MXPA98006655A - Agente de contraste termicamente estabilizado - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una vesícula secada por congelado que contiene gente de contraste para ultrasonido que contiene un estabilizador secado por congelado y térmicamente estable a temperaturas en exceso de 20øC.

Description

Agente de contraste térmicamente estabilizado ^^ Esta invención se refiere a vesícula secada por congelado térmicamente estabilizada que contiene agentes de contraste para ultrasonido y un proceso para su preparación.

Las vesículas (el término se usa aquí para denotar estructuras unilamelares y multilamelares, p. ej . estructuras «gue se refieren diversamente a liposomas, micelas, microburbujas y microesferas) se usan frecuentemente como un W medio para liberar agentes terapéutica o diagnósticamente activos. En el campo del medio de contraste de imagen para ultrasonido, las' vesículas que contienen materiales (aquí referido como materiales vesiculares) que son gaseosos a temperaturas corporales podrían usarse como agentes de contraste ecogénicos, particularmente para la administración en vascularidad.

El medio de contraste vascular se administrará en general en la forma de una dispersión acuosa que contiene una baja concentración de las vesículas con relación al medio de vehículo acuoso. Por lo tanto el almacenamiento y transportación de tales agentes de contraste vesicular es hecho significativamente más eficiente si las vesículas pueden almacenarse en una forma seca.

REF.: 28165 El secado por congelado de composiciones vesiculares es posible y, por esto, en general se incluyen formulaciones de excipientes en la composición para ayudar a la técnica de secado. Tales excipientes en general cumplen una de dos funciones . Los agentes voluminosos se adicionan para aumentar el contenido de sólidos totales para obtener un producto mecánicamente más fuerte. Los estabilizadores, referidos de otra forma como crioprotectores o lioprotectores, se adicionan para ayudar a la formación del estado cristalino -LO producido durante la deshidratación y para proporcionar resistencia física en el producto secado. Ejemplos de estabilizadores usados de esta manera incluyen manitol y glucosa.

Los agentes de contraste para ultrasonido vesicular secada por congelado proporcionan ventajas para el transporte y almacenamiento debido a la reducción en volumen con ? relación a las dispersiones listas para uso, también proporcionan problemas dado que el producto secado por congelado no es térmicamente estable en el rango de temperaturas ambiente encontradas normalmente durante la transportación y almacenamiento y como resultado deben mantenerse, antes de la producción secundaria, en un ambiente en el cual la temperatura se mantenga abajo de la ambiente (p. ej . de 5 a 10°C) .

Se ha encontrado ahora sorprendentemente que mediante la elección apropiada del estabilizador usado para secado por congelado es posible producir agentes de contraste para ultrasonido vesiculares secados por congelado los cuales son térmicamente estables y las temperaturas ambientales y por encima, y de hecho en todas las temperaturas encontradas normalmente durante la transportación y almacenamiento .

El producto secado por congelado térmicamente estable después podría almacenarse y transportarse sin necesidad de controlar la temperatura de su ambiente y en particular podría suministrarse a hospitales y médicos para formulación en el sitio en una dispersión administrable sin requerir «que tales usuarios tengan facilidades de almacenamiento especiales .

De esta manera se observa un aspecto la invención proporciona una vesícula secada por congelado que contiene agente de contraste para ultrasonido que contiene un estabilizador secado por congelado y térmicamente estable a temperaturas en exceso de 20°C, preferentemente al menos 22°C, especialmente 22°C, al menos 25°C, más preferentemente al menos 30°C y en especial preferentemente al menos 40°C, p.. ej . hasta 65°C o mayor. Alternativamente se observa que la invención proporciona una vesícula secada por congelado que contiene agente de contraste para ultrasonido que contiene un estabilizador secado por congelado y que tiene una temperatura de transición cristalina (Tg) arriba de 20°C, preferentemente 22°C, en especial preferentemente al menos 25°C, más preferentemente al menos 30°C y en especial preferentemente 40°C, p. ej . hasta 65°C o mayor.

Como se observa de un aspecto adicional la invención proporciona un proceso para la preparación de una vesícula secada por congelado térmicamente estable que contiene agente de contraste para ultrasonido, el proceso comprende congelar-secar una dispersión acuosa que comprende un agente de contraste para ultrasonido vesicular y un estabilizador secado por congelado o mezcla de estabilizadores, caracterizado porque el estabilizador o mezcla de estabilizadores tiene un valor de Tg de al menos 20°C (preferentemente al menos 22°C, en especial al menos 25°C, más preferentemente al menos 30°C y en especial preferentemente al menos 40°C, p. ej . hasta 65°C o mayor) y un valor de Tg' de -37°C o por encima (preferentemente por encima de -36°C, en especial preferentemente por encima de -35°C, p. ej . -10 a -37°C) .

