MXPA98004158A - El receptor ob y metodos de diagnosticar y tratarel peso - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al descubrimiento, la identificación y la caracterización de nucleótidos que codifican el receptor OB (ObR), una proteína receptora que participa en la regulación del peso del cuerpo de mamíferos. La invención incorpora nucleótidos obR sistema de expresión de célula anfitriona, proteínas ObR, proteínas de fusión, polipéptidos y péptidos, anticuerpos al receptor, animales transgénicos que expresan un transgene obR, o animales desprovistos, recombinantes, que no expresan ObR, antagonistas y agonistas del receptor, y otros compuestos para modular la expresión del gene obR o actividad Obr que puede usarse para diagnóstico, análisis de medicamentos, monitoreo de pruebas clínicas y/o el tratamiento de desórdenes del peso del cuerpo, incluyendo pero sin limitarse a obesidad, cachexia y anorexia.

Description

EL RECEPTOR OB Y MÉTODOS DE DIAGNOSTICAR Y TRATAR EL PESO I . Introducción La presente invención se refiere al descubrimiento, la identificación y la caracterización de nucleótidos que codifican el receptor Ob, (ObR) , una proteina receptora que participa en la regulación del peso corporal del mamífero. La invención abarca nucleótidos obR, sistemas de expresión de células anfitrionas, proteínas ObR, proteínas de fusión, polipéptidos y péptidos, anticuerpos para el receptor, animales transgénicos que expresan un transgén obR, o animales recombinantes que no expresan el ObR, antagonistas y agonistas del receptor, y otros compuestos que modulan la expresión del gen obR o la actividad de obR que se puede utilizar para diagnóstico, rastreo de fármacos, monitoreo de ensayos clínicos, y/o el tratamiento de desórdenes de peso corporal, incluyendo, pero no limitándose a, obesidad, caquexia y anorexia . II . Antecedentes de la Invención La obesidad representa el más prevaleciente de los desórdenes del peso corporal, y es el desorden nutricional más importante en el mundo occidental, con estimaciones de su preva-lencia desde el 30 por ciento hasta el 50 por ciento dentro de la población de edad media. Otros desórdenes del peso corporal, tales como anorexia nerviosa y bulimia nerviosa, que afectan juntas a aproximadamente al 0.2 por ciento de la población femenina del mundo occidental, también presentan serias amenazas para la salud. Además, los desórdenes tales como anorexia y caquexia (desperdicio) también son características prominentes de otras enfermedades tales como cáncer, fibrosis cística, y SIDA. La obesidad, definida como un exceso de grasa en el cuerpo en relación con la masa magra del cuerpo, también contribuye a otras enfermedades. Por ejemplo, este desorden es respon-sable del aumento de incidencias de enfermedades tales como enfermedad arterial coronaria, embolia, y diabetes. (Ver por ejemplo, Nishina P.M. y colaboradores, 1994, Metab. 43 : 554-558) . La obesidad no es meramente un problema de comportamiento, es decir, el resultado de hiperfagia voluntaria. Más bien, la composición corporal diferencial observada entre los sujetos obesos y normales, resulta de las diferencias tanto el metabolismo como en las interacciones neurológicas/metabólicas . Estas diferencias parecen de verse, hasta algún grado, a diferencias en la expresión genética, y/o en el nivel de productos genéticos o actividad (Friedman, J.M. y colaboradores, 1991, Mammalian Gene 1:130-144) . La epidemiología de la obesidad muestra fuertemente que el desorden exhibe características heredadas (Stunkard, 1990, N. Eng. J. Med. 322 : 1483) . Molí y colaboradores han reportado que, en muchas poblaciones, la obesidad parece ser controlada por unos pocos lugares genéticos (Molí y colaboradores. 1991, Am. J. Hum. Gen. 4j3: 1243) . En adición, los estudios de gemelos humanos sugieren fuertemente una base genética sustancial en el control del peso corporal, con estimaciones de posibilidad de herencia del 80 al 90 por ciento (Simopoulos, A.P. y Childs B., eds, 1989, en "Genetic Variation and Nutrition in Obesity", World Review of Nutrition and Diabetes .63., S. Karger, Basilea, Suiza; Borjeson, M., 1976. Acta. Paediatr. Scand. 65: 279-287). Los estudios de las personas no obesas que trataron deliberadamente de ganar peso sobre-comiendo sistemáticamente, se encontraron más resistentes a esta ganancia de peso y capaces de mantener un peso elevado solamente por una ingestión calórica muy alta. En contraste, los individuos espontáneamente obesos pueden mantener su estado con una ingestión calórica normal o sólo moderadamente elevada. En adición, es una experiencia común en la cría de animales, que diferentes cepas de cerdos, ganado, etcétera, tienen diferentes predisposiciones a la obesidad. Los estudios de la genética de la obesidad humana y de los modelos de obesidad animal, demuestran que la obesidad resulta de una regulación defectuosa compleja de tanto la ingestión de alimento, el gasto de energía inducido por el alimento, como del equilibrio entre el anabolismo de lípidos y del cuerpo magro. Existen un número de enfermedades genéticas en el hombre y en otras especies que tienen la obesidad entre sus síntomas más prominentes, junto con, frecuentemente, caracterís- ticas dismórficas y retardo mental. Por ejemplo, el síndrome de Prader-Willi (PWS) afecta a aproximadamente 1 de 20,000 nacimientos vivos, e involucra un tono muscular neonatal pobre, deformidades faciales y genitales, y en general obesidad. En adición al PWS, se han caracterizado muchos otros síndromes pleyotrópicos que incluyen obesidad como un síntoma. Estos síndromes son más genéticamente directos, y parecen involucrar alelos recesivos autosomales . Las enfermedades incluyen entre otras, síndromes de Ahlstroem, Carpenter, Bardet-Biedl, Cohén, y Morgagni-Stewart-Monel . Existen un número de modelos para el estudio de la obesidad, (ver, por ejemplo, Bray, G.A., 1992, Prog. Brain Res. 93=333-341, y Bray, G.A., 1989, Amer. J. Clin. Nutr. 5:891-902). Por ejemplo, se han identificado animales que tienen mutaciones que conducen a síndromes que incluyen síntomas de obesidad, y se han hecho intentos por utilizar estos animales como modelos para el estudio de la obesidad. Los modelos animales mejor estudiados hasta la fecha, para la obesidad genética, son los modelos de ratones. Para las revisiones, ver, por ejemplo, Friedman, J.M. y colaboradores, 1991. Mamm. Gen. 1:130-144; Friedman, J.M. y Liebel, R.L., 1992, Cell 69:217-220) . Los estudios que utilizan ratones han confirmado que la obesidad es un rasgo muy complejo con un alto grado de posibilidad de herencia. Se han identificado mutaciones en un número de lugares que conducen a los fenotipos obesos. Estas incluyen las mutaciones recesivas autosomales de obeso (ob) , diabetes (db.) , grasa (fat) , y rechoncho (tub) . En adición, las mutaciones dominantes autosomales Amarillas en el lugar agouti y Adiposa (Ad) han demostrado que contribuyen a un fenotipo obeso. Las mutaciones ob y db. están sobre los cromosomas 6 y 4, respectivamente, pero conducen a un fenotipo de obesidad complejo, clínicamente similar, evidente empezando aproximadamente a un mes de edad, que incluye hiperfagia, anormalidades severas en el metabolismo de la glucosa y de la insulina, termo-rregulación muy pobre, y termogénesis sin escalofríos, y entumecimiento extremo y subdesarrollo de la masa corporal magra. Este fenotipo complejo ha hecho difícil identificar el defecto primario que se puede atribuir a las mutaciones (Bray G..A., y colaboradores, 1989 Amer J. Clin. Nutr. 5_:891-902). Utilizando marcadores genéticos moleculares y clásicos, se ha mapeado el gen db en el cromosoma medio 4 (Friedman y colaboradores, 1991, Mamm. Gen 1 : 130-144) . La mutación se mapea en una región del genoma de ratón que es sintónica con la humana, sugiriendo que, si hay un homólogo humano de db, es posible mapearse en el cromosoma humano lp . El gen ob y su homólogo humano se han clonado recientemente (Zhang, Y. y colaboradores, 1994, Nature 372:425-432) . El gen parece producir una ARN mensajero de tejido adiposo de 4.5 kb que contiene un marco de lectura abierta de 167 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos predicha del producto del gen ob indica que es una proteína secretada, y por consiguiente, puede tener un papel como parte de una trayectoria de señalización desde el tejido adiposo, que puede servir para regular algún aspecto del deposito de grasa corporal. Además, los estudios recientes han demostrado que la proteína Ob recombinante, también conocida como leptina, cuando se administra exógenamente, puede corregir cuando menos parcialmente el fenotipo relacionado con obesidad exhibido por los ratones ob (Pelleymounter, M.A., y colaboradores, 1995, Science 269 : 540-543; Hálalas, J.L. y colaboradores 1995, Science 269:543-546; Campfield, L.A. y colaboradores, 1995, Science 269: 546-549) . Los estudios recientes han sugerido que los seres humanos y los roedores obesos (diferentes de los ratones ob/ob) no son defectuosos en su capacidad para producir ARNm de ob o proteína, y en general producen niveles más altos que los indivi-dúos magros (Maffei y colaboradores, 1995, Nature Med, 1 (11) : 1155-1161; Considine y colaboradores, 1995, J. Clin. Invest. 95 (6) :2986-2988; Lohnqvist y colaboradores, 1995, Nature Med. 1:950-953, Hamilton y colaboradores 1995, Nature Med. 1:953-956) .

