de aproximadamente 3,000. Los poliésteres y su método de preparación se describen con detalle en el documento EP 311 342.

Agentes suavizantes: También se pueden incorporar agentes suavizantes de telas en las composiciones de detergente de lavandería de acuerdo con la presente invención. Estos agentes pueden ser- de tipo inorgánico u orgánico. Los agentes suavizantes inorgánicos están ejemplificados por las arcillas de esmectita descritas en el documento GB-A-1 400898 y en el documento US 5,019,292. Los agentes suavizantes de telas orgánicas incluyen las aminas terciarias insolubles en agua como se describen en GB-A1 514 276 y EP 0 011 340 y su combinación con sales monocuaternarias de amonio de C12-C14 como se describen en PE-B-0 026 528 y en amidas de di-cadena larga como se describen en EP 0 242 919. Otros ingredientes orgánicos útiles de los sistemas suavizantes de telas incluyen materiales de óxido de polietileno de peso molecular elevado como se describe en los documentos EP 0 299 575 y 0 313 146. Las concentraciones de arcilla esmectita normalmente están en el intervalo desde 5% hasta 15%, de manera más preferible desde 8% hasta 12% en peso, con el material agregado como un componente de mezcla seca al resto de la formulación. Los agentes suavizantes de tela orgánicos tales como las aminas terciarias insoblubles en agua o los materiales de amida de cadena larga se incorporan a concentraciones desde 0.5% hasta 5% en peso, normalmente desde 1% hasta 3% en peso mientras que los materiales de óxido de polietileno de peso molecular elevado y los materiales catiónicos solubles en agua se agregan a concentraciones desde 0.1% hasta 2%, normalmente desde 0.15% hasta 1.5% en peso. Estos materiales normalmente se agregan a la porción secada por aspersión de la composición, aunque en algunos casos puede ser más conveniente agregarlos como particulado mezclado seco, o rociarlos como un líquido fundido sobre otros componentes sólidos de la composición.

