MXPA98005607A

MXPA98005607A - Composiciones que incluyen bloqueadores de flujode calcio para inhibir el crecimiento celular

Info

Publication number: MXPA98005607A
Application number: MXPA/A/1998/005607A
Authority: MX
Inventors: Alan Berger Stuart; Lynn Gommerman Jennifer
Original assignee: Alan Berger Stuart; Lynn Gommerman Jennifer; The Wellesley Central Hospital
Priority date: 1996-01-11
Filing date: 1998-07-10
Publication date: 1999-05-31

Abstract

Una característica general de la presente invención es la inducción de la muerte de células estimuladas por un bloqueador de flujo de Caý+. La invención, en varios aspectos, incluye administración de composiciones que inducen muerte celular que incluye administración de una composición a un mamífero por ejemplo, un humano para propósitos terapéuticos;composiciones por ejemplo, una composición que tiene un bloqueador de flujo de Caý+ y un agente el cual normalmente estimula las células en la cual se induce la muerte celular;equipos de composiciones por ejemplo, un equipo que tiene un bloqueador de flujo de Caý+ y un agente el cual normalmente estimula las células en la cual se induce muerte celular;uso de tales composiciones o equipos de composiciones como agentes anti inflamatorios y/o agentes anti proliferativos, y uso de un bloqueador de flujo de Caý+ en el agente de la preparación de un medicamento para uso en la inducción de muerte celular. La invención incluye un método para diagnosticar la susceptibilidad de animales enfermos a tratamiento con un bloqueador de flujo de CAý+ o la combinación de un bloqueador de flujo de Caý+ y un agente el cual estimula normalmente las células con el fin de que el tratamiento puede inducir muerte celular. La invención incluye un método para investigar compuestos potenciales como bloqueadores de flujo de Caý+.

Description

COMPOSICIONES QUE INCLUYEN BLOOUEADORES DE FLUJO DE CALCIO PARA INHIBIR EL CRECIMIENTO CELULAR DESCRIPCIÓN CELULAR Esta invención caracteriza el uso de un bloqueador de 5 flujo de Ca2+ para inducir la muerte de una célula estimulada/' incluyendo un método para tratar una enfermedad proliferativa. Las terapias de cáncer ayudan, en gran parte, a eliminar o controlar el crecimiento de células de cáncer mientras repara el tejido normal. Por lo tanto, se ha puesto 10 mucha atención sobre la identificación de características que distinguen las células de cáncer de células normales con la meta de objetivar estas diferencias con agentes terapéuticos específicos . El crecimiento ordenado y desarrollado de las células está controlado, en gran parte, por la interacción entre ligandos solubles, secretados y receptores específicos sobre la superficie de la célula estimulada (Cell, 61:203-12 [1990]). No sorpresivamente, dado su papel importante en el control del crecimiento celular, un número de factores de crecimiento o sus receptores son protooncogenes conocidos incluyendo neu, FCER (v-erb-b) , c-fms (CSF-1R) , y c-kit, subrayando la relación cercana en estos casos entre estimulación normal y anormal. Ya que los factores de crecimiento o sus receptores están con frecuencia implicados en la génesis y/o mantenimiento de células tumorales, estas moléculas pueden ser consideradas como objetivos válidos para terapias específicas auxiliadas en la contraacción o neutralización de su actividad estimulatoria. El receptor c-kit es un ejemplo en donde la expresión inapropiada o mutación ha sido asociada con un número de tumores. Además de su espresión común en las leucemias mieloides (Siitonen et al., 1994), c-kit se encuentra también en una alta proporción de cánceres de pulmón de células pequeñas (Hiñes et al., 1995). En muchos casos, las células tumorales expresan ambos c-kit y SLF, resultando en una estimulación autocrina que contribuye a su tumorigenicidad. Así también, una mutación activante común, dominante en c-kit ha sido identificada en mastocitomas de origen humano, de ratón y rata (Tsujimura et al., 1994; Tsuj imura et al.,; 1995; Kanakura et al., 1994; Kitayama et al., 1995). Los oricogenes transformantes dominantes y la pérdida de la función del supresor de tumor están fuertemente implicados en muchas formas de cáncer. Por ejemplo, varios estudios han documentado la mutación, expresión inapropiada, overexpresión, y estimulación autocrina de los receptores de factor de crecimiento en células de cáncer de mama primario (Lupu et al., 1992; Ethier, 1995; LeJeune et al., 1993).

