MXPA98008195A - Tratamiento de una hemoglobinopatia - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para tratar un paciente identificado como teniendo una hemoglobinopatía que se caracteriza por una reducida afinidad de la hemoglobina por el oxígeno. Los métodos implican proveeróxido nítrico y/o monóxido de carbono gaseosos para (I) inhalación por el paciente o (II) tratamiento ex vivo de los eritrocitos del paciente, de manera alternativa, puede administrarse al paciente un compuesto que liberaóxido nítrico.

Description

TRATAMIENTO DE UNA HE OG OBINOPATIA Declaración Relativa a Investigación Patrocinada Federalmente Esta invención fue realizada al menos en parte con fondos del gobierno federal de los Estados Unidos, bajo la asignación USPHS NHLBI-HL 42397, otorgada por el Instituto Nacional de Salud. El gobierno por tanto tiene ciertos derechos en la invención. Antecedentes de la Invención El campo de la invención es el de las hemoglobinopa-tias . Varias hemoglobinopatias están asociadas con una afinidad reducida de la hemoglobina (Hb) por el oxígeno. Ejemplos de tales hemoglobinopatias incluyen la enfermedad de las células f~alciforr-.es (SCD) y los rasgos de células falciformes; las talasemias; los desórdenes Hb-C, Hb-D, Hb-E, Hb-H, Hb-I, Hb-O-Arab, y Hb-Kansas; y las combinaciones heterocigóticas mixtas de cualesquiera de éstas. Quizá la hemoglobinopatia mas extensamente estudiada es la enfermedad de las células falciformes (SCD) , la cual es resultado de una mutación en el sexto aminoácido a partir del término N de la cadena de ß-polipéptidos de hemoglobina (Hb-S) . La mutación reemplaza el glutamato de aminoácido cargado negativamente (codificado por GAG) con una valina neutra, de residuo hidrófobo (codificada por GUG) . A concentraciones fisiológicamente relevantes (por ejemplo, alrededor de 0.2 g/cm3), y bajo ciertas condiciones tales como hipoxia, las moléculas de Hb-S se agregan en polímeros de filamentos múltiples, formando un gel viscoso o similar a sólido. Esta polimerización de Hb-S dentro de los glóbulos rojos (eritrocitos) distorsiona los eritrocitos en una variedad de formas anormales, algunas de las cuales se asemejan a células falciformes. La polimerización de Hb-S también ocasiona que los eritrocitos se tornen mas rígidos, reduciendo la capacidad de las células a atravesar los vasos angostos de la microvasculatura . Los individuos portadores de un gene que codifica hemoglobina adulta normal (Hb-A) y uno que codifica Hb-S se dice que tienen los rasgos de células falciformes. Tales heterocigotos rara vez sufren de síntomas clínicos, pero por supuesto pueden pasar el gene mutante a su descendencia. Los individuos que son homocigóticos para Hb-S o una combinación de Hb-S y Hb-C se dice que tienen la enfermedad de las células falciformes (SCD); estos individuos son referidos en la presente como "SS". Los adultos cuyos RBCs contienen hemoglobina normal son referidos en la presente como "AA" . Clínicamente, se asocia SCD con hemolisis crónica, que puede llevar a anemia e ictericia. También se asocia SCD con crisis episódicas agudas vaso-oclusivas, conocidas como crisis falciformes. Durante tal crisis, la microvasculatura puede tornarse ocluida de manera transiente o permanente, y casi cada órgano del cuerpo puede ser dañado como resultado del disminuido suministro de oxigeno. Tal daño a órganos es la causa mayor de mortalidad y morbidez asociadas con SCD. Es particularmente común infarto (es decir, necrosis de tejido debido a un insufi-ciente suministro de sangre) de hueso, bazo, riñon y pulmones, y da como resultado dolor agudo que puede durar por varios días. Los métodos convencionales para tratar hemaglobinopa-tías tales como SCD incluyen llevar a cabo transfusiones sanguíneas en pacientes anémicos para producir un nivel de hemoglobina de 10 g/dl y/o lograr una concentración total de hematocritos del 30%. Otros métodos implican usar hidroxiurea para reducir la formación de eritrocitos falciformes incrementando el nivel de la hemoglobina fetal (Hb-F) en eritrocitos (Charache y colaboradores, 1995, N. Eng. J. Med. 332:1317-1322; Goldberg y colaborado-res, 1990, N. Eng. J. Med. 323:366-372). Usando este método, se necesitan varias semanas de tratamiento para incrementar el nivel de Hb-F; por tanto, este método no es particularmente útil para responder a una crisis de células falciformes. Métodos adicionales de tratamiento incluyen proveer terapias de soporte, tales como terapia de oxígeno, analgésicos, e hidratación. Tal terapia de soporte es provista al paciente hasta que se resuelve la crisis, lo que habitualmente toma varios días. Para cualquier hemoglobinopatía dada, la afinidad de la hemoglobina del paciente por el oxígeno puede medirse generando una curva de disociación de oxihe oglobina (ODC) característica de la hemoglobina total del paciente. Esta curva matemática puede ser generada graficando la saturación porcentual de oxigeno (Sa02) de la hemoglobina total en el eje de las y versus la presión parcial de oxigeno (Pa02) en mm de Hg en un amplio rango de presiones de oxígeno (por ejemplo, 0 a 100 mm de Hg) en el eje de las x (ver, por ejemplo, Bunn y Forget, Hemoslobin: Molecular Genßtics and Clinical Aspects. 1986, .B. Saunder, editor) . La Pa02 a la cual ocurre semi-máxima saturación de oxígeno de la hemoglobina total es llamada el valor P50. La hemoglobina que tiene una capacidad reducida de ligar oxígeno está caracterizada por un desplazamiento a la derecha en la ODC, con relación a la ODC obtenida con hemoglobina de adulto normal (Hb-A) ; esto puede ser expresado alternativamente como un incremento en P50, en comparación con Hb-A. La hemoglobina normal a 37°, PaC02, 40 mm de Hg, pH 7.40, y condiciones isotónicas, tiene P50 de aproximadamente 26 mm de Hg, mientras que Hb-S tiene P50 de aproximadamente 37 mm de Hg . El valor P50 de un paciente dado puede ser medido fácilmente mediante equipo comercialmente asequible, tal como el analizador de disociación de oxígeno en sangre automático Heraox-Analyzer (TCS Medical Products Company, Huntingdon Valley, Pennsylvania, Estados Unidos) . Compendio de la Invención Se ha encontrado ahora que pueden usarse óxido nítrico (NO) y/o monóxido de carbono (CO) , o un compuesto que libera NO, a niveles no tóxicos, para tratar aun paciente identificado por tener cualquiera de una clase particular de hemoglobinopatias. Estas hemoglobinopatias, que incluyen no solamente SCD y rasgos de células falciformes, sino también desórdenes de Hb-C, Hb-D, Hb-E, Hb-H, Hb-I y Hb-Kansas, y combinaciones de éstos u otros mutantes de ß-globina (por ejemplo, las ß-talasemias) con Hb-S, están caracterizadas por una reducida afinidad de la hemoglobina del paciente por el oxígeno, en comparación con la afinidad por el oxígeno exhibida por la hemoglobina de adulto normal (Hb-A) . El método implica proveer un gas terapéutico para inhalación por el paciente, donde el gas terapéutico incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de NO gaseoso. En una variación de este método, el paciente es tratado con un gas terapéutico que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de CO gaseoso, o una combinación de NO y CO. El tratamiento de la invención incrementa la afinidad de la hemoglobina del paciente por oxígeno, haciendo que funcione mas como Hb-A. Esto puede ser cuantificado, si se desea, midiendo P50 o la ODC de la hemoglobina del paciente (ya sea como hemoglobina libre de células o en eritrocitos intactos) tanto antes como después de que se administra el tratamiento. Si la hemoglobinopatia del paciente es SCD, los métodos de la invención tienen el beneficio considerable adicional de reducir la tendencia a polimerizar de la Hb-S del paciente, y por tanto la factibilidad de que los eritrocitos del paciente se tornen falciformes. Sin quedar limitados por ninguna teoría en particular, se observa que un mecanismo posible median-te el cual puede funcionar la terapia con NO puede ser porque afecta las membranas RBC o los canales de membrana. De preferencia, el gas terapéutico es provisto en ausencia de humo de tabaco e incluye NO a una concentración de al menos 1 parte por millón (ppm) en un gas inerte tal como nitrógeno (N2) o helio (He) , en aire, en aire complementado con oxígeno adicional (02) , o en otro gas que contiene 02 (por ejemplo, una mezcla 02/N2 que contiene de 20 