MXPA98009914A - Sintesis de antibacterianos beta-lactamicos usando esteres con cadena lateral, solubles y enzima acilasa - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a descubrimiento es un proceso para la síntesis de antibacterianos beta-lactámicos utilizandoésteres con cadena lateral soluble en presencia de la enzima acilasa. Tambien se descubrieronésteres novedosos como reactantes en dicho proceso.

Description

SÍNTESIS DE ANTIBACTERIANOS BETA-LACTAMICOS USANDO ESTERES CON CADENA LATERAL SOLUBLE Y ENZIMA ACILASA La presente invención esta dirigida hacia un proceso para la producción de antibacterianos ß-lactámicos, denominados penicilinas y cefalosporinas, en presencia de la enzima acilasa, y un éster soluble como aportador del acilo. La invención está también dirigida hacia la utilización de nuevos esteres como reactivos en dicho proceso. ,10 Publicaciones de las Solicitudes de Patentes Japonesas Nos. 47-25388, 47-29588, 48-26985, 48-35090, 48-99393, 49- 14687, 49-36890, 49-48892, 49-75787, 49-13893 y 52-110896 muestran procesos para la preparación de cefalosporinas o penicilinas por reacción de un metilo o etil ester de la porción acilo que es introducida, con ácido 6- aminopenicilánico o ácido 7-aminocefalosporánico o derivados de éstos. La aportación de acilo en estas referencias es un éster alquilo inferior y especialmente un metil éster. Eiji Kondo, y colaboradores, Patente Estadounidense No. 4,340,672, otorgada en Julio 20 de 1982, presenta un proceso para la preparación de antibacterianos ß-lactámicos, estos son penicilinas y cefalosporinas, por la acción de una acilasa REF. 28504 sobre el núcleo amina de la penicilina ó de la cefalosporina y un éster (1) de la fórmula siguiente, como aportador de acilo: RCOO(CH2CHO)nY X () donde RCO es un grupo acilo de las cadenas laterales de la penicilina o cefalosporina; X, es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo inferior o un grupo hidroxilo alquilo inferior; Y es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior; y n es un entero de 1 a 20. El proceso mencionado utiza el (poli) etilenglicol éster como aportador de acilo que es libremente miscible con agua comparado con los aportadores de acilo conocidos., tales como metilésteres, los cuales tienen baja solubilidad.

WO 92/01061, asignado a Novo Nordisk y publicada en Enero 23 de 1992, describe un proceso para la preparación de derivados ß-lactámicos por acilación enzimática de la familia amino ß-lactámica con amidas como agentes acilantes.

La presente invención proporciona un proceso nuevo para la preparación de antibacterianos ß-lactámicos, esto es penicilinas y cefalosporinas, por la acción de una acilasa sobre el núcleo amina de una penicilina o cefalosporina y un éster que tiene la fórmula (II) como aportadora acilo RCOOCH-R' R- (") donde RCO es un grupo acilo de la cadena lateral de una penicilina o cefalosporina; R' es H o CH2X o CHXY, R" es H o CH2Y o CHXY y X e Y son hidrógeno, hidroxilo, alquilos inferiores o alquilos inferiores-hidroxilos independientes entre si.

Como se ha utilizado en la especificación, a menos que sea explícitamente indicado de otra manera o por contexto, el grupo acilo, representado por RCO es un acilo de penicilinas o cefalosporinas naturales o sintéticas. El alquilo inferior considera alquilos de 1 a 4 átomos de carbono.

