MXPA98008070A

MXPA98008070A - Polipeptidos novedosos portadores de ubiquitina selectivos de ciclina

Info

Publication number: MXPA98008070A
Application number: MXPA/A/1998/008070A
Authority: MX
Inventors: V Rudderman Joan; Hershko Avram; W Kirschner Marc; Townsley Fiona; Aristarkov Alexander; Eytan Esther; Yu Hongtao
Original assignee: President And Fellows Of Harvard College
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1998-09-30
Publication date: 2000-06-01

Abstract

Se describen polipéptidos novedosos portadores de ubiquitina humana y de almeja, implicados en la ubiquitinación de ciclinas A y/o B;también se describen inhibidores de polipéptidos,ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos e inhibidores, anticuerpos específicos para dichos polipéptidos, y métodos de su uso.

Description

t POLIPEPTIDOS NOVEDOSOS PORTADORES DE UBIQUITINA SELECTIVOS DE CICLINA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la regulación del ciclo de las células. Más específicamente, esta invención se refiere a polipéptidos portadores de ubiquitina (Ubc) , novedosos, involucrados en la ubiquitinación y degradación de ciclinas, y al ácido nucleico que codifica esas proteínas. Esta invención se refiere también a inhibidores de dichos Ubc y a equipos y métodos para depurar compuestos que inhiban la ubiquitinación A. y, por consiguiente, la destrucción de las ciclinas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La entrada y la salida mitóticas en la mayoría de los ^ organismos son controladas por la síntesis y la destrucción de ciclina B, una subunidad reguladora positiva de la proteína cinasa Cdc2 , el componente catalítico del factor promotor de mitosis (MPF) (Norbury y coautores (1992), Apn, Rev. Biochem. , 61: -441-470; Murray (1995) Cell 81: 149-152) . Las ciclinas son marcadas para su destrucción por la adición covalente de ubiquitina al final de la mitosis (Glotzer y coautores (1991) Nature 349: 132-138; Hershko y coautores (1991), J". Biol . Chem. , 266: 16374-16379; Hershko y coautores (1994), J". Biol .

Chem. , 269 : 4940-4946) . Luego se degradan rápidamente las ciclinas . ubiquitinadas por la proteasoma 26S (Hershko y coautores (1994), J. Biol . Chem . , 269: 4940-4946). Se cataliza este procedimiento por medio de una ligasa de ubiquitina específica para la ciclina, E3-C, que es parte de una partícula 20S, el ciclosoma (Sudakin y coautores (1995), Mol . Biol . Cell . , 6 : 185-198) . Se inicia la activación del ciclosoma mediante Cdc2 (Félix y coautores (1990) Nature 346: 370-382; Sudakin y coautores (1995) Mol . Biol . Cell . , 6 : 185-198) y terminada mediante la fosfatasa sensible al ácido okadaico (Lahav-Baratz y coautores (1995) Proc . Nat . Acad. Sci . , USA, en prensa) . Esta partícula contiene homólogos de dos proteínas de levadura, Cdcl6 y Cdc27 (King y coautores (1995) Cell 81: 279-288) , proteínas necesarias para la destrucción de la ciclina B y la transición de metafase-anafase (Tugendreich y coautores (1995) Cell 81: 261-268; Irniger y coautores (1995) Cell 81: 269-277) . E3-C, asociado al ciclosoma, cataliza la ubiquitinación de . la ciclina, utilizando una enzima conjugadora de ubiquitina, especializada, o proteína portadora (E2) ; también denominada Ubc, identificada originalmente como E2-C (Hershko y coautores (1994), J. Biol . Chem. , 269 : 4940-4946). Se encontró primero especies múltiples e E2 en células de animales (Pickart y coautores (1985) J. Biol . Chem. , 260: 1573-1581) y se ha identificado ahora por lo menos diez diferentes Ubc en levaduras (Jentsch (1992) Ann. Rev. Genetics, 26: 179-207).

Estructuralmente, todos los E2 conocidos comparten un dominio conservado de aproximadamente 16 kD. Este dominio ^^ contiene el residuo cisteína (Cys) necesario para la formación del éster tiol de ubiquitina-E2. Ciertas enzimas E2 contienen 5 dominios típicos adicionales. Con base en su estructura, se puede dividir las enzimas E2 en tres grupos (Jentsch (1992) Ann . Rev. Genet . , 26: 170-207)). Los E2 de clase I consisten casi exclusivamente del dominio conservado. Las proteínas de clase II tienen extensiones del terminal C que pueden contribuir al reconocimiento del substrato o a la localización ^ celular. Por ejemplo, las levaduras Ubc2 y Ubc3 tienen un dominio C-terminal fuertemente ácido que promueve la interacción con los substratos básicos, tales como las histonas v (Jentsch (1992), Ann. Rev. Genet . 26: 179-207)). Las enzimas 15 de clase III tienen diversas extensiones N-terminales ; sin embargo, no se sabe su función. El análisis genético y molecular ha revelado que diferentes Ubc tienen diferentes funciones celulares. Dos Ubc íntimamente relacionadas, Ubc4 y Ubc5, parecen ser responsables de la degradación dependiente de la ubiquitina en la mayoría de las proteínas de vida corta y anormales (Jentsch (1992) Ann. Rev. Genetics 26 : 179-207). Ubc2 (RAD6) es necesaria para varias funciones, incluyendo la reparación del ADN, la esporulación (Sung y coautores (1988) Genes & Dev. , 2: 1476- 5 1485) y degradación de la regla de extremo N (Dohmen y coautores (1991) Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 88: 7351-7355).

Ubc3 (Cdc34) es necesaria para la transición Gl/S (Goebl y coautores (1988) Science 241: 1331-1335) en donde parece participar en la destrucción dependiente de la ubiquitina, del inhibidor de cinasa dependiente de la ciclina Gl (cdk) , p40sl (Schwob y coautores (1994) Cell , 79: 233-244). Ubc9 es necesaria para la progresión del ciclo de la célula en G2 tardío o M temprano; tanto CLB5, una ciclina de fase C, como CLB2 , una ciclina de fase M, son estables en mutantes Ubc9, lo que sugiere que Ubc9 puede ser responsable de la ubiquitinación de ciclina (Seufert y coautores (1995) Nature, 373: 78-81). Se determinó que E2-C, una Ubc de almeja era uno de los componentes del sistema de oocitos de almeja, responsable de la ubiquitinación específica de la ciclina (Hershko y coautores (1994), J. Biol . Chem. , 269: 4940-4946. Sin embargo, hasta ahora, las Ubc responsables de la ubiquitinación de las ciclinas mitóticas en humanos, no estaban identificadas ni caracterizadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto que tanto la almeja como los humanos tienen polipéptidos portadores de ubiquitina novedosos, selectivos a la ciclina, que están involucrados en la ubiquitinación de proteínas y en la degradación de proteínas dirigida por ubiquitina. Estos descubrimientos han sido explotados para desarrollar la presente invención, que está dirigida a polipéptidos portadores de ubiquitina, humanos y de almeja, y sus inhibidores, a ácidos nucleicos que codifican dichos j^ polipéptidos, y a métodos que emplean los polipéptidos portadores de ubiquitina y a los inhibidores . 5 En un primer aspecto, la invención provee un polipéptido portador de ubiquitina (Ubc), sin xenopal, aislado y purificado, involucrado en la ubiquitinación de la ciclina A y/o B. Tal como se usa aquí, el término "aislado y purificado" se refiere a los polipéptidos que están f) sustancialmente libres de componentes celulares contaminantes u otros componentes asociados que incluyen, pero sin limitación a ellas, las impurezas proteináceas, de carbohidrato o lípidas. Este término significa también que abarca moléculas que son homogéneas por una o más características de pureza o de homogeneidad, usadas por los expertos en la materia. Por ejemplo, un Ubc aislado y purificado mostrará características constantes y reproducibles dentro de las desviaciones experimentales comunes y corrientes para parámetros tales como 0 el peso molecular, la migración cromatográfica, la composición de aminoácidos, el perfil de HPLC, la actividad biológica y otros parámetros semejantes. El término de ninguna manera excluye las mezclas artificiales y sintéticas de los Ubc con otros compuestos . 5 El término "sin xenopal" se refiere a los Ubc que no son derivados de célula de rana ni están codificados por ácido nucleico de rana. Tal como se usa en la presente, el término "involucrado en" significa "que toma parte en" y se pretende que abarque el papel que juega, o la función que tiene un Ubc durante la ubiquitinación de la ciclina A y/o B. Este papel incluye una actividad enzimática necesaria para transportar la ubiquitina a ciclina A o B. La "extensión N-terminal específica para Ubc) , a la que se hace referencia en este aspecto de la invención se usa para describir una secuencia única (fuera del dominio conservado) de aminoácido de cuando f menos 5, o de preferencia por lo menos 10, más preferible, por lo menos 15, mejor aún, al menos 20, muy preferible al menos , lo que más se prefiere, entre 30 y 32 residuos de *' aminoácido, que tienen homología de secuencia con la(s) secuencia (s) única (s) de aminoácidos encontradas en E2-C de almeja, UbcHIO humano y Ubc-x de rana. En algunas modalidades se produce de manera recombinante el Ubc. En otras modalidades se provee fragmentos del Ubc que son enzimáticamente activos y demuestran la misma 20 función o sustancialmente similar en el polipéptido portador de ubiquitina, que en el Ubc de longitud completa. Tal como se usa aquí, un "fragmento" de una molécula, tal como E2-C, UbcHIO o sus inhibidores, se refiere a cualquier subserie de polipéptido menor que la de la molécula. En algunas 25 modalidades, el Ubc es de almeja o Ubc humano. En algunas modalidades, el Ubc tiene una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 61-100%, , mejor aún, alrededor de 75-100% y, muy preferible, alrededor de 94-100% de homología, con la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 1 o 3. Por "homología" se quiere decir la identidad o similitud de secuencia. Por similitud se quiere decir el grado en que cambia el aminoácido de acuerdo con las sustituciones conservadoras de aminoácidos ejemplificadas en el cuadro 1 que sigue.

CUADRO 1 Residuo original Sustituciones ejemplares Ala Gly; Ser Arg Lys Asn Gln; His Asp Gly Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Ala; Pro His Asn; Gln He Leu; Val Leu He; Val Lys Arg; Gln; Glu Met Leu; Tyr; He Phe Met; Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe Val He; Leu En modalidades particulares, el Ubc tiene la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 1 O 3. En otras modalidades adicionales, se codifica el polipéptido mediante un ácido nucleico hibridable con un segundo ácido nucleico señalado como SEQ ID NO: 2 o 4. De preferencia se ^P codifica el polipéptido mediante un ácido nucleico hibridable bajo condiciones estrictas con un segundo ácido nucleico que tiene SEQ ID NO: 2 o 4. Las condiciones de hibridación * estrictas son conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausebel y coautores, Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, E. U. A. (1989) ; hibridación en 50% de formamida, elevado contenido de sal (ya sea 5X SSC (20X: 3 M de NaCl/0.3 M de citrato de trisodio) o 5X SSPE (20X: 3.6 M de NaCl/0.2 M de NaH2PO4/0.02 M de EDTA, pH 7.7)), solución* 5X de Denhardt y 1% de SDS), baja rigurosidad, temperatura ambiente; rigurosidad moderada, 42°C y rigurosidad elevada, 68 °C. En algunas modalidades, la extensión N-terminal tiene alrededor de 61 a 100% de homología, de preferencia 75 a 100% y, más preferible, tiene alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID No. 9 o 10.

En las modalidades particulares, la extensión N-terminal tiene la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 9 o 10. En otras modalidades adicionales se codifica la extensión N- terminal mediante un ácido nucleico hibridable, de preferencia 5 bajo condiciones estrictas o rigurosas, con un segundo ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 9 o 10. En otro aspecto, la invención provee un ácido nucleico que codifica los Ubc y sus fragmentos, de la invención, que se describió arriba. En algunas modalidades, el ácido nucleico es un cADN y en modalidades particulares el cADN tiene la secuencia de nucleótidos señalada como SEQ ID NO: 2 o 4. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la invención * codifica un Ubc humano que tiene una secuencia de aminoácidos con alrededor de 61 a 100% de homología, de preferencia alrededor de 74 a 100% y, más preferible, alrededor de 94 a 100% de homología con la secuencia de aminoácidos señalada como á^ SEQ ID No. 1. En otras modalidades, el ácido nucleico de la invención codifica un Ubc de almeja que tiene una secuencia de aminoácidos con alrededor de 61,-100%, de preferencia alrededor de 75-100% y más preferible alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO. 3.

También está provisto un ácido nucleico hibridable bajo condiciones estrictas o rigurosas, con un segundo ácido 5 nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos señalada como SEQ ID NO : 2 o 4.

En otro aspecto, la presente invención provee un inhibidor selectivo de la función del polipéptido Ubc. Tal como se usa aquí, el término "función de Ubc" se pretende que comprenda la transferencia enzimática de ubiquitina de El a E2 y de E2 a una proteína de destina, por ejemplo, ciclina A o B.

La "función de Ubc" también se refiere a la asociación de E2 y E3. El término "inhibidores de la función de Ubc" se pretende que incluya agentes que bloqueen la transferencia de ubiquitina de El a E2 y los agentes que bloquean la transferencia de ubiquitina de E2 a una proteína de destino, por ejemplo, ciclina A o B. Tal como se usa aquí, se pretende que "inhibidores de la función de Ubc" también incluya los agentes que bloquean la asociación entre E2 y E3. Todos esos agentes s previenen la ubiquitinación de la ciclina. Se prefiere que el agente sea un inhibidor selectivo de la función de Ubc, más preferible, en donde el Ubc se selecciona del grupo que consiste de E2-C de almeja, UbcHIO humano y un fragmento flfc enzi áticamente activo de ellos. Los análisis adecuados para medir la función de Ubc, de acuerdo con la presente invención, incluyen aquellos que permiten la medición de la formación del éster tiol de E-2-ubiquitina, medición de la formación de conjugados de ubiquitina o de multi-ubiquitina de una ciclina, o la medición de la degradación de ciclina. Los análisis que permiten la medición de la progresión o avance del ciclo de las células también pueden ser usados de acuerdo con la presente invención.

Los agentes depurados en los métodos de análisis descritos más arriba pueden ser, pero sin limitación a ellos: péptidos, polipéptidos, anticuerpos, carbohidratos, derivados de vitamina u otros agentes farmacéuticos. Estos agentes 5 pueden ser seleccionados y depurados 1) en una selección aleatoria 2) mediante selección racional o 3) mediante diseño utilizando, por ejemplo, técnicas de modelo de proteína o de ligando. Para discriminación aleatoria, se selecciona agentes tales como péptidos, carbohidratos, agentes farmacéuticos y similares, aleatoriamente y se los analiza en cuanto a su capacidad para unirse a, o bloquear la actividad del Ubc. Alternativamente, los agentes pueden ser seleccionados B racionalmente o diseñados. Tal como se usa aquí, se dice que un agente es "seleccionado racionalmente o diseñado" cuando el agente es escogido con base en la configuración del Ubc anteriormente descrito, o del ligando conocido. tk La presente invención se refiere además a inhibidores selectivos de la función de Ubc o de la ubiquitinación de ciclina, identificada por los métodos de depuración y análisis descritos más atrás, que pueden incluir péptidos, polipéptidos, anticuerpos, carbohidratos, derivados de vitamina u otros agentes farmacéuticos. En una modalidad, el inhibidor es un mutante dominante negativo de una proteína portadora de ubiquitina o un fragmento de la misma, capaz de inhibir la función de Ubc. Tal como se describió con anterioridad, y como se ejemplifica más adelante, un mutante de UbcHIO que contiene una mutación de cisteína/seria en el residuo 114, es un mutante dominante negativo. El mutante dominante negativo vencen la actividad del UbcHIO de tipo silvestre e inhibe la 5 ubiquitinación de la ciclina y su degradación. Tal como se usa en la presente, un "inhibidor selectivo" es un compuesto que, de preferencia, interfiere con la función de Ubc. Se prefiere que el inhibidor selectivo reduzca la función enzimática de los Ubc novedosos de la invención. En algunas modalidades, el inhibidor es un mutante dominante negativo. Tal como se usa aquí, un "mutante dominante negativo" es una variante de polipéptido de un Ubc de tipo silvestre, con el que compite o interfiere con su función c portadora de ubiquitina. Los mutantes dominantes negativos de los Ubc novedosos de la invención inhiben el avance del ciclo de la célula, bloqueando tanto la destrucción de las ciclinas mitóticas A y B, como el inicio de la anafase . En algunas modalidades se produce de manera recombinante el mutante • negativo dominante. En otras modalidades, los mutantes dominantes negativos de la invención tienen un residuo de serie en lugar de un residuo de cisteína en una región conservada del polipéptido. En las modalidades específicas, el mutante negativo dominante de la invención comprende un residuo de serina en la posición 114 en sustitución de un residuo de cisteína. En algunas modalidades, el mutante dominante negativo inhibe la función de un Ubc humano o de almeja. El mutante negativo dominante tiene una secuencia de aminoácidos con alrededor de 61 a 100%, de preferencia alrededor de 75 a 100% y, mejor aún, alrededor de 94-100% de homología hacia la secuencia de aminoácidos señalada en SEQ ID NO: 5 o 7 en 5 algunas modalidades. En otras modalidades, el mutante dominante negativo es codificado por un ácido nucleico hibridable bajo condiciones estrictas con un segundo ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos señalada como SEQ ID NO: 6 u 8. En otras modalidades más, la invención provee un fragmento del mutante dominante negativo que inhibe la función de Ubc . La invención provee también un ácido nucleico que codifica el mutante dominante negativo descrito en la presente. c En algunas modalidades, el ácido nucleico es hibridable bajo condiciones estrictas con un segundo ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos señalada como SEA ID NO: 6 u 8. El ácido nucleico puede ser un cADN que, en algunas modalidades fe tiene la secuencia de nucleótidos señalada como SEQ ID NO: 6 u 8. En otras modalidades, el ácido nucleico de la invención codifica un mutante dominante negativo que tiene una secuencia de aminoácidos con homología de alrededor de 61 a 100%, de preferencia alrededor de 75-100%, y más preferible, alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 5 o 7. 25 También están provistos por la presente invención equipos útiles para la ubiquitinación y degradación de una ciclina. Estos equipos incluyen: (a) un complejo de ubiquitina-polipéptido portador de ubiquitina humana, en donde ?^ el polipéptido portador de ubiquitina es un Ubc sin xenopal, aislado, y purificado, involucrado en la ubiquitinación de 5 ciclina A y/o B, y que tiene una extensión N-terminal, específica para Ubc. En las modalidades preferidas, el Ubc es E2-C de almeja, UbcHIO humano o un fragmento enzimáticamente activo de E2-C de almeja o de UbcHIO; y (b) una ubiquitina- ligasa (E3) . 10 En algunas modalidades, la ciclina que va a ser degradada es ciclina A o ciclina B, y el complejo de ubiquitina-polipéptido portador de ubiquitina comprende UbcHIO s humano que tiene una secuencia de aminoácidos señalada como SEQ £ ID NO: 1. En otra modalidad, la ciclina que va a ser degradada 15 es ciclina A o ciclina B, y el complejo de ubiquitina- polipéptido portador de ubiquitina comprende E2-C de almeja que tiene una secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO. 3. En algunas modalidades, el complejo de ubiquitina-proteína portadora de ubiquitina comprende un Ubc que tiene una 20 secuencia de aminoácidos con alrededor de 61-100%, de preferencia alrededor de 75-100%, y más preferible, alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO. 1 o 3. En modalidades particulares, el Ubc en el complejo tiene la secuencia de aminoácidos 25 señalada como SEQ ID NO: 1 O 3. En otras modalidades más, el Ubc en el complejo es codificado por un ácido nucleico hibridable bajo condiciones estrictas con un segundo ácido nucleico señalado como SEQ ID NO : 2 o 4. En algunas modalidades, "el Ubc tiene una extensión N-terminal que tiene alrededor de 61-100%, de preferencia alrededor de 75-100%, más preferible alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácido señalada como SEQ ID NO: 9 o 10. En las modalidades particulares, el Ubc en el complejo tiene una extensión N-terminal con una secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 9 o 10. En otro aspecto, la invención provee otros equipos útiles para la ubiquitinación y degradación de una ciclina, incluyendo la ubiquitina, una enzima activadora de ubiquitina (El) , ATP, una proteína portadora de ubiquitina, seleccionada del grupo que consiste de E2-C de almeja, UbcHIO humano y un fragmento enzimáticamente activo de los mismos, y una ubiquitina-ligasa (E3) . En algunas modalidades, la ciclina que va a ser degradada es ciclina A o ciclina B y el complejo de ubiquitina-proteína portadora de ubiquitina comprende UbcHIO humano que tiene una secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 1. En otras modalidades, la ciclina que va a ser degradada es ciclina A y/o ciclina B y el complejo de ubiquitina-proteína portadora de ubiquitina comprende E2-C de almeja que tiene una secuencia de aminoácido señalada como SEQ ID NO: 3. La invención provee también un método de ubiquitinación de una ciclina y/o de determinación como destino de una ciclina para degradación, que comprende el paso de poner en contacto la ciclina con un complejo de ubiquitina-proteína portadora de ubiquitina; siendo el polipéptido portador de ubiquitina un Ubc sin xenopal, aislado y purificado, en la ubiquitinación de la ciclina A y/o B, y que tiene una extensión N-terminal específica para Ubc, y una ubiquitina-ligasa (E3). En modalidades preferidas, el Ubc está seleccionado del grupo que consiste de E2-C de almeja, UbcHIO humano y un fragmento enzimáticamente activo del mismo. En algunas modalidades, el complejo de ubiquitina-proteína portadora de ubiquitina comprende un Ubc que tiene una secuencia de aminoácidos con alrededor de 61-100%, de preferencia alrededor de 75-100%, mejor aún, alrededor de 94-100% de homología, con la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 1 o 3. En las modalidades particulares, el Ubc en el complejo tiene la secuencia de aminoácido señalada como SEQ ID NO: 1 o 3. En otras modalidades más, el Ubc en el complejo es codificado por un ácido nucleico hibridable bajo condiciones estrictas con un segundo ácido nucleico señalado como SEQ ID NO: 2 o 4. En algunas modalidades, el Ubc tiene una extensión N-terminal que tiene alrededor de 61-100% y, mejor aún, alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 9 o 10. En modalidades particulares, el Ubc en el complejo tiene una extensión N-terminal con una secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 9 o 10. Un método para inhibir la función de Ubc también está provisto por la invención. En una modalidad, se administra un inhibidor de un Ubc a la célula, en una cantidad suficiente para inhibir la función de Ubc, por ejemplo, inhibiendo la ubiquitinación de una ciclina. En las modalidades preferidas, el inhibidor es un mutante dominante negativo de acuerdo con la invención y como se describe más atrás . En algunas modalidades, el Ubc es un E2-C de almeja mutante. En otras modalidades, el Ubc es un UbcHIO humano mutante. En algunas modalidades, el mutante dominante negativo es producido de manera recombinante. En modalidades específicas, el mutante mm dominante negativo de la invención comprende un residuo serina en la posición 114, n sustitución de un residuo de cisteína.

