MXPA99003283A - Metodos y composiciones para la inmunomodulacion - Google Patents

Abstract

La presente invención describe el resultado inesperado de que dos anticuerpos monoclonales anti-4-1BB pueden inhibir las respuestas humorales primaria y secundaria para antígenos al menos dependientes de células T in vivo. Tales anticuerpos proporcionan un nuevo procedimiento para la inmunosupresión y terapia contra el cáncer in vivo.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA INMUNOMODULACION ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El 4-1BB es un receptor de células T inducible que pertenece a la superfamilia de receptores del factor de crecimiento nervioso. Este novedoso antígeno es expresado sobre la superficie de las células T esplénicas activadas y los timocitos. El dominio extracelular de esta proteína transme branal de tipo I es homólogo a los miembros de la superfamilia de receptores del factor de crecimiento nervioso. El dominio citoplásmico contiene una secuencia homologa al sitio de enlace para la tirosina-cinasa p56'r'' específica de células T. El papel i n vi vo de 4-1BB permanece no claro, aunque la evidencia creciente indica el involucramiento como una molécula de señalización en la activación de células T. Por ejemplo, la reticulación de 4-1BB con el anticuerpo monoclonal 53A2 sobre las células T estimuladas con anti-CD3 da como resultado un mejoramiento de 2 a 10 veces la proliferación de células T (Pollok y colaboradores, J. Immunol. 151: 1255 (1993)) . Además, Zhou y REF.: 29810 colaboradores (Im unol. Letters 41: 177-184 (1994)) han demostrado que 4-1BB es expresado sobre los linfocitos T intra-epiteliales intestinales, activados, y que los IELS activados disparados con el anticuerpo monoclonal anti-4-lBB podrían aumentar el nivel de ci totoxicidad de IEL contra las células hibridomas que secretan anti-CD4. La reticulación del anticuerpo anti-41BB también aumentó la proliferación de IELS. Han sido identificados al menos dos ligandos candidatos de 4-1BB. Chalupny y colaboradores ( Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10360-10364 (1992)) utilizaron una proteína de fusión de inmunoglobulina 4-1BB soluble (4-1BB Rg) para demostrar que 4-1BB se enlaza a la proteína de matriz extracelular (EMC) .

Goodwin y colaboradores (Eur. J. Immunol. 23: 2631 (1993)) reportado en el aislamiento de un ADNc para un ligando para 4-1BB murino (4-1-BB-L) que es un miembro de una familia emergente de ligandos con homología de aminoácidos C-terminal que incluye TNF, linfotoxina (LT)-alfa y beta, CD40-L, Cd27-L, CD30-L, y Fas-L, El análogo humano (hu4-lBB) del 4-1BB murino y un análogo humano (hu4-l-BB-L) del 4-1BBL murino han sido clonados (Alderson y colaboradores, Eur . J .

Immunol . 24: 2219-2227 (1994)) . El anticuerpo monoclonal para hu4-lBB y las células trans fectadas con hu4-l-BB-L indujeron una fuerte respuesta proliferativa en células T primarias coestimuladas con mitógeno. De este modo, existe una necesidad para el desarrollo de antagonistas de 4-1BB. La presente invención está dirigida a esta necesidad y más.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención es un método para suprimir una respuesta humoral primaria y secundaria para un antígeno en un huésped, que comprende el administrar al huésped una dosis efectiva de un anticuerpo anti-4-lBB. Los aspectos adicionales de la invención son composiciones que comprenden anticuerpos monoclonales 1D8, 3B8 o 3E1. Un aspecto adicional de la invención es una composición que comprende un anticuerpo anti-4-lBB, en donde el anticuerpo inhibe una respuesta de anticuerpo para células sanguíneas rojas de oveja i n vi vo .

Otro aspecto más de la invención es un método para bloquear las respuestas inmunes dependientes de células T en un huésped, que comprende el administrar al huésped una dosis efectiva de un anticuerpo anti-4-lBB. Otro aspecto de la invención es un método para aumentar la muerte linfocítica de células tumorales en un huésped, que comprende el administrar a dicho huésped una dosis efectiva de un anticuerpo anti-4-lBB. Otro aspecto más de la invención es un método para potenciar el desarrollo de células T citotóxicas en un huésped, que comprende el administrar al huésped una dosis efectiva de un anticuerpo anti-4-lBB. Otro aspecto más de la invención es un método para tratar a un huésped que tiene una enfermedad autoinmune por células T, que comprende el administrar al huésped una dosis efectiva de un anticuerpo anti-4-lBB.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que describe el enlace del ligando 4-1BB murino a 4-1BB inmobilizado .

La Figura 2 es una gráfica que describe el bloqueo del enlace de 4-1BB a su ligando por los anticuerpos monoclonales anti-4-lBB (mAb) .

La Figura 3 es una gráfica que describe la expresión de 4-1BB en células T activadas como una función del tiempo después de la estimulación. Los círculos representan los niveles de ARNm de 4-1BB. Los cuadros representan los niveles del receptor de 4-1BB sobre la superficie de la línea de células T activadas DO.11.10.

