MXPA99001757A - Combinaciones terapeuticas de antagonistas del receptor del acido retinoico (rar) y agonistas del receptor del retinoide x (rxr) y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para tratar un animal, preferentemente un humano, que sufre de, o estápredispuesto a, un desorden físico;por la administración de una cantidad efectiva de una composición que comprende al menos un antagonista de RAR, preferentemente un antagonista de RARalfa, y al menos un agonista de RXR. La combinación de un agonista de RXR, que no tiene efectos terapéuticos solo, con un antagonista de RAR permite el uso de dosis menores del antagonista de RAR que previamente se pensóque era eficaz;este planteamiento evita muchos de los efectos laterales fisiológicos indeseables del tratamiento con los antagonistas de RAR.

Description

COMBINACIONES TERAPÉUTICAS DE ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DEL ÁCIDO RETINOICO (RAR) Y AGONISTAS DEL * RECEPTOR DEL RETINOIDE X (RXR) Y USO DE LOS MISMOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La presente invención se refiere a los campos de la biología de los receptores del retinoide, y a los productos terapéuticos para enfermedades de mamíferos. En forma más específica, la presente invención proporciona composiciones y métodos para tratar un animal, preferentemente un humano, que sufre de, o está predispuesto a, un desorden físico; al administrar al animal una cantidad efectiva de una composición que comprende al menos un antagonista del receptor del ácido retinoide (RAR), en forma preferente un antagonista de RARa y al menos un antagonista del receptor del retinoide X (RXR) .

REF 29514 Técnica Relacionada Retinoides Un número de estudios ha demostrado que los retinoides (derivados de la Vitamina A) son esenciales para el crecimiento normal, visión, homeostasis del tejido, reproducción y supervivencia total (para revisiones y referencias, ver Sporn y colaboradores, The Retinoids, vols. 1 y 2 , Sporn y colaboradores, eds., Academic Press. Orlando, Florida (1984) . Por ejemplo, se ha mostrado que los retinoides son vitales para el mantenimiento de la homeostasis de la piel y la función de barrera en mamíferos (Fisher, G. J., y Voorhees, J.J., FASEB J. 10: 1002-1013 (1996)) . Los retinoides también son aparentemente cruciales durante la e br iogénes is , puesto que la descendencia de las madres con deficiencia de Vitamina A (VAD) exhibe un número de defectos de desarrollo (Wilson, J.G., y colaboradores, Am . J. Anat. 92:189-217 (1953), Morriss-Kay, G. M. y Sokolova, N., FASEB J. 10:961-968 (1996) ) . Con las excepciones de aquellas en la visión (Wald, G., y colaboradores, Science 162:230-239 (1968)) y la espermatogénesis en mamíferos (van Pelt, H.M.M., y De Rooij, D.G., Endocrinology 128:697-704 (1991)), la mayoría de los efectos generados por la VAD en animales y fetos se pueden prevenir y/o invertir por la administración de ácido retinoico (RA) (Wilson, J.G., y colaboradores Am. J. Anat. 92:189-217 (1953); Thompson y colaboradores, Proc. Royal Soc. 159:510-535 (1964); Morriss-Kay, G.M. y Sokolova, N., FASEB J. 10:961-968 (1996)) . Los efectos teratogénicos dramáticos de la administración de RA, maternal en embriones de mamífero (Shenefelt, R.E., Teratology 5, 103-108 (1972); Kessel, M., Development 115:487-501 (1992); Creech Kraft, J., In Retinoids in Normal Development and Teratogenesis, G.M. Morriss-Kay, ed., Oxford University Press, Oxford, UK, pp . 267-280 (1992)), y los efectos marcados de la administración tópica de retinoides en el desarrollo embriónico de vertebrados y la regeneración de los miembros, en anfibios (Mohant y-He j madi y colaboradores, Nature 355:352-353 (1992); Tabin, C.J., Cell 66:199-217 (1991) ) , han contribuido a la noción que el RA puede tener papeles críticos en la morfogénesis y organogénesis .

Receptores de Retinoide Excepto para aquellos comprendidos en la percepción visual (Wald, G. y colaboradores, Science 162:230-239 (1968)), los mecanismos moleculares que soportan los efectos altamente nerviosos de los retinoides han permanecido oscuros hasta recientemente. El descubrimiento de los receptores nucleares para RA (Petkovich y colaboradores, Nature 330:444-450 (1987); Giguére y colaboradores, Nature 330:624-629 (1987)) ha avanzado en gran medida el entendimiento de como los retinoides pueden ejercer sus efectos pie io trópicos (Leid y colaboradores, TIBS 17:427-433 (1992), Linney, E., Current Topics in Dev. Biol. 27:309-350 (1992)) . Puesto que este descub imiento ha llegado a ser aparente de las actividades genéticas de la señal de RA se medían a través de dos familias de receptores. En la familia RAR y la familia RXR, que corresponde a la superfamilia de receptores reguladores, transcripcionales, inducibles por ligando, que incluyen la hormona es eroide/ t iroide y los receptores de la vitamina D3 (para revisión ver Leid y colaboradores, TIBS 17:427-433 (1992); Chambón, P., Semin. Cell. Biol. 5:115-125 (1994); Chambón, P.

FASEB J. 10:940-954 (1996), Giguére, V. Endocrinol. Rev. 15:61-79 (1994); Mangelsdorf, D.J. y Evans, R.M., Cell 83:841-850 (1995); Gronemeyer, H., y Laudet. V., Protein Profile 2:1173-1236 (1995)) .

Receptores de RAR Los receptores que corresponden a la familia de RAR (RARa, ß, ?; y sus isoformas) se activan por todo-trans- y 9-cis-RA (Leid y colaboradores, TIBS 17:427-433 (1992); Chambón, P., Semin. Cell Biol. 5:115-125 (1994); Dollé, P. y colaboradores, Mech . Dev. 45:91-104 (1994), Chambón, P., FASEB J. 10:940-954 (1996)) . Dentro de especies dadas, los dominios de unión (C) del ADN y de unión (E) de ligando de los tres tipos de RAR son altamente similares, mientras que el dominio F C-terminal y el dominio D intermedio no exhiben o exhiben poca similitud. Las secuencias de aminoácidos de tres tipos de RAR también son notablemente diferentes en sus regiones B, y sus isoformas principales (al y a2 , ßl y ß4, y yl y ?2 ) difieren adicionalmente en sus regiones A N-terminales (Leid y colaboradores, TIBS 17:427-433 (1992) ) . Las comparaciones de las secuencias de aminoácidos han revelado que la conservación entre especies de un tipo de RAR dado es mayor que la similitud encontrada entre los tres tipos de RAR dentro de una especie dada (Leid y colaboradores, TIBS 17:. 27-433 (1992)) . Esta conservación entre especies es particularmente contundente en las regiones A N-terminales de las varias isoformas de RARa, ß y ?, cuyas secuencia de aminoácidos de la región A son completamente divergentes. Tomadas conjuntamente con los distintos patrones de expresión espacio- temporales , observados para los transcriptos de cada tipo de RAR y RXR en el embrión en desarrollo y en varios tejidos de ratón adulto (Zelent, A., y colaboradores, Nature 339:714-717 (1989); Dollé, P., y colaboradores, Nature 342:702-705 (1989), Dollé y colaboradores, Development 110:1133-1151 (1990), Ruberte y colaboradores, Development 108:213-222 (1990); Ruberte y colaboradores, Development 111:45-60 (1991); Mangelsdorf y colaboradores, Genes & Dev. 6:329-344 (1992)), esta conservación entre especies ha sugerido que cada tipo de RAR (e isoforma) pueden desempeñar funciones únicas. Esta hipótesis se soporta adicionalmente por el hallazgo que las varias formas de RAR contienen dos funciones de activación transcripcionales (AF) localizadas en la región A/B N-terminal (AF-1) y en las regiones E C-ter inal (AF-2), que pueden sinergísticamente , y en algún grado di ferencialmente , activar varios promotores sensibles a RA (Leid y colaboradores, TIBS 17:427-433 (1992), Nagpal, S., y colaboradores, Cell 70:1007-1019 (1992); Nagpal, S., y colaboradores, EMBO J., 12:2349-2360 (1993)) .

Receptores de RXR Diferente de los RAR, los miembros de la familia de los receptores del retinoide X (RXRa, ß y ?) se activan exclusivamente por 9-cis-RA (Chambón, P., FASEB J. 10:940-954 (1996); Chambón, P. Semin. Cell Biol. 5:115-125 (1994); Dollé, P., y colaboradores, Mech Dev. 45:91-104 (1994); Linney, E., Current Topics in Dev. Biol. 27:309-350 (1992); Leid y colaboradores, TIBS 17:427-433 (1992); Kastner y colaboradores, in vitamin A in Health and Disease, R. Blomhoff, ed., Marcel Dekker, Nueva York (1993) ) . Sin embargo, los RXR caracterizados a la fecha son similares a los RAR ya que diferentes tipos de RXR también difieren marcadamente en sus regiones A/B N-terminales (Leid y colaboradores, TIBS 17:427-433 (1992); Leid y colaboradores, Cell 68:377-395 (1992); Mangelsdorf y colaboradores Genes and Dev. 6:329-344 (1992)), y contienen las mismas funciones de activación transcripcionales en su región A/B N-terminal y su región E C-terminal (Leid y colaboradores, TIBS 17:427-433 (1992); Nagpal, S., y colaboradores, Cell 70:1007-1019 (1992), Nagpal, S., y colaboradores, EMBO J. 12:2349-2360 (1993)) . El RXRa y RXRß tienen un patrón de expresión extendido (posiblemente ubicuo) durante el desarrollo del ratón y en el animal adulto, que se encuentra en todos los tejidos fetales y de adulto, examinados así hasta la fecha (Mangelsdor f , D.J., y colaboradores, Genes & Devel. 6:329-344 (1992); Dollé, P., y colaboradores, Mech. Devel. 45:91-104 (1994); Nagata, T., y colaboradores, Gene 142:183- 189 (1994) ) . Los transcriptos de RXR? sin embargo, parecen tener una distribución más restringida, que se expresa en el músculo esquelético en desarrollo en el embrión (en donde su expresión persiste a todo lo largo de la vida) , y en el corazón, (después del nacimiento) en los epitelios sensores de los sistemas visuales y auditivos, en estructuras específicas del sistema nervioso central, y en tejidos comprendidos en la homeostasis de la hormona tiroide, por ejemplo, la glándula tiroide y las células tirotrópicas en la pituitaria (Mangelsdor f , D.J., y colaboradores, Genes & Devel., 6:329-344 (1992), Dollé P., y colaboradores, Mech. Devel. 45:91-104 (1994); Sugawara, A., y colaboradores Endocrinology 136:1766-1774 (1995), Liu, Q., y Linney, E., Mol. Endocrinol. 7:651-658 (1993)) . Corrientemente, no es claro si todas las propiedades moleculares de los RXR caracterizados in vitro son pertinentes para sus funciones fisiológicas in vivo. En particular, se desconoce con qué condiciones estos receptores actúan como reguladores transc ipcionales dependientes de 9-cis-RA (Chambón, P., Semin. Cell Biol. 5:115-125 (1994)) . Los éxitos de los RXRa y RXRß en el ratón han proporcionado alguna visión en las funciones fisiológicas de estos receptores. Por ejemplo, las malformaciones oculares y cardiacas observadas . en los fetos de RXRa''' (Kastner, P., y colaboradores, Cell 78:987-1003 (1994); Sucov, H.M., y colaboradores, Genes & Devel 8:1007-1018 (1994)) son similares a aquellas encontradas en el síndrome de VAD fetal, que sugiere de esta manera una importante función del RXRa en la transducción de la señal del retinoide durante el desarrollo. La implicación de los RXR en la señalización del retinoide se soporta adicionalmente por estudios de los mutantes compuestos de RXRa/RAR, que revelan efectos que están ya sea ausentes o son menos severos en mutantes individuales (Kastner, P., y colaboradores Cell 78:987-1003 (1994), Kastner, P., y colaboradores, Cell 83:859-869 (1995)) . Sin embargo, de manera interesante, el éxito de RXRa en el ratón no induce efectos perjudiciales notables, y los homozigotos de RXR?"'" que también son RXRa"'" ó RXRß" ~ no exhiben anormalidades adicionales más allá de aquellas vistas en RXRa"'", RXRa"7" y los fetos del síndrome de VAD fetal (Krezel, . , y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93 ( 17 ) : 9010-9014 (1996)), sugiriendo que el RXR?, a pesar de su patrón de expresión altamente específico del tejido, en el embrión en desarrollo, es prescindible para el desarrollo embriónico y la vida postnatal del ratón. La observación que los mutantes de RXR?" '/RXRa" "/RXRa*'" nacidos vivos pueden crecer hasta alcanzar la edad adulta (Krezel y colabo adores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93 ( 17 );: 9010-9014 (1996)) indica que un alelo individual de RXRa es suficiente para llevar a cabo todas las funciones postnatales y de desarrollo, vitales de la familia de receptores de RXR, particularmente todas las funciones de desarrollo que dependen de los RAR que pueden requerir un compañero de RXR (Dollé, P., y colaboradores, Mech. Dev. 45:91-104 (1994); Kastner, P., y colaboradores, Cell 83:859-869 (1995)) . Además, el hallazgo que los embriones con doble mutante de RXRa" _/RXR?" _ son más afectados que lo que son los mutantes de RXRa_ ", individuales (Krezel y colaboradores, Pro. Nati. Acad. Sci. USA 93 ( 17 ) : 9010-9014 (1996)) muestra claramente que el RXRß solo también puede realizar alguna de estas funciones. Por lo tanto, el hecho que el RXRa solo y, a un cierto grado el RXRß solo, sean suficientes para la terminación de un número de funciones de RXR de desarrollo, que indica claramente la existencia de un grado mayor de redundancia funcional entre los RXR. A este respecto, la situación del RXR es diferente de aquella de los RAR, puesto que todos los tipos de mutantes dobles de RAR exhibieron conjuntos mucho más amplios de defectos que los mutantes individuales (Rowe, A., y colaboradores Develop. 111:771-778 (1991); Lohnes, D., y colaboradores, Develop. 120:2723-2748 (1994); Mendelsohn, C. Develop. 120:2749-2771 (1994)) .

