MXPA98008577A - Biodetectores dirigidos a ligandos especificos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a biodetectores para detectar y cuantificar moléculas en líquido, gas, o matrices. Más específicamente, la presente invención se refiere a biodetectores que comprenden un mecanismo de detección molecular para expresar un gen reportero ante interacción con substancias objetivo. La invención además se refiere a métodos que utilizan dichos biodetectores para detectar y cuantificar substancias selectas con alta especificidad y alta sensibilidad.

Description

BIODETECTORES DIRIGIDOS A LIGANDOS ESPECÍFICOS I. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a biodetectores para detectar y cuantificar moléculas en líquidos, gases o matrices sólidas. Más específicamente, la presente invención se refiere a biodetectores que comprenden un mecanismo de conmutación molecular para expresar un gen reportero ante interacción con substancias objetivo. La invención además se relaciona a métodos que utilizan dichos biodetectores para detectar y cuantificar substancias selectas con alta especificidad y alta sensibilidad. II. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La detección de bajos niveles de materiales biológicos e inorgánicos en muestras biológicas, en el cuerpo o en el ambiente, frecuentemente es difícil. Ensayos para este tipo de detección involucra múltiples etapas que pueden incluir ligar un anticuerpo primario, varias etapas de lavado, ligar un segundo anticuerpo, adicionales etapas de lavado y dependiendo del sistema de detección, adicionales etapas enzimáticas y de lavado. Estos ensayos además tienen la carencia de sensibilidad y están sujetos a imprecisiones. Por ejemplo, los inmunoensayos adicionales fallan en detectar 30% de las infecciones .

Los ensayos de sonda molecular, aunque son sensibles, requieren personal altamente calificado y conocimientos de secuencias de ácido nucleico del organismo. Tanto el uso de la sondas de ácido nucleicos como los ensayos basados en la reacción de cadena polimerasa (PCR = polymerase chain reaction) , solo pueden detectar ácido nucleico que requiere complicados procedimientos de extracción y puede o no ser el indicador primario de un estado de enfermedad o contaminante. Ambos tipos de formatos de ensayo se limitan en su repertorio en casos en donde está disponible poca información para la entidad a detectar. Ciertos medios no invasivos para medir los parámetros físicos de un paciente tales como CAT o MRI, son costosos y a menudo inaccesibles. De esta manera, la verificación de muchos problemas médicos aún requieren pruebas, que pueden ser lentas y costosas. El tiempo entre la prueba actual y la confirmación de la condición puede ser muy importante. Por ejemplo, en el caso de sepsia, muchos pacientes sucumben antes de que se confirme la infección y el organismo de infección identificado, de esta manera el tratamiento tiende a ser empírico y menos eficaz. Otro ejemplo está en clasificar el suministro de sangre para patógenos . La verificación de un suministro de sangre libre de patógenos requiere una cantidad de ensayos intensos en mano de obra. En el caso de HIV-1, el virus que provoca el SIDA (AIDS) , los ensayos actuales clasifican anticuerpos anti-HIV y no el propio virus . Hay una ventana que dura hasta muchas semanas después de exposición al virus en donde los anticuerpos no son detectables y sin embargo la sangre contiene grandes cantidades de partículas de virus infecciosos. Clark y colaboradores, 1994 , J. Infect . Dis . 170. : 194 -197 ; Pia tak y colaboradores, 1993 , Aids Suppl . 2.- S65- 71. Por ejemplo, a fin de verificar que un suministro de sangre está libre de HIV-1, deben realizarse varias pruebas intensas en mano de obra, costosas. Aún más, las pruebas actualmente en uso para iniciar la clasificación no identifican el propio virus, que puede estar presente a niveles relativamente bajos, sino que se dirigen a anticuerpos HIV que no están presentes por semanas después de una infección inicial. Clark y colaboradores , 1994 , J. Infect . Dis . 170 : 194 - 197; Piatak y colaboradores, 1993 , Aids Suppl . 2.- S65 - 71 . De esta manera, la clasificación del suministro de sangre no solo es consumidora de tiempo y lenta sino también puede ser imprecisa . Similarmente, la capacidad en detectar substancias en el medio ambiente, tales como contaminantes arrastrados por el aire y arrastrados por el agua, es de enorme importancia. Por ejemplo, sería conveniente el verificar el agua freática, para controlar procesos industriales, procesamiento de alimentos y manejar en tiempo real utilizando un ensayo versátil económico. Sin embargo, los actuales métodos no son adecuados para esta verificación "en línea" . Hay varias razones por las cuales están limitados los métodos actuales. Primero, el acceso a cantidades suficientes de material a detectarse puede ser difícil. Por ejemplo, la detección de materiales biológicos puede ser difícil ya que los materiales biológicos de interés a menudo se secuestran dentro de un cuerpo, y puede ser difíciles grandes cantidades para obtener para verificación ex vivo . Por lo tanto, ensayos sensibles para utilizar en pequeñas cantidades de material, son necesarios . Esto indica que se requiere un método para amplificar la señal. Los métodos de amplificación se han establecido para detectar ácido nucleico pero esto no es el caso para métodos de detección de antígeno. Un segundo problema es que la detección puede ser difícil en tiempo real debido a que los materiales objetivo pueden estar presentes en pequeñas cantidades, que la detección de su presencia requiere procesos involucrados consumidores de tiempo, costosos y técnicos. Por ejemplo, en el caso de infecciones bacterianas en la sangre, la sepsia o septicemia puede ser solo una a dos bacterias en una muestra de sangre de 1-10 ml . Métodos actuales requieren que las bacterias se cultiven primero a fin de ser detectadas. Askin, 1995, J.

OJs et. Gynecol . Neonatal . Nurs . 24_ : 635-643 . Este retardo de tiempo puede ser nocivo, ya que el retardo del tratamiento o mal tratamiento enfermedades, puede significar la diferencia entre la vida y la muerte. Otros han intento evitar estas limitaciones al utilizar etiquetas radioactivas o fluorescentes, en combinación con anticuerpos {Harlow y. colaboradores , (1988) , Antibodies. A Laboratorv Manual (Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio) (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press) . Ensayos basados en anticuerpos típicamente involucran ligar un anticuerpo a la molécula objetivo, seguido por una serie de etapas de lavado para retirar todos los anticuerpos no ligados. El ligar el anticuerpo a su molécula objetivo típicamente se detecta por una molécula identificadora, por ejemplo" un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo específico de molécula objetivo que contiene una etiqueta detectable. La etapa también se sigue por múltiples etapas de lavado. En forma alterna, el anticuerpo específico de objetivo puede ligarse directamente a una etiqueta detectable. Las etiquetas tienen incluidos trazadores radioactivos, etiquetas fluorescentes y sistemas de detección quimioluminescentes . Harlow y Lañe, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual (Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio) (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press) .

Las serie de etapas requeridas utilizando estos ensayos basados en anticuerpo para generar una señal específica, son consumidores de tiempo e intensas en mano de obra. Además, estos tipos de ensayos están limitados a la detección de antígenos fijos a algún tipo de matriz. Ejemplos de este tipo de sistema de detección incluyen manchado o tinción Western, inmunohistoquímica y ELISA. La más alta sensibilidad actualmente se logra utilizando etiquetas radioisotópicas y quimioluminescentes . Sin embargo, la sensibilidad, es decir señal específica sobre el fondo de estos sistemas de detección frecuentemente queda como un factor limitante . Similarmente, la radiación de fondo impone límites en la sensibilidad de la técnica de inmunoensayo radioactivo. Además, estas técnicas son consumidores de tiempo y costosas. Finalmente, enfoques radioactivos son hostiles al medio ambiente, ya que presentan problemas de desecho de desperdicios significantes . Otro enfoque para verificar substancias involucra el uso de luz. La luz tiene la ventaja de que es fácilmente medible, no invasora y cuantitativa. Von Bally y colaboradores , (1982) , Optics in Biomedical Sciences: Proceedings of the International Conference (Óptica en Ciencias Biomédicas: Minutas de la Conferencia Internacional) (Berlín, New York: Springer-Verlag) .

Tradicional espectroscopia involucra hacer brilla luz en substancias y calcular la concentración con base en la absorbancia o dispersión de luz. Von Bally y colaboradores, (1982) , Optics in Biomedical Sciences: Proceedings of the International Conference (Óptica en Ciencias Biomédicas : Minutas de la Conferencia Internacional) (Berlín, New York: Springer-Verlag) . Técnicas ópticas detectan variaciones en la concentración de material de dispersión de luz o absorbente de luz. Von Bally y colaboradores, (1982), Optics in Biomedical Sciences: Proceedings of the International Conference (Óptica en Ciencias Biomédicas : Minutas de la Conferencia Internacional ) (Berlín, New York: Springer-Verlag). La espectroscopia infra-rojo cercano ha demostrado ser una forma no ionizante, relativamente segura de radiación que funciona bien como una sonda médica, ya que puede penetrar en tejido.