Consecuentemente, muchos investigadores están buscando procedimientos innovadores que objetivan específicamente estas moléculas (Kopreski et al., 1996; Fry et al., 1995; Levitzki et al., 1995) . Es también claro que la pérdida de la función del supresor de tumores puede contribuir a la formación de células de cáncer a través de la generación de células que no están sujetas más a mecanismos fisiológicos de muerte celular. La pérdida de la función del supresor de tumores ha sido también ampliamente documentada en cáncer de mama (Horak et al., 1991; Thor et al., 1992; Wang et al., 1993; Bargou et al., 1995; Krajewski et al., 1995; Lee, 1995). Una consecuencia importante de pérdida de función del supresor de tumores puede ser resistencia a formas convencionales del tratamiento anticáncer (Lu et al., 1996; Korsmeyer, 1995). Los agentes antiproliferativos numerosos están actualmente en uso en el tratamiento de cánceres. Para la mayor parte, son designados para actuar específicamente sobre células que se dividen rápidamente. Sin embargo, ya que la división celular ocurre normalmente en muchos tipos celulares del cuerpo, se observa con frecuencia la toxicidad hacia el tejido normal se, limitando la utilidad y eficacia de estos agentes. En una forma similar, la activación y proliferación celular anormal o excesiva es una característica de muchos estados inflamatorios. Por ejemplo, las enfermedades autoinmunes representan una situación donde las células del sistema inmune reconocen y responden a los autoantigenos presentes en el individuo afligido. Los tratamientos actuales tienden a atenuar las respuestas celulares inmunes en una forma no específica, resultando en susceptibilidad posible a la infección u otras consecuencias no deseables. Las enfermedades alérgicas representan otra situación donde las señales de activación inapropiadas resultan en morbilidad significativa. En estas y otras situaciones, hay por lo tanto la necesidad de terapias con especificidad mayor hacia las células que responden a una señal de crecimiento o activación particular. La movilización del Ca2+ de almacenamientos intracelulares, seguido por el flujo de Ca2+ extracelular a través de los canales de almacenamiento operados (también llamados canal Icrac) (Hoth et al., 1992; Hoth et al., 1993; Penner et al., 1993) es un evento de señalización común iniciado por muchos receptores del factor de crecimiento, antígeno, Fe, y enlazados a proteína G. Esta señal es la consecuencia de la activación de varias isoformas de la fosfolipasa C (FLC) , que lleva a la generación de mensajeros secundarios IP3 y diacilglicerol (Rhee, 1991) . Este incremento rápido en el Ca2+, seguido por una disminución gradual ha sido implicado en un número de procesos celulares que incluyen mitogénesis, activación y movimiento celular (Lewis et al., 1995) . Aunque el flujo de Ca2+ ha sido unido al control de apoptosis o muerte celular programada en un número de tipos celulares, el papel preciso del flujo de Ca2+ en la apoptosis no se ha entendido (Orrenius et al., 1992; Nicotera et al., 1994; Dowd, 1995) . Los niveles de Ca2+ intracelular excesivos tales como aquellos inducidos por Ca2+ ionóforo, han sido mostrados para inducir la apoptosis en un número de sistemas 5 experimentales (Kizaki et al., 1989; Tadakuma et al., 1990). La apoptosis en esplenocitos parece implicar una endonucleasa dependiente de Ca2+ (Riberiro et al., 1993) y los incrementos de Ca2+ intracelular han sido unidos a la apoptosis de ambos # hibridomas de células T activadas (Mercep et al., 1989) y timocitos inmaduros (McConkey et al., 1989) . Recientemente, Takata et al. (Takata et al., 1995) mostraron esta forma de apoptosis con movilización de Ca2+ En contraste a estas observaciones, algunas células parecen ser protegidas de la apoptosis por el flujo de Ca2+. Por ejemplo, los mastocitos dependientes de IL-3 y las líneas celulares están protegidas de la apoptosis mediada por falta del factor de crecimiento por * adición de Ca2+ ionóforo (Rodríguez- Tarduchy et al., 1992), y la muerte neuronal programada está también suprimida por incrementos en Ca2+ intracelular (Lampeet al., 1995). 20 Han sido identificadas ciertas proteínas las cuales medían tanto efectos positivos y negativos en la apoptosis. Bcl-2 es un miembro de una familia de proteínas relacionadas para las cuales C. elegans ced-9 es el prototipo (Reed, 1994) . Mientras una clase de miembros familiares (incluyendo Bcl-2) protege a las células de señales apoptóticas, otra clase * (incluyendo bax, un miembro pro apoptótico de esta familia) , promueve la apoptosis. Se ha sugerido que el equilibrio entre estas dos clases determina si una célula morirá apoptoticamente o sobrevivirá (Oltvai et al., 1993). 5 La sobre expresión de la proteína Bcl-2 lleva a la protección de la apoptosis inducida por una amplia variedad de agentes incluyendo radiación, fármacos quimioterapéuticos, agentes oxidantes y esteroides (Korsmeyer, 1995) . Sin embargo # otras señales apoptóticas parecen ser insensibles a Bcl-2. Esto incluye muerte celular inducida por TNF, activación Fas, muerte celular inducida por activación, tratamiento anti IgM de células WEHI-231, y supresión clonal mediada por superantígeno (Ashwell et al., 1987; Smith et al., 1989; Jones et al., 1990; Sentman et al., 1991; Brown et al., 1992; Cuende et al., 1993; Memon et al., 1995; Miura et al., 1995). En algunos casos, se ha demostrado que estas señales apoptóticas pueden ser neutralizadas por inhibidores de la enzima convertidora de la interleucina-iß- (ECI) familia de proteasas que sugieren la implicación de estas enzimas en apoptosis (Enari et al., 1995; Chinnaiyan et al., 1996) . Ha sido reportado el Cetotifen, un bloqueador de flujo de Ca2+ conocido para inhibir la activación de mastocitos y proliferación de células mononucleares en concentraciones altas (Gushchin et al., 1985) . Se ha demostrado también que el cetotifen puede ser usado para controlar los síntomas asociados con mastocitos -en neurofibroma (Riccardi et al. 1987; Riccardi et al., 1993). El Cetotifen ha mostrado ser efectivo para suprimir los síntomas de mastocitosis sistémica (Povoa et al., 1991) . El Cetotifen ha mostrado inhibir las respuestas de las células T al antígeno pero no a PHA o toxoide tetánico (Kondo et al., 1994) . Se ha reportado que el cetotifen puede inhibir la proliferación de linfocitos estimulada por mitógeno (Petrasch et al., 1993) . Las altas concentraciones de Cetotifen también inhiben los incrementos estimulados por mitógeno linfocito T y adenosin trifosfato en Ca2+ intracelular en linfocitos y en la línea celular del precursor de monocito humano U937, respectivamente. Sin embargo, en los experimentos in vivo, el tratamiento de voluntarios saludables con 1 mg de cetotifen b.id.d. por 7 días no altera el número o composición subconjunto de linfocitos circulantes. El econazol, otro bloqueador de flujo de Ca2+ ha mostrado reducir la viabilidad celular y números celulares de células de mieloma NSl/Ag4 a 1 µg/ml (Denyer et al., 1985) . Ha sido reportado el compuesto CAÍ, el cual tiene propiedades inhibitorias del flujo de Ca2+, para suprimir el crecimiento de células tumorales, y el crecimiento de HUVECS en respuesta a FGF (Kohn et al., 1992; Kohn et al., 1994a; Kohn et al. , 1994b) . Se describe la inhibición de crecimiento y metástasis de tumor con compuestos bloqueadores del canal de calcio en la Patente de los Estados Unidos No. 4,690,935 (Taylor et al., 1987) . La administración de un compuesto bloqueador del canal de calcio y un compuesto de coordinación de platino para inhibir el crecimiento y metástasis de tumores se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,906,646 (Honn et al., 1990) . Se ha mostrado el clotrimazol para liberar Ca2+ de almacenamientos intracelulares de células 3T3 en niveles los cuales inhiben la proliferación celular in vitro. Se ha encontrado que el efecto del clotrimazol sobre reservas de Ca2+ es reversible. Se ha encontrado también que el clotrimazol tiene un efecto inhibitorio sobre el número de metátasis de pulmón experimental producidas en ratones SCID por células melanomas humanas (Benzaquen et al., 1995) . Una característica general de la presente invención es la inducción de la muerte de células estimuladas por un bloqueador de flujo de Ca2+. La invención, en varios aspectos, incluye administración de composiciones que inducen la muerte celular incluyendo administración de una composición a un mamífero, por ejemplo, un humano para propósitos terapéuticos; composiciones, por ejemplo, una composición que tiene un bloqueador de flujo de Ca2+ y un agente el cual estimula normalmente células en las cuales la muerte celular será inducida; equipos de composiciones, por ejemplo, un equipo que tiene un bloqueador de flujo de Ca2+ y un agente el cual * estimula normalmente células en las cuales la muerte celular será inducida; uso de tales composiciones o equipos de composiciones como agentes antiinflamatorios y/o agentes antiproliferativos; y uso de un bloqueador de flujo de Ca24 o 5 uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y agente en la preparación de . un medicamento para uso en la inducción de muerte celular. La invención incluye un método para diagnosticar la susceptibilidad de animales enfermos al • tratamiento con un bloqueador de flujo de Ca2+ o la combinación de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un agente el cual estimula normalmente las células con el fin de que el tratamiento pueda inducir la muerte celular. La invención incluye un método para investigar compuestos potenciales como bloqueadores de flujo de Ca2d 15 En el contexto de esta invención, un agente o factor o ligando u otro agonista el cual estimula normalmente a una células o un receptor celular es uno el cual estimula la célula o receptor. Tal estimulación generalmente promueve el crecimiento, sobrevivencia y/o activación de la célula. En otras palabras, de acuerdo a la presente invención, la muerte celular se induce realmente en una célula estimulada. De acuerdo a un ejemplo particular, los detalles del cual se describirán posteriormente, los mastocitos los cuales son normalmente estimulados cuando se cultivan en la presencia de SLF, son inducidos a morir cuando se cultivan en la presencia de una combinación de SLF y un bloqueador de Ca2+. En general tal estimulación normal es acompañada por flujo de Ca2+ a la célula. Los bloqueadores de flujo de Ca2+ preferidos son 5 bloqueadores de flujo sin tensión de compuerta. Los sujetos preferidos para tratamiento son humanos. Un método preferido de la invención es un método para inducir la muerte de células en un mamífero en necesidad del mismo, en donde las células son capaces de ser estimuladas por un factor con flujo de Ca2+ acompañante, que comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un bloqueador de flujo de Ca2+ y una cantidad efectiva de tal factor. De acuerdo a otra modalidad preferida, en un mamífero que tiene células que están sujetas a estimulación por un ligando de un receptor de la célula por un agente, con flujo de Ca2+ acompañante, la invención es un método para inducir la muerte de células que comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un bloqueador de flujo Ca2+ y una cantidad efectiva de tal ligando. 20 De acuerdo a otra modalidad preferida, la invención es un método para inducir la muerte de células de un mamífero en necesidad del mismo, en donde tal célula tiene un receptor el cual, después del enlace con un agente resulta en el flujo de calcio en la célula y activación de la fosfolipasa C, que comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un bloqueador de flujo de Ca2+ y una cantidad efectiva de tal agente . De acuerdo a otra modalidad, la invención es un método para inducir la muerte de células de un mamífero en necesidad del mismo, en donde las células son capaces de ser estimuladas por un factor con flujo de Ca2+ acompañante, que comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un bloqueador de flujo de Ca2+ sin tensión de compuerta y una cantidad efectiva de tal factor. El factor o agente, etc., puede ser por ejemplo un anticuerpo agonístico par un receptor de las células, o un ligando natural de un receptor de las células . Las células pueden ser mastocitos, monocitos, macrófagos, fibroblastos, células T, células B, basófilos o células cancerígenas. El mamífero puede estar en la necesidad de tratamiento de una enfermedad proliferativa, por ejemplo, puede ser un humano que sufre de cáncer, particularmente cáncer de mama, o el paciente puede estar sufriendo de una alergia o de una transtorno autoinmune . Una célula (o grupo de células) en la cual será inducida la muerte puede tener, por ejemplo, un receptor superficial seleccionado del grupo de receptor c-kit o un receptor c-kit mutante, o un receptor de célula T, receptor unido a CD3 , FcyRII, FcyRiii, FceRI, proteína G, un receptor para bombesina, un receptor para péptido que libera gastrina, un receptor para bradykinin, un receptor para carbacol, un receptor para neurokinin, un receptor para la sustancia P, un receptor para una molécula purinérgica, un receptor para TGF-a, 5 un receptor para FCE, un receptor para heregulina, un receptor para erbBl, un receptor para erbB2, un receptor para erbB3 , un receptor para erbB4 , un receptor para PDGF, un receptor para SLF, un receptor para ligando FLT-3, un "receptor para FGF básico, un receptor para un FGF ácido, un receptor para enotelina, un receptor para NGF, un receptor para VFCE, y un receptor para HGF. El agente o factor a ser administrado a las células puede ser seleccionado del grupo SLF, TGF-a, FCE, heregulina, agonistas para erbBl, agonistas para erbB2 , agonistas para erbB3, agonistas para erbB4, PDGF A, PDGF B, ligando FLT-3, FGF básico, FGF ácido, enotelina, NGF, VFCE, HGF, agonistas para TCR, agonistas para receptor CD3 , agonistas para receptor RCyRII, agonistas para receptor FcyRIII, agonistas para receptor FceRI , agonistas de receptores unidos a proteína G, bombesina, gastrina, péptido que libera gastrina, bradiquinina, carbacol, agonistas de receptor muscarínico, CCK- 8, bazopresina, neuroquininas , sustancia P, agonistas de receptor purinérgico, ATP, adenosin, y 1, 25-dihidroxivitamina D3 y combinaciones de los mismos. 25 Por ejemplo, la célula puede ser una célula inmune * hiperactiva y el método puede incluir un anticuerpo y el factor puede ser un antígeno para el anticuerpo. Por ejemplo, la célula puede ser una célula inmune hiperactiva en la cual una IgE está enlazada a la célula y el factor puede ser un agonista 5 para IgE . La célula puede incluir un receptor de IgE y el factor puede ser un anticuerpo para el receptor. Las células pueden ser basófilos o mastocitos. El bloqueador de flujo de Ca2+ y el factor, ligando, 10 etc. Pueden se administrados por separado. De acuerdo a una modalidad preferida, se administra el bloqueador de flujo de Ca2+ antes que el agente. De4 acuerdo a otra modalidad preferida, se administran el agente/factor, etc. Y el bloqueador de flujo de 15 Ca2+ en una sola etapa. Preferiblemente, la estimulación de las células por tal agente en la ausencia de un bloqueador de flujo de Ca2+ promueve normalmente el crecimiento, sobrevivencia y/o activación de las células. 20 En una modalidad particular, las células expresan un receptor de c-kit, en donde el método incluye administrar una cantidad efectiva de un ligando de c-kit al mamífero. El paciente puede estar sufriendo de leucemia, crecimiento tumoral o cáncer de pulmón. 25 Un factor de la invención puede ser un factor de crecimiento el cual se une a un receptor de una célula, el cual enlazado normalmente provoca la proliferación de la célula. El paciente puede estar sufriendo de cáncer o hiperplasia. El factor puede ser una proteína. . El factor puede ser un factor de sobrevivencia el cual se une a uñ receptor de la célula, el cual enlazado, en la ausencia del bloqueador de flujo de Ca2+ incrementa normalmente la longevidad de la célula. De acuerdo a una modalidad particular, las células son células progenitoras hematopoyéticas. El factor puede ser un factor de activación el cual se une a un receptor de la célula, el cual enlazado, en la ausencia de un bloqueador de flujo de Ca2+ provoca normalmente la activación de la célula. El bloqueador de flujo de Ca2+ puede ser cualquiera de uno o más de Ni2+, cetotifen, econazol, tenidap, Cal, Cd2+, Co2+, La3+, Mn2+, SKF-96365 y cromolina, o una combinación de los mismos . De acuerdo a una modalidad particular la invención es un método para inducir la muerte de células constitutivamente activadas de un mamífero en necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad efectiva de un bloqueador de flujo de Ca2+ al mamífero. Preferiblemente, la activación resulta en una concentración de Ca2+ elevada arriba de niveles de las células * cuando está en estado no activado. La activación constitutiva puede ser el resultado de la presencia de un receptor de c-kit mutante. El paciente puede estar sufriendo de mastocitosis. De acuerdo a otra modalidad, la invención es un 5 método para inducir la muerte de un mamífero en necesidad del mismo en el cual las células son sometidas a estimulación autocrina, que comprende administrar una cantidad efectiva de un bloqueador de flujo de Ca2+ al mamífero. El bloqueador de -* flujo de Ca2+ puede ser Ni2+. 10 De acuerdo a otra modalidad, la invención es una composición farmacéutica para administración a un mamífero como un agente antiproliferativo para inhibir el crecimiento celular, que comprende un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor el cual normalmente se une a un receptor de la célula para provocar el flujo de Ca2+ en la célula. La composición puede ser una en la cual el enlace de # tal factor al receptor normalmente resulta en activación de fosfolipasa C. La composición puede incluir un bloqueador de flujo de Ca2+ el cual es un bloqueador de flujo de Ca2+ sin tensión de compuerta. El factor puede ser un ligando natural del receptor. El factor puede ser seleccionado del grupo SLF, TGF-a, FCE, heregulina, agonistas para erbBl, agonistas para erbB2, agonistas para erbB3 , agonistas para erbB4 , PDGF A, PDGF B, ligando FLT-3, FGF básico, FGF ácido, enotelina, NGF, VFCE, HGF, agonistas para TCR, agonistas para receptor CD3 , agonistas para receptor RCyRII, agonistas para receptor FcyRIII, agonistas para receptor FceRI, agonistas de receptores unidos a proteína G, bombesina, gastrina, péptido que libera gastrina, bradiquinina, carbacol, agonistas de receptor muscarínico, CCK- 5 8, bazopresina, neuroquininas , sustancia P, agonistas de receptor purinérgico, ATP, adenosin, y 1, 25-dihidroxivitamina D3 y combinaciones de los mismos. En una modalidad particular la composición incluye SLF como un factor. * Una composición puede incluir un antígeno de un anticuerpo superficial de una célula inmune. La composición puede incluir un factor el cual es un agonista para una IgE . La composición puede incluir un factor, el enlace de tal factor al receptor normalmente, en la ausencia del bloqueador de flujo de Ca2+, promueve el crecimiento, sobrevivencia y/o activación de la célula. De acuerdo a otro aspecto, la invención es un equipo de composiciones farmacéuticas para uso en la inhibición del crecimiento celular en un mamífero, el equipo que comprende un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor el cual normalmente se une a un receptor de la célula para provocar el flujo de Ca2+ hacia la célula. El factor puede ser uno el cual el enlace del mismo al receptor resulta normalmente en la activación de fosfolipasa C. 25 El bloqueador de flujo de Ca2+ puede ser un bloqueador # de flujo de Ca2+ sin tensión de compuerta. Un factor de la composición puede ser un anticuerpo agonístico al receptor. El factor puede ser un ligando natural del receptor. El factor puede ser seleccionado del grupo SLF, 5 TGF-a, FCE, heregulina, agonistas para erbBl, agonistas para erbB2, agonistas para erbB3 , agonistas para erbB4, PDGF A, PDGF B, ligando FLT-3, FGF básico, FGF ácido, enotelina, NGF, VFCE, HGF, agonistas para TCR, agonistas para receptor CD3 , agonistas para receptor RCyRII, agonistas para receptor FcyRIII, agonistas para receptor FceRI , agonistas de receptores unidos a proteína G, bombesina, gastrina, péptido que libera gastrina, bradiquinina, carbacol, agonistas de receptor muscarínico, CCK- 8, bazopresina, neuroquininas, sustancia P, agonistas de receptor purinérgico, ATP, adenosin, y 1, 25-dihidroxivitamina D3 y combinaciones de los mismos. Particularmente, el factor puede ser SLF. El factor puede ser un antígeno de anticuerpo superficial de una célula inmune. El factor puede ser un agonista para IgE . 20 El factor puede ser uno para el cual el enlace del mismo al receptor normalmente, en la ausencia del bloqueador de flujo de Ca2+, promueve el crecimiento, sobrevivencia y/o activación de la célula. En otra modalidad, la invención incluye el uso de una composición farmacéutica de la invención como un agente « antiproliferativo, o como un agente antiinflamatorio. Un equipo de composiciones farmacéuticas de la presente invención puede, por consiguiente, ser usado como un agente antiproliferativo o como un agente antiinflamatorio. 5 La invención incluye el uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor el cual se une normalmente a un receptor de una célula para provocar el flujo de Ca2+ hacia la célula, en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células. 10 La invención incluye el uso de un bloqueador de flujo de Ca + y un factor de la invención en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el enlace del factor al receptor resulta normalmente en la activación de fosfolipasa C. 15 La invención incluye el uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de la presente invención en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el bloqueador de flujo de Ca2+ es un bloqueador de flujo de Ca2+ sin tensión de compuerta.

