MXPA99001342A - Un ligando relacionado al factor de necrosis tumoral - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un ligando relacionado al factor de necrosis tumoral (TRELL), un nuevo miembro de la familia de factores de necrosis tumoral (TNF), TRELL modificado y composiciones farmacéuticas que los contienen.

Description

UN LIGANDO RELACIONADO AL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ANTECEDENTES DE LA IHVENCIÓN La presente invención se refiere al ligando relacionado al factor de necrosis tumoral o "TRELL", un polipéptido «que es un miembro de la familia de los factores de necrosis tumoral. La proteína o su receptor pueden tener aplicaciones anti-cáncer y/o in unorregruladoras .

Además, las células transfectadas con el gen de TRELL se pueden usar en la terapia génica para tratar tumores, enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias o trastornos genéticos, heredados. La invención descrita en la presente se hace en parte durante el transcurso del trabajo bajo la concesión #31-42275.94 y 32-41729.94 a Irene García del Fondo Nacional Suizo. Los derechos reservados se describen en los párrafos #27 y #29 del Estatuto del Fondo Nacional Suizo .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las citocinas (también llamadas citoquinas) relacionadas al factor de necrosis tumoral (TNF) son mediadores de la regulación inmunitaria y de defensa del hospedero. Los miembros de esta familia existen en formas ancladas a la membrana, «que actúan localmente a través del P753 contacto célula con célula, o como proteínas segregadas capaces de difundirse a objetivos más distantes. Una familia paralela de receptores señala la presencia de estas moléculas que conducen a la iniciación de la muerte celular o la proliferación celular y la diferenciación en el tejido objetivo. Actualmente, la familia de ligandos de TNF y receptores tiene al menos 9 pares receptor-ligando reconocidos, que incluye: TNF: TNF-R; LT-OC: TNF-R; LT-a/ß:LT-ß-R; FasLrFas; CD40L:CD40; CD30L:CD30; CD27L:CD27; 0X4OL: 0X40 y 4-1BB : 4-lBB . Las secuencias de ADN «gue codifican para estos ligandos tienen solo cerca del 25 % a aproximadamente 30 % de identidad en aún la mayoría de los casos relacionados, aunque la relevancia de los aminoácidos es de cerca del 50 %. La característica definitiva de esta familia de receptores de citocinas se encuentran en el dominio extracelular rico en cisteína revelado inicialmente por la clonación molecular de dos receptores de TNF, distintos1. Esta familia de genes codifica para glicoproteínas características de las proteínas transmembrana tipo I con un dominio de unión de ligando extracelular, una región de extensión de membrana individual, y una región citoplasmática comprendida en la activación de las funciones celulares. La región de unión de ligando, rica en cisterna exhibe un dominio de núcleo enlazado a disulfuro, apretadamente entretejido, qaae, dependiendo del miembro particular de la familia, se repite varias veces. La mayoría de los receptores tienen cuatro dominios, aunque puede haber tan pocos como tres, o tantos como seis. Las proteínas en la familia de ligandos de TNF se caracterizan por un tramo N-terminal, corto de aminoácidos hidrófilos, normalmente cortos, que contiene frecuentemente varios residuos de lisina o arginina gue se piensa «que sirven como secuencias de transferencia, finalizadoras . Después de segruir una región de transmembrana y una región extracelular de longitud variable, se separa el dominio de unión del receptor, C-terminal de la membrana. Esta región algunas veces se refiere como el "tallo" . La región de unión C-terminal comprende la masa de la proteína, y frecuentemente, pero no siempre, contiene sitios de glicosilación. Estos genes carecen de las secuencias de señal clásicas, características de las proteínas de membrana tipo I, «gue tienen proteínas de membrana tipo II con el C-término ?rue está fuera de la célula, y el N-término corto «que reside en el citoplasma. En algunos casos, por ejemplo, la escisión de TNF y LT- en la región del tallo puede ocurrir tempranamente durante el procesamiento proteico y el ligando luego se encuentra principalmente en la forma segregada. Sin embargo, la mayoría de los ligandos existen en una forma de membrana, que median la señalización localizada. La estructura de estos ligandos se ha definido bien por análisis cristalográfico de TFN, LT-a y CD40. El TNF y la linfotoxina-a (LT-a) están ambos estructurados en una intercalación de dos hojas ß-chapeadas, antiparalelas con el "rodillo de gelatina" o la topología de la llave griega2. La desviación RMS entre los residuos de Ca y ß-hebra es de 0.61 C, sugiriendo un alto grado de similitud en su topografía molecular. Una característica estructural «gue emerge de los estudios moleculares de CD40L, TNF y LT-a es la propensión al montaje en complejos oligoméricos. Intrínseca a la estructura oligomérica es la formación del sitio de unión del receptor en la unión entre las subunidades vecinas creando un ligando multivalente. Las estructuras cuaternarias de TNF, CD40 y LT-a se han mostrado que existen como trímeros por análisis de sus estructuras cristalinas. La mayoría de los aminoácidos conservados entre los diferentes ligandos son en tramos de la ß-hoja de saliente. Probablemente es «que la estructura básica de intercalación se conserve en todas estas moléculas, puesto que las porciones de estas secuencias de saliente se conservan entre los varios miembros de la familia. La estructura cuaternaria también se puede mantener puesto «que la conformación de la subunidad probablemente va a permanecer similar.

Los miembros de la familia de TNF se pueden describir mejor como cambios dominantes en el sistema inmunitario «gue controlan tanto la supervivencia como la diferenciación celular. Solo el TNF y LT-a se reconocen corrientemente como citocinas segregadas que contrastan con los otros miembros predominantemente anclados a la membrana de la familia de TNF. En tanto «que una forma de membrana de TNF ha sido bien caracterizada y probablemente va a tener papeles biológicos únicos, el TNF segregado funciona como una alarma general que señala a las células más distantes del sitio del caso de activación. De esta manera, la secreción de TFN puede amplificar un caso que conduce a cambios bien descritos en el forro de la vasculatura y el estado inflamatorio de las células. En contraste, los miembros unidos a la membrana de la familia envían señales a través de los receptores tipo TNF solo a las células en contacto directo. Por ejemplo, las células T proporcionan "ayuda" mediada por CD40 solo a a«guellas células B puestas en contacto directo vía las interacciones TCR similares. Las limitaciones similares de contacto célula con célula en la capacidad para inducir la muerte celular aplican a los sistemas Fas bien estudiados. La capacidad para inducir la muerte celular, programada es una característica importante bien estudiada de varios miembros de la familia de TNF. La apoptosis mediada por Fas parece jugar un papel en la regulación de los linfocitos autorreactivos en la periferia y posiblemente el timo (Castro y colaboradores, 1996) y el trabajo reciente también ha implicado a los sistemas de TNF y CD30 en la supervivencia de las células T y las líneas de linfoma anaplásticas de células grandes (Amakawa y colaboradores, 1996; Gruss y colaboradores, 1994; Sytwu y colaboradores, 1996; Zheng y colaboradores, 1995). Nosotros y otros hemos mostrado previamente que la muerte de esta línea en respuesta a la señalización por el receptor de TNF, Fas o LTb tiene características de apoptosis. (Abreu-Martin y colaboradores, 1995; Browning y colaboradores, 1996). Parece «que se pueden segregar los ligandos de TNF en tres grupos basados en su capacidad para inducir la muerte celular (Tabla III) . Primero, el TNF, el ligando de Fas y TRAIL pueden inducir eficientemente la muerte celular en muchas células y sus receptores probablemente tengan la mayoría buenos dominios de muerte canónica. Presumiblemente, el ligando DR-3 (TRAMP/WSL-1) tendría también todo en esta categoría. Luego, existen estos ligandos quienes accionan una señal débil de muerte limitada a pocos tipos de células y TRAIL, ligando de CD30 y LTalb2 son ejemplos de esta clase. Como este grupo puede accionar la muerte celular en la ausencia del dominio canónico de muerte es una cuestión interesante y sugiere que existe un mecanismo de señalización más débil, separado, de muerte. Finalmente, existen aquellos miembros que no pueden distribuir eficientemente una señal de muerte. Probablemente todos los grupos pueden tener efectos antiproliferativos en algunos tipos de células consecuentes a la inducción de la diferenciación celular, por ejemplo, CD40 (Funakoshi y colaboradores, 1994) . La familia de TNF ha crecido dramáticamente en años recientes para abarcar al menos 11 rutas de señalización diferentes que comprenden la regulación del sistema inmunitario. Los patrones de expresión de TRELL y TRAIL indican que existen aún una variedad más funcional por ser descubierta en esta familia. Este aspecto se ha resaltado especialmente en el reciente descubrimiento de dos receptores que afectan la capacidad del sarcoma de Rous y el virus del herpes simple para replicarse, así como las observaciones históricas «gue el TNF tiene actividad antiviral y los pox virus codifican para los receptores de TNF de señuelo (Brojatsc y colaboradores, 1996; Montgomery y colaboradores, 1996; Smith, 1994; Vassalli, 1992) . La generación de TRELL soluble y la identificación del receptor de TRELL debe proporcionar las herramientas para aclarar la función biológica de esta proteína interesante. El TNF es un mediador del choque séptico y ca«quexis3, y está comprendido en la regulación del desarrollo de células hematopoyéticas4. Parece «gue juega un papel principal como mediador de la inflamación y la defensa contra infecciones bacterianas, virales y parásitas5. Así como «que tiene también actividad antitumor6. El TNF también está comprendido en diferentes enfermedades autoinmunitarias7. El TNF también se puede producir por varios tipos de células, «que incluyen macrófagos, fibroblastos, células T y células asesinas, naturales8. El TNF se une a dos diferentes receptores, cada uno «gue actúa a través de moléculas de señalización, intramoleculares, específicas, dando por resultado de esta manera diferentes efectos de TNF9. El TNF puede existir ya sea como una forma unida a la membrana o como una citocina segregada, soluble10. La LT-a comparte muchas actividades con el TNF, es decir, la unión a los receptores de TNF11, pero diferente del TNF, parece ser segregada principalmente por las células T activadas y algunos tumores ß-linfoblastoides12. El complejo heteromérico de LT-a y LT-ß es un complejo unido a la membrana «gue se une al receptor de LT-ß13. El sistema de LT (LT y LT-R) parece estar comprendido en el desarrollo de órganos linfoides, periféricos puesto que el rompimiento genético de LT-ß conduce a la desorganización de las células T y B en el bazo y una ausencia de nodulos linfáticos14. El sistema de LT-ß también está comprendido en la muerte celular de algunas líneas celulares de adenocarcinoma15. El Fas-L, otro miembro de la familia de TNF, se expresa predominantemente en células T activadas16. Induce la muerte de células «que tienen su receptor, incluyendo células tumorales y células infectadas por HIV, por un mecanismo conocido como la muerte celular programada o apoptosis17. Además, las deficiencias ya sea en Fas ó Fas-L puede conducir a trastornos linfoproliferativos, que confirman el papel del sistema de Fas en la regulación de las respuestas inmunitarias18. El sistema de Fas también está comprendido en el daño hepático «gue resulta de la infección crónica, hepatitis19 y en la autoinmunidad en pacientes infectados con HIV20. El sistema de Fas también está comprendido en la destrucción de células T en pacientes con HIV21. TRAIL, otro miembro de esta familia también parece estar comprendido en la muerte de una amplia variedad de líneas celulares transformadas de diverso origen22. El CD40-L, otro miembro de la familia de TNF, se expresa en células, e induce la regulación de células B «gue tienen CD4023. Además, las alteraciones en el gen de CD40-L dan por resultado una enfermedad conocida como el síndrome hiper-IgM X-enlazado24. El sistema de CD40 también está comprendido en diferentes enfermedades autoinmunitarias25 y P753 el CD40-L se conoce que tiene propiedades anti-virales26. Aunque el sistema de CD40 está comprendido en el rescate de las células B apoptóticas27, en células no inmunitarias, induce apoptosis28. Muchos miembros linfocíticos adicionales de la familia de TNF también están comprendidos en la co-estimulación29. En general, los miembros de la familia de TNF tienen papeles reguladores fundamentales en el control de sistema inmunitario y en la activación de los sistemas de defensa agudos del huésped. Dado el progreso corriente en la manipulación de los miembros de la familia de TNF para beneficio terapéutico, probablemente es que los miembros de esta familia puedan proporcionar un medio único para controlar la enfermedad. Algunos de los ligandos de esta familia pueden inducir directamente la muerte apoptótica de muchas células transformadas, por ejemplo, LT, TNF, ligando de Fas y TRAIL (Nagata, 1997) . La activación del receptor de Fas y posiblemente TNF y CD30 pueden inducir la muerte celular en linfocitos no transformados que puede jugar una función inmunorreguladora (Amakawa y colaboradores, 1996; Nagata, 1997; Sytwu y colaboradores, 1996; Zheng y colaboradores, 1995) . En general, la muerte se activa después de la agregación de los dominios de muerte «gue residen en el lado citoplasmático de los receptores de TNF. El dominio de muerte instrumenta el montaje de varios P753 componentes de transducción de señal que dan por resultado la activación de la caspasa (Nagata, 1997) . Algunos receptores carecen de los dominios canónicos de muerte, por ejemplo, el receptor de LTb y CD30 (Browning y colaboradores, 1996; Lee y colaboradores, 1996) pueden inducir aún la muerte celular, aunque de una manera más débil. Probablemente es que estos receptores funcionen principalmente para inducir la diferenciación celular y la muerte sea una consecuencia anormal en algunas de las líneas celulares transformadas, aunque esta imagen no es clara puesto que los estudios en los ratones nulos de CD30 sugieren un papel de muerte en la selección negativa en el timo (Amakawa y colaboradores, 1996) . Por el contrario, la señalización a través de estas rutas tal como CD40 se requiere para mantener la supervivencia celular. De esta manera, existe una necesidad de identificar y caracterizar moléculas adicionales que sean miembros de la familia de TNF, proporcionando de esta manera un medio adicional para controlar la enfermedad y manipular el sistema inmunitario.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, la presente invención se dirige a un polipéptido, a un ligando relacionado al factor de necrosis tumoral llamado TRELL que evita sustancialmente uno o más de los problemas debido a las limitaciones y P753 desventajas de la técnica relacionada. El inventor ha descubierto un nuevo miembro de la familia de TNF de citocinas, y definido tanto la secuencia de aminoácidos humana como murina, de la proteína, así como las secuencias de ADN que codifican para esta proteína. La invención reivindicada se puede usar para identificar nuevos compuestos de diagnóstico y terapéuticos para numerosas enfermedades y condiciones como se discute en más detalle posteriormente, así como para obtener información acerca de, y manipular, el sistema inmunitario y sus procesos. Adicionalmente, la invención reivindicada está comprendida en la inducción de la muerte celular en carcinoma. Las características y ventajas adicionales de la invención se expondrán en la descripción que sigue, y en parte serán aparentes de la descripción, o se pueden entender por la práctica de la invención. Los objetivos y otras ventajas de la invención se realizarán y lograrán por las composiciones y métodos particularmente señalados por la descripción escrita y las reivindicaciones de la presente, así como los dibujos anexos. De esta manera, para lograr estas y otras ventajas, y de acuerdo con el propósito de la invención, como se personifica y describe ampliamente en la presente, la invención incluye una secuencia de ADN que codifica para TRELL. La secuencia de nucleótidos para TRELL de ratón P753 (mTRELL) se muestra en SEQ ID No . 1, y para TRELL humano (hTRELL) en SEQ ID No. 3. Específicamente, la invención se refiere a secuencias de ADN «gue codifican para un TRELL que tiene la secuencia de aminoácidos identificada en SEQ ID No. 2 (mTRELL) ó 4 (hTRELL). En otras modalidades, la invención se refiere a secuencias que tienen al menos 50 % de homología con el ADN que codifica para el dominio de unión del receptor, C-terminal de TRELL e hibridizan a las secuencias de ADN codificadas o fragmentos de las mismas, y codifican para TRELL «que tiene la secuencia identificada en SEQ ID No . 4 ó SEQ ID No . 2. La invención en ciertas modalidades se refiere adicionalmente a una secuencia de ADN que codifica para TRELL donde la secuencia se enlaza operablemente a una secuencia de control de expresión. Cualquier secuencia de control de expresión, adecuada es útil en la invención reivindicada, y se puede seleccionar fácilmente por un experto en la técnica. La invención también contempla un ADN recombinante «gue comprende una secuencia que codifica para TRELL, o un fragmento de la misma, así como a hospederos con secuencias de TRELL, establemente integradas, introducidas en su genoma, o «gue poseen elementos episómicos. Cualquier hospedador adecuado se puede usar en la invención, y se puede seleccionar fácilmente por un P753 experto en la técnica sin experimentación indebida. En otras modalidades, la invención se refiere a métodos para producir TRELL sustancialmente puro que comprende el paso de cultivar hospederos transformados, y TRELL esencialmente libre de las proteínas animales, normalmente asociadas . La invención abarca TRELL que tiene la secuencia de aminoácidos identificada en SEQ ID No. 4 ó SEQ ID No. 2 así como fragmentos u homólogos de la misma. En varias modalidades, la secuencia de aminoácidos y/o de ADN de TRELL puede comprender inserciones, supresiones y sustituciones conservadoras, así como se define además posteriormente o puede comprender fragmentos de las secuencias . La invención se refiere en otras modalidades a construcciones de TRELL solubles, «gue se pueden usar para accionar directamente los eventos farmacológicos mediados por TRELL. Estos eventos pueden tener beneficio terapéutico útil en el tratamiento del cáncer o en la manipulación del sistema inmunitario para tratar enfermedades inmunológicas. Las formas solubles de TRELL se pueden volver a manejar genéticamente para incorporar una marca fácilmente reconocible, facilitando de este modo la identificación de los receptores de TRELL. En aún otras modalidades, la invención se refiere P753 a métodos de terapia génica que usan el TRELL descrito y reivindicado en la presente. Las preparaciones farmacéuticas de la invención pueden incluir, opcionalmente, portadores, adyuvantes, agentes de relleno, u otras composiciones farmacéuticas, farmacéuticamente aceptables, y se puede administrar en cualquiera de las numerosas formas o rutas conocidas en la técnica. Se va a entender que tanto en la descripción general anterior como la descripción detallada que sigue son de ejemplo y explicativas, y se proponen para proporcionar explicación adicional de la invención como se reivindica. Los dibujos anexos se incluyen para proporcionar un entendimiento adicional de la invención, y se incorporan en, y constituyen una parte de, esta especificación, ilustran varias modalidades de la invención, y conjuntamente con la descripción sirven para explicar los principios de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una comparación de secuencia de aminoácidos del TRELL humano y de ratón. Las Figuras 2A y 2B son una comparación de aminoácidos de los miembros humanos de la familia de TNF.