Un aspecto de la presente invención proporciona un proceso para la producción de antibacterianos ß-lactámicos por reacción de un éster de la fórmula (II) con ácido carboxilico aminoacetidinona de la fórmula (III) en presencia de acilasa en medio acuoso para producir el antibacteriano ß-lactámico de la fórmula (IV) RCOOCH-R' NH2-Q RCONH-Q HO-CH-R' I + + ' p« acilasa R" (p) (ni) (iv) (V) donde RCO es un grupo acilo, NH2-Q, es una fuente de amino y la acilasa es una enzima de origen bacteriano o fúngico o bien obtenida por métodos recombinantes. Los substituyentes R' y R"son los definidos anteriormente. El grupo acilo, RCO puede ser, recto, ramificado, cíclico o alcanoilo inferior o alquenoilo inferior parcialmente cíclicos; aralcanoilo inferior monociclico , alcanoilo ariloxilo infeiror monocíclico, alcanoílo inferior- (O, N, o S) -heterocíclico, alcanoílo inferior- (O, N, c S) -tioheterocíclico, cianoacetilo> cianometil-tioacetilo, arilglicil monocíclico, cicloalquenilglicilo monocíclico, arilglicolil monocíclico, N-acil-arilglicilo, arilmalonil monocíclico o arilsulfoalcanoil, todos los anteriores que tengan opcionalmente alquilos inferiores, aminometilos, halógenos, hidroxilos, bajos oxialcanoílos o bajos alcoxilos como un substituyente, y preferiblemente que contengan 1 a 15 átomos de carbono.

Los grupos RCO preferidos son D-fenilglicilo y 4-hidroxi-D-fenilglicilo los cuales son bien conocidos como cadenas laterales de antibióticos como cefalexina y amoxicilina.

La aportación amino NH2-Q se refiere al substituyente sobre el grupo 7-amino o el grupo 6-amino de antibióticos conocidos como cefalosporinas y penicilinas. Q, tiene la fórmula (VI) (VI) donde Z es hidrógeno, halógeno bajo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, haloalquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alquenilo C2-4, un grupo nucleofílico o alquilo inferior de 1-3 átomos de carbono substituidos por un grupo nucleofílico. el átomo de halógeno es cloro, bromo o yodo y los grupos nucleofílicos representativos son expuestos en la Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No. 49-81381.

La enzima acilasa puede ser originaria de plantas, animales, hongos, o bacterias o bien obtenida por métodos recombinantes. Las acilasas de origen fúngico o bacteriano son especialmente importantes así como lo concerniente a su .producción, eficiencia, costo y estabilidad.

Bacterias o Hongos representativos para aportadores de acilasa incluye cepas de microorganismos como por ejemplo la¡3 siguientes: géneros Acetobacter, Achromobacter, Aeromonas, Alkalígenes, Arthrobacter, Brevibacterium, Beneckea, Bacillus, Corynebacterium, Escherichia, Flavobacterium, Gluconobacter, Kluyvera, Microbacterium, Micrococcus, Nocardia, Proteus, , Pseudomonas, Rhodopseudomonas , Spirillum, Staphylococcus , Xanthomonas, Aphanocladium o Cephalosporiu , o mutantes naturales o artificiales o variantes de ellas capaces de producir acilasa mediante la reacción de esta invención. Tales cepas incluyen aquellas descritas en, por ejemplo, Advances in Applied Microbiology, Volumen 20, página 217 (1976) , o mutantes naturales o artificiales de ellas apropiadas para la reacción de esta invención. Una enzima especialmente utilizada es la penicilina G amidasa que puede ser obtenida de Escherichia Coli por métodos que son bien conocidos en la práctica. Puede obtenerse también por el uso de E. Coli recombinante que contenga el gen de la penicilina G amidasa con un promotor tac por métodos bien conocidos en la práctica. Este método es preferido ya que hace apropiadas gran cantidad de enzimas para los procesos de manufactura.

El ácido carboxílico de aminoacetidicetona de fórmula (III) puede ser utilizado como sales alcalino-metálica soluble en agua, así como sodio, litio y potasio o como un éster, así como éster metanosulfoniletilo o éster acenonilo. Las aminoacetidicetonas de la fórmula (III) y sus sales o esteres son compuestos conocidos y pueden ser preparados por métodos conocidos.