La Figura 4 es una gráfica que describe la coestimulación de la activación de células T por dosis subóptimas del anticuerpo monoclonal anti-CD3, 145.2C11 y los anticuerpos monoclonales anti-4-lBB.

La Figura 5 es una gráfica que describe la farmacocinética del anticuerpo monoclonal anti-4-lBB 1D8. Cada símbolo representa un ratón diferente.

La Figura 6 es una gráfica que describe la inhibición de la respuesta de las células sanguíneas rojas anti-oveja, primaria y secundaria, por los anticuerpos anti-4-lBB.

La Figura 7 es una gráfica que describe la inhibición de la generación de células T citotóxicas por los anticuerpos anti-4-lBB.

La Figura 8 es una gráfica que describe la regresión del tumor P815 después del tratamiento con mAb para 4-1BB.

La Figura 9 es una gráfica que describe la sobrevivencia a largo plazo de ratones que tienen ascitis P815, después del tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-4-lBB.

La Figura 10 es una gráfica que describe el efecto de la disminución de CD4 y CD8 en el rechazo inducido por 1D8 de células tumorales P815.

La Figura 11 es una .gráfica que describe el tratamiento de ratones que reciben células de sarcoma AG104 intravenosamente inyectadas.

La Figura 12 (A-C) describe (A) la inhibición de la generación i n vi vo de las respuestas de CTC durante GvHD; (B) la aceleración de la muerte mediada por CTC, de esplenocitos BDF: por los anticuerpos monoclonales anti-4-lBB; y (C) el incremento en el porcentaje de células T CD8" en ratones que sufren GvHD.

La Figura 13 es una gráfica que describe la muerte de las células T murinas activadas por la inmunotoxina anti-4- 1BB-PE 0.

La Figura 14 es una gráfica que describe la habilidad de los anticuerpos anti-4-lBB para bloquear el desarrollo de la encefalomiel i ti s autoinmune experimental .

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ESPECIFICAS Las terapias inmunosupresoras son comúnmente Utilizadas en el control de la inflamación, el tratamiento del cáncer, y el transplante de órganos. Las terapias tradicionales, tales como el uso de hormonas adrenocorticales y su inductor, la hormona adrenocorticotrópica, agentes quimioterapéuticos , y la terapia por radiación pueden dar como resultado la inmunosupresión no específica e inmunodeficiencias . De este modo, existe una necesidad sustancial para rutas alternativas para inducir la inmunosupresión.