Además, es bien tolerada incluso en grandes dosis. Por ejemplo, la luz ahora se emplea para calcular la concentración de oxígeno en la sangre (Nellcor) o el cuerpo (imagen Benaron) o incluso para verificar glucosa en el cuerpo (Sandia) . Benaron y Stevenson, 1993, Science 259:1463-1466; Benaron y colaboradores, 1993, en: Medical Optical Tomography: Functional Imaging and Monitoring (Tomografía Óptica Médica: Formación de Imagen y Verificación Funcional) , G. Muller, B. Chance, R. Alfano y colaboradores, eds. (Bellingham, WA USA: SPIE Press), páginas. 3-9; Benaron y Stevenson, 1994, Adv. Exp . Med. Biol . 361 : 609-617. Sin embargo, las técnicas actuales están limitadas ya que muchas substancias no tienen señales espectroscópicas únicas que pueden estimarse ópticamente en forma fácil y cuantitativa. Von Bally y colaboradores, (1982), Optics in Biomedical Sciences: Proceedings of the International Conference (Óptica en Ciencias Biomédicas: Minutas de la Conferencia Internacional) (Berlín, New York : Springer-Verlag) . Además, la detección de substancias a bajas concentraciones frecuentemente se deteriora por altas señales de fondo, especialmente en medios biológicos tales como tejidos. Von Bally y colaboradores , (1982) , Optics in Biomedical Sciences: Proceedings of the International Conference (Óptica en Ciencias Biomédicas: Minutas de la Conferencia Internacional) (Berlín, New York: Springer-Verlag) . En los últimos años, los ensayos basados en emisión de luz, por ejemplo quimioluminescencia (Tatsu y Yoshikawa, 1990, Anal . Chem . 62.: 2103-2106) , han atraído atención incrementada debido al desarrollo de métodos extremadamente sensibles para detectar y cuantificar la luz. Hooper y colaboradores, 1994, J. Biolumin . Chemilumin . 9.:113-122. Un ejemplo de un producto de investigación biomédica que utiliza quimioluminescencia es el sistema de detección ECL (Amersham) para inmunoensayos y detección de ácido nucleico.

El uso de fuentes biológicas de luz, bioluminiscencia para ensayos biológicos, tiene desarrollo paralelo de detección quimioluminescente, ya que se requieren dispositivos similares para detección de luz. Kricka, 1991, Clin . Chem . 37:1472-1481.

Una de las fuentes de luz biológicas más comúnmente ~ '" empleadas es luciferasa, una enzima generadora de luz sintetizada por una de gama organismos, incluyendo Photinus pyralis (Luciérnaga americana) , Renilla renifor is (coral fosforescente) y Photobacterium (Especies bacterianas luminiscentes) . En general, la luciferasa es una óxidoreductasa de bajo peso molecular, que cataliza la deshidrogenación de luciferina en la presencia de oxígeno, ATP e iones magnesio. Durante este proceso, aproximadamente 96% de la energía liberada aparece como luz visible. Para revisión ver Jassim y colaboradores, 1990, J. Biolumin . Chemilumin . :115-122. La sensibilidad de detección de fotones y la capacidad para someter a ingeniería bacterias y otras células para expresar proteínas bioluminiscentes permite el uso de estas células como biodetectores sensibles en estudios ambientales. Guzzo y colaboradores, 1992, Toxicol .• Lett . 64:687-693; Heitzer y colaboradores, 1994, Appl . Environ .

Microbiol . 60.:1487-1494; Karube y Nakanishi, 1994, Curr. Opin .

Biotechnol . 5:54-59; Phadke, 1992, Biosystems 27:203-206; Selifonova y colaboradores, 1993, Appl . Environ . Microbiol . 59:3083-3090. Por ejemplo, Selifonova y colaboradores, describe biddetectores para contaminantes en el medio ambiente. Más específicamente, el utilizar fusiones del operón Tn2I de inducible por Hg (11) con el luxCDABE sin promotor de Vijrío Fischeri , biodetectores altamente sensibles para la detección de Hg (II) , se han construido. Además de sistemas en donde se emplea la bioluminiscencia como método de detección de una condición específica, por ejemplo la presencia de Hg (II) arriba, la expresión constitutiva de luciferasa se ha empleado como marcador para dar seguimiento a la viabilidad de células bacterianas, ya que el ensayo de luciferasa depende de la viabilidad celular. Por ejemplo, expresión constitutiva de luciferasa, recientemente se ha empleado para el desarrollo de drogas y vacunas directamente contra enfermedades bacterianas . Específicamente, utilizar una cepa de Mycobacterium tuberculosis que expresa luciferasa se ha empleado para evaluar actividad anti-microbiana en ratones. Hickey y colaboradores, 1996, Antibacterial Agents and Chemotherapy (Agentes antibacterianos y Quimioterapia) 40 : 400-407.

Sin embargo, los biodetectores que se basan en un receptor bacteriano para activar una luciferasa se limitan a detectar aquéllas moléculas que tienen un receptor bacteriano correspondiente, enlazado a una región promotora conocida que puede fusionarse al gen de luciferasa. Además, las bacterias que expresa luciferasa empleada para probar actividad anti-microbiana en ratones no son específicas. De esta manera, mientras que se han explorado métodos que utilizan la bioluminiscencia en general, y luciferasa en particular, como detectores bioluminiscentes para aplicaciones muy específicas, la presente invención se dirige a biodetectores específicos de ligando altamente sensibles y altamente selectivos para una gama muy amplia de aplicaciones. Más específicamente, la presente invención combina la selectividad de unión específica de ligando y la versatilidad del reportorio anticuerpo con la sensibilidad de detección bioluminiscente, empleando entidades que responden específicamente con emisión de fotones para ligandos predeterminados. El enfoque de la presente invención de esta manera permite la generación de biodetectores extremadamente sensibles para el desarrollo de una amplia variedad de ensayos que detectan cualquier cantidad de moléculas comercialmente importantes . III. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a biodetectores específicos de ligando objetivos, para detectar y verificar substancias selectas. Más específicamente, los biodetectores de la presente invención comprenden (1) un elemento de conversión de señal, que compromete una porción de unión específica de ligando extra celular, que se fusiona a un dominio de transformación de señal intracelular que es capaz de activar un (2) componente transductor, que en su forma activa es capaz de activar un (3) elemento de respuesta, tal como un promotor que se enlaza operativamente con un (4) gen reportero, que codifica un polipéptido con propiedades únicas que se detectan fácilmente por ejemplo de manera óptica. De esta manera, los biodetectores de la invención convierten la unión a una substancia objetivo, es decir un ligando, en una señal detectable. En modalidades preferidas de la invención, la señal detectada por el biodetector es luz y se detecta por un dispositivo de detección de luz. De acuerdo con esto, una substancia de interés puede identificarse. La presente invención además se dirige a métodos que utilizan los biodetectores, para detectar y verificar substancias selectas a alta sensibilidad y alta especificidad. Los métodos que utilizan los biodetectores de la invención incluyen la detección de contaminantes en las industrias de alimentos y agricultura, diagnóstico y verificación en medicina e investigación y detección de venenos o contaminantes en el ambiente o sitio de defensa. IV. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 ilustra un modelo genérico que demuestra los componentes principales de un biodetector. Un biodetector consiste de una entidad que posee detección (estructura "en forma de Y" en la superficie) , componentes transductores (parte de la estructura "en forma de Y" dentro del biodetector) y componentes emisores de luz (pequeños círculos) . La FIGURA 2 ilustra un esquema más específico de un biodetector en el nivel molecular. La FIGURA 3 ilustra una estructura ordenada de biodetectores en un soporte sólido, tal que una variedad de substancias en una muestra puedan ser detectadas simultáneamente. La FIGURA 4 ilustra un biodetector generado por la integración de un transposón en el genoma bacteriano como se especifica en el EJEMPLO 1. El operón luciferasa codifica cinco proteínas (de los genes A, B, C, D y E) que en conjunto pueden producir bioluminiscencia. Chl, gen de resistencia a cloranfenicol ; Kan, gen de resistencia a canamicina; Amp, gen de resistencia de Ampicilina; P04, grupo fosfato (como activador del transductor) .

La FIGURA 5 ilustra el efecto de sangre humana en la r emisión de luz del bioluminiscente Salmonella, demostrando casi detección de célula sencilla. V. DEFINICIONES A menos de que de otra forma se indique, todos los términos empleados aquí tienen el mismo significado que se entendería por una persona con destreza en la técnica. El término "molécula objetivo " como aquí se emplea describe una substancia que se va a detectar y/o cuantificar. El termino "luciferasas " como se emplea aquí, a menos de que de otra forma se establezca, incluye luciferasas procarióticas y eucarióticas así como variantes con propiedades de emisión y/o físicas variadas o alteradas. El término "biodetector" como se emplea aquí, se refiere a una entidad que responde con una señal óptica para ligar o de otra forma inter actuar con la molécula objetivo. El término "señal óptica " como se emplea aquí, se refiere a cualquier reacción o substancia bioquímica que puede distinguirse utilizando técnicas de verificación de luz. Esto incluye emisión de fotones, fluorescencia y absorbancia. El término "luz " como se emplea aquí, a menos de que de otra forma se establezca, se refiere a radiación electromagnética que tiene una longitud de onda entre aproximadamente 220 nm y aproximadamente 1100 nm.