Como se observa de un aspecto adicional la invención proporciona un medio de contraste para ultrasonido que contiene un medio de vehículo acuoso, un estabilizador secado por congelado o una mezcla de estabilizadores y un agente de contraste para ultrasonido vesicular ecogénico, caracterizado porque el estabilizador o mezcla de estabilizadores tiene un valor de Tg de al menos 20°C, (preferentemente al menos 22°C, en especial al menos 25°C, más preferentemente al menos 30°C y en especial preferentemente al menos 40°C, p. ej . hasta 65°C o mayor) y un valor de Tg1 de -37°C o por encima (preferentemente por encima de -36°C, en especial preferentemente por encima de -35°C, p. ej . -10 a -37°C) .

• Como se observa de un aspecto adicional la invención proporciona el uso de un estabilizador de secado congelado o mezcla de estabilizadores que tienen un valor de Tg de al menos 20°C, (preferentemente al menos 22°C, en especial al menos 25°C, más preferentemente al menos 30°C y en especial preferentemente al menos 40°C, p. ej . hasta 65°C o mayor) y un valor de Tg' de -37°C o por encima (preferentemente por encima de -36°C, en especial preferentemente por encima de - 35°C, p. ej . -10 a -37°C) para la elaboración de una vesícula que contiene medio de contraste para ultrasonido para usar en diagnosis que involucra el diagnóstico de imagen para ultrasonido.

Como se observa de un aspecto adicional la invención proporciona un proceso para el almacenamiento o transportación de un agente de contraste para ultrasonido vesicular, caracterizado porque el agente está en la forma de secado por congelado, contiene un estabilizador secado por congelado y tiene una temperatura de transición vitrea (Tg) de al menos 20°C (preferentemente al menos 22°C, etc.), y que el almacenamiento y 'transportación toma lugar sin enfriamiento .

Como se observa de un aspecto adicional . la invención proporciona un proceso para la preparación de una vesícula que contiene medio de contraste para ultrasonido, el proceso comprende dispersión de un agente de contraste secado por congelado de acuerdo a la invención en medio de dispersión acuosa fisiológicamente tolerable.

Para cualquier material, Tg es la temperatura de transición vitrea del material secado mientras que Tg1 es la temperatura de transición vitrea . de la solución acuosa pura máximamente concentrada por congelado del material .

A parte de la estabilidad térmica mejorada, los agentes de contraste vesicular secados por congelado de acuerdo a la invención también mejoran sorprendentemente la capacidad de las vesículas para retener los gases hidrocarburos y los gases precursores comúnmente usados en los agentes de contraste para ultrasonido.

En la invención, el agente de contraste para ultrasonido podría ser cualquier agente vesicular ecogénico fisiológicamente tolerable, sin embargo preferentemente las vesículas contendrán un gas o gas precursor (p. ej . un compuesto o mezcla de compuesto es cual es sustancialmente en la forma gaseosa (incluyendo vapor) a las temperaturas normales del cuerpo humano (37°C) ) . Podría emplearse cualquier gas biocompatible, gas precursor o mezcla. De esta manera el gas podría, por ejemplo, comprender aire; nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono; hidrógeno; óxido nitroso; un gas inerte tal como helio, argón, xenón o riptón; un fluoruro de azufre tal como hexafluoruro de azufre, decafluoruro de diazufre o pentafluoruro de trifluorometilazufre; hexafluoruro de selenio; un silano opcionalmente halogenado tal como tetrametilsilano; un hidrocarburo de bajo peso molecular (p. ej . que contenga hasta 7 átomos de carbono) , por ejemplo un alcano tal como metano, etano, propano, butano, o pentano, o un cicloalcano tal como ciclobutano o ciclopentano, un alqueno tal como propeno o un buteno, o un alquino tal como acetileno; un éter; una cetona; un éster; un hidrocarburo halogenado de bajo peso molecular (p. ej . que contenga hasta 7 átomos de carbono) ;' o una mezcla de cualquiera de los anteriores. Al menos unos átomos de halógeno en los gases halogenados son ventajosamente átomos de flúor. Así los gases hidrocarburos halogenados biocompatibles. podrían, por ejemplo, seleccionarse de bromscl orodi f luoromet ano , bromotrif luorometano , clorodif luorometano , clorotrif luorometano , cloropentaf luoroetano , diclorotetrafluoroetano y perf luorocarburos p. ej . perfluoroalcanos tales como perf luorometano, perf luoroetano, perf luoropropanos, perf luorobutanos (p. ej . perf luoro-n-butano, opcionalmente en mezcla con otros isómeros tales como perfluoro- iso-butano) , perf luoropentanos, perf luorohexanos y perf luoro eptanos ; perf luoroalquenos tales como perf luoropropeno, perf luorobutenos (p. ej . perf luorobut-2-eno) y perf luorobutadieno; perf luoroalquinos tales como perf luorobut-2-ino; y perf luorocicloalcanos tales como perfluorociclobutano, perfluorometilciclobutano, perfluorodimetilciclobutanos, perfluorotrimetil-ciclobutanos, perf luoroc i cl open taño, perf luorometil -ciclopentano, perf luorodime til ciclopent anos , perf luoroc i clohexano, perf luoromet ilciclohexano y perf luorocicloheptano. Otros gases halogenados incluyen fluorados, p. ej . perfluorados, cetonas tales como perfluoroacetona y fluorados, p. ej . perfluorados, éteres tales como perf luorodietil éter.

