MXPA99001582A - Uso de un gen asociado de diferenciacion de melanoma (mda 7) para invertir un fenotipo canceroso - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a uso de unácido nucleico que comprende un gen-7 asociado de diferenciación de melanona para la preparación de un medicamento para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer en un sujeto, en donde la célula de cáncer se selecciona del grupo que consiste de una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer cervical, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer nasofaríngeo, una célula de cáncer de pulmón y una célula de cáncer de tejido conectivo.

Description

USO DE UN GEN ASOCIADO DE DIFERENCIACIÓN DE MELANOMA (mda 7) PARA INVERTIR UN FENOTIPO CANCEROSO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de E.U.A. No. de Serie 08/696,573, presentada el 16 de junio de 1996, el contenido de la cual se incorpora en esta solicitud para referencia. La invención aqui descrita fue hecha con el soporte del gobierno bajo la Garantía NCI/NIH No. CA35675 del Departament of Health and Human Services. Por consiguiente, el Gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención. A través de esta solicitud, se presentarán varias referencias entre paréntesis. Las descripciones de estas publicaciones en sus totalidades están incorporadas aquí para referencia en esta solicitud para describir más completamente el estado de la técnica a la cual pertenece esta invención. Las citas bibliográficas completas de estas referencia pueden encontrarse al final de cada serie de experimentos. i 25 ir Anteceden es de la Invención El cáncer es un proceso de factores múltiples y pasos múltiples complejo que implica a la expresión y supresión coordinada de genes -que funcionan como reguladores positivos y negativos de oncogénesis (1-5) . Las estrategias de clonación directas, basadas en la transferencia de una transformación de dominante o genotipo t umo r i gen i co , han identificado oncogenes de activación positiva (6-9) . En contraste, la detección y clonación de genes que suprime el fenotipo de cáncer ha probado ser más sensible y evasivo (10-15) . Un aspecto directo para aislar genes directamente involucrados en la regulación del crecimiento y diferenciación implica la hibridación de substracción entre colecciones de ADNc construidas de células de cáncer activamente en desarrollo y colecciones de cáncer ADNc de células de cáncer inducidas para perder capacidad de proliferación irreversiblemente y terminalmente diferenciadas (13,14) . Esta estrategia experimental ha sido aplicada a células de melanoma humano, inducidas para diferenciar terminalmente a través del tratamiento con interferon humano recombinante ß (IFN-ß) y mezereina (MEZ) , dando como resultado la clonación de genes asociados de diferenciación de melanoma novedosas ( m da ) no previamente descritos en base de datos de ADN (13,14) . Un papel directo para genes m da específicos en la mediación del crecimiento y control del ciclo de célula es evidente por la identificación y clonación de m da - 6 (13,16) , que es idéntica al inhibidor ubiquitoso de sin asas dependientes de ciclina p21 (17) . La importancia de p21 en el control de crecimiento está bien documentada y este gen ha sido independientemente aislado como WAF-1, CIF-1, y SDI-1, a través de un número de laboratorios utilizando diferentes aspectos (18-20) . Estos estudios indican que genes específicos asociados con el control proliferativo son inducidos y pueden contribuir a los procesos de interrupción de crecimiento y diferenciación terminal en células cancerosas humanas. El gen m da - 7 fue clonado a partir de un inductor de diferenciación de una colección sustraída de (IFN-ß más MEZ ) -me 1 anoma humano tratado (H0-1) (13,14) . El ADNc de m da - 7 de longitud completa es de 1718 nucleótidos, y el marco de lectura abierto mayor codifica una proteína novedosa de 206 aa con un Mr de 23.8 kDa (21) . Estudios previos indican que m da - 7 es inducido como una función de la interrupción del crecimiento e inducción de diferenciación terminal en células de melanoma humano (14,21) . La expresión de m da - 7 también se correlaciona inversamente con la progresión del melanoma, es decir, el desarrollo activo de melanocitos humanos normales expresa más m da - 7 que las células de melanoma humano metástaticas (21) . Además, m da - 7 esta desarrollando capacidad inhibidora hacia las células de melanoma humanas en ensayos de transfección pasajeros y en células transformadas estables que contienen un gen m da - 7 inducible por dexametasona (DEX) (21) . Estos estudios indican que m da - 7 puede contribuir a la fisiología de melanocitos y melanomas humanos, y este gen ha desarrollado propiedades supresoras cuando se sobreexpresa en células de melanoma humana s . El gen de m da - 7 también fue descrito en la Solicitud de Tratado de Cooperación de Patente Internacional No. PCT /US 94 / 12160 , fecha de presentación internacional, 24 de octubre de 1994 con la Publicación Internacional No. 095/11986, el contenido de la cual se incorpora en esta solicitud para referencia.

Esta invención reporta que m da - 7 es un potente gel supresor de crecimiento en células de cáncer, de origen diverso, incluyendo pecho, sistema nervioso central, cervix, colón, próstata y tejido conjuntivo. Una inhibición en la formación de colonia ocurre en las células de cáncer que contienen defectos en sus genes p53 y/o retinoblastoma (RB) o carecen de expresión p53 y RB . En contraste, la expresión de m da - 7 en células epiteliales mamarias humanas normales, fibroblastos de piel humana y fibroblastos de • embrión de rata induce cuantitativamente menos supresión de crecimiento que en células cancerosas. Cuando se expresa establemente en células de carcinoma cervical humano (HeLa) , y carcinoma de próstata (DU-145) m da - 7 tiene un efecto negativo sobre el crecimiento y pr'op i edades relacionadas con la transformación. Los efectos de m da - 7 en células HeLa son reversibles después de la abrogación de la proteína MDA-7 a través de la infección con- un vector Ad5 genéticamente modificado expresando un gen m da - 7 antisentido. Estas observaciones indican que m da - 7 es un gen supresor de crecimiento novedoso con una amplia variedad de acciones inhibidoras en cáncer humano manifestando diferentes defectos genéticos'.

Breve Descripción de la Invención Esta invención proporciona un método para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer introduciendo un ácido nucleico que incluye un gen asociado de diferenciación de melanoma ( m da -7 ) en la célula bajo condiciones que permiten la expresión del gen, de manera que invierte así el fenotipo canceroso de la célula. Esta invención también proporciona un método para invertir el fenotipo canceroso de célula de cáncer en un sujeto introduciendo el ácido nucleico antes descrito en, la célula cancerosa del sujeto. Esta invención también proporciona un método para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer introduciendo el producto de un gen asociado de diferenciación de melanoma ( m da - 7 ) en la célula de cáncer con el fin de invertir así el fenotipo canceroso de la células. Esta invención también proporciona un método para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer en un sujeto introduciendo el producto de gen antes descrito en la célula cancerosa del sujeto.

Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que tiene una cantidad de ácido nucleico incluyendo un gen asociado de diferenciación de melanoma ( m da - 7 ) efectiva para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que tiene una cantidad del producto de gen del gen anteriormente descrito efectiva para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1: Efecto de la expresión de mda - 7 en la formación de colonia resistente a higromicina en células HeLa. Las células HeLa fueron transfectadas con 10 µg del vector pREP4 (vector RSV) m da - 7 clonado en una orientación antisentido en el vector pREP4 ( RSV-MDA- 7 - nt i s ent i do ) , o m da - 7 clonado en una orientación en sentido en el vector pREP4 ( RSV-MDA-7 -Sent ido ) y seleccionado en un medio conteniendo 100 µg de higromicina. Figura 2: Efecto del m da - 7 antisentido en el desarrollo de monocapa del vector pREP4 HeLa cl 1 y m da - 7 (S) expresando células HeLa cl 2. Se desarrollaron células HeLa cl 1 (vector de HeLa transformado con el vector pREP4) y HeLa cl 2 (clon de HeLa expresando m da - 7 ) en ausencia o después de la infección con 10 unidades formadoras de placa/célula con un adenovirus tipo 5 recombinante (Ad5) expresando m da - 7 antisentido [Ad. m da - 7 (AS) ] . Los resultados son el número de célula promedio de muestras por triplicado que variaron por <_ 10%. Figura 3: Efecto de m da - 7 antisentido en la proteína formadora de complejo (HMC) de MDA-7 de peso molecular alto, de proteína de MDA-7 y la proteína actina en células HeLa, HeLa cl 1, y HeLa cl 2. HeLa y HeLa cl 1 (clon HeLa transformado por el vector pREP4) fueron no infectadas (-) o infectadas (+) con 10 unidades formadoras de placa/célula de Ad.inda-7 (AS) durante 96 horas marcadas con [j5S] metionina, y los niveles de las proteínas HMC, MDA-7 y actina fueron determinados a través de análisis de inmunoprecipitación. Para HeLa cl 2 (clon de HeLa de expresión m da - 7 ) , el efecto de infección con 10 unidades formadoras de placa/ml de Ad.jOda-7 (AS) en los niveles de proteína se determinó a través de análisis - de inmunoprecipitación de lisatos de célula marcados con [35S] metionina después de +24, +48, +72 y +96 horas. El efecto de infección de células HeLa cl 2 con el mutante de control Ad5,H5dl 434, fue determinado a través de análisis de inmunoprecipitación de lisatos de célula marcados con [35S] metionina 96 horas después de la infección con 10 unidades formadoras de pl acá / cél ul a . Figuras 4A y 4B : Síntesis de ARN de m da - 7 y proteína en clones DU-145 conteniendo un gen m da - 7 que se induce mediante DEX. Figura 4A: Se desarrollaron células en ausencia o presencia de 10~6 M DEX durante 96 horas, y se aisló el ARN total, se sometió a tinción Northern y se sondeo con m da - 7 , un gen de resistencia neomicina (NeoR) y GAPDH. Figura 4B: Se desarrollaron células en ausencia o presencia de 10~6 M DEX durante 96 horas, se marcaron proteínas celulares con [35S] metionina y se inmunopr e cip i t ar on con anticuerpos de MD.A-7 reconocidos y proteínas de actina. Figura 5: Inhibición del desarrollo de exeno in j e r t o s de cáncer cervical humano establecido (HeLa) en ratones naturales atímicos. Figura 6: Efecto de Ad . m da - 7 S en las relaciones de volumen de tumor de HeLa. El resultado indica que Ad . da - 7 S puede inhibir la producción de tumor i n vi vo en ratones naturales.

Descripción Detallada de la Invención Con el fin de facilitar un entendimiento de la sección de los detalles experimentales que se presenta más adelante, ciertos métodos y/o términos actualmente existentes se describen en Sambrook, et al . ( 45 ) . Esta invención proporciona un método para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer, que comprende introducir un ácido nucleico que comprende un gen asociado de diferenciación de melanoma ( m da - 7 ) en la célula bajo condiciones que permitan la expresión del gen con el fin de invertir así el fenotipo canceroso de la célula. Esta invención también proporciona un método para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer en un sujeto, que comprende introducir una molécula de ácido nucleico comprendiendo un gen asociado de diferenciación de melanoma ( m da - 7 ) en la célula cancerosa del sujeto bajo condiciones que permiten la expresión del gen en las células del sujeto con el fin de invertir así el fenotipo canceroso de la célula.

En la técnica, son bien conocidos los métodos para introducir una molécula de ácido nucleico en células. Una molécula de ácido nucleico desnuda puede ser introducida en la célula a través de transformación directa. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede ser embebida en liposomas. Por consiguiente, esta invención proporciona los métodos anteriores, en donde el ácido nucleico es introducido en las células a través de tecnología de ADN desnudo, vector de adenovirus, vector de virus asociado con adeno, vector del virus Epstein-Barr, vector de virus de Herpes, vector de VIH atenuado, vectores retrovirales, vector de virus de vacuna, liposomas, liposomas revestidos con anticuerpos, medios mecánicos o eléctricos. Los métodos anteriormente citados son meramente presentados como ejemplos para medios confiables de introducción de ácido nucleico a células. Otros métodos conocidos también puede ser utilizados en esta invención. En una modalidad de los métodos anteriores, el gen asociado de diferenciación de melanoma ( m da -7 ) es enlazado a un elemento regulador de manera que su expresión esta bajo el control del elemento regulador. En una modalidad más, el elemento regulador puede ser inducido o constitutivo. El elemento regulador que puede ser inducido como un promotor inducido es conocido en la técnica. El elemento regulador tal como el promotor que puede dirigir la expresión constitutiva también es conocido en la técnica. En una modalidad separada, el elemento regulador es un elemento regulador específico en el tejido. La expresión del gen mda-7 entonces será específica en el tejido. En otra modalidad de los métodos anteriormente descritos, la célula de cáncer se caracteriza por la presencia dentro de lá célula de cáncer de un gen supresor de tumor defectuoso. El gen supresor de tumor defectuoso incluye, pero no se limita a un gen p53, un retinoblastoma .(RB) , o un gen pl6ink4d En una modalidad de los métodos anteriormente descritos, la célula de cáncer se caracteriza por la presencia dentro de la célula de cáncer de un oncogen de acción dominante. Específicamente, el oncogen de acción dominante puede ser un Ha-ras, p53 mutante o genes de virus de papiloma humano. El Ha-ras es un oncogen ras del virus Harvey.

En una modalidad de los métodos anteriores, el ácido nucleico comprende un vector. El vector incluye, pero no se limita a, un vector de adenovirus, un vector de virus asociado con a eno, vector de virus de Epstein-Barr, vector de virus de Herpes, vector, de VIH atenuado, vector de retrovirus y vector de virus de vacuna. En una modalidad preferida, el vector de adenovirus es un vector de adenovirus defectuoso de replicación expresando m da -7 , designado Ad.iOda-7 S. En otra modalidad, el vector de adenovirus es un vector de adenovirus competente de replicación. Esta invención también proporciona un método para invertir ed fenotipo canceroso de una célula de cáncer, que comprende introducir un producto de gen de un gen asociado de diferenciación de melanoma ( m da - 7 ) en la célula cancerosa con el fin de invertir así el fenotipo canceroso de la célula . Esta invención también proporciona un método para invertir el fenotipo canceroso de 'una célula de cáncer en un sujeto, que comprende introducir el producto de gen de un gen asociado de diferenciación de melanoma ( m da - 7 ) en la célula cancerosa del sujeto con el fin de invertir así el fenotipo canceroso de la célula. En una modalidad de los métodos anteriormente descritos, la célula de cáncer incluye, pero no se limita a, una célula de pecho cervical, colón, próstata, nasofaríngea, tejido conjuntivo de pulmón o célula de sistema nervioso. La célula de cáncer además incluye células de glioblastoma multiforme, linfomas y leucemia. Esta invención también proporciona una composición farmacéutica, la cual comprende una cantidad de un ácido nucleico que comprende un gen asociado de diferenciación de melanoma ( m da - 7 ) efectivo para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" abarca cualquiera de los vehículos farmacéuticos normales. La composición farmacéutica puede ser constituida en cualquier forma adecuada para el modo de administración seleccionado. Las composiciones adecuadas para administración oral incluyen formas sólidas tales como pildoras, cápsulas, granulos, tabletas y polvos, y formas líquidas tales como soluciones, jarabes, elixires y suspensiones. Las formas útiles para administración parenteral incluyen soluciones, emulsiones y suspensiones estériles . En una modalidad, el ácido nucleico comprende un vector. El vector incluye, pero no se limita a, un vector de adenovirus, un vector de virus asociado con adeno, un vector de virus Epstein-Barr, vector de virus de Herpes, virus de VIH atenuado, vector de retrovirus y vector de virus de vacuna. En una modalidad preferida, el vector, de adenovirus es un vector de adenovirus defectuoso de replicación que expresa m da - 7 , designado Ad . m da - 7 S. En otra modalidad, el adenovirus es un vector de adenovirus competente de replicación. Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad del producto de gen de un gen asociado de diferenciación de melanoma ( m da - 7 ) efectiva para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad de los métodos anteriormente descritos, la célula de cáncer incluye pero no se limita a, células de pecho, cervical, colon, próstata, nasofaríngeo, tejido conjuntivo de pulmón y células del sistema nervioso. La célula de cáncer además incluye célula de glioblastoma multiforme, linfomas y leucemia. Esta invención se entenderá mejor a partir de los detalles experimentales que siguen. Sin embargo, un experto en la técnica fácilmente apreciará que los métodos y resultados específicos discutidos son meramente ilustrativos de la invención como se describen más completamente en las reivindicaciones que se presentan más adelante.