Los esteres de la fórmula (II) pueden ser preparados por métodos conocidos, ésto es por reacciones de un ácido RCOOH con diol o triol o poliol de la fórmula (V) HO-CH-R' (V) R" donde RCO, R' y R" son como se han definido anteriormente, la reacción de esterificación puede ser por deshidratación bajo condiciones ácido-catalizadas o por medio de un ácido halurado por reacciones de intercambio de ester. El RCOOH y el diol, triol o poliol son compuestos conocidos o pueden ser obtenidos por métodos que son bien conocidos en la práctica.

Otro aspecto de la invención proporciona el ester, R-COO-CH2-CH2-OH donde R es D-fenilglicilo o 4-hidroxi-D-fenilglicilo. Estos esteres son novedosos y reactantes importantes en el proceso de la invención porque dan rendimientos de mas del de 90 % de productos finales. Estos esteres se preparan por métodos conocidos.

Una modalidad preferida de la presente invención es un proceso para la preparación de antibacterianos ß-lactámicos, estos son: cefprocil, cefadroxil y amoxicilina por la acción de penicilina G amidasa en aminas de penicilinas o de cealosporinas de la siguiente fórmula (VII) (VII) donde Z es grupo metilo ( en 7-ADCA) o grupo 1-propenilo (en 7-PACA, el núcleo cefprocil) y un éster de la fórmula (VIII) R-COO-CH2-CH2-OH (VIII) donde R es 4-hidroxi-D-fenilglicilo. Las aminas de penicilina o de cefalosporina de la fórmula (VII) son compuestos conocidos y pueden obtenerse por métodos bien conocidos en la práctica. El ester de la fórmula (VIII) puede ser obtenido por reacción de RCOOH, donde R es como se definió antriormente con etilenglicol. El compuesto RCOOH y etilenglicol están comercialmente disponibles.

El proceso de la invención es llevado a cabo preparando una solución que contenga ester, amina de cefalosporina o de penicilina y la enzima sin un regulador a la temperatura ambiente. Esta solución se prepara por disolución del ester en agua y añadiendo hidróxido de amonio hasta alcanzar un pH de 7.5. Entonces se añade la amina de la penicilina o de la cefalosporina a la solución ester y se ajusta otra vez el pH a 7.5 con hidróxido de amonio. La mezcla se enfría hasta 5-15 °C y se le añade la enzima sólida. Durante este tiempo, el pH baja hasta o.6 unidades y no se mantiene a 7.5. La mezcla de reacción es analizada por HPLC, por ejemplo sobre una columna C18 de fase inversa, de 5 cm. X 4.6 mm, 5 µm "Spherosorb ODS2". El producto final es obtenido con una eficiencia de 90-99 %.

El proceso de esta invención dá el antibacteriano ß-lactámico final en el rendimiento usual de mas del 90 % y algunas veces mas del 95 %, y ocasionalmente mas del 99 %. El rendimiento obtenido por esteres alquilos simples, tales como metilos esta usualmente en el rango del 70 a 90 %. Porque por el alto rendimiento del antibiótico final obtenido por el presente proceso, el proceso es muy utilizado para la manufactura de antibióticos cefalosporínicos o penicilínicos .

Una mezcla de reacción típica contiene 5-35 % de aportadores de acilo (VIII) (preferiblemente 8-12 %) y 2-20 % de la aportadora de amina (VII' (preferiblemente 2-5 %). La enzima puede estar presente en una forma soluble o insoluble, pero preferiblemente la enzima está presente en la forma de una preparación inmobilizada insoluble. Esta preparación tiene ventajas, tales como la aportación de la estabilidad de la enzima y también la relativa facilidad para la remoción de enzimas inmobilizadas de las mezclas de reacción como una primera etapa en el aislamiento del antibiótico.

La invención es ilustrada pero no de manera limitativa por los ejemplos siguientes: Ejemplo 1 Síntesis de ceftrocil desde (VII) utilizando penicilina G amidasa recombinante inmobilizada como la enzima e hidroxietil ester de 4-hidroxi-D-fenilglicina preparada por reacción ácido-catalizada como la aoortadora de acilo.