En particular preferentemente, las vesículas contendrán un perfluoroalcano, especialmente un perfluorobutano, perfluoropentano o perfluorohexano, en particular n-perfluorobutano .

En las vesículas, las membranas podrían formarse de cualquier material que forma membrana fisiológicamente tolerable, en particular fosfolípidos, y podría ser de enlace cruzado y de no enlace cruzado. Las membranas formadas de mezclas de fosfolípidos cargados y no cargados se prefieren especialmente y se prefiere particularmente que las vesículas deberían portar una carga superficial neta, preferentemente una carga negativa. Tales vehículos fosfolípidos tienen particularmente tiempos de residencia sanguíneos favorables.

Las vesículas podrían proporcionarse además con un agente de prolongación de residencia sanguínea, p. ej . conjugando tal agente a una membrana a un grupo lipofílico el cual soportará dentro de la membrana. Tales agentes de prolongación de residencia sanguínea, p. ej . óxidos de polialquileno tales como polietilen glicol, pueden actuar como inhibidores de opsonisación que retardan la entrada de las vesículas del vasculatorio por el sistema reticuloendotelial .

Deseablemente al menos 75%, preferentemente sustancialmente todo el material fosfolípido en los agentes de contraste de la invención consisten de moléculas crue • . . . soportan individualmente una carga global neta bajo condiciones de preparación y/o uso, esta carga podría ser positiva o, más preferentemente, negativa. Fosfolípidos cargados positivamente representativos incluyen esteres de ácidos fosfatídicos tales como ácido dipalmitoilfosfatídico o ácido distearoilfosfatídico con aminoalcoholes tales como hidroxietilendiamina. Ejemplos de fosfolípidos cargados ^ negativamente presentándose naturalmente incluyen (p. ej . derivados de soya o yema de huevo), semisintéticos (p. ej . parcialmente o completamente hidrogenados) y fosfatidilserinas sintéticas, fosfatidilgliceroles, fosfatidilinositoles, ácidos fosfatídicos y cardiolipinas . Los grupos acilo grasos de tales fosfolípidos contendrán cada uno típicamente aproximadamente 14-22 átomos de carbono, por ejemplo como en los grupos palmitoilo y estearoilo. Las formas liso de tales fosfolípidos cargados también son útiles de acuerdo con la invención, el término "liso" denota fosfolípidos que contienen solo un grupo acilo graso, que es preferentemente éster enlazado a átomo de carbono en la posición 1 del radical glicerilo. Tales formas liso de fosfolípidos cargados podrían usarse ventajosamente en mezcla con fosfolípidos cargados que contienen dos grupos asilo grasos .

Las fosfatidilserinas representan fosfolípidos particularmente preferidos para usar en agentes de contraste de acuerdo a la invención y constituyen preferentemente una parte sustancial, p. ej . al menos 80% del contenido de fosfolípido inicial del mismo, por ejemplo 85-92%, aungue esto podría reducirse subsecuentemente un tanto, p. ej . a ca. 70%, en el procesamiento subsecuente tal como esterilización con calor. No deseamos asegurar mediante consideraciones teóricas, podría ser «que el puente iónico entre los grupos carboxilo y amino de los radicales de serina adyacentes contribuyen a la estabilidad de tales sistemas. Las fosfatidilserinas preferidas incluyen fosfatidilserina natural saturada (p. ej . hidrogenada o sintética) y dialcanoilfosfatidilserinas sintéticas o semisintéticas tales como distearoil-fosfatidilserina, dipalmitoilfosfatidilserina y diaraquidoilfosfatidilserina.

Una ventaja importante del uso de tales agentes de contraste basados en fosfatidilserina es que el cuerpo reconoce células de glóbulos rojos adultas y plaquetas mediante altas concentraciones de fosfatidilserina sobre su superficie y de esta manera podrían eliminar tales agentes de contraste de la corriente sanguínea de una manera similar a la eliminación de células de glóbulos rojos adultos. Además, dado gue la superficie de" tales agentes de contraste podría g^ registrarse como endógena por el cuerpo, podrían evitar la inducción de efectos laterales sistémicos adversos tal como 5 efectos hemodinámicos y otras reacciones anafilácticas que podrían acompañar la administración de algunas preparaciones liposomales (ver p. ej . O-A-95/12386) .