Agentes inhibidores de transferencia de color poliméricos: Las composiciones detergente de acuerdo con la presente invención también pueden comprender desde 0.001% hasta 10%, preferiblemente desde 0.01% hasta 2% y de manera más preferible desde 0.05% hasta 1% en peso de agentes poliméricos inhibidores de transferencia de colorante. Tales agentes poliméricos inhibidores de transferencia de colorante normalmente se incorporan en las composiciones de detergente con el fin de inhibir la transferencia de colorantes de las telas con color a las telas lavadas con los mismos. Estos polímeros tienen la capacidad de formar complejos o adsorber los colorantes fugitivos eliminados por lavado de las telas teñidas antes de que los colorantes tengan la oportunidad de unirse a otros artículos en el lavado. Los agentes poliméricos inhibidores de transferencia de colorante adecuados especialmente son polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol , polímeros de polivinilpirrolidona, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de los mismos. La adición de tales polímeros también mejora el funcionamiento de las enzimas de acuerdo con la invención. La composición detergente de acuerdo con la invención puede estar en forma líquida, en pasta, en geles, en barras o granular. Se pueden elaborar granulados que no formen polvo, por ejemplo como se describe en los documentos US 4,106,991 y 4,661,452 (ambos para Novo Industri A/S) y opcionalmente se pueden recubrir por métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos de materiales de recubrimiento cerosos son productos de poli (óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos molecular medios de 1000 a 20,000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene desde 12 hasta 20 átomos de carbono y en el cual existen 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y tri-glícéridos de ácidos grasos. Los ejemplos de materiales de recubrimiento formadores de película adecuados para aplicación por técnicas de lecho fluido se proporcionan en el documento GB 1483591. Las composiciones granulares de acuerdo con la invención también pueden estar en "forma compacta" es decir, pueden tener una densidad relativamente más elevada en comparación con los detergentes granulares convencionales, es decir, desde 550 hasta 950 g/1; en tal caso, las composiciones detergentes granulares de acuerdo con la presente invención contendrán una cantidad menor de "sal de relleno inorgánica" en comparación con los detergentes granulares convencionales; las sales de relleno típicas son sales de metal alcalinotérreo de sulfatos y cloruros, típicamente sulfato de sodio; los detergentes "compactos" típicamente comprenden no más de 10% de sal de relleno. Las composiciones líquidas de acuerdo con la presente invención también pueden estar en "forma concentrada", en tal caso, las composiciones de detergentes líquidos de acuerdo con la presente invención contendrán una cantidad menor de agua, en comparación con los detergentes líquidos convencionales. Típicamente, el contenido de agua del detergente líquido concentrado es menor de 30%, más preferiblemente menor de 20%, de manera más preferible menor de 10% en peso de las composiciones de detergente. Las composiciones de la invención por ejemplo, se pueden formular como composiciones de detergente de lavandería a mano o en máquina, que incluyen composiciones de aditivo de lavandería y composiciones adecuadas para uso en el pretratamiento de telas teñidas, enjuague agregado en composiciones suavizantes de tela, y composiciones para uso en operaciones de limpieza de superficie duras caseras en general y operaciones de lavado de trastes. Los siguientes ejemplos se presentan para ejemplificar las composiciones de la presente invención, pero no necesariamente significa que limiten o definan de alguna otra manera el alcance de la invención. En las composiciones de detergente, las identificaciones de componentes abreviados tienen los siguientes significados: LAS: Alquilbencensulfonato de sodio lineal de C12 tas: Sebo alquilsulfato de sodio XYAS: Alquilsulfato de sodio de C1X-C1Y SS : Surfactante de jabón secundario de fórmula de ácido 2-butiloctanoico 25EY: Un alcohol primario predominantemente lineal de C12-C15 condensado con un promedio de Y moles de óxido de etileno 45EY: Un alcohol primario predominantemente lineal de C14-C1S condensado con un promedio de Y moles de óxido de etileno XYEZS: Alquilsulfato de sodio de C1X-C1Y condensado con un promedio de Z moles de óxido de etileno por mol No iónico: Alcohol graso etoxilado/propoxilado mezclado de C13-C15 con un grado promedio de etoxilación de 3.8 y un grado promedio de propoxilación de 4.5, vendido bajo el nombre comercial Plurafax LF404 por BASF Gmbh CFAA: Alquil N-metilglucamida de C12-C14 TFAA: Alquil N-metilglucamida de C16-C18 Silicato: Silicato de sodio amorfo (Si02: NA20 proporción = 2.0) NaSKS-6: Silicato estratificado cristalino de fórmula d- Na2Si205 Carbonato: Carbonato de sodio anhidro Fosfato: Tripolifosfato de sodio MA/AA: Copolímero de 1:4 de ácido maleico/acrílico, peso molecular promedio de aproximadamente 80,000 Poliacrilato: Homopolímero de poliacrilato con un peso molecular promedio de 8,000 vendido bajo el nombre PA30 por BASF Gmbh Zeolita A: Aluminosilicato de sodio hidratado de fórmula Na12 (Al02Si02) 12.27H20 que tiene un tamaño de partícula primaria en el intervalo de 1 a 10 micrómetros. Citrato: Dihidrato de citrato trisódico Cítrico: Ácido cítrico Perborato: Perborato de sodio anhidro monohidratado como blanqueador, fórmula empírica NaB02.H202 PB4 : Perborato de sodio anhidro tetrahidratado Percarbonato : Percarbonato de sodio anhidro blanqueador de fórmula empírica, 2Na2C03.3H202 TAED: Tetraacetil etilendiamina CMC: Carboxilmetilcelulosa de sodio DETPMP: Dietilentriamina penta (ácido metilenfosfónico) , vendido por Monsanto bajo el nombre comercial de Dequest 2060 PVP: Polímero de polivinilpirrolidona EDDS: Ácido etilendiamina-N' -disuccínico, isómeros [S,S] en forma de sal de sodio Aguas jabonosas: Cera parafínica 25% Mpt 50 °C, 17% de sílice hidrofóbico, 58% Supresor: Aceite de parafina Agua jabonosa granular: 12% de silicona/sílice, 18% de alcohol estearílico, 70% de supresor: almidón en forma granular Sulfato: Sulfato de sodio anhidro HMWPEO: Óxido de polietileno de peso molecular elevado TAE 25: Etoxilato de alcohol de sebo (25) Eiemplo I de detergente Una composición limpiadora de tela granular de acuerdo con la invención se puede preparar como sigue: Alquilbencensulfonato de sodio lineal de C12 6.5 Sulfato de sodio 15.0 Zeolita A 26.0 Nitrilotriacetato de sodio 5.0 Enzima de la invención 0.1 PVP " 0.5 TAED 3.0 Ácido bórico 4.0 Perborato 18.0 Fenol sulfonato 0.1 Cantidades menores hasta 100 Ejemplo II de detergente Se puede preparar como sigue una composición limpiadora de tela granular compacta (densidad 800 g/1) de acuerdo con la invención: 45AS 8.0 25E3S 2.0 25E5 3.0 25E3 3.0 TFAA 2.5 Zeolita A 17.0 NaSKS-6 12.0 Ácido cítrico 3.0 Carbonato 7.0 MA/AA 5.0 CMC 0.4 Enzima de la invención 0.1 TAED 6.0 Percarbonato 22.0 EDDS 0.3 Supresor granular de agua jabonosa 3.5 Agua/cantidades menores hasta 100% Ejemplo III de detergente Las composiciones limpiadoras de telas granulares de acuerdo con la invención las cuales son especialmente útiles en lavandería de telas de color se preparan como sigue: LAS 10.7 TAS 2.4 TFAA 4.0 45AS 3.1 10.0 45E7 4.0 25E3S 3.0 68E11 25E5 - 8.0 Citrato 15.0 7.0 Carbonato - 10.0 Ácido cítrico 2.5 3.0 Zeolita A 32.1 25.0 Na-SKS-6 - 9.0 MA/AA 5.0 5.0 DETPMP 0.2 0.8 Enzima de la invención 0.10 0.05 Silicato 2.5 - Sulfato 5.2 3.0 PVP 0.5 — Poli (4-vinilpiridin) -N-óxido/ copolímero de vinilimidazol y vinilpirrolidona - 0.2 Perborato 1.0 Fenol sulfonato 0.2 Agua/cantidades menores hasta 100% Ejemplo IV de detergente Se puede preparar como sigue composiciones limpiadoras para telas granulares de acuerdo con la invención, las cuales proporcionan la capacidad de "suavizado mediante lavado" : 45AS - 10.0 LAS 7.6 68AS 1.3 45E7 4.0 25E3 - 5.0 Cloruro de cocoalquildimetilhi-droxietilamonio 1.4 1.0 Citrato 5.0 3.0 Na-SKS-6 - 11.0 Zeolita A 15.0 15.0 MA/AA 4.0 4.0 DETPMP 0.4 0.4 Perborato 15.0 - Percarbonato - 15.0 TEAD 5.0 5.0 Arcilla esmectita 10.0 10.0 HMWPEO - 0.1 Enzima de la invención 0.10 0.05 Silicato 3.0 5.0 Carbonato 10.0 10.0 Supresor granular de agua j abonosa 1.0 4.0 CMC 0.2 0.1 Agua/cantidades menores hasta 100% Ejemplo V de detergente Se pueden preparar como sigue composiciones limpiadoras de tela líquidas de uso de trabajo pesado de acuerdo con la invención.

II LAS forma acida 25.0 Ácido cítrico 5.0 2.0 25AS forma acida 8.0 25AE2S forma acida 3.0 - 25AE7 8.0 - CFAA 5 - DETPMP 1.0 1.0 Ácido graso 8 - Ácido oleico - 1.0 Etanol 4.0 6.0 Propandiol 2.0 6.0 Enzima de la invención 0.10 0.05 Cloruro de coco-aquil-dimetil -hidroxietilamonio _ 3.0 Arcilla de esmectita - 5.0 PVP 2.0 Agua/cantidades menores hasta 100% MATERIALES Y MÉTODOS Cepas : B. lentus 309 y 147 son cepas específicas de Basillus lentus, depositadas ante la NCIB y de acuerdo con el número de acceso NCIB 10309 y 10147, y se describen en la patente Norteamericana No, 3,723,250 incorporada en la presente como referencia.