hasta alrededor de 99% de oxígeno) . La concentración de NO o CO en el gas terapéutico en general se esperaría ser de al menos 10 ppm, y de preferencia al menos 20 o 40 ppm. Dependiendo de la longitud del tiempo que se inhale el gas en una sesión de tratamiento dada, concentraciones útiles de NO o CO variarían de 1 a 10,000 ppm (por ejemplo, 20 a 4,000 ppm o 40 a 2,000 ppm) . Se espera que un paciente pueda recibir un beneficio terapéutico de inhalar continua o intermitentemente 20, 40, 80, 100, 160 o 200 ppm de NO o CO por períodos de tiempo largos. Donde se usa CO, la dosis debe ser controlada de modo que en general la carboxi-Hb del paciente no exceda de 20% de la Hb total. De manera alternativa, el NO o CO puede ser provisto a una concentración relativamente elevada, tal como 300, 400, 500, 1,000, 1,500 o incluso 2,000 ppm, particularmente, donde el paciente inhala el gas terapéutico por solamente un breve período de tiempo antes de regresar a aire u oxígeno. Cuando el gas terapéutico incluye CO, un valor de referencia útil sería usar una concentración de CO que produzca 2 a 10% de carboxi-Hb en la sangre del paciente, medida por medios convencionales. El gas terapéutico provisto para inhalación de preferencia también incluiría oxígeno (por ejemplo, aproximadamente 20% de oxígeno, tal como en aire, y hasta cerca de 100% de oxígeno) . Para minimizar la formación de niveles potencialmente peligrosos de N02 y otros óxidos superiores de NO, particularmente donde se están empleando concentraciones relativamente elevadas de NO, el tiempo que el oxígeno está en contacto con el NO en el gas terapéutico debe ser minimizado: el NO debe ser almacenado en la ausencia de 02, y mezclado con gas que contiene 02 poco antes de que se inhale la mezcla por parte del paciente. En general, esto significa llevar a cabo el mezclado no mas de alrededor de 10 minutos (de preferencia, no mas de alrededor de 5 minutos, y con mayor preferencia no mas de alrededor de 2 minutos) antes de la inhalación del gas terapéutico por parte del paciente. Se recomienda que el gas que contiene NO y el gas que contiene 02 sean mezclados inmediatamente antes de la inhalación, tal como en un aparato de flujo continuo, como se describe mas adelante. El método también puede incluir supervisar la concentración de NO y/o NOz en el gas terapéutico. Típicamente, el gas terapéutico incluirá no mas de 5 ppm de N02, y de preferencia no mas de 1 ppm de N02, en el punto en que se inhala por el paciente. Si se desea, al menos una porción de cualquier N02 que se forma en el gas puede ser retirada exponiendo el gas terapéutico a un despojador de N02 antes de que el paciente inhale el gas. Un típico protocolo de tratamiento incluye proveer el gas terapéutico al paciente por al menos un período de cinco minutos por día por al menos diez días consecutivos, donde la concentración de NO es de 40 a 240 ppm. Esto puede repetirse varias veces cada día. Otro protocolo de tratamiento adecuado incluye proveer al paciente una dosis relativamente baja (por ejemplo, 2 a 160 ppm) de NO en aire u 02/N2 (por ejemplo, 50% de 02) , de manera continua por ocho horas o mas (por ejemplo, 24 horas o incluso una semana) . Todavía otro protocolo incluye proveer al paciente una dosis elevada (por ejemplo, 1,000 ppm) de NO por un período corto de tiempo (por ejemplo, menos de 15 segundos) , según se necesite para impedir que los eritrocitos del paciente se conviertan falciformes, o para mejorar la capacidad portadora de oxígeno de la hemoglobina del paciente. Esto puede ser logrado usando un dispositivo inhalador portátil, de dosis múltiples, equipado con una cánula de NO comprimido en un gas inerte tal como N2, con o sin un tubo de re-respiración. Como el beneficio terapéutico parece ser duradero, se espera que este tratamiento a dosis elevada no necesite ser repetido mas de una vez por hora, y quizá no mas de una vez o dos por día. Generalmente, el gas terapéutico es provisto al paciente por al menos 10 segundos (por ejemplo, suficientemente para una o dos respiraciones profundas), y hasta 1 o 5 minutos. Como el volumen de sangre de un adulto es de aproximadamente 5 litros y el rendimiento cardíaco es de alrededor de 5 litros/minuto, llenar los pulmones con el gas que contiene NO por un minuto en teoría daría como resultado en el tratamiento de todo el volumen de sangre en circulación (suponiendo una mezcla completa) . Un tratamiento con una duración de cinco minutos probablemente sería una meta mas realista. El protocolo de tratamiento óptimo para cualquier paciente individual puede ser fácilmente establecido por el médico del paciente. En una variación de los métodos antes descritos, el paciente puede ser tratado por administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que libera NO (o donador de NO) . Ejemplos de compuestos que liberan NO adecuados incluyen S-nitrosotioles tales como S-nitroso-N-acetilpenicilami-na, S-nitrocisteína, y otros descritos en la publicación WO 92/17445 y la patente de los Estados Unidos 5,427,797 (incorporadas en la presente por referencia) ; nitroprúsido; nitrosoguanidi-na; trinitrato de glicerilo; azida; hidroxilamina; y cualquier compuesto NONOato, incluyendo aquéllos divulgados en las patentes de los Estados Unidos 4,954,526 y 5,155,137. Ejemplos de com-puestos NONOato incluyen dietilamina/NONO, dietilenotriamina/ NONO, y metilaminohexilmetilamina/NONO (ilustrados en Hanson y colaboradores, Nitric Oxide, Biochemistry, Molecular Bioloqy, and Therapeutic Implications , Ignarro y Murad, editores, Academic Press, New York (1995) ) . Un compuesto que libera NO puede ser provisto en forma de polvo o como liquido (por ejemplo, mezclando el compuesto con un excipiente biológicamente compatible) . El compuesto que libera NO puede ser administrado al paciente solo o en conjunción con el NO gaseoso, CO gaseoso, u otro compuesto que libera NO. Cuando se administran al paciente mas de un compuesto, los compuestos pueden ser mezclados conjuntamente, o pueden ser administrados al paciente de manera secuencial. Cualquiera, o una combinación, de las siguientes rutas de administración pueden usarse para administrar el o los compuestos que liberan NO al paciente: inyección intravenosa, inyección intra-arterial, entrega transcutánea, entrega oral, e inhalación (por ejemplo, de un gas, polvo o líquido) . La inhalación es la ruta de administración preferida. En todavía otra variación de los métodos antes descritos, el paciente puede ser tratado poniendo en contacto una porción de los eritrocitos del paciente ex vivo o in situ con una cantidad terapéuticamente efectiva de NO y/o CO gaseosos. Por ejemplo, un aparato oxigenador de membrana extra-corpórea (ECMO) , un aparato de derivación cardiopulmonar (CPB) , o un aparato oxigenador intravenoso (IVOX) pueden adaptarse para uso para poner en contacto los eritrocitos del paciente con NO y/o CO gaseosos (por ejemplo, 1 a 1,000 ppm en un gas que contiene oxígeno) . En casos donde el paciente es identificado como teniendo SCD o una de las combinaciones de Hb-S que produce células falciformes, la invención puede ser usada para tratar un paciente identificado como (i) sufriendo de una crisis de células falciformes, o (ii) estando en riesgo de incurrir en una crisis de células falciformes. Por ejemplo, el paciente puede tener SCD y estar a punto de someterse a cirugía con anestesia general. En tal caso, el paciente es tratado de acuerdo con el método de la invención durante cirugía y/o dentro de una hora antes y/o después de la cirugía, y por tanto como se estime necesario para impedir la crisis de células falciformes que a menudo es resultado de tal cirugía. Los pacientes susceptibles de tratarse con la invención incluyen aquéllos con o sin una enfermedad pulmonar conocida (por ejemplo, asma o hipertensión pulmonar) además de la hemoglobinopatía . La afinidad reducida de la hemoglobina del paciente por el oxígeno puede ser medida como un desplazamiento hacia la derecha en la ODC de la hemoglobina del paciente, con relación a la ODC obtenida con Hb-A. De manera alternativa, la afinidad reducida de la hemoglobina por el oxígeno puede ser medida como un valor P50 incrementado de la hemoglobina del paciente, con relación al valor P50 de Hb-A. Si se desea, la ODC y/o el valor P50 pueden medirse antes y después de tratar al paciente a fin de proveer