Unión del Retinoide a los Receptores de RAR y RXR Las estructuras cristalinas de los dominios de unión al ligando (LBD) de los RAR y RXR se han elucidado recientemente (Bourget, W., y colaboradores, Nature 375:377-382 (1995); Renaud, J.P., y colaboradores, Nature 378:681-689 (1995); Wurtz, J.M., y colaboradores Nature Struct. Biol. 3:87-94 (1996)) . Entre los varios tipos de RAR, se observa una identidad substancial de la secuencia de aminoácidos en estos dominios: comparación de los LBD de los RARa, RARß y RAR? indica que solo tres residuos de aminoácidos son variables en la cavidad de unión al ligando de estos receptores. Estos residuos dan cuenta aparentemente que los varios tipos de RAR exhiben alguna selectividad en la unión a ciertos retinoides sintéticos (Chen, J.-Y., y colaboradores, EMBO J. 14 ( 6 ) : 1187- 1197 (1995); Renaud, J.P., y colaboradores, Nature 378-681-689 (1995)), y se puede usar a consideración de estos residuos divergences para diseñar retinoides sintéticos específicos al tipo de RAR que pueden ser agonistas o antagonistas (Chambón, P., FASEB J. 10:940-954 (1996)) . Este planteamiento de diseño se puede extender en general a los otros receptores nucleares, tal como el receptor a de la tiroides (Wagner, R.L. y colaboradores, Nature 378:690-697 (1995)), las cavidades de unión al ligando de las cuales pueden asemejarse estructuralmente y químicamente a aquellas de los RAR (Chambón, P., FASEB J. 10:940-954 (1996)) . Inversamente, el modelado molecular de la cavidad de unión al ligando de los RXR demuestra que no hay diferencias notables en la composición de aminoácidos entre RXRa, RXRß y RXR? (Bourguet, W., y colaboradores, Nature 375:377-382 (1995); Wurtz, J.M., y colaboradores, Nature Struct. Biol. 3:87-94 (1996)), sugiriendo que el diseño los ligandos sintéticos específicos del tipo para los RXR puede ser más difícil que para los RAR (Chambón, P., FASEB J. 10:940-954 (1996)) .

Señalización del Retinoide a Través de los Heterodímeros RAR : RXR Los receptores nucleares (NR) son miembros de una superfamilia de factores reguladores, transc ipcionales, inducibles por ligando, que incluyen receptores de las hormonas esteroides, las hormonas tiroides, vitamina D3 y retinoides (Leid, M., y colaboradores, Trends Biochem. Sci. 17:427-433 (1992); Leid, M., y colaboradores, Cell 68:377-395 (1992); y Linney, E. Curr. Top. Dev. Biol., 27:309- 350 (1992) ) . Los NR exhiben una estructura modular que refleja la existencia de varios dominios funcionales, autónomos. En base a la similitud de secuencia de aminoácidos entre el receptor de estrógeno del pollo, los receptores de estrógeno y glucocorticoides de humanos, y el oncogen v-erb-A (Krust, A., y colaboradores, EMBO J. 5:891-897 (1986)), definieron seis regiones --A, B, C, D, E y F— , que exhiben diferentes grados de conservación evolutivas entre varios miembros de la superfamilia de receptores nucleares. La región C altamente conservada contiene dos salientes de zinc y corresponden al núcleo del dominio y la unión de ADN (DBD), que es responsable del reconocimiento específico de los elementos de respuesta similar. La región E es funcionalmente completa, puesto que además del dominio de unión al ligando (LBD), contiene una función de activación dependiente del ligando (AF-2) y una interconexión de dimerización.

Una función de activación transcripcional, autónoma (AF-1) se presenta en las regiones A/B N- terminales , no conservadas de los receptores de esteroide. De manera interesante, tanto AF-1 como AF-2 de los receptores de esteroides exhiben propiedades de activación transcripcionales, diferenciales, que parecen ser tanto específicas del tipo celular como específicas del contexto del promotor (Gronemeyer, J., H, Annu. Rev. Genet 25:89-123 (1991)) . Como se describe anteriormente, las señales del ácido todo-trans- (T-RA) y 9-cis (9C-RA) retinoico se transducen por dos familias de receptores nucleares, RAR a, ß y ? (y sus isoformas) se activan tanto por T-RA como por 9C-RA, en tanto que RXR a, ß y ? se activan exclusi amente por 9C-RA (Allenby, G. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:30-34 (1993)) . Los tres tipos de RAR difieren en sus regiones B, y sus isoformas principales (al y a2 , ßl-4, y ?l y ?2 ) tienen diferentes regiones A N-terminales (Leid, M. y colaboradores, Trends Biochem. Sci. 17:427-433 (1992) ) . De manera similar, los tipos de RXR difieren en sus regiones A/B (Mangel sdor f , D.J. y colaboradores, Genes Dev. 6:329-344 (1992)) . La región E de los RAR y los RXR también se ha mostrado que tiene una interconexión de dimerización (Yu, V.C., y colaboradores, Curr. Opin. Biotechnol. 3:597-602 (1992)) . De manera más interesante, se demostró que- los he terodímeros de RAR/RXR se unen de manera más eficiente in vitro que los homodímeros de su receptor a un número de elementos de respuesta de RA (RARE) (Yu, V.C. y colaboradores, Cell 67:1251-1266 (1991); Berrodin, T.J. y colaboradores, Mol. Endocrinol 6:1468-1478 (1992); Bugge, T.H. y colaboradores, EMBO J. 11:1409-1418 (1992); Hall, R. K. y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 12: 5527-5535 (1992), Hallenbeck, P. L. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5572-5576 (1992); Hus ann, M. y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1558-1564 (1992); Kliewer, S.A. y colaboradores Nature 355:446-449 (1992), Leid, M. y colaboradores, Cell 68:377-395 (1992); Marks, M. S. y colaboradores, EMBO J. 11:1419-1435 (1992), Zhang, X. K. y colaboradores, Nature 355:441-446 (1992)) . Los he terodímeros de RAR y RXR también se forman preferencialmente en solución in vitro {YU, V.C. y colaboradores, Cell. 67:1251-1266 (1991); Leid. M., y colaboradores, Cell 68:377-395 (1992); Marks, M.S. y colaboradores, EMBO J. 11:1419-1435 (1992)), aunque la adición de 9C-RA parece mejorar la formación de los homodímeros de RXR in vitro (Lehman, J.M. y colaboradores, Science 258:1944-1946 (1992), Zhang, X. K. y colaboradores Nature 358-587-591 (1922b)) . Se ha mostrado que la activación de los promotores sensibles a RA ocurre probablemente a través de los heterodímeros de RAR.-RXR en lugar de a través de los homodímeros (Yu, V.C. y colaboradores, Cell 61 : 1251-1266 (1991), Leid y colaboradores, Cell 68:377-395 (1992b); Durand y colaboradores, Cell 71:73-85 (1992);: Nagpal y colaboradores, Cell 70:1007-1019 (1992), Zhang, X.K., y colaboradores, Nature 355, 441-446 (1992); Klie er y colaboradores, Nature 355:446-449 (1992); Bugge y colaboradores, EMBO J. 11:1409-1418 (1992); Marks y colaboradores, EMBO J. 11:1419-1435 (1992); Yu, V.C. y colaboradores, Cur. OP. Biotech 3:597-602 (1992); Leid y colaboradores, TIBS 17:427-433 (1992) . Laudet y Stehelin, Curr. Biol. 2:293-295 (1992); Green, S., Nature 361:590-591 (1993)) . La porción de RXR de estos heterodímeros se ha propuesto que está ausente en la señalización inducida por retinoide (Kurokawa, R., y colaboradores, Nature 371:528-531 (1994); Forman, B.M., y colaboradores, Cell 81:5412-550 (1995); Mangelsdorf, D.J. and Evans, R.M., Cell 83:835-850 (1995)), aunque se han reportado resultados en conflicto en este tejido (Apfel, C.M. y colaboradores, J. Biol. Chem. 270 (51) : 30765-30772 (1995); ver Chambón, P. FASEB J. 10:940-954 (1996) para revisión) . Aunque los resultados de estos estudios sugieren fuertemente que los heterodímeros de RAR/RXR son en realidad unidades funcionales que transducen la señal de RA in vivo, no es claro si todas las combinaciones he terodiméricas ocurren in vivo (Chambón, P., Semin. Cell Biol. •5:115-125 (1994)) . De esta manera, la base del efecto altamente pleiotrópico de los retinoides puede residir, al menos en parte, en el control de los diferentes subconjuntos de promotores sensibles al retinoide por las combinaciones he terodiméricas expresadas específicamente en la célula, de los tipos de RAR:RXR (y sus isoformas), cuya actividad puede ser a su vez regulada por los niveles específicos de las células de todo-trans y 9-cis-RA (Leid y colaboradores, TIBS 17:427-433 (1992) ) . Los receptores de RXR también pueden estar comprendidos en la señalización dependiente de RA. Por ejemplo, la observación del metabolismo anormal de los lípidos en las células Sertoli de los animales mutantes de RXRß"'" sugiere que las interacciones funcionales también pueden ocurrir entre RXRß y la ruta de señalización de los receptores activados por proliferador , peroxisomal (WO 94/26100; Kastner, P., y colaboradores, Genes & Devel.' 10:80-92 (1996)) .