Estos datos sugieren que la resistencia a los niveles normales o elevados de Ob puede ser más importante que una producción inadecuada de Ob en la obesidad humana. Sin embargo, el receptor para el producto del gen ob, que se piensa que se expresa en el hipotálamo, sigue siendo elusivo. Las mutaciones homocigóticas , ya sea en los lugares fat o tub ocasionan obesidad que se desarrolla más lentamente que aquellas observadas en los ratones ob y db. (Coleman, D.L. y Eicher, E.M., 1990, J. Heredity 81: 424-427 ) , desarrollándose la obesidad tub más lentamente que la observada en los animales fat. Esta característica del fenotipo obeso tub hace que el desarrollo del fenotipo obeso tub se parezca más estrechamente a la manera en la cual se desarrolla la obesidad en los seres humanos. Sin embargo, inclusive así, el fenotipo obeso dentro de estos animales, se puede caracterizar como masivo, en que los animales eventualmente alcanzan pesos corporales que son casi dos veces el peso promedio que se ve en los ratones normales. La mutación fat se ha mapeado en el cromosoma de ratón 8, mientras que la mutación tub se ha mapeado en el cromosoma de ratón 7. De acuerdo con Naggert y colaboradores, la mutación fat se ha identificación recientemente (Naggert, J.K. y colaborado-res, 1995, Nature, Genetics .10:135-141) . De una manera específica, la mutación fat parece ser una mutación dentro del lugar Cpe, que codifica la proteína de carboxipeptidasa (Cpe) E. La Cpe es una exopeptidasa involucrada en el procesamiento de pro-hormonas, incluyendo pro-insulina. La mutación amarilla dominante en el lugar aaouti, ocasiona un síndrome pleyotrópico que provoca una obesidad moderada que se establece en los adultos, un color de recubrimiento amarillo, y una alta incidencia de formación de tumor (Herberg, L. y Coleman, D.L., 1977, Metabolism .26:59), y una distribución anatómica anormal de la grasa corporal (Coleman, D.L., 1978, Diabetología 1.: 141-148) . Esta mutación puede representar el único ejemplo conocido de una mutación pleyotrópica que ocasiona un incremento, en lugar de una disminución, en el tamaño del cuerpo. La mutación ocasiona la expresión ampliamente exten-dida de una proteína que se ve normalmente sólo en la piel neonatal (Michaud, E.J. y colaboradores, 1994, Genes Devel . 8.:1463-1472) . Otros modelos animales incluyen ratas fa/fa ( fatty) , que llevan muchas similitudes con lo ratones ob/ob y db/db discutidos anteriormente. Una diferencia es que, aunque las ratas fa/fa son muy sensibles al frío, su capacidad para la termogéne-sis sin escalofríos es normal. El entumecimiento parece tener una mayor parte en el mantenimiento de la obesidad en las ratas fa/fa que en los ratones mutantes. En adición, las cepas de ratón consanguíneas, tales como los ratones NZO y los ratones japoneses KK son moderadamente obesas. Ciertos ratones híbridos tales como el ratón Wellesley, llegan a ser espontáneamente gordos. Además, varios roedores del desierto, tales como el ratón espinoso, no llegan a ser obesos en sus hábitats naturales, pero sí llegan a serlo cuando se alimentan con alimento de laboratorio convencional . Los animales que se han utilizado como modelos para la obesidad, también se han desarrollado por medio de métodos físicos o farmacológicos. Por ejemplo, las lesiones bilaterales en el hipotálamo ventromedial (VMH) y en el hipotálamo ventrola- teral (VLH) en la rata, están asociadas, respectivamente, con la hiperfagia y obesidad mayor, y con afagia, caquexia, y anorexia. Además, se ha demostrado que la alimentación con glutamato monosódico (MSG) , o con tioglucosa de oro, a los ratones recién nacidos, también da como resultado un síndrome de obesidad. Cada uno de los modelos de obesidad de roedor está acompañado por alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos, que se parecen a aquellas de la diabetes Tipo II en el hombre. Por ejemplo, tanto a partir de ob como db, los ratones C57BL/KS congénicos desarrollan una diabetes severa con necrosis de células ß final y atrofia del islote, dando como resultado una insulinopenia relativa, mientras que los ratones ob y db C57BL/6J congénicos desarrollan una diabetes resistente a la insulina transitoria que eventualmente es compensada por hipertrofia de células ß que se parece a la diabetes humana Tipo II. Con respecto a los ratones ob y db, el fenotipo de estos ratones se parece a la obesidad humana de diferentes maneras al desarrollo de la diabetes, en que los ratones mutantes comen más y gastan menos energías que los controles magros (así como los seres humanos obesos) . Este fenotipo también es muy similar a aquel que se ve en los animales con lesiones del hipotálamo ventromedial, lo cual sugiere que ambas mutaciones pueden interferir con la capacidad para integrar o responder apropiadamente a la información nutricional dentro del sistema nervioso central. El apoyo para esta hipótesis viene de los resultados de los experimentos de parabiosis (Coleman, D.L. 1973, Diabetología 9.: 294-298) que sugieren que los ratones ob son deficientes en el factor de saciedad circulante, y que los ratones db son resistentes a los efectos del factor ob. Estos experimentos han conducido a la conclusión de que la obesidad en estos ratones mutantes puede resultar de diferentes defectos en un ciclo aferente y/o centro integrativo del mecanismo de retroalimentación postulado que controla la composición corporal. En resumen, por consiguiente, la obesidad, que presenta un problema de salud mayor mundial, representa un rasgo complejo altamente hereditario. Dada la severidad, la prevalencia, y la heterogeneidad potencial de estos desórdenes, existe una gran necesidad de la identificación de los genes y de los productos genéticos que participan en el control del peso del cuerpo. Es un objetivo de la invención proporcionar moduladores del peso del cuerpo, proporcionar métodos para el diagnóstico de desórdenes de peso del cuerpo, proporcionar terapia para éstos desórdenes, y proporcionar un sistema de ensayo para el rastreo de sustancias que se puedan utilizar para controlar el peso del cuerpo . II . Compendio de la Invención La presente invención se refiere al descubrimiento, la identificación, y la caracterización de nucleótidos que codifican el receptor Ob (ObR) , una proteína receptora novedosa que participa en el control del peso corporal del mamífero. La ObR, descrita por primera vez en la presente, es una proteína transmembrana que extiende la membrana celular una vez, y está involucrada en la transducción de señal desencadenada por la fijación de su ligando natural, Ob, también conocido como leptina. La ObR tiene motivos de secuencia de aminoácidos que se encuentran en la familia del receptor de citoquina Clase I, y está más relacionada con el componente de transducción de señal gpl30 del receptor de IL-6, el