De acuerdo a una modalidad particular, la invención incluye el uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de la invención en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el factor es un anticuerpo agonístico para el receptor. 25 Una modalidad particular incluye el uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de la invención en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el factor es un ligando natural del receptor. Modalidades particulares incluyen el uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de la presente invención en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el factor es seleccionado del grupo SLF, TGF-a, FCE, heregulina, agonistas para erbBl, agonistas para erbB2, agonistas para erbB3, agonistas para erbB4, PDGF A, PDGF B, ligando FLT-3, FGF básico, FGF ácido, enotelina, NGF, VFCE, HGF, agonistas para TCR, agonistas para receptor CD3 , agonistas para receptor RCyRII, agonistas para receptor FcyRIII, agonistas para receptor FceRI, agonistas de receptores unidos a proteína G, bombesina, gastrina, péptido que libera gastrina, bradiquinina, carbacol, agonistas de receptor muscarínico, CCK-8, bazopresina, neuroquininas, sustancia P, agonistas de receptor purinérgico, ATP, adenosin, y 1, 25-dihidroxivitamina D3 y combinaciones de los mismos. El factor puede ser, en particular, SLF. Una modalidad preferida incluye el uso de bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de la invención en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el factor es un antígeno del anticuerpo superficial de una célula inmune. Una modalidad preferida incluye el uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de la invención de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el factor es un agonista para una IgE. Otra modalidad incluye el uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de la invención en la preparación de un medicamento para uso como un agente antiproliferativo en donde el enlace del factor al receptor normalmente, en la ausencia del " bloqueador de flujo de Ca2+, promueve el crecimiento, sobrevivencia y/o activación de la célula. De acuerdo a otra modalidad, la invención es un método para diagnosticar la susceptibilidad de células de mamíferos enfermas al tratamiento con un bloqueador de flujo de Ca2+, o un bloqueador y factor el cual además activa los receptores de las células, que comprende: Ensayar si una muestra de tejido contiene un nivel de actividad FLC la cual está elevada en comparación con tejido normal ; en donde , Un nivel elevado de FLC activada indica que las células tienen probabilidad de ser susceptibles al tratamiento. Tal método puede incluir también obtener una muestra del tejido enfermo. Además el método puede incluir una etapa de ensayo en la cual se incluye monitorear la cantidad de un substrato de FLC el cual reacciona en la presencia de FLC obtenida de una cantidad predeterminada de tejido. El método puede incluir también aislar FLC de la cantidad predeterminada del tejido por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, el substrato de FLC puede ser [3H]-PIP2. En otra modalidad, la invención es un método para investigar un -agente como bloqueador de flujo de Ca2+, el método comprende las etapas de : Cultivar un primer grupo de células en la presencia del agente, en donde las células tienen un receptor activado el cual promueve el flujo de Ca2+ hacia las células; Cultivar un segundo grupo de células en la presencia del agente, en donde las células del segundo grupo carecen de un receptor activado el cual promueve el fujo de Ca2+ hacia las células del segundo grupo; Determinar si el crecimiento del primer grupo de células es menor que un primer nivel predeterminado que corresponde al creejmiento de las células del primer grupo en la ausencia del agente; y Determinar si el crecimiento del segundo grupo de células es sustancialmente el mismo como un segundo nivel predeterminado que corresponde al crecimiento de células del segundo grupo en la ausencia del agente; en donde El crecimiento del primer grupo menor que el primer nivel predeterminado y el crecimiento del segundo grupo de K células sustancialmente el mismo como en el segundo nivel predeterminado indica que el agente es un bloqueador de Ca2+. El receptor del primer grupo de células puede ser activado constitutivamente, o el receptor del primer grupo de 5 células es sometido a estimulación autocrina, o el receptor del primer grupo de células es activado por un agente exógeno. El agente puede ser un ligando natural del receptor del primer grupo de células. El receptor del primer grupo de # células y el receptor del segundo grupo de células puede ser el 10 mismo receptor. En modalidades particulares, el receptor es seleccionado del grupo de receptor de c-kit, un receptor para FCE y un receptor para FGF. Preferiblemente, las células del primer grupo y las 15 células del segundo grupo son células humanas . Preferiblemente, las células del primer grupo son mastocitos, las . células del segundo grupo son mastocitos, el receptor es el receptor de c-kit y el primer grupo de células es cultivado en la presencia de SLF. 20 De acuerdo a una modalidad particular, el primer grupo de células es transfectado con el receptor del primer grupo de células . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras ÍA a 1F muestran inducción de muerte en 25 MMO a través de la combinación de señales de crecimiento o activación con bloqueadores de flujo de Ca2+. Se realizan ensayos de citotoxicidad como se describe en Materiales y Métodos. En las Figuras Ia a ÍC, se incuban las MMO con ya sea SLF (500 ng/ml en todos los casos) (círculos) o IL-3 (25% de medio WEHI-3 acondicionado en todos los casos) (cuadros) con las cantidades indicadas de cetotifen (Figura ÍA) , econazol (Figura IB) o Ni2+ (Figura 1C) . En la Figura ID, se incuban las MMO con IL-3, y las cantidades indicadas de SLF. Los círculos graficados también incluyen Ni2+ 2.5 mM y los cuadros graficados no incluyen Ni2+. En la Figura ÍE, se recubren las MMO con SPE-7 monoclonal anti DNP de IgE, después se incuban con IL-3 más las cantidades indicadas de DNP-HSA (Ag) , con econazol 5 µM (círculos) o sin econazol (cuadros) . En la Figura 1F, se incuban las MMO con IL-3 más las cantidades indicadas de la sustancia P, econazol 5 µM (círculos) o sin econazol (cuadros) . En todos los casos, se determina la proporción de células muertas después de 24 horas en cultivo contando las células que pueden o no ser excluidas de azul Trypan. Las barras de error representan el error estándar determinado de mediciones por triplicado. Las Figuras 2A y 2B muestran la inducción de muerte celular en células 32D-kit o p815 con SLF más bloqueadores de flujo de Ca2+. Se incuban las células 32D-kit (Figura 2A) o p815 (Figura 2B) con ya sea SLF (barras sólidas) o IL-3 (barras rayadas) más la concentración indicada de bloqueador de flujo de Ca2+. Se determina la muerte celular por exclusión de azul Trypan después de 18 horas en cultivo. Las Figuras 3A a 3E muestran la morfología de células 32D-kit incubadas con varios factores y bloqueadores de flujo de Ca2+. Se incuban las células 32D-kit con SLF solo (Figura 3A) , IL-3 sola (Figura 3B) , econazol 5 µM y SLF (Figura 3C) , o econazol 5 µM y SLF (Figura 3C) , o econazol 5 µM y IL-3 por 18 horas (Figura 3D) . En la Figura 3E, las células se incuban sin agregar el factor. Las céluls son fotografiadas bajo contraste de fase a una amplificación de 400X. La Figura 4 muestra gráficas del número relativo de células 32D-kit (eje y) como una función del contenido de ADN celular, las células 32D-kit son incubadas con SLF solo (Figura 4A) , IL-3 sola (Figura 4B) , en econazol 8 µM y SLF (Figura 4C) , o en econazol 8 µM y IL-3 (Figura 4D) por 18 horas. En la Figura 4E, las células son incubadas sin agregar el factor. Las células son teñidas con yoduro de propidio como se describe en Materiales y Métodos y entonces se analiza por citometría de flujo para contenido de ADN. La Figura 5 muestra protección de ácido oleico de células 32D-kít de la apoptosis inducida por SLF y bloqueador de flujo de Ca2+. Las células 32D-kit son incubadas por 18 horas con SLF y econazol 5 µM y ácido oleico (barras sólidas) , o con SLF y econazol 5 µM y ácido elaidico (barras sombreadas) , o IL-3 y econazol 5 µM y ácido oleico (barras rayadas) . Se determina la proporción de células muertas por la exclusión de azul Trypan. La Figura 7A muestra el análisis Western Blot de usados celulares de las células 32D-kit (banda 1) o 32D-kit -Bel-2 (banda 2) . Las células son lisadas como se describe en Materiales y Métodos y se separan por SDS-PAGE, se transfieren a nitrocelulosa y se sondean con anticuerpos anti-Bcl-2. La Figura 5B muestra el efecto de la sobre expresión de Bel-2 sobre la apoptosis inducida por SLF mas bloqueador de flujo de CA2+ Se incuban las células 32D-kit (barras sólidas) o 32D-kit-Bcl-2 (barras rayadas) por 18 horas con SLF o IL-3 más econazol 2.5, 5 ó 10 µM y se determina la proporción de células muertas por exclusión de azul Trypan. Se agrega en cultivos adicionales, IL-3 sola o no se agrega ningún factor y se prueba similarmente la viabilidad celular. Se evalúa también el efecto de la viabilidad celular al agregar YVAD-CHO 25 ó 250 µM a cultivos separados en los cuales no se agregan factores adicionales . La Figura 8 muestra el efecto de YVAD-CHO sobre la apoptosis inducida por SLF y bloqueador de flujo de Ca2+. Se incuban las células 32D-kit con ya sea SLF en la ausencia de YVAD-CHO (círculos) , o con SLF en la presencia de YVAD-CHO 25 µM (triángulos) , o IL-3 (cuadros) con las cantidades indicadas de econazol. Se evalúa la proporción de células muertas por exclusión de azul de Trypan después de 18 horas en cultivo.

* La Figura 9A muestra la apoptosis inducida por un bloqueador de flujo de Ca2+ en células cancerosas que tienen un receptor continuamente activado. Se incuban 2.5 x 104 células SK-BR3 (ATCC cat. # HTB-30) en los pozos de una placa de 96 5 pozos en RPMI 0.1 ml más FBS 0.5% con (círculos) o sin (cuadros) FCE 10 ng/ml (factor de crecimiento epidermal) y con las concentraciones indicadas de econazol por 18 horas. Se evalúa la proporción de células muertas por exclusión de azul * Trypan después de 18 horas en cultivo. 10 La Figura 9B muestra apoptosis inducida por bloqueador de Ca2+ en células cancerosas de mama MDA-MB-231 bajo varias condiciones. Barra 1: control; Barra 2: econazol 20 µM; Barra 3: econazol 20 µM y YVAD-CHO 10 µM (inhibidor de ECI) ; Barra 4: econazol 20 µM y YVAD-CHO 100 µM; Barra 5: econazol 20 µM y ionomicina 0.1 nM (yonóforo de calcio); Barra 6: econazol 20 µM y ionomicina 10 nM; Barra 7: econazol 20 µM y ionomicina 1 µM; Barra 8: econazol 20 µM y ácido oleico 10 µM (inhibidor de la activación de FLC) ; y Barra 9: econazol 20 µM y ácido oleico 100 µM. 20 La Figura 10 muestra la apoptosis inducida por FCE y bloqueador de flujo de Ca2+ en células derivadas de carcinoma de mama humano. Se incuban 2.5 x 104 células MCF-7 en los pozos de una placa de 96 pozos en MEMD 0.1 ml mas FBS 0.5% con (círculos) o sin (cuadros) FCE 10 ng/ml y con las concentraciones de econazol indicado para 18 horas. Se evalúa f- la proporción de células muertas por exclusión de azul Trypan después de 18 horas en cultivo. La Figura HA muestra el efecto de bloqueador de flujo de Ca2+ y factor activador sobre células de leucemia en 5 ratones en los cuales se administra SLF intravenosamente. 'Se inoculan los ratones intravenosamente con 1 x 107 células 32D- kit resistentes a G418. Entre 3 y 5 semanas después de la inoculación (Experimentos 1 & 3; 5 semanas, experimento 2; 3 semanas) , se les da a los ratones 100 mg/kg de cetotifen por alimentación forzada a través de un tubo oralmente. Cuatro horas después del tratamiento con cetotifen, se inyectan los ratones con 15 µM de SLF intravenosamente. Dos horas después se les da a los ratones 100 mg/kg de cetotifen p.o. Al siguiente día, se retiran los bazos y se ensayan para la presencia de células leucémicas colocando células en placas con agar 0.3% en medio de crecimiento que contienen 20% de medio WEHI-3 acondicionado y Img/ml de G418 para limitar la detección para las células leucémicas resistentes a G418. Siete días después se enumeran las colonias. 20 La Figura 11B es similar a la Figura HA, pero en este caso las células del bazo son ensayadas para la presencia de todas las células capaces de formar coloinas en agar en respueta a IL-3, para incluir células leucémicas así como también células normales. 25 La Figura 12 muestra el efecto del bloqueador de flujo de Ca2+ y factor activador sobre las células de leucemia en ratones en el cual se administra el SLF subcutáneamente. Los ratones son inoculados intravenosamente con 1 x 107 células 32D-kit. Tres semanas después de la inoculación, se les da a 5 los ratones por alimentación forzada a través de un tubo oralmente 100 mg/kg de cetotifen. Cuatro horas después del tratamiento de cetotifen, se inyecta los ratones con SLF 15 µg de SLF subcutáneamente. Dos horas después de la inyección, se # les da a los ratones 100 mg/kg adicionales de cetotifen p.o. Al siguiente día, se remueven los bazos y se ensayan para la presencia de células leucémicas colocando la células en placas con agar 0.3% en medio de crecimiento que contiene medio WEHI-3 acondicionado 20% y G418 1 mg/ml para limitar la detección para células leucémicas resistentes a G418. Se enumeran las colonias siete días más tarde. Materiales y Métodos Células. Se generan mastocitos derivados de médula ósea (MMO) como se describe previamente (Berger et al., 1994) . Se cultivan en OPTI-MEM (Gibco, Burlington, ON) suplementado con FBS 10% inactivado por calor y sobrenadante WEHI-3 2% como una fuente de IL-3. Las células 32D-kit (donadas por el Dr. Mark Minden, Ontario C ncer Institute) son una línea celular mielomonocítica dependiente de IL-3 que expresa c-kit (Hu et al., 1995). Se hacen crecer las células 32D-kit en RPMI (Gibco) suplementado con FBS 10% inactivado por calor, sobrenadante f WEHI-3 2%, y G418 1 mg/ml (Gibco) . La línea celular p815 es una línea celular de mastocitoma de murino. Se hacen crecer las células p815 en RPMI suplementado con FBS 10% inactivado por calor. Se hacen crecer células que empacan Bel-2 gp+e NIH 3T3 5 en medio de Eagle modificado de Dulbecco (MEMD- Gibco) y suplementado con FBS 10% y puromicina 2 µg/ml (Sigma, St . Louis, Mo) . Todos los cultivos celulares también contienen ß- mercaptoetanol 55 µM y antibióticos (ambos Sigma) . Se obtiene las células SK-BR3, MDA-MB231 y MCF-7 de ATCC. Se cultivan las células SK-BR3 y MDA-MB231 en medio RPMI suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10%. Se cultivan las células MCF-7 en medio MEMD suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% y 10 µg/ml de insulina humana (Sigma) . 15 Generación de células 32D-kifc que sobre expresan Bcl- 2. Las células productoras de gp + e bcl-2 retroviral son una • donación del Dr. Y. Ben-David (Toronto) y contienen un vector retroviral en base a LXSN que expresan genes para tanto resistencia a puromicina y bcl-2 de murino. Para la infección, se co cultivan una capa confluente de células empacadoras de gp + e con células 32D-kit por 24 horas. Se remueven las células 32D-kit no adherentes, cultivadas por 48 horas y entonces se seleccionan para células que sobre expresan bcl-2 en la presencia de puromicina 2 µg/ml . 25 Producción de SLF recombinante. Se produce el factor de acero de murino recombinante (SLF) en forma soluble en E. Coli usando el vector de expresión de secreción inducible por pFLAG, ATS, IPTG (InterScience, Markham, ON) . Este vector incluye un epitopo FLAG N-terminal de ocho aminoácidos (InterScience) . Se incuban E. Coli que contiene el plásmido pFLAG . ATS . SLF durante la noche a 37°C en caldo Luria (Gibco) con ampicilina 100 µg/ml (sigma) . Este cultivo se diluye entonces 20 veces y se hace crecer a OD60o de 0.4-0.5 antes de ser inducidos con IPTG 33 mg/L (Gibco) . Se incuba entonces el cultivo durante la noche a 37°C, y se forman en granulos las células a 10,000 rpm por 20 minutos. Se pasa el sobrenadante bacteriano a través de un filtro de 0.22 micrones y se almacena a -80 °C con CaCl2 1 mM, y PMSF 100 µM. Se purifica por afinidad el FLAG-SLF sobre una columna de anticuerpos monoclonales de ratón anti FLAG Ml unido covalentemente a gel de agarosa (InterScience) . • Este monoclonal une el epitopo FLAG en una forma dependiente de Ca+ permitiendo la elución por quelación de Ca2+ en exceso con EDTA. Se equilibra primero la columna con 30 ml de PBS + CaCl2 1 mM y se pasan los sobrenadantes bacterianos sobre la columna tres veces. Se lava la columna prolongadamente con PBS + CaCl2 1 mM y se eluye la proteína de fusión FLAG-SLF con seis alícuotas de 1 ml de PBS + EDTA 2 mM. Estas se recolectan, concentran y dialisan contra PBS y se checan para pureza por tinción con plata. Otros reactivos. Se obtienen IgE específico a dinitrofenilo de murino monoclonal (DNP) , clon SPE-7 así como también el antígeno DNP-HSA albúmina-humano de SIGMA. Se obtienen también la sustancia P, todos los bloqueadores de canal de Ca2+, ionomicina, ácidos oleico y elaidico FCE, y bFGF de Sigma. Se almacena la ionomicina como una solución al 1 mM en DMSO a -20 °G. Se almacenan los ácidos oleicos y elaidicos en soluciones etanólicas desgaseadas a concentraciones de 1 M y 100 mM respectivamente, sellados bajo una fuente de gas de nitrógeno y almacenados a -20°C. Se obtiene el péptido de inhibidor de YVAD-CHO ECI de Amersham (Arlington Heights, IL) y se almacena como una solución 1 mM en DMSO a -20°C. Ensayos de muerte celular. Se colocan 2.5 x 104 células MMO, 32D-kit o P815 en placas de fondo plano de 96 pozos en un volumen de RPMI 0.1 ml que contiene 0.5% de FBS. Se suplementan las células con ya sea SLF, sustancia P o IL3 mas bloqueador de canal de Ca2+. En el caso de agregar IgE, se incuban las células con SPE-7 10 µg/ml por 45 minutos a 4°C a seguido por 3 lavados con RPMI, FBS 0.5% antes de colocar en placas de 96 pozos y agregar DNP-HSA 100 ng/ml. Se determina la proporción de muerte celular después de 18 ó 24 horas en cultivo contando células que pueden o no ser excluidas por azul Trypan. Análisis de contenido de ADN. Se incuban 1.25 x 10e por 18 ó 24 horas como se describe anteriormente. Se extienden las células y se resuspenden en reactivo de Vindelov: Tris 3.4 mM pH 8, yoduro de propidio 75 µM (de Sigma), NP-40 0.1%, ARNasa 700 µ/1 (Sigma) y NaCl 10 mM. Se analizan entonces las células por citometría de flujo. Western Blotting. Se lavan 1 x 106 células 32D-kit y 5 32D-kit-bcl2 en PBS y se resuspenden en amortiguador de lisis que contiene NP-40 1%, glicerol 10% en TBS con inhibidores: sodio-ortovanadato 500 µM, aprotinina 10 µg/ml, leupeptina 10 µg/ml, y PMSF 1 mM (todos de Sigma) y se incuban a 4°C por 20 # minutos. Se centrifugan los lisados a 12,000 rpm por 10 minutos y se agrega el sobrenadante a un volumen igual de amortiguador de muestra con ß-mercaptoetanol. Se separan las muestras por SDS-PAGE 12% y se transfieren a nitrocelulosa. Se bloque el blot con polvo de leche descremada 5%, TWEEN-20 0.1% (ICN, Aurora OH) en PBS y se sondea con anticuerpos anti-bcl-2 (U.B.I. Lake Placid, NY) . Se desarrolla la prueba de Western Blot con reactivos de quimioluminiscencia (Amersham) . Ratones. Para los experimentos de 32D-kit in vivo, los ratones son machos C3H/ratones de 6 a 8 semanas de edad y se obtienen de Charles River Laboratories, Boston, Massachusetts. Se inoculan los ratones intravenosamente con 1 x 107 células leucémicas. Entre 3 y 5 semanas después de la inoculación, se les da a los ratones 100 mg/kg de cetotifen (Sigma) en un volumen de 0.4 ml de agua por alimentación forzada a través de un tubo oralmente . Después del primer tratamiento de cetotifen, se inyectan los ratones intravenosamente o subcutáneamente con SLF 15 µg en PBS. Un segundo tratamiento de cetotifen sigue a la administración de SLF. Experimento 1 : bloqueadores de canal de Ca2+ convierten las señales de activación a señales de muerte. Se estimulan los mastocitos normalmente para proliferar por SLF, el ligando para la tirosina quinasa del c-kit receptor. Sin embargo, como se muestra en la Figuras 1A-C, se convierte esta señal proliferativa a señal de muerte si se co incuban las células con un bloqueador de flujo de Ca2+ tal como cetotifen, econazol o Ni2+. En contraste, no se observa muerte cuando los mastocitos se incuban con un bloqueador de flujo de Ca2+ y IL-3. La incubación simultánea de mastocitos con SLF, bloqueador de flujo de Ca2+, y IL-3 resulta todavía en muerte celular (Figura ID) , indicando que IL-3 no es protector para esta señal de muerte particular. Los bloqueadores de flujo de Ca2+ por sí mismos no aceleran la muerte de mastocitos debido a la extracción de factores de crecimiento o de sobrevivencia (no mostrados) . La inducción de muerte celular por SLF mas bloqueador de flujo de Ca+ se incrementa con concentraciones incrementadas de SLF. Esto señala que hay una propiedad de señalización asociada con SLF, pero no con IL-3, esto es requerido para inducir esta forma de muerte celular en conjunto con un bloqueador. El efecto del bloqueador de flujo de Ca2+ no es simplemente contra actuar o neutralizar las * propiedades estimulatorias de SLF. Mas bien, un bloqueador se combina con una señal crítica generada por SLF para convertir una trayectoria de activación a una trayectoria de muerte celular. 5 Aunque tanto SLF y IL-3 son mitogénicas para mastocitos, solamente SLF induce el flujo de Ca2+ (Columbo et al., 1994 Rao et al., 1994). Los efectos sobre la viabilidad celular de otras dos señales conocidas para movilizar Ca2+ en mastocitos son investigados de esta forma. La reticulación del receptor de alta afinidad para IgE con antígeno inicia una serie de eventos de señalización que incluye activación de PLC- ? y movilización de Ca2+, lo cual resulta en desgranulación de mastocitos (Jouvin et al., 1995) . El efecto sobre la viabilidad de mastocitos estimulantes con Ag más IgE en la presencia de un bloqueador de flujo de Ca2+ se muestra en la Figura ÍE. Como se muestra, se induce muerte celular cuando se estimulan * mastocitos con IgE mas antígeno en la presencia de econazol, mientras que la sola estimulaicón antígénica o econazol solo no tienen efecto sobre la viabilidad celular. Ni2+ y cetotifen también se combinan con el receptor de IgE que se retícula para inducir la muerte celular (no mostrado) . Los mastocitos también responden a péptidos catiónicos anfifílicos tales como la sustancia P (Bueb et al., 1990 Mousli et al., 1990). Estas moléculas estimulan directamente las proteínas G heterotriméricas que resultan en * la activación de FLC-ß, movilización de Ca2+ y, en la presencia de niveles sub óptimos de antígeno mas IgE, desgranulación de mastocitos. Como se muestra en la Figura 1F, se induce también muerte celular cuando se estimulan mastocitos con la sustancia 5 P en la presencia de econazol. Como con SLF, el grado de muerte celular en la" presencia de bloqueador de flujo de Ca2+ se incrementa con concentraciones incrementadas de Ag o sustancia P. Ya que estas tres señales (pero no IL-3) movilizan todas el flujo de Ca2+, es probable que la movilización de Ca2+ es la señal requerida para la inducción de muerte celular en combinación con bloqueadores de flujo de Ca2+. La inducción de muerte celular a través de la combinación de una señal activadora y un bloqueador de flujo de Ca2+ en células diferentes a los mastocitos se examina también.