El término "inducción de promotor" , como se emplea aquí, se refiere a un evento que resulta en una activación directa o indirecta de un elemento genético inducible selecto. VI. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A. Revisión Detallada General de la Invención La presente invención se dirige a biodetectores específicos de ligando dirigidos, para detectar y verificar substancias selectas, incluyendo microorganismos, moléculas e iones para una amplia gama de aplicaciones. Los biodetectores de la presente invención combinan la especificidad y selectividad de unión especificada de ligando con la sensibilidad de detección bioluminiscente al emplear entidades que responden específicamente a la unión de un ligando predeterminado con emisión de fotones. De esta manera, el enfoque de la represente invención permite la generación de biodetectores sensibles para el desarrollo de una amplia variedad de ensayos que detectan y verifican cualquier substancia selecta. Más específicamente, los biodetectores de la presente invención proporcionan el acoplamiento de unión específica de ligando, mediante un "conmutador molecular", es decir una transducción de señal, con la activación de una molécula reportera detectable, en respuesta a unión de ligando. Los biodetectores de la presente invención pueden consistir de entidades biológicas viables tales como bacterias, o entidades abióticas tales como liposomas. Como esquema general, los biodetectores se caracterizan por su capacidad para reconocer específicamente un ligando y convertir la unión al ligando a una señal medible, tal como emisión de luz. Por ejemplo, pueden emplearse bacterias como biodetectores específicos de ligando, que responden específicamente con emisión de fotones a ligandos predeterminados. Los biodetectores de la presente invención permiten detección altamente sensible de una amplia variedad de substancias, por ejemplo microbios en sangre humana, virus y bacterias, moléculas tóxicas, iones, células de cáncer, antígenos, pequeñas moléculas (por ejemplo glucosa) , pH, oxígeno y metales. Además, la presente invención proporciona el uso de estos biodetectores en una amplia variedad de ensayos, para detectar cualquier substancia selecta. En general, los biodetectores de la presente invención comprenden un elemento de conversión de señal, que comprende una porción de unión específica de ligando extra celular, que se acopla a un dominio de transformación de señal intracelular que es capaz de activar un componente transductor. El componente transductor en su forma activa es capaz de activar un elemento de respuesta, tal como un promotor que se enlaza operativamente con un gen reportero, que codifica para un polipéptido de diagnóstico con propiedades únicas que son fácilmente detectables. En forma alterna, una molécula reportera se activa directamente al ligar otro dominio de transformación de señal intracelular del elemento de conversión de señal . De esta manera, los biodetectores de la invención convierten la unión a una substancia objetiva, es decir un ligando, en una señal detectable. En modalidades preferidas de la invención, la señal generada por el biodetector es luz y se detecta por un dispositivo de detección de luz. De acuerdo con esto, con base en esta interacción, el o los ligandos dirigidos pueden ser cuantificados e identificados. B. Biodetectores Los biodetectores de la invención se caracterizan porque generan una señal detectable en repuesta ya sea a la presencia de una substancia objetivo in vivo o in vi tro . En una modalidad específica, la luz es la señal detectable generada por el biodetector, en respuesta a la presencia de la substancia objetivo. Ya que virtualmente no hay luz de fondo que provenga de tej idos normales y otros materiales orgánicos o inorgánicos, la sensibilidad del sistema se limita solo por la interferencia o ruido de fondo del biodetector. Más específicamente, los biodetectores específicos de ligando dirigidos de la presente invención consisten de un dominio específico de ligando, que mediante un "conmutador molecular", se enlaza a un gen reportero que codifica una proteína detectable. El gen reportero de esta manera se activa en respuesta a unir el ligando con el dominio específico de ligando. La porción de unión específica de ligando puede ser cualquier anticuerpo que liga selectivamente a la substancia de interés. El "conmutador molecular" es un componente de transducción de señal que acopla la unión de ligando con la activación de un elemento de respuesta. La molécula transductora puede ser cualquier sistema regulatorio de dos componentes de bacterias, incluyendo fosfato reguión o cualquier transductor eucariótico. El elemento de respuesta puede ser cualquier promotor inducible, enlazado operativamente con un gen reportero. La transcripción y traducción de este gen reportero resultará en un producto de gen que produce una señal detectable tal como luz . La señal se detecta por medios convenientes, en el caso que la señal es luz, estos medios serán un dispositivo de fotodetección. Por ejemplo, el formar en imagen las entidades de biodetector emisores de luz, puede involucrar el uso de un fotodetector capaz de detectar niveles extremadamente bajos de luz, típicamente eventos de un solo fotón. \ De ser necesario, la ubicación de señal puede determinarse al integrar emisión de fotones hasta que pueda construirse una imagen. Ejemplos de estos fotodetectores sensibles incluyen dispositivos (tales como intensificadores de placa de micro-canales y tubos fotomultiplicadores) que intensifican los eventos de fotones sencillos. Los intensificadores pueden colocarse tras de una cámara. Además, también podrán emplearse cámaras sensibles (enfriadas por ejemplo con nitrógeno líquido) que son capaces de detectar fotones simples sobre el ruido de fondo inherente en un sistema de detección. Una vez que se genera una imagen de emisión de fotones, típicamente se superpone en una imagen de luz reflejada "normal" del sujeto para proporcionar un marco de referencia para la fuente de los fotones emitidos. Esta imagen "compuesta" luego se analiza para determinar la ubicación y/o cantidad de un objetivo en el sujeto. En la mayoría de las circunstancias las imágenes de la fuente de luz no se requieren. Una cuantificación simple de los números de fotones emitidos desde una muestra (como se detecta por ejemplo por un luminómetro) indica la concentración de un reportero emisor de luz . El número de fotones por lo tanto será proporcional a la cantidad de ligando-dirigido, que percibe un detector específico. Sin las restricciones impuestas por la necesidad de una imagen, los detectores pueden colocarse en proximidad inmediata con el biodetector emisores de luz, optimizando de esta manera la detección óptica y sensibilidad de ensayo. Intensificadores de placa de microcanales pueden emplearse en dicha configuración resultando en detección de un solo fotón. Este dispositivo actualmente se fabrica por Hamamatsu Corporation. En el sistema Hamamatsu a concentraciones de ATP de células sencillas pueden ensayarse al rociar amortiguador de lisis, luciferasa y el substrato, luciferina en células inmovilizadas . El mecanismo genérico de un biodetector específico de ligandos ilustra la FIGURA 1. La FIGURA 2 muestra el mecanismo molecular de un biodetector preferido más específicamente. En el ejemplo ilustrado, el biodetector es una célula bacteriana que expresa un elemento para conversión de señal específico objetivo de transmembrana, que comprende una porción de unión específica de ligando extracelular, por ejemplo, un anticuerpo, que se acopla a un dominio de transformación de señal intracelular. El elemento para conversión de señal específico objetivo se integra en una membrana, por ejemplo, una membrana bacteriana, que separa un compartimiento "extracelular" de un compartimiento "intracelular" . La porción específica de ligando es capaz de ligar a una substancia selecta, que dispara la activación del dominio para transformación de señal intracelular. El dominio para transformación de señal intracelular activado a su vez convierte un transductor inactivo en un transductor" activo. El transductor se caracteriza por su capacidad para ligar, cuando se convierte en su forma activa, a un elemento promotor, que se enlaza operativamente con un gen reportero. La transcripción y traducción del gen reportero u operón resulta en un producto de gen que genera una señal detectable, tal como luz. En modalidades preferidas de la invención, el reportero es un operan luciferasa que produce luz visible y pueden verificarse fácilmente, medirse y cuantificarse con alta sensibilidad. En forma alterna, el dominio de transformación de señal puede actuar directamente en una molécula reportera modificada. La molécula reportera se modificará para expresarse en un estado activo, que luego puede activarse a través de su interacción con el dominio de transformación de señal directamente . Los biodetectores que proporcionan un "conmutador de luz" que responde a una substancia selecta predeterminada, presentan una cantidad de ventajas frente a las metodologías presentes. Primero, el conmutador permite detección de antígenos, presentes en mezclas complejas y elimina la necesidad por lavar por arrastre anticuerpos no ligados, simplificando de esta manera la detección. Este ligando unido al anticuerpo activa la luz y ya que no hay luz de fondo en la muestra, no es necesario lavado para reducir la proporción de señal a interferencia, la reducida interferencia incrementa la sensibilidad y solo la interacción específica enciende la luz. Una vez unido a un ligando, una cascada enzimática se activa que sirve para transmitir la señal. Aún más, si el ligando objetivo se expresa abundantemente en la superficie por ejemplo de microbios patogénicos, muchas bacterias biodetectoras ligarán a un solo objetivo, sirviendo de esta manera para amplificar la señal y resultar en sistemas de detección extremadamente sensibles. Además, conforme el dominio específico de ligando del elemento de conversión de señal para el sistema biodetector puede intercambiarse como un cartucho, un número ilimitado de biodetectores puede generarse para reconocer cualquier substancia deseada o selecta. De esta manera, los biodetectores de la presente invención proporcionan un sistema flexible y genérico que puede adaptarse para reconocer cualquier substancia selecta, de una amplia variedad de selecciones. Los biodetectores que están dirigidos a una substancia de interés pueden desarrollarse rápidamente. Los biodetectores de la invención son versátiles ya que son eficaces in vivo, en solución o en placas de detector fijas. Además, estructuras de estos biodetectores pueden construirse, operando en longitudes de onda diferentes o en diferentes posiciones de un "microcircuito (chip) biodetector " , permitiendo la verificación y clasificación simultánea de múltiples agentes, genes, productos de gen, u otros objetivos. Ver, FIGURA 3. Por ejemplo, pueden ensamblarse los biodetectores en una configuración de estructura de múltiples detectores única, con el propósito de construir un sistema capaz de análisis poderoso de rango amplio en una sola etapa. Por ejemplo, el biodetector puede colocarse en un gel que se encuentra en la parte superior de un instrumento de detección de señal normal, que en el caso de que la señal generada sea luz, puede por ejemplo, ser un microcircuito y dispositivo acoplado de carga (CCD) . Debido al reconocimiento espacial de la señales por la estructura CCD, la estructura biodetectora puede proporcionar un análisis basado en luz utilizando múltiples detectores diferentes colocados en una estructura en un microcircuito detector. De esta manera, puede realizarse simultáneamente un análisis por ejemplo, tipo sanguíneo, exposición de HIV, estado de Hepatitis, perfiles de Linfocina y positividad CMV. Múltiples tipos de infección serán rápida y simultáneamente clasificados., Si la luz de la señal es producida por él reportero, la señal puede detectarse en forma no invasora ya que la luz puede detectarse a través, por ejemplo de tejido. Ver, la solicitud de patente de los E.U.A. No. 08/270,631, aquí incorporada por referencia completamente. Además, ya que los biodetectores de la invención son biocompatibles y ya que son ambientalmente amigables, tienen costos de desarrollo comparativamente bajos, y un carga menor al usuario, especialmente cuando se comparan con métodos que pueden involucrar desechos de tóxicos, tales como ensayos basados en radioactividad. Una ventaja significante adicional de los biodetectores de la invención es la reducción en tiempo y mano de obra requeridas para desempeñar muchas pruebas de diagnóstico. Una etapa común, limitadora de velocidad de muchos campos de prueba y diagnóstico es la necesidad por un sistema de detección preciso y sensible adecuado para proporcionar información inmediata. Ejemplos incluyen clasificar el suministro de sangre para el virus del SIDA y otros patógenos transportados por la sangre, el estudio y evaluación de drogas novedosas en cultivo de tejido y modelos de animales, y la verificación de la salida de proteína terapéutica después de terapia genética. Por ejemplo, la clasificación obligatoria del suministro de sangre para HIV y otros agentes actualmente requieren numerosas pruebas. Un detector económico, rápido y específico que detecta numerosos patógenos transportados por la sangre con pruebas confirmatorias inter construidas, puede significativamente hacer dinámico el proceso, reduciendo de esta manera el costo neto al usuario. Similarmente, la evaluación de nuevas drogas potenciales, conocidas como compuestos de plomo, por compañías farmacéuticas ahora requieren pruebas con animales y cultivos de tejidos costosos y elaborados. Un detector económico y herramental relacionado para permitir verificación in vi tro e in vivo de cinéticas de drogas y efectividad, tendrá enorme valor para las compañías farmacéuticas que buscan formas de hacer dinámico este desarrollo de compuestos de plomo.