Detalles Experimentales. El cáncer es un enfermedad caracterizada por defectos en el control de crecimiento, y las células del tumor por lo regular exhiben patrones anormales de diferenciación celular. La combinación de interferon de fibroblasto humano recombinante y la mezereina de agente ant i leucémi co corrige estas anormalidades en células de melanoma humano cultivadas dando como resultado la interrupción del crecimiento irreversible y diferenciación terminal. La hibridación de sustracción identifica un gen asociado de diferenciación de melanoma ( m da - 7 ) con expresión elevada en el crecimiento interrumpido y células de melanoma humano terminalmente diferenciadas. La formación de colonias se reduce cuando mda-7 es transfectado a células de tumor humano de origen diverso y con múltiples defectos genéticos. En contraste, los efectos ' de m da - 7 en el crecimiento y formación de colonia en ensayos de transfección pasajeros con células normales, incluyendo epitelio mamario humano, fibroblasto de piel humana y fibroblasto de embrión de rata, es cuantitativamente menor que aquel encontrado con células de cáncer. Células de tumor que expresan mda - 7 elevado exhiben supresión en el crecimiento de monocapa e independencia de anclaje. La infección con un m da - 7 antisentido de expresión de adenovirus tipo 5 recombinante elimina la supresión de m da - 7 del desarrollo in vi t ro y fenotipo transformado. La habilidad de m da - 7 para expresar el crecimiento en células de cáncer que no expresan o contienen defectos tanto en el retinoblastoma (RB) y genes p53 indica una falta de implicación de estos elementos supresores de tumor críticos para mediar la inhibición del crecimiento inducido por m da - 7 . La falta de homología de proteína de m da - 7 con genes de supresión de crecimiento previamente descritos y el efecto diferencial de este gen sobre células normales contra cancerosas sugiere que m da - 7 puede representar una nueva clase de genes de supresión de crecimiento de cáncer sin actividad antitumoral.

MATERIALES Y MÉTODOS Lineas de Célula y Condiciones de Cultivo. Se desarrollaron líneas de célula de carcinoma humano, incluyendo MCF-7 y T47D (pecho) , LS174T y S 480 (colorectal) , HeLa (cervical, Du-145 (próstata) , y HONE-1 (nasofaríngeo) (9,22-25) , en un medio Eagle modificado con Dulbecco suplementado con suero de bovino fetal al 10% (DMEM-10) a 37°C en un incubador humedecido con 5% de C02/95% de aire. Bajo condiciones similares, se mantuvieron tipos de célula humana adicionales incluyendo HBL-110 (epitelio mamario normal), HO-1 y C8161 (melanoma) , GBM-18 y T98G (glioblastoma multiforme) y Saos-2 ( o s t e o s ar coma humano) . Las células epiteliales mamarias normales de pasaje anterior (HMEC; pasajes -12) se obtuvieron de Clonetics Corporation ('San Diego, CA) . Las células HMEC fueron mantenidas en un medio libre de suero como se describió por Clonetics Corporation. CREF-Trans ß (fibroblasto de embrión de ratón Físcher clonado) (9,26) y CREF Ha-ras (células CREF transformadas por el oncogen Ha-ras (T24) ) (27) fueron cultivadas en DMEM-5. HeLa cl 1 es un vector HeLa transformado del vector RSV del virus (pREP4) resistente a higromicina (HygR) Rous Sacroma.

(Invitrogen) HeLa cl 2 es un clon HeLa de expresión de m da - 7 HygR. Las células de HeLa cl 1 y HeLa cl 2 fueron construidas corao se describió (12,21) y se mantuvieron en DMEM-10 conteniendo 10 µg/ml de higromicina. Las células Du-145 ci ß y Du-145 cl 7 contienen un gen m da - 7 inducible por DEX (clonado en un vector pMAMneo) (Clontech) (21) y se mantuvieron en DMEM-10 conteniendo 200 µg/ml de G418.

Hibridación de Sustracción, Plasmidos, Construcciones de Vector de Expresión e Hibridación Northern. La identificación y clonación de m da - 7 a través de hibridación de sustracción se logró como se describió (13) . Se aisló un ADNc de m da - 7 de longitud completa cla-S i f i cando un IFN-ß a una colección de ADN de HO-1 tratada con MEZ (13) y utilizando el procedimiento de amplificación rápida de extremos de ADNc como se describió (15) . Un fragmento de ADNc de m da - 7 (posición de nucleótido 176-960) conteniendo el marco de lectura abierto se amplificó con PCR y se clonó a pCRII™ (Invitrogen) a través de clonación TA . La orientación de los insertos en los vectores se determinó a través, de formación de mapa de restricción. Las construcciones de expresión de célula humana se hicieron a través de la clonación de los fragmentos Kpn I - Xh o I a partir de los vectores PCR™ al vector pREP4 (Invitrogen) corriente abajo de un promotor RSV en una orientación de sentido [ m da - 7 (S) ] o antisentido [ m da - 7 (AS) ] . Alternativamente, el fragmento de gen de m da - 7 se clonó en el vector pMAMneo (Clontech) en una orientación de sentido y antisentido. " El aislamiento de ARN y la tinción Northern se realiza como se describió (9,12,13,21) .

Crecimiento de Monocapa, Independencia de Anclaje y Ensayos de Transfección de ADN. Se realizaron ensayos de crecimiento de monocapa e independiente de anclaje como se describió previamente (8,12,26) . Para estudiar el efecto de m da - 7 sobre la formación de colonia de monocapa, el vector [pREP4 (RSV) ] conteniendo ningún inserto, las construcciones de expresión m da - 7 (S) o m da - 7 (AS) fueron transfectadas a los varios tipos de células a través del método de lipofectina (GIBCO/BRL) y se determinó la formación de colonia resistente a higromicina o el crecimiento de célula en higromicina (12,21) .