Las células 32D son c-kit negativas, células mielomonocíticas dependientes a IL-3 que mueren apoptoticamente después de la eliminación del factor (Baffy et al., 1993). La transferencia y expresión de c-kit en estas células las hace que den respuesta a SLF in vitro y las lleva a ser tumorígenas in vivo (Hu et al., 1995) . Como se muestra en la Figura 2A, la expresión de c- kit hace a estas células sensibles para inducción de muerte celular por SLF y bloqueador de flujo de Ca2+. Han sido descritos los tumores independientes a factor numerosos que son transformados debido a la activación constitutiva o estimulación autocrina de los receptores del » factor de crecimiento. Un ejemplo de un tumor independiente de factor es el mastocitoma p815, el cual crece en la ausencia de factor agregado debido a la presencia de un receptor c-kit activado constitutivamente, mutado (Tsujimura et al., 1994). 5 Como se muestra en la Figura 2B, los bloqueadores de flujo de Ca2+ solos son suficientes para inducir muerte celular en células p815 en la ausencia de estímulo SLF agregado. Esto refleja probablemente la naturaleza independiente a ligando de señalización a través del receptor de c-kit de p815. Estos resultados muestran que la inducción de muerte celular por SLF mas bloqueador de Ca2+ no está limitado a mastocitos, pero puede ser observado en otros tipos celulares también, particularmente aquellos con receptores altamente activados. Experimento 2: MMO y muerte inducida por 32D-kit es apoptótica. La inspección visual de ambos mastocitos y células m - 32d-kit después del tratamiento con SLF y un bloqueador de flujo de Ca2+ revela característica de apoptosis que incluyen condensación nuclear y blebbing membranar (Figura 3C) . Se mide el contenido de ADN, el cual se fragmenta característicamente y disminuye durante la apoptosis . Como se muestra en las Figuras 4A y 4B y se resumen en la Tabla 1, el tratamiento de células 32D-kit con SLF o IL-3 solos por 18 horas no genera una población de células con contenido de ADN subdiploide, mientras que el econazol mas SLF, pero no con IL-3, genera una gran * población de células con ADB subdiploide (Figuras 4C y 4D) . Las células 32D-kit son conocidas para sufrir apoptosis cuando son privadas del factor de crecimiento. Después de 18 horas de la extracción del factor de crecimiento, las células 32D-kit muestran una p-roporción modesta de células con contenido de ADN sub diploíde. Esta población se incrementa sustancialmente después de 24 horas de extracción del factor (datos no mostrados) . De esta forma el proceso apoptótico inducido por # bloqueador de flujo de Ca2+ mas SLF es más rápido que la apoptosis observada a partir de la extracción del factor. Los mastocitos también exhiben contenido de ADN subdiploide después del tratamiento con SLF mas bloqueador de flujo de Ca2+ (Tabla 1) , consistente con la inducción de muerte celular por un mecanismo apoptótico. 15 Tabla 1 Contenido de ADN Gl sub de MMO o células 32D- kit con econazol más factor Contenído de Gl sub (%) Sin econazol econazol 8 µM MMO IL-3 25.4 20.4 SLF 6.8 66.8 Extracción del 6.18 n.d. factor 32D-kit IL 1.6 4.8 SLF 2.3 35 Extracción del 9.2 n.d. factor (1) se incuban MMO con econazol 8 µM más IL-3 (medio WEHI acondicionado 25%) , SLF (500 ng/m) , o sin factor por 24 horas, se tiñe con yoduro de propidio, y se analiza para * contenido de ADN. 5 (2) (2) se incuban similarmente las células 32D-kit por 18 horas antes del análisis, n.d.: no determinado. Experimento 3 : Protección de células de apoptosis inducida por el bloqueador de flujo de SLF-CA2+ por ácido oleico. La observación de que las señales de movilización de Ca2+ pueden combinarse con bloqueadores de flujo de Ca2+ para induci apoptosis sugiere que este efecto es mediado por * activación de fosfolipasa C. Con el fin de determinar si la activación de FLC es importante para la muerte celular, se examina el efecto del ácido oleico, el cual ha sido mostrado para inhibir la activación de FLC en respuesta a la estimulación del factor de crecimiento epidérmico (FCE) (Casabiell et al., 1993), sobre la inducción de apoptosis. Este efecto inhibitorio, el cual no altera el enlace de FCE o la activación de la tirosina quinasa del receptor de FCE, se observa solamente con ácido cis-9-octadecenoico (ácido oelico) pero no con ácido trans-9-octadecenoico (ácido elaidico) (Casabiell et al., 1991). Se incuban las células 32D-kit con econazol y SLF o IL-3 en la presencia de ya sea ácido oleico o elaidico. Como se muestra en la Figura 5, las células 32D-kit 5 tratadas con SLF y un bloqueador de canal de Ca2+ son rescatadas de muerte celular por ácido oleico pero no ácido elaidico. El rango de eficacia del ácido oleico está entre 1- 100 µM el cual corresponde a concentraciones requeridas para # inhibición de FLC (Casabiell, Zugaza, 1993) . Esta observación es consistente con un requerimiento para activación de fosfolipasa C en la inducción de apoptosis en combinación con los bloqueadores de flujo de Ca2+. Experimento 4: Protección de sélulas de apoptosis inducida por bloqueador de flujo de SLF-Ca2+ por yonomicina. 15 El flujo de Ca2+ que sigue la activación del receptor de es mediada por la abertura de canales de Ca2+ de almacenamiento operado (también llamado Icrac) (Penner et al., 1993) . Es probable que el canal Icrac sea el objetivo para inhibición ya que la eficacia con la cual los tres compuestos, cetotifen, econazol y Ni2+, inducen muerte celular junto con SLF se correlaciona con su capacidad para inhibir Icrac (Franzius et al., 1994). Se ha observado también que los bloqueadores de canal de Ca2+ con tensión de voltaje verapamil y nifedipina son ineficaces para la inducción de muerte celular cuando se combinan con SLF (no mostrado) . Este resultado * sugiere que la" inducción de muerte celular junto con SLF es específico para bloqueadores de flujo de Ca2+ sin tensión de voltaje . Han sido reportados otros efectos no específicos para 5 tanto econazol y cetotifen (Franzius, Hoth, 1994) . Con el fin de determinar si el bloqueo de Ca2+ es crítico para inducción de muerte celular, se examina el efecto de ionomicina ionóforo de calcio sobre la inducción de apoptosis. Como se muestra en la Figura 6A, la ionomicina protege a las células 32D-kit de muerte inducida por SLF más bloqueador de flujo de Ca2+ en una forma dependiente de la concentración, con protección máxima a 10 nM. Dada la especificidad de ionomicina por Ca2+ (Liu et al., 1978)), estos resultados indican que lo que se requiere es el bloqueo del flujo de Ca2+ para inducción de apoptosis junto con señales de activación. Concentraciones mayores de ionomicina, las cuales generan niveles excesivos de Ca2+ intracelular, resultan en el restablecimiento de muerte celular. Esto demuestra que en el contexto de la activación celular, ambos extremos de flujo de Ca2+ pueden inducir muerte celular. Experimento 5: Efecto de Bcl-2 sobre apoptosis inducida en células 32D-kit por SLF y más bloqueador de flujo de Ca2+ Ha sido fuertemente unida la familia de Bcl-2 de proteínas a la protección de células de la apoptosis inducida por una amplia variedad de agentes. La expresión de Bcl-2 está correlaciona con las células proliferantes (Hockenbery et al., 1991; Veis et al., 1993), esta regulada negativamente por el supresor de tumor p53 (Miyashita et al., 1994) y la sobre 5 expresión de Bcl-2 protege a las células 32D de muerte apoptótica después de la extracción del factor (Nunez et al . , 1990; Baffy, Miyashita et al., 1993). El efecto de la sobre expresión de la proteína Bel-2 sobre la inducción de apoptosis por SLF y el bloqueador de flujo de Ca+ se examina de esta forma. Se infectan las células 32D con un vector de retrovirus (Schwarze et al., 195) que contiene el gen Bcl-2, para generar una línea celular de sobre expresión de Bcl-2 (Figura 7) . Las células son probadas para susceptibilidad para apoptosis y se encuentra que la sobre expresión de Bel-2 protege a las células 32D-kit de apoptosis inducida por extracción de factor (Figura B) . Sin embargo, como se muestra también en la Figura 7B, la sobre expresión de Bel en células 32D-kit falla para proteger a estas células de la inducción de apoptosis por SLF y econazol . Estas observaciones llevan a la conclusión de que la inducción de muerte celular por SLF mas bloqueador ocurre en una forma independiente a Bel-2. Las células 32D-kit -Bel -2 son protegidas similarmente de apoptosis por SLF más bloqueador con niveles bajos de ionomicina (Figura 6B) , sin embargo, diferente a las células 32D-kit, no demuestran muerte celular significativa a niveles mayores de ionomicina. Estos resultados por lo tanto muestran que para células activadas, la muerte inducida por bloqueo de Ca2+ contra muerte inducida por niveles excesivo de flujo de Ca2+ son divergentes, por lo menos en el nivel de sensibilidad a Bcl-2. Experimento 6: Efecto de un inhibidor de ECI proteasa sobre muerte celular inducida por bloqueador de flujo de Ca2+ y S1F y muerte celular inducida por extracción de factor. El ligando TNF-a y Fas son dos ejemplos de señales que inducen apoptosis por lo cual falla la sobre expresión de Bcl-2 para proporcionar protección (Memon et al., 1995; Strasser et al., 1995) . En estos casos, se ha mostrado que la apoptosis es mediada por miembros de la familia de proteasas deenzimas que convierten la interleucina-lß. Con el fin de determinar si la familia de ECI proteasas están implicadas en la inducción de apoptosis por SLF y bloqueador de flujo de Ca2+, se incuban las células con el inhibidor de ECI tetrapéptido-aldehído YVAD-CHO (Mashima et al., 1995; Vasilakos et al., 1995) . Se ha encontrado en la presente que YVAD-CHO protege a las células 32D-kit de apoptosis inducida por etopsido inhibidor de topoisomerasa (no mostrado) . Se ha encontrado que YVAD-CHO proporciona resistencia a la apoptosis inducida por SLF más econazol (Figura 8) pero falla para proteger a las células 32D-kit de apoptosis inducida por extracción del factor (Figura 7B) . Es probable por lo tanto que **^-- ~*fiütá. la apoptosis inducida por la combinación de un señal de crecimiento o activación con un bloqueador de flujo de Ca2+ es mediada por una proteasa como ECI . Experimento 7. Efecto del bloqueador de Ca+ y FCE 5 sobre células de carcinoma humano. Los estudios han demostrados la implicación de receptores de factores de crecimiento en cáncer de mama. Por ejemplo, se ha encontrado que más del 45% de cánceres de mama son positivos a FCER (Fox et al., 1994, Franzius et al., 1994).