Usos Terapéuticos de los Retionoides Visión General Puesto que el ácido retinoico se conoce que regula las capacidades proliferativas y di ferenciat i vas de varios tipos de células de mamífero (Gudas, L.J., y colaboradores, In The Retinoids, 2a ed., Sporn, M.B., y colaboradores, eds., Nueva York Raven Press, pp . 443-520 (1994)), se usan los retinoides en una variedad de ambientes quimioprevent ivos y quimioterapéuticos. La prevención de cánceres orales, de piel, cabeza y cuello, en pacientes en riesgo de estos tumores se ha reportado (Hong, W.K. y colaboradores, N. Engl. J. Med. 315:1501-1505 (1986); Hong, W.K. y colaboradores, N. Engl. J. Med. 323:795-801 (1990); Kraemer, K. H. y colaboradores, N. Engl. J. Med. 318:1633-1637 (1988); Bollag, W. y colaboradores, Ann. Oncol. 3:513-526 (1992); Chiesa, F. y colaboradores, Eur. J. Cáncer B. Oral. Oncol. 28:97- 102 (1992); Costa, A. y colaboradores Cáncer Res. 54 suppl. 7, 2032-2037 (1994)) . Los retinoides también se han usado para tratar el carcinoma de células escamosas del cuello uterino y la piel (Verma, A.K., Cáncer Res. 47:5097-5101 (1987), Lippman S.M. y colaboradores, J. Nati Cáncer Inst. 84:235-241 (1992); Lippman, S.M. y colaboradores J. Nati Cáncer Inst. 84:241-245 (1992)) y el sarcoma de Kaposi (Bonhomme, L. y colaboradores, Ann. Oncol. 2:234-235 (1991)), se ha encontrado uso significante en la terapia de la leucemia promielocí tica aguda (Huang, M.E. y colaboradores, Blood 72:567-572 (1988), Castaigne, S. y colaboradores, Blood 76:1704-1709 (1990); Chomienne, C. y colaboradores, Blood 76:1710-1717 (1990); Chomienne, C. y colaboradores, J. Clin. Invest. 88:2150-2154 (1991), Chen Z y colaboradores, Leukemia 5:288-292 (1991); Lo coco, F. y colaboradores, Blood 77:1657-1659 (1991); Warrel, R.P., y colaboradores, N. Engl. J. Med. 324:1385-1393 (1991)/ Chomienne, C, y colaboradores, FASEB J. 10:1025-1030 (1996)) .

Leucemia Promielocí tica Aguda (APL) Un desplazamiento cromosómico, equilibrado, t(15;17), se ha identificado en la mayoría de las células con leucemia promielocí tica aguda (APL) (Larson, A.R., y colaboradores, Am. J. Med. 76:827- 841 (1984)) . El punto de rotura para este desplazamiento ocurre dentro del segundo intrón de RAR'a (Alcalay, M.D., y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1977-1981 (1991); Chang, K.S., y colaboradores, Leukemia 5:200-204 (1991); Chen, S., y colaboradores, Blood 78:2696-2701 (1991) y dentro de dos sitios del gen que codifica para el factor de transcripción de la saliente de zinc, putativo PML (Goddard, A., y colaboradores, Science 254:1371-1374 (1991)) . El desplazamiento recíproco t(15;17) conduce la generación de una proteína de fusión PML- RARa que se co-expresa con PML y RARa en células APL (para revisión y referencias, ver Warrell, R.P., y colaboradores, N. Engl. J. Med. 329:177-189 (1993); Grignáni, F., y colaboradores, Blood 83:10-25 (1994); Lavau, C., y Dejean, A., Leukemia 8:1615- 1621 (1994); de Thé, H. FASEB J. 10:955-960 (1996)) .

La fusión PML-RARa es aparentemente responsable del bloque de diferenciación en la etapa promielocí tica , puesto que (i) se observa- en casi todos los pacientes de APL (Warrell, R.P., y colaboradores, N. Engl. J. Med. 329:177-189 (1993); Grignáni, F., y colaboradores, Blood 83:10-25 (1994); Lavau, C. y Dejean, A., Leukemia 8:1615-1621 (1994)), (ii) exhibe diferenciación mieloide cuando se sobreexpresa en células de leucemia mieloblás tica U937 ó HL60 (Grignáni, F., y colaboradores, Cell 74:423-431 (1993)), y (iii) la remisión clínica completa debido a la diferenciación de las células leucémicas a granulocitos maduros en el tratamiento con ácido todo- trans- re t inoico (T-RA) se enlaza expresamente a la expresión de PML-RARa (Warrell, R.P., y colaboradores, N. Engl. J. Med. 324:1385-1393 (1991); Lo Coco, R., y colaboradores Blood 77:1657-1659 (1991); Chomienne, C, y colaboradores, FASEB J. 10:1025-1030 (1996)) . Múltiples estudios han hecho frente a posible impacto de la formación de la proteína de fusión PML-RARa en la proliferación celular (Mu, X.M., y colaboradores, Mol., Cell. Biol. 14:6858-6867 (1994)) y apóptosis (Grignáni, F., y colaboradores, Cell 74:423-431 (1993)), t rans epres ion de API (Doucas, V., y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:9345-9349 (1993)), y la señalización de la vitamina D3 (Pérez, A., y colaboradores, EMBO J. 12:3171-3182 (1993)), pero el (los) mecanismo(s) por el cual el PML-RARa bloquea la maduración de las células mieloides ha permanecido no claro. Consistente con la división nuclear, anormal en secciones de PML-RARa, que adopta la ubicación "tipo PML" en el tratamiento con RA (Dyck, J.A., y colaboradores, Cell 76:333-343 (1994); Weis, K., y colaboradores, Cell 76:345-358 (1994); Koken, M.H., y colaboradores, EMBO, J. 13:1073-1083 (1994)), la hipótesis que prevalece corrientemente es que el PML-RARa posee propiedades transcripcionales alteradas en comparación a PML-RARa y/o puede actuar de una manera negativa al dominio (Pérez, A., y colaboradores, EMBO J. 12:3171-3182 (1993); de Thé, H., y colaboradores, Cell 66:675-684 (1991); Kastner, P., y colaboradores, EMBO J. 11:629-642 (1992) ) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por la invención, se proporciona un método para tratar un animal, preferentemente un humano, que sufre de, o está predispuesto a, un desorden físico. El método comprende administrar al animal una cantidad efectiva de una composición que comprende al menos un antagonista de RAR, preferentemente un antagonista de RARa, en forma más preferente el compuesto A o B, y al menos un agonista de RXR, en forma más preferente SR11237. La combinación de un agonista RXR, que no tiene efectos terapéuticos solo, con un antagonista de RAR permite el uso de dosis menores del antagonista de RAR que se pensó previamente que es eficaz; este planteamiento evita muchos de los efectos laterales fisiológicos, indeseables del tratamiento con antagonistas de RAR. Los desórdenes físicos tratables por el método de la presente invención incluyen cánceres (preferentemente; un cáncer de piel, un cáncer de la cavidad oral, un cáncer de pulmón, un cáncer de la glándula mamaria, un cáncer prostético, un cáncer de vesícula, un cáncer de hígado, un cáncer pancreático, un cáncer cervical, un cáncer ovárico, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de colon, un cáncer de células germen, tal como tera tocarcinoma o una leucemia, y en forma más preferente una leucemia promielocí tica aguda), un desorden de la piel (preferentemente psoriasis, queratosis actínica, acné, ictiosis, fo toenve j ecimiento o atrofia de la piel inducida por corticosteroides) , artritis reumatoide y una lesión premal igna . La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un antagonista de RAR que preferentemente es un antagonista de RARa; y en forma más preferente el compuesto A o compuesto B, al menos un agonista de RXR que es más preferentemente SR11237, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo. La invención abarca, además, el uso de estas composiciones farmacéuticas en el tratamiento de un animal, preferentemente un humano, que está sufriendo de, o está predispuesto a, un desorden físico. Los desórdenes físicos tratables usando las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen aquellos descritos anteriormente . Otras modalidades preferidas de la presente invención serán aparentes para un experto en la técnica en vista de los siguientes dibujos y la descripción de la invención, y de las reivindicaciones .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Resumen de las actividades agonísticas y antagoní sticas de varios retinoides sintéticos de BMS . " + " indica agonístico para el receptor dado, "(+)" débilmente agonístico, "-" antagonístico y "0" no actividad.

Figura 2. Representación de color falso del análisis de la cámara de fotones, individual de la actividad de luciferasa inducida por retinoide que se origina en células indicadoras HeLa tratadas con ligandos específicos de RAR solos (senda a), o con todo- t rans-RA 10 nM (senda b) .

Figura 3. Sinergia entre agonistas o antagonistas de RARa y agonistas de RXR, para la inducción de la diferenciación de células NB4. Las fotomicrografías de células teñidas con tetrazolio nitroazul (a-d) o fotomicrografías de inmunof luorescencia de células teñidas con antisueros ant i -PML (e-h) después del tratamiento durante 4 días con etanol o el retinoide(s) indi cado .

Figura 4. Sinergia entre los agonistas o antagonistas de RARa y los agonistas de RXR, para la inducción de la apóptosis de las células NB4. Los efectos de los retinoides en la distribución y apariencia del ciclo celular de las células y partículas apoptóticas "sub-2N", como es pertinente por el análisis citométrico de flujo. El eje horizontal en cada histograma indica la intensidad de- fluorescencia integrada y el eje vertical indica el número de partículas. Aproximadamente 20,000 partículas se representan en cada histograma. Los histogramas que indican el número de células que contienen 2N, 4N ó una cantidad intermedia de ADN para: células NB4 no tratadas (a), células tratadas con T-RA 1 mM durante 4, 6 u 8 días (b-d), Am80 1 nM durante 4 u 8 días (e, f), o la combinación de 100 nM del compuesto A de 100 nM de SR11237 durante 4 u 8 días (g, h) .

FIGURA 5. Inducción por retinoide del apóptosis en células NB4. La fotomicrografía de un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, en un ensayo de fragmentación de ADN, realizado con células cultivadas en la ausencia (sendas 2-4) o presencia (sendas 5-13) de los retionoides indicados a las- siguientes concentraciones: T-RA, 100 nM; AM80, 1 nM; SR11237, 100 nM; Compuesto A, 10 nM (sendas 9 y 10) y 100 nM (sendas 12 y 13) .

FIGURA 6. Fotografías de los geles de secuenciación que demuestran sinergismo de RARa y RXR. Las células tratadas con agonistas como se indica, se procesaron luego como se describe posteriormente para la PCR medida por ligación (a, b) o la PCR con transcriptasa invertida (c) y resuelta en un gel de secuenciación (a) células NB4, autorradiograma , (b) células P19, autorradiograma; (c) células NB4, gel teñido con bromuro de etidio, (transcriptos de ARN del gen ß-actina se usaron como control ) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Síntesis de los Agonistas y Antagonistas de RAR y RXR Los agentes que se van a usar en los métodos de la presente invención, pueden ser; pero no limitados a; péptidos, carbohidratos, esteroides y derivados de vitamina, que pueden cada uno ser naturales o sintéticos (preparados, por ejemplo, usando los métodos de la química orgánica e inorgánica, sintética, que es bien conocida en la técnica) . De acuerdo con la invención, se pueden seleccionar los agentes y detectar al azar. Para la detección al azar, los agentes tal como péptidos, carbohidratos, esteroides, o derivados de vitamina (por ejemplo, derivados de RA) se seleccionan al azar y se valoran, usando métodos directos o indirectos que son de rutina en la técnica, para su capacidad para unirse a un receptor de RAR o RXR o un heterodímero del receptor de RAR:RXR, de retinoide, funcional. Por ejemplo, los agonistas de RAR candidatos de acuerdo con la presente invención incluyen retinoides sintéticos tal como AmdO, compuesto 1 y compuesto 2 (las estructuras de los cuales se describen en Ostrowski y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:1812-1816 (1995), que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) y Am80 (Roy y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 15 { 12) : 6481-6487 (1995), que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) . Los agonistas de RXR candidatos de acuerdo con la presente invención incluyen retinoides sintéticos tal como SR11237 (la estructura de la cual se describe en Lehman, J.M., y colaboradores, Science 258:1944-1946 (1992), que se incorpora en la presente en su totalidad) . Los antagonistas de RAR, candidatos, incluyen, pero no se limitan, a, aquellos descritos previamente (Chen y colaboradores, EMBO J. 14:1187-1197 (1995); Roy y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 15 ( 12 ) : 6481 - 6487 (1995); Chen y colaboradores, EMBO J. 14:1187-1197 (1995), cada uno de los cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) , y el compuesto A y el compuesto B como se describe en detalle posteriormente. De esta manera, se conocen métodos en la técnica para desarrollar antagonistas de RAR y agonistas de RXR; candidatos, para detectar como se describe posteriormente, que se van a usar de acuerdo con la presente invención. De manera específica, la invención se puede llevar a cabo con los compuestos antagonistas de RAR designados en la presente "Compuesto A" y "Compuesto B", que tienen respectivamente las siguientes estructuras: Compuesto B Estos compuestos se pueden preparar como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,559,248, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Otros antagonistas de RAR útiles se describen en, por ejemplo, Eyrolles y colaboradores, Med. Chem. Res. 2:361-367 (1992) y Apfel y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:7129-7133 (1992), que se incorporan por referencia en la presente en su totalidad. La invención también se puede llevar a cabo con el agonista de RXR, LG1069, la estructura y la preparación del cual se describen en Boehm y colaboradores, J. Med. Chem. 37:2930-2941 (1994), que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. Otros agonistas de RXR útiles se describen en por ejemplo, Lehmann y colaboradores, Science 258:1944-1946 (1992), que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. Otros antagonistas de RAR y agonistas de RXR adecuados para el uso en la presente invención se pueden preparar por los métodos citados anteriormente y otros de rutina para aquellos expertos en la técnica .