receptor de G-CSP, y del receptor de LIF. Los resultados presentados en los ejemplos de trabajo de la presente, demuestran que la ObR de forma larga (predominantemente expresada en el hipotálamo) transduce la señal medio de una trayectoria mediada por STAT típica de los receptores de citoquina tipo IL-6, mientras que una forma truncada mayor que se presenta naturalmente, o una forma mutante que se encuentra en los ratones db/db obesos, no lo hace. La ObR de forma larga puede mediar la activación de las proteínas STAT, y estimular la trascripción a través de los elementos genéticos que responden a IL-6. Los experimentos de reconstitución indican que, aunque la ObR media las señales intracelulares con una especificidad similar a los receptores de citoquina tipo IL-6, la señalización parece ser independiente del componente de transducción de señal gpl30 de los receptores de citoquina tipo IL-6. La transcripción del ARNm de ObR, que es de aproximadamente 5 kb de largo, se expresa en el plexo coroide, el hipotálamo, y otros tejidos, incluyendo el pulmón y el hígado. Las formas cortas de murino descritas en la presente, codifican proteínas receptoras de 894 (Figura 1) y 893 aminoácidos; los ADNcs de obR de forma larga de murino y los ADNcs de obR humanos, descritos, en la presente, codifican proteínas receptoras de 1162 aminoácidos y de 1165 aminoácidos, respectivamente (Figura 6 y Figura 3, respectivamente) . La ObR tiene una secuencia líder hidrófoba típica (de aproximadamente 22 aminoácidos de largo en ambas formas de ObR de murino, y de aproximadamente 20 aminoácidos de largo en ObR humana) ; un dominio extra celular (de aproximadamente 815 aminoácidos de largo en ambas formas de ObR de murino, y de aproximadamente de 819 aminoácidos de largo en la ObR humana) ; una región transmembrana corta (de aproximadamente 23 aminoácidos de largo en ambas formas de ObR de murino, y en ObR humana); y un dominio citoplásmico . Las transcripciones que codifican la forma corta (Figura 1) y la forma larga (Figura 6) de ObR de murino, son idénticas, hasta el quinto 5' del codón de detención de la forma corta, y luego divergen completamente, sugiriendo un empalme alternativo. Como se describe en la presente, el dominio citoplásmico codificado por el ADNc de obR de forma corta de murino de 894 aminoácidos, es de 34 aminoácidos, mientras que el codificado por el ADNc de obR de forma larga de murino (302 aminoácidos) es de aproximadamente la misma longitud que el dominio citoplásmico codificado por el ADNc de obR humano (303 aminoácidos) . Las secuencias de aminoácidos deducidas a partir de ObR de forma larga de murino y ObR humana, son homologas a través de toda la longitud de toda la región de codificación, y comparten una identidad del 75 por ciento (Figura 7) . El fenotipo obeso del ratón db resulta de una transversión G-T en el gen obR. Esta transversión crea un sitio donador de empalme, que a su vez conduce a un procesamiento aberrante del ARNm de forma larga de obR en los mutantes db. En los mutantes db, este procesamiento aberrante genera ARNms de forma larga que codifica una proteína obR truncada que es idéntica a la ObR de forma corta de 894 aminoácidos. Como la ObR de forma corta, la ObR de forma larga mutante carece de la mayor parte del dominio citoplásmico, y es incapaz de transducir una señal por medio de una trayectoria mediada por STAT. La ObR de forma larga competente en señalización, que está ausente en los ratones db/db, se requiere para el mantenimiento del peso del cuerpo . La invención abarca los siguientes nucleótidos, las células anfitrionas que expresan esos nucleótidos, y los productos de expresión de esos nucleótidos: (a) nucleótidos que codifican ObRs de mamífero, incluyendo la ObR humana, y el producto del gen obR; (b) nucleótidos que codifican porciones de la ObR que corresponden a sus dominios funcionales, y los productos de polipéptidos especificados por esas secuencias de nucleótidos, incluyendo, pero no limitándose a, el dominio extra celular (ECD) , el dominio transmembrana (TM) , y el dominio citoplásmico (CD) ; (c) nucleótidos que codifican mutantes de la ObR, en donde todo o una parte de uno de los dominios se suprime o se altera, y los productos de polipéptidos especificados por esas secuencias de nucleótidos, incluyendo, pero no limitándose a, receptores solubles en donde todo o una porción del dominio transmembrana se suprime, y receptores no funcionales en donde todo o una porción del dominio citoplásmico se suprime; (d) nucleótidos que codifican proteínas de fusión que contienen a la ObR o uno de sus dominios (por ejemplo, el dominio extra celular) fundido con otro polipéptido. La invención también abarca agonistas y antagonistas de ObR, incluyendo moléculas pequeñas, moléculas grandes, proteínas Ob mutantes que compiten con Ob nativas, y anticuerpos, así como secuencias de nucleótidos que se pueden utilizar para inhibir la expresión del gen obR (por ejemplo, moléculas anti-sentido y de ribozima y construcciones de reemplazo de secuencia de gen o reguladora), o para mejorar la expresión del gen obR (por ejemplo, construcciones de expresión que colocan el gen obR bajo el control de un sistema promotor fuerte) , y animales transgénicos que expresan un transgen obR o "inconscientes" que no expresan ObR. En adición, la presente adición abarca métodos y composiciones para la evaluación de diagnóstico, la tipificación, y el pronóstico de desórdenes de peso del cuerpo, incluyendo obesidad y caquexia, y para la identificación de sujetos que tengan un predisposición a estas condiciones. Por ejemplo, se pueden utilizar las moléculas de ácido nucleico de obR de la invención como sondas de hibridación de diagnóstico, o como cebadores para el análisis de reacción en cadena de polimerasa de diagnóstico para la identificación de mutaciones del gen obR, variaciones alélicas, y defectos reguladores en el gen obR. La presente invención proporciona además estuches de diagnóstico para la práctica de estos métodos. Además, la presente invención también se refiere a métodos para la utilización del gen obR, y/o productos del gen obR, para la identificación de compuestos que modulen, es decir, actúen como agonistas o antagonistas, de la expresión del gen obR, y/o la actividad del producto del gen obR. Estos compuestos se pueden utilizar como agentes para controlar el peso del cuerpo, y en particular, como agentes terapéuticos para el tratamiento del peso del cuerpo y desórdenes del peso del cuerpo, incluyendo obesidad, caquexia, y anorexia. Todavía, además la invención, abarca métodos y composiciones para el tratamiento de desórdenes de peso del cuerpo, incluyendo obesidad, caquexia, y anorexia. Estos métodos y composiciones son capaces de modular el nivel de la expresión del gen obR, y/o el nivel de la actividad del producto del gen obR.

Esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento sorprendente, después de un extenso estudio de numerosas líneas celulares y tejidos, de un receptor de alta afinidad para Ob en el plexo coroide del cerebro, la identificación y clonación del ADNc de obR a partir de una biblioteca preparada a partir de ARNm del plexo coroide, la caracterización de su secuencia novedosa, el mapeo del gen obR hasta el mismo intervalo genético en el genoma de ratón en que se mapea el gen db, y la caracterización de la ObR como un receptor transmembrana de la familia de receptores de citoquina de la Case I. Se detectó el ARNm de obR en otros tejidos, incluyendo el hipotálamo. La ObR de longitud completa, expresada predominantemente en las señales del hipotálamo, se transduce a través de la activación de las proteínas STAT, y el estímulo de la trascripción a través de los elementos genéticos que responden a IL-6. La capacidad de la ObR de forma larga de longitud completa para señalar, está en contraste con la forma truncada que se presenta naturalmente, o la forma mutante que se encuentra en los ratones db/db que no pueden mediar la transducción de señal. La invención también incluye formas de ObR que carecen de uno u otro de los dominios intracelulares importantes para señalar e inducir la expresión genética. A. Definiciones Como se utilizan en la presente, los siguientes términos, ya sea utilizados en el singular o en el plural, tendrán los significados indicados: Ob: significa la proteína Ob descrita en Zhang, Y. y colaboradores, 1994, Nature 372 : 425-432 , que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad, que también se conoce como leptina. La Ob incluye moléculas que son homologas a la Ob, o que se fijan a la ObR. Las proteínas de fusión Ob que tienen un dominio de fosfatasa alcalina N-terminal, son referidas en la presente como proteínas de fusión AP-Ob, mientras que las proteínas de fusión Ob que tienen un dominio de fosfatasa alcalina C-terminal, son referidas en la presente como proteínas de fusión Ob-AP. Nucleótidos o secuencias de codificación de obR: significan las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína ObR, el polipéptido o los fragmentos de péptido de la proteína ObR, o proteínas de fusión ObR. Las secuencias de nucleótidos de obR abarcan ADN, incluyendo ADN genómico (por ejemplo el gen obR) o ADNc o ARN. ObR: significa la proteína receptora Ob. Los polipéptidos o fragmentos de péptido de la proteína ObR son referidos como polipéptidos ObR o péptidos ObR. Las fusiones de ObR, o de polipéptidos ObR o fragmentos de péptidos, con una proteína no relacionada, son referidas en la presente como proteínas de fusión ObR. Una ObR funcional se refiere a una proteína que fija la Ob con una alta afinidad en vivo o in vi tro.

ECD: significa "dominio extra celular ". TM: significa "dominio transmembrana". CD: significa "dominio citoplásmico". IV. Descripción de los Dibujos Figura 1. Secuencia de nucleótidos (SEQ. ID. No: 1) y secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID. No: 2) de ADNc de obR (forma corta) de murino, que codifica la proteína ObR de forma corta de murino (894 aminoácidos) . Los dominios de ObR de murino de forma corta son: secuencia de señal (residuos de aminoácidos 1 a aproximadamente 22), demonio extra celular (desde aproximadamente el residuo de aminoácido 23 hasta aproximadamente 837), dominio transmembrana (desde aproximadamente el residuo de aminoácido 838 hasta aproximadamente 860), y dominio citoplásmico (desde aproximadamente el residuo de aminoácido 831 hasta el -894) . Los sitios de glicosilación N-enlazados potenciales en el dominio extra celular están indicados por asteriscos arriba del primer aminoácido de los motivos en N-X-S- y N-X-T . Los puntajes inferiores indican motivos conservados en la familia de receptores de citoquina de la Clase I. Figura 2A-2B. Estudios de fijación de proteína de fusión AP-Ob. Figura 2A. Células COS-7 transfectadas con el ADNc de ObR, que se trataron con diferentes proteínas de fusión AP o AP-Ob a InM (diluido en DMEM + suero fetal de becerro al 10 por ciento) . Las columnas muestran el promedio de dos determinaciones de fijación, y las barras de error muestran la diferencia entre las dos. 1) AP no fundida, 2) AP-Ob (ratón), 3) AP-Ob (ratón) + 100 nM de Ob de ratón, 4) AP-Ob (ratón) + 100 nM de Ob humana, 5) AP-Ob (humana), 6) Ob-AP (ratón), 7) AP-Ob (ratón) incubada con células COS-7 transfectadas simuladamente (vector-sin inserto) . Figura 2B. Isoterma de fijación y análisis de Scatchard de la interacción de AP-Ob y ObR. Se incubaron células COS-7 transfectadas con el ADNc de obR, con diferentes concentraciones de la proteína de fusión AP-Ob (ratón) . La transformación de Scatchard se muestra como un inserto. Figura 3. Secuencia de nucleótidos (SEQ. ID. No:3) y secuencia de aminoácidos deducida (SEQ. ID. No: 4) de ADNc de obR humana que codifica la proteína ObR humana. Los dominios de la ObR humana son: secuencia de señal (desde el residuo de aminoácido 1 hasta aproximadamente 20) , dominio extra celular (desde aproximadamente el residuo de aminoácido 21 hasta aproximadamente 839), dominio transmembrana (desde aproximadamente el residuo de aminoácido 840 hasta aproximadamente 862), y dominio citoplásmico (desde aproximadamente el residuo de aminoácido 863 hasta 1165) . También se ilustran las secuencias de nucleótidos no trasladadas 5 ' . Los sitios de glicosilación N-enlazados potenciales en el dominio extra celular, están indicados por asteriscos arriba del primer aminoácido de los motivos N-X-S y N-X-T. Los puntajes inferiores indican los motivos conservados en la familia de receptores de citoquina de la Clase I. Figura 4. Alineación de los dominios extracelulares de la ObR de murino y la gpl30 humana. Los residuos idénticos (negros) y los cambios conservadores (gris) se indican sombreando alrededor de los aminoácidos correspondientes. Los cambios conservadores indicados son como son definidos por FASTA. Figura 5. Alineación de ObR de ratón (forma corta mostrada en la Figura 1) y ObR humana. Los aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias están indicados por una estrella. Figura 6. Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos deducida de ADNc de obR de forma larga de murino, que codifica la proteína ObR de forma larga de murino. Los dominios de la ObR de murino de forma larga son: secuencia de señal (residuos de aminoácidos 1 a aproximadamente 22), dominio extra celular (desde aproximadamente el residuo de aminoácido 23 hasta aproximadamente 837), dominio transmembrana (desde aproximadamente el residuo de aminoácido 838 hasta aproximadamente 860), y dominio citoplásmico (desde aproximadamente el residuo de aminoácido 861 hasta 1162) . Figura 7. Alineación de las formas largas de ObR humana y de murino. Los residuos idénticos y los cambios conservadores están indicados por dos asteriscos o un asterisco, respectivamente. Los cambios conservadores indicados son como son definidos por FASTA. Abreviaturas: mobr-1, forma larga de ObR de murino; y hobr, homólogo humano. Figura 8. Localización del gen que codifica ObR sobre el cromosoma de ratón 4. Figura 9. Secuencia de nucleótidos del inserto de 106 pares de bases en la transcripción de forma larga de db/db . Se muestra la posición precisa de la inserción en la secuencia de aminoácidos deducida cerca de la región de inserción. Figura 10. Gráfica de barras que ilustra la neutralización de ObR-Ig de la proteína OB . Se transfectaron transitoriamente células COS con el ADNc de ObR, y se probaron para determinar su capacidad para fijar 0.5 nM de AP-Ob. La