P753 La Figura 3 es un análisis Northern de la expresión de ARNm de TRELL en diferentes líneas y tejidos celulares de ratón. Las sendas se duplican y contuvieron ARN de (1) macrófagos peritoneales inducidos por tioglicolato, (2), médula ósea, (3) bazo, y (4) hígado. La Figura 4 es un análisis Northern de la expresión de ARNm de TRELL en diferentes tejidos humanos. Figura 5: SDS-PAGE de TNF, LTa y TRELL recombinante bajo condiciones reductoras y no reductoras. Figura 6: TRELL es citotóxico a la línea de adenocarcinoma humano HT29. A. Capacidad de TNF, TRELL, LTa/ß y anti-Fas para blo«guear el crecimiento de la línea HT29 en la presencia del interferón-g. Las células se cultivaron durante 4 días en la presencia de varios agentes y el crecimiento se evaluó usando la tinción con MTT. B. Morfología de las células que se someten a la muerte celular. Las células se precultivaron durante 2 días y luego se trataron durante 24 horas con 80 U/ml de interferón-g y A. No adición adicional, B. 100 ng/ml fijados con etanol y mostrado por la microscopía de contraste de fase en paneles superiores (aumento de 400 x) y P753 tinción con 1 ug/ml de tinte Hoescht para revelar los núcleos en el panel del fondo. Las células típicas con núcleos condensados característicos de la apoptosis se indican con flechas .

DESCRIPCIÓN DETALLADA Ahora se hará referencia en detalle a las presentes modalidades preferidas de la invención. Esta invención se refiere a secuencias de ADN que codifican para TRELL humano o de ratón, fragmentos y homólogos de las mismas, y la expresión de estas secuencias de ADN en hospederos transformados con los mismos. La invención se refiere a los usos de estas secuencias de ADN y los péptidos codificados por las mismas. Adicionalmente la invención abarca las secuencias de aminoácidos tanto humanas como de ratón para TRELL, o fragmentos de las mismas, así como composiciones farmacéuticas «que comprenden o se derivan de los mismos.

A. DEFINICIONES "Homólogo" como se usa en la presente, se refiere a la similitud de secuencia entre las secuencias de las moléculas que se comparan. Cuando una posición en ambas de las dos secuencias comparadas se ocupa por la misma P753 subunidad de monómero de base o aminoácido, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN se ocupa por adenina, entonces las moléculas son homologas en esa posición. El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de acoplamiento o posiciones homologas compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10, de las posiciones en las dos secuencias se igualan o son homologas, entonces las dos secuencias son 60 % homologas. A manera de ejemplo, las secuencias de ADN ATTGCC y TATGGC comparten 50 % de homología. En general, se hace una comparación cuando se alinean dos secuencias para dar una homología máxima. Una "preparación purificada" o una "preparación sustancialmente pura" de un polipéptido, como se usa en la presente, significa un polipéptido que se ha separado de otras proteínas, lípidos y ácidos nucleicos con los cuales se presenta de manera natural. En forma preferente, el polipéptido también se separa de otras sustancias, por ejemplo, anticuerpos, matrices, etc., que se usan para purificarlo. "Hospedero transformado" como se usa en la presente, abarca cualquier hospedero con una secuencia establemente integrada, es decir, secuencia de TRELL, P753 introducida en su genoma o un hospedero que posee la secuencia, es decir, TRELL, que codifica para los elementos episómicos . Un "tratamiento", como se usa en la presente, incluye cualquier tratamiento terapéutico, por ejemplo, la administración de un agente terapéutico o sustancias, por ejemplo, un fármaco. Un "ácido nucleico substancialmente puro", por ejemplo, un ADN substancialmente puro, es un ácido nucleico que es uno o ambos de: no inmediatamente contiguo con ya sea una o ambas de las secuencias, por ejemplo, secuencias de codificación, con las cuales está inmediatamente contiguo (es decir, uno en el extremo 5' y uno en el extremo 3 ' ) en el genoma que se presenta de manera natural en el organismo del cual se deriva el ácido nucleico; ó (2) que está substancialmente libre de una secuencia de ácido nucleico con la cual se presenta en el organismo del cual se deriva el ácido nucleico. El término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, por ejemplo, en un plásmido virus autónomamente replicante, o en el ADN genómico de una célula procariótica o eucariótica, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o el tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias de ADN. El ADN P753 substancialmente puro también incluye un ADN recombinante «gue es parte de un gen híbrido «gue codifica para TRELL. Los términos "péptidos", "proteínas", y "polipéptidos" se usan de manera intercambiable en la presente. "Biológicamente activo" como se usa en la presente, significa «gue tiene una actividad in vivo o in vitro que se puede realizar directamente o de manera indirecta. Los fragmentos biológicamente activos de TRELL pueden tener, por ejemplo, 70 % de homología de aminoácidos con el sitio activo de TRELL. En forma más preferente, al menos 80 % y de manera más preferente, al menos 90 % de homología. La identidad u homología con respecto a TRELL se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos de TRELL en SEQ ID Nos. 2 ó 4. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, «que están dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se describen en la literatura30.

P753 B. SECUENCIAS DE ADN DE LA INVENCIÓN Como se describe en la presente, un aspecto de la invención personifica un ácido nucleico substancialmente puro (o recombinante) «gue incluye una secuencia de nucleótidos «gue codifica para un polipéptido de TRELL, tal como el ADN descrito en SEQ ID No. 1 ó 3, y/o equivalentes de estos ácidos nucleicos. El término ácido nucleico como se usa en la presente puede incluir fragmentos y e«guivalentes, tal como por ejemplo, secuencias que codifican para péptidos funcionalmente equivalentes. Las secuencias de nucleótidos equivalentes pueden incluir secuencias que difieren por una o más sustituciones, adiciones, o supresiones de nucleótidos, tal como variantes alélicas, mutaciones, etc., e incluyen secuencias que difieren de las secuencias de nucleótidos que codifican para TRELL mostrada en SEQ ID No . 1 ó 3 , debido a la degeneración del código genético . Los inventores han secuenciado un ADN de 1936 pb, humano, que contiene un marco de lectura abierto que codifica para un polipéptido de TRELL, que tiene la secuencia de 248 aminoácidos como se identifica en SEQ ID No . 4. El inventor describe en la presente secuencias tanto humanas como murinas ; la invención se describirá en general por referencia a las secuencias humanas, aunque un experto en la técnica entenderá que las secuencias murinas P753 se abarcan también en la presente. Una característica notable de TRELL es la amplia conservación de la secuencia del dominio de unión del receptor entre el humano y el ratón; solo el ligando de Fas alcanza este nivel de conservación. Ambas proteínas de TRELL, humanas y murinas tienen todas las características de la familia de TNF, es decir, una organización proteica de membrana tipo II y conservación de las porciones de la secuencia comprendidas en el repliegue de la proteína en la estructura de la ß-hoja, y paralela de TNF. La secuencia de nucleótidos para mTRELL se expone en SEQ ID No. 1, la secuencia de aminoácidos para mTRELL se describe en SEQ ID No . 2. Las secuencias de ADN y de aminoácidos para hTRELL se describen en SEQ ID No. 3 y 4, respectivamente. Las secuencias de la invención se pueden usar para preparar una serie de sondas de ADN que son útiles en la detección de varias colecciones de ADN naturales y sintéticos para la presencia de secuencias de ADN que codifican para TELL o fragmentos o derivados de las mismas. Un experto en la técnica reconocerá que la referencia "TRELL", como se usa en la presente, se refiere a los derivados, fragmentos, u homólogos, biológicamente activos del mismo. Las secuencias de ADN que codifican para TRELL, P753 de la invención, se pueden emplear para producir péptidos de TRELL, en la expresión en varios hospederos procarióticos y eucarióticos transformados con los mismos. Estos péptidos de TRELL se pueden usar en aplicaciones anticáncer, e inmunorreguladoras . En general, esto comprende los pasos de cultivar un hospedero transformado con una molécula de ADN que contiene la secuencia que codifica para TRELL, enlazado operativamente a una secuencia de control de expresión. Las secuencias de ADN y las moléculas de ADN recombinantes de la presente invención se pueden expresar usando una amplia variedad de combinaciones de hospedero/vector . Por ejemplo, los vectores útiles pueden consistir de segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas o sintéticas. Los vectores de expresión de la invención se caracterizan por al menos una secuencia de control de expresión que se puede enlazar operativamente a una secuencia de ADN de TRELL insertada en el vector, a fin de controlar y regular la expresión de la secuencia de ADN. Además, dentro de cada vector de expresión, se pueden seleccionar varios sitios para la inserción de una secuencia de TRELL de la invención. Los sitios se designan usualmente por una endonucleasa de restricción que los corta, y estos sitios y endonucleasas son bien reconocidos por un experto en la técnica. Por supuesto, se va a P753 entender que un vector de expresión útil en esta invención no necesita tener un sitio de endonucleasa de restricción para la inserción del fragmento de ADN deseado. En cambio, el vector se puede clonar al fragmento por medios alternativos. El vector de expresión, y en particular, el sitio elegido en la presente para la inserción de un fragmento de ADN seleccionado, y su enlace operativo en el mismo a una secuencia de control de expresión, se determina por una variedad de factores. Estos factores incluyen, pero no se limitan, el tamaño de la proteína «que se va a expresar, la susceptibilidad de la proteína deseada a la degradación proteolítica por las enzimas de la célula hospedera. El número de sitios susceptibles a una enzima de restricción particular, contaminación o unión de la proteína que se va a expresar por proteínas de la célula hospedera que puede probar ser difícil de remover durante la purificación. Los factores adicionales que se pueden considerar incluyen las características de expresión tal como la ubicación de los codones de inicio y de finalización con relación a las secuencias del vector, y otros factores que se reconocerán por un experto en la técnica. La elección de un vector y sitio de inserción para las secuencias de ADN reivindicadas se determina por un equilibrio de estos factores, no todas las selecciones que son igualmente efectivas para una aplicación deseada.