Una mezcla de 4-hidroxi-D-fenilglicina (10 g . ) , .etilenglicol (15 ml . ) y ácido sulfúrico concentrado (5 ml . ) se agitó por 18 horas a 55 °C bajo condiciones anhidras. La solución fué enfriada, y se le añadió hielo (10 g.), y el pH fue ajustado a 1.0 con NH40H 10 N (4.5 ml.) resultando 40 ml . de solución de hidroxietil ester.

La mezcla de enzimas de 20 ml . conteniendo 10 % de ester, 4 % (VII), y 8 % de enzima (equivalente a 42 U/ml. de enzima) preparada sin regulador como sigue: La solución ester preparada anteriormente (6.9 ml . ) fue mezclada con agua (2ml.) y ajustada a pH de 7.5 con NH4OH 10 N Entonces le fue añadido el compuesto (VII) (0.8g) y el pH ajustado a 7.5 con NH40H 1 N y el volumen llevado hasta 18.4 ml . Entonces se enfrió la mezcla a 5-15 °C y la enzima sólida (1.6 g; 640 Ul) le fue añadida. El pH no se conservó a 7.5 y cayó hasta 0.6 unidades durante la reacción. La mezcla de reacción fue analizada por HPLC sobre una columna C18 de Fase Inversa de 5 cm. X 4.6 mm. 5µm "Spherosorb 0DS2". La fase móbil fué 10 % acetonitrilo/0.3 % H3PO4 @ 2 ml. /minuto con detección a 215 nm. Los isómeros de cefprocil aparecen a loe 2.9 minutos (cis) y a 5.1 minutos (trans). El producto final fué obtenido con un rendimiento máximo de 92-96 %. Todo el experimento fue completado en 25-50 minutos.

Ejemplo 2.

Síntesis de cefprocil desde (VII) utilizando penicilina G amidasa recombinante inmobilizada como la enzima e hidroxietil ester purificado de 4-hidroxi-D-fenilglicina como la aportación de acilo.

El éster purificado fue preparado por la reacción de la Sal de Dañe de 4-hidroxi-D-fenilglicina con bromoetanol y fue obtenida como una sal clorhidrato cristalina, pura.

La mezcla de reacción de 20 ml . conteniendo 12.5 % ester, 4 % (VII), y 8 % enzima (equivalente a 24 Ul/ml. de enzima) se preparó como sigue; El éster purificado (2.5 g.) preparado como anteriormente, fue mezclado con agua (9 ml.) y ajustado a pH 8.0 con NH40H concentrado para dar una solución. El compuesto (VII) (0.8 g.) fue añadido a la solución y el pH de la solución ajustado a 6.76 con H2SO4 2M y el volumen llevado hasta 18.4 ml. Esta solución fue enfriada a 15 °C y la enzima sólida (1.6 g; 480 Ul) le fue añadida. El pH no se mantuvo y cayó hasta 0 . 6 unidades durante la reacción. El producto final fue obtenido con un rendimiento máximo de 99 %. El por ciento del área de no reactivos (VII) bajó a 0.7 %. El experimento se completó en veinticinco minutos.

Ej emplo 3 Síntesis de cefadroxil desde 7-ADCA utilizando penicilina G amidasa Boehringer como la enzima e hidroxietil éster de 4-hidroxi-D-fenilglicina preparada por reacción ácido-catalizada como aportación de acilo.

El éster fue preparado como en el ejemplo 1. El experimento fue repetido como en el ejemplo 1 pero a 15 °C y utilizando 1.6 g. de la enzima Boehringer. La mezcla de reacción fue analizada por HPLC sobre una columna Merck, 250-4, Lichrosorb RP-18 (10 µm) , con 10 % acetonitrilo/1% NH4H2PQ4 como fase móvil corriendo a 1.3 mi. /min. con detección a 280 nm. El producto se obtuvo con un rendimiento máximo de aproximadamente 95 % . El experimento fue completado en 35 minutos.