Construcción del Vector Adenovirus de mda - 7 antisentido. El Ad..mda-7 (AS) de replicación-defectuoso recombinantes se creo en dos pasos. En primer lugar, la secuencia de codificación del -gen m da - 7 se clonó a un vector de expresión Ad modificado pAd . CMV (28) . Este contiene, en orden, los primeros 355 pb desde el extremo izquierdo del genoma Ad, el promotor temprano inmediato citomegalovirus (CMV) , el donador de rebanada de codificación de ADN y sitios de recepción, sitios de clonación para el gen descrito (en este caso m da - 7 ) , ADN que codifica una secuencia de señal poliA a partir del gen be t a-gl obina , y aproximadamente 3 kpb de secuencia de adenovirus extendiéndose desde el interior de la región de codificación E1B. Esta disposición permite la expresión de alto nivel de la secuencia clonada a través del promotor de gen temprano inmediato de CMV y el procesamiento de ARN apropiado (28) . El virus recombinante se creo i n vi vo en 293 células (29) a través de re combina c i ón homologa entre el vector que contiene m da - 7 y el plasmido JM17, el cual contienen todo el genoma Ad clonado en la versión modificada de pBR322 (30) . JM17 da surgimiento a genomas Ad i n vi vo , pero son demasiado grandes para empacar. Esta restricción es aliviada a través de la re combinación con el vector para crear un genoma que se pueda empacar (30) , conteniendo el gen de elección. El virus recombinante es defectuoso para repicación en células humanas excepto 293 células que expresan el adenovirus ElA y E1B._ Después de la transfección de los dos plasmidos, el virus infeccioso es recuperado, los genomas analizados para confirmar la reestructura recombinante, y después el virus es colocado en placa purificado, todo a través de procedimientos estándares (31) .

Producción de Anticuerpo de Péptido y Análisis de Inmunoprecipitación. Se prepararon anticuerpos de péptido contra PSQENEMFSIRD como se describió (21) . Las células HeLa, HeLa cl 1 logarítmicamente en desarrollo (vector HygR pREP4 contra el clon HeLa) , y HeLa cl 2 [clon de HeLa expresando pREP4 tranfectado por HygR m da - 7 ] fueron ya sea no tratadas o infectadas con 10 unidades formadoras de placa de adenovirus de control (H5dl434) (32) o m da -7 de expresión de adenovirus recombinante (AS) [ad.ra a-7 (AS) ] . En varios tiempos después de la infección, los cultivos carecieron de metionina durante una hora a 37°C en un medio libre de metionina, las células fueron concentradas formando en pellas y marcando durante 4 horas a 37°C en 1 ml del mismo medio con 100 µCi (lCi=37GBq) de 35S (NEN; Express 35S) . Los análisis de inmunoprecipitación con 2 µg de anticuerpo policlonal de conejo del péptido MDA - 7 o anticuerpo monoclonal de actina (Oncogene Sciences) fueron realizados como se describió. (15,21) .

RESULTADOS EXPERIMENTALES Propiedades Inhibidoras de Crecimiento Mejoradas de mda-7 en Células de Cáncer Humanas y Células de Fibroblasto de Embrión de Rata T nsfec adas con Ha-ras. Se realizaron ensayos de transfección de ADN para evaluar el efecto de la expresión elevada de m da - 7 en el crecimiento de células. Cuando se transfectaron a células de carcinoma cervical humano (HeLa) , la construcción de m da - 7 (S) dio como resultado una reducción de 10 a 15 veces en colonias HygR en comparación con el vector pREP4 y los cultivos transfectados con la construcción m da - 7 (AS) (Figura 1 y Tabla 1) . Tabla 1 Efecto de m da - 7 en la formación de colonia de monocapa de células de cáncer humano, fibroblasto de embrión de rata normal (CREF) y células CREF transformadas mediante Ha-ras.

Tipo de Célula Vector RSV3 RSV-ip a-7 (Sr RSV-iOda-7 (AS) líneas de célula de cáncer humano MCF-7 (Pecho-Ca) 118 ± 24 42 ± 16 (3.5) 146 ± 20 T47D (Pecho-Ca) 172 ± 9 44 ± 7 (4.2) 186 ± 28 HeLa (Cervix-Ca) 1571 ± 446 177±107 (15.2) 1771 ± 385 LS174T 130 ± 14 30 ± 3 (5.4) 160 + 15 (Colorectal-Ca) HONE-1 219 ± 19 71 + 8 (3.5) 250 ± 19 (Nasof aringeo-Ca ) DU-145 (Próstata-Ca) 174 ± 18 54 ± 8 (3.1) 166 + 12 T98G (Glioblastcma) 99 + 9 32 + 4 (3.6) 115 + 14 Saos-2 126 ± 22 35 + 6 (3.9) 138 + 14 (Osteosarcoma) Fibroblasto de embrión de rata CREF (embrión 60 ± 10 35 ± 5 (1.7) 66 + 7 de rata normal) CREF-ras 147 ± 16 25 + 4 (6.0) 151 + 16 (tras formada) a Células logarítmicamente en crecimiento fueron sembradas a 1 X 106 por 100 mm de placa y transfectadas con 10 µg del vector [pREP4 (RSV) ] sin contener ningún inserto, mda-7 (S), o mda-7 (AS) .

Después de 24 horas, las células se volvieron a colocar en placas a aproximadamente 2 X 105 células por 100 mm de placa en un medio conteniendo 100 µg/ml de higromicina. El medio se cambio cada 3 o 4 días y las placas se fijaron en formaldehí d'o y se tiñeron con Giemsa en el día 14 o 21. Se enumeraron las colonias conteniendo 50 o más células. Los valores mostrados son las colonias de HygR promedio en cuatro a cinco placas de replica ± S.D. b Los valores entre paréntesis indican las veces de reducción en la formación de colonia contra células transfectadas con RSV-mda-7 (AS) . c MCF-7, T47D, HeLa, LS174T, DU-145 y HONE-1 son líneas de célula de carcinoma humano (Ca) aisladas del sitio anatómico indicado. T98G es .una línea de célula multiforme de glioblastoma humano. CREF-ras es un clon CREF transformado con el oncogen Ha-ras (T24 ) . Además de formar pocas colonias, las colonias de m da - 7 (S) son generalmente de un tamaño más pequeño que las colonias de HygR cor espondientes que resultan después de la transfección con el vector pREP4 o construcciones m a-7 (AS) (Figura 1) . Cuando son transfectadas a líneas de célula de cáncer humano adicionales las construcciones de m da - 7 (S) reducen la formación de la colonia HygR en 3 a 10 veces (Tabla 1) . Estas incluyen carcinoma de pecho humano (MCF-7 y T47D) , carcinoma de colon (LS174T y SW480) , carcinoma nasofaríngeo (HONE-1), carcinoma de próstata (DU-145) , melanoma ( H 0 - 1 y C8161) , glioblastoma multiforme (GBM-18 y T98G) y osteosarcoma (saos-2) . Como se observó con las células HeLa, los tamaños promedio de las colonias HygR que se forman después de la transfección con construcciones m da - 7 (S) son más pequeñas que aquellas formadas después de la transfección con el vector de pREP4 vacío o las construcciones mda - 7 _ (AS) . Estos resultados demuestran que m da - 7 es un potente gel de supresión de crecimiento cuando se s obr e - e pr e s a en un amplio espectro de cáncer humano histológicamente distinto. Para determinar si m da - 7 también inhibe el crecimiento de células normales y si este efecto es cuantitativamente similar a aquel observado con células de cáncer humanas, sd realizaron ensayos de transfección de ADN pasajeros con el pasaje de 10 a 12 células epiteliales mamarias humanas normales (HMEC) , la línea de célula epitelial de pecho normal HBL-100, fibroblastos de piel humana normales (pasaje 21) y una línea de célula de dibroblasto de embrión de rata clonado (CREF-Trans 6) (7,8) . Ya que HMEC, HBL-100 y fibroblastos humanos de piel normales no forman colonias bien definidas a altas frecuencias, aún cuando se utiliza una capa alimentadora, el efecto en el número total de célula después de la transfección con las diferentes construcciones RSV y el crecimiento durante 2 ó 3 semanas en higromicina se determinó. Utilizando este aspecto, una aproximación de 1.1 a 1.6 veces de reducción en HMEC, una aproximación de 1.1 a 1.2 veces de reducción en HBL-100 y una aproximación de 1.3 a 2.1 veces la reducción en el número de célula de fibroblasto de piel humana normal se observó (tres experimentos independientes con cada tipo de célula) en m da - 7 (S) contra m da - 7 (AS) o células normales transfectadas del vector pREP4, respectivamente. En contraste, utilizando un protocolo experimental similar con las células de carcinoma de pecho humano T47D, el crecimiento fue inhibido después de la transfección con la construcción mda - 7 (S) aproximadamente de 3.2 a 5.2 veces en comparación con células transfectadas de vector y antisentido. En el caso de células CREF-Trans 6, la diferencia en la formación de colonia de Hyg1 para seis ens ayo s de transfección independientes entre mda-7 (S) contra mda-7 (AS) y células transfectadas con el vector variaron de 0.5 a 2.8 veces (Tabla 1) . En contraste, la transfección de construcciones mda-7 (S) a células CREF 5 transformadas con Ha-fas redujo la formación de colonia de aproximadamente 6 a 8 veces (Tabla 1) . Estos resultados indican que mda-7 es cuantitativamente menos efectivo para reducir el crecimiento y la formación de colonia en células 10 humanas normales y de roedor normales que en células cancerosas y de embrión de rata transformadas por Ha - ra s .