P753 Sin embargo, es rutina para un experto en la técnica analizar estos parámetros y elegir un sistema apropiado dependiendo de la aplicación particular. Un experto en la técnica puede hacer fácilmente modificaciones apropiadas a las secuencias de control de expresión para obtener altos niveles de presión proteica, es decir, por sustitución de codones, o seleccionando codones para aminoácidos particulares «que se usan preferencialmente por organismos particulares, para minimizar la proteolisis o para alterar la composición de la glicosilación. Igualmente, se pueden cambiar cisteínas u otros aminoácidos para simplificar los problemas de producción, repliegue o estabilidad. De esta manera, no todas las combinaciones de hospedero/vector de expresión funcionan con igual eficiencia en la expresión de las secuencias de ADN de esta invención. Sin embargo, una selección particular de una combinación de hospedero/vector de expresión se puede hacer por un experto en la técnica. Los factores «gue se pueden considerar incluyen, por ejemplo, la compatibilidad del hospedero y el vector, toxicidad al hospedero de las proteínas codificadas por las secuencias de ADN, facilidad de recuperación de la proteína deseada, característica de expresión de las secuencias de ADN y las secuencias de control de expresión enlazadas operativamente a éstas, P753 bioseguridad, costos y el repliegue, forma, u otras modificaciones de post-expresión necesarias de la proteína deseada. El TRELL y homólogos del mismo, producidos por hospederos transformados con las secuencias de la invención, así como el TRELL nativo, purificado por los procesos de esta invención, o producido de las secuencias de aminoácidos reivindicadas, son útiles en una variedad de composiciones y métodos para las aplicaciones anti-cáncer e inmunorreguladoras. También son útiles en la terapia y métodos dirigidos a otras enfermedades . Esta invención también se refiere al uso de las secuencias de ADN descritas en la presente para expresar TRELL bajo condiciones anormales, es decir, en un ajuste de la terapia génica. El TRELL se puede expresar en células tumoral bajo la dirección de promotores apropiados para estas aplicaciones. Esta expresión puede mejorar las respuestas inmunitarias antitumor o afectar directamente la supervivencia del tumor. Las citocinas tal como TRELL también pueden afectar la supervivencia de un injerto de órgano al alterar la respuesta inmunitaria local. En este caso, el injerto mismo o las células circundantes se modificarán con un gen de TRELL manejado genéticamente. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del ácido nucleico aislado «gue codifica para TRELL, en la P753 terapia "antisentido" como se usa en la presente, terapia "antisentido" se refiere a la administración o generación in situ de oligonucleótidos o sus derivados que hibridizan específicamente bajo condiciones celulares con ARNm celular y/o ADN que codifica para TRELL, para inhibir la expresión de la proteína codificada, es decir, al inhibir la transcripción y/o la traducción. La unión puede ser por la complementariedad de los pares de bases, convencional, o por ejemplo, en el caso de la unión a ADN dobles, a través de interacciones específicas en la ranura principal de la doble hélice. En general, la terapia "antisentido" se refiere a un intervalo de técnicas empleadas en general, e incluye cualquier terapia que dependa de la unión específica a las secuencias de oligonucleótidos. Una construcción antisentido de la presente invención se puede distribuir, por ejemplo, como un plásmido de expresión, que, cuando se transcribe en la célula, produce ARNm que es complementario al menos a una porción del ARNm celular que codifica para TRELL. Alternativamente, la construcción antisentido puede ser una sonda de oligonucleótido que se genere ex vivo. Estas sondas de oligonucleótido son preferentemente oligonucleótidos modificados que son resistentes a nucleasas endógenas, y son por esto estables in vivo. Las moléculas de ácido nucleico de ejemplo para el uso como P753 oligonucleótidos antisentido son fosforamidatos, análogos de fosfotioato y metilfosfonato de ADN (ver, por ejemplo, 5,176,996; 5,264,564; y 5,256,775). Adicionalmente, los planteamientos generales para construir oligómeros útiles en la terapia antisentido se han revisado, por ejemplo, por Van Der Krol y colaboradores, (1988) Biotechni«gues 6:958-976; y Stein y colaboradores (1988) Cáncer Res 49: 2659-2668, incorporados en la presente específicamente por referencia.

C. TREEL Y SUS SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS La proteína relacionada a la familia de los factores de necrosis tumoral (TRELL) de la invención, como se discute anteriormente, es un miembro de la familia de TNF. La proteína, fragmentos u homólogos de los mismos pueden tener amplias aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico . El TRELL está presente en muchos tejidos, en un patrón «gue es relativamente único entre los miembros de la familia de TNF. Estos miembros de la familia de TNF están comprendidos en la regulación de la muerte y supervivencia celular, y en la diferenciación celular, es posible que TRELL también esté comprendido en la supervivencia, diferenciación y reparación celular en varios tejidos. Aunque la estructura tridimensional precisa de P753 TRELL no se conoce, se predice que, como un miembro de la familia de TNF, puede compartir ciertas características estructurales con otros miembros de la familia. El TRELL tanto de ratón como de humano se describen en la presente. El TRELL de ratón, como se deduce de la secuencia de ADNc existente, comprende un tramo de al menos 21 aminoácido hidrófobos, que actúan presumiblemente como un dominio de anclaje a la membrana para una proteína de membrana tipo II. La secuencia de aminoácidos de mTRELL se describe en SEQ ID No. 2. El TRELL humano comprende un dominio citoplasmático, hidrófilo, N-terminal, un dominio tipo II, transmembrana, hidrófobo, de aproximadamente 27 aminoácidos, y un dominio extracelular de 204 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de hTRELL se describe en SEQ ID No. 4. La Figura 1 representa una comparación de la secuencia de aminoácidos de TRELL humano y de ratón. En tanto que se puede pronosticar una región N-terminal de 52 aminoácidos de un marco de lectura abierto en el clon de ADNc, no se puede pronosticar la metionina de inicio exacta. El Met-36 tiene una secuencia Kozak, de consenso, razonable que puede hacerla el codón de inicio preferido . La comparación de la secuencia TRELL con otros miembros de la familia de TNF humanos revela una similitud P753 estructural, considerable. Por ejemplo, como se puede ver en las Figuras 2A y 2B, todas las proteínas parecen proteínas de membrana tipo II, y comparten varias regiones de conservación de secuencia en el dominio extracelular. Las regiones con barras sobre las secuencias indican aquellas secuencias en TNF y LT-a comprendidas en una organización de ß-hebra de las moléculas. Se subrayan los sitios de glicosilación N-enlazados, putativos. Los asteriscos indican las cisteínas comprendidas en un enlace de disulfuro en TNF. Los dominios conservados probablemente van a estar comprendidos en interacciones inter-subunidad y organización de la hoja. Una búsqueda de EST reveló un clon humano de 345 bases que es altamente homólogo al TRELL humano . Una secuencia de aminoácidos de TRELL humano se expone en SEQ ID No. 4. Los marcos de lectura abiertos codificados por el EST no contienen las porciones de secuencia que permitirían caracterizar esta secuencia como un miembro de la familia de TNF de ligandos, por ejemplo, la porción usada por Wiley y colaboradores para identificar una TRAIL EST dentro de la base de datos existente. Los nuevos polipéptidos de la invención interactúan específicamente con un receptor, que aún no se ha identificado. Sin embargo, los péptidos y métodos descritos en la presente permiten la identificación de P753 receptores que interactúan específicamente con TRELL o fragmentos del mismo. La invención reivindicada en ciertas modalidades incluye péptidos derivados de TRELL que tienen la capacidad de unirse con receptores de TRELL. Los fragmentos de TRELL se pueden producir de varias maneras, por ejemplo, de manera recombinante, por PCR, por digestión proteolítica, o por síntesis química. Los fragmentos internos o terminales de un polipéptido se pueden generar al remover uno o más nucleótidos de un extremo o ambos extremos de un ácido nucleico que codifican para el polipéptido. La expresión del ADN mutagenizado produce fragmentos polipeptídicos. La digestión con endonucleasas con "recorte terminal" puede generar de esta manera los ADN que codifican para una variedad de fragmentos. Los ADN que codifican para los fragmentos de una proteína también se pueden generar por recorte aleatorio, digestión por restricción o una combinación de los métodos discutidos anteriormente. Los fracjmentos polipeptídicos también se pueden sintetizar químicamente usando técnicas conocidas en la técnica tal como la química de f-moc o t-boc, de fase sólida, de Merrifield, convencional. Por ejemplo, los péptidos y secuencias de ADN de la presente invención se pueden dividir arbitrariamente en fragmentos de longitud deseada sin traslape del fragmento, o divididas en P753 fragmentos de traslape de una longitud deseada, Estos métodos se describen en más detalle posteriormente.

D. Generación de TRELL soluble Las formas solubles de ligando pueden señalizar frecuentemente de manera afectiva y por lo tanto se pueden administrar como un fármaco que ahora imita la forma de membrana natural. Es posible que TRELL se segregue de manera natural como una citocina soluble, sin embargo, si no lo es, se puede volver a manejar genéticamente el gen para forzar la secreción. Para crear una forma segregada, soluble de TRELL, se removerá al nivel del ADN, las regiones transmembrana del N- érmino, y alguna porción de la región de tallo, y recolocarlas con una guía tipo I o alternativamente una secuencia guía tipo II que permitirá la escisión proteolítica eficiente en el sistema de expresión elegido. Un experto en la técnica puede variar la cantidad de la región de tallo retenida en la construcción de expresión de secreción para optimizar tanto las propiedades de unión del receptor como la eficiencia de secreción. Por ejemplo, las construcciones que contienen todas las longitudes de tallo posibles, es decir, los truncamientos N-terminales, se podrían preparar tal que resultarán las proteínas que inician en los aminoácidos 81 a 139. La secuencia de tallo de longitud óptima resultará P753 de este tipo de análisis.