Los agentes de contraste para ultrasonido liposomales ^ para usar de acuerdo a la invención podrían prepararse como w 10 se describe en la literatura, ver por ejemplo O-A-92/22247, O-A-94/28780, O-A-93/05819 , O-A-95/16467 , PCT/GB96/01361 y Unger et al. Invest. Radiol . 2=. (Suppl. 2): S134-S136 (1994) .

El estabilizador usado de acuerdo a la invención podría 15 ser un estabilizador secado por congelado fisiológicamente tolerable (o mezcla) que tiene una temperatura de transición cristalina (Tg) por encima de 20°C, p. ej . en el rango de 25 a 70°C, y que tiene un valor de Tg' de -37°C o por encima. Ejemplos de estabilizadores apropiados incluyen sacarosa, 20 maltosa -H20, trehalosa, rafinosa y estaquiosa. Un ejemplo particularmente apropiado es sacarosa, opcionalmente en mezcla con cantidades menores (p. ej . hasta 20% en peso, preferentemente hasta 10% en peso) de otros estabilizadores.

En general el estabilizador estará presente en la composición que es secada por congelado a una concentración significativamente en exceso del agente de contraste vesicular, p. ej . a una relación de peso de al menos 10:1, más normalmente al menos 20:1, óptimamente tan alto como 200:1, p. ej . hasta 5000:1 o aún mayor. Por lo tanto, la contribución de la temperatura de transición cristalina (Tg) del producto secado es relativamente independiente del componente vesicular y los estabilizadores candidatos pueden protegerse fácilmente por técnicas rutinarias para determinar • si, en combinación con otros excipientes se presentan en el medio de vehículo acuoso, secar para formar un producto que tiene una temperatura de transición cristalina (Tg) por encima de 20°C.

Convenientemente el estabilizador estará presente de 1 a 50% en peso, preferentemente 5 a 30%, más especialmente • aproximadamente 10 a 20% en peso, en la composición que se somete a secado por congelado. La concentración del estabilizador podría si se desea estar muy en exceso de las concentraciones isotónicas debido a que, en la reconstitución después del secado por congelado, el producto puede diluirse. El componente de la vesícula estará preferentemente en 0.01 a 5% en peso, preferentemente 0.1 a 3%, en especial preferentemente aproximadamente 0.5 a 1.5% en peso (considerando que su peso es solo el peso del material que forma membrana) . La cantidad de estabilizador con relación al fluido de reconstitución usado para transformar el producto en una dispersión administrable será seleccionado dependiendo de la región del cuerpo u órgano a ser representado por la imagen y sobre la forma de administración elegida. A manera de ejemplo podría ser al menos dos veces la composición a la cual se sometió a secado por congelado.

Para aplicaciones para ultrasonido tal como ecocardiografía, para permitir el paso libre a través del sistema pulmonar y para lograr resonancia con las frecuencias de imagen preferidas de aproximadamente 0.1-15 MHz, podría ser conveniente emplear vesículas que tienen un tamaño promedio de 0.1-10 µm, p. ej . 1-7 µm. Las vesículas podrían producirse con una distribución de tamaño de partícula estrecho dentro del rango preferido para ecocardiografia, mejorando de este modo ampliamente su ecogenicidad además de su seguridad in vivo, y haciendo de los agentes de contraste de particular ventaja en aplicaciones tal como mediciones de la -presión sanguínea, indicación del flujo sanguíneo y tomografía para ultrasonido. Así, por ejemplo, podrían prepararse eficientemente los productos en los cuales por encima de 90% (p. ej al menos 95%, preferentemente al menos 98%) de las vesículas tienen diámetros en el rango de 1-7 µm y menor de 5% (p. ej . no mas de 3%, preferentemente no más de 2%) de las vesículas tienen diámetros por encima de 7 µm.

En aplicaciones para ultrasonido el medio de contraste podría, por ejemplo, administrarse en dosis tal que la cantidad de material que forma membrana (p. ej . fosfolípido) inyectado está en el rango de 0.1-10 µg/kg de peso corporal, más preferentemente 1-5 µg/kg. Se apreciará que el uso de tales niveles bajos de material que forma membrana es de ventaja sustancial en la minimización de posibles efectos laterales tóxicos .

La concentración global del material que forma membrana en composiciones listas para uso elaboradas usando el producto seco de la invención estarán deseablemente en el rango de 0.01 a 5% en peso, preferentemente 0.05 a 2.0% y particularmente aproximadamente 0.5% en peso.