Se vuelve a E. coli MC 1000 (M.J. Casadaban y S.N. Cohén (1980); J. Mol . Biol . 138 179-207), r", m+ por métodos convencionales y también se describe en la solicitud de patente Norteamericana No. 039,298.

Plásmidos : pJS3 : vector lanzadera de E. coli - B . subtilis que contiene un gen sintético que codifica para subtilasa 309. (Descrito por Jacob Schi?dt et al., en Protein and Peptide letters 3:39-44 (1996) . pSX222 : vector de expresión de B . subtilis (descrito en el documento PCT/DK96/00207) .

Métodos generales de biologia molecular: A menos que se indique de otra manera, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron utilizando métodos estándar de biología molecular (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al., (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley y Sons, 1995; Harwood, C.R., y Cutting, S.M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley y Sons, 1990) .

Las enzimas para manipulación de ADN se utilizaron de acuerdo con las especificaciones de los proveedores.

Enzimas para manipulación de ADN A menos que se mencione de otra manera, todas las enzimas para manipulación de ADN tales como, por ejemplo, endonucleasas de restricción, ligasas, etc., se obtienen de New England Biolabs, Inc.

Construcción de bibliotecas mu agenizadas aleatorias Preformación de mutagénesis aleatoria localizada Se sintetiza un cebador o iniciador mutagénico (oligonucleotídico) el cual corresponde a la parte de la secuencia de ADN que se va a mutagenizar excepto para los nucleótidos que corresponden a los codones de aminoácidos que se van a mutagenizar. Subsecuenctemente, el cebador mutagénico resultante se utiliza en una reacción de PCR con un cebador opuesto adecuado. El fragmento PCR resultante se purifica y digiere y clona en el vector lanzadera. Alternativamente y si es necesario, se utiliza el fragmento de PCR resultante en una segunda reacción de PCR como cebador con un segundo cebador opuesto adecuado de manera que se permite la digesión y clonación de la región mutagenizada dentro del vector lanzadera. Las reacciones de PCR se realizan bajo condiciones normales.

Actividad proteolitica En el contexto de esta invención, la actividad proteolítica se expresa en kilounidades de proteasa NOVO (KNPU) . La actividad se determina relativamente a una enzima estándar (SAVINASEÓ) , y después la determinación se basa en la digestión de una solución de dimetilcaseina (DMC) por la enzima proteolítica en condiciones estándar, es decir, 50°C, pH, 8.3, 9 min. de tiempo de reacción, 3 min. de tiempo de medición. Está disponible un documento AF 220/1 a solicitud ante Novo Nordisk A/S, Dinamarca, documento el cual se incluye en la presente como referencia. Una GU es una unidad de glicina, definida como la actividad de enzima proteolítica la cual, bajo condiciones estándar, durante una incubación de 15 minutos a 40 °C con N-acetilcaseina como sutrato produce una cantidad de grupo de NH2 equivalente a 1 mmol de glicina. La actividad de enzima también se puede medir utilizando el ensayo PNA, de acuerdo con la reacción con el sustrato soluble succinil-alanin-alanin-prolin. fenil-alanin-para-nitrofenol, el cual se describe en Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H. , y Smith, L.A.

Fermentación: La fermentación de enzimas de subtilasa se realiza a 30°C en una mesa de agitación giratoria (300 rpm) en matraces Erlemeyer con deflectores de 500 mi que contienen 100 mi de medio BPX, durante 5 días. Consecuentemente, con el fin de elaborar, por ejemplo, 2 litros de caldo, se fermentan simultáneamente 20 matraces Erlemeyer.

Ensayo para prueba para proteasa con estabilidad autoproteolitica aumentad : Las muestras que contienen proteasa se elaboran al hacer crecer cepas que incluyen cepas de referencia en medios adecuados lo que permite la expresión de la proteasa en placas de microtitulación o en matraces de agitación. A partir de cada muestra que contiene proteasa, se toman alícuotas, a las cuales se agrega 1/10 vol. de amortiguador glicina-NaOH 2M; pH 10.0, y se incuban las alícuotas durante 3 horas a 4°C y 55 °C, respectivamente.

Después de la incubación se determinan las actividades de proteasa utilizando el sustrato succinil-alanin-alanin-para-nitrofenol (Suc-Ala-Ala-pNA) a 0.6 g/1, en el siguiente amortiguador: KCl 150 mM, Na2B407 50 mM; pH ajustado a 9.0. Se mezclan 20 µl de muestra + 180 µl de sustrato en pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos. Se observa el desarrollo de color a 405 nm en un lector de microplaca. Se determinaron actividades utilizando Savinasa™ como estándar. Se calculó la actividad residual de una muestra como la actividad de proteasa de la alícuota incubada a 55 °C en porcentaje de la actividad de proteasa de la alícuota incubada a 4°C. Se identificaron las proteasas que muestran actividad residual aumentada.

Medio: BPX: Composición (por litro) almidón de papa 100 g cebada molida 50 g harina de frijol de soya 20 g Na2HP04 X 12 H20 9 g pluronic 0 . 1 g caseinato de sodio 10 g El almidón en el medio se licúa con a-amilasa y el medio se esteriliza al calentarlo a 120 °C durante 45 minutos. Después de esterilización se ajusta el pH del medio a 9 por adición de NaHC03 hasta 0.1 M.