ErbB2, un receptor de factor de crecimiento relacionado cercanamente a FCER es sobre expresado en 30-40% de todos los cánceres de mama (Slamon, et al., 1989) . Con el fin de determinar si la muerte celular puede ser inducida por estas células con bloqueadores de flujo de Ca2+ más señales de activación, se incuban células SK-BR3 con o sin FCE y en la presencia de econazol, las células SK-BR3 (ATCC cat # HTB-30) se derivan de un adenocarcinoma humano de mama. Son tumorigénicos en ratones desnudos. Estas células contienen un gen p53 mutante (Elster, et al., 1995), son negativos al receptor de estrógeno, y expresan niveles altos de la molécula erbB2 (Li, et al., 1993) resultando en activación continua de este receptor. Como se muestra en la Figura 9a, el econazol induce niveles equivalentes de muerte en células SK-BR3 en la presencia o ausencia de FCE. 25 La línea celular MDA-MB-231 es un carcinoma altamente anaplástico de mama. Es también tumorigénico en ratones desnudos pero expresa solamente niveles bajos de erbB2. Sin embargo es FGFR positivo y es estimulado en una forma autocrina por bFGF (el Yazidi et al., 1995). Se llevan a cabo experimentos para determinar la susceptibilidad de las células MDA-MB-231 a un bloqueador de flujo de Ca2+ y la influencia de ácido oleico, ionomicina y YVAD-CHO sobre la inducción de muerte celular por el bloqueador. Los resultados son resumidos juntos en la Figura 9B . Como se indica, las células MDS-MB-231 sufren de apoptosis en respuesta a la exposición al econazol bloqueador de flujo de Ca2+. Adicionalmente, el mecanismo apoptótico inducido por flujo de Ca2+ de MDA-MB-231 parece tener las mismas características como aquellas de las células 32D-kit. La ionomicina, ácido oleico y YVAD-CHO pueden proteger a las células MDA-MB-231 de muerte inducida por el bloqueador de flujo de Ca2+. Las células MCF-7 (ATCC cat. # HTB-22) se derivan de carcinoma de mama humano. Son tumorigénicos en ratones desnudos, particularmente cuando son tratados con estrógeno (Benz et al., 1993) o cuando las células son encapsuladas en matrigel (Noel et al., 1995). Estas células han sido reportadas para ser estimuladas por FCE (Godden et al., 1992). Con el fin de determinar la susceptibilidad de estas células a muerte celular por bloqueador de flujo de Ca2+ y señal activadora, se incuban las células MCF-7 con y sin FCE 10 ng/ml, con varias concentraciones de econazol por 18 horas . Como se muestra en la Figura 10, las células MCF-7 son más sensibles a muerte celular del econazol en la presencia de FCE 10 ng/ml que en su ausencia. Tomadas junto con los experimentos mostrados en las 5 Figuras 9Aa 9B y 10 indican que las células de cáncer de mama exhibirán sensibilidad incrementada a bloqueador en la presencia de un factor activador tal como FCE. Experimento 8: Efecto del bloqueador de flujo de Ca+ y SLF sobre células de leucemia 32D.kit in vivo. 10 Con el fin de determinar la eficacia de la combinación de un bloqueador de flujo de Ca2+ con una señal activadora in vivo, ratones inoculados con células de leucemia 32D-kit, resistentes a G418 y dependientes de factor son tratados con una combinación de cetotifen y SLF. En un grupo de experimentos, se extraen los bazos y se ensayan para la presencia de células leucémicas por colocación de células en placas con agar en medio de crecimiento que contiene medio WEHI-3 acondicionado al 20% y G418 1 mg/ml para limitar la detección a células leucémicas resistentes a G418. En otro grupo de experimentos, se ensayan los bazos para la presencia de todas las células capaces de formar colonias en agar en respuesta a IL-3, para incluir células leucémicas así como también normales. Como se muestra en la Figura HA, en cada experimento, las células que forman colonias resistentes a G418 pueden ser detectadas en los animales inoculados. Estos niveles encontrados en los bazos de animales inoculados varían de animal a animal, sin embargo la mayoría de los animales contiene entre 30 y 1,000 colonias resistentes a G418. La cuenta de colonias promedio aritmética de animales inoculados pero no tratados es 69,938, sin embargo un animal contiene niveles muy altos de células leucémicas. Si este animal no es incluido, la cuenta de colonia promedio aritmética es 391. La media geométrica de este grupo es 813 colonias/bazo. El número de colonias resistentes a G418 detectadas en animales que son inyectados con SLF solamente tiende a ser mayor que aquellos que no reciben el factor, variando entre 654 y 31,00 con un promedio aritmético de 7,399 y una media geométrica de 1,545 colonias/bazo. Este incremento en número de colinas detectable puede ser atribuible a estimulación de células leucémicas por SLF. En ratones que reciben cetotifen solo, el número de colonias detectables varía entre 114 y 27,645 con un promedio aritmético de 5,502 y una media geométrica de 849. En animales tratados con cetotifen y SLF, el número de colonias detectables varía de 8 a 537, con un promedio aritmético de 131 y una media geométrica de 61 colonias resistentes a G418 /bazo. El análisis de estos datos usando una prueba de t de Student acoplada sin cola (después de la transformación log) indica que hay solamente una probabilidad del 6.2% de que los grupos no tratados y tratados no sean diferentes entre sí. Si un animal en el grupo no tratado que contiene niveles muy altos de # células leucémicas no se incluye en este análisis, entonces la probabilidad de que los grupos no tratados y tratados no sean diferentes entre sí es de 8.9%. Una comparación similar entre el grupo de animales que recibe cetotifen solo contra aquellos que reciben cetotifen mas SLF indica que la probabilidad de que estos grupos no difieran entre sí es 0.8%, y de esta forma altamente significativo. Este resultado indica que mientras que el cetotifen solo tiene poco actividad sobre células leucémicas in vivo, la combinación de cetotifen y SLF no resulta en una disminución significativa en el número de células leucémicas. [1) Se comparan los logaritmos de los datos de la Figura HA entre sí usando la prueba de t de Student con cola. Se indica el % de probabilidad de que dos grupos comparados no sean diferentes entre sí . Los números entre paréntesis tienen 5 las mismas probabilidades determinadas si un animal con números muy altos de células leucémicas en el grupo no tratado no se incluye en el análisis. Se realiza un análisis similar para el número total de células formadoras de colonias en los bazos de estos ratones y se presentan los datos en la Figura 11B. El número de colonias promedio aritmético de ratones no inoculados con células leucémicas es 857, con una media geométrica de 669. La cuenta de colonias promedio aritmética de los animales inoculados pero no tratados es 84,073, sin embargo un animal contiene niveles muy altos de células leucémicas. Si no se incluye este animal, la cuenta de colonias promedio aritmética es 3,448. La media geométrica de este grupo es 4,573 colonias/bazo. El número de colonias dependientes de IL-3 detectadas en animales que son inyectados con SLF solo tienden a ser mayor que aquellos que no reciben el factor, con un promedio aritmético de 18,212, y una media geométrica de 5,171 colonias/bazo. Este incremento en el número de colonias detectables puede ser atribuible a estimulación de células leucémicas por SLF. En ratones que reciben cetotifen solo, el promedio aritmético es 7,715 con una media geométrica de 2,320. En animales tratados con cetotifen y SLF, el promedio aritmético es 793 con una media geométrica de 66 colonias dependientes a-IL-3/bazo. El análisis de estos datos usando la prueba de t de Student acoplada sin cola (después de la transformación log) indica que hay 2% de probabilidad de que los grupos no tratados y tratados no sean diferentes entre sí. Si no se incluye en este análisis un animal en el grupo no tratado que contiene niveles muy altos de células leucémicas, entonces la probabilidad de que los grupos no tratados y tratados no sean diferentes entre sí es 5.1%. Similarmente, una comparación de los grupos tratados con SLF solo o cetotifen solo contra aquellos tratados con cetotifen mas SLF indica también que hay una probabilidad de 2% o 1.6% de que estos grupos no sean diferentes. (l)Se comparan los logaritmos de los datos de la Figura HA entre sí usando la prueba de t de Student con cola. Se indica el % de probabilidad de que dos grupos comparados no sean diferentes entre sí. Los números entre paréntesis tienen las 5 mismas probabilidades determinadas si un animal con números muy altos de células leucémicas en el grupo no tratado no se incluye en el análisis. Se realiza otro experimento en el cual los ratones inoculados con células 32D-kit son tratados con cetotifen p.o. y se administra SLF subcutáneamente. Como se muestra en la Figura 12, en esta circunstancia, la combinación de SLF con cetotifen no parece tener un efecto significativo sobre el número de células leucémicas en los bazos de ratones tratados. Este experimento indica que la ruta de administración del factor activador y probablemente la sincronización relativa de dos sustancias puede afectar la eficacia de una régimen terapéutico particular. Los resultados de los experimentos anteriores describen un método novedoso para inducir la apoptosis. Este método implica la combinación del bloqueo de flujo de Ca 2+ hacia la célula, con un factor el cual activa el receptor. En una modalidad particular, la activación de la fosfolipasa C se asocia con el flujo de Ca2+ . Se ha mostrado, por ejemplo, que SLF, sustancia P y EgE y antígeno, pero no IL-3 pueden combinarse con bloqueadores de flujo de Ca2+ (sin tensión de voltaje) para inducir la apoptosis en mastocitos. Esta forma de apoptosis no requiere necesariamente señales proliferativas ya que ambos SLF y IL-3 son proliferativos, mientras que la sustancia P y el antígeno-IgE son solo débilmente proliferativos. Ya que incrementar las señales lleva a apoptosis incrementada, esta forma de muerte celular será más efectiva cuando los bloqueadores de flujo de Ca2+ son combinados con receptores altamente activados . En el soporte de esta observación, el mastocitoma p815, el cual es un receptor c-kit constitutivamente activado, es sensible a los bloqueadores de flujo de Ca2+ solos (Figuras 2B) . Las células SK-Br3 y MDA-MB-231 son también susceptibles a bloqueadores de flujo de Ca2+ solos. Esto sugiere también que las células con mutaciones similares (o que sufren de estimulación autocrina) pueden ser susceptibles a apoptosis por esta clase de fármaco. La observación de que el ácido oleico puede invertir la inducción de apoptosis por SLF mas un bloqueador indica una necesidad para una señal de activación que resulte en la activación de la fosfolipasa C en por lo menos algunas modalidades. La ionomicina puede también proteger a las células de muerte celular inducida por SLF más bloqueador, indicando que se requiere el bloqueo específico de flujo de Ca2+ para inducción de apoptosis. La apoptosis inducida por SLF mas bloqueador es insensible a la sobre expresión de Bel-2, pero puede ser invertida por un inhibidor de proteasas ECI , sugiriendo un papel en este mecanismo apoptótico para ECI o un miembro de la familia de proteasas de ECI en por lo menos algunas modalidades. En aquellas ciertas células proliferativas tienen receptores altamente activados (Figura 9A) que resultan en la activación de FLC, esta invención incluye un método para diagnosticar la susceptibilidad de tales células al tratamiento con bloqueador de flujo de Ca2+, o un bloqueador y factor el cual además activa receptores de estas células . Tal método incluye : Obtener una muestra de tejido enfermo; Determinar si el tejido contiene un nivel de FLC elevado en comparación con el tejido normal; Si el tejido contiene un nivel elevado de FLC, entonces determinar si la FLC está activada. Si se encuentra tal nivel elevado de FLC activada, entonces las células son probablemente para ser tratadas, es decir muerte inducida, proliferación disminuida, etc., por exposición de las células a un bloqueador de flujo de Ca2+ o un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor el cual además activa * los receptores los cuales producen la señal que lleva a niveles elevados de FLC activada. Ha sido usado el antisuero específico a anti-FLC para mostrar que los carcinomas de mama tienen niveles elevados de la enzima comparado con los controles normales . La inmunoprecipitación con anticuerpos antifosfotirosina, seguido por Western Blotting con anticuerpos anti FLC pueden ser usados para determinar los niveles de FLC activada ya que la -^^ FLC que es tirosina fosforilada será probablemente activada (Arteaga et al. 1991) . La actividad enzimática de FLC puede ser ensayada directamente (Huang et al., 1995) . Brevemente, las células a ser ensayadas son lisadas, se ensayan FLC inmunoprecipitada usando antisuero específico a FLC (disponible por ejemplo, de Upstate Biotechnology Inc. Lake Placid, New York) y la enzima ensayada usnado [3H] -PIP2 (de <new England Nuclear Boston, Massachusetts) como un sustrato en liposomas (DMPM 90%, PIP2 10%) en un amortiguador que contiene lípidos totales 0.3 mM en tris 50 mM (pH 8), CaCl2 0.1 mM. Se terminan las reacciones por la adición de CaCl2 0.2 M en HCl 1 M. Se recolectan las vesículas precipitadas sobre placas de filtro (tal como placas Millipore de 96 pozos hidrofóbicas MultiScreen DP) y se cuantifica el producto de la reacción el fosfato de inositol, el cual esta presente en el flujo de paso, por conteo de escintilación.