En suma, los biodetectores de la invención proporcionan numerosas ventajas frente a los sistemas de detección de diagnóstico actualmente disponibles. 1. Entidades gue Alojan Biodetectores Los componentes biológicos del biodetector pueden contenerse en o de otra forma puede conectarse a entidades vivas o no vivas que estabilizan las interacciones esenciales. Configuración de estos componentes como tal resulta en un sistema de micro detección capaz de detectar pequeñas cantidades de ligandos con enorme especificidad y sensibilidad. Entidades Vivas . Más típicamente, la entidad biodetectora es una célula viva que se somete a ingeniería genética para comprender todos los componentes requeridos . Entidades vivas incluyen aunque no están limitadas a, procariotas, eucariotas, virus, retrovirus, vectores, plásmidos, fago, células eucarióticas transformadas, tales como linfocitos, macrófagos, líneas celulares establecidas. Más típicamente, la entidad que aloja una célula bacterial sometida a ingeniería genética tal como E. coli . Bacterias modificadas genéticamente, pueden desarrollarse rápidamente a bajo costo, de esta manera la ventaja del uso de las células vivas como entidad biodetectora es que depósitos de estos biodetectores pueden replicarse y desarrollarse una vez que se construye el biodetector original .

El uso de entidades biodetectoras "vivas" tienen varias ventajas. Primero, permite el crecimiento de biodetectores a bajo costo, una vez que los detectores se someten a ingeniería. Segundo, permite un sistema en donde un detector puede crecer y continuar desarrollándose dentro de un tejido, en vez de ser desgastado como sería un detector inorgánico convencional. En tercer lugar, un biodetector vivo puede amplificar la señal detectada. Por ejemplo, la unión de un antígeno a la superficie de la bacteria puede activar que una serie de substancias generadoras de luz sean producidas, cada una de las cuales pueda producir luz en una forma repetitiva. De esta manera, la unión de un antígeno que estimula adecuadamente el sistema puede resultar en la producción de grandes cantidades de fotones desde un biodetector vivo. En cuarto lugar, ya que estos biodetectores pueden ligar en grandes cantidades un objetivo, el resultado es que muchos biodetectores, es decir bacteria, con cada una que amplifican el evento de' unión, llevan a un alto grado de amplificación. De esta manera, puede lograrse una sensibilidad extremadamente elevada. Entidades No Vivas . Sin embargo, biodetectores abióticos pueden generarse por igual. El sistema biodetector puede colocarse en un gel inanimado, en cápsulas abióticas y liposomas y como tal inyectado al cuerpo o montado en placas.

Además, cualquier otra entidad capaz de conservar metabolismo vectorial tal como una bicapa lípida podrá emplearse. 2 o El Elemento de Conversión de Señal El elemento de conversión de señal está compuesto por una porción "extracelular" que liga selectivamente una substancia específica y una porción "intracelular" capaz de activar el transductor. Típicamente, el elemento de conversión de señal será una proteína de fusión de transmembrana compuesta de una porción de unión de ligando extracelular, por ejemplo, un anticuerpo y una porción enzimática intracelular, que se activa al ligar la porción extracelular a un objetivo selecto. De acuerdo con esto, el elemento de conversión de señal se designa para convertir el reconocimiento y unión de una substancia específica, es decir ligando y en una señal intracelular, resultando en la activación del componente transductor, que a su vez activa un promotor que desplaza la expresión de la proteína reportera. El Dominio de Unión de un Ligando . Substancias que pueden identificarse por la presente invención, incluyen aunque no están limitadas a proteínas, péptidos, azúcares, ácidos grasos, iones, microorganismos, incluyendo bacterias, virus y retrovirus. De acuerdo con esto, el dominio de unión de ligando puede ser un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, receptor celular o cualquier otra proteína que une ligando, tal como las Proteínas de Staphylococcus A y G, un receptor de macrófago Fe, una porción carbohidrato, o una porción que liga ion, tales como dominios de los canales sodio o potasio. En modalidades específicas, el dominio de unión de ligando es un anticuerpo o su derivado, incluyendo aunque no limitado a anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs) , anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, anticuerpo anti-idiotípicos (anti-Id) , y fragmentos de unión epítopo, de cualquiera de los anteriores. En particular, la tecnología de anticuerpo monoclonal y el desarrollo más reciente de técnicas para expresar anticuerpos funcionales en células bacterianas han incrementado la versatilidad y facilidad de identificar dominios de unión de ligando convenientes para cualquier objetivo deseado. Para detalles respecto a la expresión de cuerpos en células bacterianas, Ver, entre otros sitios Collet y colaboradores, 1992, Proc . Nati . Acad. Sci . U.S.A. 89:10026- 10030, y Huse y colaboradores 1989, Science 246 : 1275-1281. Aún más, la fuente de las regiones que codifican anticuerpo no se limita a aquéllas clonadas de líneas de células de hibridoma, en donde la especificidad del anticuerpo se conoce y es monoclonal en naturaleza. Por el contrario, pueden emplearse grandes bibliotecas de anticuerpos para generar las proteínas de fusión, tal que una gran cantidad de biodetectores para detección de una gama indefinida de antígenos, pueda generarse. El Dominio de Transformación de Señal . El dominio de transformación de señal puede consistir de una enzima o dominio activo de una enzima que tiene una cantidad de funciones de modificación de proteína que pueden incluir fosforilación, desfosforilación, metilación, acetilación y actividad de proteasa. Estas enzimas incluyen proteínas cinasas, fosforilasas, proteína de metilasas, acetilasas, proteasas, proteinasa K, serina proteasas entre otras. En una modalidad específica de esta patente, el dominio activo de la fosforilasa bacteriana, PhoQ, se fusionará en una fusión de gen a una región de un anticuerpo de cadena pesada ADNc. Como tal, la interacción de la proteína de fusión expresada con el antígeno dirigido (ligando) resultará en un cambio de conformación en la fusión de anticuerpo-fosforilasa que activará la actividad fosforilasa específica que activa el PhoP, una proteína transductora, a través de un evento de fosforilación/-desfosforilación. PhoP activo activa el promotor Pho, que se emplea para dirigir la expresión del lux operón reportero. El dominio activante transductor del evento de conversión de señal se caracteriza ya que cambia con formación o carga eléctrica a ligar una molécula específica, lo que resulta en activación del transductor. El transductor puede activarse por fosforilación, glicosilación, transporte de electrones de metilación, transporte de hidrógeno, carboxilación, deshidrogenación, oxidación/reducción o cualquier otra modificación química. 3. Transductores El transductor se activa por el elemento de conversión de señal ante unión de ligando. El transductor puede ser cualquier molécula que pueda reconocer y responder a un cambio en conformación, carga eléctrica, adición o substracción de cualquier sub-grupo químico, tal como fosforilación, glicosilación y a su vez es capaz de disparar una respuesta detectable. En modalidades específicas de la invención, la activación del transductor dispara, directa o indirectamente la activación de elementos de activación de transcripción, por ejemplo, un promotor, para efectuar la activación de un gen reportero u operón reportero. La transcripción y traducción del gen reportero u operón a su vez resulta en un producto gen o productos de gen que producen una señal detectable, tal como luz. Sin embargo, en modalidades alternas, la activación del transductor puede resultar directamente en una señal visible y medible . 4. Genes Reporteros y Operones Una amplia gama de genes reporteros u operones reporteros puede emplearse, incluyendo aquéllos que resultan de bioluminiscencia, reacciones colorimétricas o fluorescencias.

