MXPA99001499A - Benzamidinas novedosas - Google Patents

Abstract

Los compuestos de la fórmula I. (Ver Fórmula) donde R, R1, R2, R3, R4, R5 y R6 y l, m y n tienen los significados establecidos en la descripción, y su preparación se describe en la presente. Los compuestos novedosos son adecuados para controlar enfermedades.

Description

BENZAMIDINAS NOVEDOSAS La presente invención se refiere a las benzamidinas novedosas, a su preparación y su uso como inhibidores competitivos de serina proteasas parecidas a tripsina, especialmente trombina y cininogenasas como calicreína. La invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos como ingredientes activos, y al uso de los compuestos como inhibidores de trombina, agentes anticoagulantes y antiinflamatorios. La trombina pertenece al grupo de serina profesas y desempeña una parte central en la cascada de coagulación sanguínea como enzima terminal. Las cascadas de coagulación intrínseca y la extrínseca dan origen a una pluralidad de etapas de amplificación para la producción de trombina a partir de protombrina. El desdoblamiento catalizado por trombina de fibrinógeno a fibrina entonces inicia la coagulación sanguínea y la agregación de plaquetas que, a su vez, debido a la unión del factor 3 de las plaquetas y el factor de coagulación XIII, y una gran cantidad de mediadores altamente activos, favorecen la formación de trombina. La formación y acción de trombina son sucesos centrales en el desarrollo de trombos blancos arteriales y de trombos rojos venosos y por tanto son puntos de ataque potencialmente efectivos para medicamentos. Los inhibidores de trombina son, por contraste por la heparina, capaces de, independientemente de los cofactores, completamente inhibir simultáneamente los efectos de trombina libre y de esta unión a las plaquetas. Estas pueden prevenir en la fase aguda sucesos tromboembólicos después de la angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) y lisis, y actuar como anticoagulantes en la circulación extracorporal (la máquina corazón-pulmón, hemodiálisis) . Estos también pueden utilizarse generalmente para la profilaxis de trombosis, por ejemplo, después de las operaciones quirúrgicas. Es sabido que los derivados sintéticos de arginina tienen influencia en la actividad enzimática de trombina interactuando con el residuo serina activo de la trombina proteasa. Los péptidos basados en Phe-Pro-Arg en los cuales el aminoácido N-terminal es en la forma D han demostrado beneficio particular. El D-Phe-Pro-Arg isopropil éster se describe como inhibidor competitivo de trombina (C. Mattson et al, Folia Hae atol, 109 (1983) 43-51) . La derivación de arginina en el C-terminal al aldehido da origen a un mejoramiento del efecto inhibitorio. De esta manera, se ha descrito una gran cantidad de arginales que pueden unir el grupo hidroxilo de la serina "activa" en un hemiacetal (EP 185390, 479489, 526877, 542525; WO 93/15756, 93/18060) .

La actividad inhibidora de trombina de los péptidos cetonas, alquil cetonas fluoradas y cetoésteres, derivados de ácido bórico, esteres fosfóricos y a-cetocarboxamidas puede, de la misma manera, ser explicada por esta interacción de serina (EP 118280, 195212, 362002, 364344, 410411, 471651, 589741, 293881, 503203, 504064, 530167; WO 92/07869, 94/08941) . El péptido 4-amidinofenilglicinfosfonato difenil esteres descrito por J. Oleksyszyn et al. En J. Med. Chem. 37 (1994) 226-231 son inhibidores de trombina irreversibles con selectividad inadecuada con respecto a otras serinas proteasa. En DE 3 108 810, WO 93/11152 y EP 601 459 se describe la agmatina y por tanto los derivados de arginina que son incapaces de interactuar con la serina activa en serina proteasas. En WO 94/29336, EP 061 459 y WO 95/23609 se representa otro desarrollo en el que la agmatina se sustituye por un residuo arilamidina. Las cininogenasas son serina proteasas que liberan péptidos vasoactivos conocidos como quininas (bradicinina, calidina y Met-Lys-bradicinina) , de los cininógenos. Los cininógenos son proteínas multifuncionales que están presentes en las reacciones en cascada coagulación e inflamación. Como inhibidores, estos protegen las células del daño por las cisteína proteasas (Müller Esterl, FEBS Lett. 182 (1985) 310-314. Las cininogenasas importantes son calicreína de plasma, calicreína de tejido y triptasa de célula mastica. Las cininas como bradicinina y calidina son péptidos vasoactivos que tienen influencia en una gran cantidad de procesos biológicos. Estos desempeñan una parte esencial en los procesos inflamatorios. Al incrementar la permeabilidad vascular, estas dan origen a hipotensión y edema. Además, estas son autacoides productores de dolor muy potentes y tienen gran importancia como mediadores celulares en la patofisiologia de asma, rinitis alérgica y artritis (K. D. Bhoola, C. D. Figueroa, K. Worthy, Pharmacological Reviews 44 (1992) 1-80). Independientemente de los mecanismos que fundamentan los procesos inflamatorios, el fluido que contiene todos los sistemas de proteínas en la sangre circulante escapa de los vasos sanguíneos. Esto significa que el escape del fluido plasma de los vasos esta involucrado en enfermedades como asma, rinitis y enfermedades internas inflamatorias. Además, la triptasa de células masticas se libera particularmente en los procesos alérgicos (Salomonsson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1992, 146, 1535-1542). Las argininclorometilcetonas H- (D) -Pro-Phe-Arg-CH2Cl y H- (D) -Phe-Phe-Arg-CH2C1 han sido descritas por Kettner y Shaw como inhibidores calicreína de plasma (Biochem 17 (1978) 4778-4784 y Meth. Enzy . 80 (1981) 826-842) . Diversos derivados sintéticos de benzamidinas y bencilaminas han demostrado ser inhibidores de calicreina en plasma, teniendo las benzamidinas efecto inhibidor considerablemente más fuerte (F. Markward, S. Drawert, P.