E. Generación de Anticuerpos Reactivos con TRELL La invención también incluye anticuerpos reactivos específicamente con TRELL o su receptor. Los anticuerpos monoclonales o antisueros anti-proteína/anti-péptido se pueden elaborar por protocolos normales (ver por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. por Harlow y Lañe (Cold Spring Harbor Press: 1988)) . Se puede inmunizar un mamífero tal como un ratón, un hámster o conejo, con una forma inmunogénica del péptido . Las técnicas para conferir inmunogenicidad en una proteína o péptido incluyen conjugación a portadores, u otras técnicas bien conocidas. Una porción inmunogénica de TRELL o su receptor se puede administrar en la presencia de un adyuvante. El progreso de la inmunización se puede inspeccionar por la detección de los títulos de anticuerpos en el plasma o suero. El ELISA normal u otros inmunoensayos se pueden usar con el inmunógeno como el antígeno para valorar los niveles de anticuerpos. En una modalidad preferida, los presentes anticuerpos son inmunoespecíficos para determinantes antigénicos de TRELL o su receptor, por ejemplo, determinantes antigénicos de un polipéptido de SEQ ID No. 2 ó 4, ó un homólogo de mamífero o cercanamente relacionado a P753 humano (por ejemplo, 70, 80 o 90 por ciento homólogo, en forma más preferente al menos 95 por ciento homólogo) . En una modalidad preferida, adicional, de la presente invención, los anticuerpos anti-TRELL o anti-receptor de TRELL no interreaccionan substancialmente (es decir, reaccionan específicamente, con una proteína que es por ejemplo, menos de 80 por ciento homologa a SEQ ID No. 2 ó 4; en forma preferente menos de 90 por ciento homologa con SEQ ID No. 2 ó 4; y en la forma más preferente menos de 95 por ciento homologa con SEQ ID No. 2 ó 4. Por "no inter-reaciona substancialmente", se quiere decir que el anticuerpo tiene una afinidad de unión para una proteína no homologa que es menos del 10 por ciento, en forma más preferente menos del 5 por ciento, y en forma aún más preferente menos del 1 por ciento, de la afinidad de unión para una proteína de SEQ ID No. 2 ó 4. El término anticuerpo como se usa en la presente se propone para incluir fragmentos del mismo que también son reactivos específicamente con TRELL o el receptor de TRELL. Se pueden fragmentar los anticuerpos usando técnicas convencionales y los fragmentos detectados para la utilidad de la misma manera como se describe anteriormente para los anticuerpos completos. Por ejemplo, los fragmentos F(ab')2 se pueden generar al tratar el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab') se puede P753 tratar para reducir los puentes de disulfuro para producir fragmentos Fab' . Los anticuerpos de la presente invención se proponen además para incluir moléculas bioespecíficas y quiméricas que tienen actividad anti-TRELL o anti-receptor de TRELL. De esta manera, los anticuerpos (ab) tanto monoclonales como policlonales dirigidos contra TRELL o su receptor, y los fragmentos de anticuerpos tal como Fab' y F(ab')2 se pueden usar para bloquear la acción de TRELL y su receptor. También se pueden elaborar varias formas de anticuerpos usando técnicas de ADN recombinante, normales. (Winter y Milstein, Nature 349:293-299 (1991) incorporado específicamente por referencia en la presente) . Por ejemplo, se pueden construir anticuerpos quiméricos en los cuales el dominio de unión del antígeno de un anticuerpo de animal se enlaza a un dominio constante de humano (por ejemplo, Cabilly y colaboradores, Patente Norteamericana No. 4,816,567, incorporada en la presente por referencia). Los anticuerpos quiméricos pueden reducir las respuestas inmunogénicas observadas producidas por los anticuerpos de animal cuando se usan en tratamientos clínicos en humanos. Además, los "anticuerpos humanizados" recombinantes que reconocen TRELL o su receptor se pueden sintetizar. Los anticuerpos humanizados son quimeras que comprenden principalmente secuencias de IgG humanas en las P753 cuales se han insertado las regiones responsables de la unión específica al antígeno. Se inmunizan animales con el antígeno deseado. Se aislan los anticuerpos correspondientes, y se remueve la porción de las secuencias de región variable responsables de la unión específica al antígeno. Las regiones de unión al antígeno, derivadas de animal luego se clonan en la posición apropiada de los genes de anticuerpos humanos en los cuales se han suprimido las regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos humanizados minimizan el uso de secuencias heterólogas (es decir, interespecie) en anticuerpos humanos, y de esta manera es menos probable producir respuestas inmunitarias en el sujeto tratado. También se puede lograr la construcción de diferentes clases de anticuerpos recombinantes al elaborar anticuerpos quiméricos o humanizados que comprenden dominios variables y dominios constantes de humano (CHI1, CH2 , CH3 ) aislados de varias clases de inmunoglobulinas. Por ejemplo, los anticuerpos con valencias incrementadas del sitio de unión al antígeno se pueden producir de manera recombinante al clonar el sitio de unión al antígeno en vectores «que tienen las regiones constantes de humano : cadena (Arulanandam y colaboradores, J. Exp. Med., 177:1439-1450 (1993), incorporado en la presente por referencia) .

P753 Además, se pueden usar técnicas de ADN recombinante, normales, para alterar las afinidades de unión de los anticuerpos recombinantes con sus antígenos al alterar los residuos de aminoácidos en la vecindad de los sitios de unión al antígeno. La afinidad de unión al antígeno de un anticuerpo humanizado se puede incrementar por mutagénesis basada en el moldeado molecular. (Queen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. 86:10029-33 (1989) incorporado en la presente por referencia) .

F. Generación de Análogos, Producción de ADN Alterado y Secuencias Peptídicas Los análogos de TRELL pueden diferenciar del TRELL «gue se presenta de manera natural en la secuencia de aminoácidos, o en maneras que no comprendan las secuencias o ambas. Las modificaciones no de secuencia incluyen la derivatización química in vivo o in vitro de TRELL. Las modificaciones no de secuencia incluyen, pero no se limitan a, cambios en acetilación, metilación, fosforilación, carboxilación o glicosilación. Los análogos preferidos incluyen TRELL o fragmentos biológicamente activos de los mismos, cuyas secuencias difieran de la secuencia dada en SEQ ID Nos. 2 y 4 por una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos, o por una o más sustituciones, supresiones o inserciones no P753 conservadoras de aminoácidos que no quitan la actividad de TRELL. Las sustituciones conservadoras incluyen típicamente la sustitución de un aminoácido por otro con características similares, por ejemplo, sustituciones dentro de los siguientes grupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, serina, treonina, lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

TABLA 1 REEMPLAZOS CONSERVADORES DE AMINOÁCIDOS P753 P753 Los métodos útiles para la mutagénesis incluyen mutagénesis por PCR y mutagénesis por saturación como se discute en más detalle posteriormente. También se puede generar una genoteca de variantes aleatorias de la secuencia de aminoácidos por la síntesis de un conjunto de secuencias de oligonucleótidos de regeneración.

-Mutagénesis por PCR En la mutagénesis por PCR, se puede usar la fidelidad reducida de la Taq-polimerasa para introducir mutaciones aleatorias en un fragmento clonado de ADN (Leung P753 y colaboradores, 1989, Technique 1:11-15) . Este es un método muy poderoso y relativamente rápido para introducir mutaciones aleatorias . La región de ADN que se va a someter a mutagénesis se puede amplificar usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) bajo condiciones que reducen la fidelidad de la síntesis de ADN por la Taq-ADN-polimerasa, por ejemplo, al usar una relación de dGTP/dATP de cinco y al adicionar Mn2+ a la reacción de PCR. La mezcla de fragmentos de ADN amplificados se puede insertar en vectores de clonación apropiados para proporcionar genotecas mutantes aleatorias .

-Mutagénesis por Saturación La mutagénesis por saturación permite la rápida introducción de un gran número de sustituciones de bases, individuales en los fragmentos de ADN clonados (Mayers y colaboradores, 1985, Science 229:242). Esta técnica incluye la generación de mutaciones, por ejemplo, por el tratamiento químico o irradiación de ADN de hebra individual in vitro, y la síntesis de una hebra de ADN complementario . La f ecuencia de mutación se puede modular al modular la severidad del tratamiento, y esencialmente se pueden obtener todas las posibles sustituciones de base. Debido a que este procedimiento no comprende "una selección genética de los fragmentos mutantes se pueden obtener ambas P753 sustituciones neutrales, así como se puede preparar una proteína por mutagénesis aleatoria de ADN cuya función se altera. La distribución de las mutaciones de punto no se altera hacia los elementos de la secuencia conservada.

-Oligonucleótidos de degeneración También se puede generar una genoteca de homólogos a partir de un conjunto de secuencias de oligonucleótidos de degeneración. La síntesis química de la secuencia de degeneración se puede llevar a cabo en un sintetizador automático de ADN, y los genes sintéticos luego se ligan en un vector de expresión apropiado. La síntesis de oligonucleótidos de degeneración se conoce en la técnica31. Estas técnicas se han empleado en el desarrollo directo de otras proteínas32. Las técnicas de mutagénesis no aleatorias o directas, se pueden usar para proporcionar secuencias o mutaciones específicas en regiones específicas. Estas técnicas se pueden usar para crear variantes que incluyen, por ejemplo, supresiones, inserciones, sustituciones, de residuos de la secuencia de aminoácidos conocida de una proteína. Los sitios para la mutación se pueden modificar individualmente o en serie, por ejemplo, al (1) sustituir primero con aminoácidos conservados y luego con más elecciones radicales dependiendo de los resultados P753 logrados, (2) suprimir el residuo objetivo; ó (3) insertar residuos de la misma o diferente clase adyacentes al sitio localizado, o combinaciones de las opciones 1-3.

-Mutagénesis de Exploración de Alanina La mutagénesis de exploración de alanina es un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones de la proteína deseada que son ubicaciones o dominios preferidos para la mutagénesis, Cunningham y Wells (Science 244:1081-1085, 1989) incorporado específicamente por referencia. En la exploración por alanina, un residuo o grupo de los residuos objetivo se identifican (por ejemplo, residuos cambiados tal como Arg, Asp, His, Lys, o Glu) y se reemplazan por un aminoácido neutral o negativamente cargado (en forma más preferente, alanina o polialanina) . El reemplazo de un aminoácido puede afectar la interacción de los aminoácidos con el ambiente acuoso circundante en o fuera de la célula. Aquellos dominios que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones luego se pueden redefinir al introducir además otras variantes en o para los sitios de sustitución. De esta manera, en tanto que el sitio para la introducción de una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el desempeño de una mutación en un P753 sitio dado, se puede llevar a cabo la mutagénesis aleatoria o de exploración por alanina en el codón o región de objetivo y las variantes de subunidad de proteína expresadas, deseadas se detectan para la combinación óptima de la actividad deseada.

-Mutagénesis Mediada por Oligonucleótidos La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un método útil para preparar variantes por sustitución, supresión e inserción, de ADN, ver por ejemplo, Adelman y colaboradores, (DNA 2:183, 1983) incorporado en la presente por referencia. De manera breve, el ADN deseado se puede alterar al hibridizar un oligonucleótido que codifica para una mutación a una plantilla de ADN, donde la plantilla es de la forma de hebra individual de un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia de ADN no alterada o nativa de la proteína deseada. Después de la hibridación, se usa una ADN-polimerasa para sintetizar una segunda hebra complementaria, completa de la plantilla que de esta manera incorporará el cebador de oligonucleótido, y codificará para la alteración seleccionada en el ADN de la proteína deseada. En general, los oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud son los que se usan. Un oligonucleótido óptimo tendrá 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios a la plantilla en cualquier P753 lado del (los) nucleótido (s) que codifican para la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido hibridizará apropiadamente a la molécula de la plantilla de ADN de hebra individual. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente usando técnicas conocidas tal como aquella conocida por Crea y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 75: 5765 [1978]) incorporado en la presente por referencia.

-Mutagénesis de Cartucho Otro método para preparar variantes, la mutagénesis de cartucho, se basa en la técnica descrita por Wells y colaboradores, (Gene, 34 : 315 [1985 ] ) incorporado en la presente por referencia. El material de inicio puede ser un plásmido (u otro vector) que incluye el ADN de la subunidad de proteína que se va a mutar. El (los) codón (es) en el ADN de la subunidad de proteína que se va a mutar se identifica. Debe haber un sitio único de endonucleasa de restricción en cada lado del sitio (s) de mutación, identificado. Si no existen estos sitios de restricción, se pueden generar usando el método de mutagénesis mediado por oligonucleótidos, descrito anteriormente, para introducirlos en las ubicaciones apropiadas en el ADN en la subunidad de proteína, deseada. Después de que se han introducido los sitios de restricción en el plásmido, el P753 plásmido se corta en estos sitios para linealizarlo. Se sintetiza usando procedimientos normales con un oligonucleótido de doble hebra que codifica para la secuencia del ADN entre los sitios de restricción pero que contiene la(s) mutación (es) deseada. Las dos hebras se sintetizan de manera separada y luego se hibridizan conjuntamente usando técnicas normales. Este oligonucleótido de doble hebra se refiere como el cartucho. Este cartucho se diseña para tener extremos 3' y 5' que son comparables con los extremos del plásmido linealizado, tal que se puede ligar directamente al plásmido. Este plásmido ahora contiene la secuencia de la subunidad de proteína, deseada, mutada.

-Mutagénesis combinatoria También se puede usar la mutagénesis combinatoria para generar mutantes. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos para un grupo de homólogos u otras secuencias combinadas se alinean, preferentemente para promover la homología más alta posible. Todos los aminoácidos «que aparecen en una posición dada de las secuencias alineadas se pueden seleccionar para crear un conjunto de degeneración de las secuencias combinatorias. La genoteca variada de variantes se genera por mutagénesis combinatoria al nivel del ácido nucleico que se codifica por una P753 genoteca variada. Por ejemplo, se puede ligar enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en las secuencia génicas tal que el conjunto de degeneración de las secuencias potenciales son expresables como péptidos individuales, o alternativamente, con un conjunto de proteínas de función más grandes que contienen el conjunto de secuencias de degeneración. Se conocen varias técnicas para detectar productos génicos mutantes, generados. Las técnicas para detectar las genotecas grandes incluyen frecuentemente la clonación de la genoteca en vectores de expresión replicables, la transformación de técnicas apropiadas con la genoteca resultante de los vectores, y la expresión de los genes bajo condiciones en las cuales la detección de una prioridad deseada, por ejemplo, en este caso, la unión a TRELL o su receptor, facilita el aislamiento relativamente sencillo del vector que codifica para el gen cuyo producto se detectó. Cada una de estas técnicas descritas posteriormente es tratable para el análisis de alto corte para detectar grandes números de secuencias creadas, por ejemplo, por las técnicas de mutagénesis aleatoria. La invención también proporciona la reducción de los dominios de unión de la proteína de los presentes polipéptidos de TRELL o sus receptores, para generar P753 agentes miméticos, por ejemplo, peptídicos o no peptídicos. Los agentes peptídicos son capaces de romper la unión de un TRELL y su receptor. Los residuos críticos de TRELL comprendidos en el reconocimiento molecular de un polipéptido receptor o de una proteína intracelular en la dirección 3 ' , se puede determinar y usar para generar agentes peptidomiméticos derivados de TRELL o su receptor, que inhiben competitivamente o de manera no competitiva la unión de TRELL con un receptor (ver por ejemplo, "Peptide inhibitors of human papilloma virus protein binding to retinoblastoma gene protein" solicitudes de Patente Europea EP-412,752A y EP-B31, 080A) , incorporadas específicamente en la presente por referencia.

G. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Al hacer disponible TRELL codificado y recombinante, la presente invención proporciona ensayos que se pueden usar para detectar candidatos de fármacos que son ya sea agonistas o antagonistas de la función celular normal, en este caso, de TRELL o su receptor. En una modalidad, el ensayo evalúa la capacidad de un compuesto para modular la unión entre TRELL y su receptor. Una variedad de formatos de ensayo satisfacerá, y en vista de las presentes dimensiones, se comprenderá por un experto en la técnica.

P753 En muchos programas de detección de fármacos que prueban bibliotecas de compuestos y extractos naturales, son deseables ensayos de alto rendimiento a fin de maximizar el número de compuestos examinados en un periodo de tiempo dado. Los ensayos que se realizan en sistemas libres de células, tal como se pueden derivar con proteínas purificadas o semipurificadas, se prefieren frecuentemente como detecciones "primarias" ya que se pueden generar para permitir el rápido desarrollo y la detección relativamente fácil de una alteración en un objetivo molecular que se media por un compuesto de prueba. Además, los efectos de la toxicidad celular y/o biodisponibilidad del compuesto de prueba se pueden ignorar en general en el sistema in vitro, el ensayo en cambio «gue se enfoca principalmente del efecto del fármaco en el objetivo molecular como se puede manifestar en una alteración de la afinidad de unión con otras proteínas o el cambio en las propiedades enzimáticas del objetivo molecular. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de TRELL o del receptor de TRELL, o fragmentos o miméticos de los mismos, y opcionalmente, puede incluir portadores farmacéuticamente aceptables. Por consiguiente, esta invención proporciona métodos para el tratamiento del cáncer, y métodos para estimular, o en ciertos casos, P753 inhibir el sistema inmunitario, o parte del mismo, al administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto de la invención o sus sales o derivados farmacéuticamente aceptables. Por supuesto, se debe entender que las composiciones y métodos de esta invención se pueden usar en combinación con otras terapias para varios tratamientos . Las composiciones se pueden formular para una variedad de rutas de administración, que incluyen, administración sistémica, tópica o localizada. Para la administración sistémica, se prefiere la inyección, incluyendo la intramuscular, intravenosa, intraperitoneal o subcutánea para la inyección, las composiciones de la invención se pueden formular en soluciones líquidas, preferentemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles tal como la solución de Hank o solución de Ringer. Además, las composiciones se pueden formular en la forma sólida, y opcionalmente, se redisuelven o dispersan inmediatamente antes del uso . También se incluyen en la invención las formas liofilizadas. Las composiciones se pueden administrar oralmente, o por un medio transmucósico o transdérmico. Para la administración transmucósica o transdérmica, se usan agentes penetrantes apropiados a la barrera que se va a permear, en la formulación. Estos agentes penetrantes se P753 conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucósica, sales biliares, derivados de ácido fusídico, y detergentes. La administración transmucósica puede ser a través de aspersiones nasales o usando supositorios. Para la administración oral, las composiciones se formulan en formas de administración oral, convencionales, tal como cápsulas, tabletas y tónicos. Para la administración tópica, las composiciones de la invención se formulan en ungüentos, bálsamos, geles, o cremas, como se conoce en la técnica. De manera preferente, las composiciones de la invención estarán en la forma de una dosis unitaria y se administrarán una o más veces. La cantidad del compuesto activo administrada de una vez o durante el transcurso del tratamiento dependerá de muchos factores. Por ejemplo, la edad y tamaño del sujeto, la severidad y curso de la enfermedad que se trata, la manera y forma de administración, y los juicios del facultativo que trata. Sin embargo, una dosis efectiva puede estar en el intervalo desde aproximadamente 0.005 hasta aproximadamente 5 mg/kg/día, en forma preferente cerca de 0.05 hasta aproximadamente 0.5 mg/kg/día. Un experto en la técnica reconocerá que pueden ser también útiles dosis menores y mayores . Las construcciones génicas de acuerdo con la P753 invención también se pueden usar como una parte de un protocolo de terapia génica para distribuir ácidos nucleicos que codifican ya sea para una forma antagonística o agonística de un polipéptido de TRELL. Las construcciones de expresión de TRELL se pueden administrar en cualquier portador biológicamente efectivo, por ejemplo, cualquier formulación o composición capaz de distribuir efectivamente el gen para TRELL a las células in vivo. Los planteamientos incluyen la inserción del gen en vectores virales que pueden transfectar las células directamente, o distribuir el ADN del plásmido con la ayuda de, por ejemplo, liposomas, o portadores intracelulares, así como inyección directa de la construcción génica. Se prefieren los métodos de transferencia por vector viral. Una preparación farmacéutica de la construcción de terapia génica puede consistir esencialmente del sistema de distribución génico en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual se incruste el vehículo de distribución génica. Alternativamente, donde se puede producir el sistema completo de distribución génica, intacto de las células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede comprender una o más células «que producen el sistema de distribución génica.

Además del uso en terapia, los oligómeros de la invención se pueden usar como reactivos de diagnóstico para detectar la presencia o ausencia del ADN objetivo, ARN o secuencias de aminoácidos a las cuales se unen específicamente. En otros aspectos, la invención reivindicada se puede usar para evaluar una entidad química para su capacidad para interactuar con, por ejemplo, unirse o asociarse físicamente con, un polipéptido de TRELL o un fragmento del mismo. El método incluye poner en contacto la entidad química con el polipéptido de TRELL, y evaluar la capacidad de la entidad para interactuar con el TRELL. Adicionalmente, el TRELL de la invención se puede usar en métodos para evaluar los ligandos o receptores que se presentan de manera natural de TRELL, así como para evaluar las entidades químicas que se asocian o unen con los receptores de TRELL. En ciertos aspectos, la invención reivindicada personifica un método para evaluar una entidad química para la capacidad para modular la interacción entre TRELL y su receptor. El método incluye combinar un receptor de TRELL, y TRELL bajo condiciones en donde el par es capaz de interactuar, adicionando la entidad «química «que se va a evaluar y detectando la formación o distribución de complejos. Estos agentes de modulación se pueden evaluar adicionalmente in vitro, por ejemplo, al probar su capacidad en un sistema libre de células, y luego, P753 opcionalmente al administrar el compuesto a una célula o animal, y evaluar el efecto.

H . EJEMPLOS I. AISLAMIENTO DE ADN DE TRELL a) Clonación de TRELL murino El ADNc que codifica para mTRELL se aisló por PCR de una genoteca de ADNc a partir de los macrófagos peritoneales de ratón. La secuencia de aminoácidos y la colocación de la región de transmembrana son típicos de una proteína de membrana. La secuencia de aminoácidos de mTRELL se expone en SEQ ID No . 2 , y la secuencia de ADN se expone en SEQ ID No . 1. Se obtuvieron macrófagos a partir de ratones Balb/c por lavado peritoneal y las células que se adhieren al plástico en el tiempo de una hora se lisaron y procesaron para la extracción de ARN. Un cebador de oligonucleótido antisentido 5 ' GTTCCAGGCCAGCCTGGG3 ' de una secuencia de eritropoyetina de ratón se sintetizó. C.B. Shoemaker y L.D. Mistock, "Murine erythropoietin gene: cloning, expression and human gene homology", Mol. Cell. Biol. 6,849 (1986), específicamente incorporado en la presente por referencia. Este cebador se usó en un protocolo de 5 'RACE siguiendo la recomendación del fabricación (sistema 5 'RACE de BRL) en asociación con el cebador de ancla diseñado por BRL. Una primera hebra del ADNC se elaboró del ARN de macrófagos peritoneales que se adhirieron en una hora. Se hizo la amplificación en un ciclador térmico, de ADN, Perkin Elmer con Taq-ADN-polimerasa de Perkin Elmer. Después de la desnaturalización de 5 minutos a 94 -C , las condiciones de ciclización fueron como sigue: 35 ciclos a 942C durante 30 segundos, 552C durante 30 segundos, y 72 aC durante 3 minutos. Se realizó una extensión adicional a 722C y luego las reacciones se sostuvieron a 42C. El análisis del experimento de PCR en gel de agarosa reveló dos fragmentos amplificados de 650 pb y 500 pb. Los 2 fragmentos se escindieron del gel, se insertaron en el vector pBS-T y se secuenciaron. Los dos insertos fueron diferentes. Ambos tuvieron en cada extremidad el mismo oligonucleótido específico del gen de eritropoyetina, usado para cebar la síntesis de PCR. Las hibridizaciones Northern con fragmentos cebados aleatoriamente, marcados con 32P indicaron «gue hibridizaron a dos diferentes ARN, el fragmento de 500 pb <gue hibridiza a un ARN de 1.4 kb en macrófagos, las ribosondas marcadas con 32P en ambas direcciones se usaron en la hibridación Northern para determinar la orientación del ADNc . A partir de las orientaciones y secuencias determinadas, se derivaron dos cebadores internos para el P753 ARNm de 1.4 kb. Estos se usaron en el PCR de 3 ' y 5 'RACE, respectivamente. El experimento de 3 'RACE reveló un fragmento de 750 pb que se insertó en un vector pBS-T y se secuenció. Corresponde al extremo 3' del ARN de 1.4 kb puesto que la secuencia posee una señal de poli A-adición AATAAA justo antes del tracto poli A. El 5 'RACE no reveló ninguna banda. El equipo de amplificación de ADNc de Clontech Marathón se usó para preparar una genoteca de ADNc del macrófago adherente en una hora. Un fragmento de PCR de 1040 pb, aislado por PCR con los cebadores de oligonucleótido homosentido y antisentido, de la secuencia de ADNc determinada, se usaron, y el cebador universal del equipo. Esto dio por resultado el aislamiento de un fragmento de un tamaño mayor que el fragmento original de 1040 pb. El nuevo fragmento que se secuenció adicionó 60 pb a la secuencia de 5' (SEQ ID No . 1) . Se extrajo el ARN de los macrófagos peritoneales inducidos por tioglicolato, de ratón, después de 1 hora de adherencia. Se realizó la hibridación con ADNc de mTRELL, marcado con 32P. La Figura 3 representa el análisis Northern de la expresión de ARNm de TRELL en macrófagos peritoneales de ratón en diferentes tejidos de ratón. Los primeros 21 aminoácidos de delinean en dominio transmembrana, hidrófobo. No se encontraron secuencias idénticas a los niveles de nucleótidos o P753 aminoácidos en las bases de datos disponibles. Usando el programa PROSITE, y la secuencia de 225 aminoácido, se determinó que la secuencia correspondió a la familia de proteínas de TNF . La proteína también poseyó los diferentes dominios descritos para LT-a y otros miembros e esta familia (J. Browning y colaboradores, Lymphotoxin-a, a novel member of the TNF family that forms a hetermetic complex with lymphotoxin on the cell surface", Cell, 72, 847 (1993); C.F. Ware y colaboradores, "The Ligands and receptors of the lymphotoxin system", in Pathways for cytolysis, G. M. Griffiths and J. Tschopp (Eds) , Springer, Verlag, Berlin, Heidelberg, p 175-218 (1995) , cada uno de los cuales se incorpora específicamente en la presente por referencia) . Esta secuencia es única. A los niveles de nucleótidos o aminoácidos, se observaron una débil identidad o similitud con los diferentes miembros de la familia de TNF o con cual«quier secuencia. Buscando en las bases de datos de EST, una secuencia de humano fue claramente homologa a la secuencia murina. El clon 154742,5' (No. de acceso del GenBank R55379) de una biblioteca de pecho elaborada por Soares, Washington, University, tiene una secuencia de 345 pares de base, 89 % homologa al TRELL murino . No se encontró secuencia humana en las bases de datos disponibles que se igualen al ADN 5' disponible de mTRELL.