La composición sometida a secado por congelado contendrá ventajosamente al menos un agente voluminoso, p. ej . un poliol (p. ej . un poliol C3 tal como glicerol o propilen glicol) o un polisacárido tal como dextrano, o un poliglicol tal como polietilen glicol o mezclas de los mismos. Típicamente el agente voluminoso podría usarse en concentraciones similares a o ligeramente menor que la del estabilizador, p. ej . 3 a 10% en peso, preferentemente aproximadamente 5% en peso. Los agentes voluminosos deberían tener la capacidad de cristalizar durante el proceso de secado por congelado como solo en este estado tendrán un efecto neutral sobre la estabilidad del producto. De esta manera estos se distinguen de los estabilizadores" que deberían estar presentes en el estado amorfo durante el secado por congelado.

Otros excipientes podrían si se desea estar presentes en la composición a ser secada o podrían adicionarse sobre la formulación para la formulación. Tales excipientes podrían por ejemplo incluir reguladores de pH, ajustadores de osmolalidad, mejoradores de viscosidad, emulsificadores, etc. y podrían usarse en cantidades convencionales .

El producto secado será en general en forma de polvo y es fácilmente reconstituible en agua, una solución acuosa tal como salina (que podría balancearse ventajosamente para que el producto final por inyección no sea hipotónico) , o una solución de uno o más sustancias ajustadoras de tonicidad tal como sales (p. ej . cationes de plasma con contraiones fisiológicamente tolerables) , o azúcares, alcoholes de azúcar, glicoles y otros materiales polioles no iónicos (p. ej . glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol, glicerol, polietilen glicoles, propilen glicoles y similares) . La reconstitución en general requerirá solo agitación mínima tal como podría, por ejemplo, proporcionarse por agitación manual suave. El tamaño de las vesículas así generado es consistentemente reproducible y en la práctica es independiente de la cantidad de energía agitacional aplicada, que se determina por el tamaño de las vesículas formadas en la dispersión de vesícula inicial, este parámetro de tamaño sorprendentemente se mantiene sustancialmente en el producto liofilizado y reconstituido. Así, debido a que el tamaño de las vesículas en el dispersión inicial podría controlarse fácilmente por parámetros del proceso tal como el método, la velocidad y duración de agitación, el tamaño de la vesícula final podría controlarse fácilmente.

El volumen y concentraciones del líquido de reconstitución podría balancearse deseablemente para hacer las formulaciones resultantes listas para uso esencialmente isotónicas . Por esto el volumen y concentración del fluido de reconstitución elegido será dependiente del tipo y cantidad de estabilizador (y otros agentes voluminosos) presentes en el producto secado por congelado.

Los productos liofilizados de acuerdo a la invención han demostrado ser estables en almacenamiento durante varios meses bajo condiciones ambientales. Las dispersiones de vesícula generadas debido a la reconstitución en agua (u otros líquidos de reconstitución como se discutió anteriormente) podrían ser estables para duraciones de tiempo considerables, p. ej . hasta al menos 12 horas, permitiendo flexibilidad considerable conforme el producto secado se reconstituye antes de la inyección.

Si el líquido de reconstitución contiene como un ajustador de tonicidad el mismo compuesto tanto que se usa como un estabilizador en la liofilización, la cantidad de estabilizador presente en la composición secada por congelado necesita solo ser suficiente para dar la optimización óptima durante el secado por congelado. La isotonicidad del producto final de esta manera podría obtenerse seleccionando una cantidad y concentración adecuada del líguido de reconstitución. Por esto se permite una considerable flexibilidad conforme la concentración y tipo(s) de compuesto (s) a ser usado (s) como estabilizador (es) durante la etapa de secado por congelado, y la concentración y tipo(s) de compuesto (s) en el líquido de reconstitución, mientras que se logra aún un producto reconstituido estable .

El secado por congelado de acuerdo a la invención podría efectuarse de una manera convencional aunque el uso de estabilizadores de acuerdo a la invención podría haber adicionado la ventaja que, debido a que las composiciones antes del secado en general tienen temperaturas cristalinas mayores (Tg') que las composiciones equivalentes que contienen crioprotectores tal como glucosa o manitol, podrían usarse ciclos de secado por congelado más cortos .

La invención se ha descrito anteriormente con referencia a agentes de contraste para ultrasonido vesiculares. Sin embargo también es aplicable a agentes de contraste vesicular para otras modalidades de imagen de diagnóstico (p. ej . MRl, rayos X, SPECT, PET, formación de imagen magnetográfica etc.