Ejemplo 4 Síntesis de amoxicilina desde 6-APA utilizando penicilina G amidasa Boehringer como la enzima e hidroxietil ester de 4-hidroxi-D-fenilglicina preparada por reacción ácido catalizada como aportación de acilo.

Un volumen de 20 ml de mezcla, conteniendo 12 % de éster, 3 % de 6-APA, y 8 % de enzima fué preparada como sigue: Una solución del éster (preparada como en el ejemplo 1, 8.3 ml . ) fué mezclada con agua (2 ml . ) y ajustada a pH. 7.5 con N-NH4OH.10 N. Entonces el compuesto 6-APA (0.6 g.) fué añadido a la solución y el pH ajustado aproximadamente a 7.0 con hidróxido de amonio 1 N hasta un volumen de 18.4 ml . Luego la solución fué enfriada a 20 °C y se le añadió la enzima Boehringer (1.6 g.) . Esta solución se analizó por HPLC sobre una columna de Fase Inversa de 5 cm X 4.6 mm. 5 µm. Spherosorb ODS 2. La fase móbil fue 2.5 % de acetonitrilo/NaH2P04 0.025 M hasta pH de 3.5 con H3PO4 corrida @ 1 ml./min. con detección a 215 nm. El producto _inal fue obtenido con un rendimiento de 90-95 % durante 160 minutos.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad en las siguientes,

Claims (6)

Reivindicaciones

1. Un proceso para producir una penicilina o cefalosporina caracterizado porque consiste en una reacción de una amina de la fórmula NH2-Q (III), con un éster de la fórmula (II) RCOO-CH-R' I (II) R" en presencia de una acilasa, donde Q es donde Z es hidrógeno, halógeno, bajo alquilo de 1-3 átomos de carbono, haloalquilo de 1-3 átomos de carbono, alquenilo C2-4, un grupo nucleofílico o bajo alquilo de 1-3 átomos de carbono substituido por un grupo nucleofílico, RCO es derecho, ramificado cíclicico o bajo alcanoilo parcialmente cíclico o bajo alquenoílo, bajo aralalcanoilo monocíclico, alcanoílo bajo oxiarilo monocíclico, (O, N, o S)- heterocíclico-bajo alcanoílo, (O, N, o S)- bajo tioalcanoílo heterocíclico, cianoacetilo, cianometil-tioacetilo, arilglicilo monocíclico, cicloalquenilglicilo monocíclico. monociclicarilglicoliloo, N-acil-arilglicilo, monociclicarilmlonil o arilsulfoalcanoilo, todos los anteriores teniendo opcionalmente bajo alquilo, aminometilo, halógeno, hidroxilo, bajo alcanoiloxilo o bajo alcoxilo como un substituyente, y conteniendo 1 a 15 átomos de carbono. R' es hidrógeno, CH2X o CHXY, R" es hidrógeno, CH2Y o CHXY, donde X e Y están independientemente del hidrógeno, hidroxilo, bajo alquilo o hidroxilo-bajo alquilo, para producir una penicilina o cefalosporina de la fórmula (IV) RCONH-Q (IV), RCO y Q son como se ha definido anteriormente .

2. Un proceso de la reivindicación 1, caracterizado porque NH2-Q es un sal alcalina metálica soluble en agua o un éster.

3. Un proceso de la reivindicación 1, caracterizado porque la acilasa es penicilina G amidasa recombinante inmobilizada .

4. Un proceso para producir el antibiótico cefprocil, cefadroxil o amoxicilina, caracterizado porque consiste en la reacción donde Z es metilo o un grupo 1-propenilo con un éster de la fórmula R-COO-CH2-CH2-OH donde R es 4-hidroxi-D-fenilglicilo en presencia de la enzima, penicilina G amidasa para producir cefprocil, cefadroxil o amoxicilina.

5. El proceso de la reivindicación 4, caracterizado porque la enzima es penicilina G amidasa recombinante inmobilizada .

6. Un compuesto de la fórmula R-COO-CH2-CH2-OH caracterizado porque R es D-fenilglicilo o 4-hidroxi-D-fenilglicilo.