Métodos de Detección Un número de métodos para detectar antagonistas de RAR y agonistas de RXR; y candidatos, generados por diseño rotacional o moldeado por computadora como se describe anteriormente, son bien conocidos en la técnica y permitirán que un experto en la técnica determine si un compuesto es útil en los métodos de la presenté invención. Por ejemplo, en Che y colaboradores, EMBO J. 14 ( 6) : 1187-1197 (1995), se han usado tres líneas celulares "indicadoras" para caracterizar un número de retinoides sintéticos de disociación específicos de RARa, RARß, RAR?, que inducen selectivamente la función de activación de AF-2 presente en LBD de RARß (ßAF-2) (Chen, J.-Y., y colaboradores, EMBO J. 14 ( 6 ) : 1187- 1197 (1995)) . Estas líneas regulares expresan establemente proteínas quiméricas que contienen el dominio de unión de ADN del transactivador de levadura GAL4 fusionado a las regiones EF (que contiene que LBD y la función de activación de AF-2) de RARa (GAL-RARa) , RARß (GAL-RARß) ó RAR? (GAL-RAR?) , y un gen indicador de luciferasa accionado por un pentámero de la secuencia de reconocimiento de GAL4 ("17 m") enfrente del promotor de ß-globina (17 m) 5-GAL-Luc) . En estas líneas celulares, los ligandos de .RAR inducen de esta manera la actividad de luciferasa que se puede medir en las células intactas usando una cámara de conteo de fotones, individual. Este sistema indicador es insensible a los receptores endógenos que no pueden reconocer el sitio de unión de GAL4. Usando ensayos de detección análogos, estos retinoides sintéticos, similar a RA, se ha reportado que no inhiben el crecimiento independiente del anclaje de las células 3T3 transformadas con oncogen, en tanto que el promotor del gen de interleucina- 6 (IL-6) humano, cuyo producto está comprendido en la regulación de la hematopoyesis, respuestas inmunitarias e inflamación (Kishimoto, T. y colaboradores Science 258:593-597 (1992)), se ha mostrado que se induce por RA pero no por los retinoides de disociación sintéticos que reprimen su actividad. De una manera similar, los agonistas de RXR se han identificado usando líneas celulares que expresan un receptor de RXR enlazado a un gen indicador de TREpal-tk que se activa por ambos heterodímeros RAR-RXR y los homodímeros de RXR (Lehmann, J.M., y colaboradores Science 258:1944-1946 (1992) ) . De esta manera, las líneas de células indicadoras que se construyen fácilmente, por métodos de rutina para un experto en la técnica, se pueden usar para distinguir no solo los tipos de RAR o RXR específicos a los cuales se unirá el ligando candidato, sino también si esa unión induce un efecto de activación (es decir, agonístico) o efecto represivo (es decir, antagoní s t ico ) . Aunque las líneas celulares, indicadoras, referidas anteriormente comprendidas del gen de luciferasa o timidina-cinasa como indicadores, otros indicadores tal como Neo, CAT, ß-galactosidasa o la Proteína de Fluorescencia Verde son bien conocido en la técnica y se pueden usar de una manera similar para llevar a cabo la presente invención. Por ejemplo, las referencias que describen plásmidos indicadores que contienen un gen indicador y vectores de expresión que codifican para un LBD de un receptor nuclear incluyen Meyer y colaboradores, Cell 57:433-442 (1989); Meyer y colaboradores, EMBO J. 9(12) :3923-3932 (1990); Tasset y colaboradores, Cell 62:1177-1187 (1990), Gronemeyer, H., y Laudet, V., Protein Profile 2:1173-1308 (1995), Webster y colaboradores, Cell 54:199-207 (1988); Strahle y colaboradores, EMBO J. 7:3389-3395 (1988); Seipel y colaboradores, EMBO J. 11:4961-4968 (1992); y Nagpal y colaboradores, EMBO J. 12:2349-2360 (1993) . Se han usado otros ensayos de proteína para detectar compuestos para sus propiedades agonísticas o an tagoní s t i cas en funciones de otros receptores nucleares, tal como receptores de esteroides. Por ejemplo, se ha usado un sistema de expresión transiente/ retardo en gel para estudiar los efectos de los esteroides sintéticos RU486 y R5020 en la función del receptor de progesterona y glucocorticoides (Meyer, M-E . , y colaboradores, EMBO, J. 9(12) 3923-3932 (1990)) . Se han usado ensayos similares para mostrar que el tamoxifen inhibe competitivamente la unión de ERAP160 inducida por estradiol, al receptor de estrógeno, sugiriendo un mecanismo para sus efectos inhibitorios del crecimiento en el cáncer de pecho (Halachimi, S . , y colaboradores, Science 264:1455-1 58 (1994)) . Puesto que los receptores de RAR y RXR son aparentemente similares en estructura a otros receptores nucleares tal como los receptores de esteroides (como se revisa en Chambón, P. FASEB J. 10:940-954 (1996)), los ensayos de rutina de este tipo pueden ser útiles en la valoración de compuestos para sus actividades agonísticas o antagonís ticas en los receptores de RAR o RXR. Como un método de rutina, alternativo, el efecto de un agonista o antagonista candidato en la unión del modulador TIF1 de AF-2, dependiente del ligando, a un LBD de RAR o RXR se puede estudiar usando los ensayos de interacción de glutat iona-S-transferasa (GST) al marcar los LBD con GST como se describe en detalle en Le Douarin y colaboradores, EMBO J. 14:2020-2033 (1995) .

En otro ensayo de detección, ratones transgénicos y líneas celulares transgénicas que se alteraron en su expresión de uno o más receptores de RAR o RXR se pueden hacer como se describe previamente (Krezel, W., y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93 ( 17 ) : 9010- 9014 (1996)) , y se pueden usar para identificar los agonistas y antagonistas en miembros específicos de la clase de RAR/RXR de receptores usando los métodos descritos previamente (WO 94/26100) . En este ensayo, la gente que se va a probar se incubará con una o más de las líneas celulares transgénicas, o ratones o tejidos, derivados de los mismos. El nivel de unión del agente luego se determina, o el efecto que el agente tiene en el desarrollo o en la expresión del gen se inspecciona, por técnicas que son de rutina para un experto en la técnica. Como se usa en la presente, el término "incubar" se define como poner en contacto el compuesto o agente bajo investigación con la célula o tejido apropiado, o al administrar el agente o compuesto al ratón apropiado, vía cualquiera de las rutas bien conocidas de administración que incluyen administración enteral, intravenosa, subcutánea e intramuscular.

Otros ensayos, tal como aquellos descritos en detalle posteriormente en los Ejemplos 1 y 2, se pueden usar para determinar los efectos agonísticos o antagonís ticos de los ligandos de RAR y RXR. Por ejemplo, ciertos retinoides agonísticos inducirán la asociación de la proteína de fusión de PML/PMAL-RARa, endógena con cuerpos nucleares en células a partir de pacientes con APL (Dyck, J.A., y colaboradores, Cell 76:333-343 (1994); Weis, K., y colaboradores, Cell 76:345-356 (1994), Koken, M.H.M., y colaboradores, EMBO J. 13 ( 5 ) : 1073- 1083 (1994)), o en líneas celulares, relacionadas, establecidas, tal como NB4 (Lanotte, M. y colaboradores, Blood 77(5) 1080-1086 (1991)) . Estos efectos de los agonistas y antagonistas de RAR o RXR se pueden determinar, por ejemplo, por varias técnicas inmunológicas tal como microscopía inmunof luorescente o de inmunoelectrones , usando anticuerpos específicos para PML, RAR y/o proteínas de fusión de PML-RARa. Los agonistas o antagonistas de RAR o RXR también se pueden identificar por sus capacidades para inducir la diferenciación (maduración) in vitro de ciertas líneas celulares establecidas tal como las células de leucemia neoblástica, HL-60 (Nagy, L., y colaboradores, Mol'.

Cell. Biol. 15(7) 3540-3551 (1995)), células promielíticas NB4 (Lanotte, M., y colaboradores, Blood 77 (5) : 1080-1086 (1991), células de carcinoma embriónico P19 ó F9 (Roy, B., y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 15 ( 12 ) : 6 81- 6487 (1995); Horn., V., y colaboradores, FASEB J. 10:1071-1077 (1996)), o células 3T3 o transformadas con ras (Chen y colaboradores, EMBO J. 14 ( 6 ) : 1187- 1197 (1995)) . La diferenciación inducida por ligandos en estas y otras líneas celulares se puede determinar al valorar las células tratadas o no tratadas con el ligando para la expresión de una variedad de marcadores bien conocidos de la diferenciación como se describe en general en las referencias anteriores . De manera similar, los agonistas y antagonistas candidatos se pueden detectar al inhibir sus capacidades para inducir la apóptosis (muerte celular programada) en por ejemplo, células HL-60 (Nagy, L., y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 15 (7) :'3540-3551 (1995)) o células P19 (Horn, V., y colaboradores, FASEB J. 10:1071-1077 (1996)), o en otras células primarias o líneas de células establecidas. La apóptosis se valora típicamente por la medición de la fragmentación de ADN inducida por ligandos, que se logra - por métodos tal como electroforesis en gel (apariencia de bandas de peso molecular más pequeñas), microscopía (cambios en la morfología de la membrana de plasma tal como formación de protuberancias superficiales ("ampollas") o en la morfología nuclear tal como picnosis o fragmentación o expresión de la proteína BCL-2 supresora de la apóptosis putativa (disminuida en células apoptót icas ) ; para métodos y discusiones generales de estos ensayos en cuanto a su relación a la- biología de RAR y RXR, ver Nagy, L., y colaboradores Mol. Cell Biol. 15 ( 7 ) : 3540-3551 (1995); Horn, V., y colaboradores, FASEB J. 10:1071-1077 (1996) ) . Otros métodos para valorar la apóptosis inducidas por ligandos en células primarias y líneas celulares establecidas, tal como la citometría de flujo o análisis de particular (apariencia de partículas más pequeñas con diferentes perfiles de dispersión de luz y/o contenido de ADN; son bien conocidos en la técnica (Telford, W.G., y colaboradores, J. Immunol. Meth. 172(1) :1-16 (1994); Camapan, D., y colaboradores, Cytometry 18(2) :68-74 (1994); Sgonc, R., y Wick, G., Int. Arch. Allergy Immunol. 105 ( ) : 327-332 (1994); Fraker, P.J., y colaboradores, Meth. Cell Biol. 46:57-76 (1995); Sherwood, S.W., y Schimke, R.T., Meth. Cell Biol. 46:77-97 (1995); Carbonari, M., y colaboradores, Cytometry 22 ( 3 ) : 161 - 167 (1995); Mastrangelo, A.J., y Betenbaugh, M.J., Curr. Opin. Biotechnol. 6(2) :198-202 (1995)) . Finalmente, la detección de los agonistas o antagonistas se puede lograr por un ensayo conocido como la "impresión in vivo" (Mueller, P.R. y Wold, B. Science 246:780-786 (1989); Garrity, P.A. y Wold, B.J., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:1021-1025 (1992)), como se describe en más detalle posteriormente en los Ejemplos 1 y 2, que ha probado ser útil para el análisis de la transcripción inducida por RA de RARß2 (Dey, A., y colaboradores, Mol. Cell. Biol 14 (12) : 8191-8201 (1994)) . Otros métodos para determinar las actividades agonistas o antagonistas de un ligando candidato que son de rutina en la técnica se pueden usar para llevar a cabo la presente invención. En la realización de estos ensayos; un experto en la técnica será capaz de determinar qué tipo de receptor de RAR o RXR se une a un agente, que receptor (es) específico se utiliza por un compuesto dado, y si el agente es un agonista o antagonista del receptor (es) dado.