Por ejemplo, genes reporteros pueden codificar pigmentos (Bonhoeffer. 1995, Arzeimi ttel fors chung 45 : 351-356) tales como rodopsina bacterial (Ng y colaboradores, 1995, Biochemistry 34.: 879-890) , melanina (Vitkin y colaboradores, 1994, Photo chemistry and Photobiology 59:455-462) , aquirones (Molecular Probes, Seattle) , proteína fluorescente verde (GFP, Clonetech, Palo Alto; Chalfie y colaboradores, 1994, Science 263:802-805; Cubitt y colaboradores, 1995, TIBS 20:448-455), proteína fluorescente amarilla (Daubner y colaboradores, 1987, Proc . Na ti . Acad. Sci . U. S. A . , .34:8912-8916), flavinas, bioflavinoides, hemoglobina (Chance y colaboradores, 1995, Analytical Biochemistry 227:351-362; Shen y colaboradores, 1993, Proc . Nati . Acad. Sci . U. S. A . , 90:8108-8112), heme (Pieulle y colaboradores, 1996, Biochem . Biophys . Acta 1273 : 51-61), colorante índigo (Murdock y colaboradores, 1993, Biotechnology 11:381-386) . peridinina-clorofila proteína (PCP) (Ogata y colaboradores, 1994, FEBS Letters, 356.: 367-371) o piocianina (al-Shibib y Kandela, 1993, Acta Microbiologica Polonica 42.: 275-280) . En forma alterna, genes reporteros pueden codificar enzimas que pueden escindir un substrato absorbente de color tal como una ß-lactamasa, luminescente a proteínas fluorescentes, enzimas con substratos fluorescentes o cualquier otro gen que codifica un producto químico ópticamente activo o que puede convertir substrato a un compuesto ópticamente activo. En una modalidad alterna, genes reporteros pueden codificar fotoproteínas, en cada caso, el reportero se enlaza operativamente con un promotor inducible que se activa por la forma activa del componente transductor. En una modalidad específica de la invención, se emplean reporteros bioluminescentes . Genes y Operones Reporteros de Base Bioluminescente .

Varios tipos de genes reporteros bioluminescentes se conocen, incluyendo la familia luciferasa {por ejemplo, Wood y colaboradores, 1989, Science 244:700-702). Miembros de la familia luciferasa se han identificado en una variedad de organismos procarióticos y eucarióticos . La luciferasa y otras enzimas involucradas en los sistemas luminiscentes procarióticos { lux) , así como los genes de lux correspondientes, se han aislado de bacterias marinas en los géneros Vibrio y Photobacterium, y de bacterias terrestres en el género Xenorhabdus, también conocidos como fotoralodus . Un organismo eucariótico ejemplar que contiene un sistema luciferasa { luc) es la luciérnaga Norte Americana Photinus pyralis . La luciferasa de luciérnaga se ha estudiado extensamente y se emplea ampliamente en ensayos ATP. ADNcs que codifica luciferasas de Pyrophorus plagiophthalamus , escarabajo chasqueante, otras especies, se han clonado y expresado (Wood y colaboradores, 1989, Science 244 :700-702) . Este escarabajo es poco usual ya que diferentes miembros de la especie emiten bioluminescencia de diferentes colores. Cuatro clases _ de ciónos, que tienen 95-99% de homología entre sí se aislaron.

Emiten luz a 546 nm (verde) , 560 nm (amarillo-verde) , 578 nm (amarillo) y 593 nm (naranja) . Luciferasas requieren una fuente de energía, tal como ATP, NAD(P)H, y semejantes y un substrato tal como luciferina, decanal (enzimas bacterianas) o coelentrizina y oxígeno. El substrato luciferina debe suministrarse a la enzima luciferasa a fin de que luminezca. De esta manera, un método conveniente para proporcionar luciferina es expresar no solo la luciferasa sino también las enzimas de biosíntesis para la síntesis de decanal substrato. El oxígeno luego es el único requerimiento extrínseco para bioluminiscencia, en bacterias que expresan estas proteínas del operón Lux. Por ejemplo, el operón lux obtenido de la materia de suelo o -del terreno Xenorhabdus luminescence (Frackman y colaboradores, 1990, ". Bact . 1_72: 5767-5773) puede emplearse como operón reportero, ya que confiere al E. coli transformado la capacidad de emitir fotones a través de la expresión de dos subunidades de la luciferasa heterodimérica y tres proteínas accesorias (Frack y colaboradores, arriba) . La bioluminiscencia óptima para E. coli que expresa los genes lux de X luminescence, se observa a 37°C (Szittner y Meighen, 1990, J. Biol . Chem. 265:16581-16587; Xi y colaboradores, 1991, J. Bact . 173 : 1399-1405) , que contrasta el óptimo a baja temperatura de luciferasas de organismos luminiscente eucarióticos y otros procarióticos (Campbell, 1988, Chemiluminescence . Principies and Applications in Biology and Medicine (Ouimioluminescencia. Principio y Aplicaciones en Biología y Medicina) . (Chichester, Inglaterra: Ellis Horwood Ltd. y VCH Verlagsgesellschaft mbH) . De esta manera, el operón reportero puede elegirse de acuerdo con la naturaleza y los requerimientos de una aplicación específica. Por ejemplo, la luciferasa de X. luminescence , por lo tanto está bien adecuada para utilizar como un marcador para estudios en animales. Construcciones vectoriales de luciferasa pueden adaptarse para utilizar en transformar una variedad de células huésped, incluyendo la mayoría de las bacterias y muchas células eucarióticas. Además, ciertos virus tales como el virus del herpes y virus de vaccinia pueden someterse a ingeniería genética para expresar luciferasa. Por ejemplo, Kovacs y Mettenlieter, 1991, J. Gen . Virol . 72:2999-3008, ilustra la expresión estable de la luciferasa de luciérnaga que codifique gen en un virus de herpes. Brasier y Ron, 1992, Meth . in Enzymol . 216:386-396, ' ilustran el uso de construcciones de gen de luciferasa en células de mamífero. La expresión de luciferasa de células de mamífero en cultivos se ha estudiado utilizando formación de imagen CCD tanto macroscópicamente (Israel y Honigman, 1991, Gene 104 : 139-145) y microscópicamente (Hooper y colaboradores, 1990, J. Biolu . and Chemilum. 5:123-130). C. Formación de Imagen de Biodetectores Emisores de Luz Los biodetectores emisores de luz pueden formarse en imagen en una cantidad de formas. Líneas guía para esta formación de imagen así como ejemplos específicos, se describen a continuación. 1. Dispositivos Fotodetectores En una modalidad de la presente invención, en donde la señal generada por el biodetector es luz, un aspecto importante será la selección de un dispositivo fotodetector con una sensibilidad suficientemente elevada para permitir la formación de imagen de tenue luz. Además en casos en donde el biodetector se emplea en un sujeto vivo, la formación de imagen tiene que ser en una cantidad razonable de tiempo, de preferencia inferior a aproximadamente treinta (30) minutos, y para utilizar la señal de este dispositivo para construir una imagen . En casos en donde es posible el utilizar porciones generadoras de luz que son extremadamente brillantes y/o para detectar conjugados emisores de luz localizados cerca de la superficie del sujeto o animal que se forma a la imagen, un par de lentes de "visión nocturna" o una cámara de video de alta sensibilidad standard, tal como una cámara con Tubo Intensificado de Silicio (SIT - Silicon Intensified Tube) (por ejemplo Hamamatsu Photonic Systems, Bridgewater, NJ) , pueden emplearse. Más típicamente, sin embargo, se requiere un método más sensible de detección de luz . A niveles de luz extremadamente bajos, tales como aquéllos que se encuentran en la práctica de la presente invención, el flujo de fotones por área unitaria se vuelve tan bajo que la escena que se forma en imagen ya no aparece más continua. Por el contrario, se representa por fotones individuales que tanto son temporal como espacialmente distintos entre sí. Vista en un monitor, esta imagen parece como puntos de destelleo de luz, cada uno que representa un solo fotón detectado. Al acumular estos fotones detectados en un procesador de imagen digital con el tiempo, puede adquirirse y construirse una imagen. En forma alterna, los puntos de destelleo pueden ser enumerados y reportados numéricamente evitando la etapa de reconstrucción de imagen, lo que acelera de esta manera el análisis. En contraste con cámaras convencionales en donde la señal en cada punto de imagen se le asigna un valor de intensidad, en formación de imagen por conteo de fotones la amplitud de la señal no transporta significado. El objetivo simplemente es detectar la presencia de una señal (fotón) y contar la ocurrencia a la señal con respecto a su posición con el tiempo. Al menos dos tipos de dispositivos fotodetectores descritos a continuación pueden detectar fotones individuales y generar una señal que pueda analizarse por un procesador de formación de imagen. Dispositivos para Fotodetección con Interferencia Reducida . La primer clase constituye dispositivos que logran sensibilidad al reducir la interferencia de fondo en el detector de fotones, en oposición a amplificar la señal de fotones. La interferencia se reduce primordialmente al enfriar la estructura detectora. Los dispositivos incluyen cámaras con dispositivo acoplado de carga (CCD = charge coupled device) que se refieren como cámaras CCD enfriadas "con respaldo adelgazado") . En los instrumentos más sensibles, el enfriamiento se logra utilizando por ejemplo nitrógeno líquido, que lleva la temperatura de la estructura CCD a aproximadamente -120°C. El "respaldo adelgazado" se refiere a una placa posterior ultra-delgada que reduce la longitud de trayectoria que un fotón sigue para detectarse, incrementando de esta manera la eficiencia cuántica. Una cámara CCD criogénica de respaldo adelgazado sensible particularmente es la "TECH 512", una cámara serie 200 disponible de Photometrics, Ltd. (Tucson, AZ) . Disposi tivos de Amplificación de Fotones . Una segunda clase de fotodetectores sensibles incluye dispositivos que amplifican fotones antes de que incidan en la pantalla de detección. Esta clase incluye cámaras CCD con intensificadores, tales como intensificadores de microcanales. Un intensificador de microcanal típicamente contiene una estructura de metal de canales perpendiculares a y co-extensivas con la pantalla de detección de la cámara. La estructura de microcanales se coloca entre la muestra, sujeto o animal que se forma en imagen, y la cámara. La mayoría de los fotones que entran a los canales de la estructura contactan un lado de un canal antes de salir. Un voltaje aplicado a través de la estructura resulta en la liberación de muchos electrones de cada colisión de fotón. Los electrones de esta colisión salen de su canal de origen en un patrón de "escopeta", y se detectan por la cámara. Incluso mayor sensibilidad puede lograrse al colocar estructuras de microcanales intensificantes en serie, de manera tal que los electrones generados en la primer etapa a su vez resultan en una señal amplificada de electrones en la segunda etapa. Incrementos en sensibilidad sin embargo, se logran a costo de resolución espacial, que disminuye con cada etapa adicional de amplificación. Un dispositivo para detección de fotones sencillo basados en intensificador de microcanales ejemplar adecuado para la práctica de la invención es la serie C2400 disponible de Hamamatsu. Procesadores de imagen . Señales generadas por los dispositivos fotodetectores que cuentan fotones requeridos para procesarse por un procesador de imagen a fin de construir una imagen que puede por ejemplo exhibirse en un monitor o imprimirse en una impresora de video. Estos procesadores de imagen típicamente se venden como parte de sistemas que incluyen las cámaras de conteo de fotones sensibles descritas anteriormente y de acuerdo con esto, están disponibles de las mismas fuentes {por ejemplo, Photometrics, Ltd. , y Hamamatsu) .