En algunas modalidades el mutante negativo dominante inhibe la fc función de un Ubc humano o de almeja. El mutante dominante negativo tiene una secuencia de aminoácidos con alrededor de 61-100%, mejor aún, alrededor de 75-100% y, muy preferible, alrededor de 94-100%, de homología con la secuencia de < aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 5 o 7, en algunas modalidades. En otras modalidades, el mutante dominante negativo es codificado mediante un ácido nucleico hibridable bajo condiciones estrictas con un segundo ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos señalada como SEQ ID NO: 6 u 8. En otras modalidades adicionales, la invención provee un fragmento del mutante dominante negativo que inhibe la función de Ubc. En una modalidad preferida, el método para inhibir la función de Ubc da por resultado la inhibición de la proliferación de células. La presente invención se refiere adicionalmente a un método para depurar compuestos que inhiban la función de Ubc. En este método se provee un análisis para medir la función de 5 Ubc, en donde el análisis comprende un polipéptido portador e ubiquitina, seleccionado del grupo que consiste de un polipéptido portador de ubiquitina sin xenopal, involucrado en la ubiquitinación de ciclina A y/o B y que tiene una extensión N-terminal específica para Ubc, y un fragmento enzimáticamente 10 activo del mismo. Se efectúa el análisis en presencia y ^^ ausencia de un compuesto que va a ser probado. La cantidad de cambio en la función de Ubc, medida en presencia del compuesto, en comparación con la función de Ubc medida en ausencia del • compuesto, es determinada entonces; indicando una reducción en la función de Ubc medida en presencia del compuesto, que el compuesto es un inhibidor de la función de Ubc. En las modalidades preferidas, el polipéptido portador de ubiquitina es seleccionado del grupo que consiste de E2-C de almeja, UbcHIO humano, y un fragmento enzimáticamente activo del mismo. 20 Más preferible, el polipéptido portador de ubiquitina es aislado y purificado. En otro aspecto, la invención provee un método para depurar los compuestos que inhiben la ubiquitinación de ciclinas. En este método, la ubiquitina, una enzima activadora de ubiquitina (El) , ATP, un Ubc aislado y purificado, sin xenopal, involucrado en la ubiquitinación de ciclina A y/o B, y que tiene una extensión N-terminal específico para Ubc, una ubiquitina-ligasa (E3), Cdc2 y una ciclina, son incubados en presencia y en ausencia de un compuesto que va a ser probado. La cantidad del complejo de ciclina-ubiquitina-complejo Cdc2 , formado en presencia y en ausencia del compuesto, se mide entonces y una reducción en la cantidad de complejo formado en presencia del compuesto indica que el compuesto es un inhibidor de la ubiquitinación de ciclina. Tal como se usa aquí, el término "complejo de ciclina-ubiquitina-Cdc2 " se refiere a ubiquitina covalentemente unida a ciclina B formada a complejo con Cdc2. En las modalidades preferidas, el Ubc es seleccionado del grupo que consiste de almeja E2-C de almeja, UbcHIO humana o una porción enzimáticamente activa de ellas. De preferencia, el polipéptido portador de ubiquitina es aislado y purificado. En algunas modalidades el UbcHIO humano o E2-C de almeja tiene una secuencia de aminoácido con alrededor de 61-100%, de preferencia alrededor de 75-100% y, más preferible, alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 1 o 3, respectivamente. En modalidades particulares, UbcHIO y E2-C tienen las secuencias de aminoácidos señaladas como SEQ ID NO: 1 y 3, respectivamente. ' En otras modalidades adicionales, UbcHIO y E2-C son codificados por un ácido nucleico hibridable bajo condiciones estrictas, con un segundo ácido nucleico señalado como SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente. En algunas modalidades, UbcHIO tiene una extensión N-terminal que tiene alrededor de 61-100%, de preferencia alrededor de 75-100% y, mejor aún, alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 9 y E2-C tiene una extensión N-terminal que tiene alrededor de 61-100%, de preferencia alrededor de 75-100%, y más preferible, alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 10. En modalidades particulares, la extensión N-terminal de UbcHIO y E2-C tiene la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 9 y 10, respectivamente. También están provistos pro la invención anticuerpos específicos para E2-C y para UbcHIO, y oligonucleótidos de sentido contrario, específicos para ácidos nucleicos de E2-C o UbcHIO. En otro aspecto más, la invención provee formulaciones terapéuticas que comprenden un inhibidor selectivo de la función de proteína portadora de ubiquitina, en una cantidad suficiente para inhibir la ubiquitinación de una ciclina y un portador farmacéuticamente aceptable. En modalidades preferidas, el inhibidor comprende un mutante negativo dominante de una proteína portadora de ubiquitina, o un fragmento de la misma, capaz de inhibir la función Ubc. En algunas modalidades, el mutante negativo dominante tiene un residuo serina en la posición 114, en sustitución de un residuo cisteína. En modalidades particulares, el mutante dominante negativo tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos alrededor de 90-95% de homología con la secuencia de aminoácidos señalada como SEQ ID NO: 5 o 7. En otras modalidades, el mutante negativo está codificado por un ácido nucleico que es hibridable bajo condiciones estrictas con el 5 ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos señalada como SEQ ID NO : 6 u 8.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los objetivos anteriores y otros de la presente fl) invención, sus diversos aspectos, así como la propia invención, podrán ser comprendidos mejor a partir de la siguiente descripción, cuando se lea conjuntamente con los dibujos que van anexos, en los cuales: 15 La figura 1 es una representación diagramática de la trayectoria de ubiquitina-proteasoma para la degradación de la proteína. fl La figura 2 es una representación diagramática de la trayectoria de ubiquitina-proteasoma para la degradación de 20 ciclina B. La figura 3 es una representación diagramática del involucramiento de varias ciclinas, durante el ciclo de la célula. La figura 4 es una representación esquemática de la secuencia de nucleótidos del cADN de E2-C de almeja (SEQ ID NO: 4) y la secuencia de sus aminoácidos deducida (SEQ ID NO : 3); en donde los cuatro péptidos obtenidos por microsecuenciación están subrayados . La figura 5A es una secuencia de nucleótidos del cADN de UbcHIO humano (SEQ ID NO: 2) y la secuencia de sus aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 1) . La figura 5B es una representación esquemática de la comparación de la proteína E2-C de almeja con la proteína UbcHIO humana. La figura 6 es una representación de un gel de poliacrilamida que ilustra la purificación por afinidad covalente del oocito E2-C 'de almeja, en donde el corredor 1 contiene el pico de E2-C de la columna El de Mono S, y MgATP; el corredor 2 contiene el pico de E2-C y MgATP; el corredor 3 contiene El y MgATP; y la actividad de E2-C en esas fracciones está expresada como el porcentaje de la actividad de E2-C total, aplicada a perlas de ubiquitina-Sepharose. La figura 7A es una representación de un gel de poliacrilamida de fracciones de filtración de E2-C purificado por afinidad, en donde "Cont." se refiere a la contaminación en la preparación de 125I-ciclina, "Cyc" se refiere a 125I-ciclina libre y los marcadores de masa molecular están indicados a la derecha . La figura 7B es una representación de un gel de poliacrilamida de fracciones de filtración en gel de E2-C purificado por afinidad, en donde "Cont." se refiere a la contaminación en la preparación de 125I-ubiquitina; "El-Ub", "E2-C-Ub" y "E2-A-Ub" indican las posiciones de los correspondientes aductos, y los marcadores de masa molecular están indicados a la derecha. La figura 8 es una representación de un gel de poliacrilamida que ilustra la formación de tioléster entre ubiquitina y .E2-C expresado bacterianamente, en donde las muestras fueron puestas a ebullición con 5% de mercaptoetanol durante 5 minutos ("+Me") o no fueron tratadas ("-M?") antes de la electroforesis; los números a la izquierda indican la posición de las proteínas marcadoras de masa molecular, "El-Ub", "E2-C-Ub", "E2A-Ub" indican la posición de los correspondientes aductos de ubiquitina-enzima, y "*" indica la posición del aducto que igra mas rápido de E2-C con x"I-ub?qu?tina. La figura 9A es una representación de un gel de poliacrilamida que muestra la actividad de diferentes Ubc en la ligación de ¿3I-c?clma a ubiquitma, en donde la fracción 1 es una preparación de E3-C activado, purificado mediante filtración en gel en Superose-6; los números a la izquierda indican la posición de los marcadores de masa molecular, y "Cyc" indica la posición de -"-^-"I-ciclina libre. La figura 9B es una representación de un gel de poliacrilamida que muestra la capacidad de diferentes E2-C para ligar 125?-ubiguitina a proteínas, en donde "E2-C-UB" denota la posición de producto de autoubiquitinación de E2-C y los números a la derecha indican la posición de proteínas marcadoras de masa molecular.