Indicaciones Clínicas De esta manera, los métodos para identificar, sintetizar y detectar antagonistas de RAR y agonistas de RXR son bien conocidos en la técnica. Estos ligandos se pueden usar entonces de acuerdo con la presente invención en el tratamiento de una variedad de desórdenes físicos en animales, particularmente en mamíferos incluyendo humanos. Como se describe anteriormente, se conoce que el ácido retinoico regula las capacidades proliferativas y di ferencia t i vas de varios tipos de células de mamífero (Gudas, L.J. y colaboradores, (1994) In Sporn, M.B., Roberts, A.B. y Goodman, D.S. (eds) . The Retinoids, 2a edición, Raven Press, Nueva York, pp 443-520) . De esta manera, se han usado los retinoides en un número de regímenes quimioprevent i vos y quimioterapéuticos. Incluido entre estos planteamientos químicos están la prevención y/o tratamiento de una variedad de cánceres y lesiones premalignas de los mismos, tal como aquellas de la cavidad oral, piel (incluyendo el carcinoma de células escamosas, melanoma y sarcoma de Kaposi), cáncer de cabeza y cuello, ovario, pulmón, glándula mamaria, vejiga, próstata, hígado y páncreas (Hong, W.K., y colaboradores N. Engl. J. Med. 315:1501-1505 (1986); Verma, A.K., Cáncer Res. 47-5097-5101 (1987); Hong, W.K., y colaboradores, N. Engl. J. Med. 323:795-801 (1990); Kraemer, K.H., y colaboradores, N. Engl. J. Med. 318:1633-1637 (1988); Bonhomme, L., y colaboradores, Ann. Oncol. 2:234-235 (1991); Bollag, W., y colaboradores Ann Oncol. 3:513-526 (1992); Chiesa, F., y colaboradores, Eur. J. Cáncer B. Oral Oncol. 28:97-102 (1992), Lippman, S.M., y colaboradores, J. Nati. Cáncer Inst. 84:235-241 (1992); Lippman, S.M., y colaboradores, J. Nati. Cáncer Inst. 84:241-245 (1992), Costa, A., y colaboradores, Cáncer Res. 54 (Suppl. 7) :2032-2037 (1994), de Thé, H. FASEB J. :955-960 (1996); Lotan, R., FASEB J. 10:1031-1039 (1996), Berard, J. y colaboradores, FASEB J. :1091-1097 (1996)) . En forma más específica, se han usado los retinoides para tratar pacientes afligidos con ciertas leucemias, particularmente la leucemia promielocí t ica aguda (Huang, M.E., y colaboradores, Blood 72:567-572 (1988), Castaigne, S., y colaboradores, Blood, 76:1704-1709 (1990); Chomienne, C., y colaboradores, Blood 76:1710-1717 (1990); Chomienne, C-, y colaboradores, J. Clin.

Invest. 88:2150-2154 (1991); Chen. Z., y colaboradores, Leukemia 5:288-292 (1991); Lo Coco, F., y colaboradores Blood 77:165701659 (1991), Warrell, R.P., y colaboradores, N. Engl. J. Med. 324 : 13'85-1393 (1991); Chomienne, C, y colaboradores, FASEB J. 10:1025-1030 (1996)) . También los retinoides han probado ser efectivos en el tratamiento de ciertos desórdenes de la piel tal como psoriasis, acné, ictiosis, fo toenvej ecimiento y atrofia de la piel inducida por cort icos t eroides tal como aquella que puede acompañar el uso tópico de cor t icos t eroides en el tratamiento de la inflamación de la piel (Fisher, G.J., y Voorhees, J.J., FASEB J. 10: 1002-1013 (1996) ) . De esta manera, las combinaciones de los antagonistas de RAR y agonistas de RXR de la presente invención se pueden usar en el tratamiento de un animal, preferentemente un mamífero incluyendo un humano, que esté sufriendo de, o esté predispuesto a una variedad de desórdenes físicos. Como se usa en la presente, un animal que está "predispuesto" a un desorden físico se define como un animal que no exhibe una pluralidad de síntomas físicos palpables del desorden, pero que esté genéticamente, fisiológicamente o de otro modo el riesgo de desarrollar el desorden. Las combinaciones de los antagonistas de RAR y agonistas de RXR se pueden usar de esta manera de manera profiláctica como agentes quimioprevent ivos para estos desórdenes. En el tratamiento del animal con las combinaciones de la presente invención, los agonistas de RXR se pueden administrar al animal antes de, concurrentemente con, o después de la administración de los antagonistas de RAR. Los desórdenes físicos tratables con las combinaciones y métodos de la presente invención incluyen una variedad de cánceres, tal como cáncer de piel, incluyendo el melanoma y sarcoma de Kaposi) cáncer de la cavidad oral, cáncer de pulmón, cáncer de la glándula mamaria, cáncer prostético, cáncer de vesícula, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de cuello y cabeza, cáncer de colon, cáncer de células germen (incluyendo tera tocarcinoma ) y leucemia, en forma más preferente leucemia promi elocí t ica aguda. Otros desórdenes físicos tratables con las combinaciones y métodos de la presente invención incluyen desórdenes de la piel tal como psoriasis, queratosis actínica, acné, ictiosis, fotoenvej ecimiento y atrofia de piel inducida por corticosteroides, y artritis reumatoide. Las composiciones y métodos de la presente invención también se pueden usar en la prevención de la progresión de la enfermedad, tal como en la quimioprevención de la progresión de una lesión premaligna a una lesión maligna. Las composiciones y métodos de la presente invención también se pueden usar para tratar un animal que sufre de, o está predispuesto a, otros desórdenes físicos que responden al tratamiento con retinoides.

Formulación y Métodos de Administración Como se indica anteriormente, los ligandos selectivos de RAR y RXR se conoce que producen un arreglo amplio de respuestas celulares, varias de las cuales tienen aplicaciones técnicas en el tratamiento de un paciente. El término "paciente" como se usa en la presente se define como un animal, preferentemente un mamífero, incluyendo un humano. Por la invención, las dosis de uno o más antagonistas de RAR se pueden reducir de manera significante cuando se co-admini s tran con al menos un agonista de RAR. Como se usa en la presente, "una cantidad efectiva de un antagonista de RAR (o RXR)" se define como una cantidad efectiva para reducir una respuesta celular en células que expresan un receptor de RAR (o RXR) . Las terapias químicas de ejemplo que comprenden la administración de composiciones que comprenden al menos un antagonista de RAR y al menos un agonista de RXR a un paciente se discuten en mayor detalle posteriormente . Las combinaciones de agonistas de RAR y agonistas de RXR, con uso potencial en la terapia para humanos, se conocen en la técnica (Lehmann, J.M., y colaboradores, Science 258:1944-1946 (1992); Durand, B., y colaboradores, EMBO J. 13:5370-5382 (1994); Lotan, R., y colaboradores, Cáncer Res. 55:232-236 (1995); Roy, B., y colaboradores Mol. Cell. Biol. 15 (12) : 6481-6487 (1995); Horn, V., y colaboradores (FASEB J. 10:1071-1077 (1996)) . Sin embargo, ninguna de estas descripciones previas describieron o auguraron el hallazgo inesperado de la presente invención que las combinaciones de los antagonistas de RAR con agonistas de RXR son útiles en el tratamiento de una variedad de desórdenes f i s icos . De esta manera, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un agonista de RAR (tal como aquellos descritos anteriormente), al menos un agonista de RXR (tal como aquellos descritos anteriormente), y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable; las cuales se puede administrar oralmente, de manera rectal, parenteralmente, intrasistémica, de manera intravaginal , int raperi tonealmente, de manera tópica (como por polvos, ungüentos, gotas o parches transdérmicos), de forma bucal, o como un aerosol oral o nasal. De manera importante, al co-administrar un antagonista de RAR y un agonista de RXR, se pueden reducir los efectos laterales químicos al usar dosis menores tanto del antagonista de RAR como del agonista de RXR. Como se indica, se entenderá que el agonista de RXR se puede "co-administrar" ya sea antes, después o simultáneamente con el antagonista de RAR, dependiendo de las exigencias de una aplicación terapéutica particular. Por "portador farmacéuticamente aceptable" se quiere decir un sólido no tóxico, semisólido o agente de relleno líquido, diluyente, material de encapsulamiento o auxiliar de formulación de cualquier tipo. El término "parenteral" como se usa en la presente se refiere a los módulos de administración que incluyen infusión e inyección intrav.enosa, intramuscular, intraperitoneal, intraexterna, subcutánea e intraart icular . Las composiciones farmacéuticas de la presente invención para la inyección parenteral pueden comprender soluciones acuosas o no acuosas, estériles, farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones así como polvos estériles para la reconstitución en soluciones inyectables, estériles o dispersiones justo antes del uso. Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos, adecuados, diluyentes, solventes o vehículos incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de la misma, aceites vegetales (tal como aceite de olivo), y esteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de materiales de revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de las dispersiones, y por el uso de agentes tensioactivos. Las composiciones de la presente invención también pueden contener adyuvantes tal como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes, y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos se puede asegurar por la inclusión de varios agentes antibacterianos y ant i fúngales , por ejemplo, parabe'n, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tal como azúcares, cloruro de sodio, y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede efectuar por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tal como monoestearato de aluminio y gelatina. En algunos casos, a fin de prolongar el efecto de los fármacos, es deseable desacelerar la absorción de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr por el uso de una suspensión líquida del material líquido amorfo con pobre solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco depende entonces de su velocidad de solución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. En forma alternativa, la absorción retrasada de una forma de fármaco parenteralmente administrada, se logra al disolver o dispersar el fármaco en un vehículo aceitoso.