una indicación de la efectividad terapéutica del gas terapéutico, compuesto que libera NO o tratamiento de eritrocitos ex vivo . Un desplazamiento hacia la izquierda en el valor P50 del paciente después de tratamiento, con relación a la ODC o el valor P50 antes del tratamiento, es una indicación de la efectividad terapéutica del método. Otra indicación de la efectividad del tratamiento cuando NO es el gas terapéutico es el grado de nitrosación de Hb, que puede medirse, por ejemplo, usando el método de Kon y colaboradores, 1977, J. Toxicol. and Environmen-tal Health 2:1109-1113 (incorporado en la presente por referencia) . Por ejemplo, un nivel de nitrosación de 0.01 a 25% puede ser tomado como correspondiente a un efecto terapéutico. De manera alternativa, o en adición, la efectividad del tratamiento puede ser medida como una reducción en el dolor, que puede ser evaluada en una escala analógica (es decir, 0-10) . Si se desea, el porcentaje de células de forma anormal (por ejemplo, falciformes y deformes) en la sangre del paciente (con o sin hipoxia u otra tensión que se esperaría produjera formación de células falciformes) puede ser determinado antes y después del tratamien-to; una reducción en el porcentaje de células de forma anormal después del tratamiento provee una indicación de la efectividad terapéutica del método. Como se usa en la presente, el término una "hemoglobi-nopatía" es un desorden o una enfermedad ocasionado por, o asociado con, la -presencia de una hemoglobina anormal en la sangre. Se incluyen las hemoglobinopatías en las cuales está presente en la sangre una combinación de hemoglobinas anormales (por ejemplo, enfermedad de células falciformes/Hb-C) . Las hemoglobinopatías que pueden ser tratadas con el método de la invención están asociadas con una afinidad reducida de la sangre del paciente por el oxígeno, o una tendencia de los eritrocitos del paciente a convertirse en falciformes bajo hipoxia y otras tensiones . Un paciente que es homocigótico para Hb-S, la hemoglo-bina de células falciformes en la cual se sustituye valina por ácido glutámico en la sexta posición de la cadena ß de Hb-A se dice tener la "enfermedad de las células falciformes". Los "rasgos de células falciformes" son la contraparte heterocigóti-ca, en la cual solamente uno de los genes Hb-A del paciente es reemplazado con el gene Hb-S mutante. Un paciente con rasgos de células falciformes típicamente tiene 20 a 45% de Hb-S y el resto de Hb-A. En el estado homocigótico, 75 a 100% de la hemoglobina es Hb-S, y el resto de la hemoglobina es hemoglobina fetal (Hb-F) o Hb-A2, ambas de las cuales son expresadas a partir de diferen-tes sitios genéticos que Hb-A o Hb-S. SCD ocasiona que todos o una porción de los eritrocitos en la sangre periférica del paciente se tornen de forma anormal (por ejemplo, falciformes o en forma de cuarto creciente) cuando se exponen a ciertas condiciones de disparo tales como bajo oxígeno o deshidratación. Un paciente con SCD ocasionalmente experimentará una "crisis" de células falciformes, caracterizada por vaso-oclusión, que puede afectar casi cada órgano del cuerpo. El infarto (es decir, necrosis de tejidos debido a una súbita insuficiencia del suministro de la sangre) de hueso, bazo, riñones y pulmones es común, y da como resultado dolor intenso y muerte de tejidos.

La hemoglobinopatía "Hb-C" es una condición caracterizada por la sustitución de lisina por ácido glutámico en la sexta posición de la cadena ß de Hb-A. La hemoglobinopatía "Hb-D" es resultado de la sustitución de glutamina por ácido glutámico en la posición 121 de la cadena ß de Hb-A. "Hb-E" está caracterizada por la sustitución de lisina por ácido glutámico en la posición 121 de la cadena ß de Hb-A. "Hb-H" está caracterizada por un homotetrámero de la cadena ß. "Hb-I" resulta de la sustitución de ácido glutámico por lisina en la posición 16 de la cadena OÍ. "Hb-Kansas" está caracterizada por la sustitución de treonina por asparagina en la posición 102 de la cadena ß de Hb-A. Estas hemoglobinopatías pueden afectar la plasticidad y la forma de eritrocitos que contienen la hemoglobina mutante, así como su afinidad por el oxígeno. Las talasemias dan como resultado una cantidad menor que la normal de ß-globina siendo expresada a partir del lugar afectado, o la expresión de una forma mutante de ß-globina que se sintetiza de manera ineficiente o catabolizada rápidamente de modo que esté disponible poca para formar Hb funcional. Un paciente que combina Hb-S con ß-talasemia puede tener poca o ninguna Hb-A normal presente para contrarrestar los efectos del gene de Hb-S sencillo, y así puede tener el equivalente funcional de SCD. Una cantidad "terapéuticamente efectiva" de NO gaseoso, CO gaseoso, o un compuesto que libera NO es una cantidad o concentración suficiente para producir cualquiera uno o mas de los siguientes efectos: (i) una reducción en el valor P50 de la hemoglobina del paciente de al menos 2 mm de Hg; (ii) un desplazamiento hacia la izquierda estadísticamente significativo en la ODC del paciente; (iii) en el caso de SCD, una reducción de 10% o mas en el número de eritrocitos que se deforman bajo condiciones de hipoxia (definidas como Pa02 de menos de 50 mm de Hg) ; o (iv) en el caso de un paciente que presenta una crisis de células falciformes, una reducción clínicamente significativa en el dolor sufrido por el paciente en un momento antes de que se esperara la resolución natural de la crisis. La invención provee un método simple, rápido y eficaz de tratar un paciente identificado como teniendo hemoglobinopatía. Los eritrocitos que llevan hemoglobina normal no son afectados de manera significativa por el método de tratamiento, al menos a niveles por debajo de 100 ppm de NO y 35 ppm de CO, de modo que el método sea seguro de usar incluso en heterocigóticos . Los efectos terapéuticos del tratamiento (por ejemplo, una reducción en el valor P50) persisten incluso después de que la hemoglobina ya no está expuesta a la fuente de NO o CO. En contraste con los métodos convencionales para tratar crisis de células falciformes, que ofrecen solo terapia de soporte, la invención puede ser usada para impedir o revertir la crisis de células falciformes reduciendo la polimerización de Hb-S y de esta manera la formación de células recientemente falciformes . Debido a que tales formación de células falciformes puede estar correlacionada con el nivel de dolor, la morbidez y la mortalidad resultantes de la crisis de células falciformes, la invención mitiga las complicaciones físicas asociadas con SCD, de una manera no invasiva. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una representación esquemática de un circuito de respiración que puede usarse para proveer el gas terapéutico que contiene NO a un paciente en un ambiente clínico. La figura 2 es una representación gráfica del valor P50 de eritrocitos de Hb-A y Hb-S humanos, frescos, enteros, después de exposición in vitro a aire sin NO, o después de exposición a 80 ppm de NO en aire. La figura 3 es una representación gráfica de la ODC y el valor P50 de eritrocitos de Hb-S humanos en aire y en 80 ppm de NO en aire in vi tro . El tratamiento con NO ocasiona un desplazamiento hacia la izquierda en la ODC y una reducción en el valor P50 de eritrocitos de Hb-S. La figura 4 es una representación gráfica del valor P50 de eritrocitos de Hb-S humanos después de exposición in vi tro a 80 ppm de NO en aire por varios lapsos de tiempo (se muestran datos de dos pacientes) . Cinco minutos de tratamiento de NO reducen significativamente el valor P50 de Hb-S, mientras que tratamiento adicional con NO tiene poco efecto adicional, si acaso. La figura 5 es una representación gráfica del porcenta-je de eritrocitos de Hb-S humanos falciformes como una función del porcentaje de saturación de hemoglobina con oxigeno, en la presencia de aire o de 80 ppm de NO. El tratamiento con NO in vitro (80 ppm) reduce el porcentaje de células falciformes a todas las concentraciones de hemoglobina. La figura 6 es una representación gráfica del porcentaje de células de apariencia normal (a diferencia de células deformes o células falciformes) como una función del porcentaje de saturación de hemoglobina con oxígeno, en la presencia de aire o de 80 ppm de NO en aire. Mas de las células tratadas con NO tenían una apariencia normal que las células