La figura 10 es una representación gráfica de la hidrofilicidad de E2-C de almeja. La figura 11 es una representación diagramática de diversos mutantes de E2-C y su actividad enzimática en análisis 5 in vitro de ciclinaubiquitinación, que incluyen el E2-C dominante negativo. La figura 12A es una representación gráfica de la capacidad de diferentes concentraciones del mutante E2-C C (114) S para inhibir la ligación de 125I-ciclina a ubiquitina, 10 en presencia de E2-C de tipo silvestre. ^ La figura 12B es una representación gráfica que ilustra la capacidad del mutante E2-C C(114)*S para ser inhibidor competitivo de la ubiquitinación de ciclina. La figura 12C es una representación gráfica que ilustra que la competencia entre el E2-C de tipo silvestre y el inhibidor dominante negativo E2-C-C(114)S no involucra los aminoácidos 1-21 de la región N-terminal de E2-C. A La figura 13A es una representación gráfica de la capacidad de UbcHIO humano y E2-C de almeja para estimular la ligación de ciclina-ubiquitina. La figura 13B es una representación gráfica de la capacidad del mutante recombinante humano UbcH10-C(114) S para actuar como un inhibidor dominante negativo de la ubiquitinación dependiente de ciclina. 25 La figura 13C es una representación gráfica de la inhibición de la ligación de ciclina-ubiquitina por los mutantes C(114)S de UbcHIO humano, en donde el UbcHIO recombinante fue añadido a las concentraciones indicadas, en ausencia ( ° , control) o presencia (°) del mutante C(114)S (1 µM) . 5 La figura 13D es una representación de un autorradiograma que demuestra los efectos de los mutantes UbcC(114)S humano y de almeja, sobre la degradación de la ciclina B de almeja. La figura 13E es una representación de un autorradiograma que muestra la inversión de los efectos de los ^ mutantes Ubc C(114)S humano y de almeja (mostrados en la figura 13D) mediante Ubc humano de tipo silvestre, en donde se añadió los polipéptidos a las concentraciones indicadas. * La figura 14 es una representación diagramática de construcciones E2-C de almeja y UbcHIO humano, y su actividad enzimática en análisis in vitro de ciclina-ubiquitina. La figura 15A es una representación diagramática del plásmido pUHD15-l, usado de manera novedosa para expresar genes de tipo silvestre y mutantes de UbcHIO en células de mamífero, 20 in vivo. La figura 15B es una representación diagramática del plásmido pUHD10-3 usado para la expresión dependiente de tTA de los genes de tipo silvestre y mutantes de UbcHIO, en células de mamífero, in vivo. 25 La figura 16A es una representación esquemática de la secuencia de nucleótidos del cADN de mutante dominante negativo humano UbcHIO C(114S (SEQ ID NO: 5) y su secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 6) . La figura 16B es una representación esquemática de la secuencia de nucleótidos del cADN de mutante dominante negativo 5 E2-C C(114)S de almeja (SEQ ID NO : 7) y su secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 8); y La figura 17 es una representación de un autorradiograma que muestra el incremento de la destrucción de ciclina A y B humanas por la adición de UbcHIO y que muestra el 10 bloqueo de esa destrucción por UbcHIO C(114)S.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La literatura de patentes y la científica a la que se hace referencia en la presente, establece el conocimiento que está disponible para los expertos en la materia. Las patentes estadounidenses expedidas, las solicitudes concedidas, las fl) solicitudes extranjeras publicadas y las referencias citadas aquí, quedan incorporadas en la presente mediante la referencia. En las células eucarióticas, muchas proteínas celulares son destruidas usando la trayectoria que depende de la ubiquitina y del proteasoma. Se conoce cuatro actividades de enzima en esta trayectoria: El (enzima activadora de ubiquitina) , E2 (también denominada proteína portadora de ubiquitina o Ubc) , E3 (también denominada ubiquitina-ligasa) y el proteasoma (un complejo de proteasa multicatalítico grande) . Estas se encuentran ilustradas en la figura 1. Tal como se muestra en la figura 2, la adición de ubiquitina a las ciclinas mitóticas ocurre únicamente durante un periodo breve cerca del extremo de la mitosis. Al comienzo de mitosis, los complejos de ciclinas mitóticas con la proteína-cinasa Cdc2 queda activada. Los complejos de ciclina mitótica/Cdc2 catalizan entonces la entrada en la mitosis. Cerca del final de la mitosis, el complejo de ciclosoma/promotor de anafase (APC) queda activado durante un periodo breve. El ciclosoma/APC cataliza la transferencia de ubiquitina de E2-C o UbcHIO a la proteína ciclina de destino. Luego se reconoce la ciclina ubiquitinada y es proteolizada por el proteasoma. Esto da por resultado la liberación de Cdc2 monomérico, inactivo, la complementación de la mitosis y la salida de la fase M a la fase Gl del siguiente ciclo de la célula, tal como se muestra en la figura 3. Las actividades de enzima E2/Ubc y E3 son responsables de reconocimiento de las proteínas de destino específicas que van a ser ubiquitinadas . Los estudios genéticos y bioquímicos en levadura, humanos y otros organismos, han identificado diferentes miembros de la familia E2/Ubc, pero no se conoce ninguno responsable de E2/Ubc para la ubiquitinación de las ciclinas mitóticas A o B. La presente invención está dirigida a los E2/Ubc responsables de la ubiquitinación de las ciclinas mitóticas A o B. Estos E2/Ubc son polipéptidos portadores de ubiquitina, sin xenopal, implicados en la ubiquitinación de ciclina A y/o B, y que tienen una extensión N-terminal, específica para Ubc. Pueden ser aislados y purificados, por ejemplo, a partir de fuentes naturales, o pueden ser sintetizados bioquímica o recombinantemente . Los polipéptidos E2-C o, UbcHIO de esta invención pueden ser purificados a partir de material biológico. Por ejemplo, se puede purificar E2-C de almeja a partir de oocitos de almeja, como se describe en los ejemplos más adelante. Alternativamente, esas proteínas pueden ser obtenidas mediante expresión del ADN recombinante, tal como se describe más adelante . Las secuencias de ADN que codifican E2-C y UbcHIO son derivadas de una variedad de fuentes . Esas fuentes incluyen ADN genómico, cADN, ADN sintético y sus combinaciones. Por ejemplo, se puede extraer ADN genómico de UbcHIO humano y se lo puede purificar de cualquier célula o tejido humano, y se puede extraer el ADN de E2-C de almeja de oocitos de almeja, o de cualquier célula o tejido de almeja, por medios conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook y coautores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . En los humanos, dicho ADN genómico puede ser obtenido en asociación con la región promotora 5 ' de las secuencias de genes UbcHIO y/o con la región de terminación translacional 3 ' . Adicionalmente, se puede obtener dicho ADN genómico en asociación con las secuencias de ADN que codifican la región no trasladada 5 ' del mARN de UbcHIO y/o con las g—^ secuencias genéticas que codifican la región no trasladada 3 ' . En la medida en que una célula anfitriona pueda reconocer las 5 señales reguladoras de transcripción y/o de translación, asociadas con la expresión del mARN y de la proteína, las regiones no transcritas 5 ' y/o 3 ' del gene natural y/o las regiones no trasladadas 5 ' y/o 3 ' del mARN pueden ser retenidas y empleadas para la regulación de transcripción y de translación. ^ Alternativamente, se puede aislar el mARN de UbcHIO o E2-C de cualquier célula que exprese UbcHIO o E2-C y se lo puede usar para producir cADN por medios bien conocidos en la "•" técnica (por ejemplo, véase Sambrook y coautores, supra) . De preferencia, la preparación de mARN usada enriquecerá en mARN que codifica Ubc, ya sea naturalmente, por aislamiento de células que producen cantidades grandes de Ubc o in vitro, mediante las técnicas usadas comúnmente para enriquecer las preparaciones de mARN para secuencias específicas, tales como 0 la centrifugación con gradiente de sacarosa, o ambas. Se puede obtener mARN de Ubc de tejido y células e mamífero o de líneas de células derivadas de ellos. Para clonar a un vector, se rompe aleatoriamente o se divide enzimáticamente preparaciones adecuadas de ADN (ya sea 5 genómico o cADN) , respectivamente, y se liga a vectores apropiados para formar un banco de genes recombinantes (genómicos o de cADN) . Se puede insertar una secuencia de ADN que codifique Ubc en un vector, de acuerdo con técnicas convencionales, que incluyen extremos de terminación roma o extremos de terminación escalonada para ligación, digestión con enzima de restricción para proveer extremos apropiados, relleno en extremos coherentes cuando sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable, y ligación con ligasas apropiadas . Las técnicas para esa manipulación están descritas en Sambrook y coautores, supra, y son bien conocidas en este arte. Los bancos que contienen clones Ubc pueden ser depurados y se puede identificar los clones de Ubc mediante cualquier medio que seleccione específicamente el ADN de Ubc tal como, por ejemplo: 1) mediante hibridación con una o más sondas de ácido nucleico apropiadas que contienen una secuencia específica para el ADN de esta proteína; o 2) por análisis translacional seleccionado por hibridación, en donde el mARN natural se hibrida al clon en cuestión, es trasladado in vitro y se caracteriza adícionalmente a los productos de translación; o 3) si las secuencias de ADN clonadas son por sí mismas capaces de expresar el mARN, mediante inmunoprecipitación de un producto Ubc trasladado, producido por el anfitrión que contiene el clon. Alternativamente, se puede preparar un banco de cADN en el vector Mgtll y se lo puede depurar usando anticuerpos específicos para Ubc (Huynh y coautores, Constructing and Screening cDNA Librarles in Mgtl O and Mgtll , en DNA Cloning: A Practical Approach, tomo I, Glover, D. M. (Ed.) IRL Press, Washington, D. C. , páginas 49-78 (1985)). Las sondas de oligonucleótido específicas para- Ubc, 5 que pueden ser usadas para identificar los clones para esta proteína, pueden estar diseñadas a partir del conocimiento de la secuencia de aminoácidos del Ubc correspondiente. Por ejemplo, la secuencia de dichas sondas oligonucleótidas puede basarse en la secuencia de aminoácidos del fragmento de péptido. fl Usando el código genético, se puede identificar uno o más oligonucleótidos, cada uno de los cuales sería capaz de codificar polipéptidos de Ubc. El oligonucleótido, o la serie de oligonucleótidos, que contienen una secuencia muy probablemente capaz de identificar los fragmentos de secuencia de gene Ubc se usa para identificar la secuencia de una serie complementaria de oligonucleótidos, que es capaz de hibridar a la secuencia o serie de secuencias. Una secuencia de oligonucleótido que contiene dicha secuencia complementaria, 0 puede ser empleada como sonda para identificar y aislar la secuencia de genes de Ubc aislados (por ejemplo, véase Sambrook y coautores, supra) . El oligonucleótido adecuado, o serie de oligonucleótidos, puede ser sintetizado por medios bien 5 conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y coautores, supra) . Las técnicas de hibridación de ácido nucleico y la identificación de clones están descritas en Sambrook y coautores, supra. Aquellos miembros del banco de ^ genes descrito más arriba, que se encontraron capaces de dicha hibridación, son analizados entonces para determinar el grado y 5 la naturaleza de las secuencias codificadoras de Ubc que contienen. A fin de caracterizar adicionalmente las secuencias de ADN que codifican Ubc, y a fin de producir la proteína recombinante, se expresa las secuencias de ADN. Esas secuencias son capaces de expresar un polipéptido, si contienen las secuencias de control de expresión "operablemente enlazadas" a la secuencia de nucleótido que codifica la proteína. Las secuencias de control contienen la información * reguladora de transcripción y dichas secuencias. 15 Las células anfitrionas procarióticas recombinantes pueden expresar el polipéptido Ubc. Alternativamente, se puede expresar Ubc recombinante por dichas células, como una proteína de fusión. Las células anfitrionas procarióticas, útiles, son E. coli y B. subtilis. La presente invención comprende también la expresión de Ubc en. células eucarióticas y especialmente células de mamíferos, de insectos y de levadura. Los anfitriones eucarióticos preferidos son las células de mamífero que proveen modificaciones post-translacionales a Ubc recombinante, incluyendo plegamiento y/o fosforilación. Las células anfitrionas de mamífero, útiles, incluyen las células de ovarios de hámster chino, las células de pituitaria de rata, las células HeLa y las células de hepatoma de rata. La secuencia codificadora de la proteína Ubc y un promotor enlazado operablemente pueden ser introducidos en las células eucarióticas, ya sea como una molécula de ADN (o ARN) que no se reproduce, que puede ser una molécula lineal o, más preferible, una molécula circular covalente, cerrada. De preferencia, se incorpora la secuencia introducida en un vector plásmido o viral, capaz de reproducción autónoma en el anfitrión receptor. 10 Por ejemplo, E2-C de almeja fue purificado primero ^P parcialmente mediante cromatografía por cambio de cationes y luego se sometió a cromatografía por afinidad covalente en ubiquitina-Sepharose . En presencia de El y MgATP, los E2 se * unen a ubiquitina inmovilizada mediante enlazamiento con tioléster; luego se puede eluir las enzimas unidas a ubiquitina con concentraciones elevadas de DTT o elevando el pH (Hershko y coautores (1983) J. Biol . Chem. , 258: 8206-8214). En el experimento mostrado en la figura 6, se mezcló perlas de ubiquitina-Sepharose con tres clases de mezclas. La mezcla completa contenía el pico de E2-C de la columna Mono S, El purificado de eritrocitos humanos y MgATP; los otros dos fueron controles, que carecían de El o de la fuente de E2-C. La fracción no adsorbida en ubiquitina-Sepharose ("que fluye a través de") fue recogida y después de lavado extensivo de las perlas, se eluyó las enzimas unidas a ubiquitina-Sepharose con regulador pH 9 que contenía 5 mM de DTT. Los análisis cuantitativos de la actividad de E2-C en estas fracciones (figura 6, panel inferior) mostraron que en la mezcla completa, virtualmente la totalidad de la actividad de E2-C fue adsorbida a ubiquitina-Sepharose (retirada de la porción que fluye a 5 través de ella, y se recuperó en el eluado a pH 9. En contraste, cuando se omitió El no hubo actividad importante de E2-C en el eluado a pH 9, y la mayor parte de la actividad de enzima permaneció en la porción que fluye a través de ella. Este resultado muestra que unir E2-C a ubiquitina-Sepharose hizo necesario un proceso de transferencia de tioléster mediado por El. La composición de proteína de los eluados a pH 9 de estos tratamientos, fue examinada por electroforesis en SDS-gel * de poliacrilamida y teñido con plata. Tal como se muestra en la figura 6 (panel superior) , el eluado a pH 9 de la mezcla completa de reacción (corredor 1) contenía varias bandas de proteína. Estas incluyen una proteína de alrededor de 105 kD, fe identificada como El (que se une a la columna de ubiquitina y es eluada a pH 9 - (Ciechanover y coautores (1982) J". Biol . 0 Chem. , 257: 2537-2542)), varias bandas en la escala de 45-105 kD que son los productos divididos de El (Ciechanover y coautores (1982) . Biol . Chem. , 257: 2537-2542) y dos bandas de alrededor de 21 kD y 16 kD. Las últimas dos proteínas fueron identificadas tentativamente como E2-C y E2-A, 5 respectivamente, con base en las siguientes consideraciones. Primero, están presentes tanto E2-C como E2-A en las fracciones 21-23 de la columna de Mono S usada para la purificación por afinidad, de modo que se espera que ambas se unan a las perlas ^^ de ubiquitina bajo las condiciones empleadas. En segundo lugar, ambas proteínas están ausentes del eluado de pH 9 del 5 control que carece de El (figura 6, corredor 2) , lo que indica que ambas son E2. En tercer lugar, también estuvieron ausentes en el control que contiene El, pero que carece de la fuente de E2-C (figura 6, corredor 3), lo que indica que las dos bandas de ajo peso molecular no se derivan de alguna contaminación de 0 la preparación de El usada para cromatografía por afinidad ^ covalente. Por otra parte, las bandas de mayor peso molecular en la región de 45-105 kD son derivadas de El (figura 6, corredores 2 y 3) . Los tamaños moleculares esperados de los * aductos de E2-C y E2-A con ubiquitina (8.5 kD) son alrededor de 5 29.5 kD y 24.5 kD, respectivamente; estos son mayores que los observados para sus tiolésteres putativos (alrededor de 27 kD y 18 kD) . Para examinar adicionalmente la identidad de E2-C putativo, se sometió el eluado a pH 9 de la preparación 0 purificada sobre ubiquitina-Sepharose, a filtración en gel sobre Superose-12. La actividad de E2-C (determinada por el análisis de ligación de ciclina-ubiquitina) eluido principalmente en las fracciones 33-34 (figura 7A) , fue coincidente con la banda de ubiquitina-tioléster de 27 kD 5 (figura 7B) . Se separó parcialmente del tioléster de E2-A- ubiquitina, de 18 kD, que eluyó a un tamaño inferior durante la filtración en gel (figura 7B) . De esa manera, el aducto de 27 kD que migra de manera anómala, es el tioléster de ubiquitina _^ de la proteína E2-C de 21 kD. Con base en esa identificación, se seleccionó el E2-C 5 de 21 kD para la microsecuenciación. El material que se origina de 100 mi del extracto de oocito de almeja fue procesado mediante los pasos de Mono S y ubiquitina-Sepharose descritos anteriormente y se digirió la banda de 21 kD son tripsina. Se obtuvo secuencias de cuatro péptidos trípticos, como se muestra en la figura 4 (secuencias subrayadas) . Un flfe sensibilizador oligonucleótido degenerado, que corresponde al segundo péptido fue diseñado y luego se juntó con un sensibilizador Mgt22 para depurar un banco de cADN de ovario de almeja, utilizando RCP, tal como se describe en los siguientes ejemplos. Se obtuvo un clon de cADN de longitud parcial que contenía secuencias correspondientes a tres de los cuatro péptidos, y se lo usó para seleccionar varios clones candidato á_^ que codificaban E2-C de longitud completa. En ellos, se identificó la primera secuencia de péptido en la región N- 20 terminal (figura 4) . Se encontró la misma secuencia codificadora en otros clones de cADN aislados independientemente . La secuencia obtenida (SEQ ID NO: 4) contiene únicamente un marco de lectura abierto grande, que se inicia en el primer codón de metionina (figura 4) . El tamaño del producto de translación supuesto es de 20 kD, en buena coincidencia con el tamaño del E2-C observado por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. La proteína codificada es claramente un E2, como lo demuestra por su alineación extensiva con otros Ubc clonados. El E2-C de almeja no parece ser un homólogo de Ubc2 , puesto que los Ubc2 de las diferentes especies muestran similitudes de secuencia muy superiormente conservadas dentro de la familia (-70%) . La secuencia de almeja contiene una extensión N-terminal de 30-32 aminoácidos, novedosa, que no se encuentra en ningún otro Ubc, además del de rana y del humano. Otras regiones únicas ^P incluyen la secuencia adyacente que comienza en la posición 42 (TLLMSGD) y una extensión C-terminal corta (KYKTAQSDK) . Estos aspectos indican que E2-C representa un Ubc novedoso. Para demostrar de manera concluyente que este Ubc de almeja novedoso es realmente E2-C, se expresó la proteína recombinante y se lo comparó. Se subclonó la región codificadora en un vector de expresión bacteriano PT7-7, se mm^ indujo la proteína y se analizó un lisato crudo en dos formas diferentes . Primero se examinó la capacidad de la proteína recombinante para formar aductos de tioléster con 25i- ubiquitina (figura 8A y 8B) . Para comparación se separó en el mismo gel tiolésteres de ubiquitina de una mezcla de E2-C y E2- A naturales . La proteína recombinante formó un aducto con ubiquitina. La movilidad electroforética del tioléster de ubiquitina del E2 recombinante fue idéntica a la del aducto de 27 kD con E2-C natural (figura 8, corredores 2 y 3) . Además, se observó una especie menor de un aducto de ubiquitina que migró más rápidamente, de la proteína recombinante (marcado *) (figura 8, corredor 3) . Este puede ser un producto de desprendimiento o, más probable, un conformador desnaturalizado incompletamente del tioléster de E2-C/ubiquitina. Se había observado previamente múltiples bandas de tiolésteres con algunos otros E2 , y se las había atribuido a las condiciones de desnaturalización incompletas necesarias para el mantenimiento del enlace lábil de tioléster durante la electroforesis (Haas y coautores (1988), J. Biol . Chem, 263: 13258-13267; Sullivan y p coautores (1991) J. Biol . Chem. , 266: 23878-23885). Que estos dos aductos son tiolésteres está indicado por la observación de que son abolidos casi por completo al ebullir con 2- mercaptoetanol (figura 8, "+ Me") . Persiste una cantidad pequeña de derivado de mayor peso molecular después de la ebullición con mercaptoetanol (figura 4, corredores 4 y 5) .

Este, presumiblemente, es un producto de "auto-ubiquitinación" a * (formación de ligadura amida entre la ubiquitina y un residuo lisina del E2) , observado previamente in vitro con algunos E2 pero no con otros (Banerjee y coautores (1993) J". Biol . Chem. , 268: 5668-5675) . Tiene lugar una auto-ubiquitinacióin similar con E2-C naturales y recombinantes. La capacidad del E2 recombinante para promover la ligación ciclina-ubiquitina fue probada en presencia de complejos activados, parcialmente purificados, de E3- C/ciclosoma. Tal como se muestra en las figuras 9A y 9B, el E2 recombinante promovió eficientemente este proceso, en comparación con la acción de E2-C natural. El E2 recombinante estimuló la ubiquitinación de ciclina a concentraciones notablemente bajas: se obtuvo activación media-máxima con 005 µM de E2 recombinante . Puesto que se había informado que Ubc4 puede soportar la ubiquitinación de ciclina B en un extracto de huevo de Xenopus (King y coautores (1995) Cell , 81:279-288), la actividad de un homólogo humano recombinante, UbcH5 (Scheffner y coautores (1994), roc. Nat . Acad. Sci . USA, 91:8797-8801) fue probado también. Como se muestra en las figuras 9 a y 9B (corredor 4) , UbcH5 provocó cierto estímulo de la ligación ciclina-ubiquitina mediante el complejo E3-C de almeja/ciclosoma; pero la cantidad de conjugados formada y su tamaño (que refleja el número de moléculas de ubiquitina unido a la ciclina) fue muy inferior al obtenido con la proteína de almeja recombinante. Adicionalmente, en este experimento, había tenido que añadirse la proteína UbcH5 recombinante a una concentración molar 20 veces mayor que E2-C de almeja recombinante. Así pues, por lo menos en el sistema de oocitos de almeja, Ubc4 soporta la ubiquitinación de ciclina mucho menos eficientemente que la nueva proteína Ubc clonada aquí . Para examinar la selectividad de E2-C de almeja recombinante, se comparó la actividad de estos dos E2 sobre la ligación de I-ubiquitma a protemas endógenas de oocito de almeja. La fracción Ia de los oocitos de almeja contiene una ubiquitina-proteína ligasa (E3) "no específica) que se puede separar del complejo de E3-C selectivo para la ciclina/ciclosoma, por su tamaño menor. Este E3 no específico, ^ liga I-ubiquitina a proteínas endógenas en presencia de una mezcla de los E2 de almeja (Sudakin y coautores (1995), Mol . 5 Biol . Cell , 6:185-198) . Los substratos de proteína para ligación de ubiquitina presumiblemente son proteínas de oocito de almeja, presentes en la preparación parcialmente purificada del E3 no específico. Tal como se muestra en las figuras 9a y 9B, UbcH5 estimula fuertemente la ligación de 5I-ubiquitina a 0 conjugados de elevado peso molecular, en presencia de E3 no específico de oocitos de almeja. Este hallazgo indica que el homólogo de Ubc4 humano puede actuar con el E3 de almeja apropiado. La formación de los conjugados de elevado peso molecular necesitó de la adición de UbcH5 y el E3 no 5 específico. En contraste, el E2 de almeja recombinante no tuvo influencia importante sobre la formación de conjugados de ubiquitina-proteína mediante el E3 no específico (figura 9B, corredor 3) . El único aducto estable formado en presencia del E2-C de almeja recombinante, es un producto de auto-0 ubiquitinación de 30 kD. La formación de ese producto no necesita de la presencia del E3 no específico. La cantidad del producto es mayor en las figuras 9a y 9B que en las figuras 4a y 4B, debido al tiempo de incubación más prolongado. Su tamaño aparente de 30 kD en las condiciones de desnaturalización de la 5 electroforesis en gel se acerca a la esperada para el aducto de E2 recombinante-ubiquitina (29.5 kD) . Un producto de auto- ubiquitinación similar, con E2-C natural, está mostrado con una mezcla de E2-C y E2-A naturales (figuras 9A y 9B, corredor 2) . En este aso, se ve cierta formación de conjugados e ubiquitina- proteína de elevado peso molecular. Esto se debe 5 presumiblemente a la acción de E2-A, que se había encontrado previamente que coincidía con una actividad de ubiquitinación no específica (Herschko y coautores, (1994) J". Biol . Chem. , 269: 4940-4946) . De tal manera, mediante el criterio de la carencia de su acción con un E3 no específico, el E2-C de almeja recombinante es selectivo para el sistema de ciclina- ^P ubiquitinación. Consecuentemente, el clon de cADN descrito aquí codifica el E2-C selectivo para la ciclina, que es responsable de la ubiquitinación selectiva a la etapa del ciclo de célula, y la destrucción de las ciclinas mitóticas A y B.

En resumen, estos experimentos proveen la primera identificación, clonación, secuencia y análisis in vitro de un E2 (E2-C) que muestra elevada selectividad para la ciclina B O± mitótica, un regulador clave de la proteína cinasa Cdc2, que controla la entrada y la salida de mitosis (fase M) del ciclo de división de la célula en todos los eucariotes . En los embriones de almeja, E2-C también funciona en la ubiquitinación de la ciclina A. En células somáticas de vertebrados (incluyendo los humanos) y otros organismos, se necesita la ciclina A para que entre en la fase S (síntesis de ADN) y en la fase M (mitosis) . Las comparaciones de la secuencia de E2-C con la de otros Ubc muestra que el E2-C es un Ubc novedoso y revela la presencia de varios dominios de secuencia únicos, que incluyen una extensión N-terminal e 32 aminoácidos, que no se ve en ningún otro Ubc de la familia; una región de 7 aminoácidos inmediatamente corriente arriba de esa extensión y 5 una extensión corta C-terminal. E2-C de almeja tiene una homología de secuencia de 65% con el Ubc-x de rana correspondiente . La proteína E2-C recombinante exhibe especificidades similares a las que observadas con E2-C natural. Se demostró que la proteína recombinante era responsable de la i ubiquitinación sumamente selectiva de las ciclinas mitóticas durante el ciclo de la célula. En contraste, la proteína recombinante Ubc4 no funciona bien en los análisis de ubiquitinación de ciclina, ni cuando se provee a niveles 20 veces mayores que E2C. Estos resultados establecen que E2-C es un Ubc novedoso, selectivo para la ciclina. Para detectar proteínas que interactúan con E2-C, se ^ ha construido una inserción de "sitio PKA" que contiene la proteína E2-C de almeja entre Ser2 y Gly3 en el extremo N, confirmada por secuencia y expresada como proteína (véase la figura 14) . El sitio PKA es una región de 5 aminoácidos (arg- arg-ala-ser-val) que, cuando está presente en una proteína recombinante, puede ser fosforilada in vitro por la proteína cinasa A (PKA) , lo que produce una proteína marcada con 32P, que puede ser usada como reactivo para detectar proteínas que interactúan con E2-C.

Las secuencias de aminoácido y de ácido nucleico que distinguen a UbcHIO de otras proteínas portadoras de ubiquitina humanas y de otro tipo (y, por consiguiente, que son reactivos específicos para UbcHIO' o E2-C potenciales, útiles) , están mostradas a continuación en el cuadro 2.

CUADRO 2 (1) Aminoácidos 3-32: S Q N R D P V A TCC CAÁ AAC CGC GAC CCA GCC GCC ACT AGC GTC GCC A R K G A E P S G G A A GCC GCC CGT AAA GGA GCT GAG CCG AGC GGG GGC GCC A R G P V G GCC CGG GGT CCG GTG GGC (2) Aminoácidos 43-48: M M S G D K ATG ATG TCT GGC GAT AAA (3) Aminoácidos 77-79: L R Y _ CTG AGG TAT (4) Aminoácidos 91-93 Y N A TAC AAT GCG (5) Aminoácidos 108-110 D T Q GAC ACC CAG (6) Aminoácidos 124-127: A L Y D GCC CTG TAT GAT (7) Aminoácidos 158-167: N P T A F K K Y L Q AAC CCC AC GCT TTT AAG AAG TAC CTG CA (8) Aminoácidos 171-179: S K Q V T S Q E P TCA AAG CAG GTC ACC AGC CAG GAG CCC Un equivalente humano de E2-C de almeja, UbcHIO, también fue identificado en una depuración de un banco de cADN de células HeLa humanas. Se clonó esta proteína y se secuenció según se describe en los ejemplos que vienen después. La secuencia de cADN resultante (SEQ ID NO: 2) y la secuencia de proteína correspondiente (SEQ ID NO: 1) están mostradas en la figura 5. Se identificó esta proteína como el homólogo E2-C por alineación con la secuencia de E2-C de almeja. Este Ubc tiene una similitud de secuencia de 80% con Ubc-x de rana y 61% de homología de secuencia con E2-C de almeja. UbcHIO y HsRad6A, los miembros de la familia Ubc humanos más íntimamente relacionados, tienen una homología e secuencia de 41%. HsRad6A tiene una variante de . secuencia activa con 94% de homología de secuencia con WT. De igual manera, las variantes de Ubc de almeja y humano que tienen alrededor de 61-100%, de preferencia alrededor de 75-100% y, muy preferible, alrededor de 94-100% de homología de secuencia con sus contrapartes de tipo silvestre, es de esperar que tengan funciones de ubiquitinación.

La similitud funcional de UbcHIO humana con E2-C de almeja está mostrada en la figura 2. Tanto E2-C de almeja como el homólogo humano UbcHIO, funcionan con una actividad E3 especializada que reside en una partícula 2OS denominada el ciclosoma en las almejas, o el APC en ranas, humanos y levadura . E2-C de almeja y UbcHIO humano también comparten una extensión N-terminal de 2 aminoácidos que también es conservada en Ubc-x de rana. Las secuencias de aminoácido de esas extensiones N-terminales, derivadas de sus cADN respectivos están señaladas a continuación en el cuadro 3.