Walsmann, Biochemical Pharmacology 23 (1974) 2247-2256) . El PKSI-527, el clorhidrato de N-(trans-4-aminometilciclo-hexilcarbonil) -L-fenilalanin-4-carboximetilanilida, también es un inhibidor efectivo de esta cininogenasa (Wanaka, Ohamoto et al., Thromb. Res., 57 (1990) 889-895) . La invención se refiere a los compuestos de la fórmula I R2 R4 R5 Rl-(CH2)m-C -(CH2)n -N-C-CO - N^(CH2>? 3 Rß CO I, i R donde R, R , R , R , R , R y R , 1, m y n tienen los siguientes significados: 1 0 ó 1, m 0, 1 ó 2, n 0, 1 ó 2, R H o alquilo de C?~4, R1 HOOC, alquilo de d-6-OOC-, bencil-OOC- ó -OH, R2 H, alquilo de Cx-4, o R1(CH2)m-, R3 H- o alquilo de C?-- que puede ser sustituido por -OH o -COOH, R4 H- alquilo de C3.-4, HOOC-alquileño de C1-4, R5 es alquilo de C?-8, cicloalquilo-CR8R9r- (r= 0 ó 1, R8, R9= H-, cicloalquilo-, o alquilo de C1-4) , en el cual hasta cuatro grupos CH2 en el radical cicloalquilo pueden ser sustituidos, independientes entre si, por CR10R1:L (R10= H- 0 alquilo de C3.-4, R11 = alquilo de C1-C4) , y/o el grupo CH en el radical cicloalquilo al cual esta unido, CR8R9 puede ser sustituido por CR12(R12 == alquilo de C?- ) , y/o 1 o 2 enlaces sencillos C-C en el anillo pueden ser sustituidos por un doble enlace C=C, R6 H-, alquilo de C1-C4, o, R4 y R5 juntos -CH2-CH2-CH (R7) -, (R7 = H-, fenil- o ciclohexil-) R2 y R5 juntos -CH2-CH o -CH2-CH2-CH2-, en el cual un átomo de hidrógeno puede ser sustituido por alquilo de C1-4, fenil- o cicloalquil-, y las sales de los mismos con los ácidos fisiológicamente tolerados. Los residuos aminoácido representados por -NR-C- (R5R6) -CO- de preferencia tienen la configuración (D) , y 3,4-dihidroprolina y el ácido 4, 5-dihidropripecólico de preferencia tiene la configuración (L) . Los compuestos preferidos de la fórmula I son aquéllos donde : R2 Rl (CH2), (CH2)n R3 es HOOC-(CH2)t- (t= 1, 2 ó 3), (H00C-CH2) 2-CH-, (H0-CH2)2CH-, HOO-CH2-CH(COOH)-, HOOC-CH (CH2-CH2-OH) -, H00C-CH (alquilo de C?~4-) , alquilo C?- -00C-CH2-, bencil-00C-CH2-, y donde R4 R5 I I N CO es R6 (Ra,Rb = H, ciclohexil- o alquilo de C?_4) (Rc, Rd, Rß, Rf, Rg, Rh, = H o alquil de C?-4 r donde el grupo CH2- del anillo puede ser mono o di sustituido) , fenil- o ciclohexil-) R3 —NH — CH — CO— (RJ = ciclopentil-, cicloheptil-, 1-adamantil-, 1- norbornil-, 1-biciclo [2.2.2] octil-, neopentil-, ter- butil-, diisopropilmetil-, o 1- (1, 4-ciclohexadienil-) ) donde este bloque constructivo de preferencia tiene la configuración D, 1 es 0, y R es H- o CH3-. Otros compuestos preferidos de la fórmula I son aquéllos donde R2 Rl (CH2 )m C (CH2 > n I 3 es HOOC-(CH2)t- (t = 1, 2 ó 3) , (HOOC-CH2) 2"CH-, (HO-CH2) 2CH-, HOOC-CH2-CH(COOH)-, HOOC-CH (CH2-CH2-OH) -, HOOC-CH (alquilo de C?-4)-, alquil de C?_4-OOC-CH2-, bencil-OOC-CH2, y donde R4 R5 1 I N C CO es R« (Ra,Rb = H, ciclohexil- o alquil de C?-4) (Rc, Rd, Re, Rf, Rg, Rh, = H- o alquil de C1-4, donde los grupos CH2- del anillo puede ser mono o disustituido) , NH CH CO R1 (R1= fenil- o ciclohexil- N PT CH CO R3 "I NH CH CO (R3 = ciclopentil-, cicloheptil-, 1-adamantil-, 1- norbornil-, 1-biciclo [2.2.2] octil-, neopentil-, ter- butil-, diisopropilmetil-, o 1- (1, 4-ciclohexadienil-) ) . donde este bloque constructivo de preferencia tiene la configuración D, 1 es 1 y R es H- o CH3 Otros compuestos preferidos de la fórmula I son aquéllos donde donde l es O ó l y R es H o alquilo de C1-C4, en particular CH3. Los intermediarios preferidos son compuestos de la fórmula II. 2 R4 R5 Rl-(CH2)m- en donde R2 Rl (CH2)m (CH2)„ R3 es HOOC-(CH2)t- (t= 1, 2 ó 3), (HOOC-CH2)2-CH-, (H0-CH2)2CH-, HOO-CH2-CH(COOH)-, HOOC-CH (CH2-CH2-OH) -, HOOC- CH (alquilo de C1-4-) , alquilo C1-4 -OOC-CH2-, bencil-OOC-CH2-, y donde R4 R5 N CO es R6 = H ciclohexil- o alquil de C1-4-) (Rc, Rd R% Rfr Rg, Rhr = H o alquil de C?-4, donde el grupo CH2- del anillo puede ser mono o di sustituido) , -Rg NH CH CO — N — CH — CO — (Rx= fenil o ciclohexil-) R3 I (Rj = ciclopentil-, NH CH CO cicloheptil-, 1-adamantil-, 1- norbornil-, 1-biciclo [2.2.2]octil-, neopentil-, terbutil-, diisopropilmetil-, o 1- (1, 4-ciclohexadienil-) ) . donde este bloque constructivo de preferencia tiene la configuración D, 1 es 0 ó 1 y R es H- o CH3-. Otros intermediarios interesantes son los compuestos de la fórmula : Donde 1 y R tienen los significados especificados en la reivindicación 1, y Y es un grupo protector de N, un aminoácido N-terminal protegido o no protegido o H-. Los compuestos preferidos de la fórmula III son aquellos donde : Y es Boc-, Boc-Cha-, H-Cha, Boc-Chg-, H-Chg o H, 1 es 0 ó 1 y R es H o CH3. Las siguientes sustancias son particularmente preferidas 1. H00C-CH2- (D) -Cha-Pyr-NH-4-amb 2. HOOC-(CH2)2-(D)-Cha-Pyr-NH-4-amb 3. (H00C-CH2 ) 2CH- (D) -Cha-Pyr-NH-4-amb 4. (H0-CX2) 2CH- (D) -Cha-Pyr-NH-4-amb 5. H00C-CH2-CH (CooH) - (D) -Cha-Pyr-NH-4-amb 6. H00C-CH2- (D) -Chg-Pyr-NH-4-amb 7 . H00C-CH2- (D) - (a-Me) Cha-Pyr-NH-4-amb 8 . H00C-CH2- (D, L) - ( 1-Me) Cha-Pyr-NH-4-amb 9. H00C-CH2- (D, L) - (B, B-Me2 ) Cha-Pyr-NH-4-amb 10. H00C-CH2- (D, L) - (trans 4-Me) Cha-Pyr-NH-4-amb 11. H00C-CH2- (D, L) -cicloheptilalanin-Pyr-NH 12. H00C-CH2- (D, L) -1-adamantilalanin-Pyr-NH 13. H00C-CH2- (D, L) -2-norbornilglicin-Pyr-NH 14. H00C-CH2- (D,L)-(3,3-Mez)Cha-Pyr-NH-4-amb 15. H00C-CH2- (D) -ter-butilalanin-Pyr-NH-4-amb 16. H00C-CH2- (D,L) (1,4-ciclohexadien-l-il) alanin-Pyr-NH-4-amb 17. H00C-CH2- (D) -Cha-Dep-NH-4-amb 18. HOOC-CH2-(D)-Chg-Dep-NH-4-amb 19. H00C-CH2- (D,L) -Dch-Pyr-NH-4-amb Las abreviaciones que se utilizan en la presente y los ejemplos son como sigue amb = amidinobencilo Boc = ter-butiloxicarbonilo Cha = ciclohexilalanina Chea = cicloheptilalanina Chg = ciclohexilglicina Dch = diciclohexilalanina Dpa = difenilalanina Me metilo Pyr = 3, 4-dihidroprolina Dep =ácido 4, 5-dihidropipecólico en el caso donde -NR4-CR5R6-CO- es un residuo ciclohexil alanina, los átomos de carbono individuales son designados como sigue: — Los compuestos de la fórmula I pueden existir como tales o en la forma de sus sales con ácidos fisiológicamente tolerados. Los ejemplos de estos ácidos son: ácido clorhídrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido fosfórico, ácido metansulfónico, ácido acético, ácido fórmico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido hidroxisuccinico, ácido sulfúrico, ácido glutárico, ácido aspártico, ácido pirúvico, ácido benzoico, ácido glucurónico, ácido oxálico, ácido ascórbico y acetil glicina. Los compuestos novedosos de la fórmula I pueden emplearse para las siguientes indicaciones: - enfermedades cuyo mecanismo patogenético derive directa o indirectamente del efecto proteolitico de trombina. - enfermedades cuyo mecanismo patogenético deriva de la activación dependiente de trombina de los receptores y la transducción de la señal, enfermedades asociadas con la estimulación [por ejemplo, por PAI-1, PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas), P-selectina, ICAM-1, factor de tejido] o inhibición (por ejemplo, síntesis de NO en células del músculo liso) de la expresión de los genes en las células corporales, enfermedades provenientes del efecto mitogénico de trombina, enfermedades provenientes del cambio dependiente de trombina en la contractilidad y permeabilidad de las células epiteliales (por ejemplo, células endoteliales vasculares) , - sucesos tromboembólicos dependientes de trombina como puede ser una trombosis de vena profunda, embolismo pulmonar, infarto al miocardio o cerebral, fibrilación atrial, oclusión de baipas, coagulación intravascular diseminada (DIC) , - reoclusión y para reducir el tiempo de reperfusión en la co-medicación con trombolíticos como estreptocinasa, urocinasa, prourocinasa, t-PA, APSAC, activadores de plasminógeno provenientes de las glándulas salivales de animales y las formas recombinantes y mutadas de todas estas sustancias, la presencia de reoclusión temprana y restenosis tardía después de PTCA, proliferación dependiente de trombina de las células del músculo liso, - la acumulación de trombina activa en el SNC (por ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer) , crecimiento de tumor y la prevención de la adhesión y metástasis de las células tumorales. Los compuestos novedosos pueden utilizarse en particular para la terapia y profilaxis de los sucesos tromboembólicos dependientes de trombina como pueden ser las trombosis de vena profunda, embolia pulmonar, infartos al miocardio o cerebrales y angina inestable, también para la terapia de la coagulación intravascular diseminada (DIC) . Estos además son adecuados para la terapia en combinación con trombolíticos como estreptocinasa, urocinasa, prourocinasa, t-PA, APSAC y otros activadores plasminógenos para acortar el tiempo de reperfusión y extender el tiempo de reoclusión. Otras áreas de uso preferidas son para evitar la reoclusión temprana dependiente de trombina y la restenosis tardía después de angiplastia coronaria transluminal percutánea, para evitar la proliferación producida por trombina de las células del músculo liso, para evitar la acumulación de trombina activa en el SNC (por ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer) , para controlar los tumores y para prevenir los mecanismos que dan origen a la adhesión y metástasis de las células tumorales. Los compuestos novedosos también pueden ser utilizados para el revestimientos de superficies artificiales como membranas para hemodiálisis y los sistemas de entubamiento en líneas necesarias para estos, y de oxigenadores en la circulación extra vascular, stents y válvulas cardiacas. Los compuestos novedosos además pueden ser empleados para enfermedades cuyos mecanismos patogénicos derivan directa o indirectamente del efecto proteolítico de cininoginasas, especialmente calicreina, por ejemplo en enfermedades inflamatorias como asma, pancreatitis, rinitis, artritis, urticaria y otras enfermedades inflamatorias internas . La ventaja específica de los compuestos novedosos es que estos muestran, debido a la sustitución de prolina por 3,4-dihidroprolina y por la sustitución de -ácido pipecólico por ácido 4, 5-dihidropipecólico, un efecto farmacológico mejorado y por tanto se distinguen de los compuestos que se describen en WO 94/29336. Los compuestos de acuerdo con la invención pueden ser administrados en una forma convencional por vía oral, parenteral (subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, rectal) . La administración también puede llevarse a cabo con vapores o aspersores a través del espacio nasofaríngeo. La dosificación depende de la edad, estado y peso del paciente y en el modo de administración. Como regla general la dosis diaria de la sustancia activa por persona es aproximadamente 10-2000 mg en la administración oral y aproximadamente 1-200 mg en la administración parenteral. Esta dosis puede darse en dos a cuatro dosis individuales o una vez al día como forma de depósito. Los compuestos novedosos pueden utilizarse en formas farmacéuticas sólidas o liquidas convencionales, por ejemplo, como tabletas no cubiertas o cubiertas (con películas) , cápsulas, polvos, granulos, supositorios, soluciones, ungüentos, cremas o rocíos. Estas se producen en una forma convencional. Las sustancias activas pueden para este propósito ser mezcladas con auxiliares farmacéuticos convencionales como aglutinantes de tabletas, agentes de volumen, conservadores, desintegrantes de tabletas, controladores del flujo, plastificantes, agentes humectantes, dispersantes, emulsificadores, solventes, agentes para liberación lenta, antioxidantes y/o gases propelentes (véase, H. Sucker et al.: Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1978) . Las formas de administración obtenidas de esta manera normalmente contendrán de 0.1 a 99% en peso de la sustancia activa.