P753 b) Clonación del TRELL humano i) Generación de sondas de oligonucleótido y cebadores de PCR La secuencia del EST R55379 humano que tiene homología al TRELL de ratón se usó como una base para la síntesis de los cebadores de oligonucleótido. Dos oligonucleótidos homosentido de hebra 20 mer: LTB-065 5=-CCC TGC GCT GCC TGG AGG AA (NT 70-89 de R55379) LTB-066 5=-TGA TGA GGG GAA GGC TGT CT (NT 14-33 de R55379), y un oligonucleótido antisentido 20 mer. LTB-067 5=-AGA CCA GGG CCC CTC AGT GA (NT 251-270 de R55379) se sintetizaron. ii) Identificación de la fuente de genoteca de ARNm y ADNc para la clonación de hTRELL El poliA+ARNm de hígado humano (# de catálogo 6510-1) , bazo (# de catálogo 6541-1) y nodulo de linfático (# de catálogo 6594-1) se compraron de Clontech. El poliA+ARNm de las líneas celulares humanas THP-1, U937 y 11-23 se generaron en Biogen, Cambridge, MA. Una biblioteca de ADNc de angina humana 'en Lambda gtlO, y ADN de la genoteca de angina también se prepararon en Biogen. Se realizó la RT-PCR en seis muestras de ARN. Cada reacción de ADNc contuvo 1 µg de poliA+ARNm, Tris 50 P753 mM pH 8.3, KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, DTT 10 mM, dNTP 250 µM, 50 ng de hexámero aleatorio (50 ng/µl) y 400 unidades de transcriptasa invertida SupercriptII (Gibco BRL# de catálogo 6542-1) en un volumen final de 40 µl . La reacción se incubó a 20EC durante 20 minutos, 42EC durante 50 minutos, y 99EC durante 5 minutos. Para la PCR, un «quinto de cada reacción de ADNc ó 100-1000 ng de la genoteca de la ADNc se usó. Se establecieron dos reacciones de PCR para cada muestra, una con el par de cebadores LTB-065 y LTB-067 que produce un producto un PCR de 201 pb, y la segunda reacción con el par de cebadores LTB-066 y LTB-067 que produce un producto de 257 pb si el transcripto está presente en la muestra. Las reacciones de PCR se realizaron en Tris 10 mM pH 8.3, KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM, gelatina al 0.01 %, 10 % de DMSO 100 µM de dNTP, 30 pmol de cada cebador y 5 unidades de Amplitaq (Perkin Elmer No. de catálogo N801-0060) . La PCR se llevó a cabo en un ciclador térmico de ADN Perkin Elmer Cetus modelo #480. Las condiciones del ciclo usadas fueron 95EC 1 minutos, 60 EC 1 minuto, y 72 EC 1 minuto durante 35 ciclos. Los productos de tamaño correcto se obtuvieron del hígado, bazo, nodo linfático, THP-1 y angina, pero no de ARNm de U937 ó 11-23. El producto de PCR de 201 pb generado del hígado se purificó para el uso como una sonda para la detección de la genoteca de ADNc.

P753 iii) Detección de la Genoteca de ADNc Habiendo demostrado por PCR que la genoteca de angina contuvo TRELL, un millón de unidades formadoras de placa (PFU) de la genoteca de ADNc de angina humana, Lambda gt 10 se colocaron en placa a una densidad de 1 x 105 PFU/placa Nuncm. Se hicieron dos mejoras en duplicado sobre filtros Schelicher y Scheull BA-S 85 Optitran™ (de 20 x 20 cm. El producto de PCR de 201 pb se marcó con P32N por cebado aleatorio (Feinberg y Vogelstein, Anal. Biochem 137:266-267, 1984, específicamente incorporado en la presente por referencia) . Los filtros se hibridizaron durante la noche a 65EC en 400 ml de amortiguador de detección de placa (Tris 50 mM, pH 7.5, NaCl 1M, pirofosfato de sodio al 0.1 %, PVP al 0.2 % y Ficoll al 0.2 %) «gue contiene sulfato de dextrano al 10 %, 100 ug/ml de ARNt y 6 x 105 CPM/ml de sonda. Se lavaron dos veces con el amortiguador de detección de placa y dos veces con 2X SSC, SDS al 0.1 % a 65C se expusieron a película a -70C con una detección de identificación durante 40 horas. Se «quitaron los positivos en duplicado de las placas principales en SM (NaCl 100 mM, MgS04 10 mM, Tris 50 mM, pH 7.5) más gelatina. Se purificaron en placa 12 de los positivos. El ADN miniprep Lambda de 12 candidatos purificados se digirió con Notl, se sometió a P753 electroforesis en gel de agarosa al 1 %, se transfirió por Southern y se hibridizó con una sonda de 201 pb. Los clones con los insertos más largos (aproximadamente 2 kb) que hibridizaron a la sonda se seleccionaron para la purificación de ADN a gran escala y la secuenciación de ADN. Los insertos de cada uno de estos clones se subclonaron en el sitio Notl y pBluescrip SK+ (Stratagene #212205) . La secuencia de ADN se obtuvo del ADN lambda y el ADN de plásmido. El clon Fia que tuvo un inserto de ADNc de 2006 pb pareció tener un intrón en el 5' de la región de codificación y no contuvo un marco de lectura abierto, completo. El clon A2a, también llamado PB133 contuvo un inserto de ADNc de 1936 pb. Este clon contuvo una región no traducida en 5 ' de 543 pb, un marco de lectura abierto de 852 pb y una región no traducida 3 ' , pero no una señal de poliadenilación o similar de poli A. La secuencia de nucleótidos que codifica para el marco de lectura abierto del clon a 2 del ADNc de hTRELL se expone en SEQ ID No. 3. La secuencia deducida de 284 aminoácidos se expone en SEQ ID No. 4. La segunda metionina en la posición 36 puede ser más probablemente el sitio de inicio de la traducción, puesto que este sitio satisface más cercanamente los requerimientos para un inicio como se define por Kozak. Usando las secuencias identificadas, las P753 secuencias de ADNc que codifican para TRELL se determinaron. Para las secuencias de ADN descritas anteriormente (es decir, SEQ ID No. 3), se dedujeron las secuencias de aminoácidos de TRELL (SEQ ID No. 4) . Debe ser claro que dado el estado corriente de la técnica de manejo de proteínas, un experto en la técnica podria hacer alteraciones, inserciones o supresiones determinadas en estas secuencias de aminoácidos y obtener una variedad de moléculas que tienen substancialmente las mismas actividades biológicas o inmunológicas como a«quellas de las moléculas que se han descrito en la presente. iv. Análisis Northern de la Expresión de TRELL humano Un fragmento de PpuMl/BstXl de 440 pb del clon 2a del ADNc humano se marcó con 32P por cebadura aleatoria y se usó para sondear las transferencias Northern comerciales que contienen ARN de varios tejidos humanos. El análisis Northern mostró que el fra«gmento de hTRELL hibridizó a una especie individual de ARNm de aproximadamente 1.4 a 1.6 kb de longitud. El TRELL humano se expresa en la mayoría de los órganos del sistema inmunitario, es decir, bazo, linfocitos de la sangre periférica (PBL) , nodulos linfáticos, apéndice, pero fue extremadamente bajo en timo, hígado fetal (fuente de linfocitos progenitores) y médula ósea (Figura 4) . Por lo tanto, los órganos del sistema P753 inmunitario secundario expresan principalmente a TRELL. También se detectó la expresión en el ovario, próstata, intestino delgado, colon, corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, o músculo esquelético, riñon y páncreas. La expresión fue relativamente baja en testículos, hígado, riñon y timo. Este patrón indica una expresión extendida que se asemeja cercanamente a aquella de ligando de TRAIL excepto que TRAIL se expresa pobremente en corazón y cerebro . c) Aislamiento de un receptor que se une al ligando de TRELL Los ligandos de la familia de TNF se pueden usar para identificar y clonar receptores. Con la secuencia de TRELL descrita, se puede fusionar el extremo 5' del dominio extracelular del ligando de TRELL que constituye la secuencia de unión al receptor a un marcador o secuencia de marcado y luego adicionar una secuencia guía que forzará la secreción del ligando en cualquiera del número de sistemas de expresión. Un ejemplo de esta tecnología se describe por Browning y colaboradores (1996) (JBC 271, 8618-8626) donde el ligando de LT-ß se segregó en esta forma. La secuencia guía de VCAM se acopló a una marca peptídica myc corta seguido por el dominio extracelular de LT-ß . La secuencia de VCAM se usa para forzar la secreción de la P753 molécula de LT-ß unida normalmente a la membrana. La proteína segregada retiene una marca myc en el N-término «que no daña la capacidad de unión a un receptor. Esta proteína segregada se puede expresar ya sea en células Cos transientemente transfectadas o sistema celular, por ejemplo, vectores derivados con EBNA, células de insecto/baculovirus, Picchia, etc. El sobrenadante celular no purificado se puede usar como una fuente de ligando marcado . Las células que expresan el receptor se pueden identificar al exponerlas al ligando marcado. Las células con el ligando marcado unido se identifican en un experimento FACS al identificar la marca myc con un anticuerpo anti-péptido de myc (9E10) seguido por inmunoglobulina anti-ratón marcada con ficoeritrina (o una marca similar) . Las células positivas a FACS se pueden identificar fácilmente y servirán como una fuente de ARN que codifica para el receptor. Luego se preparará una genoteca de expresión de este ARN vía las técnicas normales y se separa en mezclas. Las mezclas de clones se transfectarán en una célula hospedadora adecuada y la unión del ligando marcado a las células transfectadas positivas al receptor se determina vía el examen microscópico, después del marcado de la marca de péptido myc unido con un reactivo de Ig anti-ratón marcada con enzima, es decir.

P753 galactosidasa, fosfatasa alcalina o anticuerpo marcado con luciferasa. Una vez que se ha identificado una mezcla positiva, el tamaño de la mezcla se reducirá hasta «que se identifique el receptor que codifica para ADNc. Este procedimiento se puede llevar a cabo con ya sea el TRELL de humano o ratón, puesto que pueden conducir más fácilmente a un receptor. 2. Células y Reactivos Se obtuvieron todas las células de la American Type Culture Collection (ATC, Rockville, MD) excepto para el clon 13 de WEHI 164 que se obtuvo del doctor Kawashima (Geneva Biomedical Research Institute, Genova, Suiza) . El subclón HT29 (HT29-14) se describió previamente (Browning y colaboradores, 1996) y el subclón ME180 sensible a TNF se obtuvo del doctor Cari Ware. El hibridoma de células T II-23 se ha descrito (Browning y colaboradores, 1991) . Se inyectaron ratones Balb/c intraperitonealmente 3 días antes del sacrificio con 1.5 ml de caldo de tioglicolato (Difco Lab., MI) . Se tomaron células de la cavidad peritoneal y se cultivaron a 106 células/ml durante 1 hora en DMEM (Gibco Lab) . Se lavaron las células no adherentes de las placas y las células adherentes, casi exclusivamente macrófagos, se lisaron en Tri-reactivo (Molecular Research Center Inc.) y se procesaron para la extracción de ARN.

P753 El TNF, LTa, LTal/b2 humanos, recombinantes, los anticuerpos a estas proteínas y las proteínas de fusión receptor-Ig se han descrito previamente (Browning y colaboradores, 1995). Se ha descrito el anticuerpo 5C8 anti-CD40L. Un suero anti-hTRELL policlonal se preparó vía la intrainyección de nodos linfáticos de hTRELL recombinante, puro en CFA como se describe previamente (Browning y Ribolini, 1989) . Después de 2 meses, se observó una respuesta anti-hTRELL y se purificó la inmunoglubulina usando proteína A-sefarosa.

Clonación de TRELL de ratón El cebador de oligonucleótido antisentido 5 ' GTTCCAGGCCAGCCTGGG3 ' de la secuencia de eritropoyetina de ratón se usó en un protocolo 5 'RACE siguiendo la recomendación del fabricante (sistema 5 'RACE de BRL) en asociación con el cebador de ancla diseñado por BRL. SE hizo el ADNc de primera hebra del ARN de macrófagos perifonéales adherentes en 1 hora. Se hizo la amplificación en un ciclador térmico de ADN Perkin Elmer con Taq ADN-polimerasa. Después de una desnaturalización de 5 minutos a 94/c, las condiciones de ciclización fueron como siguen: 35 ciclos de 30 segundos a 94/C, 30 segundos a 55/c y 3 minutos a 72 /C se«guido por una extensión adicional, terminal a 72 /C. El análisis del experimento de P753 PCR en agarosa reveló 2 fragmentos amplificados de 650 pb y 500 pb. Los 2 fracamentos se escindieron del gel, se insertaron en vectores pBS-T y se secuenciaron. Las hibridizaciones Northern con fragmentos cebados aleatoriamente, marcados con 32P indicaron que el fragmento de 500 pb que hibridiza a un ARN de 1.4 kben macrófagos. Para determinar la orientación de la ADNc, ribosondas marcadas con 32P en ambas direcciones se usaron en al hibridación Northern. De las orientaciones determinadas y las secuencias, se derivaron dos cebadores internos para el ARNm de 1.4 kb : 5 ' TCAGGTGCACTTTGATGAGG3 ' Y 5 ' CTGTCAGCTCCTCCTGAG3 ' «que se usaron en 3 ' y 5 'RACE-PCR, respectivamente. El experimento 3 'RACE reveló un fragmento de 750 pb «que se insertó en un vector pBS-T y se secuenció. Correspondió al extremo 3' del ARN de 1.4 kb puesto que la secuencia poseyó una señal de poli A-adición justo antes del tracto de poli-A. El 5 'RACE no reveló ninguna banda. El equipo de amplificación de ADNc de Clontech Marathón Se usó para preparar una genoteca de ADNc de los macrófagos adherentes en una hora. La PCR usó un fragmento de PCR de 1040 pb aislado con los cebadores de oligonucleótido homosentido y antisentido de la secuencia de ADNc determinada ' ( 5 ' AGCAGGAGCCTTCTCAGGAG3 ' y 5 ' GATCCAGGGAGGAGCTTGTCC3 ' ) y el cebador universal del equipo. Esto dio por resultado el aislamiento de un P753 fragmento de 600 pb de largo y el extremo 5' «que el fragmento de 1040 pb original.