CUADRO 3 Secuencia de aminoácidos SEO ID NO: Humano : MASQNRDPAATSVAAARKGAEPSGGAARGPVG de almeja: MSGQNIDPAANQVRQKERPRDMTTSKERHSVS 10 El análisis de mutación de E2-C de almeja demuestra que la eliminación de los primeros 21 aminoácidos de la extensión N-terminal novedosa no interfiere significativamente con la capacidad de E2-C de efectuar la ubiquitinación de la ciclina B, cuando se juzga mediante el análisis de ubiquitinación de ciclina in vitro (figura 12C) . La eliminación de la extensión N-terminal da por resultado un E2-C con actividad media baja, lo que indica que la región es importante para alguna parte de la reacción de ubiquitinación de ciclina (véase la figura 14) . 5 Por ejemplo, esa extensión puede ser un dominio responsable de la localización tridimensional correcta de la proteína en la célula, una localización que podría llevarla cerca de las proteínas de destino importantes. Esa información espacial no se mantendría, al menos necesariamente, en los experimentos que utilizan extractos de células . ^_ La identificación de la extensión N-terminal conservada, novedosa, en UbcHIO de almeja y humano, permite el uso de esa extensión, así como toda la secuencia E2-C, para * usarla en depuraciones para proteínas de interacción y para la investigación de los mecanismos moleculares mediante los cuales se usa UbcHIO para la ubiquitinación presumida y la proteólisis subsecuente de las ciclinas, y posiblemente otras proteínas ^^ reguladoras del ciclo de las células . La presente invención también está dirigida a fragmentos enzimáticamente activos de los Ubc novedosos e la invención que pueden ser obtenidos, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante división proteolítica de la proteína Ubc purificada. Dichos fragmentos enzimáticamente activos retienen su función Ubc. La metodología descrita en la patente estadounidense 5,384,255 puede efectuarse para preparar dichos fragmentos. Las proteasas representativas, útiles en la preparación de fragmentos, incluyen: tripsina, quimiotripsina, papaína y proteasa V8 de Staphylococcus aureus . Las condiciones para la división proteolítica de una proteína son bien conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede efectuar la digestión tríptica: 1) disolviendo el Ubc a una concentración entre 2 y 10 mg/ml en bicarbonato de amonio. 0.2 M; 2) añadiendo una solución recién preparada de tripsina (tripsina bovina tratada con DCC) a una concentración de 1 mg/ml en agua, lo que da una razón enzimática final de tripsina/Ubc de 1:50; y 3) mezclando la muestra e incubando a ^fe 37°C durante 48 horas (Gooderham en Methods in Molecular Biology, tomó 1: Proteins, J. M. Walker (Ed.), Humana Press, Clinton, NJ, E.U.A., páginas 179-192 (1984)). * Un digesto proteolítico de Ubc puede ser fraccionado mediante una variedad de técnicas. Por ejemplo, se puede fraccionar un digesto proteolítico de Ubc mediante SDS-PAGE y se puede recuperar los fragmentos a partir del gel mediante em electroelución ( Current Protocols in Molecular Biology, Asubel y otros (Eds.), John Wiley & Sons, New York, páginas 10.5.1-20 10.5.5 (1987)) . Alternativamente, el cromatoenfoque y la cromatografía de interacción hidrófoba proveen purificación rápida con elevada recuperación y mínima desnaturalización, que pueden ocurrir durante SDS-PAGE (Id., en páginas 10.14.1-10.15- 9) . También se puede purificar fragmentos de Ubc a partir del material biológico producido de manera recombinante como se describió antes .

Se puede analizar rutinariamente Ubc y fragmentos de Ubc para la actividad enzimática usando los análisis aquí descritos. Por ejemplo, E2-C, UbcHIO y sus fragmentos, pueden ser probados en cuanto a su capacidad para promover la formación de conjugados de ubiquitina-proteína en presencia de El y E3 (ejemplo 2a) y en cuanto a su capacidad para formar esteres de I-ubiquitina-tiol (ejemplo 2B) . Tal como se describe más adelante, se puede usar Ubc aislado y purificado para generar anticuerpos específicos para Ubc que, a su vez, pueden ser usados para detectar Ubc en una £fe muestra biológica, y para inhibir la actividad de la enzima Ubc tanto en instalaciones comerciales como clínicas. Dicho Ubc purificado puede ser aislado de tejidos o puede ser obtenido * usando tecnología de ADN recombinante, como se describe más adelante. El Ubc purificado también puede ser usado para identificar una ligasa de proteína E3 , en una muestra biológica. Por ejemplo, se puede identificar E3 determinando • si la muestra biológica promueve la formación de conjugados de ubiquitina-proteína en presencia de El y Ubc purificado (véase el ejemplo 2a) . Además, se puede usar el Ubc purificado para construir una columna de afinidad a Ubc, usando técnicas bien conocidas (véase Affini ty Chromatography : A Practical Approach, Dean y otros (Eds.) IRL Press, Washington, D. C. E. U.

A. (1985) ) . Dicha columna de afinidad para Ubc puede ser usada, por ejemplo, para unir la enzima E3 de una muestra biológica, tal como se describió en la patente estadounidense No. 5,384,255. Los fragmentos enzimáticamente activos de E2-C o UbcHIO también pueden ser usados para generar anticuerpos que son específicos para dominios particulares de la enzima Ubc. Adicionalmente, se puede usar dichos fragmentos de Ubc para inhibir la ubiquitinación dependiente de Ubc, de las proteínas. Por ejemplo, se puede usar las técnicas descritas más atrás para preparar fragmentos de Ubc que contengan el dominio necesario para formar el éster tiol de ubiquitina-Ubc, pero que carezcan del dominio que reconoce la enzima E3. La introducción de dicho fragmento de Ubc en una célula inhibiría la ubiquitinación al disminuir la transferencia de ubiquitina a E3. Esos fragmentos de Ubc pueden ser introducidos en células cultivadas o se los puede administrar terapéuticamente, tal como se describe para- usos comerciales y terapéuticos de anticuerpos de Ubc, respectivamente. Además, se puede usar Ubc purificado para depurar los inhibidores de la actividad enzimática de Ubc in vitro. Por ejemplo, se puede determinar la capacidad de una sustancia para inhibir la actividad portadora de ubiquitina de un Ubc, observando la inhibición de la formación dependiente de Ubc de los esteres tiol de en presencia de la sustancia de prueba, observando la inhibición de la formación dependiente de Ubc de los conjugados de ubiquitina-proteína en presencia de El, E3 y de la sustancia de prueba, tal como se describe en los ejemplos que vienen más adelante. Alternativamente, se puede usar células cultivadas para la depuración rápida de un inhibidor de Ubc. Por ejemplo, se puede efectuar dicha depuración rápida introduciendo la sustancia de prueba en células cultivadas, en donde se sabe que las células ' cultivadas degradas al menos una proteína identificada, a través de la trayectoria dependiente de Ubc. Se muestra una inhibición de la degradación dependiente de Ubc por la acumulación de la proteína identificada dentro de las células cultivadas. Los análisis de mutación de E2-C de almeja y UbcHIO humano demuestran que el reemplazo de diversos aminoácidos en las secuencias con otros aminoácidos, pueden dar por resultado la formación de un Ubc que funcione como un inhibidor negativo dominante de la función de Ubc de tipo silvestre. Para la expresión de los genes UbcHIO mutantes en células humanas (véase más abajo) fue necesario marcar con epítope las proteínas E2-C recombinantes, de tal manera que .se pueda distinguir su expresión de la del gene UbcHIO endógeno en la línea de células seleccionada. Se usó RCP para añadir la secuencia DTYRYI al extremo C y al extremo N de UbcHIO de tipo silvestre y a los mutantes UbcHIO C(114)S, UbcHIO C(114)s y L(118)S. DTYRYI forma el epítope para el anticuerpo monoclonal Babeo de ratón AU1 obtenible en el comercio (No. de catálogo MMS130R) , Richmond, CA. E. U. A. ) . Este anticuerpo es efectivo para la inmunofluorescencia, el inmunomanchado y la inmunoprecipitación. El sensibilizador usado para añadir la secuencia debe codificar también sitios de restricción adecuados para la clonación subsecuente en vectores de expresión bacterianos y de célula de mamíferos. Las figuras 16A y 16B muestran el cADN y las secuencias de aminoácidos correspondientes e dos mutantes negativos dominantes en humano y almeja, respectivamente. Esos mutantes, al cambiar la cisteína catalítica a serina en la posición 114 ("C(114)S") crea un Ubc que es un inhibidor de E2- C de tipo silvestre o función UbcHIO, cuando se juzga por el análisis de ubiquitinación de ciclina in vitrs, descrito en la presente y mostrado en las figuras 12a-12B. En ese análisis, se incubó 125I-ciclina B con E2-C natural y diferentes concentraciones de la proteína mutante E2-C C(114)S y la preparación de E3C/ciclosoma, y se analizó en cuanto a la ubiquitinación de ciclina, como se describe más adelante en los ejemplos. Los resultados representativos mostrados en la figura 13a demuestran que UbcHIO de tipo silvestre cataliza in vitro la ubiquitinación de ciclina, mientras que UbcHIO C(114)S actúa como dominante negativo in vitro (figura 13B) . En otros análisis se añadió una cantidad constante de proteína mutante y cantidades cada vez mayores de E2-C de tipo silvestre o mutante por omisión E2-C/\l-21. Los resultados representativos están mostrados en la figura 12C. Esos resultados demuestran que UbcHIO C(114)S bloquea la destrucción mediada por ubiquitina de la ciclina B . Esas proteínas mutantes dominantes negativas son reactivos valiosos para interferir con la destrucción de ciclinas mitóticas, otras _ ciclinas y otras proteínas del ciclo de las células, cuyo nivel es regulado por la proteólisis mediada por ubiquitina. Para probar si los mutantes actúan como inhibidores competitivos o no competitivos de ligación de ciclina-ubiquitina, se examinó una concentración constante (1 µM) del mutante C->S humano a niveles incrementantes de UbcHIO humano de tipo silvestre. Tal como se muestra en la figura 13C, 1 µM del mutante C->S inhibió fuertemente la ligación de ciclina-ubiquitina a bajas concentraciones de UbcHIO de tipo silvestre, pero se sobrepuso a la inhibición por concentraciones altas de UbcHIO de tipo silvestre. Esto indica una competición entre UbcHIO de tipo silvestre y mutante, sobre un destino común. También se probó los efectos de los mutantes C(114)S sobre la degradación de la ciclina B de longitud completa, endógena, en extractos crudos de oocitos de almeja, cuando se vigiló mediante inmunomanchado . En la incubación de control, se completó esencialmente la degradación de ciclina B endógena en 30 minutos; la degradación fue bloqueada efectivamente al aumentar las concentraciones de derivados C->S de almeja o humanos (figura 13D) . Como con los componentes purificados, se necesitó un exceso grande del mutante C->S para la inhibición completa de la degradación de ciclina (la concentración de E2-C endógeno en los extractos de almeja es alrededor de 0.5 µM, datos no mostrados) . De manera similar, la inhibición de la degradación de ciclina endógena B por el mutante C->S fue vencida por la adición de exceso de UbcHIO humano, de tipo silvestre (Figura 13E) . Se determinó que UbcHIO C(114)S es un inhibidor 5 negativo dominante del progreso in vivo del ciclo de las células, que bloquea la destrucción de las ciclinas A y B mitóticas, y el inicio de la anafase, de la siguiente manera: Se probó la capacidad del mutante C(114)S para afectar el progreso del ciclo de la célula en células vivas, en dos sistemas diferentes: el ciclo de célula somática de células de cultivo de tejido de mamíferos, y el ciclo de célula embriónica rápido de huevos de rana. Se transfectó células COS con UbcH10_ de tipo silvestre o mutante, marcados con AU1, y 48 fc horas después se vigiló por microscopía la distribución de los transfectantes en interfase frente a mitosis. Se marcó las células transfectadas individuales, identificadas mediante tinción con el anticuerpo AU1, como en interfase (células aplanadas, núcleo intacto, cromatina descondensada) o mitosis • (células redondeadas, sin envoltura nuclear obvia, cromosomas condensados) . Alrededor de 1% de las células transfectadas con WT-UbcHIO estaba en mitosis, similar al 2% visto en cultivos transfectados ficticios. En contraste marcado, cerca del 50% de las células transfectadas con el mutante C(114)S se había acumulado en la mitosis (datos no mostrados) con la mayoría mostrando cromosomas en disposiciones pre-anafásicas . Los inmunomanchados mostraron que el mutant.e C(114)S aumentó grandemente los niveles de ciclina A y B, lo que sugiere la inhibición de su degradación (datos no mostrados) . La inyección de E2-C de almeja dominante en una de las dos células de un embrión de rana de dos células, que se divide, disminuyó la velocidad de la división de la célula (datos no mostrados) . Se recogió los embriones inyectados en las etapas media-tardía de blástula, se las fijó, se las tiñó con Hoechst 33342 y se las aplasta para examinar las extensiones del cromosoma En los embriones inyectados son E2-C de tipo silvestre, los cromosomas en fase M mostraron la siguiente distribución: 40% en pre-metafase, 45% en metafase y 15% en anafase. Los embriones inyectados con E2-C mutante mostraron una reducción contundente en el porcentaje de formaciones de premetafase, acopladas con una acumulación correspondiente de cifras de metafase (datos no mostrados) . El trabajo previo ha establecido que se necesita la destrucción de ciclina para la inactivación de Cdc2 que, a su vez, conduce a la descondensación de cromosoma, el desensamble de huso y la citoquinesia; pero que el inicio de anafase puede proceder independientemente de la destrucción de la ciclina. Los resultados presentados aquí establecen de manera conclusiva que E2-C es necesario para la destrucción de ciclina in vivo, tanto en los ciclos somáticos como en los ciclos de célula embriónico, y que se necesita para un segundo evento, normalmente concurrente, que da por resultado el inicio de la anafase .

También se encontró que UbcHIO C(114)S) bloquea la destrucción mediada por ubiquitina de las ciclinas A y B humanas. El uso del método de Brandéis y Hunt (EMBO J. (1996) 15:5280-5289) para preparar un sistema libre de células humanas, se determinó que UbcHIO de tipo silvestre, recombinante, extra, acelera la proteólisis de ciclina A y B marcada con 35S-metionina, mientras que se encontró que la adición del mutante dominante negativo UbcHIO C(114)S bloqueaba la proteólisis de ciclina A y B (figura 17) . Por supuesto, dado que se conoce la secuencia de otros Ubc (véase, por ejemplo, Wasugie y coautores (1996) Nucleic Acids Res . , 24: 2005), mutantes dominantes negativos de estos Ubc pueden ser producidos reemplazando un residuo cisteína en una región conservada de la secuencia de aminoácidos, con un residuo serina o incluso algún otro residuo de aminoácido. Por ejemplo, el residuo e cisteína en la posición 93 de Ubc9 puede ser reemplazado con un residuo serina. Asimismo, se puede reemplazar un residuo cisteína en las regiones conservadas de cualquiera de Ubc4 , Ubc5, Ubc6, Ubc7o Ubc8, con un residuo serina para crear un mutante dominante negativo. La disponibilidad de un E2-C de almeja dominante negativo y UbcHIO humano permite las investigaciones en la función de E2-C y UbcHIO en la ubiquitinación de otras proteínas durante el ciclo de la célula o en otros procesos fisiológicos. Por ejemplo, dichos estudios determinarán si Ubc funciona sólo como una transición en el ciclo de la célula, es decir, la salida de mitosis a Gl del siguiente ciclo de célula, o si también funciona en las transiciones adicionales del ciclo de la célula y, de hacerlo así, qué otras proteínas son ubiquitinadas usando este Ubc. Para definir las regiones importantes en la interacción entre E2-C de almeja y el resto de la maquinaria de degradación de ciclina, se ha efectuado un análisis mutacional de otras regiones de E2-C. Se ha hecho las construcciones delineadas en la figura 11, confirmadas por la secuenciación de ADN, expresadas como proteínas y probadas en el análisis de ubiquitinación de ciclina in vitro. Tal como se resume en la figura 14, E2-C-/_\169-177, un mutante por omisión que carece de los residuos 169-177, tiene actividad media-baja in vitro, lo que indica que es importante la extensión corta y novedosa C-terminal . E2-C-.A_154-177, un mutante por omisión que carece de los residuos de aminoácido 154-177, secuencias en el dominio común compartido con otros miembros de la familia E2 , tiene también baja actividad. Los inhibidores de la función Ubc, de preferencia los inhibidores selectivos, tales como los mutantes dominantes negativos, pueden ser usados comercialmente, por ejemplo, para bloquear el avance del ciclo de las células, tanto in vitro como in vivo. Así pues, los inhibidores de la función Ubc son útiles para sincronizar o proveer células cultivadas no proliferantes. Esos inhibidores también son útiles para inhibir la degradación de proteínas recombinantes producidas por anfitriones recombinantes . Los Ubc de la invención, así como sus fragmentos • enzimáticamente activos, pueden ser usados en formulaciones terapéuticas, por ejemplo, para el tratamiento de trastornos que dan por resultado la reducción de los Ubc. Los inhibidores de Ubc de la invención, así como sus fragmentos enzimáticamente activos, también pueden ser usados en formulaciones terapéuticas. Los inhibidores tienen utilidad como agentes contra la proliferación, para uso en el tratamiento de ^ enfermedades tales como psoriasis, enfermedades autoinmunológicas y cáncer, en las que la proliferación de las células contribuye a la patología de la enfermedad. Se puede usar agentes anti-proliferación para bloquear la expansión clonal de las células B y de las células T, que reconocen específicamente los autoantígenos, una señal de enfermedad autoinmunológica . Las enfermedades autoinmunológicas que son mm^ tratables con los inhibidores de la función de Ubc o la ubiquitinación de ciclina incluyen, sin limitación a ellas: artritis, esclerosis múltiple, lupus y enfermedad de intestino inflamable . Los inhibidores de la presente invención bloquean la proliferación de células tumorales y tienen utilidad amplia para el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de cánceres tratables con esos agentes incluyen, sin limitación, los cánceres de mama, de próstata, de colon o de pulmón. Las formulaciones terapéuticas de la invención comprenden un inhibidor sel ctivo de la función de Ubc, o un fragmento activo del mismo, en una cantidad suficiente para inhibir .la ubiquitinación de una ciclina, y un portador farmacéuticamente aceptable. Alternativamente, dichas formulaciones pueden contener un Ubc, o un fragmento activo del mismo, en una cantidad suficiente para ubiquitinar una ciclina, y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa aquí, un "portador farmacéutica o fisiológicamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes (incluyendo, pero sin limitación a ella, lactosa) , medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes retardadores isotónicos y de absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto por lo que se refiere a cualquier medio convencional o agente que es incompatible con el ingrediente activo, está contemplado su uso en las composiciones terapéuticas - de la invención. También se puede incorporar ingredientes activos complementarios en las composiciones. Tal como se usa aquí, el término "cantidad terapéuticamente aceptable" significa la cantidad total de cada componente activo de la formulación -farmacéutica o método farmacéutico, que es suficiente para mostrar un beneficio significativo para el sujeto o paciente, es decir, una reducción en la proliferación de las células o el crecimiento del tumor, o en la expresión de proteínas que provocan o caracterizan la enfermedad. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere al ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el ^^ término se refiere a las cantidades combinadas de los 5 ingredientes activos, que darán por resultado el efecto terapéutico, ya sea administradas en combinación, en serie o simultáneamente . Se puede efectuar la administración de composiciones farmacéutica de la invención en una variedad de maneras convencionales, tales como por ingestión oral, administración ?— enteral, rectal o transdérmica, inhalación, administración sublingual o inyección cutánea, subcutánea, intramuscular, infraocular, intraperitoneal o intravenosa, o cualquier otra ruta de administración conocida en la técnica para administrar agentes terapéuticos. Cuando se va a administrar la composición oralmente, subíigualmente o por cualquier otra ruta no inyectable, la m formulación terapéutica de preferencia incluirá un portador fisiológicamente aceptable, tal como un diluyente inerte o un portador comestible asimilable con el que se administra la composición. Las formulaciones adecuadas que incluyen excipientes farmacéuticamente aceptables para introducir compuestos en el torrente sanguíneo mediante rutas diferentes a la inyección, se puede encontrar en Remington ' s Pharmaceutical Sciences (18a edición) (Genarro, ed. (1990) Mack Publishing Co . , Easton, PA, E. U. A. ) . El Ubc, el inhibidor de Ubc o sus fragmentos y otros ingredientes, pueden estar encerrados en cápsulas de gelatina duras o blandas; comprimidos a tabletas o incorporados directamente en la dieta del individuo . ' Se puede incorporar composiciones terapéuticas con excipientes y se las puede usar en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, caramelos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Cuando se administra oralmente la composición terapéutica, puede ser mezclada con otras formas de alimento y con incrementadores de sabor, farmacéuticamente aceptables. Cuando se administra enteralmente la composición terapéutica, se la puede introducir en una forma sólida, semisólida, de suspensión o emulsión, y se puede componer con cualquier número de aditivos farmacéuticamente aceptables, bien conocidos. También están contemplados los , sistemas de suministro oral de liberación sostenida y/o los revestimientos entéricos para formas de dosis administradas oralmente, tales como las descritas en las patentes estadounidenses No. 4,704,295, 4,556,552, 4,309,404 y 4,309,406. Cuando se administra por inyección una cantidad terapéuticamente efectiva de un Ubc, un inhibidor de Ubc o sus fragmentos, de la invención, el Ubc, el inhibidor de Ubc o sus fragmentos de preferencia estarán en la forma de una solución acuosa libre de pirógenos, parenteralmente aceptable. La preparación de dichas soluciones parenteralmente aceptables, que dan debida consideración al pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, está dentro de la experiencia en la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección también debe contener un vehículo isotónico, tal como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyección de ringer lactada u otros vehículos conocidos en la técnica.