La invención se describirá ahora con referencia adicional a los Ejemplos no limitantes: EJEMPLO 1 Preparación del producto liofilizado 550.4 mg de fosfatidilserina hidrogenada de huevo se adicionó a 100 ml de agua que contiene 5.4% (p/p) de una mezcla de propilen glicol y glicerol (3:10 p/p) . La mezcla se agitó y calentó a 80°C durante cinco minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente, se agitó nuevamente y se dejó permanentemente toda la noche antes de su uso. 50 ml de la solución resultante se transfirió a un matraz de fondo redondo con un cuello cónico. El matraz se equipó con una chaqueta de vidrio que tiene una entrada y una salida de control de la temperatura conectada a un baño de agua que se mantuvo a 25°C. Un eje de rotor del mezclador estatório se introdujo en la solución y para evitar la fuga de gas el espacio entre la pared del cuello y el eje del mezclador se selló con un tapón enroscado de metal diseñado especialmente con una conexión de gas de entrada/salida para ajustar el contenido de gas y el control de la presión. La salida de gas se conectó a una bomba de vacío y la solución se desgasificó durante un minuto. Después se aplicó una atmósfera de gas perfluoro-n-butano por medio de la entrada de gas .

La solución se homogeneizó a 23000 rpm durante 10 minutos, manteniendo el eje del rotor del mezclador estatório tal que las aberturas estuvieron ligeramente arriba de la superficie del líquido. Se obtuvo una dispersión cremosa de color blanco, la cual se transfirió a un contenedor sellado y se niveló con perfluoro-n-butano. La dispersión después se transfirió a un embudo de separación y se centrifugó a 12000 rpm durante 30 minutos, produciendo una capa cremosa de burbujas en la parte superior y un infranadante turbio. Se removió el infranadante y se reemplazó con agua. LA centrifugación después se repitió dos veces, pero ahora a 12000 rpm durante 15 minutos. Después de la última centrifugación, el sobrenadante se reemplazó con sacarosa al 10% (p/p) . Porciones de 2 ml de la dispersión resultante se dividieron entre ampolletas de 10 ml de fondo plano diseñadas especialmente para liofilización, y las ampolletas se enfriaron a -47°C y se liofilizaron durante aproximadamente 48 horas, dando una sustancia sólida blanca esponjosa. Las ampolletas se transfirieron a una cámara de vacío, y el aire se removió mediante una bomba de vacío y se reemplazó con perfluoro-n-butano. Antes del uso, se adicionó agua y las ampolletas se agitaron manualmente suavemente durante varios segundos, dando dispersiones de microburbujas apropiadas como agentes de contraste para ultrasonido.

Caracterización La distribución de tamaño y la concentración de volumen de las microburbujas se midieron usando un aparato usando un Contador Coulter Mark II calibrado con una abertura de 50 µm con un rango de medición de 1-30 µm. Se diluyeron muestras de 20 µl en 200 ml de solución salina saturada con aire a temperatura ambiente, y se dejó e«quilibrar durante 3 minutos antes de la medición.

La caracterización para ultrasonido se realizó sobre un grupo experimental ligeramente modificado de Jong, N. and Hoff Ultrasonics, 31: 175-181 (1993) . Este instrumento mide la eficiencia de atenuación para ultrasonido en el rango de frecuencia de 2-8 MHz de una suspensión diluida de agente de contraste. Durante la medición de atenuación se realizó una prueba de estabilidad de presión exponiendo la muestra a una sobrepresión de 120 mmHg durante 90 segundos. Típicamente se diluyó 2-3 µl de la muestra en 50 ml de Isoton II y la suspensión de la muestra diluida se agitó durante 3 minutos previo al análisis. Como parámetro de respuesta primaria se usó la atenuación a 3.5 MHz, junto con el valor de atenuación recuperado a 3.5 MHz después de la liberación de sobrepresión .

Tabla 1 Características in vitro de las dispersiones de burbujas producidas de acuerdo al ejemplo 1. Concentraciones pesadas número y volumen y volumen de diámetros medios . Propiedades acústicas medidas de acuerdo a la descripción anterior.

EJEMPLO 2 Los contenidos de gas de las cinco muestras preparadas de acuerdo al Ejemplo 1 anterior se reemplazaron con aire, perfluorobutano, hexafluoruro de azufre, pentafluoruro de trifluorometilazufre y tetrametilsilano respectivamente, de acuerdo al siguiente procedimiento: Dos muestras que contienen el producto liofilizado del Ejemplo 1 se colocaron en un desecador que tiene una entrada y una salida de gas. El desecador se conectó a un controlador de vacío/destilador Büchi 168 el cual permitió la evacuación controlada de las muestras y la entrada de un gas seleccionado. Las muestras se evacuaron a aproximadamente 10 mbar durante 5 minutos, donde después la presión se aumentó a la atmosférica mediante la entrada del gas seleccionado, seguido del tapado cuidadoso de las ampolletas . Este procedimiento se repitió usando pares adicionales de muestras para cada uno de los gases seleccionados .