EJEMPLOS Para la generación de variantes de enzimas de acuerdo con la invención se utilizaron los mismos materiales y métodos descritos en, por ejemplo, WO 89/06279 (Novo Nordisk A/S) , EP 130,756 (Genentech) , EP 479,870 (Novo Nordisk A/S) , EP 214,435 (Henkel) , WO 87/04461 (Amgen) , WO 87/05050 (Genex) , la solicitud EP No. 87303761 (Genentech), EP 260,105 (Genencor), WO 88/06624 (Gist-Brocades NV) , WO 88/07578 (Genentech) , WO 88/08028 (Genex), WO 88/08033 (Amgen), WO 88/08164, Thomas et al. (1985) Nature, 318 375-376; Thomas et al. (1987) J. Mol . Biol . , 193, 803-813; Russel y Fersht (1987) Nature 328496-500. Otros métodos bien establecidos en la técnica también se pueden utilizar.

EJEMPLO 1 Construcción v expresión de variantes de enzimas : Se elaboran variantes de subtilasa 309 dirigidas a sitio por las técnicas de "eliminación de sitio único (USE) " o la técnica "Uracil-USE" descritas respectivamente por Deng et al. (Anal. Biochem. 200:81-88 (1992)) y Markvardsen et al. (BioTechniques 18 (3) : 371-372 (1995)). El plásmido plantilla es pJS3 , o un análogo de éste que contiene una variante de subtilasa 309, por ejemplo se realizó mutagénesis USE en el análogo pJS3 que contiene un gen que codifica para la variante Y167I+R170L con un oligonucleótido dirigido a la construcción de la variante A194P que resulta en una variante final de subtilasa 309 Y167I+R170L. Las variantes de subtilasa 309 construidas en pJS3 después se subclonan en el plásmido de expresión pSX222 para B . subtilis, utilizando las enzimas de restricción Kpnl y Mlul . Este constructo o contrucción se transforma en una cepa competente de B. subtilis con el fin de purificar la proteasa fermentada como se describe antes en un medio que contiene 10 µg/ml de cloramfenicol (CAM) .

EJEMPLO 2 Purificación de las variantes de enzima: Este procedimiento se relaciona con la purificación de una fermentación a escala de 2 litros de la enzima subitilisina 147, la enzima subtilisina 309 o mutantes de las mismas . Se centrifugan a 500 rpm durante 35 minutos aproximadamente 1.6 litros de caldo de fermentación en vasos de precipitados de 1 litro. Se ajustan los sobrenadantes a pH 6.5 utilizando ácido acético al 10% y se filtran en placas de filtro Seitz Supra SlOO. Los filtrados se concentran a aproximadamente 400 mi utilizando una unidad Amicon CH2A UF equipada con un cartucho Amicon S1Y10 UF. El concentrado UF se centrifuga y filtra antes de absorción a temperatura ambiente en una columna de afinidad Bacitracina a pH 7. La proteasa se eluye a partir de la columna de Bacitracina a temperatura ambiente utilizando 2 -propanol 25% y cloruro de sodio 1 M en solución amortiguadora con ácido dimetilglutárico 0.01, ácido bórico 0.1 M y cloruro de calcio 0.002 M ajustado a pH 7. Las fracciones con actividad de proteasa a partir de la etapa de purificación de Bacitracina se combinan y aplican a una columna Sephadex G25 de 750 mi (5 cm de diámetro) equilibrada con un amortiguador que contiene ácido dimetilglutárico 0.01, ácido bórico 0.2 M y cloruro de calcio 0.002 M ajustado a pH 6.5.

Las fracciones con actividad proteolítica a partir de la columna de Sephadex G25 se aplicaron a una columna de intercambio catiónico de CM Sepharose CL 6B 150 mi (5 cm de diámetro) equilibrado con un amortiguador que contiene ácido dimetilglutárico 0.01 M, ácido bórico 0.2 M y cloruro de calcio 0.002 M ajustado a pH 6.5. La proteasa se eluyó utilizando un gradiente lineal de cloruro de sodio 0.01 M en 2 litros del mismo amortiguador (cloruro de sodio 0-0.2 M en el caso de subtilisina 147) . En una etapa de purificación final se combinó y concentró la proteasa que contiene las fracciones de la columna de CM Sepharose y se concentró en una celda de ultrafiltración Amicon equipada con una membrana GR81PP (de the Danish Sugar Factories Inc.) . Al utilizar las técnicas del ejemplo 1 para la construcción y el procedimiento de aislamiento anterior, se produjeron y aislaron las siguientes variantes de subtilisina 309: Y167I + R107L + A133P Y167I + R107L + T134P Y167I + R107L + A133P + T134P Y167I + R107L + V104C +S132C Y167I + R107L + A108C + T134C Y167A + R170S + F189A G: Y167A + R170S + Y192A H: Y167A + R170S + Y192P I: Y167A + R170S + Y192A + A194P J: Y167A + R170S + Y192P + A194P K: Y167A + R170S + F189G L: Y167A + R170S + F189E M: Y167A + R170S + F189R N: Y167I + R170L M: Y167I + R170L + A194P 0: Y167A + R170S + A194P P: Y167A + R170L + A194P Q: Y167A + R170N + A194P R: V104C + S132C + Y167I + R170L S: A108C +T134C + Y167I + R170L EJEMPLO 3 Identificación del sitio de separación autolítica: Una fracción de la variante Sevinase™ N:167I+R170L (después de la purificación como se ha descrito antes) se somete a análisis SDS-PAGE y se encontró que tiene dos bandas que se originan supuestamente de degradación autolítica. Las bandas migran con Mr de 12 kDa y 10 kDa, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la parte N terminal de los péptidos que constituyen estas dos bandas se determinaron posterior a SDS-PAGE y se electrotransfieron a una membrana de PVDF. La secuencia de aminoácidos en la parte N terminal de la banda que migra con Mr 12 kDa se encontró que es Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Trp-Gly-Ile-Ser- , la cual es idéntica a la secuencia de aminoácidos N-terminal de N: 167I+R170L. La secuencia de aminoácidos en la parte N terminal de la banda que migra con Mr 10 kDa se encuentra que es Gly-Ala-Gly-Leu-Asp-Ile-Val-Ala-Pro- , la cual es idéntica a la secuencia de aminoácidos de los residuos aminoácidos 187 a 195 en N:Y167I+R170L (residuos 193 hasta 201 en la numeración BPN' ) . Esto identifica a la unión peptídica entre los residuos aminoácidos 186 y 187 en N: Y167I+R170L (residuos 192 y 193 en la numeración BPN' ) como un sitio de separación autolítica. La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de tiempo ionización por desorbción láser asistida en matriz de la fracción reveló que las masas de los dos componentes son de 12,997.5 kDa + 13 kDa y 8,397.8 kDa + 8 kDa, respectivamente. La masa teórica del fragmento autolítico que consiste de los residuos aminoácidos 187 a 269 en N: Y167I+R170L (residuos 192 a 275 en la numeración BPN') es de 8,397.3 kDa, por lo que se confirma que no se han producido otra separaciones autolíticas en la parte C terminal respecto al residuo 186.