Parte experimental Los compuestos de la fórmula I pueden ser preparados como se muestran en los esquemas I-III, 2 donde A es I Rl (CH2)m C (CH2)n 3 (CH2)! C es o y E tiene el significado indicado en los esquemas. Los radicales R1, R2, R3, R4, R5 y R6, y L, M y N tienen los significados antes mencionados. Los bloques constructivos A, B, C y D de preferencia se ensamblan por separado de antemano y se emplean en la forma adecuadamente protegida (véase el esquema I-III) . Los compuestos de la fórmula I pueden ser preparados comenzando a partir de los bloques constructivos adecuadamente protegidos A, B, C, D y E como se muestra en el esquema I-III. Esquema I B (P= grupo protector, (P) = grupo protector o H, (U)= grupo saliente o, donde sea adecuado, aldehido o cetona, véase el siguiente texto) . El esquema I describe el ensamblado lineal de la molécula I copulando la amina H-D-CN con el aminoácido N-protegido P-C-OH para dar P-C-D-CN, eliminado el grupo protector N-terminal para dar M-C-D-CN, copulando el aminoácido N-protegido P-B-OH para dar P-B-C-D-CN, eliminando el grupo protector P para dar H-B-C-D-CN, posteriormente alquilando con el bloque constructivo (P)-A-U protegido o no protegido (U)= grupo saliente) o la aminación reductiva con (P) -A' -U(U=aldehído, cetona) o adición de Michael con un derivado (P)-A''-C=C adecuado para dar(P)-A-B-C-D-CN. La conversión de la funcionalidad nitrilo en grupo amidina se lleva a cabo por la síntesis clásico de Pinner (R. Boder, D.G. Neilson, Chem. Rev. 61 (1962) 179) o por una síntesis Pinner modificada que procede a través de las sales iminotioéster como intermediario (H: Vieweg et al., Pharmazie 39 (1984) 226) o directamente por el método de A. Eschenmoser, Helv. Chimica Acta 69 (1986)124. Posteriormente los grupos protectores todavía presentes en la molécula se eliminan, de preferencia por hidrólisis acida. Si el bloque constructivo D se incorpora como H-D-C0NH2 en la síntesis, la deshidratación de la amida a la funcionalidad nitrilo se lleva a cabo en uno de los intermediarios protegidos.