Los anticuerpos de la presente invención proporcionan una oportunidad para dirigirse preferentemente a los polipéptidos particulares, por ejemplo, 4-1BB, expresados sobre las células T. El término "4-1BB" como se utiliza en la presente se pretende que se refiera a la proteina 4-1BB de la superficie celular urina y a los homólogos de esta proteina, presentes en estas especies, incluyendo humanos. Aunque se espera alguna homología secuencial de aminoácidos entre los homólogos en diferentea especies, el grado de homología puede ser tan bajo como de aproximadamente 50%. De este modo, los homólogos de 4-1BB son definidos como poseedores de proteínas transmembranales expresadas sobre las células T activadas, que tienen al menos 50% de homología de secuencia de aminoácidos a la 4-1BB murina. Además, los alelos de 4-1BB y homólogos, 4-1BB y homólogos con sustituciones de aminoácidos conservadoras, y formas solubles de 4-1BB y homólogos, son incluidas en esta definición de 4-1BB. El término "respuesta humoral" como se utiliza en la presente se pretende que se refiera a una reacción inmune que puede ser transferida con el suero, que resulta típicamente de la presencia del anticuerpo específico. Los términos respuestas inmunes "primaria" y "secundaria" se refieren a la primera exposición del huésped al antígeno, y a las exposiciones subsecuentes al antigeno, respectivamente. Típicamente, en la respuesta inmune humoral, la clase mayor de anticuerpo durante la respuesta primaria temprana (por ejemplo, la primera semana) es IgM, mientras que IgG es la clase mayor de anticuerpo en la respuesta secundaria. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden ser de cualquier clase, pero preferentemente son IgG o IgM. Para la administración a humanos, por ejemplo, como un componente de una composición para el tratamiento i n vi vo , los anticuerpos monoclonales de la invención son preferentemente sustancialmente humanos, para minimizar la in unogenicidad, y están sustancialmente en la forma pura. Por "sustancialmente humano" se entiende que la porción de inmunoglobulina de la composición contiene en general al menos aproximadamente 70% de la secuencia del anticuerpo humano, preferentemente al menos aproximadamente 80% humana, y más preferentemente al menos aproximadamente 90 a 95% o más de una secuencia de anticuerpo humano. Cuando se hace referencia a "anticuerpo", se entenderá que pueden estar opcionalmente presentes secuencias no inmunoglobulina en la molécula, siempre y cuando la molécula conserve la habilidad para enlazarse a 4-1BB. Puede ser deseable el transferir las regiones de enlace al antigeno (por ejemplo las regiones F(ab')_-, las regiones variable o hipervariable (de determinación de complementariedad) ) , de los anticuerpos monoclonales no humanos, tales como provenientes de un anticuerpo monoclonal murino que ha sido elaborado para el homólogo de 4-1BB humano, a las regiones constantes humanas (Fe) o a las regiones estructurales utilizando técnicas de ADN recombinante, con lo cual se producen moléculas sustancialmente humanas. Tales métodos son en general conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 4,816,397, las publicaciones Europeas 173,494 y 239,400, las cuales son incorporadas por referencia en la presente. Alternativamente, ,se pueden aislar secuencias de ADN que codifican para un anticuerpo monoclonal humano o una porción del mismo, que se enlaza específicamente a 4-1BB, mediante la selección de una genoteca de ADN proveniente de células B humanas, de acuerdo al protocolo general descrito por Huse y colaboradores, Science 246: 1275-1281 (1989), y descrito en la Patente Internacional O90/14430, incorporadas por referencia en la presente, y luego clonando y amplificando las secuencias que codifican para el anticuerpo (o el fragmento de enlace) de la especificidad deseada. En otras modalidades más, los polipéptidos de enlace de cadena simple pueden ser elaborados, los cuales se enlazan a 4-1BB. Estos polipéptidos de cadena simple pueden ser producidos mediante la clonación y la unión de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo monoclonal, el cual se enlaza a 4-1BB. Los métodos para la producción de los polipéptidos de enlace de cadena simple se describen con detalle por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 4,946,778, la cual se incorpora por referencia en la presente. Como se utiliza en la presente, los términos "tratamiento" o "tratar" incluyen: 1) prevenir que ocurran los síntomas o estados patológicos indeseables en un sujeto quien puede estar predispuesto a estos síntomas o estados patológicos indeseables, pero quien no ha sido todavía diagnosticado como poseedor de ellos; 2) el inhibir los síntomas indeseables o estados- patológicos indeseables, por ejemplo, para detener su desarrollo; o 3) el disminuir o aliviar los síntomas o estados patológicos indeseables, por ejemplo, provocando la regresión de los síntomas o estados patológicos indeseables. Una cantidad de las composiciones de la invención que logra cualquiera de estas metas, es denominada una "cantidad efectiva", y se pretende que incluya los usos profilácticos y terapéuticos de las compos iciones . Los anticuerpos de la invención son útiles en la prevención o en el tratamiento de enfermedades o estados patológicos, que se beneficien de las terapias inmunosupresoras , incluyendo pero no limitadas a la enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune, artritis reumatoide, enfermedad injerto versus huésped, lupus eritematoso sistémico, otras enfermedades autoin unes de células T y el cáncer. Los anticuerpos monoclonales u otros compuestos útiles en la presente invención pueden ser incorporados como componentes de las composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéutica o profiláctica de al menos uno de los anticuerpos monoclonales o fragmentos de enlace de los mismos con un portador farmacéuticamente aceptable.