La observación de que la ionomicina puede proteger tanto contra o inducir la muerte celular indica que ambos extremos del flujo de Ca2+ puede llevar a la apoptosis. En ambos casos sin embargo, la activación celular parece ser 5 requerida ya que se observa solo muerte celular mínima en la ausencia de SLF, la sobre expresión de Bcl-2 protege a células de muerte celular inducida por altas concentraciones de ionomicina, sugiriendo que los mecanismos importante para muerte celular inducida en los dos extremos de flujo de Ca2+ no son idénticos, por lo menos al nivel de sensibilidad de Bcl-2. De esta forma, a concentraciones altas de ionomicina, las células pueden ser sometidas a una forma de "sobrecarga de Ca2+" y ciertas células expuestas a esta forma de toxicidad son conocidas para ser protegidas por Bcl-2 (Strasser et al., 1991; Redd, 1994) . Se ha postulado que un posible mediador de muerte por alta concentración de Ca2+ puede ser fosfatasa calcineurin dependiente a Ca2+, la cual ha sido mostrada para potenciar apoptosis en células T (Shibasaki et al., 1995) y células B (Bonnefoy et al., 1994) . 20 Los resultados descritos en la presente (Figuras 7B y 8) indican que Bcl-2 y ECI están implicadas en la regulación de mecanismos de apoptosis diferentes. Mientras que las células están protegidas por Bcl-2 (pero no el inhibidor de ECI) de apoptosis que resultan de la extracción del factor, el inhibidor de ECI (pero no Bel -2) protege contra la combinación del bloqueador de flujo de Ca2+ y SLF. Los experimentos con otras señales que inducen apoptosis son también consistentes con estas observaciones. (Cuende, et al., 1993; Memon et al., 1995; Strasser et al., 1995; Vasilakos et al., 1995; Parijs et 5 al., 1996). Se ha demostrado también recientemente que la activación de Fas inhibe el flujo de Ca2+ mediado por anti CD3 en células T sin afectar la liberación de Ca2+ de las reservas internas (Kovacs et al., 1995). f El cetotifen es un fármaco bien conocido anti alérgico y anti asmático que exhibe tanto antagonismo para el receptor Hl de histamina e inhibición de flujo de Ca2+ (Martinet al., 1978; Grant et al., 1990). Dada la implicación del flujo de Ca2+ en desgranulación de mastocitos, la inhibición de este proceso es un mecanismo aceptado para sus efectos anti inflamatarios . Los resultados descritos en la presente sugieren de esta forma que el bloqueador de flujo de Ca2+, particularmente cetotifen, puede ser co administrado con una señal de activación apropiada para el tratamiento de síntomas de alergia. Los bloqueadores de flujo de Ca2+ han sido propuestos como agentes anti proliferativos (Riccardi, 1987; Felder et al., 1991; Kohn et al., 1992; Estación et al., 1993; Petrasch et al., 1993; Kondo et al., 1994; Burckley et al., 1995; De Vries et al., 1995) . Los resultados descritos en la presente sugieren que estos compuestos pueden ser más efectivos cuando se acoplan con una señal proliferativa o activadora fuerte. Por lo tanto la combinación de bloqueadores de flujo de Ca + con señales proliferativas o activadoras puede tener propiedades anti proliferativas o anti inflamatorias potentes y específicas . 5 Los inventores no desean unirse a ninguna teoría que explique el mecanismo preciso por el cual se provoca el flujo de Ca2+ hacia las células . Los resultados presentados en la presente, sin embargo, establecen una conexión entre la inducción de muerte celular después de la administración a la célula de una combinación de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor el cual se une a un receptor de tal célula para provocar bajo condiciones normales la activación del receptor para provocar el flujo de Ca2+. Tal factor puede ser un ligando natural del receptor, es decir, un ligando que actúa después del receptor en naturaleza, un anticuerpo agonístico etc. Por lo menos en algunos casos, el flujo implica la activación de FLC. En muchos casos, la activación implica la estimulación de la célula en donde la "estimulación" incluye proliferación, activación, y/o sobrevivencia de la célula. Los resultados mostrados en la Figura 9A indican, que en el caso de células constitutivamente activadas, en las cuales el receptor está activado normalmente por un ligado seguido por flujo de Ca2+, la administración de un bloqueador de Ca2+ solo puede inducir la muerte celular. La invención descrita en la presente de esta forma incluye también la administración de un bloqueador de flujo de Ca2+ para inducir la muerte en células que tienen un receptor constitutivamente activado, en el cual la activación del receptor promueve el 5 flujo de Ca2+ en la célula. Es posible también que células que tienen receptores los cuales son activados en respuesta a un factor producido por la misma célula, sean tratadas con un bloqueador de Ca2+ para inducir la muerte celular. 10 Con respecto a factores conocidos particulares, el SLF por ejemplo, las variantes de SLF, el ligando del receptor de c-kit, pueden también ser efectivos para inducir la muerte celular. Por ejemplo, anticuerpos agonísticos para el receptor c-kit pueden ser desarrollados de acuerdo a procedimientos conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Otras moléculas pequeñas capaces de reticular receptores e inducir el flujo de Ca2+ pueden también ser efectivos. El mismo SLF puede ser modificado por mutaciones para estabilizar la molécula y por lo mismo prolongar su vida media en el cuerpo del mamífero.

Alternativamente o adicionalmente, SLF puede ser modificado por conjugación con polietilenglicol (PEG) con el fin de prolongar su longevidad en uso . En lugar de IgE y antígeno al caso de los mastocitos, por ejemplo, puede ser usado un anticuerpo para el receptor de IgE celular. Es probable que un anticuerpo capaz de reticular los receptores IgE pueda ser probablemente la causa para que ocurra el flujo de Ca2+. En el caso de aquellos que sufren de alergias, las inmunoglobulinas específicas al alérgeno de la case IgE son producidas por células B que han sido estimuladas por alérgenos específicos a células T para producir este isotipo particular. Los anticuerpos IgE son secretados por células B en el espacio extracelular donde pueden ser unidos a receptores específicos llamados RceRI encontrados sobre la superficie de mastocitos o basófilos. Estos mastocitos o basófilos deben encontrar un alérgeno polivalente que sea reconocido por su superficie unida a IgE, los IgE/receptores pueden estar reticulados o activados, provocando la liberación de uno o mas mediadores preformados tal como histamina, y la síntesis y liberación eventual de otras moléculas inflamatorias tal como leucotrienos, prostaglandinas y citosinas. Esta respuesta compleja por lo tanto implica un número de tipos celulares y moléculas diferentes, todos los cuales son objetivos posibles en la modulación de respuesta alérgica. Esto incluye células B que producen IgE específico a alérgeno, células T que expresan los receptores de células T específicos para el alérgeno y mastocitos y basófilos, con IgE específico a alérgeno sobre su superficie. Ya que las señales transmitidas a través de estos receptores todas movilizan Ca2+, pueden ser capaces de combinarse con bloqueadores de flujo de Ca2+ para inducir la ________ muerte celular, como ha sido mostrado para IgE más antígeno sobre mastocitos. Para las células B que expresan IgE de membrana, los compuestos anti IgE específicos reticularán estas moléculas, resultando en la transmisión de una señal. Tales 5 compuestos pueden ser anticuerpos, tal como se describe por Chang en la Patente de los Estados Unidos No 5,422,258 y 5,428,133 o Rupp et al. en la Patente de los Estados Unidos No. 4, 940, 782, m por ejemplo. Además, pueden ser empleados fragmentos de estos anticuerpos tales como reactivos (Fab)2 u otros compuestos que reconozcan y reticulen IgE de superficie sobre células B. Cuando las células B son el objetivo específico, puede ser deseable usar reactivos que reconozcan preferencialmente IgE sobre la superficie de células B, pero no IgE para ser unido a mastocitos o basófilos. En situaciones en donde es deseable específicamente eliminar células B que producen anticuerpos que reconocen un antígeno particular, el mismo antígeno, si es polivalente y se da en suficiente cantidad, puede proporcionar un señal suficiente en combinación con el bloqueador de flujo de Ca+ de tal forma que las células B que producen el anticuerpo serán eliminadas. Alternativamente, pueden ser usados anticuerpos anti idiotípicos, que reconocen las regiones variables del anticuerpo que es producido por la célula B. Los objetivos potenciales para tal tratamiento pueden incluir células B que producen anticuerpos para un autoantígeno, resultando en una enfermedad autoinmune . Hay, por supuesto, otro enlace de ligando de receptores celulares el cual resulta en el flujo de Ca2+ hacia 5 la célula que porta el receptor. Los agonistas del receptor del factor de crecimiento dentro del alcance de esta invención incluyen TGF-a (factor de crecimiento transformante) , FCE, heregulina, y otros agonistas de erbBl, 2, 3 y 4, PDGF A y B (factor de crecimiento derivado de plaquetas) , SLF, FLT-3 (fms- 10 como tirosin quinasa 3) ligando, FGF básico y ácido (factores de crecimiento de fibroblasto) (una familia de factores de crecimiento relacionados) , enotelina, NGF (factor de crecimiento nervioso) , VEGF (factor de crecimiento endotelial muscular) , HGF (SF) (factor de crecimiento hepático; factor dispersión) . Agonistas para receptores de reconocimiento de multi cadenas Inmunes incluyen agonistas para el receptor de antígeno sobre células B (es decir, antígenos específicos reconocidos por células B) incluyendo anticuerpos que reticulan inmunoglobulina de superficie, agonistas del receptor de células T tal como anticuerpos que reconocen TCR particulares, anticuerpos Anti CD3 u otros anticuerpos agregados agonistas y otros reactivos que activan FcyRII y FcyRIII, y agonistas para el receptor de FceRI sobre mastocitos y basófilos. Los agonistas de receptores unidos a proteína G están también dentro del alcance de las enseñanzas de esta invención: ^B» bombesina, gastrina, péptido que libera gastrina, bradiquinina, carbacol y otros agonistas del receptor muscarínico, CCK-8, vasopresina, neuroquininas tales como la sustancia P, agonistas del receptor purinérgico incluyendo ATP y adenosin, 1,25- 5 dihidroxivitamina D3. Hay también muchos neurotransmisores que estimulan el flujo de Ca2+. La muerte celular puede ser mostrada para que ocurra como el resultado de administración de tales células de un bloqueador de flujo de Ca2+ y ligando * usando experimentos similares a aquellos descritos en la presente. Las variantes de tales ligandos y anticuerpos del receptor agonista pueden también ser desarrollados para uso y probados usando experimentos similares a aquellos descritos anteriormente en los cuales se mide la muerte celular en respuesta a la administración de tal variante en combinación con un bloqueador de flujo de Ca2+ . Los bloqueadores de flujo de CA2+ además de aquellos descritos junto con las modalidades preferidas incluyen tenidap, CAÍ, Cd2+, Co2+, La3+, Mn2+, SKF-96365 y cromolina, aunque hay muchos mas de aquellos conocidos por los que tienen experiencia en la técnica (Lewis et al., 1995) . En cualquier caso particular, puede ser encontrado que una combinación de agentes que enlazan el receptor administrados junto con uno o más bloqueadores de flujo de Ca+ cambia para ser más efectivo en provocar la respuesta celular deseada.

Como se indica por los experimentos descritos en la presente, es el receptor y la respuesta normal de la célula a señales generadas sobre enlace de receptor apropiado los cuales son importantes para determinar si la muerte celular puede ser 5 inducida por administración de un lignado del receptor (u otro agente agonista) y un bloqueador de flujo de Ca2+. Sin embargo, no se conoce que los tipos celulares mas allá de aquellos usados en los experimentos descritos en la presente tengan ftf tales receptores expresados, por lo menos durante algún punto de su ciclo de vida, el cual producirá la respuesta normal celular requerida para aplicación de la invención descrita en la presente. Ejemplos de otros tipos celulares conocidos para expresar el receptor c-kit y dar respuesta a SLF son células progenitoras hematopoyéticas y células germinales. Ejemplos de tipos celulares los cuales pueden ser expresar receptores los cuales se unen a otros ligandos, enlace el cual resulta en la respuesta requisito incluyen células de cáncer de mama que expresa receptores FCE y FGF y células de carcinoma de colon que expresan receptores PDGF. 20 Tales células que exhiben estados tumorigénicos, hiperplásticos o altamente activos pueden ser tratadas por administración de un factor de enlace apropiado y bloqueador de flujo de Ca2+ de acuerdo a la presente invención. De esta forma es posible administrar tratamientos de acuerdo a la presente invención para tratar una persona que sufre por ejemplo de cáncer, mastocitosis, enfermedades inflamatorias autoinmunes o una alergia. Se ha encontrado un receptor c-kit para ser sobre expresado sobre células leucémicas (Murol et al., 1995) y para 5 ser encontrados en alta proporción de cánceres de pulmón de células pequeñas (Hida et al., 1994), tumores del tracto genital femenino (Inoue et al., 1994) y puede estar implicado en la infiltración de mastocitos de neurofibromas (hirota et al., 1993) . Tales sitios son de esta forma candidatos primarios para el tratamiento de acuerdo a la presente invención. En ejemplos en los cuales serán objetivos las células de acuerdo a la presente invención están constitutivamente activadas, (Figura 9A) puede no ser necesario incluir un agente para estimular la señal generada por el enlace del receptor, como señal ya siendo generada. En tal ejemplo, la administración del bloqueador de flujo de Ca2+ puede ser administrado sin el agente estimulante del receptor acompañante. Ciertas células tumorales son conocidas para poseer tal actividad y por lo tanto pueden ser tratadas por este método. La mutación activadora de c-kit ha sido encontrada en mastocitomas de origen humano y de roeder (Kanakura et al., 1994; Kitayama et al., 1995). Esto no es para decir que pudiera no ser preferido en algunas circunstancias potenciar la señal por administración de un factor adecuado junto con un bloqueador de Ca2+.