Clonación del TRELL humano Una búsqµeda de la base de datos EST mostró un clon humano que fue claramente homólogo a la secuencia murina. El clon 154742 (número de acceso del Genbank: R55379) tiene una secuencia de 345 pb 89 % homologa al ADNc murino . Se usaron dos cebadores derivados del EST (5 ' CCCTGCGCTGCCTGGAGGAA3 ' : y 5 'AGACCAGGGCCCCTCAGTGA3 ' ) para detectar por RT-PCR diferentes tejidos y bibliotecas para la presencia de los transcriptos de hTRELL. Los productos de tamaño correcto se obtuvieron del hígado, bazo, nodulo linfático, THP-1, y angina, pero no de ARNm de U937. El producto de 201 pb se clonó y se usó para detectar una genoteca de ADNc de angina humana, lambda gtlO . Se colocaron en placas 106 unidades formadoras de placa a 105 PFU/placa. Se hicieron mejoras en duplicado en filtros de nitrocelulosa de 20 x 20 cm y se hibridizaron con una sonda preparada por cebadura aleatoria. Los filtros se hibridizaron durante la noche a 65/C en amortiguador de detección de placa (Tris 50 mM, pH 7.5, NaCl 1 M) , pirofosfato de sodio al 0.1 %, polivinilpirrolidona al 0.2 % y ficol al 0.2 %) que contiene sulfato de dextrano al 10 %, 100 mg/ml de tARN y 6 x 105 cpm/ml de sonda. Se lavaron P753 dos veces con el amortiguador de detección de placa y dos veces con 2XSSC, SDS al 0.1 % a 65 /C. Los ADN miniprep Lambda se prepararon a partir de colonias positivas y los clones con insertos más largos se seleccionaron para la purificación de ADN a gran escala y la secuenciación de ADN. Los insertos se subclonaron en el sitio Notl de pBlueScript SK+ . Se encontraron __ EST humanos que codifican para las partes del Análisis de ARN Se marcó ya sea un fragmento PpuMl/BstXl de 0.45 kb ó un fra«gmento Narl/Noti de 1.25 del ADNc de hTRELL, por cebadura aleatoria y se usó para sondear transferencias Northern de tejido humano y de ratón, compradas de Clontech. Los tejidos y células de ratón fueron extraídos con ARN con el Tri-reactivo . El análisis Northern se hizo esencialmente como se describe ya (Chicheportiche y Vassalli, 1994) con 4 ug del ARN total y ADNc de mTRELL, cebado aleatoriamente, marcado con 32P.

Asignación Cromosómica Un panel de ADN de los híbridos de células monocromosómicas (HGMP Resource centre, Hinxton, Cambridge, UK) se usó para amplificar por PCR un fragmento de 340 pb con cebadores elegidos en la región no traducida 3' que no P753 son homólogos a la secuencia murina ( 5 'AGTCGTCCCAGGCTGCCGGCT3 ' y 5 ' CCTGAAGTGGGGTCTTCTGGA3 ' ) . La amplificación se hizo durante 40 ciclos, 30 segundos a 94/C, 90 segundos a 65/C y 90 segundos a 727C. Se llevó a cabo la detección en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.

Expresión de la Proteína de hTRELL Recombinante Una construcción de expresión soluble «que combina la secuencia guía e VCAM, la marca peptídica myc y el dominio extracelular de hTRELL similar a aquel descrito para linfotoxina-b (ref) se preparó de una manera similar a aquella descrita para LTb (browning y colaboradores, 1996). Se aislaron los siguientes fragmentos de ADN, un fragmento Notl/romo que codifica para la guía VCAM y un par de oligonucleótido que codifican para la marca myc (5' romo, sitio 3' PpuMl) que se ha descrito, un fragmento BstXl/Notl de 0.45 e TRELL y un fragmento PpuMl/BstXl de 0.65 de TRELL. Los cuatro fragmentos se ligaron en un vector pBluescript de Notl/fosfatasado . El inserto de Notl de este vector se transfirió en el vector pFastBacl (GibcoBRL) y seusó para generar el baculovirus recombinante. Se preparó TRELL soluble al infectar células de insecto HlfiveTM en MOI 10 y el medio se recolectó después de 2 días. Se adicionaron los siguientes artículos al medio: P753 amortiguador HEPES a una concentración final de 25 mM, pH 7.4, AEBSF 1 mM (Pierce) y pepstatina 1 mg/ml. El medio se filtró y se concentró diez veces por ultrafiltración sobre un filtro de corte de 10 kDa, a Amicon. El medio que contiene TRELL concentrado se encargó directamente en una columna de flujo rápido de SP-sefarosa y se lavó con amortiguador HEPES 25 mM pH 7.0 que contiene NaCl 0.4 M. Se eluyó el TRELL con el mismo amortiguador con NaCl 0.6 m. El TRELL purificado se sometió al análisis de tamaño en un Análisis de Secreción Se construyeron los vectores para la expresión a base de EBNA usando el vector CH269 que es una versión modificada de pEBV?is ABC (Invitrogen) en donde el gen de EBNA y la marca de histidina se removió. Un fragmento de 0.71 kb de hTNF en el vector de pFastBac se proporcionó por el Dr. P. Pescamento y A. Goldfeld. El inserto SnaBI/Xhol se ligó en el sitio PvuII/XhoI de CH269. Un inserto genómico de TNF contiene la supresión del sitio de insición 1-12 fue una donación del Dr. G. Kollias y se insertó en el vector CH269 por A. Goldfeld. Un inserto Notl de 1.8 kb del clon A2A de hTRELL, el fragmento Notl de 0.98 kb que contiene el ADNc de hCD40L proporcionado por el Dr. E. Garber y un inserto Notl de 1.46 kb que contiene hLTa P753 (Browning y colaboradores, 1995) se ligaron en el sitio Notl de CH269. Un inserto HindIII de 0.81 kb que contiene la región de codificación de hLTb con un sitio de inicio modificado (Browning y colaboradores, 1995) se ligó en el sitio HindIII de CH269. Se transfectaron células EBNA-9293 con varios vectores CH279 junto con el vector GFP usando lipofectamina y ya sea se removió con PBS con EDTA 5 mM para el análisis FACS o después de 2 días, las células se sometieron a la marcación metabólica. Ambos procedimientos utilizaron los siguientes anticuerpos, hTRELL una fracción policlonal de conejo, hTNF el mAb 104c, hLTa el mAb AG9 , Ltal/b2, el mAb B9 y CD40L y mAb 5C8. El análisis FACS se llevó a cabo en el medio RPMI «que contiene FBS al 10 % y 50 ug/ml de IgG humana agregada en caliente con los anticuerpos a 5 ug/ml. La IgG anti-cone o o ratón marcada con ficoeritrina (Jackson ImmunoResearch) se usó para detectar la marcación de anticuerpos. Las células transíectadas con GFP brillante se confinaron vivas. Para la inmunoprecipitación, las células 2 días después de la transfectación se lavaron con PBS y se transfectaron en PBS libre de MEM libre de met/cys «gue contiene 200 uCi/ml de TranSlabel (ICN) . Después de - h los sobrenadante se recolectaron y se sometieron a la inmunoprecipitación como se describe (Browning y colaboradores, 1995) .

P753 Ensayos de citotoxicidad: Se llevaron a cabo los ensayos de crecimiento celular como se describe previamente (Browning y Ribolini, 1989) . Par la microscopía, HT29-14 se sembraron en placas de 12 pozos a una densidad de 200,000 células/pozo y se cultivaron durante 2 días. El TRELL humano, linfotoxina-a lb2 (browning y colaboradores, 1996) o anti-fas (CHll, Ka aya) se adicionaron junto con 80 unidades/ml de interferon-g humano. Después de 26 horas, el medio se removió después de lo cual el tratamiento con citocina o anti-Fas incluyó muchas células muertas «que se desecharon del plástico. Las células restantes se fijaron con etanol al 80 % y se lavaron en PBS que contiene 1 mg/ml de tinte Hoescht . Después de 2 minutos, el tinte se removió, las células se lavaron con PBS y se examinaron para la microscopía por fluorescencia.

P753 Tabla II: Sitios de Unión de TRELL Humano y Efectos Citotóxicos en Varias Líneas Celulares Línea Celular Tipo Unión Citotoxicida de da TRELL Hematopoyético Jurkat Linfoma T SK W 6.4 Célula EBV de B Namalwa Linfoma burkitt K562 Promielocítico + THP-1 Leucemia monocítica ++ No hematopoyético Adenocarcinoma de ++ HT29 colon ME-180 Carcinoma cervical Hela Carcinoma cervical MCF-7 Adenocarcinoma de + /- 293 pecho Células de riñon + nd Cos embriónica nd Fibroblastos de riñon 'Ensayo de 3-5 días de proliferación en la presencia y ausencia del interferón-g humano. bCitotoxicidad se observó solamente en la presencia del interferón-g . ND, no determinado. dCambios de morfología.

Tabla III: Agrupación de Varios Miembros de la Familia de TNF por patrones de Citotoxicidad Grupo Activación del receptor Inductores potentes de apoptosis TNF, Fas, TRAIL-Ra, DR-3 en muchos tipos de células Inductores débiles solamente en LTb-R, TRELL-R6, CD30 tipos de células limitadas No se puede inducir la célula CD27, CD40, OX-40 muerta, anti-proliferativa en algunos ajustes aEstos receptores no se han aún identificado.