Efecto de Expresión de mda-7 Estable e Inducible e Inhibición Antisentido de la Expresión mda-7 en el Crecimiento de Célula y el Fenotipo Trans ormado. <jflfc. Para determinar la razón de sobrevivencia de célula HeLa de baja frecuencia después de la transfección con el gen mda-7 (S) , se aislaron diez colonias de HygR independientes después de la transfección -con la construcción mda-7 (S) . De los 10 clones analizados a través de tinción Northern para expresión de mda-7, 1 clones no expresaron ARNm de mda-7 detectable, 2 clones expresaron niveles bajos de ARNm de mda-7 y un clon (designado como HeLa cl 2) exhibió altos niveles de ARNm de m da - 7 . En contraste, todos los clones exhibieron niveles comparables de HygR y expresión del. gen ' de deshidrogenasa de 3-fosfato de g 1 i cer a ldeh í do (GAPDH) . Cuando se comparó con células HeLa padres o un clon de HeLa del vector pREP4 (designado HeLa cl 1) , las células de HeLa cl 2 (expresando m da - 7 ) crecieron a una velocidad reducida (Figura 2) . Cuando se desarrollaron en agar, las células HeLa y HeLa cl 1 no clonadas se desarrollaron con una eficiencia de aproximadamente 42%, mientras que las células HeLa cl 2 (expresando m da - 7 ) se desarrollaron con una eficiencia de aproximadamente 25% y los tamaños promedio de las colonias fueron más pequeños que los observados con las células HeLa cl 1 del vector pREP4 y células HeLa padres. Estos resultados indican que la sobrevi encia de HeLa después de la transfección con mda-7 resulta principalmente de la falta de o bajos niveles de expresión de mda-7. Sin embargo, en células HeLa que establemente expresan m da - 7 elevado, se redujeron el crecimiento én el cultivo de monocapa y la i dependencia de anclaje. Para determinar si la reducción en el desarrolla i n vi t ro y la .supresión de transformación encontradas en HeLa cl 2 (expresión de mda-7) son una consecuencia directa de la expresión de m da - 7 , se utilizó una estrategia antisentido para inhibir directamente la expresión de m da - 7 . Se construyó un vector Ad5 recombinante conteniendo el clon mda-7 clonado en una orientación antisentido [Ad. m da - 7 (AS) ] . La infección de HeLa cl 2 (expresión de m da -7 ) , pero no la de HeLa cl 1 (vector pREP4, .sin expresión de m da - 7 ) o HeLa padres con Ad. mda-7 (AS) incrementó la velocidad de crecimiento y la eficiencia de clonación de agar (de aproximadamente 25 a aproximadamente 44%) (Figura 2) . En contraste, el vector Ad5 mutante de control (H5dl434) , sin contener el gen m da - 7 , no afecto la monocapa o el crecimiento de agar de HeLa padres, o células HeLa cl 1 o HeLa cl 2 (datos no mostrados) . Utilizando anticuerpos de péptido específicos de mda-7 producidos en conejos y análisis de imunopr e cip i t aci ón , las células HeLa cl 2 (que expresan mda-7) contienen niveles elevados de la proteína de MDA-7 de aproximadamente 24 kDa y una proteína formadora de complejo (HMC) de alto peso molecular de a roximadame te 90 a 110 kDa (Figura 3 ) . _L a infección con Ad. mda-7 (AS) , pero no el virus de expresión de mda-7 ~ de control de H5dl434, da como resultado una reducción temporal tanto en la proteína MDA-7 de -24 kDa como la proteína de HMC (21) (figura 3) . Los niveles reducidos de ambas proteínas se ven en 48 horas y permanecen suprimidos durante un periodo de 96 horas después de la infección con Ad. mda-7 (AS) . En contraste, los niveles de actina permanecen sin alteración después de la infección viral. Estos hallazgos indican que la inhibición antisentido de la expresión de la proteína MDA-7 en HeLa cl 2 (que expresa mda-7) puede directamente extinguir la supresión de crecimiento inducida por mda-7 y la inhibición en el crecimiento independiente de anclaje. Para confirmar el efecto supresor de mda-7 es el crecimiento de célula, se expresaron por ingeniería celular de cáncer de próstata humana DU-145 para expresar un gen de mda-7 inducible por DEX. Cuando las células cl 6 o cl 7 DU-145 [conteniendo un gen (S) de mda-7 inducible por DEX], pero no las células DU-145 de origen, se desarrollan de 24 a 96 horas en presencia de 1_0~6 M DEX, ARNm de mda-7 y proteína (incluyendo la proteína HMC) , son inducidas (figura 4) . En contraste, DEX no altera la expresión del gen de resistencia a neomicina (NeoR) ' en células o DU-145 cl 6 y cl 7 o GAPDH en cualquiera de las células probadas (Figura 4) . La inducción de la expresión de mda-7 en células DU-145 cl 6 y cl 7 a través del. crecimiento en 10~6 M DEX da como resultado una reducción de aproximadamente 50% en el número de célula después de 96 horas contra el crecimiento en ausencia de DEX. En contraste, no ocurre ninguna inhibición de crecimiento significativa cuando se desarrollaron células DU-145 de origen o DU-145 transformadas de vector pMAMneo durante 96 horas en un medio conteniendo 10~6 M DEX (datos no mostrados) . Estos datos indican que la expresión ectópica de m da - 7 puede alterar directamente el crecimiento de célula en células de cáncer de próstata.