Utilizando el valor de masa del fragmento más grande (12,997.5 kDa) es posible deducir que la otra separación utolítica se produjo entre los residuos aminoácidos 130 y 131 en N:Y167I+R170L (residuos 132 y 133 en la numeración de BPN') . La masa teórica del fragmento autolítico consistió de los residuos de aminoácidos 1 a 130 en N:Y167I+R170L (residuos 1 a 132 en la numeración BPN') la cual es de 12,699.1 kDa. Para sustanciar estos hallazgos de sitios de ruptura autolíticas en N: Y167I+R170L, se incubó la proteasa en una concentración de 2 mg/ml en fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.5 a 37 °C en diversos puntos en el tiempo desde 0 min hasta 6 horas, y se extrajo una alícuota de 20 µl de la mezcla de incubación y se agregaron 80 µl de TFA 1% lo que resulta en una inhibición irreversible de la actividad proteolítica de N: Y167I+R170L. Las muestras se mantuvieron en un congelador hasta la espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorbción láser asistida por matriz. El resultado de la espectrometría de masas muestra claramente un incremento estable en la cantidad de fragmentos con masas de 12,698.9 kDa + 13 kDa y 8,396.1 kDa + 8 kDa, respectivamente, y una disminución estable en el componente con una masa de 26, 607.0kDa±26KDa. La masa teórica de N:Y167I+R170L es 26,605.4 kDa.

EJEMPLO 4 Construcción de variantes de proteasa aleatorias : Se construyeron 3 bibliotecas aleatorias en la vencidad del sitio de separación autoproteolítico 132-133. En cada una de las 3 bibliotecas se utilizó como plantilla BLS309 variante Y167I+R170L. Se preparó la construcción de las 3 bibliotecas de aminoácidos (aa) 1) 129-131, 2) 132-133, 3) 134-135 como se describe en materiales y métodos antes . Se sintetiza un oligonucleótido con 25% de cada uno de las cuatro bases en la primera y segundas bases en los codones de aminoácidos que se busca mutagenizar. El tercer nucleótido (la base variable) en los codones se sintetiza con 50% G/50% C para proporcionar una probabilidad más grande para cambios a los aminoácidos con 1 ó 2 codones . El cebador mutagénico se utilizó en una reacción de PCR con un cebador opuesto adecuado y el plásmido pJS3 : (Y167I+R170L) como plantilla. El fragmento de PCR resultante se purifica y el fragmento de PCR resultante se utiliza en una segunda reacción de PCR como un cebador con un segundo cebador opuesto adecuado. Esta etapa es ventajosa y es capaz de digerir y clonar la región mutagenizada dentro del vector lanzadera pJS3.

Se han preparado bibliotecas de la región 129-131, 132-133, 134-135 que contienen de 10,000 a 80,000 clonas/biblioteca . Se secuencias 10 colonias elegidas aleatoriamente poara confirmar las mutaciones diseñadas.

EJEMPLO 5 Identificación de variantes de proteasa con antiviral autoproteolítica aumentada: Las clonas de cada biblioteca construida como se describe en el ejemplo 4 se probaron para determinar su estabilidad autoproteolítica como se describe antes. Para cada biblioteca se incuban 500 clonas individuales en una placa de microtitulación durante la noche a 37°C en 200 µl de medio LB co 10 µg/ml de cloramfenicol (CAM) . Con la variante de SAVINASE™ N: Y167I+R170L como cepa de referencia se identificaron dos variantes con estabilidad autoproteolítica aumentada X : A133D +Y167 I +R170L , Y:P129K+Y167I+R170L, y GG: P129K+P131H+Y167I+R170L . Esto ilustra que las sustituciones (P129K, P131H, A133D) en la vecindad del sitio de separación autoproteolítico localizado entre las posiciones 132-133 proporcina estabilidad autoproteolítica aumentada.

EJEMPLO 6 Experimento de fermentación comparativa con variantes con estabilidad autoproteolítica aumentada: La variante de Savinase™ "M: Y167I+R170L+A194P" se encuentra en un experimento de fermentación en comparación con su variante precursora "N:Y167I+R170L" que no tiene una sustitución A194P en la vecindad del sitio de división autoproteolítica localizado entre los residuos 192-193. Ambas variantes se clonaron en un fondo de vector de expresión pSX222 y se fermetaron como se describe antes en 100 mi de medio BPX que contiene 10 µg/ml de CAM. Después de 5 días de fermentación, se centrifugan 1.5 mi del medio de fermentación BPX y se utiliza el sobrenadante para medir la actividad proteolítica (KPUN) como se describe antes. El medio de fermentación que contiene la variante "M: Y167I+R170L+A194P" tiene un nivel significativamente superior de actividad proteolítica en comparación con el medio de fermentación que contiene la variante "N: Y167I+R170L" .