La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizadores, conservadores, reguladores, antioxidantes u otros aditivos conocidos por los expertos en la materia. 10 Las formas farmacéuticas adecuadas para uso á—^ inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los „ casos, la forma debe ser estéril. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y pueden ser mantenidas contra la acción contaminadora de microorganismos, tales como bacterias y hongos . El portador puede ser un • solvente o un medio de dispersión. La prevención de la acción de microorganismos puede efectuarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungales . La absorción prolongada de los agentes terapéuticos inyectables puede efectuarse por el uso de las composiciones o agentes que retardan la absorción. Se prepara soluciones inyectables estériles incorporando el Ubc, el inhibidor de Ubc o los fragmentos de Ubc o de inhibidor de Ubc en la cantidad requerida, en el solvente apropiado, y luego la esterilización filtrada.

Se puede administrar la formulación farmacéutica en dosis de bolo, continuas o intermitentes, o en una combinación de dosis continua e intermitente, según lo determine el médico y el grado y/o etapa de enfermedad del paciente. La duración de la terapia usando la composición farmacéutica de la presente invención variará dependiendo de las características únicas del Ubc, del inhibidor de Ubc, o de sus fragmentos, y del efecto terapéutico particular que se deba lograr; de las limitaciones inherentes en la técnica de preparar dicha formulación terapéutica para el tratamiento de humanos, de la severidad de flfc la enfermedad que se está tratando y de la condición y la respuesta idiosincrática potencia de cada paciente individual.

Finalmente, el médico que atiende decidirá la duración * apropiada de la terapia usando la composición farmacéutica de la presente invención. Las composiciones terapéuticas de la invención también incluyen ácidos nucleicos que codifican los Ubc y los ?± inhibidores de Ubc de la invención en la forma de vectores para administración a animales y, más preferible, a mamíferos tales 20 como humanos. Estos vectores pueden ser administrados por medio de técnicas de terapia con genes, tales como las conocidas en el arte (véase, por ejemplo, Miller (1992) , Nature 357:455) . También se dirige la presente invención a la producción y el uso de anticuerpos específicos para Ubc. El término "anticuerpos" se refiere a anticuerpos policlonales, que son poblaciones heterogéneas y a anticuerpos monoclonales, que son poblaciones sustancialmente homogéneas . Se deriva los anticuerpos policlonales de los sueros de animales inmunizados con una preparación antígena. 5 Los anticuerpos monoclonales para antígenos específicos pueden ser obtenidos mediante métodos conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein (1975) Nature 256:496-497; y Harlow y coautores, supra) . Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, que incluye IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y ?k cualquier subclase de ellas. El término "anticuerpo" también se pretende que incluya tanto las moléculas intactas como los fragmentos de las * mismas, tales como, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab')2/ gue sean capaces de unir el antígeno. Se apreciará que Fab, F(ab')2 FV y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención pueden ser usados para la detección y cuantificación m^ de Ubc en una muestra biológica. Dichos fragmentos son producidos típicamente por división proteolítica, usando 0 enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2- Alternativamente, se puede producir dichos fragmentos mediante medios recombinantes . Los anticuerpos dirigidos contra un Ubc, tales como 5 los Ubc novedosos de la invención, pueden ser usados para depurar muestras biológicas en cuanto a la presencia de Ubc .

Los anticuerpos (o sus fragmentos) útiles en la presente invención, son particularmente adecuados para uso en inmunoanálisis in vitro para detectar la presencia de Ubc en una muestra biológica. En dichos inmunoanálisis, los 5 anticuerpos (o los fragmentos de anticuerpo) pueden ser utilizados en fase líquida o unidos a un portador de fase sólida, como se describe más adelante. Un método de depuración para determinar si una muestra biológica contiene Ubc utiliza inmunoanálisis que 10 emplean metodologías de radioinmunoanálisis (RÍA) o de análisis ^t inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA) . Otros métodos de depuración adecuados serán fácilmente aparentes para los expertos en la materia. Alternativamente, se puede marcar detectablemente los 15 anticuerpos específicos para Ubc o un derivado funcional con cualquier marcador adecuado, por ejemplo, un radioisótopo, una enzima una etiqueta fluorescente, una etiqueta paramagnética o g^ un radical libre. Los métodos para formar y detectar dichos anticuerpos 20 marcados detectablemente o sus derivados funcionales, son bien conocidos por los expertos en la materia y están descritos con más detalle después. Los trabajos de referencia normales que señalan los principios generales de inmunología incluyen el trabajo de Eisen (en Microbiology, 3 a edición (Davis y trps . 25 Jarér & Row, Filadelfia (1980)). Alternativamente la presencia de Ubc, tal como los Ubc novedosos de la invención, en una muestra biológica, se puede detectar tratando la muestra biológica con nitrocelulosa u otro soporte sólido que sea capaz de inmovilizar células, partículas de célula o proteínas solubles . Luego se puede lavar el soporte con reguladores adecuados, y a continuación se trata con el anticuerpo específico para Ubc, marcado de manera detectable. Se puede lavar entonces el soporte de fase sólida con el regulador, una segunda vez, para eliminar el anticuerpo no unido. Se puede detectar entonces la cantidad de etiqueta unida en el soporte sólido, por medios convencionales. Mediante "soporte de fase sólido" se pretende definir cualquier soporte capaz de unirse al antígeno o los anticuerpos. Los soportes bien conocidos o portadores, incluyen: vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano., nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble en cierta medida o insoluble, para los propósitos de la presente invención. El material soportador puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible, siempre y cuando la molécula acoplada sea capaz de unirse a un antígeno o anticuerpo. Quienes sean expertos en la materia notarán muchos otros portadores adecuados para unir el anticuerpo monoclonal o el antígeno, o serán capaces de determinarlos mediante el uso de experimentación rutinaria. La detección se puede lograr usando cualquiera de una variedad de inmunoanálisis. Por ejemplo, mediante mareaje radioactivo de los anticuerpos específicos para Ubc o e los fragmentos del anticuerpo, es posible detectar el Ubc mediante el uso de análisis radioinmunológicos . Se puede detectar el isótopo radioactivo mediante _medios tales como el uso de un contador gamma o de un contador de destello, o por autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles "1 o t para los propósitos de Xa presente invención son: H, I, 35S, C y, de preferencia, 25I. También es posible marcar el anticuerpo específico para Ubc con un compuesto fluorescente . Entre los compuestos marcadores fluorescentes usados muy comúnmente están el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina, la ficocianina, la aloficocianina, el o-ftalaldehído y la fluorescamina . El anticuerpo específico para el Ubc también puede ser marcado de manera detectable acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente . Los ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes, particularmente útiles, son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster oxalato. De igual manera, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo específico para Ubc de la presente invención. Quienes sean expertos ordinarios en la materia sabrán de otras etiquetas adecuadas que pueden ser empleadas de acuerdo con la presente invención. La unión de esas etiquetas a anticuerpos o sus fragmentos se puede lograr utilizando técnicas comunes y corrientes, conosidas por los expertos ordinarios en la materia. Las técnicas típicas están descritas por Kennedy y otros ( Clin . Chim. Acta, (1976), 70: 1-31) y en Schurs y coautores Clin . Chim. Acta (1977) 81: 1-40). La proteólisis dependiente de ubiquitina media la degradación de las proteínas anormales (por ejemplo, véase Ciechanover y coautores (1984) Cell 37: 57-66; Seufert y coautores (1990) EMBO J. , 9: 543-550). Por consiguiente, la inhibición de la proteólisis dependiente de ubiquitina debe aumentar el rendimiento de las proteínas recombinantes, que son "anormales" para las células anfitrionas recombinantes eucarióticas. Los anticuerpos de Ubc de la presente invención pueden ser introducidos en -células anfitrionas recombinantes, cultivadas, que producen proteínas recombinantes a fin de inhibir la degradación de la proteína mediada por Ubc . Por ejemplo, se puede usar liposomas para administrar los anticuerpos de Ubc a las células cultivadas. Específicamente, se puede usar lípidos catiónicos para facilitar el transporte de los anticuerpos para Ubc a las células anfitrionas recombinantes cultivadas (por ejemplo, véase W091/17424, WO91/16024) . Alternativamente, los anticuerpos para los Ubc de la presente invención pueden ser usados para disminuir la degradación inapropiadámente incrementada de las proteínas "normales", que ocurre en ciertas condiciones patológicas.

En general, cuando se provee a un paciente anticuerpos para los Ubc de la presente invención, o sus fragmentos, la dosis de agente administrado dependerá de factores tales como la edad del paciente, su peso, altura, sexo, condición médica general y de la historia médica previa. En general, es conveniente proveer al receptor una dosis de agente que esté en la escala aproximada del pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso de cuerpo del paciente) , si bien también se puede administrar una dosis menor o mayor. Los anticuerpos de Ubc o sus fragmentos pueden ser administrados a pacientes en una forma farmacéuticamente aceptable, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, enteral o parenteral. Cuando se administra el anticuerpo de Ubc mediante inyección, la administración puede ser hecha mediante infusión continua o por bolos individuales o múltiples . Se puede formular el anticuerpo de la presente invención de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones útiles farmacéuticamente, de modo que se combine los anticuerpos de Ubc o sus fragmentos en una mezcla con el vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados y su formulación están descritos, por ejemplo, en Remington ' s Pharmaceutical Sciences (16a edición, Osol A., Ed. , Mack, Easton, PA. (1980)). Se puede emplear los métodos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción. Se puede lograr preparaciones de liberación controlada mediante el uso de polímeros para formar complejo con, o adsorber el anticuerpo de Ubc, o el fragmento de anticuerpo de Ubc. Se puede ejercer el suministro controlado seleccionando macromoléculas 5 apropiadas (por ejemplo, los poliésteres, poliaminoácidos, polivinilo, pirrolidona, etileno/acetato de vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, o sulfato de protamina) , mediante la concentración de dichas macromoléculas, así como mediante métodos de incorporación. Otro método posible para controlar la duración de la acción mediante preparaciones de liberación controlada, es incorporar el anticuerpo de Ubc o su fragmento en partículas de un material polimérico, tal como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli (ácido láctico) o copolímeros de etileno/acetato de vinilo. Alternativamente, los anticuerpo de Ubc o sus fragmentos pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, ^ cápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli (metacrilato de metilo), respectivamente, o en sistemas coloidales para suministro de fármaco (por ejemplo, liposomas, lípidos catiónicos, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Dichas técnicas están descritas en Remington ' s Pharmaceutical Sci enees , supra . 25 Se puede usar secuencias de ácido nucleico específicas para E2-C o UbcHIO para generar oligonucleótidos de sentido contrario, específicos para E2-C y UbcHIO . La síntesis de dichos oligonucleótidos es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Protocols for Oligonucleotides and Analogs (Agrawal, ed.) Meth. Mol . Biol . , (1993), tomo 20). Los siguientes ejemplos ilustrativos no están destinados a limitar el alcance de la invención, puesto que se puede usar métodos alternativos para obtener resultados similares .

EJEMPLOS PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE E2-C DE ALMEJA A. Fraccionación de los extractos de oocito de almeja Se preparó extractos de oocitos en fase M de la almeja Spisula solidissima y se los fraccionó sobre DEAE-celulosa, tal como lo describió Hershko y coautores (J". Biol . Chem. (1994) g_ 269: 4940-4946). Se sometió la fracción 1 (la fracción no adsorbida a la resina) a centrifugación a 100,000 x g durante una hora. El sobrenadante resultante a alta velocidad contiene E2-C (Hershko y coautores (1994) J. Biol . Chem. , 269: 4940- 4946) . Se preparó la fracción 1A, una subfracción que contiene E3-C activo mediante extracción con sal y fraccionación con sulfato de amonio, tal como fue descrito por Sudakin y 5 coautores " (Mol . Biol . Cell , (1995) 6: 185-198).

B. Purificación de E2-C Se aplicó una muestra del sobrenadante de alta velocidad de la fracción 1 de los oocitos de almeja (Hershko y coautores (1994), J". Biol . Chem . , 269: 4940-4946) (10 mg de proteína) a una columna de Mono S HR 5/5 (Pharmacia, Piscataway, NJ, E. U. A.), equilibrada con 20 mM de Hepes-KOH (pH 7.2) que contenía 1 mM de ditriotreitol (DTT) ("regulador B"). Se lavó la columna con 10 mi de regulador A y luego se sometió a un gradiente de 40 mi de 0 a 200 mM de KCl en regulador B. Se recogió muestras de 1 mi a un régimen de flujo de 1 mi/minuto, en tubos que contenían 0.5 mg de ovalbúmina portadora. Se concentró las fracciones de columna mediante ultrafiltración centrífuga con concentradores Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA, E. U. A.). Se eliminó la sal con una dilución a 20 veces del regulador B, seguido por otra ultrafiltración a un volumen final de 100 µl . Se depuró las fracciones de columna mediante dos análisis (véase más adelante) : ligación de ciclina-ubiquitina (efectuada en presencia de El y E3-C activo) y la formación de -1 OQ tioléster con ,?-7I-ubiquitina (efectuada en presencia de El) . El primer análisis detecta la actividad de E2 específica para la ubiquitinación de ciclina; el segundo detecta todos los E2. La actividad de ligación de ciclina-ubiquitina de E2-C eluye como un solo pico centrado en las fracciones 21-23, que corresponden a 70 mM de KCl en el gradiente de sal. El pico de la actividad de E2-C contenía dos tiolésteres de E2 -ubiquitina, aproximadamente de 27 kD y 18 kD. Estos fueron identificados, tentativamente, como E2-C y E2-A, por comparación con los resultados previos (Hershko y coautores (1994), J. Biol . Chem. , 269: 4940-4946). E2-A es un E2 de bajo peso molecular que 5 coincide con la actividad de ubiquitinación no específica en oocitos de almeja. También como se observó previamente, la cantidad de E2-C fue mucho menor que la de E2-A. Otras actividades de E2 eluidas a concentraciones más altas de sal, bien separadas de la región de actividad de E2-C. Esta separación fue importante para la purificación subsecuente de j?k E2-C, puesto que un E2 mayor que eluye en la fracción 28, tuvo un tamaño similar al de E2-C. Para purificación por' afinidad covalente, se preparó perlas de ubiquitina-Sepharose (aproximadamente 20 mg de ubiquitina/ml de gel hinchado) , como fue descrito por Hershko y coautores, J". Biol . Chem . (1983) 258: 8206-8214). Se lavó dos veces 1 mi de perlas de ubiquitina-Sepharose con 10 volúmenes ?^ de una solución que consistía de regulador A (20 mM de Tris- HCl, pH 7.2, 5 mM de MgCl2, 2 mM de ATP, 0.1 mM DTT y 0.2 mg/ml de ovalbúmina) . Se mezcló las perlas con un volumen igual de regulador A que contenía 3 nanomol de El y se hizo rotar a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Subsecuentemente se añadió 300 µl de preparación de E2-C parcialmente purificada, después del paso MonoS, y se continuó la rotación a 18°C 5 durante otros 20 minutos. Se hizo lento el giro de las perlas (500 rpm, 3 minutos) y se recogió la fracción sobrenadante ("que fluye a través") para la estimación de la enzima no unido a Ub-Sepharose . Se lavó dos veces las perlas con 10 mi de una solución que consistía de 20 mM de Tris-HCl, pH 7.2 , 1 M de KCl y 0.2 mg/ml de ovalbúmina y luego tres veces con porciones de 10 mi de una solución que consistía de 20 mM de Tris-HCl, pH 7.2, y 0.3% (en peso/volumen) de octilglucosida (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN, E. U. A.). Se eluyó las enzimas unidas a ubiquitina-Sepharose, mezclando las perlas con 2 mi de una solución que consiste de 50 mM de Tris-HCl, pH 9.0, 5 mM de DTT y 0.3% de octilglucosida a la temperatura ambiente durante 5 minutos. Se neutralizó el eluado a pH 9 mediante la adición de 0.1 M de Tris-HCl a pH 7.2. Se concentró la preparación con microconcentradores Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA, E. U. A.) . Luego se cambió la solución por dilución a 20 veces en un regulador que consistía de 20 mM de Tris-HCl, pH 7.2 y 0.1% de octilglucosida, seguida por ultrafiltración a un volumen final de 300 µl.

C. Microsesuenciación de la proteína Se resolvió las proteínas mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, se tiñó con azul Coomassie, se extirpó la banda de 21 kD y se sometió a tripsina (Promega) mediante el procedimiento de digestión en gel (Rosenfeld y coautores (1992) Anal. Biochem. , 203:173-179). Se separó los péptidos resultantes mediante HPLC de fase inversa en columna RP-300 Aquapore (Perkin Elmer, Norwalk, CT, E. U. A.), con un gradiente de acetonitrilo, en presencia de 0.1% de ácido trifluoroacético. Se secuenció los péptidos son químisa normal, en un modelo 476a de secuenciador de proteína-péptido (Perkin Elmer, Norwal, CT, E. U. A.) 2.- ANÁLISIS DE ACTIVIDAD A. Análisis de actividad de Ubc Se determinó la actividad de E2-C y UbcHIO mediante el análisis de ligación de ciclina-Ubc (Hershko y coautores (1991) . <J. Biol . Chem. , 269-4940-4946) , bajo condiciones en las que El y E3-C estuvieron en exceso, mientras que E2-C fue limitante. A menos que se indique de otra manera, la mezcla de reacción contenía en un volumen de 10 µl : 40 mM de Tris-HCl, pH 7.6, 5 mM de MgCl2, 0.5 mM de ATP, 10 mM de fosfocreatina, 50 µm/ml de creatina-fosfocinasa, 1 mg/ml de rcm-BSA, 50 µM de ubiquitina (Sigma, St . Louis, MO, E. U. A.), 1 µM de ubiquitin-aldehído (Mayer y coautores (1989), Biochem, 28: 166-172), 1-2 pmol de ciclina B marcada con 125? (Glotzer y coautores (1991) Nature 349: 132-138) (13-91) /proteína A (denominada 125I-ciclina, 1-2 x 105 cpm), 1 pmol de El (Hershko y coautores (1983) J. Biol . Chem, 258-8206-8214), 1 µM de ácido okadaico (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN, E. U. A.), 10 µg de proteína de la fracción Ia en fase M (que contiene E3-C activo y que está esencialmente libre de E2-C (Sudakin y coautores (1995) Mol .

Biol . Cell . , 6: 185-198) y la fuente de E2 , según se especifica. Después de incubación a 18 °C durante 60 minutos, se separó las muestras mediante electroforesis en 12.5% de gel de poliacrilamida-SDS . Se cuantifico los resultados mediante análisis de fosforimaginador . Se expresa la cantidad de radioactividad en todos los conjugados de ciclina-ubiquitina como el porcentaje de la radioactividad total en cada corredor (Sudakin y coautores (1995), Mol . Biol . Cell , 6 : 185-198). En otro análisis se probó la actividad de E2-C como se describió por Sudakin y coautores (ibid.) . En pocas palabras, las reacciones de 10 µl contenían 40 mM de Tris-HCl, pH 7.6, 5 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 0.5 mM de ATP, 10 mM de fosfato de creatina, 50 µg/ml de creatinafosfocinasa, 1 mg/ml de albúmina de suero bovino reducida-carboximetilada, 20 mM de ubiquitina, 3 µM de ubiquitin-aldehído, 1 µM de ubiquitin-aldehído, 1 µM de ácido okadaico, 1 pmol de El, 1-2 pmoles de 125I-ciclina B(13-91) (-l-2xl05 cpnm) , 10 µg de proteína de la fracción Ia de extractos de oocitos de almeja y E2-C según se especifica. Después de incubar a 18 °C durante 60 minutos se sometió las muestras a electroforesis en 12.5% de geles de poliacrilamida, seguidos por autorradiografía y cuantificación con un fosforimaginador Fuji.