Se adicionó 2 ml de agua destilada a cada ampolleta y las ampolletas se agitaron manualmente suavemente antes de su uso. Las dispersiones de microburbujas resultante se caracterizaron con respecto a mediciones de distribución de tamaño como se describió en el Ejemplo 1. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2 » Características in vitro de dispersiones de 10 microburbujas de fosfatidilserina estabilizada producidas de acuerdo al Ejemplo 2 - Concentraciones pesadas número y volumen y volumen de diámetros medios .

Como se observará de los resultados anteriores no hay cambio significativo en la distribución de tamaño sobre el intercambio de gas, demostrando que el tamaño de microburbuja preformado se preserva sustancialmente durante la liofilización y reconstitución.

Resultados in vivo Un grupo preparado con cada uno de los cinco gases se evaluó in vivo para propiedades de mejoramiento Doppler a 10 MHz. Las dispersiones se inyectaron en conejos chinchilla por vía de la vena de una oreja y se midió usando una técnica Doppler en donde una prueba para ultrasonido se coloca directamente sobre una arteria carótida. Las intensidades de señal y duración se registraron y se calculó la curva integral del Doppler. Los resultados obtenidos (ver Tabla 3 posterior) muestran que las burbujas contenían perfluorobutano dieron el mejoramiento de intensidad Doppler más fuerte. Las microburbujas que contenían hexafluoruro de azufre, pentafluoruro de trifluorometilazufre o tetrametilsilano fueron ligeramente menos eficientes como mejoradores Doppler que aquellas que contenían perfluorobutano, dando integrales en el rango de 60-80% de la figura para perfluorobutano .

Tabla 3 Resultados para inyecciones i.v. de los productos del Ejemplo 2 en conejos. Los valores se ajustan para tender hacia la línea base. La unidad Doppler se define como el aumento en la señal Doppler con relación a la sangre.

Promedio de las dos inyecciones EJEMPLO 3 Una ampolleta que contiene material liofilizado bajo una atmósfera de perfluorobutano se preparó como se describió en el Ejemplo 1. Se adicionó agua a la ampolleta solo antes de usar para dar una suspensión de microburbuja. 200 ml del fluido Isoton II se expuso a aire durante varios días a temperatura ambiente para dar una solución completamente saturada de aire. Otros 200 ml del fluido se desgasificaron en un matraz de vacío a 60°C durante una hora y se enfrió a temperatura ambiente manteniendo el vacío. El aire se dejó entrar inmediatamente al matraz antes del uso.

Porciones de 10 µl de la suspensión de microburbuja se adicionaron a cada uno de los fluidos y la mezcla resultante se incubó durante 5 minutos previo a la caracterización de tamaño (Coulter Multisizer Mark II) .

En el ambiente desgasificado, en donde no hay difusión de los gases desde el fluido hasta las microburbujas se esperó, que el diámetro medio de microburbuja fue 1.77 µm y 0.25% de las microburbujas son mayores que 5 µm. En el fluido saturado con aire los valores correspondientes fueron 2.43 µm y 0.67%; las mediciones repetidas hechas después de 5 minutos adicionales indican que los tamaños de las microburbujas habían alcanzado un valor estable.

Estos resultados muestran que el diámetro promedio de las microburbujas aumentó solo 37% cuando se expusieron a un fluido saturado con aire análogo a la sangre arterial, con muy pocas microburbujas que alcanzaron un tamaño que podría causar bloqueo de los vasos sanguíneos capilares . Esto podría contrastarse con el doble de tamaño de microburbujas que contienen aire/perfluorohexano en un ambiente similar (p. ej . una dispersión altamente diluida de microburbujas en agua que contiene aire disuelto) reportado en el Ejemplo II de O-A-95/03835.

EJEMPLO 4 Comparación El Ejemplo 1 se repitió reemplazando el sobrenadante antes de la liofilización en lugar de con (a) 65 mg/mL de sacarosa más 65 mg/mL de manitol, (b) 100 mg/mL de manitol más 50 mg/mL de glucosa, (c) 20 mg/mL de sacarosa, 76 mg/mL de manitol y 38 mg/mL de glucosa, y (d) 90 mg/mL de sacarosa.

Se determinaron los valores de Tg1 y Tg de las composiciones húmeda y seca y se establecen e la Tabla 4 posterior.

Tabla 4 Las formulaciones (a) a (c) necesitan ciclos de secad por congelado más largos que la formulación (d) y a diferencia de la formulación (d) deben almacenarse por debajo de la temperatura ambiente para mantener su integridad.

EJEMPLO 5 Retención de gas Se produjo el material análogamente al Ejemplo 1 pero usando (a) sacarosa 10% (p/p) , (b) PEG 3000 5% (p/p) , (c) manitol 2% (p/p) y glucosa 1% (p/p) , y (d) trehalosa 5% (p/p) para reemplazar el sobrenadante antes de la liofilización se expuso a inundación extensiva con N2, exposición a ciclos de vacío repetidos, y trituración para probar la capacidad del producto a retener perfluorobutano .