Actualmente se considera que ambas variantes tienen la misma actividad específica, y en consecuencia actualmente se considera que el más elevado nivel de actividad proteolítica en el medio de fermentación que contiene la variante "M: Y167I+R170L+A194P" se debe a una estabilidad autoproteolítica relativamente aumentada en la variante "M: Y167I+R170L+A194P" en comparación con la variante del precursor "N: Y167I+R170L" que no tiene la sustitución A194P. Se obtienen resultados similares con las variantes O:Y167A+R170S+A194P, P : Y167A+R170L+A194P y Q : Y167A+R170N+A194P en comparación con su variante precursora correspondiente sin la mutación A194P. Además, se obtuvieron resultados similares con la variante HH: A133P+Y167A+R170S en comparación con su variante precursora correspondiente sin la mutación A133P, que muestra que la sustitución A133P proporciona actividad autoproteolítica aumentada. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se prefiere.

Claims (32)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede , se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una variante de enzima subtilasa caracterizada porque se deriva de una enzima subtilasa precursora que tiene un sitio de división autoproteolítico entre los residuos 132 y 133 (en la numeración BASBPN) , la cual además ha sido modificada por sustitución, inserción o supresión en o dentro de uno o más de los residuos situados en las posiciones que corresponden a los residuos 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 de BLS309 (en la numeración BASBPN) ; por lo que la variante muestra una estabilidad autoproteolítica aumentada en relación a la enzima subtilasa precursora.

2. Una variante de enzima subtilasa caracterizada porque se deriva de una variante de enzima subtilasa precursora que tiene modificaciones en uno o más residuos aminoácidos situados en las posiciones que corresponden a los residuos G159, S164, 1165, Y167, R170, Y171 de BLS309 (en la numeración BASBPN) ; la cual además ha sido modificada por sustitución, inserción o supresión en o dentro de uno o más residuos situados en las posiciones que corresponden a los residuos 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (en la numeración BASBPN) ; por lo que la variante muestra una estabilidad autoproteolítica aumentada en relación a la variante de subtilasa precursora loa cual no está modificada en ninguna de las porciones 129-136.

3. Una variante de enzima subtilasa caracterizada porque se deriva de una enzima subtilasa precursora que tiene un sitio de división autoproteolítico entre los residuos 192 y 193 (en la numeración BASBPN) , la cual además ha sido modificada por sustitución, inserción o supresión en o dentro de uno o más de los residuos situados en las posiciones que corresponden a los residuos 189, 190, 191, 192, 193, 196 (en la numeración BASBPN) ; por lo que la variante muestra estabilidad autoproteolítica aumentada en relación a la enzima subtilasa precursora.

4. Una variante de enzima subtilasa caracterizada porque se deriva de una variante de enzima subtilasa precursora que tiene modificaciones en uno o más residuos aminoácidos situados en las posiciones que corresponden a los residuos P129, P131, E136, G159, S164, 1165, Y167, R170, Y171 de BLS309 (en la numeración BASBPN) ; la cual además ha sido modificada por sustitución, inserción o supresión en o dentro de uno o más residuos situados en las posiciones que corresponden a los residuos 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 de BLS309 (en la numeración BASBPN) ; por lo que la variante muestra una estabilidad autoproteolítica aumentada en relación a la variante de subtilasa precursora la cual no está modificada en ninguna de las porciones 189-196.

5. La variante de enzima subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la enzima subtilasa precursora ha sido modificada en ambas posiciones: i) en uno o más de los residuos situados en las posiciones que corresponden a los residuos 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (en la numeración de BASBPN) y ii) en uno o más de los residuos situados en las posiciones que corresponden a los residuos 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 de BLS309 (en la numeración de BASBPN) .

6. La variante de enzima subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la subtilasa precursora se elige del subgrupo I -SI.

7. La variante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la subtilasa precursora se elige del grupo que comprende ABSS168, BASBPN, BSSDY y BLSCAR o variantes funcionales de las mismas que tienen retenida la característica del subgrupo I -SI.

8. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la subtilasa precursora se elige del subgrupo I-S2.

9. La variante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la subtilasa precursora se elige del grupo que comprende BLS147, BLS309, BAPB92 y BYSYAB o variantes funcionales de las mismas que tienen retenida la característica del subgrupo I-S2.

10. La variante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la subtilasa original o parental es TVTHER o variantes funcionales de la misma que tiene retenida la característica del subgrupo I-S2.

11. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la sustitución o sustituciones se combinan con sustituciones, inserciones o supresiones en por lo menos otra posición.

12. La variante de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque las sustituciones se combinan con sustituciones, inserciones o supresiones en cualquiera otra de una o más de las posiciones 36, 222, 218 y 76.

13. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque es una combinación de cualquiera de las siguientes: T129V, T129I, T129L, T129M, T129F A129V, A129I, A129L, A129M, A129F G131V, G131I, G131L, G131M, G131F K136V, K136I, K136L, K136M, K136F, S159V, S159I, S159L, S159M, S159F, T164V, T164I, T164L, T164M, T164F, K170V, K170I, K170L, K170M, K170F, Q136V, Q136I, Q136L, Q136M, Q136F, T159V, T159I, T159L, T159M, T159F, A164V, A164I, A164L, A164M, A164F, Y170V, Y170I, Y170L, Y170M, Y170F, Y171A, Y171H, Y171N, Y171P, Y171C, Y171W, Y171Q, Y171S, Y171T, Y171G Y171V, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F E136V, E136I, E136L, E136M, E136F, G159V, G159I, G159L, G159M, G159F, G164V, G164I, G164L, G164M, G164F, S164V, S164I, S164L, S164M, S164F, Y167A, Y167H, Y167N, Y167P, Y167C, Y167W, Y167Q, Y167S, Y167T, Y167G Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F R170A, R170H, R170N, R170P, R170C, R170W R170Q, R170S, R170T, R170Y, R170G R170V, R170I, R170L, R170M, R170F, en combinación con una modificación en una o más de cualquiera de las siguientes posiciones: 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (en la numeración de BASBPN) .

14. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque es una combinación de cualquiera de las siguientes modificaciones : T129V, T129I, T129L, T129M, T129F A129V, A129I, A129L, A129M, A129F G131V, G131I, G131L, G131M, G131F K136V, K136I, K136L, K136M, K136F, S159V, S159I, S159L, S159M, S159F, T164V, T164I, T164L, T164M, T164F, K170V, K170I, K170L, K170M, K170F, Q136V, Q136I, Q136L, Q136M, Q136F, T159V, T159I, T159L, T159M, T159F, A164V, A164I, A164L, A164M, A164F, Y170V, Y170I, Y170L, Y170M, Y170F, Y171A, Y171H, Y171N, Y171P, Y171C, Y171W, Y171Q, Y171S, Y171T, Y171G Y171V, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F E136V, E136I, E136L, E136M, E136F, G159V, G159I, G159L, G159M, G159F, G164V, G164I, G164L, G164M, G169F, S164V, S164I, S164L, S164M, S164F, Y167A, Y167H, Y167N, Y167P, Y167C, Y167W, Y167Q, Y167S, Y167T, Y167G Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F R170A, R170H, R170N, R170P, R170C, R170W R170Q, R170S, R170T, R170Y, R170G R170V, R170I, R170L, R170M, R170F, en combinación con una modificación en una o más de cualquiera de las siguientes posiciones: 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 (en la numeración de BASBPN).

15. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque es una combinación de conformidad con cualquiera de las siguientes modificaciones : T129V, T129I, T129L, T129M, T129F A129V, A129I, A129L, A129M, A129F G131V, G131I, G131L, G131M, G131F K136V, K136I, K136L, K136M, K136F, S159V, S159I, S159L, S159M, S159F, T164V, T164I, T164L, T164M, T164F, K170V, K170I, K170L, K170M, K170F, Q136V, Q136I, Q136L, Q136M, Q136F, T159V, T159I, T159L, T159M, T159F, A164V, A164I, A164L, A164M, A164F, Y170V, Y170I, Y170L, Y170M, Y170F, Y171A, Y71H, Y171N, Y171P, Y171C, Y171W, Y171Q, Y171S, Y171T, Y171G Y171V, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F E136V, E136I, E136L, E136M, E136F, G159V, G159I, G159L, G159M, G159F, G164V, G164I, G164L, G164M, G164F, S164V, S164I, S164L, S164M, S164F, Y167A, Y167H, Y167N, Y167P, Y167C,' Y167W, Y167Q, Y167S, Y167T, Y167G Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F R170A, R170H, R170N, R170P, R170C, R170W R170Q, R170S, R170T, R170Y, R170G R170V, R170I, R170L, R170M, R170F; en combinación con una modificación en uno o más de cualquiera de las siguientes posiciones: i) 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (en la numeración de BASBPN) y ii) 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 (en la numeración de BASBPN)

16. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada porque la variante se combina con sustituciones, supresiones y/o inserciones adicionales en cualquiera de uno o más de las posiciones: 27, 36, 57, 76, 97, 101, 104, 120, 123, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.

17. La variante de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la subtilasa pertenece al subgrupo I-S2 y un cambio adicional se elige del grupo que comprende K27R, *36D, S57P, N76D, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L y T274A.

18. La variante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque comprende cualquiera de las variantes V104N+S101G, K27R+V104Y+N123S+T274A o N76D+V104A, u otras combinaciones de estas mutaciones (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A) , en combinación con cualquiera de una o más de las sustituciones, supresiones y/o inserciones mencionadas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 caracterizada porque se elige del grupo de variantes que comprenden por lo menos las siguientes mutaciones : A Y167I + R170L + A133P B Y167I + R170L + T134P C Y167I + R170L + A133P + T134P D Y167I + R170L + V104C + S132C E Y167I + R170L + A108C + T134C F Y167A + R170S + F189A G Y167A + R170S + Y192A H Y167A + R170S + Y192P I Y167A + R170S + Y192A + A194P J Y167A + R170S + Y192P + A199 K Y167A + R170S + F189G L Y167A + R170S + F189E M Y167A + R170S + F189R N: Y167I + R170L M: Y167I+R170L+A194P 0: Y167A+R170S+A194P P: Y167A+R170L+A194P Q: Y167A+R170N+A194P R: V104C+S132C+Y167I+R170L S: A108C+T134C+Y167I+R17OL T: V104C+S132C+Y167A+R170S V: V104C+S132C+Y167A+R170 V: V104C+S132C+Y167A+R170N X: A133D+Y167I+R170L Y: P129K+Y167I+R170L Z: A133P+Y167A+R170S+A194P AA: T134P+Y167A+R170S+A194P BB: A133P+T134P+Y167A+R170S+A194P CC: A133P+Y167A+R170N+A194P DD: T134P+Y167A+R170N+A194P EE : A133P+T134P+Y167A+R170N+A194P FF: A133P+Y167A+R170L GG: P129K+P131H+Y167I+R170L HH: A133P+Y167A+R170S II: A133P+Y167A+R170N JJ: Y167A+R170S+F189K KK: V104C+T134C+Y167A+R170S

20. Un proceso para la identificación de una variante de proteasa que muestre estabilidad autoproteolítica, caracterizado porque comprende llevar a cabo una mutación en el ADN que codifica para la enzima subtilasa o su pre- o preproenzima en una o más posiciones que correspondan a los aminoácidos P129, P131, E136, G159, S164, 1165, Y167, R170, Y171 de BLS309 (en la numeración BASBPN) ; transformar una cepa de Bacillus con el ADN mutado; seleccionar cepas que produzcan tales variantes de proteasa; fermentar/hacer crecer tal cepa; recuperar la variante de proteasa, y realizar pruebas para determinar estabilidad mejorada al almacenamiento y/o funcionamiento en el lavado, en detergentes.

21. Un proceso para la producción de enzima subtilasa mutante, caracterizado porque comprende la manufactura de una enzima subtilasa mutante que tiene una estabilidad autoproteolítica aumentada deseada después de su identificación de conformidad con el procedimiento de la reivindicación 20.