expuestas únicamente a aire . La figura 7 es una gráfica de barras que ilustra la reducción progresiva en el valor P50 cuando eritrocitos obtenidos de dos pacientes con SCD fueron tratados in vitro con concentraciones escalantes de NO en aire. 1 = 0 ppm NO; 2 = 10 ppm NO; 3 = 40 ppm NO; 4 = 80 ppm NO. La figura 8 es una gráfica que muestra que NO inhalado incrementa la afinidad de RBCs por el oxígeno en pacientes SS (es decir, pacientes con SCD) . La reducción promedio del valor P50 de RBC en diez estudios con nueve pacientes SS estables (D) fue de aproximadamente 5 mm de Hg (rango 3-7 mm de Hg; p -< 0.001) después de que los pacientes respiraron 80 ppm de NO por 45 minutos. En un paciente SS, el valor P50 de RBC no cambió. Los adultos normales (•) no mostraron cambios (<1 mm de Hg) en el valor P50 de RBC después de respirar NO, indicando que los efectos de NO son selectivos para pacientes que tienen una hemoglobinopa-tia . Se tomaron muestras de sangre de tres pacientes AA y cinco pacientes SS mientras respiraban aire una hora después de que se habia descontinuado la respiración de NO. La reducción en el valor P50 de RBC fue mantenida por al menos una hora en 3 de 5 pacientes SS . En todos los pacientes, niveles intraeritrocíti-cos 2,3-DPG y ATP, el pH venoso y las tensiones de gas en sangre no cambiaron después de 45 minutos de respiración de óxido nítrico. En todos los sujetos, no hubo efectos clínicos secundarios observados. El nivel medio de hemoglobina después de 45 minutos de respiración de NO fue bajo (1.4 + 0.5%) para RBCs SS y el nivel de metemoglobina regresó a la linea de base después de 60 minutos, aun cuando los efectos de la terapia con NO sobre la afinidad al oxígeno persistieron en tres de los cinco pacientes SS evaluados . Descripción Detallada Los métodos de la invención pueden ser usados para tratar un paciente identificado como teniendo cualquiera de una variedad de hemoglobinopatías caracterizadas por una afinidad reducida de la hemoglobina del paciente por el oxígeno, en comparación con la afinidad por el oxígeno de hemoglobina de adulto normal . Esta afinidad reducida por el oxígeno es det'ecta-da típicamente como un desplazamiento hacia la derecha en la ODC de la hemoglobina afectada, en comparación con la ODC de Hb-A, o por un incremento en el valor P50 de la hemoglobina afectada, en comparación con el valor P50 de Hb-A. Tal afinidad reducida por el oxígeno es característica de tales hemoglobinas anormales como Hb-S (vista en la forma homocigótica como SCD, y en la forma heterocigótica como rasgos de células falciformes) , Hb-C, Hb-D, Hb-E, Hb-H, Hb-I, o desorden de Hb-Kansas. Un paciente puede ser homocigótico o heterocigótico para el gene mutante. Ocasionalmente, un paciente será un "heterocigoto mixto" que es portador de dos diferentes genes mutantes de ß-globina. Ejemplos incluyen las siguientes combinaciones: S/C, S/D, S/O-Arab, S/Quebec-Clori, S/ß-talasemia, S/E, S/Lepore, y otras descritas en Kinney y Ware, Compound Heterozygous Sta tes, capítulo 29 en Sickle Cell Disease: Basic Principies and Clinical Practice, editores Stephen H. Embury y colaboradores, Raven Press, Ltd., New York (1994), incorporado en la presente por referencia. Los métodos y criterios convencionales, incluyendo observaciones clínicas, análisis genético, análisis de proteínas, análisis de ODC y análisis de P50, pueden usarse para identificar un paciente teniendo tal hemoglobinopatía, incluyendo pacientes con tipos que todavía no se han descubierto de hemoglobinopatías. Se describen a continuación pruebas in vi tro sencillas para determinar si es factible que una hemoglobinopatía dada responda al tratamiento con los métodos de la invención. De manera alternativa, se puede probar el método directamente en el paciente.

Uso de NO o CO Gaseosos Inhalados para Tratar una Heptoslobinopa-tia En un aspecto de la invención, NO o CO gaseosos, o una combinación de NO y CO, es provisto a un paciente para inhala-ción. Se describe mas adelante el uso de NO; aplican principios similares para el uso de CO o una combinación de CO y NO. NO gaseoso o CO gaseoso comprimidos pueden obtenerse de un proveedor comercial, tal como Aireo (Murray Hill, New Jersey, Estados Unidos) o Air Products and Chemicals, Inc. (Allentown, Pennsylva-nia, Estados Unidos) . Típicamente, se provee NO como una mezcla de 200-2,000 ppm de NO en N2 u otro gas inerte tal como helio. Se prefiere almacenar el NO como una mezcla que está libre de 02, debido a que el 02 puede reaccionar con NO para formar óxidos superiores de nitrógeno tóxicos, tales como N02. Si se desea, el gas que contiene NO puede ser mezclado con aire u 02 inmediatamente antes de proveer la mezcla para inhalación. Rotámetros calibrados que han sido previamente calibrados con un espirómetro pueden usarse para mezclar cantidades precisas del gas que contiene NO con aire u 02, particularmente en un entorno de hospital. Generalmente, un gas terapéutico que incluye al menos 21% de oxígeno así como un nivel terapéutico de NO y/o CO es adecuado para uso en la invención. La concentración de CO puede determinarse, si se desea, usando técnicas estándar de detección infrarrojas. A fin de limitar la formación de óxidos superiores de nitrógeno, el NO debe estar en contacto con el oxígeno por menos de alrededor de 10 minutos (y de preferencia menos de 5 minutos) antes de la inhalación del gas terapéutico por el paciente. Si se desea, pueden usarse métodos estándar de quimo-luminiscencia para medir la cantidad de NO y/o N02 en el gas terapéutico antes de administrar el gas a un paciente (ver, por ejemplo, Fontijin y colaboradores, 1970, Anal. Chem. 42:575-579) . Puede despojarse N02 antes de proveer el gas terapéutico al paciente. Métodos apropiados de despoj amiento incluyen exponer el gas a soluciones de NaOH, barali a, o cal de sosa. Estos métodos de despoj amiento pueden también ser usados para extraer N02 del gas que es exhalado por el paciente, si se desea, de modo que no se introduzca N02 a la atmósfera. La manera preferida de suministrar el gas terapéutico al paciente es mediante flujo continuo, por ejemplo en un circui-to de respiración de máscara, mas que por mezclado estático en un receptáculo tal como una bolsa Douglas. Un circuito de respiración ejemplar es mostrado esquemáticamente en la figura 1. Este circuito incluye una fuente de una mezcla a presión de NO gaseoso en N2, una fuente de aire o de 02 gaseoso conectado a una mezcla-dora para introducir el aire o el 02 gaseoso al circuito, un analizador de NO para supervisar la concentración de NO en el gas terapéutico, y una válvula en T de no re-respiración que lleva al paciente. Los gases exhalados pueden ser despojados, si se desea, por el sistema de vacío del hospital. Las concentraciones de NO y N02 dentro del circuito de respiración pueden ser anali-zadas de manera electroquímica con sensores disponibles comercialmente (por ejemplo, el sensor de NO (modelo No. 4586) y el sensor de N02 (modelo No. 4584) de Exidyne Instrumentation Technologies, de Exton, Pennsylvania, Estados Unidos). La concentración de oxigeno puede ser supervisada con un analizador de oxigeno en línea, si se desea. Como una alternativa a usar el circuito de respiración de máscara, un dispositivo inhalador portátil (con o sin un tubo de re-respiración) puede ser usado para proveer el NO al pacien-te. Ejemplos de dispositivos inhaladores adecuados que pueden ser adaptados para los métodos de la invención son descritos en el documento de patente WO 92/1228, y en las patentes de los Estados Unidos 5,485,827; 5,396,882; 4,667,668; 4,592,348; 4,534,343; y 4,852,561, cada uno de los cuales es incorporado en la presente por referencia. Otros dispositivos inhaladores son descritos en Phvsicians Desk Reference, Edward R. Barnhar, editor. Generalmente, los dispositivos inhaladores adecuados son portátiles, es decir de menos de 5 kg, y de preferencia de menos de 1 kg, y pueden ser de un diseño similar a los inhaladores disponibles actualmente para el tratamiento de ataques de asma. El dispositivo contiene cualquiera o ambos de (a) NO o CO gaseosos a presión, y (b) un compuesto que libera NO. Típicamente, tal dispositivo incluiría un gas a presión que contiene al menos 1 ppm (de preferencia al menos 5 ppm, con mayor preferencia al menos 40 y con la mayor preferencia al menos 80 ppm) de NO o CO.