En la preparación de las composiciones farmacéuticas útiles en los presentes métodos, un portador farmacéutico debe ser empleado, el cual sea cualquier sustrato no tóxico, compatible, adecuado para distribuir al paciente los anticuerpos o los fragmentos de enlace de los mismos o los compuestos terapéuticos identificados de acuerdo con los métodos descritos en la presente. El agua estéril, alcohol, grasas, ceras, sólidos inertes e incluso liposomas pueden ser utilizados como el portador. Los adyuvantes farmacéuticamente aceptables (agentes amortiguadores, agentes dispersantes) pueden también ser incorporados dentro de la composición farmacéutica. Los anticuerpos y composiciones farmacéuticas de los mismos son particularmente útiles para la administración parenteral, por ejemplo, intravenosamente, intraarterialmente , intramuscularmente o subcutáneamente. No obstante, son también útiles las formulaciones intranasales u otras formulaciones en aerosol. La concentración del compuesto tal como un anticuerpo en una formulación para la administración, puede variar ampliamente, por ejemplo, de menos de aproximadamente 0.5%, usualmente al menos 1% hasta tanto como 15 ó 20% o más en peso, y se seleccionarán principalmente con base en los volúmenes de fluido, en las viscosidades, etc., preferidos para el modo particular de administración seleccionada. Los métodos efectivos para la preparación de las composiciones adminis trables serán conocidos o aparentes para aquellos expertos en la técnica, y se describen con más detalle por ejemplo en Remington' s Pharmaceutical Science, 17a Edición, Mack Publishing Co . , Easton, PA (1985), la cual se incorpora por referencia en la presente. Los compuestos de la invención, útiles en la inhibición de la respuesta inmune a un antígeno o antígenos, pueden ser administrados para el tratamiento profiláctico o terapéutico. En los tratamientos pretendidos para aplicaciones profilácticas, las composiciones se administran a un paciente que probablemente va a estar expuesto a un antígeno o antígenos particulares, tales como en pacientes que reciben transplantes de tejidos (incluyendo transfusiones de sangre o de suero) o compuestos inmunogénicos tales como antibióticos. La administración de los compuestos de la invención puede ser realizada antes de la exposición del antígeno o antígenos, o al mismo tiempo. Para prevenir la enfermedad recurrente y las secuelas de la misma, las composiciones pueden ser administradas diariamente, semanalmente u otra terapia de mantenimiento programada. El régimen dependerá también de la dosis y de la efectividad del mismo, del uso pretendido y del estado general de salud del paciente. El médico que atiende, el dentista u otro profesional del cuidado de la salud, seleccionará los niveles de dosis y el patrón de administración, por ejemplo, la ruta y las administ aciones simples o múltiples . En aplicaciones terapéuticas, los compuestos de la invención se administran a un paciente que ya sufre de los síntomas indeseables o de la patología, en una cantidad suficiente para suprimir al menos parcialmente la respuesta inmune para el o los antígenos. Una cantidad adecuada para lograr esto es definida como una "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependerán del compuesto que se emplee, de la ruta de administración, de la severidad de los síntomas indeseables o de los estados patológicos indeseables, y del estado general de salud del paciente. La determinación de una cantidad efectiva de un compuesto de la invención para suprimir la respuesta inmune a un antígeno, puede ser determinada por técnicas bien conocidas en la materia. Por ejemplo, una disminución en la inmunoglobulina específica de antígeno, y de este modo la eficacia de las composiciones objetivo de la invención, puede ser verificada periódicamente con una variedad de procedimientos de diagnóstico i n vi t ro , bien conocidos . El antígeno (o antígenos) al cual está expuesto el paciente huésped, es preferentemente dependiente de células T. La mayoría de los antígenos son dependientes de las células T, por ejemplo, que requieren células T con el fin de provocar una respuesta inmunológica . Los antigenos independientes son típicamente moléculas poliméricas grandes con determinantes antigénicos repetidos, múltiples. Frecuentemente, los antígenos independientes de las células T tienen propiedades mitogénicas . En modalidades adicionales de la presente invención, los anticuerpos anti-4-lBB de la invención pueden ser utilizados en cromatografía de afinidad para purificar los polipéptidos 4-1B, tales como la región extracelular de 4-1BB, las formas solubles de 4-1BB, y las fusiones de 4-1BB a otras moléculas tales como inmunoglobulinas . Los anticuerpos anti-4-1BB de la invención pueden también ser marcados con una molécula reportera tal como fluoresceína , fosfatasa alcalina, y similares, y utilizados para visualizar la presencia de 4-1BB sobre las superficies celulares. Los anticuerpos radiomarcados pueden ser utilizados para cuantificar la cantidad de 4-1BB sobre las células. En otras modalidades, los anticuerpos anti-4-lBB de la presente invención pueden ser utilizados en ensayos comparativos con ligandos de 4-1BB. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración, pero no de limitación.

EJEMPLOS I . Protocolos de inmunización y de selección Para la inmunización y selección, se construyó una proteína de fusión que consiste de la porción extracelular de la molécula 4-1BB murina y la región constante de la inmunoglobulina humana (Ig) (Patente Europea EP-0, 595, 659, incorporada en su totalidad por referencia en la presente) . La proteína de fusión 4-lBBIg contenía un sitio para la escisión o rompimiento por la proteasa trombina entre las porciones 4-1BB e Ig de la molécula. Para la inmunización la proteína de fusión fue escindida con trombina, luego se hizo pasar sobre una columna de proteína A para eliminar la proteína no digerida y los fragmentos de Ig. El material no enlazado resultante de este procedimiento, el cual contenía diversas bandas mediante análisis de SDS-PAGE, se utilizó para la inmunización. El uso de células esplénicas inmunes y la línea celular de mieloma AG8 de ratón (Kearney y colaboradores, J. Immunol. 123: 1548-1550 (1974)) como socio de fusión, fueron generados y seleccionados hibridomas de rata-ratón utilizando técnicas estándares. Los anticuerpos fueron obtenidos de dos fusiones separadas. Los Abs 3B8 y 1D8 fueron producidos a partir de una fusión después de dos inyecciones en la planta del pie de 20 µg de proteína en adyuvante RIBI (RIBI Immunochemical ) a ratas Sprague-Da ley los días 0 y 3; en el día 10 las ratas recibieron una tercera inyección en la planta de la pata de 20 µg de proteína en PBS, y en el día 13 fue retirado el drenado del nodulo linfático poplíteo y se realizó una fusión. Los mAbs remanentes fueron producidos en una segunda fusión de las células esplénicas después de 4 inyecciones intraperitoneales de 20 µg de proteína en RIBI en un periodo de 5 meses. Se realizó una inyección intravenosa de 30 µg en los días 17 y 3 antes de la fusión .