columna 1 muestra los altos niveles de fijación específica observados en ausencia de proteína de fusión ObR-IgG. Las columnas 2, 3, y 4 muestran la inhibición casi completa de la fijación observada con tres fracciones de columna diferentes de ObR-IgG purificada. Figura 11A. Dibujos esquemáticos de diferentes mutantes de supresión C-terminales de proteína ObR. Los nombres y la longitud predicha (aa) de las proteínas se muestran arriba de cada proteína. Los dominios extracelulares se muestran como en franjas, los dominios transmembrana se muestran negros, y los dominios citoplásmicos se muestran blancos. La localización de los residuos de tirosina en el dominio citoplásmico se indica por las barras horizontales (Y 986, Y1079, y Y1141 están conservadas entre ObR humana y de murino) . La longitud de los dominios citoplásmicos (aa) se muestran abajo de cada proteína. Figura 11B. Una gráfica de barras que ilustra los resultados de los ensayos CAT que emplean una construcción de expresión de IL-6RE-CAT (panel superior) , o una construcción de expresión de HRRE-CAT (panel inferior) , y los mutantes de supresión de ObR de la Figura HA. Se transfectaron células H-35 con ADNcs que codifican la ObR mutante y, cualquiera de IL-6RE-CAT 0 HRRE-CAT. Se trataron subcultivos de células durante 24 horas con medio exento de suero solamente (-), o medio exento de suero conteniendo leptina de ratón (+) . Se determinó la actividad CAT, y se expresa en relación con los valores obtenidos para los cultivos de control no tratados . Figura 12. Una gráfica de barras que ilustra los resultados de un ensayo de fijación de proteína de fusión AP-Ob. Se transfectaron células COS-7 con un ADNc que codifica la proteína ObR indicada. Cuarenta y ocho horas más tarde, las células se incubaron con 1 mM de proteína de fusión AP-Ob. Las barras muestran el promedio de dos ensayos de fijación. Las barras de error indican la diferencia entre los dos ensayos. Figura 13A. Dibujos esquemáticos de diferentes proteínas ObR mutantes. Se indica la localización de los residuos de tirosina 986 y 1079. También se indica la localización de la secuencia del "cuadro 1" . Figura 13B. Gráficas de barras que ilustra los resultados de un ensayo de inducción de HRRE-CAT. Se co- transfectaron células H-35 con HRRE-CAT y construcciones de expresión para cualquiera de OB-RY1079F ó OB-R (cuadro lmt) . Los subcultivos de las células se trataron durante 24 horas con medio exento de suero que contenía leptina humana. Se determinó la actividad CAT, y se expresa en relación con los valores obtenidos para los cultivos de control no tratados. Figura 14A. Dibujos esquemáticos de diferentes quimeras de receptor. Las porciones derivadas de G-CSFR están sombreadas; las porciones derivadas de ObR no lo están. Se indican las localizaciones de los motivos de Cuadro 1, Cuadro 2 y Cuadro 3 predichos. Figura 14B. Gráficas de barras que ilustran los resultados de los ensayos de inducción de IL-6RE-CAT (panel izquierdo) y HRRE-CAT. Se co-transfectaron células H-35 con plásmidos de expresión para el receptor indicado (ObR, G-CSFR, o quimérico, ) y la construcción de expresión de IL-6-RE-CAT o HRRE-CAT. Las células se estimularon con el ligando apropiado, y se determinó la actividad CAT como en los experimentos descritos en la Figura 11B. Todos los valores están expresados en relación con los cultivos de control no tratados (promedio + desviación estándar de 3 a 4 experimentos) . Figura 15A. Gráfica de barras que ilustra los resultados de los ensayos de inducción de HRRE-CAT. Se cotransfectaron células H-35 con HRRE-CAT, y la cantidad indicada de ObR y OB-R?868-1165. Las células se estimularon con leptina, y se determinó la actividad CAT como en los experimentos descritos el la Figura 11. Todos los valores se expresan en relación con los cultivos no tratados . Figura 15B. Gráfica de barras que ilustra los resultados de los ensayos de inducción de IL-6RE-CAT. Se cotransfectaron células H-35 con IL-6RE-CAT, y la cantidad indicada de ObR/G-CSFR y 0B-R?868-1165. Las células se estimularon con leptina, y se determinó la actividad CAT como en los experimentos descritos en la Figura 11. Todos los valores se expresan en relación con los cultivos no tratados. Figura 15C. Gráfica de barras que ilustra los resultados de los ensayos de inducción de IL-6RE-CAT. Se cotransfectaron células H-35 con IL-6RE-CAT y la cantidad indicada de G-CSFR y G-CSFR (?cyto) . Las células se estimularon con G-CSF, y se determinó la actividad CAT como en los experimentos descritos en la Figura 11. Todos los valores se expresan en relación con los cultivos no tratados . Figura 15D. Gráfica de barras que ilustra los resultados de los ensayos de inducción de IL-6RE-CAT. Se co-traNsfectaron células H-35 junto con IL-6RE-CAT y la cantidad indicada de G-CSFR/ObR y G-CSFR (?cyto) . Las células se estimularon con G-CSF, y se determinó la actividad CAT como en los experimentos descritos en la Figura 11. Todos los valores se expresan en relación con los cultivos no tratados . Figura 15E. Gráfica de barras que ilustra los resultados de los ensayos de inducción de IL-6RE-CAT. Se cotransfectaron células H-35 con IL-6RE-CAT y la cantidad indicada de ObR y 0B-RY1141F. Las células se estimularon con leptina, y se determinó la actividad CAT como en los experimentos descritos en la Figura 11. Todos los valores se expresan en relación con los cultivos no tratados. V. Descripción Detallada de la Invención La ObR, descrita por primera vez en la presente, es una proteína receptora novedosa que participa en la regulación del peso corporal. La ObR es una proteína transmembrana que extiende la membrana una vez, y pertenece a la familia de receptores de citoquina de la Clase I, y está más estrechamente relacionada con el componente de transducción de señal gpl30 del receptor de IL-6, el receptor de G-CSF, y el receptor de LIF. La transducción de señal es desencadenada por la fijación de Ob al receptor. La neutralización de la Ob, la remoción de la Ob, o la interferencia con su fijación para la ObR, da como resultado ganancia de peso. El ARNm de ObR se detecta en el plexo coroide, y en otros tejidos, incluyendo el hipotálamo. La invención abarca el uso de nucleótidos obR, proteínas ObR y péptidos, así como anticuerpos para ObR (que, por -ejemplo, pueden actuar como agonistas o antagonistas de ObR), antagonistas que inhiben la actividad o la expresión del receptor, o agonistas que activan la actividad del receptor o incrementan su expresión en el diagnóstico y el tratamiento de - desórdenes del peso corporal, incluyendo, pero no limitándose a, obesidad, caquexia, y anorexia en animales, incluyendo seres humanos. El diagnóstico de una anormalidad de ObR en un paciente, o de una anormalidad en la trayectoria de transducción de señal de ObR, ayudará a idear un tratamiento o régimen terapéutico apropiado. En adición, los nucleótidos obR y las proteínas ObR son útiles para la identificación de compuestos efectivos en el tratamiento de desórdenes del peso corporal regulados por la ObR. En particular la invención descrita en las subsecciones siguientes, abarca ObR, polipéptidos o péptidos que corresponden a los dominios funcionales de la ObR (por ejemplo, dominio extra celular, transmembrana, o dominio citoplásmico), ObRs mutadas, truncadas, o suprimidas (por ejemplo, una ObR con uno o más dominios funcionales o porciones de los mismos suprimidos, tales como ?TM y/o ?CD), proteínas de fusión ObR (por ejemplo, una ObR o un dominio funcional de ObR tal como el demonio extra celular, fundido con un proteína o un péptido no relacionado, tal como una región constante