DISCUSIÓN EXPERIMENTAL La hibridación de sustracción identificó genes m da con expresión elevada en crecimie'nto interrumpido y células de melanoma humanas terminalmente diferenciadas (13,14,21) . La determinación de la función de estos genes m da será enorme para definir la base molecular del control de crecimiento y la diferenciación terminal en células de melanoma humano y otros tipos de células. El gen mda-7 (14,21) ahora se muestra que es un gen de supresión de crecimiento ubiquitoso cuando se expresa pasajeramente o establemente en una amplia disposición de líneas de célula de cáncer humano. 5 Este hallazgo extiende las observaciones previas indicando propiedades inhibidoras de crecimiento de la proteína MDA-7 en células de melanoma humano (21) . En contraste a estos efectos sobre células de cáncer, la transfección de m da - 7 en epitelio mamario fc.10 humano normal, fibroblasto de piel humana normal y células de fibroblasto de embrión de rata normal da como resultado una supresión de crecimiento cuantitati amente menor. Como otro gen m da ' la expresión de m da - 6 (p21) , m da - 7 también está inversamente correlacionada con la progresión del melanoma, con niveles elevados tanto de m da - 6 (p21) y m da - 7 presentes en melanocitos humanos normales con relación a células de melanoma humano metas t a ticas (14-16,21) . Ya que los melanocitos normales siguen reteniendo la actividad proliferativa, aunque a un régimen reducido con relación a células de melanoma, es posible que tanto m da - 6 (p21) como mda-7 funcionen como reguladores negativos del fenotipo de progresión en células, de linaje de me 1 ano cito /me 1 anoma (14-16,21) . Además, la expresión elevada tanto de m da - 6 (p21) como de m da - 7 en células de melanoma humanas terminalmente diferenciadas e irreversiblemente de crecimiento impedido, sugiere que estos genes también pueden ser reguladores importantes del fenotipo de diferenciación terminal (13-16,21) . El mecanismo a través del cual m da - 7 produce sus efectos supresores de crecimiento en células cancerosas humanas no es actualmente conocido. La estructura de mda-7 no proporciona una penetración en la función potencial, ya que no están presentes motivos de secuencias que puedan sugerir un modo potencial de acción. El efecto de m da - 7 en el crecimiento de células puede ser distinguido a partir del gen supresor de tumor p53 extensamente estudiado (33,34) . La expresión pasajera de p53 en la línea de célula de carcinoma de pecho humano T47D conteniendo el mutante p53 da como resultado la supresión de crecimiento, mientras que la transfección del gen p53 de tipo silvestre a la línea de célula de carcinoma de pecho humana MCF-7 conteniendo p53 de tipo silvestre no induce inhibición de crecimiento (34) . En contraste, m da - 7 induce una supresión de crecimiento similar tanto en células T 7 D como MCF-7 (Tabla 1) . La inhibición del crecimiento a través de m da - 7 también puede ser disasociada de aquella observada con el gen ' de retinoblastoma (pTB) , el gen pl07 asociado a pRb y el gen supresor de tumor putativo pld i n 4 (25,35) La s obr e -exprés ion de pRb y pl07 inhibe la proliferación celular en tipos de célula específicos y en una forma dependiente de ciclo de células (35-37) . La transfección de pRb o pl07 a la línea de célula de glioblastoma humano T98G que contiene un qen RB aparentemente normal (25) no induce supresión de crecimiento (35,37), mientras que la expresión de m da - 7 (S) pasajera reduce la formación de colonia de T98G (Tabla 1) . En la actualidad, el efecto inhibidor de crecimiento de m da - 7 no puede ser distinguido a partir de la supresión de crecimiento inducida por el miembro de la familia RB pl30/pRb2, que también inhibe la proliferación en células T98G El gen pl6 ink4 induce la det ene ion de crecimiento en células que contienen un gen RB funcional (35,37) , mientras que la supresión de crecimiento por mda-7 ocurre en células que contienen genes RB normales, anormales o no funcionales. La transfección de m da - 7 a la línea de célula de ^carcinoma de próstata humano DU-145 que contiene un gen RB mutado (38) y células de osteosarcoma humano Saos-2 que o expresan RB (o p53 de tipo silvestre) da corao resultado una inhibición en la formación de colonia (Tabla 1) . Similarmente, la inducción de la expresión mda-7 en clones DU-145 transformados por m da - 7 inducibles por DEX estables, da como resultado la supresión de crecimiento. Estos hallazgos indican una falta de dependencia en el -gen RB funcional para la inhibición de crecimiento por parte de m da - 7 . Tomado junto con estos estudios se demuestra que el efecto inhibidor de m da - 7 ocurre a través de un mecanismo que es distinto del modo de acción de los dos genes supresores de tumor más extensamente estudiados, p53 y pRb, y el gen supresor de tumor putativo pld?nk4. Varios genes han sido identificados que exhiben expresión elevada como una función de la detención del crecimiento o daño de ADN en células de mamífero (39,40) . Tres genes de detención ( de crecimiento e inducibles de daño por ADN ( ga dd) , ga dd 4 5 , ga dd l 53 y ga dd3 4 , el gen de respuesta primaria de diferenciación mieloide estrechamente relacionado (MyDll8) (41) y el gen inhibidor de p53 de tipo silvestre mdm-2 (42) son s obr e - r egu 1 ado s en células a través del tratamiento con el agente de daño de ADN, metansulfo ato de metilo (MMS) (40) . El Gadd45 y el gen específico de detención _ de crecimiento (gasl) ( 43 ,' 44 ) son inducidos a través de células de mantenimiento en células carentes de suero, de confluencia o células en crecimiento en un bajo nivel de suero (40,43,44) . En contraste, la expresión de ARNm de mda-7 no es inducida en células de melanoma humano después del tratamiento con metal sulfonato de metilo (MMS) o después' de mantener las células en confluencia (21) . Además, solo un pequeño incremento en la expresión de ARNm de mda-7 ocurre en células de melanoma humano H0-1 después del crecimiento en un medio libre de suero durante 96 horas (21) . La diferencia en la regulación de mda-7 contra los genes gadd, MyDllß y gas-1 indica que mda-7 puede representar una nueva clase de genes de detención de crecimiento. En resumen, se describe un regulador de crecimiento negativo, mda-7 que induce la supresión de crecimiento en células cancerosas humanas conteniendo los genes p53 y RB tanto normales como mutados. La caracterización de la estructura genómica de mda-7 será importante para determinar si este gen normalmente funciona como un gen supresor de tumor y si están presentes alteraciones en este gen en células de tumor contranormales. La identificación de la región de promotor de m da - 7 también permitirá un análisis del mecanismo a través del cual este, gen es diferencialmente expresado e inducible por INF-ß más MEZ en tipo de células específicos. De importancia potencial y otorgando e s_tudios expandidos, se encuentra el hallazgo de que m da - 7 es más inhibidor de crecimiento hacia células cancerosas y transformadas que a células normales. En este contexto, m da - 7 puede probar ser útil como parte de una estrategia de intervención a base de gen para terapia de cáncer, en una forma análoga ya que el gen p53 de tipo silvestre se está actualmente probando para eficacia en la terapia de enfermedades mal ignas ' humanas específicas.

Referencias 1. Fisher, P.B. (1984) in Tumor Promation and Cocar e inogenes is in Vitro: Mechanisms of Tumor Promotion, ed. Slaga, T.J., (CRC, Boca Ratón, FL), vol. 3, pp . 57-123. 2. Bishop, J.M. (1991) . Cell 64, 235-248. 3.Knudson, A.G. (1991) . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10914-10921. 4. MacLachlan, T.K., Sang, N. & Giordano, A. (1995) Crit. Rev. EuKaryotic Gene Express. 5, 127-156. 5. Sang, N., Baldi, A. & Giordano, A. (1995) . Mol. Cell. Differ. 3, 1-29. 6. Barbacid, M. (1987) . Anna. Rev. Biochem. 56, ^79-827. 7. Bos, J. (1989) . Cáncer Res. 49, 4682-4689. 8. Su, Z.-z., Olsson, C.A., Z imme r , S.G. & Fisher, P.B. (1992) . Anticancer Res.12, 297-304. 9. Shen, R., Su, Z.-z., Olsson-; C. A. & Fisher, P. B. (1995) . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6778-6782. 10. Noda, M., Kitayama, H., Matsuzaki, T., Sugimoto, Y., Okayama, H., Bassin, R. H. & Ika a, Y. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 162-166. 11. Kitayama, H., Sugimoto, Y., Masuzaki, T., Ikawa, Y. & Noda, M. (1989) . Cell 56, 77-84. 12. Lin, J., Su, Z.-z., Grunberger, D. Zimmer, S.G. & Fisher, P. B. (1994 Int. J. Oncol 5, 5-15. 13. Jiang, H. & Fisher, P. B . (1993) Mol Cell. Differ. 1, 285-299. 14. Jiang, H., Lin, J. & Fisher, P. B. (1994) . Mol. Cell. Differ. 2, 221-239. 15. Jiang, H., Lin, J., Su, Z.-z., Herlyn, M., Kerbel, R. S., Weissman, B. E., Welch, D. R., & Fisher, P. B. (1995) Oncogene 10, 1855-1864. 16. Jiang, H., Lin, J., Su, Z.-z. & Fisher, P. B. (1996) . Mol. Cell. Differ. 4, 67-89. 17. Xiong, Y., Hannon, G. J., Zhang, H., Casso, D., Kobayashi, R. & Beach, D. (1993) . Nature (London) 366, 701-704. 18. El-Deiry, W. S., Tokino, *T . , Velculescu, V. E., Levy, D. B., Parsons, R., Trent, J. M., Edn, D., Mercer, W. E., Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. (1993) . Cell 75, 817-825. 19. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K.& Elledge, S. J. (1993) . Cell 75, 805-816.