II . Caracterización de los Anticuerpos Anti-4-lBB Los anticuerpos fueron primeramente identificados mediante enlace específico a la fusión 4-lBBIg en un ensayo de ELISA estándar. La especificidad de los anticuerpos fue establecida mediante criterios adicionales: 1) el enlace a las células COS que expresan la molécula 4-1BB de longitud completa, pero no las células COS control transíectadas simuladamente; 2) el enlace a la línea hibridoma de células T DO-11-10 que fue activada para expresar 4-1BB (activación por 12 horas con 10 ng/ml de PMA, y Iono icina, 0.5 µg/ml) . El isotipo del anticuerpo 3B8 es IgM de rata, mientras que los otros anticuerpos son todos del isotipo IgG2a como se determina mediante el uso de los reactivos de peroxidasa específicos del isotipo (Zymed) en un ensayo de ELISA con la proteína 4-lBBIg.

III. Purificación de Anticuerpos El anticuerpo monoclonal 3B8 (IgM) fue purificado por afinidad sobre una columna de cadena anti-kappa ( AB RG7 (ATCC T1B 172)). El mAb fue eluído con el Amortiguador de Elución de Ig (Pierce) y luego se dializó contra solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . El material purificado con RG7 sí contenía algunas cadenas ligeras libres que se copuri ficaron con el anticuerpo intacto. Todos los otros anticuerpos fueron -purificados sobre proteina G (Ga mabind Plus, Pharmacia). El Amortiguador de Elución Ig inmunopuro fue utilizado para eluir el anticuerpo. El anticuerpo eluido fue dializado contra PBS antes de utilizarse.

IV. Inhibición del enlace del ligando 4-1BB a la proteína 4-1BB por anticuerpos monoclonales (mAbs ) La proteína de fusión soluble que consiste de la porción extracelular del ligando 4-1BB en el extremo carboxílo, y la porción extracelular del CD8 murino en el extremo amino, se utilizó como un subrogado para estudiar la inhibición del ligando que se enlaza a la molécula de 4-1BB. El ADN que codifica para el dominio extracelular del ligando 4-1BB murino (residuos 104-309) se generó mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando un cebador con dirección hacia arriba (5') que contiene un sitio BamHI ( 5' -GCGGCGGATCCCCGCACCGAGCCTCGGCCAGCG-3') y un cebador con dirección hacia abajo (3') que contiene el sitio Xbal (5'-CGCTCTAGAGGATAGTTCTCATTCCCATGG-3' ) . El fragmento de ADN del ligando 4-1BB murino se clonó dentro de la estructura en el vector CDM7(B-) que contiene el dominio extracelular de CD8, seguido por un sitio Ba HI. Esta molécula será denominada en la presente como el ligando 4-1BB (4-1-BBL). La habilidad de los mAbs anti-4-lBB para bloquear el enlace del ligando a la molécula de 4-1BB se evaluó en un ensayo de ELISA y en los sistemas de ensayo basados en células. El 4-1-BB-L fue purificado sobre una columna de afinidad anti-CD8 utilizando el anticuerpo monoclonal 53.6 (ATCC TIB 105) mediante elución con 40% de propilenglicol/ 60% de Tris 50 mM (pH 7.0)/sulfato de amonio 1.25 M, y se dializó contra solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . El material purificado migró como una banda ancha predominante de peso molecular estimado de 55,000 en SDS-PAGE reductor. Cuando se evaluó mediante filtración en gel de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) éste eluyó como 3 picos. El pico predominante tuvo un peso molecular estimado de 300,000. El ensayo de ELISA para la inhibición del enlace de 4-1BBL se realizó como se describe más adelante. La proteína 4-lBBIg se recubrió sobre pozos de ELISA a 0.1 µg/ml en PBS toda la noche a 4°C, se bloqueó con diluyente espécimen (Genetic Systems), y se incubó con anticuerpo purificado por 1 hora. El ligando se agregó. El ligando se agregó luego y la mezcla de mAbs y ligando se incubó por 1 hora adicional. Las placas se lavaron y se incubaron con el mAb 53.6 biotinilado (anti-CD8), seguido por el conjugado de es treptavidina-peroxidasa de rábano (HRPO) . La inhibición del enlace fue indicada por una caída en la señal de ELISA. Una titulación del enlace del ligando a 4-lBBIg se muestra en la Figura 1. El control de la proteína de fusión gp39-CD8 murina no se enlazó a 4-1BB, mientras que el ligando de 4-1BB se enlazó específicamente a 4-1BB de una manera dependiente de la dosis. La habilidad de los mAbs para bloquear el enlace del ligando al 4-lBBIg en un ELISA similarmente conformado, se muestra en la Figura 2.