Las formas de depósito, inyectables, se elaboran, al formar matrices de microcápsulas del fármaco en polímeros biodegradables tal como poliláctido-poliglicólido . Dependiendo de la relación de fármaco al polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen pol'i (orto-ésteres ) y pol i ( anhídridos ) . Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan al atrapar el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales . Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención de bacterias; o por la incorporación de agentes de esterilización en la forma de composiciones sólidas estériles que . se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable, estéril justo antes del uso. Las formas de dosis sólidas para la administración oral incluyen cápsulas, tabletas, pildoras, polvos y granulos. En estas formas de dosis sólidas, los compuestos activos se mezclan con al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o a) agentes de relleno o agentes de extensión tal como almidones, lactosa, sucrosa, glucosa, manitol, y ácido salicílico, b) aglutinantes tal como por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sucrosa y goma arábiga, c) humectantes tal 'como glicerol, d) agentes de desintegración tal como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos salicatos, y carbonato de sodio, e) agentes de retardo de la solución tal como parafina, f) aceleradores de absorción tal como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tal como por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tal como caolín y arcilla de bentonita, e i) lubricantes tal como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio, y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, las tabletas y pildoras, la forma de dosis también puede comprender agentes de amortiguamiento. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como agentes de rellene en cápsulas de gelatina suave y dura usando excipientes tal como lactosa o azúcar de leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares . Las formas de dosis sólidas de tabletas, grageas, cápsulas, pildoras y granulos se pueden preparar con revestimientos y envolturas tal como revestimientos entéricos y otros revestimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Estos pueden contener opcionalmente agentes o pacificadores y también pueden ser una composición que liberará el (los) ingrediente ( s ) activo solo, o preferencialmente, en una cierta parte del t ractointes t inal , opcionalmente, de una manera retrasada. Los ejemplos de composiciones con incrustación que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras. Los compuestos activos también pueden estar en una forma microencapsulada , si es apropiado, con uno o más de los excipientes mencionados anteriormente. Las formas de dosis líquidas para la administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires, farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosis líquidas pueden contener diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica tal como por ejemplo, agua u otros solventes, agentes de solubilización y emulsionantes tal como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1 , 3-but ilengl icol , dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de algodó.n, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y ajonjolí), glicerol, alcohol tetrahidrofurfuri 1 ico , polietilenglicoles y esteres de ácido graso de sorbitan, y mezclas de los mismos. Además de los ingredientes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tal como agentes humectantes, agentes de emulsión y dispersión, edulcorantes, saborizantes y agentes de perfume. Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de dispersión tal como por ejemplo, alcoholes isos tearí 1 icos etoxilados, polioxietilen sorbitol y esteres de sorbitan, celulosa microcristalina, me t ahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, de tragacanto, y mezclas de los mismos. La . administración tópica incluye la administración a la piel o mucosa, incluyendo las superficies del pulmón y ojo. Las composiciones para la administración tópica, incluyendo aquellas para la inhalación, se pueden preparar como un polvo seco que se puede presurizar o estar no presurizado. En composiciones en polvo no presurizadas, los polvos activos en forma finamente dividida se pueden usar en mezcla con un portador inerte farmacéuticamente aceptable, de tamaño grande, que comprende partículas que contienen un tamaño, por ejemplo, de hasta 100 µm de diámetro. Los portadores inertes adecuados incluyen azúcares tal como lactosa. En forma deseable, al menos 95 % en peso de las partículas del ingrediente activo tienen un tamaño de partícula efectivo en el intervalo de 0.1 a 10 µm. De manera alternativa, la composición se puede presurizar y contener un gas comprimido, tal como nitrógeno o un propulsor de gas licuado. El medio propulsor licuado y por cierto la composición total es preferentemente tal que los ingredientes activos no se disuelven en la misma a un grado sustancial. La composición presurizada también puede contener un agente tensioactivo. El agente tensioactivo puede ser un agente tensioactivo líquido o sólido, no iónico, o puede ser un agenté tensioactivo, aniónico, sólido. Se prefiere usar el agente t.ens ioact ivo aniónico, sólido en la forma de una sal de sodio. Una forma adicional de administración tópica es al ojo. El(los) antagonista ( s ) de RAR y el (los) agonista (s) de RXR se distribuye en un vehículo oftálmico, farmacéuticamente aceptable, tal que los- compuestos se mantengan en contacto con la superficie ocular durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los compuestos penetren las regiones cornéales e internas del ojo, como por ejemplo la cámara anterior, la cámara posterior, el cuerpo vitreo, el humor acuoso, el humor vitreo, la córnea, el iris/ciliar, de lente, el coroide/retina y la esclera. El vehículo oftálmico farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, un ungüento, aceite vegetal o un material de encapsulamiento. Las composiciones para la administración rectal o vaginal son preferentemente supositorios que se pueden preparar al mezclar el (los) antagonista ( s ) de RAR y el (los) agonista(s) de RXR con excipientes soportadores no irritantes, adecuados, tal como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorio que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a la temperatura corporal y por lo tanto se funden en el recto o cavidad vaginal y liberan los fármacos. Las composiciones de la presente invención también se pueden administrar en la forma de liposomas. Como se conoce en la técnica, los liposomas se derivan en general de fosfolípidos u otras sustancias lipídicas. Los liposomas se forman por cristales líquidos hidratados, mono- o multi-laminares que se dispersan en un medio acuoso. Se puede usar cualquier lípido fisiológicamente aceptable y metabolizable, no tóxico, capaz de, formar liposomas. Las presentes composiciones en forma de liposoma pude contener, además del antagonista ( s ) de RAR, y el agonista(s) de RXR estabilizadores, conservadores, excipientes, y similares. Los lipidos preferidos son los fosfolípidos y las fos fa t idi Ico 1 inas (lecitinas), tanto naturales como sintéticas. Los métodos para formar liposomas se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Prescott, Ed . , Meth. Cell Biol. 14:pp. 33 et seq ( 1976) ) .

Dosificación Por la invención, se puede administrar un agonista de RXR in vitro, ex vivo o in vivo a células para mejorar la respuesta celular a un antagonista de RAR. Un experto en la técnica apreciará qué cantidades efectivas de un antagonista de RAR y un agonista de RXR se puede determinar empíricamente y se puede emplear en forma pura, o, donde existan las formas, en formas de sal, éster o profármaco, farmacéuticamente aceptable. El antagoni s ta ( s ) de RAR y el agonista(s) de RXR se puede administrar a un paciente en necesidad del mismo como composiciones farmacéuticas en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Se entenderá, que cuando se administra a un paciente humano, el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invención se decidirá por el facultativo que atiende dentro del alcance médico razonable. El nivel de dosis terapéuticamente efectiva, específico, para un paciente particular dependerá de una variedad de factores, los cuales incluyen el tipo y grado de respuesta celular que se va a lograr, actividad del antagonista específico de RAR y agonista de RXR empleado, la composición específica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente, el tiempo de administración, ruta de administración, y la velocidad de excreción del antagonista de RAR y/o el agonista de RXR. La duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o co-incidentales con el antagonista de RAR específico y/o agonista de RXR específico, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, está bien dentro de la habilidad de la técnica empezar dosis de los antagonistas de RAR y/o agonistas de RXR a niveles menores que aquellos requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente las dosis hasta que se logre el efecto deseado . Por ejemplo, se obtienen resultados satisfactorios por la administración oral de un antagonista de RAR y un agonista de RXR; a dosis en el orden desde 0.05 a 10 mg/kg/día, en forma preferente de 0.1 a 7.5 mg/kg/día, en forma más preferente de 0.1 a 2 mg/kg/día, administrados una vez o en dosis divididas, 2 a 4 veces por día. En la administ ación parenteral, por ejemplo, por goteo o infusión, se pueden usar dosis en el orden desde 0.01 a 5 mg/kg/día, en forma preferente de 0.05 a 1.0 mg/kg/día y en forma preferente de 0.1 a 1.0 mg/kg/día. Las dosis adecuadas diarias para pacientes son así en el orden desde 2.5 a 500 mg p.o, en forma preferente de 5 a 250 mg p.o., en forma más preferente de 5 a 100 mg p.o, o en el orden 'desde 0.5 a 250 mg i.v., en forma preferente 2.5 a 125 mg i.v., y en forma más preferente 2.5 a 50 mg i.v.. La dosificación del antagonista de RAR se puede arreglar como se describe en EP 0 661 259 Al, y se incorpora en la presente por referencia en su total idad . La dosificación también se puede arreglar en un paciente de manera específica para proporcionar una concentración predeterminada de un antagonista de RAR y/o agonista de RXR en la sangre, como se determina por técnicas aceptadas y la rutina en la técnica (se prefiere la HPLC) . De esta manera, la dosificación del paciente se puede ajustar para lograr niveles sanguíneos al comienzo, regulares, como se mide por HPLC, en el orden desde 50 a 1000 ng/ml, en forma preferente de 150 a 500 ng/ml . Será fácilmente aparente para un experto en las técnicas pertinentes que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas a los métodos y aplicaciones descritos en la presente son obvias y se pueden hacer sin que se aparten del alcance de la invención cualquier modalidad de la misma. Ahora habiendo descrito la' presente invención en detalle, la misma será más entendida claramente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen con la presente para propósitos de ilustración solamente y no se proponen para que limiten la invención.

E emplos Materiales y Métodos Los siguientes materiales y métodos se usaron en general' en todos los ejemplos a menos que se señale de otra manera.

Determinación de las actividades agoní s ticas/antagoní s ticas de los ligandos específicos de RAR. Líneas de células indicadoras HeLa que contienen un gen indicador de luciferasa inducible por retinoide (17 m) 5-globin-Luc en las construcciones indicadores, establemente transíectadas GAL-RARa, GAL-RARß o GAL-RAR? sé construyeron y usaron como se describe previamente (Chen, J.Y., y colaboradores, EMBO J. 14:1187-1197 (1995)') . Las células se trataron con ligandos específicos de RAR; y bioluminescencia inducida por luciferasa se inspeccionó in vivo usando una cámara de conteo de fotones, individual (Hamamatsu) al sembrar cantidades iguales de células placas de cultivo de tejido de 24 pozos e incubándolas con concentraciones crecientes de retinoides solos, o en la presencia de T-RA para determinar el potencial antagoní s t ico de los ligandos.

Determinación de la di erenciación de células NB4. Se obtuvieron células NB4 de ATCC y se cultivaron en RPMI-1640 (más L-glutamina 2 mM) que contiene 100 unidades /mi ero 1 i tro de penicilina y estreptomicina y 8 * de suero bovino fetal (FBS) . Las células se trataron durante veinticuatro días con retinoide(s) o vehículo de etanol, luego se lavaron y se redispersaron a una velocidad de 5 x 10' células/ml. Se esparcieron alícuotas de 50 microlitros de esta suspensión sobre portaobjetos revestidos con pol i -L- 1 is ina (Sigma, St. Louis, Missouri) . Después del lavado con PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na.HP0 , 4.3 mM, KH2P04 1.4 M) las células se fijaron durante 10 minutos en formalina al 2 % (formaldehído al 37 % en 15 % de metanol en agua) a temperatura ambiente. Determinación con tetrazolio de nitroazul: Después de la fijación, las células se lavaron tres veces en PBS y se calificaron por la reducción de tetrazolio de nitroazul inducida por TPA (12-0-tetradecanoil- forbol- 13-acetato, 200 ng/ml) (Sigma Fast BCIP/NBT) durante 30 minutos a 37°C. Se examinaron las muestras para la morfología celular y nuclear con un microscopio óptico (Diavert Leitz); el porcentaje de las células diferenciadas se determinó al contar al menos 300 células por cada tratamiento . Determinación anti-PML por inmuno luorescencia . Después de la fijación, las células se permeabi 1 i zaron con tritón X-100 al 0.1 % en PBS (amortiguador A) . Después del lavado en PBS, las células se bloquearon en IgG de cabra, normal, 0.5 mg/ml (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Mane) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Y posteriormente se incubaron durante la noche a 4°C con un anticuerpo anti-PML, policlonal (la donación del r. Anne Dejean), se diluyó en amortiguador A que contiene 0.5 mg/ml de IgG de cabra normal (amortiguador B) a 4 ° C . Después de 3 lavadas en el amortiguador A, las células se incubaron con IgG anti-conejo de asno (H+L) conjugada con cianina 3 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) en amortiguador B durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de los lavados en PBS, las muestras montadas se examinaron con un microscopio de láser confocal (TCS, Leica) equipado con equipo óptico de cianina para la localización de PML.

Determinación de la Apóptosis de las células NB .

Análisis citométrico de flujo. La distribución del ciclo celular y la presencia de células "sub-2N" en partículas en las células NB4 tratadas con retinoide y de control, se determinaron por la citometría de flujo del ciclo celular basada en el contenido de ADN, usando un clasificador de células de EPICS Profile II (Coulter Electronics, Inc., Hialeah, Florida) equipado con un láser de argón e 15 watt sintonizado a una longitud de onda de 488 nm y aparatos de filtro que proporcionan una longitud de onda de misión de 575 nm . Los cultivos de las células no tratadas o tratadas con retinoide se centrifugaron (250 x g) y se fijaron en etanol al 70 % y se almacenaron a -20°C. después de los lavados en PBS, las células y las partículas subcelulares se incubaron en 1 mg/ml de RNAsa (59 unidades Kunitz/mg, Sigma (chemical Co . St. Louis, Missouri) durante 30 minutos a 37°C, se centrifugaron y se redispersaron en PBS a una concentración DE aproximadamente 106 células por mL . Se adicionó bromuro de etidio a una concentración final de 50 microgramos/ml inmediatamente antes del análisis de la muestra.

Análisis de fragmen ación de ADN. La inducción de apóptosis por retinoides también se determinó por la apariencia de una "escalera" del ADN fragmentado como se describe previamente (Nagy, L., y colaboradores, Mol. Cell Biol. 15:3540-3551 (1995) ) . Las células se realimentaron con medio fresco y retinoides cada 2 días, y la densidad celular se mantuvo bien por abajo de la saturación a fin de prevenir la muerte celular debido al agotamiento de nutrientes y/o mitógenos. Cinco microgramos por senda de ADN se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa 1.5 %, seguido por la tensión con bromuro de etidio, y se visualizaron bandas de ADN se cromatografiaron vía iluminación ultravioleta de la fluorescencia de bromuro de etidio.