Esquema II B El esquema II describe el ensamblado lineal de la molécula I por alquilación, aminación reductiva o adición de Michael de H-B-P sobre bloques constructivos A no protegidos o protegidos adecuados para dar (P)-A-B-P, la eliminación del grupo protector C-terminal para dar (P)-A-B-OH, copulando H-C-P para dar (P)-A-B-C-P, la eliminación del grupo protector C-terminal para dar (P) -A-B-C-OH, copulando a H-D-CN para dar (P) -A-B-C-D-CN y la reacción de este intermediario para producir el producto final como en el esquema I . Donde los compuestos (P)-A-B-C-P todavía tienen una funcionalidad NH libre en B, esta debe ser provista con un grupo protector adecuado antes de la eliminación del grupo protector C-terminal. Los grupos protectores que se utilizan en cada caso deben ser ortogonales entre si. Como una alternativa al bloque constructivo H-D-CN, también es posible emplear H-D-CONH2, H-D-C- (NH)NH2, H-D-C- (NP)-NH2/ H-D-C- (NP)NHP, con el intermediario copulado (P)-A-B-C-CNH2 en el primer caso deshidratado a (P) -A-B-C-CN.

Esquema III E El esquema III describe una manera muy eficiente para preparar los compuestos I por una síntesis convergente. Los bloques constructivos adecuadamente protegidos (P)-A-B-OH y H-C-D-N se copulan entre si, y el intermediario resultante (P)-A-B-D-CN se hace reaccionar para dar el producto final como en el esquema I.

Los grupos protectores N-terminales que se emplean son Boc, Cbz, o Fmoc, de preferencia Boc, y los grupos protectores C-terminales son metilo, ter-butilo y bencilo. Si en la molécula esta presente una pluralidad de grupos protectores, estos deben ser ortogonales entre sí si no se van a eliminar simultáneamente. Si los intermediarios contienen el bloque constructivo C, los grupos protectores Cbz y bencilo son inadecuados. Las reacciones de copulación necesarias y las otras reacciones para introducir y eliminar grupos protectores se llevan a cabo bajo las condiciones estándar de la química de los péptidos (véase M. Bodanszky. A. Bodanszky "The Practice of Peptide Synthesis", 2a edición, Springer Verlag Haielberg, 1994) . Los grupos protectores Boc se eliminan utilizando dioxano/HCl o TFA/DCM, y los grupos protectores Cbz se eliminan por hidrogenólisis o con HF. La hidrólisis de las funcionalidades éster se lleva a cabo con LiOH en un solvente alcohólico o en dioxano/agua. El TFA se utiliza para disociar los ter-butil esteres. Las reacciones fueron comprobadas por CCF, normalmente utilizando las siguientes fases móviles: A. DCM/MeOH 95:5 B . DCM/MeOH 9 : 1 C. DCM/MeOH 8:2 D. DCM/MeOH/50% HOAc 40:10:5 E. DCM/MeOH/50% HOAc 35:15:5 donde se mencionan las separaciones por cromatografía en columna, estas fueron reparaciones sobre gel de sílice utilizando las fases móviles antes mencionadas. Las separaciones por CLAR en fase inversa fueron llevadas a cabo con acrilonitrilo/agua y solución amortiguadora HOAc. Los compuestos iniciales pueden ser preparados por los siguientes métodos: los ejemplos de los bloques constructivos A que se emplean para la alquilación son -bromo acetato de terbutilo, ß-bromopropionato de ter-butilo, a bromo propionato de ter-butilo, ?-bromo butirato de ter-butilo, a-bromo butirato de ter-butilo, bromo etanol protegido con THP, ?-bromo propanol protegido con THP, a-bromo-?-brutirolactona, para la aminación reductiva son dihidroxiacetona, acetondicarboxilato de di-ter-butilo, y para la adición de Michael son acrilato de ter-butilo, metacrilato de ter-butilo, fumarato de ter-butilo. Los ter-butil esteres que no puedan ser adquiridos se preparan por los métodos semejantes a los que se mencionan en G. Uray, W. Lindner, Tetrahedron 44 1988 4357-4362 que corresponden a los ácidos carboxilicos.

Bloques constructivos B: En la literatura se tiene a la disposición una amplia gama de posibilidades para la síntesis general y específica de los aminoácidos. Una revisión de la misma se proporciona por, entre otras Houben-Weyl, Volumen El6d/Parte 1, páginas 406 et seq. Los precursores que fueron frecuentemente empleados fueron benzofenona imina etiléster del ácido acético [sic], acetamido malonato de dietilo e isonitril acetato de etilo [sic] . Diversos derivados de glicina y alanina fueron preparados, por ejemplo, comenzando a partir de isonitril acetato de etilo [sic] y una cetona o aldehido adecuado (véase H. J. Prátorius, J. Flossdorf, M. R. Kula Chem. Ber. 108 (1975) 3079) . La síntesis de 2-norbornil glicina, adamantil alanina, D-ciclohexilalanina, 4-isopropil-l-ciclohexilalanina, 4-metil-1-ciclohexilalanina y 4-metil-l-ciclohexilglicina se llevaron acabo a través de los 2-formilaminoacrilatos de etilo correspondientes (U. Schollkopf y R. Meyer, Liebigs Ann. Chem. 1977, 1174) comenzando a partir de isocianoacetato de etilo con los compuestos carbonilo relevantes 2-norbornanona, 1-formiladamantano, 1-formil-l-metilciclohexano, l-formil-4-isopropilciclohexano, 1-formil-4-metilciclohexano y 4-metilciclohexanona por los siguientes métodos generales: método general para sintetizar 2-formilamino acrilatos de etilo. Una solución de 100 mol e isocianato acetato de etilo en 50 ml de THF se adiciona gota a gota a 100 mmol de terbutóxido de potasio en 150 ml de THF a 0-10°C. Después de 15 minutos, a la misma temperatura 100 mmol del compuesto carbonilo adecuado en 50 ml de THF se adicionan, se permite que la mezcla de reacción se eleve lentamente a la temperatura ambiente, y se arrastra el solvente en un evaporador rotatorio. El residuo se mezcla con 50 ml de agua, 100 ml de ácido acético y 100 ml de DCM, y el producto se extrae con DCM. La fase DCM se seca sobre Na2S04 y el solvente se arrastra en un evaporador rotatorio. Los productos resultan casi puros pero pueden, si es necesario, ser purificados más por cromatografía en columna sobre gel de sílice (fases móviles: mezclas éter/éter de petróleo).