. Noda, A., Ning, Y., Venable, S. ,F., P reira-Smith, O. M. & Smith, J. R. (1994) . Exp. Cell Res . 211, 90-98. 21. Jiang, H., Lin, J J., Su, Z . — z . , Goldstein, N. I. & Fisher, P. B (1995) . Oncogene 11, 2477-2486. 22. León, J. A., Mesa-Te j ada , R Gutiérrez, M. C., Estabrook, A., Greiner, J. W., Schlom, J. & Fisher, P. B. (1989) . Anticancer Res. 9, 1639-1648. 23. Kantor, J., Tran, R., Greiner, G., Pestka, S., Fisher, P. B., Shively, J. E. & Schlom, J. (1989) . Cáncer Res. 49, 2651-2655. 24. León, J. A., Guttierez, M. C., Jiang, H., Estabrook, A., Waxman, S. & Fisher, P. B. (1992) . Cáncer Immunol. Immunother. 35, 315-324. 25. Claudio, P. -P., Howard, C. M . , Baldi, A., De Luca, A., Fu, Y., Condorelli, G., Sun, Y., Colburn, N., Calabretta, B. & Giordano, A. (1994) . C ncer Res. 54., 5556-5560. 26. Fisher, P.B., Babiss, L. E., Weinstein, I. B. & Ginsberg, H.S. (1982) . Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 3527-3531. 27. Boylon, J., Shih, T., Fisher, P. B. & Zimmer, S. G. (1992) . Mol. Carcinog. 5, 118-128. 28. Falck-Pedersen , E., Heinflink, M., Alvira, M., Nuesenzweig, D.R. & Gershengorn, M.C. (1994) . Mol. Pharmacol. 45, 684-689. 29. Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C. & Nairn, R. (1977) . J. Gen. Virol. 36, 59-72. 30. McGrory, W.J., Bautista, D.S. & Graham, F.L. (1988) . Virology 163, 614-617. 31. Volkert, F.C. & Young, C.S.H (1983 Virology 125, 175-193. 32. Grodzicker , T Klessig, D. ( 1980 ) .

Cell 21, 453-463. 33. Baker, S . J. , Markowitz, S. , Fea ron , E . R . , Wilson, J. K . V. & Voge 1 s t e in , B . ( 1990 ) .

Science 249, 912-915. 34. Mercer, W.E. (1992 Cpt Rev .

Eukaryotic Gene Expression 2, 251-263. 35. Medema R. H., Herrera, R. E., Lam F. & Weinherg, R. A. (1995) . Proc. Natl. Acad. Sci. 'USA 92 , 6289-6293. 36. Grana, X. & Reddy, E. P. ( 1995 ) . Oncogene 11, 211-220. 37. Zhu, L., van den Heuvel, S., Helin , K., Fattaey, A., Ewen, M., Livingston, D., Dyson, N. & Harlow, E. (1993) . Genes & Dev. 7, 1111-1125. 38. Bookstein, R., Shew, J. Y., Chen, P. L., Scully, P. & Lee, W. H. (1990) . Science 247, 712- 715. _ 39. Fornace, A. J., Jr . , Álamo, I. J., Jr . & 5 Hollander, M. C. (1988) . Proc. Natl . Acad. Sci . USA 85, 8800-8804. 40. Zhan, Q., Lord, K.A., Álamo, I., Jr . , Hollander, M.C., Carrier, F., Ron, D., Kohn, K. W., Hoffman, B., Liebermann, D.A. & Fornace, A. J., Jr . f 10 (1994) . Mol. Cell. Biol. 14, 2361-2371. 41. Abdollahi, A., Lord, A., Hoffman- Liebermann, B. & Liebermann, D. (1991) . Oncogene' 6, 165-167. 42. Momand, J., Zambetti, G. P., Olson, D. 15 C., George, D. & Levine, A. J. (1992) . Cell 69, 1237-1245. , 43. Schneider, C., King, R.M. & Philipson, _ L. (1988) . Cell 54, 787-793. 44. Del Sal, G., Ruaro, M.E., Philipson, L. ,20 & Schneider, C. (1992) . Cell 70, 595-607. 45. Sambrook, J . , et al. (1989) Molecular Cloning: a laboratorv manual. Second Edition. Co Id Spring Harbor Laboratory Press (1989) .