Procesadores de imágenes de otros distribuidores también pueden emplearse, pero en general se requiere más esfuerzo para lograr un sistema funcional . Los procesadores de imagen usualmente se conectan a una computadora personal, tal como una PC compatible con IBM, o una Apple Macintosh (Apple Computer, Cupertino, CA.), que puede o no estar incluida como parte del sistema de formación de imagen adquirido. Una vez que las imágenes están en la forma de archivos digitales, pueden manipularse por una variedad de programas de procesamiento de imagen (tales como "ADOBE PHOTOSHOP", Adobe Systems, Adobe Systems, Mountain View, CA. ) e imprimirse. 2. Construir una Imagen de Emisión de Fotones 5 En casos en donde, debido a una porción generadora de luz excepcionalmente brillante y/o localización de conjugados emisores de luz cerca de la superficie del sujeto, un par de lentes de "visión nocturna" o una cámara de video de alta sensibilidad se emplea para obtener una imagen, la imagen simplemente se ve o exhibe en un monitor de video. Si se desea, la señal de una cámara de video puede desviarse a través de un proceso de imagen, que puede almacenar cuadros de video individuales en memoria para análisis o impresión, y/o puede digitalizar las imágenes para análisis e impresión en una computadora. En forma alterna, si se emplea un enfoque de conteo de fotones, la medición de la emisión de fotones genera una • estructura de números, que representan el número de fotones detectados en cada ubicación de pixel, en el procesador de imagen. Estos números se emplean para generar una imagen, típicamente al normalizar las cuentas de fotones (ya sea a un valor preseleccionado fijo, o al número máximo detectado en cualquier pixel) y convertir el número normalizado a brillantez (escala de grises) o color (pseudocolor) que se exhibe en un monitor. En una representación de pseudocolor, estructuras de color típicas son como sigue. Pixeles con cuentas de fotones cero se les asigna negro, bajas cuentas se les asigna azul e incrementadas cuentas colores de longitud de onda incrementada, hasta rojo para los valores de cuenta de fotones más altos. La ubicación de colores en el monitor representa la distribución de emisión de fotones, y de acuerdo con esto la ubicación de conjugados emisores de luz. A fin de proporcionar un marco de referencia para los conjugados, una imagen en escala de grises del sujeto (aún inmovilizado) del cual se mide emisión de fotones, se construye típicamente. Esta imagen puede construirse por ejemplo al abrir una puerta a la cámara de formación de imagen o caja, en tenue iluminación de habitación y medir los fotones reflejados (típicamente por una fracción del tiempo que tarda en medir la emisión de fotones) . La imagen en la escala de grises puede construirse ya sea antes de medir emisión de fotones o después. La imagen de emisión de fotones típicamente se superpone a la imagen de escala de grises para producir una imagen compuesta de emisión de fotones en relación al sujeto. Si se desea seguir la ubicación y/o la señal de un conjugado de emisión de luz con el tiempo, por ejemplo para registrar los efectos de un tratamiento en la distribución y/o localización de una porción biocompatible selecta, la medición de emisión de fotones o formación de imagen puede repetirse a intervalos de tiempo selectos para construir una serie de imágenes . Los intervalos pueden ser tan cortos como picosegundos (en cámaras de compuerta rápida) o segundos, hasta días o semanas con cámaras de integración. D. Aplicaciones Aplicaciones específicas de los biodetectores incluyen el diagnóstico de enfermedades, detección de substancias clínicamente relevantes, detección de contaminantes ambientales, detección de contaminantes de alimentos. Además, los biodetectores de la invención encontrarán numerosas aplicaciones en investigación y desarrollo básico. Diagnósticos de Enfermedades Infecciosas . Los biodetectores pueden emplearse para detección de antígenos en fluidos corporales, incluyendo sangre u orina, o tejidos y otros fluidos. Antígenos objetivo convenientes incluyen aunque no están limitados, a patógenos bacterianos, patógenos virales, patógenos fúngales, proteínas de suero, linfocinas, citocinas, citotoxinas, interferonas , ß-2 microglobul ina , inmunoglobulinas, péptidos y polipéptidos. Pruebas de diagnóstico específicas dirigidas a patógenos bacterianos pueden incluir pero no están limitadas a diagnóstico de enfermedad de lyme, Streptococcus , Salmonella, Tuberculosis , Staphylococcus , Pseudomonas, Helicobactor, histeria, Shigella, Proteus, Enterococci , Clos tridium, Borda tella, Bartonella, Rickettsia, Chlamydia, Spirochotes .