La concentración de NO o CO en el gas a presión puede ser relativamente elevada, por ejemplo 160, 300, 500 o 1,000 ppm. Se contempla que pueden usarse concentraciones tan elevadas o incluso mayores de 1,500 o 2,000 ppm. Si se desea, el dispositi-vo puede contener una mezcla de NO gaseoso a presión y ya sea un gas inerte tal como N2, o un propulsor líquido tal como un fluorocarburo, por ejemplo freón. Antes de administrar el gas terapéutico al paciente, puede analizarse la sangre del paciente, si se desea, a fin de establecer una línea de base contra la cual pueda compararse la sangre tratada con NO. Típicamente, una muestra de 10 ml de sangre será aspirada hacia una jeringa con heparina, y se medirá la saturación de hemoglobina, hematocritos, oxígeno y/o la saturación de metemoglobina . La ODC, el valor P50 y/o el nivel de nitrosación de la hemoglobina del paciente; y/o la concentración de 2, 3-difosfoglicerato en eritrocitos pueden medirse antes de que se inhale el gas terapéutico. Asimismo, puede analizarse una alícuota de la muestra de sangre en cuanto al grado de formación de eritrocitos falciformes. Cualquiera de o todos estos parámetros pueden medirse de nuevo después de la inhalación del gas terapéutico para proveer una medida de la efectividad terapéutica del gas inhalado. Si se desea, la saturación de oxigeno de la sangre del paciente puede ser supervisada por oximetría de pulso, mientras el paciente respira el gas terapéu-tico. Si se desea, muestras adicionales de sangre pueden ser aspiradas con el tiempo, mientras el paciente continúa respirando el gas terapéutico. De manera tipica, el paciente respirará el gas terapéutico por al menos 1 minuto, y habitualmente por 5 a 30 minutos donde se están empleando niveles de NO por debajo de 500 ppm (por ejemplo, 80 ppm) . A menor concentración de NO, mayor puede ser el periodo de inhalación; por ejemplo, la inhalación puede ser continua por mas de 24 horas a un nivel relativamente bajo de 40 u 80 ppm. Niveles superiores de NO pueden ser usados por perío-dos de tiempo cortos. Si no se detecta toxicidad (por ejemplo, en la forma de metemoglobinemia considerable (mas de 10%) ) , puede prolongarse el uso de tales niveles superiores o repetirse, según se necesite, en el curso de un dia. Se prevé que algunas hemoglobinopatias pueden beneficiarse de tratamiento profiláctico regular con NO o CO, por ejemplo tres o mas veces diariamente durante la vida del paciente, con tratamientos adicionales siempre que sea elevado el riesgo de una crisis. Se espera que pueda usarse CO a una concentración de 50-100 ppm por periodos indefinidos de tiempo, y concentraciones superiores (por ejemplo, 200-500 ppm) por períodos intermedios (tales como de una hora) . Cuando se usan CO y NO en combinación, puede usarse CO a una concentración de 1-100 ppm, y NO a una concentración de 1-80 ppm, aunque pueden emplearse dosis superiores o inferiores en los casos en que se justifique. Aunque el régimen terapéutico óptimo para cualquier paciente dado depende de factores tales como el tipo de hemoglobinopatía sufrido y la severidad de la condición de enfermedad que presente el paciente, un régimen de terapia adecuado, típico implica respirar un gas terapéutico (conteniendo 2 a 160 ppm de NO o CO) por al menos un periodo de 5 minutos por dia por al menos 10 dias consecutivos. De manera alternativa, el paciente puede respirar una concentración mucho mayor de NO o CO (por ejemplo, 300-2,000 ppm) por un tiempo mas corto (por ejemplo, tan corto como una sola respiración) de una a varias veces por dia, según se necesite. En casos en los que el paciente está en una crisis de células falciformes, se espera que los niveles elevados de NO sean necesitados de manera continua en una base de emergencia hasta que la crisis inmediata haya pasado. Un paciente en riesgo considerable de incurrir en una crisis de células falci-formes (por ejemplo, durante una exposición hipóxica esperada) debe mantenerse a un nivel de NO o CO adecuado para impedir o al menos reducir la severidad de la crisis, en tanto permanezca la crisis. Debido a que un paciente con la enfermedad de las células falciformes que ha sufrido cirugía (por ejemplo, para retirar un bazo dañado) está en alto riesgo de incurrir en una crisis durante o inmediatamente después de la cirugía, se recomienda que tales pacientes sean provistos con el gas terapéutico durante y después de la cirugía, y de preferencia de manera inmediata antes de la cirugía también (para cargar la hemoglobina del paciente con NO) .

El Uso de un Compuesto que Libera NO para Tratar una Hemoslobino-patia En lugar de, o en adición a emplear NO o CO gaseosos, puede usarse un compuesto que libera NO para entregar una canti-dad terapéuticamente efectiva de NO a la hemoglobina del paciente. Ejemplos de compuestos adecuados que liberan NO incluyen S-nitrosotioles tales como S-nitróso-N-acetilpenicilamina (SNAP) , y S-nitrocisteína; nitroprúsido; nitrosoguanidina; trinitrato de glicerilo; azida; hidroxilamina; y cualquier compuesto NONOato. Los criterios para seleccionar compuestos que liberan NO adicionales incluyen su habilidad para descomponerse para liberar NO a una tasa terapéuticamente benéfica al inyectarse, entregarse oralmente o depositarse en la parte apropiada del tracto respiratorio. Por ejemplo, se ha mostrado que SNAP es estable en su forma sólida, pero bajo condiciones fisiológicas (tales como en la película de fluido fisiológico sobre la superficie del lumen bronquiolar o alveolar) , el compuesto se descompone fácilmente para liberar NO (Ignarro, Circ. Res. 65:1-21, 1989). Un compuesto que libera NO puede ser administrado al paciente por cualquiera de una variedad de rutas, incluyendo inyección intravenosa, inyección intra-arterial, entrega transcu-tánea, entrega oral, o inhalación. Para inhalación, el compuesto que libera NO puede ser empacado en un dispositivo inhalador, tal como uno de los dispositivos antes descritos, o puede entregarse via un circuito de respiración tal como el anteriormente descri-to. Para facilitar la entrega, el compuesto que libera NO puede ser disuelto en un excipiente biológicamente compatible (por ejemplo, agua o solución salina) . De manera alternativa, el compuesto que libera NO puede ser provisto en forma de polvo. Cuando un compuesto que libera NO es inhalado en forma sólida o líquida, las partículas o gotitas son depositadas a través de todo el sistema respiratorio, las partículas o gotitas mas grandes tendiendo a depositarse cerca del punto de entrada (es decir, la boca o la nariz) y las partículas o gotitas mas peque-ñas siendo llevadas progresivamente mas lejos hacia el sistema respiratorio antes de depositarse en la tráquea, los broncos y finalmente los alveolos. (Ver, por ejemplo, Hounman y Morgan, "Particle Deposition" , capítulo 5, en Respiratory Defense Mechanisms, Part 1, Marcel Dekker, Inc., New York; editores, Brain y colaboradores, 1977, p. 125) . Un tamaño de partícula/gotita de 10 µm o menos es recomendado para uso en la invención. La dosis óptima de un compuesto que libera NO para cualquier paciente dado puede ser fácilmente determinada, y dependerá de factores tales como la naturaleza del compuesto, el tipo de hemoglobinopatía, y la severidad de la condición de enfermedad. Donde el compuesto que libera NO es provisto para inhalación, puede estar en forma sólida o líquida. Una dosis típica para un adulto sería de alrededor de 1-5 mg, independientemente de la ruta de entrega. Uso de NO Ex Vivo o In Situ para Tratar una Hemoslobinopatia A fin de entregar NO o CO a la sangre de un paciente ex vivo o in situ, se puede adaptar un aparato ECMO, IVOX o CPB estándar para usar un gas que contiene no solamente 02 sino también NO y/o CO a una concentración terapéuticamente efectiva. De manera típica, la sangre del paciente es aspirada continuamente del paciente y bombeada a través del intercambiador de gases ex vivo, luego devuelta al paciente. Al pasar la sangre por la membrana permeable a gases que la separa del gas terapéutico, las moléculas de NO o CO que han sido absorbidas a través de la membrana entran a la sangre y luego interactúan con la hemoglobina en los eritrocitos. Los intercambiadores de gases in situ tales como IVOX son colocados directamente en la vasculatura del paciente, mas que requerir que la sangre sea bombeada fuera del cuerpo. Otros tipos de dispositivos no