Segunda Serie de Experimentos Gen-7 Asociado de Diferenciación de Melanoma ( m da - 7 ) en un Adenovirus Recombinante Inhibe el Crecimiento de Tumores Humanos Establecidos en Ratones Desnudos. Estudios previos documentan que la expresión ectópica de mda-7 en células de tumor humano de diversos orígenes inhibe el crecimiento, según documentado por una reducción en la formación de colonia en un cultivo de monocapa (Jiang et al., PNAS, 93:" 9160-9165, 1996) . En contraste, m da - 7 no altera significativamente el crecimiento de células epiteliales humanas normales o fibroblasto. Estas observaciones soportan la hipótesis de que mda-7 es un gen supresor del crecimiento de cáncer ubiquitoso- La habilidad de m da - 7 para inhibir selectivamente el crecimiento de células cancerosas sugiere que este gen puede proporcionar beneficios terapéuticos en el tratamiento de cáncer humano. Para explorar esta posibilidad, se ha generado una expresión de adenovirus defectuosa por replicación m da - 7 . Los protocolos fueron similares a aquellos utilizados para construir un m da - 7 antisentido de expresión de adenovirus, Ad . m da - 7 AS (Jiang et al., PNAS, 93: 9160-9165, 1996) . El Ad. mda-7 S defectuoso por replicación recombinante se condujo en dos pasos. En primer lugar, el gen mda-7 se clonó en una orientación de sentido a un vector de expresión Ad modificado pAd. CMV. Ese virus contiene, en orden, los primeros 355 pb del extremo izquierdo del genoma Ad, el promotor temprano inmediato de c i t smegalo vi r us (CMV) ADN que codifica una secuencia de señal poliA del gen de be t a -g 1 ob ina , y aproximadamente 3 kpb de la secuencia de adenovirus que se extiende desde el interior de la región de codificación E1B. Esta disposición permite una expresión de alto nivel de la secuencia clonada a través del promotor de gen temprano inmediato CMV, y procesamiento de ARN apropiado. El virus recombinante fue creado i n vi vo en 293 células a través de re combinación homologa entre el vector que contiene m da - 7 y JM17, el cual contiene el genoma Ad clonado _a una versión modificada de pBR322. JM17 da surgimiento a genomas Ad in vi vo , pero son demasiado grandes para empacar. Esta restricción es aliviada a través de la r e combinac i ón con el vector para crear un gensma que se pueda empacar, conteniendo el gen de elección. El virus recombinante es defectuoso, en replicación en células humanas excepto 293, que expresan el adenovirus ElA y E1B. Después de la transfección de los dos plásmidos, se recuperó el virus infeccioso, los genomas fueron analizados para confirmar la estructura recombinante y después el virus se -purificó en una placa, todo a través de procedimientos estándares. Como se observó en la transfección con m da -7 , la infección de líneas de células de cáncer humano diversas, pero no de líneas de célula normal, con Ad . m da - 7 S inhib ió el crecimiento. Estos resultados demuestran que este virus retiene las propiedades observadas con la construcción de plásmido _ mda-7. En muchas células cancerosas, incluyendo carcinoma de pecho (MCF-7 y T47D) , glioblastoma (GBM-18 y T98G) y melanoma (H0-1 y C816.1) , la infección con Ad. da-7 S dio como resultado la inducción de la muerte de célula programada (apoptosis) . Este efecto no fue producido en células normales aún después de la infección con altas multiplicidades de infecciones (100 pfu/células )~ con Ad. mda-7 S. En otros tipos de células cancerosas, la supresión de crecimiento (como se indicó por una supresión en la formación de colonia en el cultivo de monocapas) fue evidente sin signos de apoptosis, como se indica a través de cambios de morfología nuclear, la formación de escalones nucí eo s orna le s o una reacción de TÚNEL positiva. Estos resultados indican que el virus Ad..mda -7 S selectivamente puede inhibir el crecimiento de células cancerosas humanas i n vi t r o . Además, en tipos de células cancerosa específicos la supresión de crecimiento se correlaciona con la inducción de apoptosis. Estas observaciones sugieren que la inhib'ición en el crecimiento de cáncer inducida por mda-7 puede ocurrir a través de trayectorias múltiples. Se utilizaron modelos de xenoinjerto de tumor humano de ratón desnudo para determinar si Ad. mda-7 S puede inhibir el crecimiento de células cancerosas humanas in vi vo . Se inyectaron ratones desnudos atímicos, obtenidos de Taconic Labs, subcutáneamente con un millón de células de carcinoma cervical humano (HeLa) en PBS mezclado con matrigel (volumen final 0.4 ml; relación de matrigel a PBS 1:1) . Lo.s tumores se dejaron desarrollar hasta que alcanzaron un volumen promedio de 100 a 200 mm (10 a 21 días después de la inoculación) . Después, los ratones fueron alea t ori z ado s y divididos en dos grupos: Grupo 1: Ad defectuoso por replicación carente del gen mda-7/ virus nulo (nulo) ; y Grupo 2: Ad. mda-7 S. El tratamiento consistió de inyecciones int ra tumorales del aspecto nulo o Ad. da-7 S (10 µl en 4 sitios /.inyección) tres veces a la semana durante 4 semanas. Los tumores se midieron dé dos a tres veces semanalmente con un calibrador. Los volúmenes de tumor fueron calculados utilizando la formula: pi/6 x diámetro mayor x (diámetro menor)2. Después de 4 semanas de terapia, los animales se dejaron durante una semana adicional y fueron sacrificados. El volumen de tumor final dividido entre el volumen de tumor inicial es igual a la relación de volumen de tumor que se define como una medición de la progresión de cáncer. Los xenoinjertos de HeLa bien establecidos, tratados con Ad. m da - 7 S, fueron inhibidos en desarrollo durante el curso del estudio, mientras que los tumores tratados con el virus nulo continuaron el desarrollo progresivo (Figura 5 y '6) . El efecto inhibidor de mda-7 fue importante con un valor de p de <0.05. Este estudio fue repetido y se obtuvieron resultados similares. Estos datos sugieren que la expresión ectópica de m da - 7 puede proporcionar un beneficio terapéutico para el tratamiento de cáncer humano. Los experimentos ahora están en progreso utilizando tumores de cáncer de pecho humano establecido MCF-7 y T47D, en ratones desnudos .

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un método para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer que comprende introducir un ácido nucleico que comprende un gen asociado de diferenciación de melanoma (inda-7) a la célula bajo condiciones que permiten la expresión de gen de manera que invierte de esta forma el fenotipo canceroso de la célula.

2. Un método para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer en un sujeto, que comprende introducir un ácido nucleico que comprende un gen asociado de diferenciación de melanoma ( mda -7) en la célula cancerosa del sujeto bajo condiciones que permiten la expresión del gen en la célula del sujeto con el fin de invertir así el fenotipo canceroso de la célula.

3. El método de acuerdo con la rei indicación 1 ó 2, en donde el ácido nucleico comprende un vector.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el gen asociado de diferenciación de melanoma ( mda - 7 ) esta enlazado a un elemento regulador de manea que su expresión esta bajo el control del elemento regulador.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, el elemento regulador es inducible o constitutivo.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, donde el elemento regulador es un elemento regulador específico en el tejido.

7. El método de la reivindicación 1 a 6, en donde el ácido nucleico es introducido a las células a través de tecnología de ADN desnudo, vector de adenorivus, vector de virus asociado a adeno, vector de virus Epstein-Barr, vector de virus de Herpes, vector de VIH atenuado, vector retroviral, vector de virus de vacuna, liposomas, liposomas revestidos con anticuerpo, y medios mecánicos o eléctricos.

8. El método de la reivindicación 1 a 7, en donde la célula de cáncer se caracteriza por la presencia dentro de ella de un gen supresor de tumor defectuoso.

9. El método de la reivindicación 8, en donde el gen supresor de tumor es un p53, un retinoblastoma o un gen pl6?nk4 .

10. El método de la reivindicación 1 a 7, en donde la célula de cáncer se caracteriza por la presencia dentro de ella de un oncogen de accionamiento dominante.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el oncogen de accionamiento dominante es Ha-ras, el mutante p53 o el gen del virus de papiloma humano .

12. El método de la reivindicación 3, en donde el vector es un vector de adenovirus, un vector de virus asociado con adeno, un vector de virus Epstein-Barr, un vector de virus de Herpes, un vector de VIH atenuado, un vector de retrovirus o un vector de virus de vacuna.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el vector de adenovirus es un vector de adenovirus defectuoso por replicación expresando mda - 7 , designado Ad..mda-7 S.

14. Un método para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer que comprende introducir el producto de gen a un gen asociado de diferenciación de melanoma ( mda - 7 ) con el fin de invertir así el fenotipo canceroso de la célula.

15. Un método para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer en un sujeto que comprende introducir el producto de gen de un gen asociado de diferenciación de melanoma ( mda - 7 ) a la célula cancerosa del sujeto con el fin de invertir así el fenotipo de la célula.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1 a 15, en donde la célula de cáncer es una célula del pecho, cervical, de colon, próstata, nasofaríngea, pulmón, glioblastoma multiforme, linfoma, leucemia, tejido conjuntivo o sistema nervioso.

17. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un ácido nucleico que comprende un gen asociado de diferenciación de melanoma (ipda-7) efectivo para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 17, en donde el ácido nucleico comprende un vector.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, en donde el vector es un vector de adenovirus, un vector de virus asociado con adeno, un vector de virus Epstein-Barr, un vector de virus de Herpes, un vector de VIH atenuado, un vector de retrovirus o un vector de virus de vacuna.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 19, en donde el vector de adenovirus es un vector de adenovirus defectuoso en replicación expresando mda - 7 , designado Ad.mda-7 S.

21. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad del producto de gen de un gen asociado de diferenciación de melanoma (mda-7) efectivo para invertir el fenotipo canceroso de una célula de cáncer y un vehículo farmacéuticamente aceptable .

22. La composición farmacéutica de la reivindicación 17 a 21, en donde la célula de cáncer es una célula del pecho, cervical, de colon, próstata, nasofaríngea, pulmón, glioblastoma multiforme, linfoma, leucemia, tejido conjuntivo o sistema nervioso.