Método general para clorhidratos de aminoácidos comenzando a partir de 2-formilaminoacrilatos de etilo. 100 mmol de 2-formilaminoacrilatos de etilo se hidrogenan con Pd/C (10%) e hidrógeno en 200 ml de ácido acético glacial hasta que se completa la reacción. El catalizador luego se filtra, el ácido acético se evapora tanto como sea posible en un evaporador rotatorio, y el residuo se somete a reflujo en 200 ml de ácido clorhídrico presentado al 50% durante 5 horas. El ácido clorhídrico se arrastra en un evaporador rotatorio, y el producto se seca a 50°C bajo presión reducida y luego se lava varias veces con éter. Los clorhidratos resultan como cristales de color pálido. 26.6 g de clorhidrato de 2-norbornilglicina fueron obtenidos comenzando a partir de 16.5 g (150 mmol) de 2-norbornanona . 26.0 g de clorhidrato de adamantilalanina fueron obtenidos comenzando desde 19.7 g (120 mmol) de 1-formiladamantano . 16.6 g de clorhidrato de gama-metilciclohexilalanina fueron obtenidos comenzando desde 12.6 g (100 mmol) de 1-formil-l-metilciclohexano. 15.9 g de clorhidrato de 4-metilciclohexilglicina fueron obtenidos comenzando a partir de 16.8 g (150 mmol) de 4-metilciclohexanona . 18 g de clorhidrato de trans-4-metil-l-ciclohexilalanina fueron obtenidos comenzando desde 15 g de trans-l-formil-4-metilciclohexano. 10 g de clorhidrato de 3, 3-dimetil-l-ciclohexilalanina fueron obtenidos comenzando a partir de 9 g de 3,3-dimetil-1-formilciclohexano . El aldehido l-formil-3, 3-dimetilciclohexano necesario para la síntesis se prepara por un método basado en los descritos por Moskal y Leusen (Rec. Trav. Chim. Pays-Bas 106 (1987) 137-141: una solución de n-butillitio en n-hexano (72 ml, 115 mmol) fue adicionada gota a gota durante el transcurso de 10 minutos a una solución en agitación de isocianometil fosfonato de dietilo (17 ml, 105 mmol) en 250 ml de dietiléter anhídrido a -60°C. La suspensión resultante fue entonces agitada a -60°C durante 15 minutos y, durante el transcurso de 10 minutos, se adicionó una solución de 3,3-dimetilciclohexanona (13 g, 105 mmol) en 100 ml de dietiléter anhidro, manteniendo la temperatura abajo de -45°C. La mezcla de reacción se dejo llegar a 0°C y, después de agitación a esta temperatura durante 90 minutos, se adicionó cuidadosamente 150-200 ml de ácido clorhídrico acuoso al 38% de concentración. La mezcla fue agitada vigorosamente a temperatura ambiente durante 15 minutos para completar la hidrólisis. La fase orgánica fue separada y lavada con 200 ml cada vez de agua, solución saturada de bicarbonato de sodio y solución saturada de cloruro de sodio. Este se seco sobre sulfato de magnesio, se filtró y concentró en un evaporador rotatorio para eliminar el solvente. El residuo resultante fue empleado sin mayor purificación como material inicial para sintetizar el aminoácido.

Boc- (D) -a-metil-ciclohexilalanina: 3.4 g (12.2 mmol) de Boc- (D) -a-metil-Phe-OH fueron hidrogenados en 100 ml de MeOH en presencia de 250 mg de Rh al 5% sobre AI2O3 a 10 bar de hidrógeno a 50°C durante 24 horas. La filtración y extracción del solvente dio como resultado 2.8 g de Boc- (D) -a-metil-Cha-OH. ^-H-NMR (DMSO-d6, d en ppm) : 12 (serial muy amplia, COOH); 1.7-0.8 (25 H) ; 1.35 (s, Boc), 1.30 (s, Me)). El Boc- (3-Ph) -Pro-OH fue sintetizado por un método semejante al que se describe en J. Y.L. Chung et al. J. Org. Chem. 1990, 55, 270) .

Preparación de Boc- (D, L) -Dch-OH Boc- (D, L) -Dpa-OH (1 mmol) fue hidrogenado en 12 ml de MeOH junto con cantidades catalíticas de Rh/Al2?3 al 5% a 5 bar. La filtración y eliminación del solvente a presión reducida dio como resultado dio como resultado el producto en rendimiento cuantitativo.

Preparación de H- (D, L) -Chea-OH: 4.0 g de metansulfonato de cicloheptilmetilo (19.39 mmol) preparado a partir de cicloheptilmetanol y cloruro de metansulfonilo fueron sometidos a reflujo junto con 4.9 g de benzofenona imina glicina etiléster [sic] (18.47 mmol), 8.9 g de carbonato de potasio polvo fino, seco (64.65 mmol) y 1 g de bromuro de tetrabutilamonio (3 mmol) en 50 ml) de acetonitrilo seco bajo una atmósfera de gas inerte durante 10 horas. El carbonato de potasio fue luego filtrado, el filtrado fue evaporado a sequedad y el producto crudo fue hidrolizado directamente con 20 ml de ácido clorhídrico 2 N en 40 ml de etanol, agitando a temperatura ambiente durante 1.5 horas. La solución de la reacción fue diluida y luego la benzofenona fue extraída con acetato de etilo en el rango ácido, y posteriormente el H- (D, L) -Chea-OEt fue extraído con DCM en el rango alcalino (pH=9) , y la solución fue secada sobre sulfato de magnesio y concentrada en un evaporador rotatorio. Rendimiento 3.7 g _ 95% del teórico. El compuesto de D- (1, 4-ciclohexadien-l-il) ala-OH [sic] fue preparado por el método de G. Zivilichovsky, V. Gurvich J. Chem. Soc. Perkin Trans I 19 (1995) 2509-15. H- (D,L) -ß,ß-Me2Cha-OH fue preparado por el método de U. Schóllkopf, R. Meyer, L. Ann. Chem. (1977) 1174-82. Los aminoácidos fueron convertidos con dicarbonato de di-terbutilo en agua/dioxano por los métodos convencionales en la forma Boc protegidas en cada caso y posteriormente recristalizados a partir de las mezclas acetato de etilo/hexano o purificado por cromatografía en columnas sobre gel de sílice (fases móviles: mezclas de acetato de etilo/éter de petróleo. Los aminoácidos protegidos con Boc fueron empleados como bloques constructivos B como se muestra en el esquema I. Los aminoácidos como los bloques constructivos B fueron también en algunos casos convertidos en los bencilésteres correspondientes y unidos a los bloques constructivos A adecuadamente protegidos. En el caso de los compuestos con una funcionalidad N-H que todavía estaban libres, estos fueron posteriormente protegidos con un grupo Boc, el grupo benciléster fue eliminado por hidrogenación, y el bloque constructivo A-B-OH fue purificado por cristalización, precipitación salina o cromatografía en columna. Esta vía se describe a manera de ejemplo por tBuOOC-CH2- (Boc) (D) Cha siguiente.