Después del tratamiento de tensión se determinó el contenido de perfluorobutano restante. Los resultados se establecen en la Tabla 5 posterior. aril a En los Ejemplos anteriores, podrían usarse los porcentajes más altos de estabilizador (p. ej . 20% en lugar de 10%) y podrían usarse otros fluidos de reconstitución que el agua, p. ej . soluciones salinas o de poliol referidas anteriormente. Similarmente, las porciones que son liofilizadas podrían ser más extensas (p. ej . 4 mL en lugar de 2 mL) , la liofilización de ampolletas podría ser más extensa (p. ej . 20 mL) y la liofilización podría ser de más duración (p. ej . 60 horas) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Una vesícula secada por congelado que contiene agente de contraste para ultrasonido caracterizado porque contiene un estabilizador secado por congelado y térmicamente estable a temeperaturs en exceso de 20°C.

2. Una vesícula secada por congelado que contiene agente de constrate para ultrasonido caracterizado porque contiene un estabilizador secado por congelado y tiene una temperatura de transición vitrea (Tg) por encima de 20^0.

3. Un agente de contraste como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el estabilizador se selecciona del grupo que consiste de sacarosa, maltosa- H20, trehalosa, rafinosa y estaquiosa.

4. Un agente de contraste como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el estabilizador comprende sacarosa.

5. Un agente de contraste como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la relación de peso del estabilizador a las vesículas en el agente es al menos 10:1.

6. Un agente de contraste como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado • porque la relación de peso del estabilizador a las vesículas en el agente es al menos 20:1. 5

7. Un agente de contraste como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las vesículas en el agente contienen un gas halocarburo o gas precursor.

8. Un agente de contraste como se reivindico en la 10 reivindicación 7, caracterizado porque las vesículas en el agente contienen un perfluoroalcano.

9. Un agente de contraste como se reivindicó en la reivindicación 7, caracterizado porque las vesículas en el agente contienen un perfluoroalcano seleccionado de perfluorobutano y perfluoropentano .

10. Un agente de contraste como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la membrana de las vesículas en el agente comprende un fosfolípido.

11. Un proceso para la preparación de una vesícula secada por congelado térmicamente estable que contiene agente de contraste para ultrasonido, el proceso comprende secar por congelado una dispersión acuosa que comprende un agente de contraste para ultrasonido vesicular y un estabilizador secado por congelado o mezcla de estabilizadores, caracterizado porque el estabilizador o mezcla de estabilizadores tiene un valor de Tg de al menos 20°C y un valor de Tg' de -37°C o por encima.

12. Un proceso como se reivindicó en la reivindicación 11, caracterizado porque la dispersión acuosa contiene de 1 a 50% en peso del estabilizador.

13. Un proceso como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado porque la dispersión acuosa contiene el estabilizador y el agente de contraste para ultrasonido vesicular en una relación en peso de al menos 10:1.

14. Un agente de contraste como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque el agente de contraste vesicular contiene un gas halocarburo o gas precursor.

15. -Un proceso como se reivindicó en la reivindicación 14, caracterizado porque las vesículas contienen un halocarburo seleccionado de perfluorobutano y perfluoropentano .

16. Un proceso como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque la dispersión acuosa contiene además un agente voluminoso.

17. Un proceso como se reivindicó en la reivindicación 16, caracterizado porque el agente voluminoso en un poliol C3

18. Un proceso como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 16 y 17, caracterizado porque la dispersión acuosa contiene 3 a 10% en peso del agente voluminoso.

19. Un medio de contraste para ultrasonido que comprende un medio de vehículo acuoso, un estabilizador secado por congelado o mezcla de estabilizadores y un agente de contraste para ultrasonido vesicular ecogénico, caracterizado porque el estabilizador o mezcla de estabilizadores tiene un valor de Tg de al menos 20°C y un valor de Tg' de -37°C o por encima.

20. El uso de un estabilizador secado por congelado o mezcla de estabilizadores que tienen un valor de Tg de al menos 20°C y un valor de Tg' de -37°C o por encima, para la elaboración de una vesícula, caracterizado porque contiene medio de contraste para ultrasonido para usar en diagnosis que involucra el diagnóstico de imagen para ultrasonido.

21. Un proceso para el almacenamiento o transportación de una vesícula que contiene agente de contraste para ultrasonido, caracterizado porque el agente está en la forma de secado congelado, contiene un estabilizador secado por congelado y tiene una temperatura de transición cristalina (Tg) de al menos 20°C, y en que el almacenamiento y transportación toma lugar sin el uso de enfriamiento.

22. Un proceso para la preparación de una vesícula que contiene medio de contraste para ultrasonido, caracterizado porque, el proceso comprende dispersar un agente de contraste secado por congelado como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en un medio de dispersión acuosa fisiológicamente tolerable.