diseñados específicamente para entrega a la sangre, pero que pueden adaptarse para la entrega de NO a la sangre de un paciente que la necesite, son descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 08/036,522, de la misma solicitante, incorporada en la presente por referencia. Pruebas In Vitro Los experimentos discutidos mas adelante demuestran que la exposición de los eritrocitos de Hb-S a niveles no tóxicos de NO ocasiona un desplazamiento hacia la izquierda en la ODC y una reducción en el valor P50 de la hemoglobina, indicando que la terapia con NO altera la capacidad de la hemoglobina anormal a ligarse y liberar oxígeno de modo que se asemeje mas estrechamente a Hb-A. Durante terapia con NO, se reduce el P02 al cual se desatura la hemoglobina anormal (es decir, libera su molécula de 02) . De esta manera, la relación de Hb-S insaturada a saturada a una presión parcial dada de oxígeno es reducida durante la terapia con NO. Como es menos factible que Hb-S polimerice si es portadora de 02, se reduce durante la terapia con NO la posibilidad de que Hb-S polimerice a una presión parcial dada de 02, con una reducción concomitante en la formación de eritrocitos falci-formes. Además, los datos discutidos mas adelante sugieren que la terapia con NO puede afectar directamente las interacciones heme-heme u ocasionar un cambio conformacional en Hb-S (posiblemente formando un aducto de NO) , reduciendo la tendencia de Hb-S a polimerizar independientemente de su efecto sobre la ODC de Hb-S . De esta manera, se cree que el tratamiento con NO tiene un efecto benéfico adicional al impedir la polimerización de Hb-S y la formación de eritrocitos falciformes, independientemente de su efecto sobre la afinidad por el oxígeno, de modo que incluso si la Hb-S tratada con NO libera su 02, los eritrocitos no se conviertan en falciformes de manera tan fácil. Experimento I : NO Ocasiona una Reducción en el Valor Pco de Hemoglobina Anormal Este experimento demuestra que la exposición de eritrocitos a niveles no tóxicos de NO reduce el valor P50 (es decir, ocasiona un desplazamiento hacia la izquierda en la ODC) cuando las células contienen Hb-S, pero no cuando contienen únicamente Hb-A normal. Eritrocitos humanos recién aspirados de ya sea pacientes SCD o controles normales fueron lavados en solución estándar de Colin y expuestos a 80 ppm de NO gaseoso en aire por 15 minutos, usando un tonómetro de sangre/gas. Usando un analizador automático de disociación de oxigeno en sangre, la ODC de la hemoglobina fue medida tanto antes como después de exposición de los eritrocitos a NO. Como se ilustra en la figura 2, la exposición de eritrocitos normales (Hb-A) a 80 ppm de NO bajo estas condiciones no da como resultado un cambio significativo en el valor P50 de Hb-A de 26 mm de Hg. En contraste, la exposición de Hb-S a 80 ppm de NO en aire ocasiona una reducción considerable en el valor P50 de Hb-S en comparación con el valor P50 de Hb-S en aire solamente. Como se ilustra en la figura 2 y el la ODC mostrada en la figura 3, el valor P50 de los glóbulos rojos que contienen Hb-S en aire (y posiblemente otras hemoglobinas, por ejemplo Hb-C) de un paciente con células falciformes fue de 32.5 mm de Hg, mientras que el valor P50 después de exposición a NO fue reducido a 26 mm de Hg. Estos datos también indican que, como se esperaba, el valor P50 sin exposición de glóbulos rojos conteniendo Hb-S a NO (30.5 mm de Hg) fue elevado, con relación al valor P50 de glóbulos rojos conteniendo Hb-A sin exposición a NO (27 mm de Hg) . Como se muestra en la Tabla 1, la exposición a NO indujo una reducción en el valor P50 de eritrocitos Hb-S que persiste por al menos una hora después de que se detiene el tratamiento con NO. Otros experimentos muestran que esta reducción persiste por al menos dos horas . Tabla 1 Exposición Secuencial de RBC Hb-S P50 Aire (línea de base) 35 mm de Hg Aire con 80 ppm NO x 15 minutos 30 mm de Hg Aire x 15 minutos, después de terminar NO 30 mm de Hg Aire x 30 minutos, después de terminar NO 30 mm de Hg Aire x 60 minutos, después de terminal NO 30 mm de Hg Experimento II : Efecto de la Longitud de Exposición a NO sobre el Valor Pcn de RBC Hb-S Este experimento ilustra que una exposición a 80 ppm de NO en un tonómetro por menos de cinco minutos es suficiente para ocasionar una reducción significativa en el valor P50 de células que contienen Hb-S. Muestras de eritrocitos de dos pacientes diferentes con SCD fueron expuestas a 80 ppm de NO o a aire, por diversos lapsos de tiempo (1, 5, 30 y 60 minutos), y se determinaron los valores P50. Aunque la exposición de eritrocitos Hb-S a 80 ppm de NO por 1 minuto no alteró sustancialmente el valor P50 de estas células (figura 4), la exposición de eritrocitos Hb-S a 80 ppm de NO por un tiempo tan reducido como 5 minutos llevó a una reducción considerable en el valor P50 para las muestras de ambos pacientes (mostradas como lineas separadas en la figura 4) . Exponer los eritrocitos a 80 ppm de NO por 30 o 60 minutos mantuvo la reducción observada pero no ocasionó una reducción adicional significativa en el valor P50 mas allá de la observada con una exposición de 5 minutos. Exponer los eritrocitos que contienen Hb-S a aire sin NO por hasta 60 minutos no produjo cambio significativo en el valor P50 con el tiempo (datos no mostrados) . Experimento III : Efecto de la Concentración de Oxihemoglobina sobre la Capacidad de NO para Alterar el Valor Pcn Este experimento ilustra cómo la concentración de oxihemoglobina afecta la capacidad de NO para reducir el valor P50 de Hb-S. En estos experimentos, dos matraces conteniendo eritrocitos Hb-S humanos fueron incubados en un baño de agua a 37 °C. La concentración de 02 del gas en cada matraz fue reducida en pasos a intervalos de una hora, de 20 a 16, 12, 8, 4 y luego 0% de 02. Un conjunto de matraces también contuvo 80 ppm de NO a través de todo el experimento, y ambos conjuntos contuvieron 5% de C02 a través de todo el experimento. Muestras de eritrocitos fueron retiradas de cada matraz después de cada hora (es decir, con cada reducción en la concentración de oxígeno) . Las concen-traciones de oxihemoglobina y metemoglobina fueron determinadas por oximetría de longitud de onda múltiple (usando un oxímetro de CO Ciba-Corning, modelo 270, y métodos convencionales) . La morfología celular fue evaluada usando microscopía luminosa para determinar el porcentaje de eritrocitos normales, deformes y falciformes en cada muestra. Las células deformes son definidas como células que no tienen la forma tipica de ya sea las células normales o las células falciformes. Como se ilustra en la figura 5, el tratamiento con NO reduce el porcentaje de células falciformes a todas las concen-traciones de oxihemoglobina. Los eritrocitos expuestos a NO incurrieron en 10-15% menos de formación de células falciformes que los eritrocitos de control a la misma saturación porcentual de oxígeno en hemoglobina. Esto sugiere que 80 ppm de NO pueden alterar interacciones "heme-heme" o producir un cambio confórmacional de la molécula de hemoglobina anormal de una manera que es independiente del efecto sobre la afinidad por el oxigeno, reduciendo la tendencia de Hb-S a polimerizar a una saturación de oxígeno dada. A mayor abundamiento, un mayor porcentaje de las células tratadas con NO que las células de control fue juzgado ser "normales" (a diferencia de deformes o falciformes) a cada saturación porcentual de oxígeno en hemoglobina medida (figura 6) . Experimento IV: Respuesta a Dosis Este experimento ilustra que incrementar concentracio-nes de NO produce un efecto de incremento del valor P50 de eritrocitos que contienen Hb-S. Muestras de eritrocitos de dos pacientes diferentes con SCD fueron expuestas a aire (0 ppm de NO; ilustradas en la columna 1 en la gráfica de barras de la figura 7), o a 10 ppm de NO (columna 2), 40 ppm de NO (columna 3) , u 80 ppm de NO (columna 4) por 5 minutos. Los valores P50 fueron entonces determinados. Como se muestra en la figura 7, los valores P50 para los eritrocitos de cada paciente se redujeron al incrementar la concentración de NO. Pruebas In Vivo en Seres Humanos Los experimentos discutidos mas adelantes demuestran que la inhalación de NO incrementa la afinidad de RBCs por el oxígeno en pacientes humanos diagnosticados como teniendo SCD. De esta manera, el NO altera la capacidad de la hemoglobina anormal