V. Activación de Células DO-11-10 para Expresar la Proteína 4-1BB El hibridoma de células T DO-11-10 se activó para expresar la molécula de 4-1BB mediante tratamiento con PMA (10 ng/ml) y ionomicina (0.5 µg/ml) para cantidades variantes de tiempo, después de lo cual el ARNm de 4-1BB o la expresión de la superficie celular del 4-1BB se midió mediante análisis de Northern o análisis FACS, respectivamente (Figura 3) . Las células no tratadas fallaron para enlazarse a la proteína 4-1BBL. Las células activadas se enlazaron a la proteína 4-1BBL pero no a una construcción de proteína de fusión similar de gp39 y Lyta2a (Hollenbaugh y colaboradores, EMBO J. 11 (12): 4313-4321 (1992)). Los anticuerpos anti-4-1BB, 1D8 y 3B8 se enlazaron a las células DO-11-10 únicamente cuando la línea celular fue activada. La preincubación de esos anticuerpos monoclonales con las células DO-11-10 pudo bloquear el enlace subsecuente de 4-1BBL. El enlace de 4-1BBL a las células se determinó utilizando el anticuerpo monoclonal anti-CD8 (53.6) conjugado a antisuero (Biosource) .

En experimentos posteriores, se investigó la habilidad de los anticuerpos anti-4-lBB para coestimular la activación de células T. La estimulación de las células T en reposo con dosis subóptimas del mAb anti-CD3 145.2C11 y 10 µg/ml de los mAbs anti-4-lBB, aumentó la proliferación en 2.5 a 8 veces sobre 145.2C11 solo (Figura 4). Existió poca correlación entre la afinidad de enlace o la habilidad para bloquear el enlace al ligando y la habilidad de los mAbs para coestimular las células T.

VI . Inhibición del Desarrollo de la Respuesta del Anticuerpo Anti-SRBC por los Anticuerpos Monoclonales Anti-4-lBB, 1D8 y 3D8 Se evaluó la farmacocinética de los anticuerpos monoclonales anti-4-lBB, 1D8, después de la inyección intravenosa de 250 mg/ratón. Las muestras de suero fueron recolectadas comenzando en el día 8 y terminando en el día 42, y se analizaron para el mAb anti-4-lBB. Los resultados mostrados en la Figura 5, demostraron que la vida media del 1D8 fue de 7 días. Estos resultados también demostraron que un anticuerpo anti-IgG de rata (anti-lD8) no fue generado en estos animales. La vida media de 3B8, un anticuerpo IgM, fue de 6.5 horas (datos no mostrados ) . Se inyectaron grupos de cinco ratones intravenosamente con las células sanguíneas rojas de oveja con antígeno dependiente de células T (SRBC) y 250 mg de 1D8 o de 3B8. Las inyecciones posteriores del anticuerpo fueron administradas cada segundo día hasta el día 6. Se tomaron muestras de suero de cada ratón periódicamente hasta la semana 7 y se evaluaron para el título de anti-SRBC. En la semana 7 los ratones recibieron un reto secundario de SRBC pero no administración adicional del anticuerpo monoclonal anti-4-lBB. Las muestras de suero fueron recolectadas en un periodo de dos semanas y se midieron para los anticuerpos anti-SRBC. El 1D8 y el 3B8 bloquearon el reto primario y secundario a SRBC (Figura 6). Estos experimentos, particularmente los resultados con 3B8, indican que este tratamiento conduce a la no respuesta a largo plazo.

VII. Inhibición de la Generación de Células Citotóxicas Con el fin de determinar si la expresión de 4-1BB es importante para otras funciones efectoras de células T, se midieron las habilidades del mAb 1D8 y de varios mAbs derivados de la segunda fusión, para efectuar la generación de CTL durante la enfermedad aguda de injerto versus huésped (GvHD) . Se aislaron células T esplénicas de ratones BDF-. (H-2JC) 10 días después de la inyección intravenosa de 10 células T esplénicas C57BL/6 (H-21 ) . Después de 5 dias de expansión en cultivo de tejidos con IL-2 recombinante de ratón (R&D Systems) a 2-10 ng/ml, las células T viables fueron evaluadas para la ci totoxicidad ya sea contra los objetivos marcados con :'Cr, la" (P815) o Iac (EL4) . Los resultados en la Figura 7 muestran que las células T esplénicas tratadas con un anticuerpo monoclonal control o PBS, matan efectivamente los objetivos que poseen el haplotipo MHC de la clase II apropiado (Ia ) a proporciones tan bajas como de 3:1. En contraste, las células T esplénicas provenientes de ratones inyectados con 1D8 no fueron capaces de matar hasta que la proporción E:T alcanzó 50:1, e incluso allí la muerte fue reducida por un 75%. Se obtuvieron resultados similares con el mAb 22B6. Mientras que el mAb 3E1 fue completamente inhibitorio, el mAb 21E5 fue menos efectivo al inhibir la generación/sobrevivencia de CTL. No se observó muerte sobre los objetivos EL-4(Iac) (datos no mostrados) . Estas observaciones no pudieron ser explicadas por la presencia del anticuerpo monoclonal anti-4-lBB en los cultivos, ya que la adición de tales anticuerpos a los ensayos de CTL no bloqueó la muerte de CTL. El examen microscópico de las células T cultivadas antes de agregarlas a los objetivos reveló una falta completa de células activadas, muchas células viables restantes muy pequeñas y un número sustancial de células apoptósicas o muertas que estuvieron ausentes de los cultivos control.