Una etapa inicial para determinar si un tipo celular particular puede ser susceptible al tratamiento de acuerdo a la presente invención puede ser determinar si el enlace del ligando de un receptor expresado sobre la membrana celular provoca un incremento en la concentración de Ca2+ intracelular. La administración de varias concentraciones del ligando y cultivos celulares de un bloqueador de flujo de Ca2+, en analogía con los experimentos descritos para las células de las modalidades descritas en la presente, puede ser llevada a cabo para determinar niveles en los cuales se induce la muerte celular. Para indicaciones particulares, la dosis apropiada dependerá de, por ejemplo, el huésped, modo de administración y la naturaleza y severidad de la condición a ser tratada, etc. Se indican resultados satisfactorios para un agente de enlace de receptor para ser obtenido en dosis diaria de, por decir, de aproximadamente 0.1 mg por kg de peso corporal del animal a aproximadamente 1 mg por kg de peso corporal aunque esto puede variar dependiendo del agente particular o el sujeto o la condición a ser tratada. Además, puede ser ventajoso que la dosis diaria sea dividía en 2 , 3, 4 ó más dosis. Si el agente es un polipéptido tal como un factor de crecimiento, la administración puede ser por ejemplo, inyección intradérmica, intramuscular o intravenosa. Las composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de enlace del receptor de la presente invención pueden incluir por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente, excipiente, lubricante, amortiguador, antibacteriano, agente de volumen, antioxidantes y similares, 5 la composición que es fabricada en una forma convencional mezclando con el portador farmacéuticamente aceptable o diluyente, etc. Las formas de dosis unitarias contienen, por ejemplo, de aproximadamente 0.025 mg a aproximadamente 50 mg del compuesto. 10 Los bloqueadores de flujo de Ca2+ pueden ser preparados y administrados de acuerdo a procedimientos conocidos, con la condición de que el agente alcance las células objetivos como se desea. Con el fin de hacer objetivo una célula específica, a decir por ejemplo, de una célula B la cual produce una IgE particular, puede ser generado un anticuerpo agonista a la porción superficial de la IgE. Puede ser enlazado un bloqueador de flujo de Ca2+ (o bloqueadores) (por ejemplo, enlazado covalentemente) al anticuerpo de tal forma que el enlace del anticuerpo a la IgE de superficie puede poner en contacto el bloqueador con la célula particular sobre la cual se desea actuar. REFERENCIAS Se dan a continuación particulares de referencias citadas. Todas las referencias enlistadas son incorporadas en la presente para referencia. Arteaga, C.L., Johnson, G. , Coffey, R.J., Carpenter, G. , Page, D.L. (1991) Elevated content of the tyfosine kinase substrate phospholipase C-gamma 1 in primary human breast carcinomas. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88, 10435-9. Ashwell ,J.D,m Cunningham, R.E., Noguchi, P.D. & Hernández, D. (1987) Cell growth cycle block of T cell hydridomas upon activation with antigen. J. Exp. Med., 165, 173- 194. Baffy, G. , Miyashita, T., Williamson, J.R. & Reedm J.C. (1993) apoptosis induced by withdrawal of interleukin-3 (IL-3) from al IL-3 dependent hematopoietic cell line is associated with repartitioning of intracellular calcium and is blocked by enforced Bel -2 oncoprotein production. J. Biol. Chem., 268,6511-9. Bargou, R. C. , P. T. Daniel, M. Y. Mapara, K. Bommert, C.