de inmunoglobulina, es decir, IgFc) , secuencias de nucleótidos que codifican estos productos, y sistemas de expresión en células anfitrionas que pueden producir estos productos de ObR. La invención también proporciona receptores de Ob que tienen una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos definida. "Sustancialmente idéntica" significa un polipéptido o un ácido nucleico que tiene una secuencia que es cuando menos el 85 por ciento, de preferencia el 90 por ciento, y más preferiblemente el 95 por ciento o más idéntica a la secuencia del aminoácido de referencia o a la secuencia de ácido nucleico. Para los polipéptidos, la longitud de la secuencia del polipéptido de referencia generalmente será de cuando menos 16 aminoácidos, de preferencia cuando menos 20 aminoácidos, más preferiblemente de cuando menos 25 aminoácidos, y muy preferiblemente de 35 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud de la secuencia de ácido nucleico de referencia generalmente será de cuando menos 50 nucleótidos, de preferencia de cuando menos 60 nucleótidos, más preferiblemente de cuando menos 75 nucleótidos, y muy preferiblemente de 110 nucleótidos. La identidad de secuencia se puede medir utilizan software de análisis de secuencia (por ejemplo, el Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, Estados Unidos) . En el caso de secuencias de polipéptidos que sean menos del 100 por ciento idénticas a una secuencia de referencia, las posiciones no idénticas de preferencia son, pero no necesariamente, sustituciones conservadoras para la secuencia de referencia. Las sustituciones conservadoras típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina, y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. En donde se dice que un polipéptido particular tiene un porcentaje de identidad específico con un polipéptido de referencia de una longitud definida, el porcentaje de identidad está en relación con el péptido de referencia. Por consiguiente, un péptido que sea el 50 pro ciento idéntico a un polipéptido de referencia que sea de 100 aminoácidos de largo, puede ser un polipéptido de 50 aminoácidos que sea completamente idéntico a una porción de 50 aminoácidos de largo del polipéptido de referencia. También podría ser un polipéptido de 100 aminoácidos de largo que sea el 50 por ciento idéntico al polipéptido de referencia sobre toda su longitud. Por supuesto, muchos otros polipéptidos cumplirán con los mismos criterios. La invención también abarca anticuerpos y anticuerpos anti-idiotípicos (incluyendo fragmentos Fab) , antagonistas y agonistas de la ObR así como compuestos o construcciones de nucleótidos que inhiban la expresión del gen obR (inhibidores del factor de transcripción, moléculas anti-sentido y de ribozima, o construcciones de reemplazo de la secuencia del gen o reguladora), o que promuevan la expresión de ObR (por ejemplo, construcciones de expresión en donde las secuencias de codificación de obR estén operativamente asociadas con los elementos de control de expresión, tales como promotores, promotores/mejoradores, etcétera. La invención también se refiere a células anfitrionas y a animales genéticamente diseñados para expresar la ObR (o mutantes de la misma) , o para inhibir o "derribar" la expresión de la ObR endógena animal. Las proteínas o péptidos ObR, las proteínas de fusión ObR, las secuencias de nucleótidos de obR, los anticuerpos, los antagonistas, y los agonistas, pueden ser útiles para la detección de ObRs mutantes, o de ObRs inapropiadamente expresadas, para el diagnóstico de desórdenes del peso corporal, tales como obesidad, anorexia, o caquexia. Las proteínas o péptidos ObR, las proteínas de fusión ObR, las secuencias de nucleótidos de obR, los sistemas de expresión en la célula anfitriona, los anticuerpos, los antagonistas, los agonistas, y las células y animales genéticamente diseñados, se pueden utilizar para rastrear fármacos efectivos en el tratamiento de estos desórdenes del peso corporal. El uso de células anfitrionas y/o animales diseñados, puede ofrecer una ventaja, en que estos sistemas permiten no solamente la identificación de los compuestos que se fijan al dominio extra celular o a la ObR, sino que también pueden identificar compuestos que afecten la señal transducida por la ObR activada. Finalmente, los productos de la proteína ObR (especialmente los derivados solubles, tales como los péptidos correspondientes al dominio extra celular de ObR, o los polipéptidos truncados que carecen del dominio transmembrana) , y los productos de proteína de fusión (especialmente las proteínas de fusión ObR-Ig, es decir, las fusiones de la ObR o de un dominio de la ObR, por ejemplo, el dominio extra celular, ?TM, a una IgFc) , los anticuerpos y los anticuerpos anti-idiotípicos (incluyendo fragmentos Fab) , los antagonistas o los agonistas (incluyendo los compuestos que modulan la transducción de señal, que pueden actuar sobre los objetivos corriente abajo en la trayectoria de transducción de señal de ObR) , se pueden utilizar para terapia en estas enfermedades. Por consiguiente, la administración de una cantidad efectiva de dominio extra celular de ObR soluble, ?TM ObR, o una proteína de fusión ECD-IgFc, o un anticuerpo anti-idiotípico (o su Fab) que imite el dominio extra celular de ObR, "limpiaría" o "neutralizaría" la Ob endógeno, y prevendría o reduciría la fijación y la activación del receptor, conduciendo a una ganancia de peso. Las construcciones de nucleótidos que codifican estos productos de ObR, se pueden utilizar para diseñar genéticamente células anfitrionas, para expresar estos productos de ObR en vivo; estas células genéticamente diseñadas funcionan como "biorreactores" en el cuerpo, entregando un suministro continuo de la ObR, el péptido de ObR, el dominio extra celular soluble, o ?TM, o la proteína de fusión ObR que "limpiará" o neutralizará la Ob . Se pueden utilizar construcciones de nucleótidos que codifiquen ObRs funcionales, ObRs mutantes, así como moléculas anti-sentido y de ribozima en los planteamientos de "terapia genética" para la modulación de la expresión y/o la actividad de ObR, en el tratamiento de desórdenes del peso corporal. Por consiguiente, la invención también abarca formulaciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento de desórdenes del peso corporal. La invención se basa, en parte, en el descubrimiento sorprendente de un receptor de alta afinidad para la Ob expresada en una concentración significativa en el plexo coroide. Este descubrimiento se hizo posible mediante la utilización de una novedosa proteína de fusión de fosfatasa alcalina/Ob (AP-Ob) para el teñido en el sitio de células y tejidos. Los estudios de competición con Ob no etiquetada, confirmaron que la fijación en el sitio observada era específica para la Ob . Se identificó ADNc de obR de murino, utilizando proteína de fusión AP-Ob para rastrear una biblioteca de expresión de ADNcs sintetizada a partir de ARNm de plexo coroide de murino, y se transfectó transitoriamente a células COS de mamífero. Se identificó y se secuenció una clona, famj5312, que expresa la forma corta de un receptor de alta afinidad para Ob. El análisis de secuencia reveló que el ADNc de obR, y la de secuencia de aminoácidos predicha, son secuencias novedosas que contienen regiones de aminoácidos que indican que la ObR es un miembro de la familia de la Clase I de proteínas receptoras. Los estudios de mapeo descritos en la presente demuestran que el gen obR se mapea en el lugar db. Los datos presentados en la presente demuestran además que el gen db es un gen obR mutante, que expresa un mensaje de forma