a ligarse a y liberar oxígeno de modo que se asemeje mas estrechamente a Hb-A. En estos estudios, los pacientes fueron tres adultos, sexo masculino, normales, de 25 a 40 años de edad (referidos en la presente como "AA" ) y nueve adultos (siete hombres y dos mujeres) clínicamente estables (edades de 20 a 33 años) que eran homocigóticos para Hb-S (referidos en la presente como "SS") . Brevemente, en sujetos SCD, estos experimentos muestran que respirar NO a 80 ppm en aire redujo la presión parcial de oxígeno a la cual la hemoglobina es saturada al 50% con oxígeno. Incluso 60 minutos después de terminar la respiración de NO, el valor P50 continuó siendo reducido. Los detalles de estos experimentos siguen. Determinaciones de ODC 50 microlitros de sangre entera fueron obtenidos por punción de vena de adultos AA o SS y diluidos con 4 ml de amorti-guador de fosfato, 10 µl de solución anti-espumante y 20 µl de albúmina al 20%. Las muestras de sangre fueron desnaturalizadas por exposición a 100% de nitrógeno gaseoso (N2) y luego re-oxigenadas usando un analizador Hemox (TCS Medical Products Company, Huntingdon Valley, Pennsylvania, Estados Unidos) para medir la ODC usando métodos convencionales (Guarnone y colaboradores, 1995, Haematologica, 80:426-430). El valor P50 fue determinado como la presión parcial de oxígeno a 50% de saturación de oxihemoglobina. Para asegurar la precisión de mediciones repetidas en el tiempo usando RBCs de SS, las muestras de sangre obtenidas de tres pacientes SS fueron medidas a los 0, 15, 30 y 60 minutos sin exposición a NO gaseoso; no se detectaron cambios en el valor P50. Inhalación de NO en Adultos SS y AA Se estudiaron tres adultos normales y nueve adultos con SCD. Un paciente SS fue estudiado dos veces, con un intervalo de tiempo de un mes entre estudios. La presión sanguínea, electrocardiogramas, tasas respiratoria y cardíaca, y oximetría de pulso fueron supervisados continuamente. Los sujetos respiraron aire y luego 80 ppm de NO en aire vía un circuito de no re-respiración por 45 minutos. Sangre venosa fue muestreada antes e inmediatamente después de respirar NO. Los sujetos normales y cinco pacientes SCD tuvieron una muestra adicional de sangre tomada una hora después de respirar NO. Se midieron las ODCs ex vivo, como se describió antes. Además, se determinaron usando métodos estándar las concentraciones de trifosfato de adenosina (ATP) y 2, 3-difosfo-glicerato (DPG) en RBCs (Poillon y colaboradores, 1985, J. Biol. Chem. 260:13897-13900) . Se midió metemoglobina usando un oxímetro de CO (Ciba-Corning, modelo 270, Mayfield, Massachusetts, Estados Unidos) y técnicas estándar antes y después de exposición de RBCs a NO. El pH venoso y los gases sanguíneos fueron medidos usando un analizador de pH/gases sanguíneos (Ciba-Corning, modelo 170, Mayfield, Massachusetts, Estados Unidos) y técnicas estándar. Análisis Estadístico Los datos presentados mas adelante son expresados como media ± SEM, salvo donde se indique lo contrario. Se usaron pruebas t de estudiante tanto apareadas como no apareadas, con un valor P de menos de 0.05 indicando significancia estadística. Todas las pruebas fueron de doble cola. Las correlaciones fueron evaluadas calculado el coeficiente de correlación de Pearson. Inhalación de NO en Adultos SS y AA Para mostrar que bajas concentraciones de NO alteran Hb-S in vivo, el valor P50 en RBCs de pacientes AA y SS fue medido antes y después de que los pacientes respiraran 80 ppm de NO en aire por 45 minutos. En pacientes SS que respiraron 80 ppm de NO, el valor P50 de RBC fue reducido (P--0.001), con una reducción promedio de 4.6 ± 2 mm de Hg (figura 8) . En contraste, el valor P50 de RBC de pacientes AA que respiraron NO no cambió (=l mm de Hg; P=NS) , indicando que el efecto de NO es selectivo para RBCs de pacientes teniendo una hemoglobinopatía. El paciente SS que fue estudiado dos veces (con un mes entre estudios) tuvo una reducción significativa en el valor P50 en ambas ocasiones. En suma, estos datos demuestran que respirar NO incrementa la afinidad de hemoglobina por oxígeno en RBCs de pacientes que tienen la enfermedad de las células falciformes. Para demostrar que la respiración de NO afecta el valor P50 incluso después de que se descontinúa la terapia con óxido nítrico, se midió la ODC de cinco pacientes SS una hora después de que se descontinuó la inhalación de NO. En tres de los cinco pacientes, el valor P50 de RBC permaneció reducido, indicando que el efecto de NO sobre la afinidad por el oxígeno de RBCs SS persiste después de que se descontinúa el NO (figura 8) . Para todos los pacientes que respiraron 80 ppm de NO en aire por 45 minutos, las concentraciones de ATP y 2,3-DPG en los RBCs de los pacientes no cambiaron en respuesta al NO. Además, la presión sanguínea de los pacientes, las tasas respiratoria y cardíaca, los niveles de saturación de oxígeno transcutánea (Sp02), el pH de la sangre venosa, y los datos de electrocardio-grama no cambiaron durante respiración de NO. Los pacientes con RBCs SS tenían un nivel superior de metemoglobina de la línea de base (0.5 ± 0.2%) que los pacientes con RBCs AA (0.1 ± 0.1%) . La exposición a NO llevó a un pequeño incremento en los niveles de metemoglobina tanto en RBCs SS (1.4 ± 0.7%) como RBCs AA (0.7 + 0.1%); 60 minutos después de exposición a NO, estos niveles de metemoglobina regresaron a niveles cercanos a la linea de base (0.6 + 0.3% y 0.2 ± 0.1%, para pacientes SS y AA, respectivamente) . No hubo correlación entre el incremento en los niveles de metemoglobina y la reducción en los valores P50 (r = 0.02, n = 10) . De hecho, el desplazamiento en el valor P50 persistió 60 minutos después de exposición a NO en tres de los cinco pacientes SS analizados, mientras que los niveles de metemoglobina habían regresado a los valores de línea de base. En suma, estos datos demuestran que puede administrarse NO a niveles terapéuticamente efectivos sin llevar a niveles considerables de metemoglobina y sin ocasionar consecuencias considerablemente nocivas a las estadísticas vitales de los pacientes. Conclusión Los experimentos in vi tro e in vivo descritos anterior-mente demuestran que la afinidad del oxígeno por hemoglobina se incrementa cuando RBCs SS son expuestos a bajas concentraciones de óxido nítrico. Esta afinidad incrementada por el oxígeno persistió por al menos dos horas in vitro y al menos una hora in vivo después de cesar la administración de óxido nítrico. Estos efectos terapéuticos del tratamiento con NO fueron obtenidos sin producir niveles clínicamente significativos de metemoglobina. De esta manera, estos datos muestran que la inhalación de óxido nítrico puede ser una terapia efectiva para tratar hemoglobinopatías que son caracterizadas por (a) una afinidad reducida de la hemoglobina del paciente por el oxígeno en comparación con la afinidad para el oxígeno de hemoglobina adulta normal, o (b) una tendencia de los eritrocitos del paciente a convertirse en falciformes . Otras formas de realización están dentro de las reivindicaciones siguientes.

Claims (52)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método de tratar a un paciente identificado como teniendo una hemoglobinopatía, el cual método comprende identificar un paciente que tiene una hemoglobinopatia caracterizada por (a) una afinidad reducida de la hemoglobina del paciente por el oxígeno en comparación con la afinidad por el oxígeno de hemoglobina adulta normal (Hb-A) , o (b) una tendencia de eritrocitos del paciente a convertirse en falciformes; y proveer un gas terapéutico para inhalación por parte del paciente, donde el gas terapéutico comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de óxido nítrico (NO) gaseoso.
2. 2. El método de la reivindicación 1, donde el gas terapéutico contiene NO a una concentración de al menos 1 ppm.
3. 3. El método de la reivindicación 2, donde el gas terapéutico contiene NO a una concentración de al menos 10 ppm.
4. 4. El método de la reivindicación 3, donde el gas terapéutico contiene NO a una concentración de 40 a 2,000 ppm.
5. 5. El método de la reivindicación 1, donde el gas terapéutico es provisto al paciente por al menos 10 segundos.
6. 6. El método de la reivindicación 5, donde el gas terapéutico es provisto al paciente por al menos 5 minutos.
7. 7. El método de la reivindicación 1, donde la hemoglobinopatía es una enfermedad de células falciformes.