B. Análisis de la formación de tioléster de E2-ubicruitina Se determinó la formación de aductos de tioléster de diversas enzimas E2 con I-ubiquitina, mediante una ligera modificación del procedimiento de Hershko y coautores, J. Biol .

Chem. (1983) 258: 8206-8214); y Haas y coautores, J. Biol .

Chem. (1982) 257: 2543-2548). Las mezclas de reacción contenían en un volumen de 10 µl : 20 mM de Hepes-KOH, pH 7.2 , 5 mM de MgCl2, 0.5 mM de ATP, 10 mM de fosfocreatina, 50 µg/ml de creatina-fosfocinasa, 0.1 mM de DTT, 1 mg/ml de rcm-BSA, 5 µM g de 5I-ubiquitina (-5,000 cpm/pmol) (procedimiento cloramina T, 0.1 µM de El y los E2 como se especifica. Después de la incubación a 18 °C durante 10 minutos, se detuvo la reacción añadiendo un regulador de muestra de electroforesis que contenía 50 mM de Tris-HCl, pH 6.8, 4% (en peso/volumen) de dodecilsulfato de litio, 4 M de urea y 10% (en volumen/volumen) de glicerol. A menos que se diga de otra manera, no se añadió ^^ ningún agente reductor al regulador de muestra. Se dejó que las muestras permanecieran a 0°C durante 30 minutos, y luego se separó en geles de 12.5% de poliarilamida-SDS, operados a 4°C.

C. análisis de la actividad de UbcHIO C(H4)S Usando una adaptación del método de Brandéis y Hunt (EMBO J. (1996) 155280-4289) , se transcribió ciclina humana A y B, un mutante de ciclina B humana que carece de la casilla de destrucción y ciclina F humana, y se las trasladó en un sistema de lisato de reticulocitos de conejo. Se mezcló 3 µl de los productos de translación con 5 µl de un extracto de células HeLa Gl , un sistema regenerador de ATP y regulador, 0.5 µg de UbcHIO de tipo silvestre o dominante negativo, expresado en E. coli como se indica. Después de 0 , 1, y 3 horas se tomó muestras de 3 µl y se las analizó mediante SDS-PAGE al 12.5%. Los resultados de la muestra están dados en la figura 17. 3.- CLONACIÓN DE Cadn DE E2-C A. Depuración del banco de cADN Se depuró un banco de cADN de ovarios de almeja poliA+, clonado en el vector de fago Mgt22 (Stratagene, La Jolla, CA, E. U. A. ) , mediante RCP. En este banco se impuso cola a insertos de cADN en el extremo 5 ' con Salí y en el extremo 3' con Notl. El par sensibilizador de RCP satisfactorio consistió de un sensibilizador de oligonucleótido degenerado que codifica el péptido 1 de E2-C (sensibilizador Pl) : ' -GAYTAYCCITAYAARCCACC-3 ' (SEQ ID No. 11, dirección positiva) y un sensibilizador de vector (Mgt22al) : ' -CAGACCAACTGGTAATGGTAGCG-5 ' (SEQ ID NO: 12) , en donde Y es T o C, R es A o G e l es inosina, reemplazando con A, C, G o T. Se usó 2 x 10 pfu en 5 cada reacción de RCP. Las reacciones contenían 3 mM de MgCl2, 0.25 mM de dNTP, X de regulador de RCP (Perkin Elmer, Norwalk, CT, E. U. A.), 1.25 unidades de Taq polimerasa (Perkin Elmer, Norwalk, CT, E. U. A.), 200 pmol de sensibilizador Pl y 50 pmol de sensibilizador Mgt22al, y se efectuó a 94 °C durante 45 10 segundos, 56°C durante 45 segundos y 72°C durante 1 minuto, • durante 30 ciclos. Se purificó un producto de reacción de 900 pares de bases (pb) mediante electroforesis en gel de agarosa (Sambrook y coautores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2 a edición, Cold .Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory, NY, E. U. A.) y se clonó en el vector plásmido pCRII (equipo de clonación TA, InVitrogen, San Diego, CA, E. U. A.), usando los protocolos del fabricante. Se secuenció el ADN de inserto usando los sensibilizadores de vector pCRII (T3 y T7) y, después los sensibilizadores CE24 únicos, internos: ' -CADDAGTAGTAAAGTTCACCACAC-3 ' (SEQ ID NO: 13, dirección positiva) y CE24R: 25 5 ' -CATAGGAAGCAGTCCAATTCTC-3 (SEQ ID NO: 14, dirección de sentido contrario) utilizando protocolos del equipo secuenciador Sequenase 7-deaza-dGTP (United States Biochemical, Cleveland, OH, E. U. A. ) . La ^ identificación de otras dos secuencias de péptido E2-C dentro de la región clonada (ILLSLQSLLG (SEQ ID NO : 15) y ENWTASYDV (SEQ ID NO: 16) lo estableció como un clon E2-C candidato. Para depurar los clones que codifican E2-C de longitud completa, se extendió 2.4 x 10 placas del banco sobe agar superior (20,000 pfu por placa) y se tomó réplicas en membranas Hybond-N (Amersham, Chicago, IL, E. U. A. ) . Para • depurar se purificó un fragmento de RCP de 900 pares de bases del clon de cADN original, con gel, se marcó con un sensibilizador aleatorio P-dCTP y se recupero después de filtrar sobre Sephadex G-50 (Sambrook y coautores (1989)MoIecular Cloning: A Laboratory Manual , 2 a edición, Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory) . Se híbrido las membranas con la sonda marcada en SSC a 65°C, seguida por varios lavados de alta rigurosidad, se formó núcleo de placas positivas y se sometió a formación de vórtice en regulador SM (100 mM de NaCl, 10 mM de Mg2S04.7H20) , 50 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 0.01% (en peso/volumen) de gelatina) para liberar el fago. En una segunda ronda de depuración, se extendió las placas con núcleo formado, sobre placas de 10 LB a una concentración de 500 placas por placa, se volvió a depurar 5 con el inserto de 900 pares de bases y se almacenó las placas positivas en regulador SM.

Para determinar los tamaños de insertó se efectuó reacciones de RCP utilizando los sensibilizadores de vector de banco µgt22al y µgt22a2. Varias placas produjeron insertos de 1.5 kb. Este inserto fue purificado en gel, se lo clonó al vector pCRII y se lo secuenció usando sensibilizadores T7, CE24, y CE24R. Esta purificación conduce a la identificación de una cuarta secuencia de péptido E2-C: RTLLMSGDPGITAFPDGDNLFK (SEQ ID NO : 17] Las igualdades entre las secuencias de los péptidos derivados de la proteína E2-C purificada y de la secuencia de proteína codificada por el cADN clonado están indicadas en la figura 4. 4. Producción de la proteína E2-C recombinante Se diluyó el producto de RCP que contenía el inserto E2-C de 1.5 kb, a 1:1000 y se llevó a cabo un segundo RCP con los sensibilizadores CE2Ful: • -GGGCATATGTCGGGACAAAATATACATC-3 ' (SEQ ID NO: 18, dirección positiva), y CE2Rev: ' -GGGAAGCTTCTATTTATCACTCTGAGCAG-3 (SEQ ID NO: 19, dirección de sentido opuesto) diseñado para ^^ crear un sitio 5 ' -Nde I en la metionma iniciadora presumida y un sitio Hind III en el extremo 3 ' ; se subclonó el producto resultante en pT7-7 (Tabor y coautores (1985) Proc. Nati . Acad. Sci . U. S. A. , 82: 1074-1078). Se transformó la construcción resultante en células Bl-21 (DE3) pLysS de E. coli (Novagen, Madison, Wl E. U A. ) , de acuerdo con el protocolo del fabricante. É?^ Para inducir la proteína, se desarrolló las células en 100 mi de LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina y 34 µg/ml de cloranfenicol, a una D.O. de 0.6. Se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y se incubó las células a 37°C durante otras 3 horas. Se lavó las pellas de células en PBS frío (140 mM de NaCl , 2.7 mM de KCl, 10 mM de Na2HP04, 1.8 mM de KH2 O4) y se volvió a suspender en 3 mi de 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 50 mM de tris-HCl, pH 7.6, 10 µg/ml de leupeptina (Sigma, St . Louis, MO, E. U. A.) y 10 µg/ml de quimiostatina (Sigma, St . Louis, MO, E. U. A.). Se vigiló la expresión de proteína por la aparición de una banda de proteína de 21 kD e geles de SDS- poliacrilamida, con azul Coomassie. Se sometió a lisis las bacterias mediante tres ciclos de congelación (en nitrógeno líquido) y descongelación (25°C) , seguidos por el paso en una jeringa equipada con una aguja de calibre 20. Se eliminó por centrifugación el material insoluble mediante centrifugación (20,000 x g durante 15 minutos); se usó el sobrenadante como la fuente de E2-C bacterianamente expresada. Se estimó la concentración de E2-C recombinante por comparación de la intensidad de la banda de 21 kD en gel de SDS-poliacrilamina teñido con Coomassie, con los de cantidades conocidas de albúmina de suero bovino, separadas en el mismo gel. Mediante este método se estima que la cantidad de E2-C fue alrededor del 12% del total de proteínas presentes en el extracto bacteriano. Los experimentos de control mostraron que la adición de extractos bacterianos en cantidades 5 veces mayores que las usadas para el análisis de la actividad de E2-C recombinante, no inhibió significativamente la actividad de E2-C natural en la ligación de ciclina-Ub o en la formación del tioléster con ubiquitina.

CLONACIÓN DE E2-C/UbcH10 Se usó un banco de cADN de HeLa humana clonado en el vector Lambda ZAP II (Stratagene No. 936201, La Jolla, CA, E.

U. A. ) como plantilla para la reacción de cadena de polimerasa (RCP) . En la primera reacción (RCP A) se usó el sensibilizador de degeneración fue YE2-C4: ' -CARCARGARYTIMGIAC-3 ' (SEQ ID NO: 20, dirección positiva) en donde R es A o G, Y es C o T, M es A o C e I es inosina, que se sustituye por A, T, C o G) , que corresponde a los aminoácidos 36-41 (QQELRT) de E2-C de almeja, conjuntamente con el sensibilizador de vector T7 : -TAATACGACTCACTATAGGG-3 ' (SEQ ID NO: 21, dirección de sentido contrario) . Las reacciones contenían 1 x 10 pfu del banco de cADN de HeLa, 2.5 mM de MgCl , 0.25 mM de dNTP, 1 x regulador de RCP (Perkin Í?k Elmer, Norwalk, CT, E. U. A.), 1.25 U de polimerasa de ADN AmpliTaq (Perkin Elmer, Norwal, CT, E. U. A.), 200 pmol de sensibilizador YE2-C4 y 50 pmol del sensibilizador T7. Se ; llevó a cabo las reacciones a 94 °C durante un minuto, a 50 °C durante 1 minuto y a 72°C durante 1 minuto, durante 35 ciclos con una extensión final e 10 minutos a 72°C. La reacción produjo una escalera de 5 bandas de —390- ^ 1000 pb. Se usó estos productos de reacción como plantilla para una segunda reacción de RCP encestada (RCP B) usando el sensibilizador YE2-C4 y un segundo sensibilizador de degeneración YE2-C2: ' -ATRTCIARRCAIATRTTICC-3 ' SEQ ID NO: 22, dirección de sentido contrario), R es A o G e I es inosina) , que corresponde a los aminoácidos 111-117 (GNICLDI) de E2-C de almeja. • Las reacciones contenían l/200avo. de productos de reacción RCP A, 2.5 mM de MgCl2, 0.25 mM de dNTP, 1 X regulador RCP (Perkin Elmer, Norwalk, CT, E. U.

^ A.), 1.25 U de polimerasa de ADN AmpliTaq (Perkin Elmer, 5 Norwalk, CT, E. U. A.), 200 pmol de sensibilizador YE2-C4 y 200 pmol de sensibilizador YE2-C2. Se llevó a cabo las reacciones a 94 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto, durante 35 ciclos, con una extensión final de 10 minutos a 72 °C. 10 La RCP B produjo un producto de RCP de 258 pb que fue ^ clonado directamente en el vector plásmido pCR-II usando el equipo de clonación TA (InVitrogen, San Diego, CA, E. U. A.) y siguiendo los protocolos del fabricante. Se secuenció el ADN del inserto usando el equipo secuenciador Sequenase 7-desaza- 15 dGTP (United States Biochemical, Cleveland, OH) , con los sensibilizadores de vector T7 y SP6 : ' -ATTTAGGTGACACTATA-3 ' SEQ ID NO: 23, dirección positiva), siguiendo los protocolos del fabricante. Se alineó la secuencia resultante con la secuencia de E2-C de almeja usando el programa de alineación de secuencias de ADN Star Múltiple (DNASTAR, Inc., Madison, Wl, E. U. A.) . El alto grado de homología estableció que era un clon E2-C humano candidato. Para depurar los clones de cADN de longitud completa de E2-C humano, se extendió alrededor de 6 x 10 pfu del banco de cADN HeLa en agar superior NZY, sobre placas de agar NZY (alrededor de 50,000 pfu por placa), Maniatis y coautores (1982) Molecular Cloning, página 440. Se tomó réplicas en membranas Hybond-N (Amersham, Chicago, IL, E. U. A.). Para depurar, se purificó en gel el fragmento de RCP e 258 pb del clon original de cADN y se marco con un usando el estuche T7 QuickPrime (Pharmacia, Piscataway, NJ, E. U. A) , y siguiendo los protocolos del fabricante. Se híbrido membranas con la sonda marcada en regulador de hibridación (6X, SSC, 20 mM de NaH2P04, 0.4% de SDS, 5X de reactivo de Denhardt (Maniatis y coautores (1982) Molecular Cloning, página 448), durante 14 horas a 65°C. Se lavó los filtros dos veces en 2X SSC, 0.1% de SDS durante 10 minutos a la temperatura ambiente, luego una vez en IX SSC, 0.1% de SDS durante una hora a 53°C y una vez en 0. IX SSC, 0.1% de SDS durante una hora a 53°C. Se expuso entonces las membranas a película de rayos X (Kodak, Rochester, NY (E. U. A.) durante 72 horas con una pantalla intensificadora y se identificó las placas marcadas mediante autorradiografía. Se identificó 50 placas positivas en la depuración primaria. Estas fueron formadas con núcleo y sometidas a vórtice en regulador SM (100 mM de NaCl, 10 mM de Mg2S04.7H2?, 50 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% (en peso/volumen) de gelatina). Luego se seleccionó las placas con núcleo para depuración secundaria: se extendió cada placa sobre dos placas de agar NZY en agar superior NZY a una densidad aproximada de 50 a 500 pfu por placa. Se sacó réplicas sobre membranas Hybond-N (Amersham, Chicago, IL, E. U. A. ) . Se volvió a depurar las membranas con la sonda de RCP original de 258 pb, usando las mismas condiciones de hibridación y lavado que en la depuración primaria. Se identificó dieciocho placas positivas en la segunda depuración; fueron formadas con núcleo y sometidas a vórtice en regulador SM. Se determinó los tamaños de inserto de los clones de cADN mediante RCP usando los sensibilizadores de vector T3 : ' -AATTAACCCTCACTAAAGGG-3 ' SEQ ID NO: 24, dirección positiva) y T7. Tres placas produjeron insertos de alrededor de 700 pb y 15 placas produjeron insertos de alrededor de 1000 pb.

Seis de las placas que produjeron insertos de alrededor de 1000 pb fueron seleccionadas para excisión in vivo del fagémido Bluescript, que contenía el inserto clonado, del vector Lambda ZAP (Stratagene, La Jolla, CA, E. U. A.), usando los protocolos del fabricante . Cada una de estas placas fue aislado independiente de la depuración primaria. Se secuenció cuatro de los fagémidos en ambos filamentos usando el equipo secuenciador Sequenase 7-desaza-dGTP (United Stated Biochemical, Cleveland, OH, E. U. A.), con los sensibilizadores de vector SK: ' -CGCTCTAGAACTAGTGGATC-3 (SEQ ID NO: 25, dirección positiva) , T7 y T3 y, subsecuentemente, con sensibilizadores de secuencia única internos HSE1 : ' -CCTCATGATGTCTGGCG-3 ' (SEQ ID NO: 26, dirección positiva) , HSE2 ' -AGGAGAACCCAACATTG-3 (SEQ ID NO: 27, dirección positiva)) y HSE3 : ' -GGAGAGCAGAATGGTCC-3 ' (SEQ ID NO: 28, dirección de sentido opuesto), siguiendo los protocolos del fabricante. Se alineó las secuencias usando el programa de alineación de secuencia DNA Star Múltiple (DNASTAR, Inc., Madison, Wl, E. U. A.). La secuencia de nucleótidos de cADN de E2-C humano y su secuencia de aminoácidos deducida están mostradas en la figura 4. 6. EXPRESIÓN DE UbcHIO DURANTE EL CICLO DE LA CÉLULA Para determinar si y cuando se involucra UbcHIO humano en una forma específica para la etapa de ciclo de la célula, se vigila los niveles de mARN de UbcHIO y se vigila a través del ciclo de la célula, de células sincronizadas. A. Sincronización de las células Se usa células transformadas, tales como células HeLa y células no transformadas, tales como IMR-90 (fibroblastos de pulmón diploides humanas) o fibroblastos de prepucio humano, por ejemplo. Dichas líneas de células son adquiridas de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, E. U. A. ) . Se puede sincronizar las células no transformadas por privación de factores de desarrollo esenciales (véase más adelante para el método) ; esto las hace entrar en estado de reposo (GO) y cuando se restablecen los factores de desarrollo al medio, atravesarán el ciclo de la célula en sincronía parcial (Resnitzky y coautores (1994) Mol . Cell Biol , 14: 1669-1679) . Se puede sincronizar células HeLa en el límite de la fase Gl/S usando un bloque doble de timidina. Se añade timidina a los cultivos de células en fase de desarrollo exponencial, a una concentración final de 2 mM y se incuba las células durante 24 horas. Luego se cosecha las células mediante centrifugación, se enjuaga en medio completo libre de timidina y se las incuba durante otras 12 horas. Se añade nuevamente timidina al medio de cultivo y se incuba las células durante otras 24 horas. Al concluir esta incubación, típicamente más del 90% de la población de células está sincronizada en Gl/S (Brown y coautores (1994)) J. Cell Biol . 125: 1303-1312) . También se puede sincronizar células HeLa en Gl temprana mediante el tratamiento de Lovastatin o sacudimiento mitótico. Se incuba células semiconfluentes en medio que contenía 20 mM de Lovastatin (Merck, Sharp and Dohme Research Pharmaceuticals, Rahway, NJ, E. U. A.) durante 36 horas. Luego se reemplaza el medio de cultivo con medio que contiene 6 mM de mevalonato (Sigma Chemical Company, St . Louis, MO) , para permitir que las células reanuden el ciclo de célula (Keyomarsi y coautores (1991), Cáncer Res . 51: 3602-3609).

Alternativamente se sacude firmemente matraces de células HeLa en desarrollo de fase logarítmica para eliminar las células mitóticas adheridas flojamente, las cuales son vueltas a extender en medio completo, precalentado, y se las incuba durante 3 horas. Al concluir esa incubación, típicamente más del 97% de la población de células está en interfase, lo que se determina mediante microscopía de contraste de fase (Brown y coautores (1994) J. Cell Biol . , 125: 1303-1312).

B. PERFIL DEL CICLO DE CÉLULA DEL mARN de UbcHIO HUMANO Se prepara ARN total a partir de células sincronizadas en diversos puntos de tiempo después de liberación de la carencia de alimento. Se efectuó el tratamiento con Lovastatin o el tratamiento con timidina, usando isotiocianato de guanidina, como se describe en Sambrook y coautores (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual , 2a edición, Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory, NY, E. U. A. ) . Se resolvió el ARN mediante electroforesis en un gel de agarosa en formaldehído y se transfirió a membrana Hybond-N (Amersham, Chicago, IL, E. U. A.) . Como sonda se marca el cADN de UbcHIO con a32P-dCTP usando el equipo T7 QuickPrime (Pharmacia, Piscataway, NJ, E. U. A.), siguiendo los protocolos del fabricante. Se incuba la membrana con la sonda de cADN y se lava de acuerdo con los protocolos del fabricante (Amersham, Chicago, IL, E. U. A.) . Se expone entonces a película de rayos X (Kodak, Rochester, NY, E. U. A.) con una pantalla intensificadora para intensificar cualquier señal por autorradiografía. Se cuantifica la intensidad del teñido en cada corredor para determinar si hay diferencias en los niveles de mARN de UbcHIO a través del ciclo de la célula. Se usa una sonda derivada del gene de acción como un control de carga para comprobar la cantidad total de mARN en cada corredor. Se marca el clon de cADN accionador de ratón, usando el equipo T7 QuickPrime, descrito más arriba. Se espera que los niveles de ARN de UbcHIO varíen a través del ciclo de la célula, lo que hace posibles terapias potenciales que implican la incubación de células con oligonucleótidos de sentido contrario, permeables a la membrana .