Impresión de RARß2 y expresión de RARß, ?, in vivo . PCR mediada por ligación. Se cultivaron células NB4 como se describe anteriormente. Las células P19.6 se obtuvieron a partir de ATCC y se cultivaron en el medio de Eagle modificado de Dulbecco que contiene FBS normal al 5 % y FBS deslipidado, al 5 l . Las células NB4 se trataron con ya- sea etanol o los retinoides indicados (Figura 6) durante 24 horas. Después del lavado en PBS. Las células se trataron con dimetilsulfato al 0.1 % (DMS; Aldrich) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se extrajo el ADN de alto peso molecular y se escindió con piperidina. El tratamiento con DMS in vitro del ADN desnudo se hizo como se describe (Mueller, P.R., y Wold, B. Science 246:780-786 (1989)) . A reacción en cadena de la polimerasa mediada por ligación (LM-PCR) se realizó como se describe (Garrity, P.A., y Wold, B.J. Pro. Nati. Acad. Sci. USA 89 1021-1025 (1992)), excepto que se usó ADN-polimerasa DEEPVENTMR (exo") (New England BioLabs, Beverly, Massachussetts ) . Los oligonucleótidos usados en la LM-PCR para detectar las interacciones en la hebra de codificación fueron : a) Promotor RARß2 humano: Cebador 1 5 ' -CCCCCTTTGGCAAAGAATAGAC-3 ' (SEQ ID No. 1) Cebador 2 5-AGAATAGACCCTCCTGCCTCTGAAC- 3 ' (SEQ ID No . 2) Cebador 3 5' -ACCCTCCTGCCTCTGAACAGCTCACTTC (SEQ ID No. 3) b) Promotor RARß2 de ratón Cebador 1 5 ' -CCCCCTTTGGCAAAGAATAGAC- 3 (SEQ ID No. 1) Cebador 2 5 ' -AGAATAGACCCTCCTGCCTCGGAG-3 ' (SEQ ID No. 4) Cebador 3 5 ' -ACCCTCCTGCCTCGGAGCAGCTCACTT-3 (SEQ ID No. 5) . Cada cebador 3 (SEQ ID No. 3 y 5) se marcó en el extremo 5' con [?-3-P]ATP usando la T4-polinucleótido-cinasa. Después de la PCR, los productos marcados se resolvieron en un gel de secuenciación al 4.8 - y los geles se secaron y expusieron una película de Rayos x para la producción de autorradiogramas .

PCR con transcriptasa invertida. Se aisló ARN total y se transcribió de manera invertida en una solución de amortiguador que comprende Tris-HCl (pH 8.3), KCl 50 M, MgCl2 2 mM, y 1 M de los cuatro trifosfatos de desoxinucleósidos , usando 25 unidades de transcriptasa invertida de AMV en la presencia de 50 unidades de ARNsin durante 60 minutos a 42°C. Para la transcripción invertida, 25 picomoles por reacción del cebador antisentido común 5' -GACATGCCCACTTCAAAGCACTTC-3' (SEQ ID No. 6) para ya sea RARa, ß o ? se usaron. Para cada reacción de PCR, el cebador antisentido, común marca un cuarto del producto transcripto de manera invertida y los siguientes cebadores homosent idos , específicos, se usaron . RARa humano: 5 ' -ACCCCCTCTACCCCGCATCTACAAG-3 ' (SEQ ID No. 7) RARß humano: 5 ' -CTCGTCCCAAGCCCCCCATCT-3 ' (SEQ ID No. 8) RAR? humano: 5 ' -ACAAGCCATGCTTCGTGTGCAAT- 3 ' (SEQ ID No . 9) . La amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 0.1 mi, usando Taq-ADN-pol imerasa (Perkin Elmer Cetus) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ochenta ciclos de PCR (30 segundos a 94°C, 30 segundos a 65°C y 30 segundos a 72°C) se realizaron; y se analizó una alícuota de 10 microlitros de cada reacción por electroforesis en un gel de poliacrilamida nativa al 6 %, que luego se tiñó con bromuro de etidio y se examinó por iluminación ultravioleta.

Ejemplo 1: Activación Inducida por RAR y RXR Se usaron retinoides sintéticos selectivos al- receptor (Chen, J.-Y., y colaboradores, EMBO J. 14:1187-1197 (1995)) (Figura 1), para investigar las contribuciones de RARa/ PML-RARa, RARß, RAR? y RXR a los casos moleculares y celulares que conducen a la diferenciación de las células NB4 (Lanotte, M., y colaboradores, Blood 77:1080-1086 (1991)) en el tratamiento con T-RA. Como se muestra en la Tabla 1, el agonista Am80, que es específico de RARa < 1 nM (Chen, J.-Y., y colaboradores, EMBO J. 14:1187-1197 (1995)), indujo eficientemente la diferenciación. Los retinoides que carecen de la actividad agonística de RARa (compuesto A y compuesto C; Chen, J.-Y., y colaboradores, EMBO J. 14:1187-1197 (1995)); Compuesto B y compuesto D, FIG. 1. SR11237 ( Lehmann, J . M . y colaboradores, Science 258:1944-1946 (1992)), fueron no efectivos por sí solos (Tabla 1, Figuras 3b, c) . El compuesto C es el compuesto descrito en el Ejemplo 23 en la Solicitud de Patente Europea No. EP 0 661 259, que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. El compuesto D es el compuesto descrito en el Ejemplo 1 de la Solicitud de Patente Europea No. EP 0 747 347, que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. Además, la diferenciación inducida por Am80 1 nM se bloqueó completamente por un exceso del compuesto B, un antagonista de RARa, puro (no mostrado) . Estos resultados demuestran que la inducción de la actividad transcripcional de AF-2 ya sea el alelo de RARa no fusionado y/o la porción de RARa de PML-RARa es suficiente para mitigar el bloque de diferenciación que resulta de la formación de una proteína de fusión de PML-RARa. Se señala que la trans rrepres ion de API por RARa es improbable que juegue un papel crítico en la diferenciación de las células NB4 inducida por RA, puesto que los retinoides "disociados" tal como el compuesto A, si bien reprimen eficientemente la actividad de API vía los tres RAR (Chen, J-Y., y colaboradores EMJO J. 14:1187-1197 (1995)), no inducen la diferenciación por sí solos (Figura 2b y no mostrados) . Después de 4 días el tratamiento con T-RA o agonistas de RARa, en el análisis de FACS mostró que las células NB4 tienen una actividad mitótica reducida y se acumularon en G1/G0 (Figuras 4b y e) . En el día 6, las partículas sub-2N se acumularon en los cultivos tratados en T-RA (Figura 4c) y en el día 8, la fragmentación de ADN masiva indicó apóptosis extensiva (Figuras 4d, f y Figura 5, sendas 6, 7) . Se señala que el análisis de dispersión delantera y lateral de las mismas preparaciones celulares confirmaron estos resultados (no mostrados) . Como en el caso de la diferenciación, solo los agonistas de RARa (pero no RARß o RAR?) podrían inducir esta secuencia de eventos (Tabla 1, y no mostrados) . Antes de la diferenciación, y como se reportó previamente (Dyck, J.A., y colaboradores, Cell 76:333-343 (1994), Weis, K., y colaboradores, Cell 76:345-358 (1994), Koken, M.H, y colaboradores EMBO J. 13:1073-1083 (1994)) para T-RA, los agonistas de RARa indujeron la asociación de PML/PML-RARa endógena con cuerpos nucleares (Figura 3e), en tanto que los antagonistas de RARa no lo hicieron (Figura 3f, y datos no mostrados) . Además, la impresión del ADN in vivo mostró que la ocupación de los elementos de respuesta del ácido retinoico tipo DR5 (DR5-RARE) presentes en el promotor de RARß2; así como el reclutamiento de otros reactores de unión al promotor, se indujo por agonistas de RARa, pero no por antagonistas (Figura 5, sendas 3, 5 y 6) . Aparte de diferencias menores, estas impresiones fueron casi indistinguibles de aquellas reportadas originalmente para las células del carcinoma embriónico, P19 de ratón (Dey, A., y colaboradores, Mol. Cell Biol. 14:8191-8201 (1994)) (Figura 6b, sendas 3, 6, 7) . La expresión de RARß2 (y RAR?) inducida por Am80 se confirmó por RT-PCR (no mostradas), no se vio inducción con los antagonistas de RARa solos (Compuesto A en Figura 6c, y no mostrado) .

Reti- Porcentaje de células NB4 diferenciadas noide +100 nM SR 11237 (nM) T-RA 9C-RA Am80 Compuesto Compuesto Compuesto Compuesto SR Am80 Compuesto Compuesto A B C D 11237 A B 0.1 _1 - < 1 - < 1 - - 0.3 - - < 1 - 20 - - 0.5 - - < 1 - 40 - - 1 < 1 < 1 80 - 80 < 1 < 1 < 1 4 81 - - 65 3 100 81 65 80 - - 78 5 1000 80 70 __ < 1 < 1 < 1 < 1 < 2 — — 10 1 « \\ no realizado Ejemplo 2: Sinergismo entre ligandos específicos de RAR y RXR.

El posible papel de RXR en los casos anteriores, más allá de un solo compañero para la heterodimeri zación, se investigó al analizar si los ligandos específicos de RAR y RXR pudiesen tener sinergismo. En realidad, en la presencia del agonista SR11237 específico de RXR, el Am80 fue significantemente más eficiente en la inducción de la diferenciación a bajas concentraciones (Tabla 1; se señala que SR11237 solo no indujo diferenciación, (Figura 3c) De manera notable e inesperada, en combinación con SR11237 aún el compuesto A antagonista de RARa indujo diferenciación con mayor eficiencia que T-RA o 9C-RA (Tabla 1; Figura 3d) . Es improbable que esa diferenciación pueda ser debida a la autoinducción de RARß2 por la actividad agonística de RARß (Figura 1) del compuesto A en la presencia de SR11237, puesto que el compuesto C (Figura 1), un fuerte agonista de RARß que el compuesto A (Chen J-Y., y colaboradores, EMBO J. 14:1187-1197 (1995)), no tiene sinergismo con SR11237 para inducir la ocupación del promotor de RARß2 (Figuras 6a, b), la producción o diferenciación de ARNm de - RARß2 (no mostrada) . Además, el compuesto B, un antagonista de RARa, "puro" no se une a RARß o RAR? (Figura 1), también indujo diferenciación en la presencia de SR11237, en tanto que el compuesto de, agonista de RAR?(ß), que no puede unirse a RARa, no lo hace (Tabla 1 y no mostrado) . La mayor eficiencia del compuesto B con relación al compuesto A se puede relacionar a su baja afinidad de unión para RARa (Figura 2, y no mostrado ) . Conjuntamente, los resultados anteriores indican claramente que RARa (o PML-RARa) está comprendido específicamente en la inducción sinergística de la diferenciación en la presencia del agonista de RXR. El sinergismo entre RARa y los ligandos de RXR no se observó solo para la diferenciación, sino también para la apóptosis subsecuente. Esto se demostró por el fuerte efecto antiproliferativo y apoptótico de una combinación del compuesto A, antagonista de RARa, junto con el agonista de RXR, SR11237, cada uno de los cuales fue ineficiente solo (Figuras 4g y h, Figura 5), y el análisis de dispersión delantera y lateral, (no mostrado) . La diferenciación y apóptosis inducida por el compuesto A/SR11237 se presidió por una asociación de PML-RARa con cuerpos nucleares que fueron indistinguibles de aquellos vistos en la presencia de los agonistas de RARa (Figura 3g y h) . Además, la ocupación del reclutamiento del factor RARß2, RARE (Dey, A., y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 14:8191-8201 (1994)) al promotor de RARß2 in vivo también se indujo cuando se trataron las células para el compuesto A y SR11237 (Figura 6a) . Este tratamiento condujo a una acumulación eficiente del ARNm de RARß y RAR? (Figura 6 c ) . Al mantener seca esta incapacidad para tener sinergismo con SR11237 para la diferenciación, el otro antagonista de RARa/agonis ta de RARß, Compuesto C, ni fue capaz de inducir la asociación de cuerpos nucleares de PML-RARa (no mostrado) ni la ocupación del promotor RARß2 ( Figura 6a) .