Síntesis de (D) -ciclohexilalanina benciléster: Una suspensión de 100 g (481 mmol) de D-clorhidrato de D-ciclohexilalanina, 104 g (962 mmol) de alcohol bencílico y 110 g (577 mmol) de monohidrato del ácido p-toluensulfónico en 2200 ml de tolueno fue lentamente calentado a reflujo con un separador de agua. El desprendimiento de cloruro de hidrógeno y disolución de la suspensión para dar una solución clara fue observado en el rango de temperatura 80- 90°C. Cuando ya no se separo más agua (aproximadamente a las 4 horas) , 500 ml de tolueno fueron destilados, la mezcla de reacción se dejo enfriar durante la noche y el residuo resultante fue filtrado y lavado dos veces con 1000 ml de hexano cada vez. El residuo resultante (195 g) fue entonces suspendido en 2000 ml de diclorometano y, después de la adición de 1000 ml de agua, ajustado a pH 9-9.5 por adición gradual de solución de hidróxido de sodio al 50% de concentración con agitación. La fase orgánica fue separada, lavada dos veces con 500 ml de agua cada vez, secada sobre sulfato de sodio y filtrada para eliminar el desecante y la concentración del filtrado dio como resultado 115 g (94%) del producto como aceite pálido.

N- (ter-butiloxicarbonilmetil) - (D) -ciclohexilalanina benciléster: 115 g (440 mmol) de (D) -ciclohexialanina benciléster fueron disueltos en 2000 ml de acetonitrilo y, a temperatura ambiente, 608 g (4.40 mol) de carbonato de potasio y 94 g (484 mmol) de bromo acetato de tert-butilo fueron adicionados, y la mezcla se agitó a esta temperatura durante 3 dias. El carbonato fu filtrado, lavando con acetonitrilo, el licor madre fue concentrado (30°C, 20 mbar) , el residuo se tomó en 1000 ml de metilterbutil éter, y la fase orgánica fue extraída con ácido cítrico al 5% de concentración y solución saturada de bicarbonato de sodio. La fase orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada para eliminar el desecante y concentrada, y el aceite resultante (168 g) fue empleado directamente en la siguiente reacción.

N-Boc-N-) ter-butiloxicarbonilmetil) - (D) -ciclohexilalanina benciléster: El aceite (168 g, 447 mmol) obtenido en la síntesis anterior fue disuelto en 1400 ml de acetonitrilo y, después de la adición de 618 g (4.47 mmol) de carbonato de potasio en polvo y 107 g (492 mmol) de dicarbonato de diterbutilo fueron agitados a temperatura ambiente durante 6 días. El carbonato de potasio fue filtrado con succión, lavando con aproximadamente 1000 ml de acetonitrilo y el filtrado fue concentrado. 230 g del producto necesario fueron obtenidos.

Sal de N-Boc-N- (ter-butiloxicarbonilmetil) - (D) -ciclohexilalanina ciclohexilamonio : 115 g de N-Boc-N- (ter-butiloxicarbonilmetil) - (D) -ciclohexilalanina benciléster fueron disueltos en 1000 ml de etanol puro e hidrogenados en presencia de 9 g de Pd al 10% sobre carbono activo bajo hidrógeno a presión atmosférica a 25-30°C durante 2 horas. La filtración y eliminación del solvente en un evaporador rotatorio dio como resultado 100 g (260 mmol) de un aceite amarillo que fue tomado en 1600 ml de acetona y calentado a reflujo. El baño de calentamiento fue retirado y una solución de 27 g (273 mmol) de ciclohexilamina en acetona fue rápidamente adicionada a través de un embudo de separación. La sal requerida cristalizo con el enfriamiento de la mezcla de reacción a la temperatura ambiente. El sólido fue filtrado, lavado con 200 ml de acetona y, para la purificación final, recristalizado una vez más a partir de acetona. El secado del residuo en un vacío de aproximadamente 30°C [sic] dio como resultado 70.2 g de la sal requerida como polvo blanco. La (L) -3, 4-dehidroprolina empleada como el bloque constructivo C puede ser adquirida, y el ácido (D,L)-4,5-dihidropipecólico puede ser preparado [lacuna] J. Org. Chem. 25 (1960) 489 o C. Herdeis, W. Engel Arch. Pharm. 326 (1993) 297 y posteriormente se convierte con Boc0 en Boc- (D, L) -Dep-OH. La síntesis de los bloques constructivos D se describe en DE 444 33 90.

Ejemplo 1 N-hidroxicarboxicarbonilmetilen- (D) -ciclohexilalanil-3, 4-dihidroprolil [sic] (4-amidinas) bencilamidas: Boc-3, 4-dihidropropil [sic] 4-cianobencilamida: Boc-3, 4-dihidroprolina (4.7 g, 22.0 mmol) y 4-cianobencilamina (4.1 g, 24.2 mmol; DE 444 33 90) fueron disueltos en diclorometano (25 ml) . La solución fue enfriada a 0°C, y se adicionó etildiisopropilamina (26.4 ml, 154 mmol) . Posteriormente, anhídrido propanfosfónico al 50% de concentración en acetato de etilo (23.3 ml, 110 mmol) fue adicionado lentamente gota a gota. La mezcla fue agitada a 0°C durante 1 hora y a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego diluida con diclorometano y lavada con solución diluida de disulfato de sodio (3x) , solución diluida de bicarbonato de sodio (3x) y solución saturada de cloruro de sodio. El secado sobre sulfato de sodio fue seguido por concentración al vacío con bomba de agua. 7.47 g del producto crudo fue obtenido . 3, 4-Dihidroprolil [sic] 4-cianobencilamida: El producto Boc-3, 4-dihidropropil [sic] 4-cianobenzilamida (7.47 g) obtenido en el experimento anterior fue disuelto en diclorometano (88 ml) y se adiciono ácido clorhídrico etéreo (88 ml, 5 ml) . La mezcla fue entonces agitada a temperatura ambiente durante 1.5 h. El solvente fue destilado al vacío con bomba de agua. El residuo fue mezclado dos veces con diclorometano y el solvente destilado al vacío con bomba de agua. Este después fue extraído por agitación dos veces con dietiléter. 5.32 g del producto crudo fueron obtenidos .

N- (ter-butoxicarbonilmetilen) - (N-BOC) - (D) -ciclohexilalanil-3, 4-dihidroprolil [sic] 4-cianobencilamida: t-BuOOC-CH2-(Boc)-(D)-Cha-OH (7.59 g, 19.68 mmol) y H-Pyr-4-cianobencilamida (5.19 g, 19.68 mmol) fueron disueltos en diclorometano (100 ml) , y se adicionó etildiisopropilamina (12.72 g, 98.4 mmol). La solución fue enfriada a 0°C, y se adicionó gota a gota durante el transcurso de 20 minutos anhídrido propanfosfónico al 50% de concentración en acetato de etilo (20 ml) y, después de agitación a 0-10°C durante 3 horas, la mezcla fue diluida con diclorometano (100 ml) y lavada con solución concentrada al 10% de disulfato de sodio (3x) solución saturada de bicarbonato de sodio (2x) y agua. El secado sobre sulfato de sodio fue seguido por la eliminación del solvente por destilación al vacío de bomba de agua. Se obtuvieron 13.28 g de un aceite café claro.