8. 8. El método de la reivindicación 7, donde antes del paso de proveer el gas terapéutico, el paciente es diagnosticado como sufriendo de una crisis de células falciformes.
9. 9. El método de la reivindicación 7, donde antes del paso de proveer el gas terapéutico, el paciente es identificado como estando en riesgo de incurrir en una crisis de células falciformes.
10. 10. El método de la reivindicación 1, donde la hemoglobinopatía es seleccionada del grupo que consiste en rasgos de células falciformes; desórdenes de Hb-C, Hb-D, Hb-E, Hb-H, Hb-I y Hb-Kansas; o una combinación de Hb-S con un segundo alelo mutante de ß-globina.
11. 11. El método de la reivindicación 1, donde el gas terapéutico es provisto en la ausencia de humo de tabaco.
12. 12. El método de la reivindicación 1, donde el gas terapéutico provisto para inhalación comprende además oxígeno, el oxígeno estando en contacto con el NO en el gas terapéutico por menos de alrededor de 10 minutos antes de la inhalación del gas terapéutico por el paciente.
13. 13. El método de la reivindicación 12, donde el gas terapéutico comprende al menos 21% de oxígeno.
14. 14. El método de la reivindicación 1, donde el gas terapéutico comprende además monóxido de carbono (CO) gaseoso a una concentración de 1 a 10,000 ppm.
15. 15. El método de la reivindicación 1, comprendiendo además supervisar la concentración de NO en el gas terapéutico.
16. 16. El método de la reivindicación 1, comprendiendo además supervisar la concentración de N02 en el gas terapéutico.
17. 17. El método de la reivindicación 1, donde el gas terapéutico es expuesto a un despojador de N02 antes de proveer el gas terapéutico para inhalación por parte del paciente.
18. 18. El método de la reivindicación 1, donde el gas terapéutico comprende no mas de 5 ppm de N02.
19. 19. El método de la reivindicación 1, comprendiendo además medir el valor P50 de hemoglobina del paciente antes y después de que se provea el gas terapéutico, donde una reducción en el valor P50 después de que se provee el gas terapéutico, con relación al valor P50 antes de que se provea el gas terapéutico, es una indicación de la efectividad terapéutica del gas terapéutico .
20. 20. El método de la reivindicación 7, comprendiendo además determinar el porcentaje de células falciformes en la sangre del paciente tanto antes como después de que se provea el gas terapéutico, donde una reducción en el porcentaje de células falciformes después de que se provea el gas, con relación al porcentaje de células falciformes antes de que se provea el gas, es una indicación de la efectividad terapéutica del gas terapéutico.
21. 21. El método de la reivindicación 1, comprendiendo además determinar el nivel de nitrosación de Hb después de que se provea el gas terapéutico.
22. 22. El método de la reivindicación 1, donde la concen-tración de NO en el gas terapéutico es de 1 a 2,000 ppm, y el gas terapéutico es provisto al paciente por al menos un período de cinco minutos por día por al menos diez días consecutivos .
23. 23. Un método para tratar un paciente identificado como teniendo una hemoglobinopatía, el cual método comprende identificar un paciente que tiene una hemoglobinopatía caracterizada por una afinidad reducida de la hemoglobina del paciente por el oxígeno en comparación con la afinidad para el oxígeno de Hb-A normal; y administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que libera NO.
24. 24. El método de la reivindicación 23, donde el compuesto que libera NO es seleccionado del grupo que consiste en S-nitrosotioles, NONOatos, nitroprúsido, nitrosoguanidina, trinitrato de glicerilo, azida, e hidroxilamina.
25. 25. El método de la reivindicación 23, donde el compuesto que libera NO es administrado al paciente por una ruta seleccionada del grupo que consiste en inyección intravenosa, inyección intra-arterial, entrega transcutánea, entrega oral, e inhalación.
26. 26. El método de la reivindicación 23, donde el compuesto que libera NO es administrado por inhalación.
27. 27. El método de la reivindicación 23, donde la hemoglobinopatía es la enfermedad de células falciformes.
28. 28. El método de la reivindicación 27, donde, antes del paso de administración, el paciente es diagnosticado como sufriendo de la crisis de las células falciformes.
29. 29. Un método de tratar un paciente identificado como teniendo una hemoglobinopatía, el cual método comprende identificar un paciente que tiene una hemoglobinopatía caracterizada por una afinidad reducida de la hemoglobina del paciente por el oxígeno en comparación con la afinidad por el oxígeno de Hb-A normal; y poner en contacto una porción de los eritrocitos del paciente ex vivo o in situ con una cantidad terapéuticamente efectiva de NO.
30. 30. El método de la reivindicación 29, donde la hemoglobinopatía es la enfermedad de células falciformes.
31. 31. El método de la reivindicación 30, donde, antes del paso de poner en contacto, el paciente es diagnosticado como sufriendo de una crisis de células falciformes.
32. 32. El método de la reivindicación 29, donde dicho NO está en forma gaseosa, y pasa a través de la membrana permeable a gases antes de poner en contacto dicha porción de los eritroci-tos del paciente.
33. 33. Un método de tratar un paciente identificado como teniendo una hemoglobinopatía, el cual método comprende identificar un paciente que tiene una hemoglobinopatía caracterizada por una afinidad reducida de la hemoglobina del paciente por el oxígeno en comparación con la afinidad por el oxígeno de Hb-A normal; y proveer un gas terapéutico para inhalación por parte del paciente, donde el gas terapéutico comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de CO gaseoso.
34. 34. El método de la reivindicación 33, donde la inhalación del gas terapéutico por parte del paciente produce 2-10% de carboxi-Hb en la sangre del paciente.
35. 35. El método de la reivindicación 33, donde el CO tiene una concentración de 1 a 10,000 ppm en el gas terapéutico.
36. 36. Un método de reducir la polimerización de hemoglobina de células falciformes (Hb-S) en un paciente, que comprende identificar un paciente cuyos eritrocitos comprenden Hb-S; y proveer un gas terapéutico para inhalación por parte del paciente, donde el gas terapéutico comprende una cantidad de NO gaseoso suficiente para reducir la polimerización de Hb-S en los eritrocitos del paciente.
37. 37. El método de la reivindicación 36, done el gas terapéutico contiene NO a una concentración de al menos 1 ppm.
38. 38. El método de la reivindicación 36, donde el gas terapéutico contiene NO a una concentración de al menos 10 ppm.
39. 39. El método de la reivindicación 36, donde el gas terapéutico contiene NO a una concentración de 40-2,000 ppm.
40. 40. El método de la reivindicación 36, donde el gas terapéutico es provisto al paciente por al menos 10 segundos.
41. 41. El método de la reivindicación 36, donde el gas terapéutico es provisto al paciente por al menos 5 minutos.
42. 42. El método de la reivindicación 36, donde el gas terapéutico provisto para inhalación comprende además oxígeno, el oxígeno estando en contacto con el NO en el gas terapéutico por menos de alrededor de 10 minutos antes de inhalación del gas terapéutico por parte del paciente.
43. 43. El método de la reivindicación 36, donde antes del paso de proveer gas terapéutico, el paciente es identificado como estando en el riesgo de incurrir una crisis de células falciformes .
44. 44. El método de la reivindicación 36, comprendiendo además supervisar la concentración de NO en el gas terapéutico.
45. 45. El método de la reivindicación 36, comprendiendo además supervisar la concentración de N02 en el gas terapéutico.
46. 46. El método de la reivindicación 36, donde el gas terapéutico es expuesto a un despojador de N02 antes de proveer el gas terapéutico para inhalación por parte del paciente.
47. 47. El método de la reivindicación 36, donde el gas terapéutico comprende no mas de 5 ppm de N02.
48. 48. El método de la reivindicación 36, donde la concentración de NO en el gas terapéutico es de 1 a 2,000 ppm, y el gas terapéutico es provisto al paciente al menos una vez al día por al menos diez días consecutivos.
49. 49. El método de la reivindicación 36, donde el gas terapéutico es provisto al paciente mientras el paciente está siendo sometido a cirugía, o dentro de una hora antes o después de cirugía.
50. 50. El método de la reivindicación 1, donde la concen-tración de NO en el gas terapéutico es de entre alrededor de 10 y alrededor de 100 ppm.
51. 51. El método de la reivindicación 1, donde la concentración de NO en el gas terapéutico es de entre alrededor de 40 y alrededor de 100 ppm.
52. 52. El método de la reivindicación 1, donde la concentración de NO en el gas terapéutico es de alrededor de 80 ppm, y el gas terapéutico es provisto al paciente por al menos un período de 45 minutos.