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Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para inducir muerte de células en un mamífero en necesidad del mismo, en donde las células son capaces de ser estimuladas por un factor eon flujo de Ca2+ 5 acompañante, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un bloqueador de flujo de Ca2+ y una cantidad efectiva del factor.
2. En un mamífero que tiene células que están sujetas a la estimulación por un ligando de un receptor de la célula 10 por un agente, con flujo de Ca2+ acompañante, un método para inducir muerte de células, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un bloqueador de flujo de Ca2+ y una cantidad efectiva del ligando.
3. Un método para inducir muerte de células en un 15 mamífero en necesidad del mismo, en donde la célula tiene un receptor el cual, después de enlazarse por un agente resulta en flujo de Ca2+ hacia la célula y activación de fosfolipasa C, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un bloqueador de flujo de Ca2+ y una 20 cantidad efectiva del agente.
4. Un método para inducir muerte de células en un mamífero en necesidad del mismo, en donde las células son capaces de ser estimuladas por un factor con flujo de Ca2+ acompañante, caracterizado porque comprende administrar al 25 mamífero una cantidad efectiva de un bloqueador de flujo de Ca2+ sin tensión de voltaje y una cantidad efectiva del factor.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 4 caracterizado porque el factor es un anticuerpo agonista para un receptor de las células. 5
6. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 4 caracterizado- porque el factor es un ligando natural d eun receptor de las células .
7. El método de conformidad con la reivindicación 2 o reivindicación donde el ligando es un ligando natural del 10 receptor.
8. El método de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado porque el agente es un anticuerpo agonista para el receptor.
9. El método de conformidad con la reivindicación 3 15 caracterizado porque el agente es un ligando del receptor.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9 caracterizado porque el ligando es un ligando natural del receptor.
11. El método de conformidad con la reivindicación 20 1,2,3,4,5,6,7,8,9 ó 19 caracterizado porque las células son mastocitos, monocitos, macrófagos, fibroblastos, células T, basófilos o células cancerosas .
12. El método de conformidad con la reivindicación 1,2,3,4,5,6,7,8,9 ó 19 caracterizado porque el mamífero esta 25 sufriendo de una enfermedad proliferativa .
13. El método de conformidad con la reivindicación 1,2,3,4,5,6,7,8,9 ó 19 caracterizado porque el mamífero está sufriendo de cáncer.
14. El método de conformidad con la reivindicación 1,2,3,4,5,6,7,8,9 ó 19 caracterizado porque el mamífero está sufriendo de cáncer de mama.
15. El método de conformidad con la reivindicación 1,2,3,4,5,6,7,8,9 ó 19 caracterizado porque el mamífero está sufriendo de una alergia.
16. El método de conformidad con la reivindicación 1,2,3,4,5,6,7,8,9 ó 19 caracterizado porque el mamífero está sufriendo de un transtorno autoinmune .
17. El método de conformidad con la reivindicación 1,4,5 ó 6 caracterizado porque la célula tiene un receptor de superficie seleccionado de receptor c-kit o un receptor c-kit mutante, o un receptor de célula T, CD3, FcyRII, FcyRiii, FceRI, proteína G, un receptor para bombesina, un receptor para péptido que libera gastrina, un receptor para bradiquinina, un receptor para carbacol, un receptor para neuroquinina, un receptor para la sustancia P, un receptor para una molécula purinérgica, un receptor para TGF-a, un receptor para FCE, un receptor para heregulina, un receptor para erbBl, un receptor para erbB2 , un receptor para erbB3 , un receptor para erbB4 , un receptor para PDGF, un receptor para SLF, un receptor para ligando FLT-3, un receptor para FGF básico, un receptor para un • FGF ácido, un receptor para enotelina, un receptor para NGF, un receptor para VFCE, y un receptor para HGF.
18. El método de conformidad con la reivindicación 2, 3, 7, 8 ó 9 caracterizado porque 1 receptor es seleccionado 5 de receptor c-kit o un receptor c-kit mutante, o un receptor de célula T, CD3, FcyRII, FcyRiii, FceRI, proteína G, un receptor para bombesina, un receptor para péptido que libera gastrina, un receptor para bradiquinina, un receptor para carbacol, un # receptor para neuroquinina, un receptor para la sustancia P, un 10 receptor para una molécula purinérgica, un receptor para TGF-a, un receptor para FCE, un receptor para heregulina, un receptor para erbBl, un receptor para erbB2, un receptor para erbB3 , un receptor para erbB , un receptor para PDGF, un receptor para SLF, un receptor para ligando FLT-3, un receptor para FGF 15 básico, un receptor para un FGF ácido, un receptor para enotelina, un receptor para NGF, un receptor para VFCE, y un receptor para HGF.
19. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 4 caracterizado porque el factor es seleccionado del grupo de 20 SLF, TGF-a, FCE, heregulina, agonistas para erbBl, agonistas para erbB2 , agonistas para erbB3 , agonistas para erbB4 , PDGF A, PDGF B, ligando FLT-3, FGF básico, FGF ácido, enotelina, NGF, VFCE, HGF, agonistas para TCR, agonistas para receptor CD3 , agonistas para receptor RCyRII, agonistas para receptor 25 FcyRIII, agonistas para receptor FceRI , agonistas de receptores unidos a proteína G, bombesina, gastrina, péptido que libera gastrina, bradiquinina, carbacol, agonistas de receptor muscarínico, CCK-8, bazopresina, neuroquininas , sustancia P, agonistas de receptor purinérgico, ATP, adenosin, y 1,25- 5 dihidroxivitamina D3 y combinaciones de los mismos.
20. El método de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque el factor se selecciona de SLF, TGF-a, FCE, heregulina, agonistas para erbBl, agonistas para erbB2 , agonistas para erbB3 , agonistas para erbB4 , PDGF A, PDGF B, 10 ligando FLT-3, FGF básico, FGF ácido, enotelina, NGF, VFCE, HGF, agonistas para TCR, agonistas para receptor CD3 , agonistas para receptor RCyRII, agonistas para receptor FcyRIII, agonistas para receptor FceRI, agonistas de receptores unidos a proteína G, bombesina, gastrina, péptido que libera gastrina, 15 bradiquinina, carbacol, agonistas de receptor muscarínico, CCK- 8, bazopresina, neuroquininas, sustancia P, agonistas de receptor purinérgico, ATP, adenosin, y 1, 25-dihidroxivitamina D3 y combinaciones de los mismos.
21. El método de conformidad con la reivindicación 2 20 caracterizado porque el ligando es seleccionado del grupo de SLF, TGF-a, FCE, heregulina, agonistas para erbBl, agonistas para erbB2 , agonistas para erbB3, agonistas para erbB4, PDGF A, PDGF B, ligando FLT-3, FGF básico, FGF ácido, enotelina, NGF, VFCE, HGF, agonistas para TCR, agonistas para receptor CD3 , 25 agonistas para receptor RCyRII, agonistas para receptor FcyRIII, agonistas para receptor FceRI, agonistas de receptores unidos a proteína G, bombesina, gastrina, péptido que libera gastrina, bradiquinina, carbacol, agonistas de receptor muscarínico, CCK- 8, bazopresina, neuroquininas, sustancia P, 5 agonistas de receptor purinérgico, ATP, adenosin, y 1,25- dihidroxivitamina D3 y combinaciones de los mismos .
22. El método de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado porque el agente es seleccionado del grupo de # SLF, TGF-a, FCE, heregulina, agonistas para erbBl, agonistas 10 para erbB2, agonistas para erbB3, agonistas para erbB4, PDGF A, PDGF B, ligando FLT-3, FGF básico, FGF ácido, enotelina, NGF, VFCE, HGF, agonistas para TCR, agonistas para receptor CD3, agonistas para receptor RCyRII, agonistas para receptor FcyRIII, agonistas para receptor FceRI, agonistas de receptores 15 unidos a proteína G, bombesina, gastrina, péptido que libera gastrina, bradiquinina, carbacol, agonistas de receptor muscarínico, CCK-8, bazopresina, neuroquininas, sustancia P, agonistas de receptor purinérgico, ATP, adenosin, y 1,25- dihidroxivitamina D3 y combinaciones de los mismos. 20
23. El método de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 4 caracterizado porque la célula es una célula inmune hiperactiva e incluye un anticuerpo y el factor es un antígeno para el anticuerpo.
24. El método de conformidad con la reivindicación 1 25 o reivindicación 4 caracterizado porque la célula es una célula inmune hiperactiva y una IgE está enlazada a la célula inmune y el factor es un. agonista para IgE.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24 caracterizado porque la célula incluue un receptor de IgE y 5 el factor es un anticuerpo para el receptor.
26. El método de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque la célula es una célula inmune hiperactiva e incluye un anticuerpo y el ligando es un antígeno para el # anticuerpo. 10
27. El método de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque la célula es una célula inmune hiperactiva y una IgE está enlazada a la célula inmune y el ligando es un agonista para IgE.
28. El método de conformidad con la reivindicación 15 27 caracterizado porque la célula incluye un receptor de IgE y el ligando es un anticuerpo para IgE.
29. El método de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado porque la célula es una célula inmune hiperactiva e incluye un anticuerpo y el agente es un antígeno para el 20 anticuerpo.
30. El método de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado porque la célula es una célula inmune hiperactiva y una IgE está enlazada a la célula inmune y el agente es un agonista para IgE. 25
31. El método de conformidad con la reivindicación 3o caracterizado porque la célula incluye un receptor de IgE y el agente es un anticuerpo para el receptor.
32. El método de conformidad con la reivindicación 24, 27 ó 30 caracterizado porque las células son basófilos. 5
33. El método de conformidad con la reivindicación 24, 27 ó 30 caracterizado porque las células son mastocitos.
34. El método de conformidad con la reivindicación 1, 4, 5, 6, 17, 23, 24 ó 25 caracterizado porque el bloqueador de flujo de Ca2+ y el factor, se administran por separado. 10
35. El método de conformidad con la reivindicación 2, 7, 18, 20, 21, 26 ó 27 caracterizado porque el bloqueador de flujo de Ca+ y el ligando, se administran por separado.
36. El método de conformidad con la reivindicación 3, 8, 9, 22, 29 ó 30 caracterizado porque el bloqueador de 15 flujo de Ca2+ y el agente, se administran por separado.
37. El método de conformidad con la reivindicación 1, 4, 5, 6, 17, 23, 24 ó 25 caracterizado porque el bloqueador de flujo de Ca2+ se administra antes que el factor.
38. El método de conformidad con la reivindicación 20 2, 7, 18, 20, 21, 26 ó 27 caracterizado porque el bloqueador de flujo de Ca2+ se administra antes que el ligando.
39. El método de conformidad con la reivindicación 3, 8, 9, 22, 29 ó 30 caracterizado porque el bloqueador de flujo de Ca2+ se administra antes que el agente. 25
40. El método de conformidad con la reivindicación 1, 4, 5, 6, 17, 23, 24 ó 25 caracterizado porque el bloqueador de flujo de Ca2+ y el factor se administran en una sola etapa.
41. El método de conformidad con la reivindicación 2, 7, 18, 20, 2?, 26 ó 27 caracterizado porque el bloqueador de 5 flujo de Ca2+ y el ligando, se administran en una sola etapa.
42. El método de conformidad con la reivindicación 3, 8, 9, 22, 29 ó 30 caracterizado porque el bloqueador de flujo de Ca2+ y el agente, se administran en una sola etapa. f
43. El método de conformidad con la reivindicación 10 1 ó 4 caracterizado porque la estimulación de las células por el factor en la ausencia del bloqueador de flujo de Ca2+ promueve normalmente el crecimiento, sobrevivencia y/o activación de las células .
44. El método de conformidad con la reivindicación 2 15 ó 4 caracterizado porque el enlace del ligando al receptor en la ausencia del bloqueador de flujo de Ca2+ promueve normalmente el crecimiento, sobrevivencia y/o activación de las células .
45. El método de conformidad con la reivindicación 3 20 ó 4 caracterizado porque el enlace del agente en la ausencia del bloqueador de flujo de Ca2+ promueve normalmente el crecimiento, sobrevivencia y/o activación de las células.
46. El método de conformidad con la reivindicación 1,2,3 ó 4 caracterizado porque las células expresan un receptor 25 de c-kit, en donde el método incluye administrar una cantidad "f efectiva de un ligando de c-kit al mamífero.
47. El método de conformidad con la reivindicación 1,2,3 ó 4 caracterizado porque el mamífero es un humano que esta sufriendo de leucemia, crecimiento tumoral o cáncer de 5 pulmón .
48. El método de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado porque el factor es un factor de crecimiento el cual se une a un receptor de una célula, el cual enlazado normalmente provoca la proliferación de la célula. 10
49. El método de conformidad con la reivindicación 48 caracterizado porque el mamífero esta sufriendo de cáncer o hiperplasia .
50. El método de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado porque el factor es una proteína. 15
51. El método de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado porque el factor es un factor de sobrevivencia el cual se une a un receptor de la célula, el cual enlazado, en la ausencia del bloqueador de flujo de Ca2+ incrementa normalmente la longevidad de la célula. 20
52. El método de conformidad con la reivindicación 51 caracterizado porque porque las células son células progenitoras hematopoyéticas.
53. El método de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado porque el factor es un factor de activación el 25 cual se une a un receptor de la célula, el cual enlazado, en la ausencia de un bloqueador de flujo de Ca2+ provoca normalmente la activación de la célula.
54. El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente caracterizado porque el mamífero es 5 humano .
55. El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente caracterizado porque el bloqueador de flujo de Ca2+ es seleccionado del grupo de Ni2+, cetotifen, econazol, tenidap, Cal, Cd2+, Co2+, La3+, Mn2+, SKF-96365 y 10 cromolina, o una combinación de los mismos.
56. Un método para inducir muerte de células constitutivamente activadas de un mamífero en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un bloqueador de flujo de Ca2+ al mamífero. 15
57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la activación resulta en una concentración de Ca2+ elevada arriba de niveles de las células cuando está en estado no activado.
58. El método de conformidad con la reivindicación 20 56 caracterizado porque la activación constitutiva es el resultado de la presencia de un receptor de c-kit mutante.
59. El método de conformidad con la reivindicación 58 caracterizado porque el mamífero está sufriendo de mastocitosis . 25
60. Un método para inducir muerte de células de un mamífero en necesidad del mism en el cual las células son sometidas a estimulación autocrina, se caracteriza porque comprende administrar una cantidad efectiva de un bloqueador de flujo de Ca2+ al mamífero. 5
61. El método de conformidad con la reivindicación 56, 57, 58 59 ó 50 caracterizado porque el bloqueador de flujo de Ca+ es Ni2+.
62. Una composición farmacéutica para administración a un mamífero como un agente anti proliferativo para inhibir el 10 crecimiento celular, que comprende un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor el cual normalmente se une a un receptor de la célula para provocar el flujo de Ca2+ hacia la célula.
63. La composición de conformidad con la reivindicación 62 caracterizada porque el enlace de tal factor 15 al receptor normalmente resulta en activación de fosfolipasa C.
64. La composición de conformidad con la reivindicación 62 ó 63 caracterizada porque el bloqueador de flujo de Ca2+ es un bloqueador de flujo de Ca2+ sin tensión de compuerta . 20
65. La composición de conformidad con la reivindicación 62, 63 ó 64 caracterizada porque el factor es un anticuerpo agonista para el receptor.
66. La composición de conformidad con la reivindicación 62, 63 ó 64 caracterizada porque el factor es un 25 un ligando natural del receptor. *
67. La composición de conformidad con la reivindicación 62, 63 ó 64 caracterizada porque el factor es seleccionado del grupo SLF, TGF-a, FCE, heregulina, agonistas para erbBl, agonistas para erbB2 , agonistas para erbB3 , 5 agonistas para erbB4 , PDGF A, PDGF B, ligando FLT-3, FGF básico, FGF ácido, enotelina, NGF, VFCE, HGF, agonistas para TCR, agonistas para receptor CD3 , agonistas para receptor RCyRII, agonistas para receptor FcyRIII, agonistas para * receptor FceRI, agonistas de receptores unidos a proteína G, 10 bombesina, gastrina, péptido que libera gastrina, bradiquinina, carbacol, agonistas de receptor muscarínico, CCK- 8, bazopresina, neuroquininas, sustancia P, agonistas de receptor purinérgico, ATP, adenosin, y 1, 25-dihidroxivitamina D3 y combinaciones de los mismos . 15
68. La composición de conformidad con la reivindicación 67 caracterizada porque el factor es SLF.
69. La composición de conformidad con la reivindicación 62 caracterizada porque el factor es un antígeno de un anticuerpo de superficie de una célula inmune. 20
70. La composición de conformidad con la reivindicación '62 caracterizada porque el factor es un agonista para IgE.
71. La composición de conformidad con la reivindicación 62 caracterizada porque el enlace de tal factor 25 al receptor normalmente, en la ausencia del bloqueador de flujo de Ca2+, promueve el crecimiento, sobrevivencia y/o activación de la célula.
72. Un equipo de composiciones farmacéuticas para uso en la inhibición del crecimiento celular en un mamífero, el equipo caracterizado porque comprende un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor el cual normalmente se une a un receptor de la célula para provocar el flujo de Ca2+ hacia la célula.
73. La composición de conformidad con la reivindicación 72 caracterizada porque el enlace del factor al receptor resulta normalmente en la activación de fosfolipasa C.
74. La composición de conformidad con la reivindicación 72 ó 73 caracterizada porque el bloqueador de flujo de Ca2+ es un bloqueador de flujo de Ca2+ sin tensión de compuerta .
75. La composición de conformidad con la reivindicación 72, 73 ó 74 caracterizada porque el factor es un anticuerpo agonístico al receptor.
76. La composición de conformidad con la reivindicación 72, 73 ó 74 caracterizada porque el factor es un ligando natural del receptor.
77. La composición de conformidad con la reivindicación 72, 73 ó 74 caracterizada por el es seleccionado del grupo SLF, TGF-a, FCE, heregulina, agonistas para erbBl, agonistas para erbB2, agonistas para erbB3 , agonistas para erbB4, PDGF A, PDGF B, ligando FLT-3, FGF básico, FGF ácido, enotelina, NGF, VFCE, HGF, agonistas para TCR, agonistas para receptor CD3 , agonistas para receptor RCyRII, agonistas para receptor FcyRIII, agonistas para receptor FceRI , agonistas de receptores unidos a proteína G, bombesina, gastrina, péptido 5 que libera gastrina, bradiquinina, carbacol, agonistas de receptor muscarínico, CCK-8, bazopresina, neuroquininas, sustancia P, agonistas de receptor purinérgico, ATP, adenosin, y 1, 25-dihidroxivitamina D3 y combinaciones de los mismos.
78. La composición de conformidad con la 10 reivindicación 77 caracterizada porque el factor es SLF.
79. La composición de conformidad con la reivindicación 72 caracterizada porque el factor es factor un antígeno de anticuerpo superficial de una célula inmune.
80. La composición de conformidad con la 15 reivindicación 72 caracterizada porque el factor es un agonista para IgE.
81. La composición de conformidad con la reivindicación 72 caracterizada porque el enlace del factor al receptor normalmente, en la ausencia del bloqueador de flujo de 20 Ca2+, promueve el crecimiento, sobrevivencia y/o activación de la célula.
82. El uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 ó 71 como un agente antiproliferativo . 25
83. El uso de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 ó 71 como un agente antiinflamatorio.
84. El uso de los componentes del equipo de conformidad con la reivindicación 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 5 79, 80 ó 81 como un agente anti proliferativo.
85. El uso de los componentes del equipo de conformidad con la reivindicación 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 ó 81 como un agente anti inflamatorio.
86. El uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un 10 factor el cual se une normalmente a un receptor de una célula para provocar el flujo de Ca2+ hacia la célula, en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células .
87. El uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un 15 factor de conformidad con la reivindicación 86 en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el enlace del factor al receptor resulta normalmente en la activación de fosfolipasa C. 20
88. El uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de conformidad con la reivindicación 86 ó 87 en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el bloqueador de flujo de Ca2+ es un bloqueador de flujo de Ca2+ sin tensión de 25 compuerta.
89. El uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de conformidad con la reivindicación 86, 87 ó 88 en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el factor es un anticuerpo agonístico para el receptor.
90. El uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de conformidad con la reivindicación 86, 87 ó 88 en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el factor es un ligando natural del receptor.
91. El uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de conformidad con la reivindicación 86, 87 ó 88 en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el factor es seleccionado del grupo SLF, TGF-a, FCE, heregulina, agonistas para erbBl, agonistas para erbB2, agonistas para erbB3 , agonistas para erbB4, PDGF A, PDGF B, ligando FLT-3, FGF básico, FGF ácido, enotelina, NGF, VFCE, HGF, agonistas para TCR, agonistas para receptor CD3 , agonistas para receptor RCyRII, agonistas para receptor FcyRIII, agonistas para receptor FceRI, agonistas de receptores unidos a proteína G, bombesina, gastrina, péptido que libera gastrina, bradiquinina, carbacol, agonistas de receptor muscarínico, CCK-8, bazopresina, neuroquininas, sustancia P, agonistas de receptor purinérgico, ATP, adenosin, y 1 , 25-dihidroxivitamina D3 y f combinaciones de los mismos.
92. El uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de conformidad con la reivindicación 91 en la preparación de un medicamento para uso como agente para inhibir 5 el crecimiento de células en donde el factor es SLF.
93. El uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de conformidad con la reivindicación 86 en la preparación de un medicamento para uso como agente para inhibir el crecimiento de células en donde el factor es un antígeno del 10 anticuerpo de superficie de una célula inmune.
94. El uso de un bloqueador de flujo de Ca2+ y un factor de conformidad con la reivindicación 86 en la preparación de un medicamento para uso como un agente para inhibir el crecimiento de las células en donde el factor es un 15 agonista para una IgE .
95. El uso de un bloqueador de flujo de Ca+ y un factor de conformidad con la reivindicación 86 en la preparación de un medicamento para uso como un agente antiproliferativo en donde el enlace del factor al receptor 20 normalmente, en la ausencia del bloqueador de flujo de Ca2+, promueve el crecimiento, sobrevivencia y/o activación de la célula.
96. Un método para método para diagnosticar la susceptibilidad de células de mamíferos enfermas al tratamiento 25 con un bloqueador de flujo de Ca2+, o un bloqueador y factor el cual además activa los receptores de las células, caracterizado porque comprende : Ensayar si una muestra de tejido contiene un nivel de actividad FLC la cual está elevada en comparación con tejido 5 normal ; en donde, Un nivel elevado de FLC activada indica que las células tienen probabilidad de ser susceptibles al tratamiento.
97. El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque además comprende obtener una muestra 10 del tejido enfermo.
98. El método de conformidad con la reivindicación 96 ó 97, caracterizado porque la etapa de ensayo de la muestra incluye monitorear la cantidad de un substrato de FLC el cual reacciona en la presencia de FLC obtenida de una cantidad 15 predeterminada de tejido.
99. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque además comprende aislar FLC de la cantidad predeterminada del tejido por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. 20
100. El método de conformidad con la reivindicación 98 ó 99 caracterizado porque el substrato de FLC es [3H]-PIP2.
101. Un método para investigar un agente como bloqueador de flujo de Ca2+, el método caracterizado porque comprende las etapas de: 25 Cultivar un primer grupo de células en la presencia del agente, en donde las células tienen un receptor activado el cual promueve el flujo de Ca2+ hacia las células; Cultivar un segundo grupo de células en la presencia del agente, en donde las células del segundo grupo carecen de 5 un receptor activado el cual promueve el fujo de Ca2+ hacia las células del segundo grupo; Determinar si el crecimiento del primer grupo de células es menor que un primer nivel predeterminado que corresponde al creejmiento de las células del primer grupo en 10 la ausencia del agente; y Determinar si el crecimiento del segundo grupo de células es sustancialmente el mismo como un segundo nivel predeterminado que corresponde al crecimiento de células del segundo grupo en la ausencia del agente; en donde 15 El crecimiento del primer grupo menor que el primer nivel predeterminado y el crecimiento del segundo grupo de células sustancialmente el mismo como en el segundo nivel predeterminado indica que el agente es un bloqueador de Ca2+ .
102. El método de conformidad con la reivindicación 20 101 caracterizado porque el receptor del primer grupo de células está activado constitutivamente.
103. El método de conformidad con la reivindicación 101 caracterizado porque el receptor del primer grupo de células es sometido a estimulación autocrina. 25
104. El método de conformidad con la reivindicación 101 caracterizado porque el receptor del primer grupo de células es activado por un agente exógeno.
105. El método de conformidad con la reivindicación 104 caracterizado porque el agente es un ligando natural del 5 receptor del primer grupo de células .
106. El método de conformidad con la reivindicación 101, 104 ó 105 caracterizado porque el receptor del primer grupo de células y el receptor del segundo grupo de células es f el mismo receptor. 10
107. El método de conformidad con la reivindicación 101, 104 ó 105 caracterizado porque el receptor es seleccionado del grupo de receptor de c-kit, un receptor para FCE y un receptor para FGF.
108. El método de conformidad con la reivindicación 15 101, 102, 103, 104, 105, 106 ó 107 caracterizado porque las células del primer grupo y las células del segundo grupo son células humanas.
109. El método de conformidad con la reivindicación 101, 102, 103, 104, 105, 106. 107 ó 108 caracterizado porque 20 las células del primer grupo son mastocitos, las células del segundo grupo son mastocitos, el receptor es el receptor de c- kit y el primer, grupo de células es cultivado en la presencia de SLF.
110. El método de conformidad con la reivindicación 25 101, caracterizado porque el primer grupo de células es transfectado con el receptor del primer grupo de células #