N- (ter-butoxicarbonilmetilen) - (N-Boc) - (D) -ciclohexilalanil-3, 4-dihidroprolil [sic] 4-aminotiocarbonilbencilamida: El producto crudo t-BuOOC-CH2- (Boc) - (D) -Cha) -Pyr 4-cianobencilamida (13.28 g) obtenido en el experimento anterior fue disuelto en piridina (70 ml) y trietilamina (12 ml) , y la solución fue enfriada a 0°C y saturada con sulfuro de hidrógeno (la solución se volvió de color verde) . Esta fue entonces agitada a la temperatura ambiente durante 48 horas. El exceso de sulfuro de hidrógeno fue desplazado con nitrógeno, y el solvente fue disuelto [sic] al vacío con bomba de agua. El residuo fue disuelto en dietil éter y lavado 3x con solución de bisulfato de sodio al 20%, solución saturada de bicarbonato de sodio (2x y agua) . El secado sobre sulfato de sodio fue seguido por la eliminación del solvente por destilación al vacío en bomba de agua. El producto impuro (14.3 g) fue purificado por cromatografía instantánea (gel de sílice, gradiente de diclorometano a diclorometano: metanol = 50:1). Rendimiento: 13.3 g (contiene pequeñas cantidades de solvente) .

N- (ter-butoxicarbonilmetilen) - (N-Boc) - (D) -ciclohexilalanil-3, 4-dihidroprolil 4-S-metiliminocarbonilbencilamida [sic]: Yoduro de metilo (7.97 ml, 126.90 mmol) fue adicionado al t-Bu00C-CH2~ (Boc) - (D) -Cha-Pyr-aminotiocarbonil-bencilamida (13.3 g) obtenido en el experimento anterior en diclorometano (135 ml) . Después de agitar a temperatura ambiente durante 24 horas, el solvente fue destilado al vacío en bomba de agua. 15.73 g de un aceite amarillento pálido fue obtenido.

N- (ter-butoxicarbonilmetilen) - (N-Boc) - (D) -ciclohexilalanil-3, 4-dihidroprolil [sic] 4-amidinobencilamida: El yodhidrato de t-BuOOC-CH2- (Boc) - (D) -Cha-Pyr 4-S-metiliminocarbonil-bencilamida [sic] (15.73 g) del producto crudo obtenido del experimento anterior fue disuelto en acetonitrilo (1290 ml) , y se adicionó acetato de amonio (3.25 g, 42.3 mmol). La mezcla fue entonces calentada a 50°C durante 1.5 horas y, después de concentración al vacio en bomba de agua se adicionó diclorometano. Las sales precipitadas fueron filtradas, y el filtrado fue concentrado al vacío en bomba de agua. 15.17 g de espuma amarillenta fue obtenido . El producto crudo fue convertido en el acetato sobre un intercambiador iónico (Fluka, orden No. 00402, acetato sobre soporte polimérico). Rendimiento: 13.3 g.

N- (hidroxicarbonilmetilen- (D) -ciclohexilalanil-3, 4-dihidro-prolil [sic] (4-amidino) bencilamida: Hidroacetato de t-BuOOC-CH2- (Boc) - (D) -Cha-Pyr 4-amidinobencilamida (13.3 g) fue disuelto en diclorometano (200 ml) y se adicionó HCl etéreo (45 ml) . La agitación a temperatura ambiente durante 2 horas fue seguida por evaporación a sequedad al vacío en bomba de agua. El residuo fue mezclado dos veces con diclorometano y el solvente fue destilado al vacío en bomba de agua. 11.6 g del producto crudo fueron obtenidos . Parte del producto crudo (3 g) fue convertido en el acetato sobre un intercambiador de iones (Fluka, orden No. 00402, acetato sobre soporte polimérico) . El producto resultante (2.9 g) fue purificado por cromatografía instantánea (gel de sílice, gradiente de diclorometano: metanol = 4:1 a diclorometano: metano: ácido acético al 50% = 40:10:2 hasta diclorometano: metanol: ácido acético al 50% = 35:15:5). Se obtuvo un aceite amarillento y fue disuelto en agua. Después de la filtración, el filtrado fue secado por congelamiento. Rendimiento: 2.13 g de un sólido incoloro. FAB-MS (M+H+) : 456.

Los siguientes fueron preparados en una forma semejante al ejemplo 1: 2. N- (hidroxicarbonilmetilen- (D) -ciclohexilglicil-3, 4-dihidroprolil [sic] (4-amidino) bencilamida: FAB-MS (M+H+) : 442 3. N- (hidroxicarbonilmetilen- (D, L) -cicloheptilalanil-3, 4-dihidroprolil [sic] (4-amidino) bencilamida: FAB-MS (M+H"r) : 470 4. N- (hidroxicarbonilmetilen- (D) -ter-butilalanil-3, 4-dihidroprolil [sic] (4-amidino) bencilamida: FAB-MS (M+H+) : 430 5. N- (hidroxicarbonilmetilen- (D) -ciclohexilalanil-4 , 5-dihidropipecolil [sic] (4-amidino) bencilamida: FAB-MS (M+H+) : 470 El efecto antitrombótico de los compuestos novedosos fue demostrado en la derivación arteriovenosa en ratas. En este experimento, un capilar de vidrio en una derivación arteriovenosa actúa como superficie trombogénica artificial e inicia a trombosis. La rata anestesiada (uretano 25%, 2 x 8 mg/kg i.p.) se fija en posición supina sobre una plataforma con control de temperatura (37°C) . La arteria carótida derecha y la vena yugular se exponen y se plantan en estas catéteres cortos de polietileno (Portex, PE 50) , llenos con solución de NaCl fisiológico y se sujetan con pinzas. Los extremos libres de los catéteres se conectan mediante un capilar de vidrio con un diámetro interno de 1.0 mm y una longitud de 20.0 mm que actúan como la superficie trombogénica. La sustancia de prueba puede ser administrada por vía intravenosa, subcutánea, oral o por infusión. Después del tiempo de incubación requerida con la sustancia de prueba o el solvente (control) , la derivación se abre separando las pinzas. El flujo sanguíneo a través de la derivación origina una rápida elevación en su temperatura, lo cual se mide en el centro del capilar de vidrio. El incremento desde la temperatura ambiente a la temperatura corporal indica la abertura de la derivación. La temperatura se registra continuamente hasta que se bloquea la derivación. Además, las muestras de sangre se toman para la determinación de la actividad anti-F lía en plasma cuando la derivación se abre y al término del experimento.