C. PERFIL DEL CICLO DE CÉLULA EN LA PROTEINA UbcHIO HUMANA Para vigilar el perfil del ciclo de célula de la proteína UbcHIO, se genera anticuerpos contra la proteína UbcHIO recombinante. Se aisla los anticuerpos policlonales y se los purifica de suero de animales inmunizados con una preparación de antígeno que consta de UbcHIO purificado y un adyuvante, tal como el adyuvante de Freund (Syntex Research, Palo Alto, CA, E. U. A.) (Harlow y coautores (1988) Antibodies . A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory) . Se sincroniza las células como se describió arriba y se prepara extractos de proteína total de las células en diversos puntos de tiempo, después que se sale de la carencia de alimento, del tratamiento con Lovastatin o del tratamiento con timidina. En cada punto del tiempo se lava las células con salina regulada con fosfato (PBS; 170 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 10 mM de Na2HP04 , 2 mM de KH2P04) y se raspa de las placas. Se cosecha las células mediante centrifugación y se mezcla con el doble del volumen de pella de un regulador de lisis que contiene 50 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 250 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 50 mM de NaF, 0.2% de Nonidet P-40, 1 mg/ml de leupeptin (Sigma Chemical Company, St . Louis, MO, E. U. A.), 2 mg/ml de aprotinina (Sigma) 15 mg/ml de benzamidina (Sigma) , 10 mg/ml de pepstatina (Sigma) y 10 mg/ml de inhibidor de tripsina de soya (Sigma) . Se incuba la suspensión a 4°C durante 45 minutos y se elimina el desecho celular mediante centrifugación en una microfuga durante 30 minutos a 4°C. Se mide la concentración de proteína de los lisatos de célula usando un sistema de análisis de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, i Hercules, CA, E. U. A.), usando albúmina de suero bovino (BSA) 5 como norma. Se ajusta los extractos de célula a la misma concentración de proteína en regulador de muestra de dodecilsulfato de sodio (SDS) (80 mM de Tris-HCl, pH 6.8, 2 de SDS, 10% de glicerol, 5% de ß-mercaptoetanol, 0.025 mg/ml de azul bromofenol) y se resuelve mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) (Sambrook y coautores (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual , 2a edición, Cold Spring » Harbour, New York; Cold Spring Harbour Laboratory, NY, E. U.

' A. ) . Se transfirió las muestras a Immobilon (Millipore, Bedford, MA, E. U. A.) y se inmunotiñó con anticuerpos anti- •15 UbcHIO, siguiendo los protocolos del fabricante. Se visualizó las bandas inmunorreactivas con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante, seguida por detección de quimioluminiscencia (Amersham, Chicago, IL, E. U. A. ) . Los cambios en los niveles de la proteína a través del ciclo de la célula o los cambios en su movilidad (por ejemplo, debidos a la fosforilación) son de interés potencial. 7. IDENTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS BUSCADAS UBIOUITINADAS POR UbcHIO HUMANO 25 Las proteínas, además de las ciclinas de tipo A y B, que son degradadas durante el avance a través de la mitosis, pueden ser ubiquitinadas usando E2-C/UbcH10. Los ejemplos de esas proteínas incluyen CENP-E, CENP F, NIMA, timidina-cinasa, la proteína 0H0-31, supresora de tumor en Drosophila, la 5 proteína de granos de Drosophila y la proteína de "engrudo" hipotética, necesaria para la coherencia cromática fraterna. Adicionalmente, UbcHIO puede ubiquitinar otras proteínas reguladoras del ciclo de célula en otras etapas del ciclo de las células. Los candidatos razonables involucrados en el 10 avance de Gl, incluyen las Gl-ciclinas, la ciclina D y la ciclina E, el inhibidor P27 de cinasa dependiente de ciclina ft (CDK) , otros miembros de la familia de inhibidores de CDK y el producto p53 de gene supresor de tumor. Las versiones recombinantes purificadas de las proteínas que van a ser probadas, son analizadas para la ubiquitinación in vitro en presencia de UbcHIO recombinante, purificado, y un sistema de lisato de reticulocito de conejo (RRL) , que es una fuente establecida de enzimas ubiquitinadoras y complejos de proteasoma (Hershko (1988), J". Biol . Chem. , 263: 15237-15240) . Los productos de reacción son analizados mediante inmunotinción con anticuerpos contra la proteína que se va a probar. Se caracteriza la ubiquitinación de la proteína por la aparición de una escala de bandas de peso ' molecular mayor, además de la banda inmunorreactiva que corresponde a la propia proteína; la aparición de esas bandas dependerá de la presencia de UbcHIO recombinante. El inmunomanchado o inmunotinción con un anticuerpo antiubiquitina confirmará que esas formas de mayor peso molecular de la proteína representan especies ubiquitinadas . Los enfoques alternativos in vivo que implican la inyección o la transfección de un UbcHIO dominante negativo presunto, están descritos más abajo. 8. PRODUCCIÓN DE UN UbcHIO DOMINANTE NEGATIVO Para subclonar UbcHIO al vector de expresión ^ bacteriano pT7-7 (Tabor y coautores, (1985) Proc . Nati . Acad. Sci . (USA) , 82: 1074-1078), se amplificó la región codificadora * mediante RCP, utilizando los sensibilizadores HSEN (5'- GGAATTCATATGGCTTCCCAAAACCGCG-3 ' , de sentido positivo, SEQ ID NO: 25) y HSEC (5 ' -CCCAAGCTTATCAGGGCTCCTGGCTGGT-3 ' , de sentido contrario, SEQ ID NO: 26) . HSEN codifica los primeros cinco aminoácidos del marco de lectura abierta de UbcHIO y contiene un sitio de restricción EcoRI seguido por un sitio Ndel en el extremo 5 ' . HSEC codifica los últimos 5 aminoácidos del marco , de lectura abierta de UbcHIO, seguidos por los dos codones de alto y luego un sitio de restricción HindIII. El producto de RCP resultante fue digerido con Ndel y ?indIII, ligado con pT7- 7 cortado en Ndei/HindIII y transformado a células BL2KDE3) pLysS (Novagen) . 25 Se generó el mutante UbcHIO C(114)S en dos pasos mediante RCP. Se amplificó la porción .amino-terminal del clon de cADN de UbcHIO, como arriba, usando los sensibilizadores HSEN y HSECSR (5 '_-GATGTCCAGGCTTATGTTACC-3 ' , sentido contrario; SEQ ID NO: 26) . Se amplificó la porción carboxilo-terminal » usando los sensibilizadores HSECSF (5 ' -GGTAACATAAGCCTGGACATC- 5 3 ' , de sentido positivo, SEQ ID NO: 27) y HSEC. HSECSR es la secuencia de sentido contrario de HSECSF y ambos codifican los aminoácidos GNISLDI, lo que altera el residuo 114 de UbcHIO de sisteína a serina. Para generar un clon mutante de UbcHIO de longitud completa, se mezcla los productos de RCP de las dos reacciones, se los desnaturaliza y se deja que se fijen en el traslape GNISLDI, luego se los amplifica con los sensibilizadores HSEN y HSEC. Se digirió el producto de RCP de » longitud completa con Ndel y HindIII y se clonó en pT7-7 como se describió para UbcHIO de tipo silvestre. 15 Se generó el mutante E2-C de almeja correspondiente mediante amplificación de la porcino amino-terminal de cADN de E2-C (Aristarkhov y coautores (1996), Proc . Nati . Acad. Sci . (USA) 93: 4294-4299), usando los sensibilizadores CE2FULL (5'- ™ GGGCATATGTCGGGACAAAATATAGATC-3 • , de sentido positivo, SEQ ID NO: 28) y CE2MUTR (5 ' -CCAGACTTATATTTCCTGACTG-3 ' , de sentido contrario, SEQ ID NO: 29) . Se amplificó la porción carboxilo- terminal usando los sensibilizadores CE2MUTF (5'- CAGTCAGGAAATATAAGTCTGG-3 ' , de sentido positivo, SEQ ID NO: 30) y CE2REV (5 ' -GGGAAGCTTCTATTTATCACTTGAGCCCAG-3 ' , de sentido contrario, SEQ ID NO: 31) . CE2MUTR tiene la secuencia de sentido contrario de CE2MUTF y ambos codifican los aminoácidos ESGNISL, lo que altera el residuo 114 de E2-C de cisteína a serina. Para generar una longitud completa de E2-C C(114)S, se amplificó los productos de RCP del primer paso con los sensibilizadores CE2FULL y CE2REV. Se digirió el producto de RCP del segundo paso con Ndel y HindIII y se los clonó a pT7-7. Para transfección a células humanas se añadió el epítope Aul (DTYRYI) al extremo C de UbcHIO de tipo silvestre y el mutante C(114)S mediante RCP, usando los sensibilizadores HSEN y HSEAUC: (5 • -GGGAAGCTTATCAAATGTACCTGTAGGTGTCGGGCTCCTGGCTGGTGA-3 ' de sentido contrario, SEQ ID NO: 32) . Se usó como plantillas vectores pT7-7 que contenían los genes de tipo silvestre y mutante . HSEAUC codifica los últimos 6 aminoácidos del marco de lectura abierto de UbcHIO, seguidos por los aminoácidos DTYRYI, dos codones de alto, luego un sitio de restricción HindIII. Se digirió el producto • de RCP resultante con EcoRI y HindIII y se ligó con pJS55 cortado con EcoRl/HindIII, un derivado de pSG5 (Stratagene) con un polienlazador modificado (Sparkowski y coautores (1994), J". Virol . 69 : 6120-6123).

EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LOS Ubc RECOMBINANTES Se desarrolló a 37°C cultivos de 400 mi de bacterias que contenían vectores de expresión de los diversos E2-C, en medio LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina y 34 µg/ml de cloranfenicol. A una adsorbencia de 07gg? nm' se añadió isopropil-ß-tiogalactosida (1 mM) y se continuó la incubación durante tres horas. Se formó pellas con las bacterias, se las ^P* lavó con PBS y se las volvió a suspender en 6 mi de 50 mM de 5 Tris-HCl (pH 7.2), 1 mM de DTT, 1 mM de EDTA, 10 µg/ml de leupeptina y quimiostatina, y se trató sónicamente 94 x 30 segundos) y se centrifugó a 15,000 x g durante 10 minutos. Todos los E2-C recombinantes estuvieron en la fracción sobrenadante . 10 Para purificación, se diluyó los extractos ^^ bacterianos con 4 volúmenes de fosfato de potasio 10 mM (pH 7.0) y 1 mM de DTT, y se aplicó a una columna de DE-52 )Whatman) a una razón de 5 mg de proteína por mi de resina. Se recogió el material no adsorbido y se lo concentró mediante ultrafiltración centrífuga (Centriprep-10, Amicon) a 10 mg de proteína/ml. Esta fracción de 20-30 mg de proteína fue aplicada a una columna de 120 mi de Superdex-75 (Pharmacia) equilibrada con 50 mM de Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM de EDTA y 1 mM de DTT. Se recogió las fracciones de 2.5 mi a un régimen de flujo de 1 ml/min. Se separó bien los diversos E2 eluidos en las fracciones 28-32, de la mayoría de las proteínas bacterianas. Todas las preparaciones de E2-C fueron homogéneas en más de 95%.

A. PRUEBA IN VITRO DE MUTANTES DOMINANTES NEGATIVOS DE UbcHIO Se clonó los mutantes de UbcHIO marcados y las versiones marcada y sin marcar de UbcHIO de tipo silvestre, en el vector pT7-7 (Tabor y Richardson, 1985) para permitir la expresión de esas proteínas en E. coli. Se purificó las proteínas recombinantes como se describió arriba y se probó la proteína de tipo silvestre en cuanto a su capacidad para promover la ligación in vitro de ciclina-ubiquitina. La proteína marcada puede promover la ubiquitinacióin de la ciclina, así como la proteína de tipo silvestre no marcada. Así, fue posible usar la proteína marcada para estudios adicionales, dado que UbcHIO marcado puede reemplazar funcionalmente a UbcHIO de tipo silvestre. A continuación se probó las proteínas mutantes marcadas en cuanto a su capacidad para competir con E2-C de almeja (y UbcHIO) en el análisis de ubiquitinación de ciclina in vitro (véase las figuras 12A-12C) .

B. PRUEBA IN V TRO DE LOS MUTANTES DOMINANTES NEGATIVOS DE UbcHIO EN EMBRIONES DE RANA Se inyectó ARN que codifica el tipo silvestre o el mutante E2-C en una célula embriones de rana de dos células, tal como se describió (LaBonne y coautores (1995), Develop.121 : 1472-1486) . Se recogió los embriones en una etapa de blástula media-tardía, se los fijó, se los tiñó con Hoechst 33342, se los aplastó y visualizó mediante microscopía con fluorescencia. Alternativamente se clonó los genes UbcHIO de tipo silvestre y mutantes en el vector pCS2+ para permitir la producción de transcriptos in vitro. Se generó los transcriptos usando el equipo MEGAscript (Ambion Inc., Austin, TX, E. U. A.), siguiendo los protocolos del fabricante. Se microinyectó los mARN de UbcHIO de tipo silvestre y mutantes, en una célula del embrión de rana en etapa de dos células, tal como se describió por Kay y coautores (Meth . Cell Biol . (1991), tomo 36, San Diego, CA, E. U. A., Academic Press) . La inyección de los transcriptos mutantes inhibió o retardó la división de la célula en la célula microinyectada con respecto a la célula no inyectada. El transcripto de tipo silvestre sirve como control y no tiene efecto inhibidor sobre la división de la célula. Si hay un efecto al usar los transcriptos mutantes, se determinará la morfología del cromosoma en las células detenidas o retardadas. Se fija los embriones en 63% de etanol, 30% de agua destilada, 7% de ácido acético glacial, durante la noche, a 4°C. Se lava dos veces los embriones durante una hora en agua, luego se los tiñe en 1 µg/ml de Hoechst 33342 (Sigma Chemical Company, St . Louis, MO, E. U. A.) durante la noche. Se diseca entonces una porción del embrión manchado, se la coloca en un portaobjetos, se sumerge en ácido acético al 10%, luego se cubre con un cubreobjetos y se aplasta. A continuación se observa las muestras usando óptica fluorescente. Para la inmunofluorescencia se añadió cubreobjetos de vidrio a los platos de transfección, antes de subcultivar las células. Se retiró los cubreobjetos de los platos a las 48 horas después de la transfección y se enjuagó brevemente con PBS. Se fijó las células durante 15 minutos en 3.7% de formaldehído en PBS, luego se permeabilizó lavando los cubreobjetos cuatro veces con 0.1% de Tritón X-100 en PBS. Se incubó los cubreobjetos durante 30 minutos en 1% de BSA + 0.1% de Tritón X-100 en PBS, luego se incuba durante una hora con el anticuerpo AU1 (Babeo) diluido 1/150 en la misma solución. Se lavó a continuación los cubreobjetos cuatro veces con PBS + 0.1% de Tritón X-100 y se incubó durante una hora en la oscuridad, con anticuerpo anti-ratón de chivo, conjugado con Cy3 (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.), diluido 1/400 en PBS + 1% de BSA + 0.1% de Tritón X-100. Se lavó las células cuatro veces con PBS + 0.1% de Tritón X-100, luego se incubó durante un minuto con 1 µg/ml de Hoechst 33342 en PBS + 0.1% de Tritón X-100. Se montó los cubreobjetos en 70% de glicerol que contenía DABCO (1, -diazabiciclo [2.2.2] octaína, Sigma) como agente anti-decoloración en PBS, se selló con pintura de uñas y se observó mediante microscopía de fluorescencia.