22. Una secuencia de ADN, caracterizada porque codifica para una variante de subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

23. Un vector, caracterizado porque comprende una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 22.

24. Una célula huésped microbiana, caracterizada porque se transforma con un vector de conformidad con la reivindicación 23.

25. El huésped microbiano de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque es una bacteria, preferiblemente un Bacillus, especialmente un B . lentus .

26. El huésped microbiano de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque es un hongo o levadura, preferiblemente un hongo filamentoso, especialmente un aspergillus.

27. Un método para producir una variante, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque se cultiva un huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26 bajo condiciones que conducen a la expresión y secreción de la variante, y la variante se recupera.

28. La composición, caracterizada porque comprende una variante de subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

29. La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque comprende adicionalmente una celulasa, lipasa, cutinasa, óxidoreductasa, otra proteasa o una amilasa.

30. La composición de conformidad con la reivindicación 28 ó 29, caracterizada porque la composición es una composición detergente .

31. El uso de una variante de subtilasa, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, o una composición de enzima de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizada porque se utiliza en un detergente de lavandería y/o para lavado de trastes .

32. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque se elige del grupo de variantes que comprenden por lo menos una de las siguientes mutaciones a continuación, en combinación con una o dos de las mutaciones A194P y/o A133P; R170A R170C R170F R170G R170H R170I R170L R170N RÍ70M R170P R170Q R170S R170T R170V R170Y Y167A + R170A Y167C + R170A Y167F + R170A Y167G + R170A Y167H + R170A Y167I + R170A Y167L + R170A Y167M + R170A Y167N + R170A Y167P + R170A Y167Q + R170A Y167S + R170A Y167T + R170A Y167V + R170A Y167A + R170C Y167C + R170C Y167F + R170C Y167G + R170C Y167H + R170C Y167I + R170C Y167L + R170C Y167M + R170C Y167N + R170C Y167P + R170C Y167Q + R170C Y167S + R170C Y167T + R170C Y167V + R170C Y167A + R170F Y167C + R170F Y167F + R170F Y167G + R170F Y167H + R170F Y167I + R170F Y167L + R170F Y167M + R170F Y167N + R170F Y167P + R170F Y167Q + R170F Y167S + R170F Y167T + R170F Y167V + R170F Y167A + R170G Y167C + R170G Y167F + R170G Y167G + R170G Y167H + R170G Y167I + R170F Y167L + R170F Y167M + R170F Y167N + R170F Y167P + R170F Y167Q + R170F Y167S + R170F Y167T + R170F Y167V + R170F Y167A + R170G Y167C + R170G Y167F + R170G Y167G + R170G Y167H + R170G Y167I + R170G Y167L + R170G Y167M + R170G Y167N + R170G Y167P + R170G Y167Q + R170G Y167S + R170G Y167T + R170G Y167V + R170G Y167A + R170H Y167C + R170H Y167F + R170H Y167G + R170H Y167H + R170H Y167I + R170H Y167L + R170H Y167M + R170H Y167N + R170H Y167P + R170H Y167Q + R170H Y167S + R170H Y167T + R170H Y167V + R170H Y167A + R170I Y167C + R170I Y167F + R170I Y167G + R170I Y167H + R170I Y167I + R170I Y167L + R170I Y167M + R170I Y167N + R170I Y167P + R170I Y167Q + R170I Y167S + R170I Y167T + R170I Y167V + R170I Y167A + R170L Y167C + R170L Y167F + R170L Y167G + R170L Y167H + R170L Y167I + R170L Y167L + R170L Y167M + R170L Y167N + R170L Y167P + R170L Y167Q + R170L Y167S + R170 Y167T + R170L Y167V + R170L Y167A + R170M Y167C + R170M Y167F + R170M Y167G + R170M Y167H + R170M Y167I + R170M Y167L + R170M Y167M + R170M Y167N + R170M Y167P + R170M Y167Q + R170M Y167S + R170M Y167T + R170M Y167V + R170M Y167A + R170N Y167C + R170N Y167F + R170N Y167G + R170N Y167H + R170N Y167I + R170N Y167L + R170N Y167M + R170N Y167N + R170N Y167P + R170N Y167Q + R170N Y167S + R170N Y167T + R170N Y167V + R170N Y167A + R170P Y167C + R170P Y167F + R170P Y167G + R170P Y167H + R170P Y167I + R170P Y167L + R170P Y167M + R170P Y167N + R170P Y167P + R170P Y167Q + R170P Y167S + R170P Y167T + R170P Y167V + R170P Y167A + R170Q Y167C + R170Q Y167F + R170Q Y167G + R170Q Y167H + R170Q Y167I + R170Q Y167L + R170Q Y167M + R170Q Y167N + R170Q Y167P + R170Q Y167Q + R170Q Y167S + R170Q Y167T + R170Q Y167V + R170Q Y167A + R170S Y167C + R170S Y167F + R170S Y167G + R170S Y167H + R170S Y167I + R170S Y167L + R170S Y167M + R170S Y167N + R170S Y167P + R170S Y167Q + R170S Y167S + R170S Y167T + R170S Y167V + R170S Y167A + R170T Y167C + R170T Y167F + R170T Y167G + R170T Y167H + R170T Y167I + R170T Y167L + R170T Y167M + R170T Y167N + R170T Y167P + R170T Y167Q + R170T Y167S + R170T Y167T + R170T Y167V + R170T Y167A + R170V Y167C + R170V Y167F + R170V Y167G + R170V Y167H + R170V Y167I + R170V Y167L + R170V Y167M + R170V Y167N + R170V Y167P + R170V Y167Q + R170V Y167S + R170V Y167T + R170V Y167V + R170V Y167A + R170Y Y167C + R170Y Y167F + R170Y Y167G + R170Y Y167H + R170Y Y167I + R170Y Y167L + R170Y Y167M + R170Y Y167N + R170Y Y167P + R170Y Y167Q + R170Y Y167S + R170Y Y167T + R170Y Y167V + R170Y