VIII . Aumento de la Generación de CTL Durante GvHD In Vi vo De los estudios anteriormente descritos, los ratones GvHD tratados con anticuerpos monoclonales anti-4-lBB no pudieron demostrar la actividad de CTL contra un objetivo apropiado, después de 5 días del cultivo i n vi tro con IL-2 o sin IL-2 (datos no mostrados) mientras que los ratones control desarrollaron respuestas CTL prominentes en presencia de IL-2. Esta observación fue sorprendente ya que la muerte de CTL inducida por 1D8, muy notoria, de las células tumorales, fue consistentemente descubierta en modelos tumorales i n vi vo separados de la enfermedad metastática y no metastática (Figuras 8, 9, 10 y 11) . Además, los bazos extirpados de ratones con GvHD tratados con anticuerpo anti-4-lBB estuvieron agrandados 2 a 3 veces el tamaño normal de los bazos, como lo estuvieron los ratones control Ab . Para enfrentar esta observación paradójica, los experimentos con GvHD fueron repetidos como se describe anteriormente, pero esta vez la actividad de CTL se evaluó inmediatamente después de la extirpación quirúrgica del bazo, eliminando la expansión de IL-2 i n vi t ro de CTL. Los resultados de este experimento son notoriamente diferentes de los resultados reportados anteriormente. En la Figura 12A, se puede observar que dos anticuerpos monoclonales anti-4-lBB, 1D8 y 22B6, cada uno que se sabe se enlaza a una región diferente de la molécula 4-1BB, mejoró la actividad de CTL casi en cuatro veces sobre aquella observada en los animales con GvHD control. En contraste, el mAb 21E5 no tuvo efecto aparente sobre la generación de CTL, mientras que el mAb 3E1, uno de los bloqueadores más potentes del enlace al ligando, inhibió completamente el desarrollo de CTL. El poderoso efecto de los anticuerpos monoclonales 1D8 y 22B6 sobre el desarrollo mejorado de la actividad de CTL es además demostrado en la Figura 12B, la cual muestra la reducción marcada en el número de esplenocitos viables totales recuperados de ratones tratados con estos dos anticuerpos. Además, el análisis fenotípico de los esplenocitos reveló que el porcentaje de células T CD8" se incrementó hasta 30% del número total de células en ratones tratados con el anticuerpo monoclonal 1D8 (Figura 12C) mientras que los ratones GvHD inyectados con 6E9, el control de no enlace igualado al isotipo, o aquellos que no recibieron anticuerpo, tuvieron 5% a 8% de células T CD8 . Los estudios de trazado del mapa de los epítopes de los mAbs anti-4-lBB utilizando las proteínas de fusión 4-1BB en las cuales fue llevado a cabo el trueque o intercambio de dominio, demostró que el mAb 1D8 era único ya que se enlazaba a la región proximal de la membrana del dominio extracelular de la molécula 4-1BB no involucrada en el enlace de 4-1BBL (datos no mostrados) .

IX . Potenciamiento del Desarrollo de las Células T Citotóxicas En estos experimentos los anticuerpos monoclonales anti-4-lBB fueron utilizados para potenciar el desarrollo de las células T citotóxicas, las cuales matan luego a los tumores débilmente y no inmunogénicos que son altamente metastát icos . La Figura 8 describe los resultados de un experimento en el cual grupos de 5 ratones Balb/C fueron inyectados subcutáneamente con 10: células de mastocitoma P815 en el día 0. Los ratones control recibieron el anticuerpo monoclonal anti-CD5 humano, 10.2. Sin embargo, los ratones inyectados ya sea con los anticuerpos monoclonales 1D8 o 3E1 (anti-4-lBB) rechazaron rápidamente sus tumores. Las inyecciones del anticuerpo fueron administradas en los días 3 y 6, 400 mg/ratón, intraperi tonealmente . La Figura 9 describe la supervivencia a largo plazo de los ratones a los que se les administró el tumor P815 y se les trató con el anticuerpo monoclonal 1D8. Los datos descritos en la Figura 10 demuestran que la disminución de las células T positivas a CD4 o CD8 provenientes de ratones a los que se les administró el tumor P815 y el anticuerpo monoclonal 1D8, son incapaces de rechazar el tumor. Sin estar restringido por ninguna teoría, estos resultados sugieren que las células CD4 y CD8 son requeridas para la efectividad del anticuerpo monoclonal 1D8. Los datos descritos en la Figura 11 demuestran que el sarcoma AG104 no inmunogénico puede ser muerto por CTL inducido a través de la estimulación del anticuerpo monoclonal 1D9. En este experimento, se inyectaron grupos de 10 ratones Balb/C subcutáneamente con 10" células tumorales AG104. Los anticuerpos monoclonales fueron inyectados subcutáneamente los días 3 y 6 como se describe anteriormente. En el día 60 70% de los ratones sobrevivieron. Este resultado es notable ya que este modelo tumoral es demasiado agresivo.