C. PRUEBA IN VIVO DE MUTANTES DOMINANTES NEGATIVOS DE UbcHIO EN CÉLULAS DE MAMÍFERO Se expresa proteínas UbcHIO mutantes y de tipo silvestre, marcadas con epítope recombinante, en células de mamífero usando un sistema de expresión inducible que usa el operador/represor de resistencia a tetraciclina bacteriana para establecer regulación hermética de la expresión del gene. Se basa el sistema en dos plásmidos pUHD15-l neo (figura 15a) y pUHD10-3 (figura 15B) que pueden ser integrados de manera 5 estable en células de mamífero para establecer líneas de células (Gossen y coautores (1992) Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 89: 5547-5551; Resnitzky y coautores (1994), Mol . Cell . Biol . , 14: 1669-1679. Se obtendrá esos plásmidos de Scripps Research Institute (La Jolla, CA, E. U. A.). 10 El plásmido pUHD15-l neo codifica una proteína • quimérica compuesta del represor de tetraciclina (207 aminoácidos) fundido al dominio de activación del activador de transcripción VP16 del virus de herpes simplex (HSV) (los 130 aminoácidos C-terminales) . Se impulsa la expresión mediante el promotor IE del citomegalovirus humano (hCMV) y hay una secuencia de poliadenilación (poli (A) ) corriente debajo de virus de simio 40 (SV40) . El plásmido codifica también un gene de resistencia a la neomicina. Se usa el plásmido pUHD10-3 para la expresión dependiente de tTA del gene de interés. Se usa sitios adecuados en el polienlazador para clonar los genes que codifican UbcHIO de tipo silvestre y los mutantes de UbcHIO en pUHD10-3. Corriente arriba del polienlazador donador hay un promotor hCMV mínimo, hCMV*-l (se ha eliminado la región incrementadora corriente arriba) y siete copias de la secuencia operadora de tetraciclina (teto) (secuencia 02 de TnlO, una repetición invertida de 19 pb que está unida mediante el represor de tetraciclina) . Corriente abajo del polienlazador hay una secuencia de poli (A) de SV40. En ausencia de tetraciclina, se puede unir tTA a la secuencia tetO y promover la transcripción del gene corriente abajo. En presencia de tetraciclina (1-2 mg/ml en el medio de cultivo) tTA ya no se puede unir a tetO, y se desconecta la transcripción del gene corriente abajo: + tetraciclina : gene OFF; - tetraciclina : gene ON. Para establecer una línea de células que exprese de manera estable el transactivador tTA y los genes E2-C/UbcHl|? humanos, inducibles, se selecciona una línea de células adecuada para esos estudios. Se ha descrito líneas de células estables que expresan el transactivador tTA , por ejemplo, la línea de células de fibroblasto de embrión de rata, Rat-1 (Resnitzky y coautores (1994), Mol . Cell Biol , 14: 1669-1679), y células HeLa (Gossen y coautores (1992) Proc . Nati . Acad. Sci USA, 89: 5547-5551). También se puede expresar tTA en una línea de células humanas no transformadas, tales como IMR-90 o fibroblastos de prepucio humano, por ejemplo, ya que esas líneas pueden ser sincronizadas mediante un método de escasez/estímulo de suero, como se describió. Se transfecta las células con 10 µg de pUHD15-l neo linealizado usando la técnica de precipitación de fosfato de calcio (Chen y coautores (1988), BioTechniq, 6 : 632-38) . Se selecciona clones en presencia de 400" µg/ml de G418 activo (Geneticin; GIBCO BRL, Fredrick, MD, E. U. A.) y se prueba en cuanto a su capacidad para inducir la expresión del promotor teto en análisis de transfección transitoria. Por ejemplo, se transfecta 10 µg de plásmido derivado de pUHD10-3 que lleva un gene UbcHIO marcado, en estos clones, en presencia o ausencia de 1 µg/ml de tetraciclina, en el medio de cultivo. Después de 48 horas se prepara los extractos de proteína de esas células, se separa las proteínas mediante SDS-PAGE y se analiza mediante inmunotinción con anticuerpo AU1 tal como se describe más arriba. Se selecciona un clon que pueda expresar UybcHIO marcado en ausencia, pero no en presencia, de tetraciclina. Para obtener líneas de células que expresen de manera estable los genes UbcHIO inducibles, se transfecta clones que expresen tTA (véase más arriba) con plásmidos que llevan genes UbcHIO de tipo silvestre y mutantes, marcados. Se hace esto mediante cotransfección con un plásmido que codifica un gene de resistencia a la higromicina. Se cotransfecta 10 µg de plásmido UbcHIO linealizado y 0.5 µg de plásmido de higromicina linealizado, en la línea de células que expresa tTA, usando la técnica de precipitación con fosfato de calcio. Se desarrolla las células en presencia de tetraciclina (1 µg/ml en el medio de cultivo) y se selecciona los clones en presencia de 150 µg/ml de higromicina (Calbiochem, San Diego, CA, E. U. A) . Se depura los clones resultantes en cuanto a su capacidad para expresar los genes UbcHIO mediante inmunotinción con el anticuerpo AU1 como se describe más arriba. Luego se mantiene clones positivos en el medio que contiene 2 µg/ml de tetraciclina, 150 µg/ml de higromicina y 350 µg/ml de G418 y se usa para experimentos subsecuentes . Para expresión en células COS, se desarrolló células a 37°C bajo 15% de CO2 en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) , complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) . Para transfección se mantuvo las células en fase logarítmica y se subcultivó células casi confluentes a una dilución de 1:4 el día antes de la transfección. Se enjuagó las células en platos de 100 mm dos veces en DMEM libre de suero y se incubó durante 30 minutos con 2.5 µg de ADN plásmido, 1.5 mi de DEAE Dextran (1 mg/ml) en TBS (25 mM de Tris-HCl, pH 7.4, 140 mM de NaCl , 5 mM de KCl) y 1.5 mi de DMEM libre de suero. Se añadió ADN al DMEM primero para prevenir la precipitación. Se eliminó la mezcla de ADN y se incubó las células en DMEM que contenía 10% de FBS y l'OO µg/ml de cloroquina durante 3-4 horas. Al finalizar este periodo se incubó las células en DMEM que contiene suero, hasta la fijación o la cosecha. Para inducir la expresión de genes E2-C/UbcH10 en células sincronizadas, se sincroniza células no transformadas usando la técnica de agotamiento/estímulo de suero (Resnitzky y coautores (1994) Mol. Cell Biol, 14: 1669-1679. Se siembra líneas de células que contienen genes UbcHIO establemente integrados e inducibles (véase más arriba) a 2 x 10 células por placa de cultivo de tejido de 60 mm de diámetro (al menos 2 placas por línea de célula para comparar la expresión en presencia y en ausencia de tetraciclina) en el medio que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 2 µg/ml de tetraciclina. Después de 24 horas se reemplaza el medio en las células con medio que contiene 0.1% de FCS (agotamiento de suero) y 2 µg/ml de tetraciclina. Se reemplaza el medio 48 horas después por medio que contiene 0.1% de FCS con o sin 2 µg/ml de tetraciclina. Después de 24 horas se induce a las células a reingresar al ciclo de células en sincronía, reemplazando el medio por medio que contiene 10% de FCS (estimulación con suero) con o sin 2 mg/ml de tetraciclina. Se cosechó las células en diversos momentos después de salir del agotamiento para la extracción de proteína/mARN (véase más arriba) i análisis del ciclo de células (véase más adelante) . Para analizar el ciclo de célula de las células sincronizadas, se marca las células durante 15-30 minutos con bromodesoxiuridina (BrdU, Amersham, Chicago, IL E. U. A.), luego se las fija y tiñe con antiBrdU conjugada con isotiocianato de fluoresceína (Becton Dickinson, Mountain View, CA) y yoduro de propidio (Pl) , Calbiochem, San Diego, CA, E. U. A. ) . A continuación se analizó las células teñidas en un clasificador de células activado por fluorescencia (por ejemplo, FACScan; Becton Dickinson, Mountain View, CA, E. U. A.) para determinar el porcentaje de células en diferentes fases del ciclo de las células y comprobar de esa manera el grado de sincronía de las células (Resnitzky y coautores (1995), Mol . Cell . Biol . , 15: 4347-4352). Luego se prueba los efectos de los mutantes E2- C/UbcHIO humanos sobre el avance del ciclo, de la siguiente manera: Se sincroniza las líneas de células que contienen los genes UbcHIO de tipo silvestre y mutantes C(114)s y C(114)S, L(118)S, marcados, tal como se describió anteriormente, y se los induce a expresar los genes UbcHIO. La capacidad de las líneas de células para entrar en la fase S se vigila mediante citometría de flujo, tal como se describió más arriba. La capacidad de las células para sufrir mitosis se determina retirando las células en diversos puntos del tiempo después de salir del agotamiento y vigilando el microtúbulo y los patrones de tinción mediante inmunofluorescencia. Se puede distinguir diferentes etapas en el ciclo de la célula y las diferentes etapas de mitosis, por observación al microscopio. Se fija las células a la temperatura ambiente con 50% en volumen/volumen de metanol/acetona, durante 2 minutos o con 3% de formaldehído durante 5 minutos, seguido por permeabilización con 0.5% de Tritón X-100 durante 10 minutos. Luego se incuba con anticuerpos contra b-tubulina (Amersham, Chicago, IL, E. U. A. ) , diluida a la concentración apropiada en BSA al 3% en PBS durante una hora a la temperatura ambiente. Después de incubación de anticuerpo primario, se lava las células tres veces con 0.5% de BSA en PBS, y se las incuba con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescente, adecuado (Amersham, Chicago, IL, E. U. A.) durante una hora, a la temperatura ambiente. Se lava las células como antes, luego se las incuba con 0.1 µg/ml de 4 ' , 6 ' -diamino-2-fenilindol (DAPI, Sigma, St .

Louis, MO, E. U. A.) en PBS durante 10 minutos, a la temperatura ambiente, para manchar el ADN. Esto permite la detección de cualquier demora en el ciclo de célula y/o alteraciones en la morfología de la célula, que resulten de la expresión de los mutantes UbcHIO. Si las células que expresan los genes UbcHIO mutantes no pueden entrar en la fase S, esto indicará que la proteína UbcHIO está involucrada en la transición de fase Gl/S y, de tal manera, está involucrada en la ubiquitinacióin de proteínas en las etapas del ciclo de célula diferentes de la mitosis. La expresión de los mutantes UbcHIO puede bloquear las células antes de la anafase, lo que indica que se requiere la proteína UbcHIO para que las células salgan de la mitosis y entren en Gl del siguiente ciclo de célula. La expresión de la proteína de tipo silvestre es usada como control para esos experimentos. Si las proteínas UbcHIO mutantes bloquean el avance del ciclo de célula en diferentes etapas, entonces las proteínas que se sabe que se degradan durante esas fases (véase más arriba) son vigiladas para ver si están estabilizadas en las células detenidas. Se prepara extractos de proteína a partir de las células detenidas y se las inmunotiñe con anticuerpos apropiados, tal como se describió anteriormente, para ver si estas proteínas están presentes a niveles más altos que lo normal en las células detenidas . Para determinar la localización de la proteína humana E2-C/UbcH10 a través . del ciclo de célula, se sincroniza las células y se las induce a expresar el gene UbcHIO de tipo silvestre, marcado con DTYRYI o sin marcar, tal como se describió más arriba. En diferentes puntos de tiempo después que salen del agotamiento, se retira las células, se las fija y 5 tiñe con el anticuerpo AU1 o con anticuerpos anti-UbcHIO para determinar la localización de UbcHIO en cada punto del tiempo en particular. Se co-tiñen las células con el anticuerpo b- tubulina y DAPI, tal como se describió antes, para ver si UbcHIO se asocia con estructuras conocidas, tales como los microtúbulos, los centrosomas o el ADN. También se co-tiñe las ^ células con anticuerpos contra cdcl6Hs humano y Cdc27Hs (John Hopkins School of Medicine, Baltimore, MD, E. U. A.) para determinar si hay co-localización entre UbcHIO y componentes conocidos del complejo promotor de ciclosoma/anafase (APC) s 15 (King y coautores (1995), Cell , 81: 279-288; Tugendreich y coautores (1995), Cell 81: 261-268). Se identifica de la siguiente manera los dominios compatibles del péptido UbcHIO. Se "mapea" la secuencia de UbcHIO sobre las estructuras cristalinas Ubc existentes (Cook y coautores (1992), J". Biol . Chem. , 267: 15116-21; Cook y coautores (1993) Biochem. , 32: 13809-13817) para identificar las regiones en la superficie. Luego se prueba los péptidos que corresponden a esas regiones por su efecto sobre la ubiquitinación de la ciclina in vitro, usando el análisis descrito arriba. Se puede usar cualquier péptido que bloquee la ubiquitinación como compuesto "conductor" para el diseño racional de agentes terapéuticos que son permeables a las células y pueden ser usados potencialmente para bloquear la ubiquitinación de la ciclina y, de tal manera, el ciclo de la ft célula, in vivo. 5 ' Para identificar las proteínas que interactúan con UbcHIO se diseña un sitio de fosforilación con la proteína- cinasa (PKA) dependiente de cAMP, en el gene UbcHIO usando RCP (Kaelin, Jr., y coautores (1992), Cell 70: 351-364); Songyang y coautores (1994) Curr. Biol . , 4: 973-982. Se expresa la proteína modificada en E. coli y se fosforila in vitro con PKA y con ATP radiomarcado. Se incuba UbcHIO marcado con la enzima » El en presencia de ubiquitina y ATP para formar el ti?léster de UbcHIO-ubiquitina. Se usa éste para sondear las manchas de todos los lisatos de célula y/o los complejos de ciclosoma purificados para depurar las proteínas que interactúan, tal como se describió para E2-C de almeja (véase más atrás) . Alternativamente se usa el anticuerpo AU1 para Xnmunoprecipitar las proteínas de los extractos de célula total para mirar las proteínas que interactúan con UbcHIO. Se indujo 20 2.5 x 10 células a expresar UbcHIO de tipo silvestre, o se marca los mutantes UbcHIO con 1 µCi de 35S-TransLabel, se lava dos veces con medios completos, luego se lava con PBS frío. Se prepara extractos para inmunoprecipitación, incubando las células en 100 µl de regulador de lisis (50 mM de Tris-HCl, pH 25 8.0, 150 mM de NaCl , 1% de Tritón X-100, 0.5% de desoxicolato de Na, 1 µg/ml de N-tosil-L-fenilalanina-clorometilcetona, 0.1 µg/ml de Pepstatin, 50 µg/ml de N-tosil-L-lisina- clorometilcetona, 50 µg/ml de antidolor, 40 µg/ml de PMSF, 12 µg/ml de fosfoamidon, 6 µg/ml de leupeptin, 6 µg/ml de aprotinina) . Se formó vértice en los extractos y se los 5 centrifugó durante 10 minutos a 14,000 rpm a 4°C para formar pellas de los núcleos y demás material insoluble. • Se añade una cantidad apropiada del anticuerpo AU1 al extracto y se incuba la reacción a 4°C durante una hora. Se añade 25 mi de una suspensión al 50% en volumen/volumen de perlas de proteína A- 10 Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ, E. U. A.), en PBS, y se • hace girar los tubos durante una hora a 4°C. Se recoge las perlas mediante centrifugación, se lava en regulador RIPA (50 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM de NaCl, 1% de Tritón X-100, 0.5% de desoxicolato de Na, 0.1% de SDS, 1 mM de EDTA, 100 µM de PMSF) a 4°C, y se deja a ebullición en 50 mi de regulador de muestra de SDS. A continuación se resuelve las muestras mediante SDS-PAGE y fluorografía (Brown y coautores (1994) , J.

^ Cell Biol . , 125: 1303-1312). La proteína UbcHIO marcada también es probada en cuanto a su capacidad para coprecipitar componentes conocidos del ciclosoma/APC. Se prepara extractos de inmunoprecipitación como se describió anteriormente, pero no se marca las células . Se resuelve las muestras de proteína procedentes de la inmunoprecipitación, mediante SDS-PAGE, se transfiere las muestras a Immobilon (Millipore, Bedford, MA, E.

U. A.) y se inmunotiñen con anticuerpos contra Cdcl6Hs y Cdc27Hs humanos, siguiendo los protocolos del fabricante.

EQUIVALENTES Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de determinar, usando no más que experimentación rutinaria, numerosos equivalentes de las sustancias específicas y de los procedimientos aquí descritos. Se considera que dichos equivalentes están dentro del alcance de esta invención y están protegidos por las reivindicaciones que vienen a continuación .

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un polipéptido portador de ubiquitina (Ubc) aislado y purificado, involucrado en la ubiquitinación de ciclina A y/o B y que tiene una secuencia de aminoácidos con alrededor de 94 a 100% con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO : l o SEQ ID NO : 3. 2.- El polipéptido portador de ubiquitina (Ubc) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque está involucrado en la ubiquitinación de ciclina A. 3.- El polipéptido portador de ubiquitina (Ubc) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque está involucrado en la ubiquitinación de ciclina B. 4.- El polipéptido portador de ubiquitina (Ubc) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque es producido de manera recombinante . 5. - Un fragmento enzimáticamente activo del Ubc de la reivindicación 1. 6.- El polipéptido portador de ubiquitina (Ubc) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque es un polipéptido humano. 7.- El polipéptido portador de ubiquitina (Ubc) de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1. 8.- El polipéptido portador de ubiquitina (Ubc) de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1. 9.- El polipéptido portador de ubiquitina (Ubc) de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque está codificado por un ácido nucleico hibridable con un segundo ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO:

2. 10.- El polipéptido portador de ubiquitina (Ubc) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el Ubc es un polipéptido de almeja. 11.- El polipéptido portador de ubiquitina (Ubc) de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO : 3. 12.- El polipéptido portador de ubiquitina (Ubc) de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 3. 13.- El polipéptido portador de ubiquitina (Ubc) de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque está codificado por un ácido nucleico hibridable con un segundo ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 4. 14. - Un ácido nucleico hibridable con un segundo ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico expuesta como SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO : 4. 15. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque codifica un fragmento enzimáticamente activo del Ubc de la reivindicación 1. 16.- El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque codifica un Ubc que tiene una secuencia de aminoácidos con alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1. 17. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque codifica un Ubc que tiene una secuencia de aminoácidos con alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:

3. 18. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque es hibridable con un segundo ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 2, y que codifica el Ubc de la reivindicación 1. 19. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque es hibridable con un segundo ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 4, y que codifica el Ubc de la reivindicación 1. 20.- El ácido nucleico de conformidad con la 5 reivindicación 14, caracterizado además porque es un cADN. 21.- El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta como SEQ ID NO: 2. 22.- El ácido nucleico de conformidad con la 10 reivindicación 20, caracterizado además porque comprende la _ secuencia de ácido nucleico expuesta como SEQ ID NO:

4. 23.- Un inhibidor selectivo del Ubc de la reivindicación 1. 24. - El inhibidor de conformidad con la reivindica- 15 ción 23, caracterizado además porque es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido con alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácido expuesta en SEQ ID NO: 6 O SEQ ID NO : 8. ^^ 25.- El inhibidor de conformidad con la reivindica- 20 ción 23, caracterizado además porque es un mutante dominante negativo . 26.- El mutante dominante negativo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque es producido de manera recombinante 25 27.- El mutante dominante negativo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque comprende un residuo de serina en la posición 114, sustituido por un residuo de cisteína. 28. - Un fragmento del mutante dominante negativo de la reivindicación 25, caracterizado porque inhibe la función 5 del Ubc. 29.- El mutante dominante negativo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque inhibe la función de un Ubc humano . 30.- El mutante dominante negativo de conformidad con 10 la reivindicación 29, caracterizado además porque es codificado por un ácido nucleico hibridable con un segundo ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO:

5. 31.- El mutante dominante negativo de conformidad con -í 15 la reivindicación 25, caracterizado además porque inhibe la función de un Ubc de almeja. 32.- El mutante dominante negativo de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque está « codificado por un ácido nucleico hibridable con un segundo 20 ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO : 7. 33. - Un ácido nucleico caracterizado porque codifica el mutante dominante negativo de la reivindicación 25. 34. - El ácido nucleico de conformidad con la 25 reivindicación 33, caracterizado además porque es hibridable con un segundo ácido nucleico que tiene la secuencia de secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1. 42. - El equipo de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la ciclina que va a ser ubiquitinada es ciclina A o ciclina B, y el complejo de ubiquitina-polipéptido portador de ubiquitina comprende el Ubc de la reivindicación 10. 43.- El equipo de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque el Ubc del complejo tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 3. 44.- Un equipo útil para la ubiquitinación y la degradación de una ciclina, caracterizado porque comprende: (a) ubiquitina; (b) una enzima activadora de ubiquitina (El) ; (c) ATP; (d) el Ubc de la reivindicación 1 o de la reivindicación 5; y (e) una ubiquitina-ligasa (E3) . 45.- El equipo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque la ciclina que va a ser degradada es ciclina A o ciclina B; y el polipéptido portador de ubiquitina es UbcH10_ humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1. 4

6.- El equipo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque la ciclina que va a ser degradada es ciclina A o ciclina B; y el polipéptido portador de ubiquitina es UbcHIO humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 3. 4

7.- Un método para ubiquitinar una ciclina y/o determinar como destino una ciclina para su destrucción, caracterizado porque comprende el paso de poner en contacto la ciclina con: (a) un complejo de ubiquitina-proteína portadora de ubiquitina, en el que la proteína portadora de ubiquitina es el Ubc de la reivindicación 1 o de la reivindicación 5; y (b) una ubiquitina-ligasa (E3) . 4

8.- Un método para inhibir la proliferación de una célula, carasterizado porque comprende el paso de poner en contacto la célula con un. inhibidor selectivo del Ubc de la reivindicación 1, en una cantidad suficiente para inhibir la ubiquitinación de una ciclina. 4

9.- El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque el inhibidor administrado es un mutante dominante negativo de un Ubc, que tiene una secuencia de aminoácidos con 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO : 8. 50.- El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque el mutante dominante negativo tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8. 51.- El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque el mutante dominante negativo tiene un residuo serina en la posición 114, sustituido por un residuo cisteína. 52.- El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque el mutante dominante negativo es codificado por un ácido nucleico que es hibridable con el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO : 5. 53. - El método de conformidad con la reivindicación ) 49, caracterizado además porque el mutante dominante negativo 5 es codificado por un ácido nucleico que es hibridable con el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 7. 54. - Un método para depurar compuestos que inhiben la función de Ubc, caracterizado porque comprende los pasos de: 10 (a) proveer un análisis para medir la función de Ubc, en donde _^ el análisis comprende un polipéptido portador de ubiquitina, seleccionado del grupo que consiste de un polipéptido portador de ubiquitina involucrado en la ubiquitinación de ciclina A y/o de ciclina B, y que tiene una secuencia de aminoácidos con 15 alrededor de 94-100% de homología con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, y un fragmento enzimáticamente activo del mismo; (b) efectuar el análisis en presencia y en ausencia de un compuesto que va a ser probado; y (c) determinar la cantidad de cambio en la 20 función de Ubc, medida en presencia del compuesto, en comparación con la función de Ubc medida en ausencia del compuesto; indicando una reducción de la función de Ubc medida en presencia del compuesto, que el compuesto es un inhibidor de la función de Ubc. 25 55.- El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque el polipéptido portador de 122 formado en presencia del compuesto, que el compuesto inhibe la ubiquitinación de la ciclina. 59. - El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque el polipéptido portador de ubiquitina es aislado y purificado. 60. - El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque se selecciona el polipéptido portador de ubiquitina del grupo que consiste de E2-C de almeja que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; UbcHIO humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1; y un fragmento enzimáticamente activo de los mismos . 61.- Un inhibidor de la ubiquitinación de ciclina, caracterizado porque es identificado mediante el método de la reivindicación 58. 62.- Una formulación terapéutica, caracterizada porque comprende un inhibidor selectivo del Ubc de la reivindicación 1, en una cantidad suficiente para inhibir la ubiquitinación de una ciclina, y un portador farmacéuticamente aceptable. 63. - La formulación terapéutica de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada además porque el inhibidor comprende un mutante dominante negativo del Ubc, o un fragmento del mismo, capaz de inhibir la función de Ubc. 64. - La formulación terapéutica de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada además porque el mutante 123 dominante negativo tiene un residuo serina en la posición 114 sustituido por un residuo cisteína. 65. - La formulación terapéutica de conformidad con la P reivindicación 63, caracterizado además porque el mutante 5 dominante negativo tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90-95% de homología con la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 6. 66. - La formulación terapéutica de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada además porque el mutante 10 dominante negativo es codificado por un ácido nucleico ^ hibridable con un segundo ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO : 5. , 67.- La formulación terapéutica de conformidad con la reivindicación 63 , caracterizado además porque el mutante 15 dominante negativo tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90-95% de homología con la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 8. 68. - La formulación terapéutica de conformidad con la É ^m reivindicación 67, caracterizada ademas porque el mutante 20 dominante negativo es codificado por un ácido nucleico hibridable con el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como SEQ ID NO: 7. 69.- Un polipéptido portador de ubiquitina {Ubc) , caracterizado porque comprende los aminoácidos 33 a 179 de SEQ 25 ID NO: 1. 70.- Un polipéptido portador de ubiquitina (Ubc), 124 caracterizado porque comprende los aminoácidos 33 a 177 de SEQ ID NO : 3. 71 — El mutante dominante negativo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6 o en SEQ ID O: 8.