Farmacocinética y parámetros de coagulación en perros Las sustancias de prueba se disuelven en solución salina isotónica inmediatamente antes de la administración a perros mestizos conscientes. Los volúmenes administrados son 0.1 ml/kg para la inyección en el bolo intravenoso y 1 ml/kg para la administración oral por cebadura. Las muestras de la sangre venosa (2 ml) en tubos con citrato se toman antes y 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 300 y 360 minutos (si se requiere después de 420, 480 minutos y 24 horas) después de la administración intravenosa de 1.0 mg/kg, o antes y 10, 20, 30, 60, 120, 180, 240, 300 y 360, 480 minutos y 24 horas después de la administración oral de 4.64 mg/kg. Inmediatamente después del muestreo se determina el tiempo de ecarina (ECT = tiempo de coagulación de ecarina) se determina en la sangre completa. Después de la preparación del plasma por centrifugación, el tiempo de trombina en plasma y el tiempo de trombina parcial activada (APTT) se determinan utilizando un medidor de la coagulación. También se determina la actividad anti-F lía (ATU/ml) y la concentración de la sustancia mediante su actividad anti-F lia en el plasma mediante un ensayo cromogénico de trombina (S-2238) , empleando gráficas de calibración con r-hirudin y la sustancia de prueba. La concentración del plasma de la sustancia de prueba es la base para calcular los parámetros farmacocinéticos: el tiempo de la concentración máxima en plasma (T max) , concentración máxima en plasma; vida media en plasma T0.s; área bajo la curva (ABC) ; fracción absorbida de la sustancia de prueba (F) .

Parámetros de coagulación: El tiempo de ecarin (ECT = tiempo de coagulación ecarin) : 100 µl de sangre tratada con citrato se incuban en un coagulómetro (CL 8, tipo esfera, Bender & Hobein, Munich, FRG) a 37°C durante 2 minutos. Después de la adición de 100 µl del reactivo ecarin precalentado (37°C) (Pentapharm) se determina el tiempo hasta que se forma un coagulo de fibrina. El tiempo de tromboplastina activada (APTT) : 50 µl de plasma tratado con citrato y 50 µl del reactivo PTT (Pathrombin, Behring) se mezclan e incuban en un coagulómetro (CL 8, tipo esfera, Bender & Hobein, Munich, FRG) a 37°C durante 2 minutos. Después de la adición de 50 µl de cloruro de calcio precalentado (37°C) , se determina el tiempo hasta que se forma un coagulo de fibrina. Tiempo de trombina (TT) : 100 µl de plasma tratado con citrato se incuban en un coagulómetro (CL 8, tipo esfera, Bender & Hobein, Munich, FRG) 37°C durante 2 minutos. Después de la adición de 100 µl de reactivo de trombina precalentado (37°C) (Boehringer Mannheim) , se determina el tiempo hasta que se forma un coagulo de fibrina. Los compuestos novedosos mostraron buen efecto en estas pruebas .

Claims (10)

RE I VIND I CAC I ONE S

1. Un compuesto de la fórmula I R2 R4 R5 Rl-(CH2)m-C -(CH2)n -N-C-CO — N (CH2)i i i T donde R, R , R , R , R , R y R , 1, m y n tienen los siguientes significados: 1 0 ó 1, m 0, 1 ó 2, n 0, 1 ó 2, R H o alquilo de C1-4, R1 HOOC, alquilo de C?-6-OOC-, bencil-OOC- ó -OH, R2 H, alquilo de C1-4, o R1 {CH2) m~ , R3 H- o alquilo de C1-4- que puede ser sustituido por -OH o -COOH, R4 H- alquilo de C1-4, HOOC-alquileno de C3.-4, R5 es alquilo de C?-8, cicloalquilo-CR8R9r- (r= 0 ó 1, R8, R9=

H-, cicloalquilo-, o alquilo de C1-4), en el cual hasta cuatro grupos CH2 en el radical cicloalquilo pueden ser sustituidos, independientes entre si, por CR10R1:L (R10= H- 0 alquilo de C1-4, R11 = alquilo de C1-C4) , y/o el grupo CH en el radical cicloalquilo al cual esta unido, CR8R9 puede ser sustituido por CR12 (R12 = alquilo de C?-4), y/o 1 o 2 enlaces sencillos C-C en el anillo pueden ser sustituidos por un doble enlace C=C, R6 H-, alquilo de C1-C4, o, R4 y R5 juntos -CH2-CH-CH(R7) -, (R7 = H-, fenil- o ciclohexil-) R2 y R5 juntos -CH2-CH2 o -CH2-CH2-CH2-, en el cual un átomo de hidrógeno puede ser sustituido por alquilo de C1-4, fenil- o cicloalquil-, y las sales de los mismos con los ácidos fisiológicamente tolerados. 2. El compuesto de la fórmula I como se menciona en la reivindicación 1 para uso para controlar enfermedades.

3. El uso de un compuesto de la fórmula 1 como se reclama en la reivindicación 1 para producir medicamentos para: • enfermedades cuyo mecanismo patogénico proviene directa o indirectamente del efecto proteolítico de trombina, • enfermedades cuyo mecanismo patogenético proviene de la activación dependiente de trombina de los receptores y la transducción de señal, • enfermedades asociadas con la estimulación o inhibición de la expresión de genes en las células corporales, • enfermedades provenientes del efecto mitogénico de trombina, • enfermedades provenientes del cambio dependiente de trombina en la contractilidad y permeabilidad de las células epiteliales, • sucesos tromboembólicos dependientes de trombina, coagulación intravascular diseminada, • reoclusión y para reducir el tiempo de reperfusión sobre la co-medicación con trombolíticos, • la presencia de reoclusión temprana y restenosis tardía, después de PTCA, • proliferación dependiente de trombina de las células del músculo liso, • la acumulación de trombina activa en el CNS, • crecimiento de tumor y para evitar la adhesión y metástasis de las células tumorales.

4. El compuesto de la fórmula I como se menciona en la reivindicación 1 para recubrir superficies.

5. El uso de un compuesto de la fórmula I como se menciona en la reivindicación 1 para producir medicamentos para: • enfermedades cuyo mecanismo patogenético proviene directa o indirectamente del efecto proteolítico de cininogenasas, especialmente calicreina, • enfermedades inflamatorias como asma, pancreatitis, rinitis, artritis, urticaria y otras enfermedades internas en las cuales está involucrada la calicreina.

6. Un compuesto que contiene un fragmento estructural de la fórmula: donde 1 es 0 ó 1 y R es H- o alquilo de C1-4.

7. Un compuesto de la fórmula: R2 4 R5 Rl-(CH2)m- donde R, R1, R2, R3, R4, R5 y R6, y 1, m y n tienen los significados antes mencionados en la reivindicación 1.

8. Un compuesto de la fórmula: donde 1 y R tienen los significados establecidos en la reivindicación 1, y Y es un grupo N protector, un aminoácido protegido o no protegido en el N terminal o H-.

9. Un inhibidor de serina proteasas que contiene un fragmento estructural de la fórmula: donde 1 es 0 ó 1, y R es H, o alquilo de C1-4

10. El uso del fragmento estructural de la fórmula en la cual l es O ó l y R es H o alquilo de C1-4 como un constituyente de la estructura completa de los compuestos que tienen un efecto inhibidor de la serina proteasa.