larga de obR aberrantemente empalmado que codifica una proteína idéntica a la ObR de murino de forma corta. La secuencia de famj5312 se utilizó para rastrear una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano, que dio como resultado la identificación de una clona de ADNc de obR humano fahj5312d, descrito en la presente. Se utilizaron cebadores de oligonucleótidos diseñados con base en la secuencia de ADNc humana para clonar la clona del ADN genómico humano, h-obR-p87, también descrito en la presente. Se clonó el ARNm que codifica la forma larga de murino de ObR, a partir de hipotálamo de murino, utilizando cebadores degenerados diseñados sobre el dominio citoplásmico de ObR humana. Diferentes aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las siguientes subsecciones . A. El gen ObR En las Figuras 1 y 6, respectivamente, se muestran la secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 1), y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 2) de la ObR de forma corta de murino (de 894 aminoácidos de largo), y de la ObR de forma larga de murino. La secuencia de señal de tanto la ObR de forma corta como de forma larga de murino se extiende desde el residuo de aminoácido 1 hasta aproximadamente 22 de las Figuras 1 y 6, respectivamente; el dominio extra celular de ambas formas de ObR de murino, se extiende desde aproximadamente el residuo de aminoácido número 23 hasta aproximadamente 837 de las Figuras 1 y 6; el dominio transmembrana de ambas formas de ObR de murino se extiende desde aproximadamente el residuo de aminoácido 838 hasta aproximadamente 860 de las Figuras 1 y 6; y el dominio citoplásmico de la ObR de forma corta de murino se extiende desde aproximadamente el residuo de aminoácido 861 a 894 de la Figura 1, mientras que aquel de la forma larga se extiende desde el residuo de aminoácido 861 hasta 1162 de la Figura 6. Se ha identificado cuando menos otra ObR de murino de forma corta que es un aminoácido más corta (es decir, de 893 aminoácidos) que la secuencia mostrada en la Figura 1. La secuencia en el término C difiere de la secuencia mostrada en la Figura 1, en que no están presentes los residuos 890-894 (RTDTL); y en lugar de eso, los residuos 890-893 de la segunda forma corta tienen la siguiente secuencia: IMWI . En la Figura 3 se muestra la secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 3), y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 4) de ObR humana. La secuencia de señal de ObR humana se extiende desde el residuo de aminoácido 1 hasta aproximadamente 20 en la Figura 3; el dominio extra celular de ObR humana se extiende desde aproximadamente el residuo de aminoácido 21 hasta aproximadamente 839 de la Figura 3; el dominio transmembrana de ObR humana se extiende desde aproximadamente el residuo de aminoácido número 840 hasta aproximadamente 862 de la Figura 3; y el dominio citoplásmico de ObR humana se extiende desde aproximadamente el residuo de aminoácido 863 hasta 1165 de la Figura 3. Se utilizaron secuencias derivadas a partir de la clona de ADNc humano para diseñar cebadores, que se utilizaron para clonar el obR genómico humano, h-obR-p87, como se describe en los ejemplos, infra. Los datos presentados en los ejemplos de trabajo, infra, demuestran que el gen obR se mapea en el lugar db, y que el gen db. es un gen obR mutante que se expresa en ratones db como una transcripción aberrantemente empalmada, que da como resultado una especie de ARNm que contiene un inserto de aproximadamente 106 nucleótidos (nt) en la porción que codifica el dominio citoplásmico de ObR. El inserto produce una mutación que da como resultado una transcripción que codifica una forma larga prematuramente truncada que es idéntica a la ObR de forma corta de murino . Las secuencias de nucleótidos de obR de la invención incluyen: (a) la secuencia de ADN mostrada en las Figuras 1, 3, ó 6, o contenida en la clona de ADNc famj5312 adentro de la cepa de E . coli 5312B4F3, como se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), o contenida en la clona de ADNc fahj5312 de la cepa de E. coli h-obRD, como se depositó con la ATCC, o contenida en la clona genómica humana, h-obR-p87, como se depositó con la ATCC; (b) la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 1, 3, ó 6, o la secuencia de aminoácidos de ObR codificada por la clona de ADNc famj5312, como se depositó con la ATCC, o la clona de ADNc fahj5312d como se depositó con la ATCC, o contenida en la clona genómica humana, h-obR-p87, como se depositó con la ATCC; (c) cualquier secuencia de nucleótidos que se hibride en la secuencia de ADN mostrada en las Figuras 1, 3, ó 6, o contenida en la clona de ADNc famj5312 como se depositó con la ATCC, o contenida en la clona de ADNc fahj5312d como se depositó con la ATCC, o contenida en la clona genómica humana, h-obR-p87, como se depositó con la ATCC bajo condiciones altamente estringentes, por ejemplo, hibridación al ADN fijado en filtro en 0.5M de NaHP04, dodecilsulfato de sodio al 7 por ciento (SDS) , ácido etilendiaminatetraacético 1 mM a 65°C, y lavando en O.lxSSC/SDS al 0.1 por ciento a 68°C (Ausubel F.M. y colaboradores, eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Volumen I, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en la página 2.10.3), y codifica un producto genético funcionalmente equivalente; (d) cualquier secuencia de nucleótidos que se hibride en el complemento de las secuencias de ADN que codifican la secuencia de aminoácidos de ADN mostrada en la Figura 1, 3, ó 6, contenida en la clona de qADNc famj5312, como se depositó con la ATCC, o contenida en la clona de ADNc fahj5312d, como se depositó con la ATCC, o contenida en la clona genómica humana, h-obR-p87, como se depositó con la ATCC bajo condiciones menos estringentes, tales como condiciones moderadamente estringentes, por ejemplo, lavando en 0.2xSSC/SDS al 0.1 por ciento a 42°C (Ausubel y colaboradores, 1989, supra) , y que no obstante todavía codifica un producto de gen obR funcionalmente equivalente. Los equivalentes funcionales de la ObR incluyen ObR que se presenta naturalmente, presente en otras especies, y ObRs mutantes, bien sea que se presenten naturalmente o diseñadas. La invención también incluye variantes degeneradas de las secuencias (a) a (d) . La invención también incluye moléculas de ácido nucleico, de preferencia moléculas de ADN, que se hibridan en, y por consiguiente son los complementos de, las secuencias de nucleótidos (a) a (d) , en el párrafo anterior. Estas condiciones de hibridación pueden ser altamente estringentes o menos altamente estringentes, como se describió anteriormente. En los casos en donde las moléculas de ácido nucleico sean desoxioligonucleótidos ("oligos"), las condiciones altamente estringentes pueden referirse, por ejemplo, al lavado en dxSSX/pirofosfato de sodio al 0.05 por ciento a 37°C (para oligos de 14 bases), a 48°C (para oligos de 17 bases), a 55°C (para oligos de 20 bases) , y a 60°C (para oligos de 23 bases) . Estas moléculas de ácido nucleico pueden codificar o actuar como moléculas anti-sentido de obR útiles, por ejemplo, en la regulación del gen obR (para y/o como cebadores anti-sentido en las reacciones de amplificación de las secuencias de ácido nucleico del gen obR) . Con respecto a la regulación del gen obR, estás técnicas se pueden emplear para regular, por ejemplo, caquexia y/o anorexia. Además, estas secuencias se pueden utilizar como parte de las secuencias de ribozima y/o de triple hélice, también útiles para la regulación del gen obR. Todavía además, estas moléculas se pueden utilizar como componentes de métodos de diagnóstico, mediante