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P753 LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: Chicheportiche, Yves Browning, Jeffrey L. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: UN LIGANDO RELACIONADO AL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) : DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: BIOGEN, INC. (B) CALLE: 14 CAMBRIDGE CENTER (C) CIUDAD: CAMBRIDGE (D) ESTADO: MA (E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 02142 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: compatible con IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 P753 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD CORRIENTE: (A) NUMERO DE SOLICITUD: no asignado aún (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-Mayo-1997 (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO (A) NOMBRE: FLYNN, KERRY A. (B) NUMERO DE REGISTRO: 33,693 (C) NUMERO DE ORDEN/REFERENCIA: AOO3 PCT (ix) INFORMACIÓN DE LA TELECOMUNICACIÓN (A) TELEFONO: (617) 679-3583 (B) TELEFAX: (617) 679-2838 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1168 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: proteína relacionada con la familia TNF (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE /CLAVE : CDS ( B ) LOCALIZACION : 2 . . . 676 ( xi ) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ . ID No : 1 ; G GTG CTG AGC CTG GGC CTG GCG CTG GCC TGC CTT GGC CTC CTG CTG 46 Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu 1 5 10 1S GTC GTG GTC AGC CTG GGG AGC TGG GCA ACG CTG TCT GCC CAG GAG CCT 94 Val Val Val Ser Leu Gly Ser Trp Ala Thr Leu Ser Ala Gln Glu Pro 20 25 30 TCT CAG GAG GAG CTG ACÁ GCA GAG GAC CGC CGG GAG CCC CCT GAA CTG 142 Ser Gln Glu Glu Leu Thr Ala Glu Asp Arg Arg Glu Pro Pro Glu Leu 35 40 45 AAT CCC CAG ACÁ GAO GAA AGC CAG GAT GTG GTA CCT TTC TTG GAA CAÁ 190 Asn Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp val Val Pro Phe Leu Glu Gln 50 55 60 CTA GTC CGG CCT CGA AGA AGT GCT CCT AAA GGC CGG AAG GCG CGG CCT 238 Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro Lys Gly Arg Lys Ala Arg Pro 65 70 75 CGC CGA GCT ATT GCA GCC CAT TAT GAG GTT CAT CCT CGG CCA GGA CAG 2S6 Arg Arg Ala lie Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln 80 85 30' 95 P753 GAT GGA GCA CAÁ GCA GGT GTG GAT GGG ACÁ GTG AGT GGC TGG GAA GAG 334 Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu 100 105 110 ACC AAA ATC AAC AGC TCC AGC CCT CTG CGC TAC GAC CGC CAG ATT GGG 382 Thr Lys lie Asn Ser Ser Ser Pro Leu Arg Tyr Asp Arg Gln lie Gly 115 120 125 GAA TTT ACÁ GTC ATC AGG GCT GGG CTC TAC TAC CTG TAC TGT CAG GTG 430 Glu Phe Thr Val lie Arg Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val 130 135 140 CAC TTT GAT GAG GGA AAG GCT GTC TAC CTG AAG CTG GAC TTG "CTG GTG 478 His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr Leu Lye Leu Asp Leu Leu Val 145 150 155 AAC GGT GTG CTG GCC CTG CGC TGC CTG GAA GAA TTC TCA GCC ACÁ GCA 526 Aßn Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala 160 1S5 1*70 175 GCA AGC TCT CCT GGG CCC CAG CTC CGT TTG TGC CAG GTG TCT GGG CTG 574 Ala Ser Ser Pro Gly Pro Gln Leu Arg Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu 180 1B5 190 TTG CCG CTG CGG CCA GGG TCT TCC CTT CGG ATC CGC ACC CTC CCC TGG 622 Leu Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Arg He Arg Thr Leu Pro Trp 195 200 205 GCT CAT CTT AAG GCT GCC CCC TTC CTA ACC TAC TTT GGA CTC TTT CAÁ 670 Ala His Leu Lya Ala Ala Pro Phe Leu Thr Tyr Píie Gly Leu Phe Gln 210 215 220 GTT CAC TGAGGGGCCT TGCTCTCCCA GATTCCTTAA ACTTTCCCTG GCTCCAGGAG 726 Val Hie 225 CATCACCACA CCTCCCTACC CCACCCCCAC TCCTCCACCC CCTCGCTGCT CCTTGGTCCA 786 GTCCTGTCTC TCCTCAAAGG CAGCCAGAGC TTGTTCACAT GTTTCCATTC CACAGACGTA 846 TCCTTGCTCT TCTTAACATC CCATCCCACC ACAACTATCC ACCTCACTAG CTCCCAAAGC 906 CCCTACTTAT CCCTGACTCC CCCACCCACT CACCCGACCA CGTGTTTATT GACTTTGTGC 966 ACCAGGC CT GAGATGGGCT GGACCTGGTG GCAGGAAGCC AGAGAACCTG GGACTAGGCC 1026 AGAAGTTCCC AACTGTGAGG GGGAAGAGCT GGGGACAAGC TCCTCCCTGG ATCCCTGTGG 1086 ATTTTGAAAA GATACTATTT TTATTATTAT TGTGACAAAA 'TGTTAAATGG ATATTAAAGA 1146 GAATAAATCA TGATTTCTCT TC 1168 P753 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 225 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 2 Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala Leu Ala Cya Leu Gly Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Val Val Ser Leu Gly Ser Trp Ala Thr Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ser 20 25 30 Gln Glu Glu Leu Thr Ala Glu As Arg Arg Glu Pro Pro Glu Leu Asn 35 40 45 Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp Val Val Pro Phe Leu Glu Gln Leu 50 55 60 Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro Lys Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg 55 70 75 BO Arg Ala lie Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp 85 90 95 Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gl? Thr Val Ser Gly Trp Glu- Glu Thr 100 105 110 P753 Lys lie Asn Ser Ser Ser Pro Leu Axg Tyr Asp Arg Gln lie Gly Glu 115 120 125 Phe Thr Val lie Arg Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His 130 135 140 Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asn 145 150 155 160 Gly Val Leu Ala Leu Arg Cye Leu Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Pro Gly Pro Gln Leu Arg Leu Cys Gln Val Ser Gl? Leu Leu lßO 185 190 Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Arg lie Arg Thr Leu Pro Trp Ala 195 200 205 His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val 210 215 220 His 225 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1373 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICO: NO P753 (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: proteína relacionada con la familia TNF (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1...852 (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 3 ATG TCA TTG TTA GAC TTT GAA ATT TCC GCC CGC CGG CTC CCC CTC CCC 48 Mee Ser Leu Leu Asp Phe Glu He Ser Ala Arg Arg Leu Pro Leu ro 1 5 10 15 CGA TCC CTC GGG TCC CGG GAT GGG GGG GCG GTG AGG CAG GCA CAG CCC 96 Arg Ser Leu Gly Ser Arg Asp sly Gly Ala Val Arg Gln Ala Gln Pro 20 25 30 CCC GCC CCC ATG GCC GCC CGT CGG AGC CAG AGG CGG AGG GGG CGC CGG 144 Pro Ala Pro Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg 35 40 45 GGG GAG CCG GGC ACC GCC CTG CTG GTC CCG CTC GCG CTG GGC CTG GGC 192 Gly Glu Pro Gly Thr Ala Leu l.eu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly SO 55 60 CTG GCG CTG GCC TGC CTC GGC CTC CTG CTG GCC GTG GTC AGT TTG QGG 240 Leu Ala Leu Ala Cya Leu Gly Leu Leu Leu Ala' Val al Ser Leu Gly 65 70 75 80 AGC CGG GCA TCG CTG TCC GCC CAG GAO CCT GCC CAG GAG GAG CTG GTG 288 Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Glti Glu Glu Leu Val 85 90 95 P753 GCA GAG GAG GAC CAG GAC CCG TCG GAA CTG AAT CCC CAG ACÁ GAA GAA 336 Ala Glu Glu Asp Gln Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu 100 105 110 AGC CAG GAT CCT GCG CCT TTC CTG AAC CGA CTA GTT CGG CCT CGC AGA 384 Ser Gln Asp Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg 115 120 125 AGT GCA CCT AAA GGC CGG AAA ACÁ CGG GCT CGA AGA GCG ATC GCA GCC 432 Ser Ala Pro Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala lie Ala Ala 130 135 140 CAT TAT GAA GTT CAT CCA CSA CCT GGA CAG GAC GGA GCG CAG GCA GGT 480 His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly 145 150 155 160 GTG GAC GGG ACÁ GTG AGT GGC TGG GAG GAA GCC AGA ATC AAC AGC TCC 528 Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg He Asn Ser Ser 165 170 175 AGC CCT CTG CGC TAC AAC CGC CAtí ATC GGG GAG TTT ATA GTC ACC CGG 576 Ser Pro Leu Arg Tyr Asn Arg ßln He Gly Glu Phe He Val Thr Arg 180 185 - 190 GCT GGG CTC TAC TAC CTG TAC TGT CAG GTG CAC TTT GAT GAG GGG AAG €24 Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val Hiß Phe Aep Glu Gly Lys 195 200 205 GCT GTC TAC CTG AAG CTG GAC TTG CTG GTG GAT GGT GTG CTG GCC CTG 672 Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu 210 215 220 CGC TGC CTG GAG GAA TTC TCA GCC ACT GCG GCC AGT TCC CTC GGG CCC 720 Arg Cys Leu Glu Gl? Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro 225 230 235 240 CAG CTC CGC CTC TGC CAG GTG TCT GGG CTG TTG GCC CTG OGG CCA GGG 768 Gln Leu Arg Leu Cye Gln Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly 245 250 255 TCC TCC CTG CGG ATC CGC ACC CTC CCC TGG GCC CAT CTC AAG GCT GCC 816 Ser Ser Leu A g He Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala 260 265 270 CCC TTC CTC ACC TAC TTC GGA CTC TTC CAG GTT CAC TGAGGGGCCC 862 Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val His 275 280 P753 TGGTCTCCCC ACAGTCGTCC CAGGCTGCCG GCTCCCCTCG ACAGCTCTCT GGGCACCCGG 922 TCCCCTCTGC CCCACCCTCA GCCGCTCTTT GCTCCAGACC TGCCCCTCCC TCTAGAGGCT 982 GCCTGGGCCT GTTCACGTGT TTTCCATCCC ACATAAATAC AGTATTCCCA CTCTTATCTT 1042 ACAACTCCCC CACCGCCCAC TCTCCACCTC ACTAGCTCCC CAATCCCTGA CCCTTTGAGG 1102 CCCCCAGTGA TCTCGACTCC CCCCTGGCCA CAGACCCCCA GGGCATTGTG TTCACTGTAC 1162 TCTGTGGGCA AGGATGGGTC CAGAAGACCC CACTTCAGGC ACTAAGAGGG GCTGGACCTG 1222 GCGGCAGGAA GCCAAAGAGA CTGGGCCTAG GCCAGGAGTT CCCAAATGTG AGGGGCGAGA 1282 AACAAGACAA GCTCCTCCCT TGAGAATTCC CTGTGGATTT TTAAAACAGA TATTATTTTT 1342 ATTATTATTG TGACAAAATG TTGATAAATG G 1373 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 284 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 4 : P753 Met Ser Leu Leu Asp. Phe Glu lie Ser Ala Arg Arg Leu Pro- Leu Pro 1 5 10 15 Arg Ser Leu Gly Ser Arg Asp Gly Gly Ala Val Arg Glp Ala Gln Pro 20 25 30 Pro Ala Pro Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg 35 40 45 Gly Glu Pro Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly 50 55 60 Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly 65 70 75 ßO Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Gln Glu Glu Leu Val B5 90 95 Ala Glu Glu Asp Gln Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu 100 105 110 Sex Gln Asp Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg 115 120 125 Ser Ala Pro Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala lie Ala Ala 130 135 140 His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly 1*5 150 155 160 Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg lie Asn Ser Ser 165 170 175 Se Pro Leu Arg Tyr Aßn Arg Gln lie Gly Glu Phe He Val Thr Arg lßO 185 190 Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val Hie Phe Asp Glu Gly* Lys 195 200 205 Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu 210 215 220 Arg Cys Leu Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro 225 230 235 240 P753 Gln Leu Arg Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly 245 2S0 255 Ser Ser Leu Arg lie Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys AÁa Ala 2€0 265 270 Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val His 275 2t30 P753

Claims (35)

1. REIVIMDICACIQMES i 1. Una secuencia de ADN que codifica para TRELL, o un fragmento de la misma.
2. 2. Una secuencia de ADN «que codifica para TRELL, la secuencia «que consiste esencialmente de SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 3.
3. 3. Una secuencia de ADN «que consiste esencialmente de SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 3 , el ADN «que codifica para un polipéptido, el polipéptido «que consiste esencialmente de SEQ ID NO 2 o SEQ ID NO 4.
4. 4. Una secuencia de ADN que hibridiza al menos un fragmento de SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 3 , el fragmento «que comprende al menos 20 bases consecutivas, la secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que es al menos 30 % homólogo con un sitio activo de TRELL.
5. 5. Una secuencia de ADN según la reivindicación 2, en donde la secuencia consiste esencialmente de SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 3 con sustituciones, alteraciones o deleciones conservadoras .
6. 6. Una molécula de ADN recombinante, que comprende una secuencia de ADN que codifica para TRELL, la secuencia enlazada operativamente a una secuencia de control de expresión.
7. 7. La molécula se«gún la reivindicación 6, «que comprende SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 3. P753
8. 8. Un hospedero transformado con una molécula de ADN recombinante de la reivindicación 6 o 7.
9. 9. Una secuencia de ADN que codifica para TRELL, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2 o SEQ ID NO 4.
10. 10. Un método para producir TRELL sustancialmente puro que comprende el paso de cultivar el hospedero unicelular de la reivindicación 8.
11. 11. TRELL esencialmente libre de las proteínas animales normalmente asociadas.
12. 12. El TRELL según la reivindicación 11, que consiste esencialmente se SEQ ID NO 2 o SEQ ID NO 4.
13. 13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de TRELL o un fragmento activo del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.
14. 14. Un método para prevenir o reducir la severidad de una enfermedad autoinmunitaria, «que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica se«gún la reivindicación 13.
15. 15. La composición farmacéutica según la reivindicación 13, en donde el TRELL o fragmento activo del mismo comprende SEQ ID NO 2 o SEQ ID NO 4, o un fragmento biológicamente activo de los mismos. P753
16. 16. Un método para prevenir o reducir la severidad de una respuesta inmunitaria, a un injerto de tejido, ue comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica según la reivindicación 13.
17. 17. Un método para estimular el sistema inmunitario, «que comprende administrar la composición de la reivindicación 13.
18. 18. Un método para suprimir el sistema inmunitario, que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica según la reivindicación 13.
19. 19. Un método para tratar el cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica según la reivindicación 13.
20. 20. Un método para identificar un receptor para TRELL, que comprende: a. proporcionar TRELL o un fragmento del mismo, b. marcar el TRELL o un fragmento del mismo con una marca detectable; c. detectar una composición para detectar receptores que se unan al TRELL detectablemente marcado en el paso b.
21. 21. Un fragmento biológicamente activo, soluble P753 del TRELL de la reivindicación 11.
22. 22. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se codifica por un ADN seleccionado a partir de un grupo que consiste de: a. una secuencia de ADN que comprende SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 3; b. una secuencia de ADN que hibridiza al ADN definido en a. y que codifica para la expresión para un polipéptido que es al menos 40 % homólogo con el TRELL de la reivindicación 12.
23. 23. Una preparación de anticuerpo que es reactiva con TRELL o su receptor o fragmentos biológicamente activos del mismo.
24. 24. La preparación de anticuerpos según la reivindicación 23, «que comprende anticuerpos monoclonales.
25. 25. Un método para producir una preparación de anticuerpos reactiva a TRELL o su receptor, que comprende el paso de inmunizar un organismo con TRELL, o su receptor, o un fragmento antigénico del mismo.
26. 26. Un ácido nucleico antisentido contra TRELL que comprende una secuencia de ácido nucleico que hibridiza al menos una porción de SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 3.
27. 27. Una composición farmacéutica que comprende una preparación de anticuerpo según la reivindicación 24.
28. 28. Un método para expresar un gen en una célula P753 de mamífero, que comprende: a. introducir un gen que codifica para TRELL en una célula; b. permitir que la célula viva bajo condiciones tal que el gen se exprese en el mamífero.
29. 29. Un método para tratar un desorden relacionado a TRELL en un mamífero a. introducir en una célula una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector que comprende un gen que codifica para TRELL; y b. expresar el gen en la célula de mamífero.
30. 30. El método según la reivindicación 29, en donde el mamífero es un humano.
31. 31. El método según la reivindicación 29, en donde el vector es un virus .
32. 32. Un método para inducir la muerte celular el cual comprende la administración de un agente capaz de interferir con la unión de TRELL a un receptor.
33. 33. El método según la reivindicación 32, que comprende además la administración del interferon-?.
34. 34. Un método para tratar, suprimir o alterar una respuesta inmunitaria, «que comprende una ruta de señalización entre TRELL y su receptor, el método que comprende el paso de : administrar una cantidad efectiva de un agente P753 capaz de interferir con la asociación entre TRELL y su receptor .
35. 35. El método según la reivindicación 35, en donde la respuesta inmunitaria comprende células de adenocarcinoma humano . P753