X. Muerte de Células T Murinas Activadas En este experimento se generó una inmunotoxina anti-4- 1BB-PE40 mediante la clonación de las regiones variables del anticuerpo monoclonal 1D8 a partir del cual se construyó una cadena simple F... Esta SFV fue luego utilizada para generar una inmunotoxina SF. - PE40 (Siegall y colaboradores, Drug Dev. Res., 34: 210-219 (1995)) . Se mostró mediante análisis FACS que esta inmunotoxina se enlaza únicamente a las células 4-1BB* activadas. Los resultados en la Figura 13 demostraron que esta inmunotoxina mata específicamente las células T 4-1BBT activadas de una manera dependiente de la dosis, mientras que una inmunotoxina control no lo hace.

XI Bloqueo de Desarrollo de EAE El siguiente experimento utiliza un modelo murino de autoinmunidad de células T, por ejemplo, el desarrollo de encefalomieli t is autoinmune experimental (o alérgica) (EAE) (ver, por ejemplo, Alvord, G.C. Jr . , ed. Experimental Allergic Encephalomyeli t is : A Useful Model for Múltiple Sclerosis, Liss, NY (1984). Ratones hembra PL X SJL/Fi fueron inyectados intradérmicamente con 100 µl de proteína básica de mielina de cerebro de conejo a 1 mg/ml en adyuvante completo de Freund, en el día 0. Se inyectaron intravenosamente 200 µl de una solución a 1 µg/ml (PBS) de toxina pertusis.

Los ratones en grupos de ocho fueron inyectados intravenosamente en los dias 0, 2 y 4 con 200 µg de una solución de PBS a 1 mg/ml que contenía uno de los siguientes anticuerpos monoclonales (todos de origen de rata y que son del isotipo IgG ) : a) mAb 6E9 control (un mAb de rata anti-gp39 humano); b) el mAb 3E1 anti-4-lBB; c) el mAb 3H3 anti-4-lBB. Los ratones fueron analizados para el inicio de EAE al notar la parálisis de la cola seguida por la parálisis de las patas traseras (punto en el cual los animales fueron sacrificadas por razones humanitarias ) , La habilidad de los anticuerpos anti-4-lBB para bloquear el desarrollo de EAE es demostrada por los datos descritos en la Figura 14. Aunque la invención anterior ha sido descrito en cierto detalle a manera de ilustración y los ejemplos para fines de claridad de entendimiento, será obvio que pueden ser practicados ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las rei indicaciones anexas. Todas las referencias citadas en la presente son incorporadas por referencia en su totalidad para todos los fines .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes :

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un método para suprimir una respuesta humoral primaria y secundaria para un antígeno en un huésped, caracterizado el método porque comprende el administrar al huésped una dosis efectiva de un anticuerpo anti-4-lBB.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la dosis es administrada antes de la exposición al antígeno.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la dosis es administrada al mismo tiempo que la exposición al antígeno .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la dosis es administrada después de la exposición al antígeno.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el huésped es un humano .

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno es dependiente de células T.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es monoclonal .

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el 4-1BB es un homólogo de 4-1BB proveniente del huésped.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es sustancialmente humano.

10. Un método para bloquear las respuestas inmunes dependientes de células T, en un huésped, caracterizado porque comprende el administrar al huésped una dosis efectiva de un anticuerpo anti-4-1BB.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, .caracterizado porque el huésped es humano.

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo es monoclonal .

13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo es sustancialmente humano.

14. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el 4-1BB es un homólogo de 4-1BB proveniente del huésped.

15. Una composición, caracterizada porque comprende el anticuerpo monoclonal 1D8.

16. Una composición, caracterizada porque comprende el anticuerpo monoclonal 3E1.

17. Una composición caracterizada porque comprende el anticuerpo monoclonal 3H3.

18. Una composición que comprende un anticuerpo anti-4-lBB, caracterizada porque el anticuerpo inhibe una respuesta de anticuerpo para células sanguíneas rojas de oveja i n vi vo .

19. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el anticuerpo inhibe el enlace del ligando a 4-1BB i n vi t ro .

20. Un método para aumentar la muerte linfocítica de células tumorales en un huésped, caracterizado el método porque comprende el administrar al huésped una dosis efectiva de un anticuerpo anti-4-lBB.

21. Un método para potenciar el desarrollo de células T citotóxicas en un huésped, caracterizado el método porque comprende el administrar al huésped una dosis efectiva de un anticuerpo anti-4-lBB.

22. Un método para el tratamiento de un huésped que tiene una enfermedad autoinmune por células T, caracterizado el método porque comprende el administrar al huésped una dosis efectiva de un anticuerpo anti-4-lBB.