Pruebas de diagnósticos dirigidas patógenos virales pueden incluir aunque no están limitadas a la detección de retrovirus, tales como HIV-1, HTLV-1, virus de hepatitis, (HBV, HCV, HAV) , virus de herpes, incluyendo EBV, CMV, herpes simplex I, herpes simplex II y HHV-6, encefalitis, incluyendo virus de encefalitis, Virus de Encefalitis Occidental y Oriental, rotavirus, todos conocidos y aún para identificar patógenos virales, humanos y animales y agentes no convencionales tales como ' aquéllos asociados con enfermedad de Alzheimer y Crutzfeld-Jacob (priones) . Dirigir a patógenos fúngales puede incluir, aunque no está limitado a criptococcus, histoplasmosis, coccidiodos, candida, giardia. Detección De Otras Substancias Clínicamente Relevantes . Aplicaciones de los biodetectores pueden incluir una detección de substancias clínicamente relevantes, tales como moléculas de azúcar, ácidos grasos, proteínas o microorganismos, en fluidos corporales, por ejemplo, sangre u orina, o tejido. Antígenos dirigidos pueden incluir enzimas que indican la función adecuada de los órganos, incluyendo lactato dehidrogenasa, urea, glucosa y otras pequeñas moléculas y citocinas. Proteína alfa- fetal puede ser dirigida para el diagnóstico de espinobfida. Ciertas especies bacteriales u otros microorganismos pueden ser dirigidos para medir su representación en poblaciones mixtas tales como flora vaginal e intestinal. Un objetivo de diagnóstico importante serán linfocinas para el diagnóstico y prognosis de una gama de enfermedades. Con los actuales métodos, el perfil de linfocinas no puede determinarse fácilmente, sin embargo puede esperarse que su determinación elucidará un amplio conjunto de aspectos desconocidos respecto a la relación de enfermedades y estados de enfermedad. Además, una aplicación médica importante será el diagnóstico perinatal temprano de enfermedades genéticas, incluyendo fibrosis cística, anemia de células falciformes, síndrome de Down, fenilcetonuria, deficiencia ADA, talasemias, deficiencia de hormona de crecimiento, predisposición de cáncer. Finalmente, los biodetectores pueden encontrar aplicación en la verificación en tiempo real, por ejemplo de niveles de glucosa y niveles de droga. Aplicaciones Agrícolas y Veterinarias . Todas las aplicaciones médicas anteriormente descritas pueden efectuarse en medicina veterinaria. Detección de Contaminantes Ambientales . Por ejemplo, pueden emplearse los biodetectores para contaminantes en suministro de agua. Objetivos selectos pueden incluir, aunque no están limitados a Giardia, Cryptococcus , Legionella, toxinas, Clostridia, Enterobacter , E. coli , protozoarios, metales pesados. Adicionalmente, representación de ciertas bacterias en poblaciones de terreno puede medirse mediante biodetectores: el terreno puede clasificarse para dar seguimiento a organismos de ingeniería genética que puedan haberse liberado en el ambiente. Detección de Contaminantes en Alimentos . Los biodetectores pueden emplearse para identificar contaminantes en alimentos, incluyendo aunque no están limitados a bacterias, tales como salmonella, coliforms , staphylococcus , clostridium, y hongos . Investigaciones y Desarrollo Básico . Los biodetectores encontrarán numerosas aplicaciones en investigación de desarrollo básico. Ejemplos incluyen sistema de detección en inmunoensayo standard, tales como Manchado Western, ELISA, la determinación de perfiles de linfocina, la detección de contaminación de cultivo celular, incluyendo Mycoplasma . Además, los biodetectores serán útiles como sistemas de detección en ensayos de expresión, para la detección de marcadores de superficie celular, tales como CD4 , CD8 , adhereinas. Biodetectores Abióticos . Para ciertas aplicaciones, cuando la antigenicidad es un aspecto (es decir in vivo) pueden ser convenientes biodetectores abióticos. Ejemplos incluyen la detección y localización ip vivo de infección, daño al tejido y otras patologías. La encapsulación del mecanismo biodetector en membranas o bicapas de vesículas generalmente inertes o cualquier otra entidad que no sea viva y conserve el metabolismo vectorial (tales como liposomas) de manera tal que contacten con ligandos, resulta en que la luz permite el uso de este sistema in vivo . Los ejemplos a continuación explican la invención con más detalle. Las siguientes preparaciones y ejemplos se dan para permitir a aquéllos con destreza en la especialidad el comprender más claramente y practicar la presente invención. La presente invención sin embargo no se limita en alcance por las modalidades ejemplificadas, que se pretenden como ilustraciones de aspectos simples de la invención solamente, y métodos que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Sin duda, diversas modificaciones de la invención además de aquéllas descritas aquí serán aparentes para aquéllos con destreza en la especialidad a partir de la descripción anterior y los dibujos acompañantes. Dichas modificaciones se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. VII . EJEMPLOS Los primeros ejemplos son tres enfoques que pueden/ emplearse para ligar la transducción de señal a la expresión de un gen específico. A. Ejemplo 1: Enlazando Transducción de Señal con la Regulación de un Gen Específico (Enfogue 1) El siguiente ejemplo ilustra un enfoque que puede emplearse para enlazar la transducción de señal a regulación de un gen específico. Un transposón, se construye para identificar promotores que se activan por unión de ligando a moléculas de unión de ligando expresadas en superficie, por ejemplo anticuerpos. Sistemas reporteros sin promotores se han empleado para identificar una variedad de secuencias regulatorias en bacterias. Ronald y colaboradores, 1990, Gene 90.: 145-148. El transposón consiste de (i) (1) un operón sin promotor que contiene los genes para bioluminescencia (2) un marcador seleccionable (gen resistente a canamicina; Kan) y (3) un regulador negativo (el represor lambda) ; (ii) un marcador seleccionable adicional (gen de resistencia a cloranfenicol; Chl) expresado por el operador lambda; y (iii) un tercer marcador seleccionable que se expresa constitutivamente (gen de resistencia a ampicilina; Amp) . Células bacterianas que expresan el anticuerpo de interés se transforman con el transposón. El cambio de conformación en la proteína de fusión-anticuerpo transmembrana señala la activación o modificación química del transductor que se diseña para retransmitir ese mensaje a la región de promotor de la construcción de lux. Transformantes positivos se eligen por la determinación de la resistencia Amp adquirida. Células que contienen el transposón transpromotores que son activos en la presencia de antígeno (incluyendo expresión constitutiva) será la resistencia Kan en la presencia de antígeno, y células que contienen un transposón transpromotores que están apagados en la ausencia de antígeno serán resistentes a Chl en la ausencia de antígeno. Por lo tanto, al pasar a través de una serie de condiciones de crecimiento, los transformantes deseados que expresan apropiadamente luciferasa en respuesta a antígenos, se identificarán. Los promotores luego pueden caracterizarse y emplearse para construir biodetectores adicionales. La FIGURA 4 ilustra un biodetector generado como se describe en el Ejemplo 1. Como se ilustra en la FIGURA 4A, en la ausencia de un antígeno, la proteína de fusión no transduce una señal al promotor que dirige expresión de los genes clonados codificados por el transposón integrado. Por lo tanto, el fenotipo del E. coli propuesto, en la ausencia de antígeno es resistente a ampicilina, resistente a cloranfenicol , sensible a canamicina y no bioluminescente . La resistencia a ampicilina se expresa de forma constitutiva para mantener la selección del transposón integrado. Cuando sin embargo el promotor se activa al ligar el transductor activado, que se activa por unión de ligando a la proteína de fusión, el operón luciferasa, el gen de resistencia a canamicina y el represor lambda, se expresan. El represor lambda actúa en el operador lambda, apagando de esta manera la expresión del gen de resistencia a cloranfenicol . En la presencia de antígeno, el fenotipo de las células por lo tanto se caracteriza por resistencia a ampicilina, resistencia a canamicina, sensibilidad a cloranfenicol y bioluminescencia. De esta manera, inducción y activación de genes, como se describe anteriormente, permite selección positiva para la respuesta deseada al antígeno. Más específicamente, solo aquéllas células bacteriales que integran el transposón descrito a un sitio conveniente en el genoma, sobreviven el proceso de selección mientras que las bacterias que no responden se mueren. ' B. Ejemplo 2: Enlazando Traducción de Señal a la Regulación de un Gen Específico (Enfogue 2) El siguiente ejemplo ilustra un segundo enfoque que puede emplearse para enlazar la transducción de señal a regulación de un gen específico. La proteína de fusión compuesta de una cadena pesada anticuerpo y una proteína de superficie conocida que transduce señales para regulación de gen, y un promotor que se afecta por esta señal, se coloca frente al gen marcador. Cadenas de anticuerpos a luz se co-expresan en el biodetector para proporcionar en especificidad de ligando adicional (Borrebaeck y colaboradores, 1992, Biotechnology 10: 697-698) . Fosfatasa bacteriana se ha seleccionado como la transmembrana inicial y el componente de transducción de señal de la fusión de gen debido a su uso corriente para identificar proteínas de fusión expresadas en superficie en bacterias (Kohl y colaboradores, 1990, Nucleic Acids Res . 18:1069; Weiss y Orfanodakis, 1994; J.