Discusión General Se ha sugerido previamente que la función de activación de la transcripción dependiente de ligando de RXR, AF-2 está ausente en los complejos de señalización, he terodiméricos , del receptor de RAR-RXR (Kurokawa, R., y colaboradores, Nature 371:528-531 (1994); Forman, B.M., y colaboradores, Cell 81:541-550 (1995); Mangelsdorf, D.J., y Evans, R.M., Cell 83:835-850 (1995)) . En contraste, los presentes resultados demuestran que en células de leucemia promielocí tica, aguda, humana, NB4 (APL), las impresiones in vivo del elemento de respuesta de RA del promotor de RARß2 y la expresión de ARNm de RARß2 se puede inducir no solo por el tratamiento con retinoides específicos de ARAa- (y no RARß, RAR? o RXR) , solos, sino también por la combinación de ciertos antagonistas de ARAa con un agonista de RXR puro. Además, estas combinaciones reducen la reubicación de PML a cuerpos nucleares y la diferenciación de células NB4 antes de la apóptosis. Estos resultados indican que los efectos ejercidos por los retinoides en las células APL se mediaron por los heterodímeros entre RARa (o PML-RARa y RXR) , en los cuales en la AF-2 de solo un compañero necesita ser transcr ipc iona lmente competente. De esta manera, los agonistas de ARAa indujeron dos casos separables. Un caso que se requiere para la unión de los heterodímeros de RXR-RARa al ADN in vivo y permite que el AF-2 de RXR se active por agonistas, se puede inducir por ya sea un agonista de RARa o ciertos antagonistas de RARa, mientras que el otro caso que induce la actividad de AF-2 de RARa se puede ejercer por los agonistas de RARa solos. El sinergismo entre los ligandos de RAR y RXR es difícil de conciliar con la conclusión de los informes previos (Kurokawa, R., y colaboradores, Nature 371:528-531 (1994); Forman, B.M., y colaboradores, Cell 81:541-550 (1995)) que el RXR es un compañero transcripcionalmente ausente en los heterodímeros de RXR-RAR tanto en los RARE de DRl y DR5 (revisado en Mangelsdorf, D.J. y Evans, R.M., Cell 83:835-850 (1995)) . Específicamente, como podría un heterodímero que comprende un RARa unido a la antagonista y un RXR unido al agonista unirse a, y activar la transcripción del promotor de RARß2, si el RXR fue incapaz de unirse a su ligando cuando se asoció con el ADN. En realidad, uno de los informes anteriores (Forman, B.M., y colaboradores, Cell. 81:541-550 (1995)) distingue entre los sujetos inhibitorios del RAR unido al ligando y dímero de ligando en la actividad de RXR. Además, en contraste a los informes anteriores (Kurokawa, R., y colaboradores, Nature 371:528-531 (1994); Forman, B.M., y colaboradores, Cell. 81:541-550 (1995)), estudios más recientes (Kersten, S., y colaboradores, Biochemistry 35:3816-3824 (1996); Apfel, R., y colaboradores, J. Biol. Chem. 270:30765-30772 (1995)) han concluido que ambos compañeros de los heterodímeros de RXR-RAR se unen a su ligando similar a pesar de su unión al ADN, soportando de esta manera la conclusión previa redactada de los experimentos de transfección que ambos compañeros pueden estar transcripcionalmente activos (Durand B., y colaboradores, Cell. 71:73-85 (1992) ) . A pesar de lo que puede ser la base de los resultados in vitro en conflicto, es claro que in vivo el compañero de RXR de los dímeros de RXR-RAR puede corresponder a un ligando agonístico, y por lo tanto, debe unírsele. Al mantenerse con esta conclusión, se ha reportado previamente el sinergismo in vivo entre los agonistas de RAR y RXR (Roy, B., y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 15:6481-6487 (1995), Apfel, R., y colaboradores, J. Biol. Chem. 270:30765-30772 (1995)) . Los presentes estudios muestran que, a niveles altos, los agonistas de RAR son suficientes para inducir los programas genéticos que conducen a la diferenciación y apóptosis de las células NB4, así como la transcripción del promotor de RARß2. En contraste, un agonista de RXR fue inactivo al menos que se asocie con un agonista de RAR, o ciertos antagonistas de RAR: Por lo tanto, parece que (i) la estructura apo-RAR en el heterodímero de RXR-RAR es incompatible con los casos que son necesarios para la transactivación in vivo, y (ii) la transactivación por el heterodímero de RXR-RAR comprende dos casos mediados por RAR. Un caso que se requiere para la unión de los heterodímeros de RXR/RARa al ADN in vivo y permite que el AF-2 de RXR se-active por agonistas, se puede inducir por ya sea un agonista de RARa o ciertos agonistas de RARa. El otro efecto induce actividad de AF-2 de RARa y se puede ejercer por los agonistas de RARa, solos. En la extensión de los presentes resultados a otros genes objetivos de RA; la conclusión que una de las dos funciones ejercidas por los ligandos de RAR en los he t erodimeros de RXR-RAR es necesaria para los ligandos de RXR para activar la transcripción del gen objetivo in vivo tiene implicaciones importantes. Los RAR "dominarán" sobre sus compañeros de RXR, y la presencia de agonistas de RXR amplificará el efecto de, pero no sustituirá, los ligandos de RAR. Se señala a este respecto que el ligando específico de RXR, SR11237 por sí solo fue incapaz de inducir la diferenciación y la expresión de los genes objetivos de RA en células F9 y P19 (Roy, B., -y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 15:6481-6487 (1995)) . Lo mismo puede ser cierto para las rutas de señalización mediadas por el heterodímero de RXR que comprenden las hormonas tiroides y la Vitamina D3, mientras que para los otros heterodímeros de RXR (Mangelsdorf , D.J. y Evans, R.M., Cell 83:835-850, 1995)) los ligandos de RXR pueden actuar como moléculas de señalización independientes. El diseño y estudio de agonistas y antagonistas de RAR y RXR, adicionales, por los métodos descritos en la presente indicará si este concepto de "dominación" de RAR sobre RXR se puede generalizar, y a qué grado otros ligandos sintéticos podrían superar o modificar esta "dominación". Ni la especificidad de RARa ni el sinergismo entre RARa/Compues to A y RXR/SR11237 son específicos de las células NB4 ó PML-RARa. Las células de leucemia mi eloblás t ico , HL-60, humanas, que carecen de la proteina de fusión de PML-RARa respondieron igualmente a las células NB4 a varias combinaciones de ligandos con respecto a la ubicación de promotor RARß2, la acumulación de ARNm de RARß2 y la diferenciación (no mostrada) . Sin embargo, se reportado que, en contraste las células NB4, la apóptosis de las células HL-60 no se puede lograr con un agonista de RAR solo, y requiere específicamente la presencia de un agonista de RXR (Nagy, L, y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 15:3540-3551 (1995)). La ocupación del promotor de RARß2 y la acumulación de ARNm de RARß2 también se observó en las células de carcinoma embriónicas P19 (EC) tratadas con una combinación de un antagonista de RARa y un agonista de RXR (Roy, B. y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 15:6481-6487 (1995)) (Figura 3b) . En contraste marcado, en las células EC F9 la misma combinación de ligandos no indujo ni la expresión de RARß2 ni la diferenciación (datos no mostrados) . De esta manera, tomados junto con la capacidad de los retinoides "disociados" (Chen, J.-Y., y colaboradores, EMBO J. 14:1187-1197 (1995)) para reprimir la actividad de API; los presentes resultados sugieren que puede ser posible iniciar los programas génicos complejos de una manera específica de la célula por la expresión apropiada de , (o combinación de) retinoides sintéticos con características predefinidas. La selectividad y el potencial sinergístico de los ligandos de RAR y RXR, que permiten concentraciones drásticamente reducidas de los compuestos individuales para lograr actividad biológica, tienen una promesa considerable para extender las aplicaciones terapéuticas de los retinoides naturales y sintéticos y los análogos de retinoides . Habiendo descrito ahora completamente la presente invención, en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y entendimiento; será obvio para un experto en la técnica que lo mismo se puede realizar al modificar o cambiar la invención dentro de un intervalo amplio y equivalente de condiciones, formulaciones y otros parámetros sin que se afecte el alcance de la invención o cualquier modalidad específica de la misma, y que estas modificaciones o cambios se proponen para ser abarcados dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación indicativas del nivel de habilidad de aquellos expertos en la técnica a la cual corresponde esta invención, y se incorporan en la presente por referencia al mismo grado como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente se indicara específicamente de manera individual para ser incorporada por referencia.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Institut National de la Santé et de la Recherche Medical (B) CALLE: 101 Rué Tolbiac (C) CIUDAD: Paris Cedex 13 (D) ESTADO: (E) PAÍS: Francia (F) CÓDIGO POSTAL: 75654 (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Centre National de la Recherche Scientifique (B) CALLE: 3 Rué Michel Ange (C) CIUDAD: Paris Cedex 16 (D) ESTADO: (E) PAÍS: Francia (F) CÓDIGO POSTAL: 75794 (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Université Louis Pasteur (Bj CALLE: 4 Rué Blaise Pascal (C) CIUDAD: Strasbourg Cedex (D) ESTADO: (E) PAÍS: Francia (F) CÓDIGO POSTAL: 67070 5 (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Bristol-Myers Squibb Company (B) CALLE: Route 206 & Provinceline Road (C) CIUDAD: Princeton 10 (D) ESTADO: New Jersey (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 08543-4000 (i) INVENTOR: 15 (A) NOMBRE: Pierre Chambón (B) CALLE: 4 Rué A. Schweitzer (C) CIUDAD: Blaesheim (D) ESTADO: (E) PAÍS: Francia 20 (F) CÓDIGO POSTAL: 67113 (i) INVENTOR: (A) NOMBRE: Hinrich Gronemeyer (B) CALLE: 1A Uhlandstrasse (C) CIUDAD: Oberkirch (D) ESTADO: (E) PAÍS: Alemania (F) CÓDIGO POSTAL: 77704 (i) INVENTOR: (A) NOMBRE: Peter R. Reczek • (B) CALLE: 100 Forest Avenue, Department 842 (C) CIUDAD: Buffalo (D) ESTADO: New York (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 14213-1091 (i) INVENTOR: • (A) NOMBRE: Jacek Ostrowski (B) CALLE: 100 Forest Avenue, Department 842 (C) CIUDAD: Buffalo (Dj ESTADO: New York (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 14213-1091 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN:' COMBINACIONES TERAPÉUTICAS DE ANTAGONISTAS DE RAR Y AGONISTAS DE RXR Y USOS DE LOS MISMOS (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 9 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: compatible con IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 60/024,772 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-AGO-1996 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: senc.lla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi ) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ . ID No : 1 : CCCCCTTGGG CAAAGAATAG AC 22 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 2 : AGAATAG?CC CTCCTGCCTC TGAAC 25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 3 : ACCCTcrrcc CTCTGAACAG CTCACTTC 28 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (Xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 4 AGAATAGACC CTCCTGCCTC GGAG 24 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 5 : ACCCTCCTGC CTCGGAGCAG CTCACTT 27 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal di) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 6 ; GACATGCCCA CTTCAAAGCA CTTC 24 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc !xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 7 : ACCCCCTCTA CCCCGCATCT ACAAG 25 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 8 : CTCGTCCCAA GCCCCCCATC T 21 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 9 : ACAAGC ATG CTTCGTGTGC AAT 23 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar un animal que sufre de, o está predispuesto a, un desorden físico, el método está caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad efectiva de una composición que comprende al menos un antagonista de RAR y al menos un agonista de RXR.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista de RAR, es un antagonista de RARa.

3. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el antagonista de RARa es el compuesto A o el compuesto B .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agonista de RXR es SR11237.

5. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende al menos un antagonista de RAR, al menos un agonista de RXR y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el antagonista de RAR es un antagonista de RARa.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el antagonista de RARa es el compuesto A o el compuesto B.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el agonista de RXR es SR11237.

9. Un método para tratar un animal que está sufriendo, de, o está predispuesto a, un desorden físico, caracterizado porque comprende administrar al animal la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 5-8.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó reivindicación 9, caracterizado porque el desorden se selecciona a partir del grupo que consiste de un cáncer, un desorden de piel, artritis reumatoide y lesión premaligna.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste de un cáncer de piel, un cáncer de cavidad oral, un cáncer de pulmón, un cáncer de glándula mamaria, cáncer prostético, un cáncer de vesícula, un cáncer de hígado, un cáncer pancreático, un cáncer cervical, un cáncer ovárico, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de colon, un cáncer de células germen, y leucemia .

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el cáncer de piel es un melanoma o sarcoma de Kaposi.

13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el cáncer de células germen es un teratocarcinoma .

14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la leucemia es leucemia promielccí tica aguda.

15. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el desorden de piel se selecciona a partir del grupo que consiste de psoriasis, queratosis actínica, acné, ictiosis, fotoenvej ecimiento y atrofia de piel inducida por corticosteroides .

16. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó la reivindicación 9, caracterizado porque el animal es un humano.