Biotechnol . 3_3:43-53) y un substrato colorimétrico está disponible para medir la actividad de fosfatasa. Fusiones de fosfatasa- fragmento anticuerpo se han generado con retención , tanto de especificidad de unión de ligando como actividad de fosfatasa ( (Kohl y colaboradores, 1991, Acad. Sci . 646.: 106-114 ; Wels y colaboradores, 1992, Biotechnology 10 : 1128-1132) . Fusiones de anticuerpo-fosfatasa se han empleado para generar anticuerpos etiquetados para inmuno-ensayo (Carrier y colaboradores, 1995, J. Immunol . Methods 181 : 177-186 ; Ducancel y colaboradores, 1993, Biotechnology 1_L: 601-605 ; Weiss y colaboradores, 1994, J". Biotechnol . 3_3:43-53; Weiss y Orfanodakis; 1994, J". Biotechnol 31:43-53; Wels y colaboradores, 1992, Biotechnology 10.: 1128-1132) . Además, anticuerpos a fosfatasa bacterial modificada se han mostrado que alteran la función fosfatasa (Brennan y colaboradores, 1995, Proc . Nati . Acad. Sci . U. S. A . 92:5783-5787), indicando que las interacciones de proteína-proteína pueden modular la actividad fosfatasa más probablemente a través de cambios en conformación en la molécula fosfatasa. Expresión de las proteínas de fusión fosfatasa en superficies celulares bacterianas transducen una señal, fosforilación en la célula que induce expresión de genes específicos. Este sistema puede modificarse para enlazar apretadamente la expresión de las proteínas marcadoras, luciferasa y sus proteínas accesorias para unir el ligando con la proteína de fusión fosfatasa-anticuerpo, es decir un conmutador molecular dependiente de ligando. C. Ejemplo 3: Transducción de Señal de Enlace con la Regulación de un Gen Específico (Enfogue 3) El siguiente ejemplo ilustra en un tercer enfoque que puede emplearse para enlazar la transducción de señal a regulación de un gen específico. Los enfoques descritos en los EJEMPLOS 1 y 2 pueden combinarse utilizando el transposón descrito anteriormente en células que expresan las funciones de anticuerpo-fosfatasa. Una cepa bacterial se establece que tiene un gen reportero enlazado a un promotor inducible que responde específicamente a la activación de una molécula transductora por ejemplo a aquélla del operón pho. Una biblioteca de repertorio anticuerpo clonada en un vector que fusionará de anticuerpo a una proteína de membrana pho, luego puede ponerse en la cepa bacteriana anterior. Esta biblioteca de biodetectores luego puede probarse contra moléculas específicas que son de interés para detectar y selección del biodetector apropiado puede hacerse. Este biodetector resultante luego puede propagarse en grandes cantidades. D. Ejemplo 4: Detección de Substancias en Solución Lo siguiente es un ensayo ilustrativo para detectar ligandos incluyendo antígenos virales y bacterianos en soluciones y bacterianos en soluciones tales como sangre íntegra y plasma. Muestras que contienen el ligando a detectar y cuantificar se diluyen (diluciones en serie dobles) en placas de 96 pozos junto con normas de referencia. El biodetector específico se agrega a cada uno de los pozos como una celda activa viable, y analizará inmediatamente. Señales bioluminescentes de la placa se detectan utilizando un dispositivo acoplado de carga (cámara CCD) o un luminómetro en un formato de 96 pozos. Bioluminescencia relativa de las muestras desconocidas se traza en una curva standard para cuantificación . E. Ejemplo 5: Detección de Substancias en Soporte Sólido Lo siguiente es un ensayo ilustrativo para detectar substancias en soportes sólidos tales como microcelulosa o membranas nylon, por ejemplo en análisis de manchado Western, utilizando biodetectores específicos.

Después de transferencia de las proteínas a un soporte sólido (PVDF Immobilon membrane, Millipore) utilizando procedimientos estandarizados, la membrana se seca y transfiere a un plato que contiene el biodetector específico, con una celda activa biológica, en medio mínimo u otro amortiguador claro que contiene nutrientes para metabolismo bacteriano. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, la membrana se retira, sella mientras que aún está húmeda, en bolsa de platico termosellable o cierre de apriete (zip lock) . La señal bioluminescente de los biodetectores ligada a la membrana se detecta utilizando una película de rayos-X, un detector CCD, u otros métodos de detección sensibles a luz. Las señales pueden cuantificarse utilizando soporte lógico para análisis de imagen standard. F. Ejemplo 6: Efecto de Sangre Humana en Emisión de Luz de Salmonella Bioluminiscente Como se demuestra en el siguiente ejemplo, menos de diez (10) células bacterianas pueden detectarse con un detector CCD intensificado. Diluciones en serie dobles de Salmonella, cepa LB5000, que se han transformado con un plásmido que confiere expresión constitutiva del operón luciferasa se revistieron en duplicado en placas de 96 pozos. Las diluciones se hicieron en 30 µm de medio de crecimiento solo (indicado como LB5000) y con µm de sangre para determinar los efectos de sangre como un medio de dispersión y absorción en los límites de detección.

Cada dilución y los números de unidades formadoras de colonia (CFU = colony forming units) implicados en revestir las muestras de pozos concentrados, se indican en la FIGURA 5. La bioluminescencia relativa por cada pozo como se determina por análisis de la imagen generada por el detector CCD, se ilustra (FIGURA 5) . La señal en los pozos más concentrados estaba fuera de escala y los números por lo tanto no son lineales a superiores concentraciones. Todas las referencias se incorporan aquí completamente .

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. Un biodetector para una substancia selecta, caracterizado porque comprende: (a) un elemento de conversión de señal, que comprende una porción específica de ligando extracelular y un dominio de transformador de señal intracelular,' en donde la porción específica del ligando extracelular reconoce selectivamente la substancia selecta, este reconocimiento activa el dominio de transformación de señal intracelular; (b) un transductor, en donde el transductor tiene una forma inactiva y una activa, que son distintas entre sí, y en donde el dominio de transformación de señal intracelular activado convierte la forma inactiva del transductor en la forma activa del transductor; y (c) un elemento de respuesta, en donde el elemento de respuesta se activa por la forma activa del transductor, resultando en una señal detectable.
2. 2. El biodetector de la reivindicación 1, caracterizado porque el elemento de respuesta comprende un elemento de activación de transcripción que se enciende por la forma activa del transductor.
3. 3. El biodetector de la reivindicación 2, caracterizado porque el elemento de respuesta además comprende un ácido ' nucleico que codifica uno o una pluralidad de productos de gen, este producto de gen o productos de gen dan lugar a la señal detectable, y en donde el ácido nucleico se enlaza operativamente con el elemento de activación de transcripción .
4. 4. El biodetector de la reivindicación 3, caracterizado porque la señal detectable es luz .
5. 5. El biodetector de la reivindicación 3, caracterizado porque el producto de gen es detectable por medios seleccionados del grupo que consiste de bioluminiscencia, reacciones colorimétricas o fluorescencia.
6. 6. El biodetector de la reivindicación 3, caracterizado porque el ácido nucleico comprende un operón de luciferasa.
7. 7. El biodetector de la reivindicación 6, caracterizado porque el elemento de transformación de señal intracelular es un transductor de señal de membrana.
8. 8. El biodetector de la reivindicación 7, caracterizado porque el transductor de señal de membrana se elige del grupo que consiste de sistemas regulatorios de dos componentes bacterianos, transductores de señal mediados por receptor eucariótico, transductores de señal mediados por receptor procariótico .
9. 9. El biodetector de la reivindicación 6, caracterizado porque la substancia se elige del grupo que consiste de microorganismo, virus, retrovirus, proteína, azúcar, ion.
10. 10. Un método para detección de una substancia seleccionada, caracterizado porque comprende: (a) generar un biodetector que comprende: (i) un elemento de conversión de señal, que comprende una porción específica de ligando extracelular y un dominio de transformación de señal intracelular, en donde la porción especifica de ligando extracelular reconoce selectivamente la substancia selecta, este reconocimiento activa el dominio de transformación de señal intracelular; (ii) un transductor, en donde el transductor tiene una forma inactiva y una activa que son distintas, en donde la forma inactiva se convierte a la forma activa por el dominio de transformación de señal intracelular activado; y (iii) un elemento de respuesta, en donde el elemento de respuesta se acciona por la forma activa del transductor, resultan en una señal detectable; (b) agregar el biodetector a una muestra; (c) medir y cuantificar la señal detectable; y (d) correlacionar los niveles de la señal detectable con la presencia y cantidad de la substancia.
11. 11. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque el elemento de respuesta del biodetector comprende un elemento de activación de transcripción que se enciende por la forma activa del transductor.
12. 12. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque el elemento de respuesta además comprende un ácido nucleico que codifica uno o una pluralidad de productos de gen, este producto o productos de gen dan lugar a la señal detectable y en donde el ácido nucleico se enlaza operativamente con el elemento de activación de transcripción.
13. 13. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque la señal detectable es luz .
14. 14. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el producto de gen es detectable por medios seleccionados del grupo que consiste de bioluminiscencia, reacciones colorimétricas o fluorescencia.
15. 15. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el ácido nucleico comprende un operón luciferasa.
16. 16. El biodetector de la reivindicación 10, caracterizado en donde la substancia se elige del grupo que consiste de microorganismos, virus, retrovirus, proteína, azúcar, ion.
17. 17. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque la señal detectable se detecta por un sistema de detección de luz .
18. 18. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque el sistema de detección de luz se elige del grupo que consiste de luminómetro, espectrofotómetro, fluorímetro, detector CCD.
19. 19. El método de la reivindicación 18, caracterizado porque el biodetector o la muestra se fija en un soporte sólido.
20. 20. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque además incluye fijar una serie de biodetectores en una estructura ordenada en un soporte sólido de manera tal que una variedad de substancias comprendidas en una muestra, puedan ser detectadas .