los cuales, por ejemplo, se puede detectar la presencia de un alelo de obR particular responsable de ocasionar un desorden de peso, tal como obesidad. En adición a las secuencias de nucleótidos de obR descritas anteriormente, se pueden identificar y aislar fácilmente secuencias de ADNc o de gen obR de longitud completa presentes en la misma especie, y/u homólogos del gen obR presentes en otras especies, sin una indebida experimentación, mediante técnicas biológicas moleculares bien conocidas en este campo. La identificación de homólogos de obR en las especies relacionadas, puede ser útil para desarrollar sistemas de modelos animales más estrechamente relacionados con los seres humanos para propósitos de descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, la bibliotecas de expresión de los ADNcs sintetizadas a partir del ARNm del plexo coroide derivado a partir del organismo de interés, se pueden rastrear utilizando Ob etiquetado derivada a partir de esa especie, por ejemplo, una proteína de fusión AP-Ob. De una manera alternativa, estas bibliotecas de ADNc, o bibliotecas de ADN genómico derivadas a partir del organismo de interés, se pueden rastrear mediante hibridación, utilizando los nucleótidos descritos en la presente como sondas de hibridación o amplificación. Además, también se pueden identificar genes en otros lugares adentro del genoma, que codifiquen proteínas que tengan una extensa homología con uno o más dominios del producto de gen obR, mediante técnicas similares. En el caso de las bibliotecas de ADNc, estas técnicas de rastreo pueden identificar clonas derivadas de transcripciones alternativamente empalmadas en las mismas o en diferentes especies. El rastreo puede ser mediante hibridación en filtro," utilizando filtros duplicados. La sonda etiquetada puede contener de cuando menos de 15 a 30 pares de bases de la secuencia de nucleótidos de ODR, como se muestra en las Figuras 1, 3, ó 6. Las condiciones de lavado de hibridación empleadas deben ser de una estringencia más baja cuando la biblioteca de ADNc se derive de un organismo diferente del tipo de organismo desde donde se derivó la secuencia etiquetada. Con respecto a la clonación de un homólogo de obR humano, utilizando sondas de obR de murino, por ejemplo, se puede realizar la hibridación, por ejemplo, a 65°C durante la noche en un regulador de Church (SDS al 7 por ciento, 250 mM de NaHP04, 2µM EDTA, BSA al 1 por ciento) . Los lavados se pueden hacer con 2XSSC, SDS al 0.1 por ciento a 65°C, y luego a 0.1XSSC, SDS al 0.1 por ciento a 65°C. Las condiciones de baja estringencia son bien conocidas por los expertos en este campo, y variarán de una manera predecible, dependiendo de los organismos específicos a partir de los cuales se deriven la biblioteca y las secuencias etiquetadas. Para una guía con respecto a estas condiciones, ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y colaboradores, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. De una manera alternativa, la sonda del nucleótido de obR etiquetada se puede utilizar para rastrear una biblioteca genómica derivada a partir del organismo de interés, nuevamente utilizando condiciones apropiadamente estringentes. La identificación y caracterización de las clonas genómicas humanas es útil para diseñar pruebas de diagnóstico y protocolos clínicos para el tratamiento de los desórdenes del peso corporal en pacientes humanos. Por ejemplo, se pueden utilizar secuencias derivadas de regiones adyacentes a los límites del intron/hexon del gen humano, para diseñar cebadores para utilizarse en ensayos de amplificación con el fin de detectar mutaciones adentro de los hexones, intrones, sitios de empalme (por ejemplo, sitios de receptor/donador de empalme) , etcétera, que se pueden utilizar en el diagnóstico. Además, se puede aislar un homólogo del gen obR a partir del ácido nucleico del organismo de interés, realizando reacción en cadena de polimerasa, utilizando dos grupos de cebadores de oligonucleótidos degenerados diseñados con base en las secuencias de aminoácidos adentro del producto de gen obR dado a conocer en la presente. La plantilla para la reacción puede ser ADNc obtenido mediante transcripción inversa de ARNm preparado a partir de, por ejemplo, líneas celulares o tejidos humanos o no humanos, tales como plexo coroide, que se sepa o se sospecha que exprese un alelo del gen obR. El producto de la reacción en cadena de polimerasa se puede subclonar y secuenciar para asegurar que las secuencias amplificadas representen las secuencias de un gen obR. El fragmento de la reacción en cadena de polimerasa puede utilizarse entonces para aislar una clona de ADNc de longitud completa, mediante una variedad de métodos. Por ejemplo, el fragmento amplificado se puede etiquetar y utilizar para rastrear una biblioteca de ADNc, tal como una biblioteca de ADNc de bacteriófagos. De una manera alternativa, el fragmento etiquetado se puede utilizar para aislar clonas genómicas por medio del rastreo de una biblioteca genómica. También se puede utilizar tecnología de reacción en cadena de polimerasa, para aislar secuencias de ADNc de longitud completa. Por ejemplo, el ARN se puede aislar, siguiendo los procedimientos convencionales, a partir de una fuente celular o de tejido apropiada (es decir, una que se sepa o se sospeche que expresa el gen obR, tal como, por ejemplo, plexo coroide o tejido de cerebro) . Se puede realizar una reacción de transcripción inversa sobre el ARN, utilizando un cebador de oligonucleótidos específico para el extremo más 5' del fragmento amplificado para cebar la síntesis de la primera cadena. Luego se puede poner "cola" al híbrido de ARN/ADN resultante con guaninas, utilizando una reacción de transferasa terminal convencional, el híbrido se puede digerir con ARNasa H, y la síntesis de la segunda cadena se puede cebar entonces con un cebador poli-C. Por consiguiente, se pueden aislar fácilmente las secuencias de ADNc corriente arriba del fragmento amplificado. Para una revisión de las estrategias de clonación que se pueden emplear, ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, supra . Las secuencias del gen obR se pueden utilizar adicionalmente para aislar alelos del gen obR mutantes. Estos alelos mutantes se pueden aislar a partir de individuos ya sea conocidos o que se proponga que tienen un genotipo que contribuya a los síntomas de los desórdenes del peso corporal, tales como obesidad, caquexia, o anorexia. Los alelos mutantes y los productos de alelos mutantes, se pueden utilizar entonces en los sistemas de terapia y de diagnóstico descritos más adelante. Adicionalmente, estas secuencias del obR se pueden utilizar para detectar los defectos reguladores del gen obR (por ejemplo, promotor, o promotor/mej orador) que pueden afectar el peso del cuerpo. Se puede aislar un ADNc de un gen obR mutante, por ejemplo, mediante la utilización de reacción en cadena de polimerasa, una técnica que es bien conocida por los expertos en este campo. En este caso, la primera cadena del ADNc se puede sintetizar mediante hibridación de un oligonucleótido oligo-dT al ARNm aislado del tejido que se sepa o se sospeche que se expresa en un individuo que lleva putativamente el alelo obR mutante, y mediante la extensión de la nueva cadena con transcriptasa inversa. Luego se sintetiza la segunda cadena del ADNc utilizando un oligonucleótido que se hibrida específicamente en el extremo 5' del gen normal. Utilizando estos dos cebadores, luego se amplifica el producto por medio de reacción en cadena de polimerasa, se clona en un vector adecuado, y se somete a análisis de secuencia del ADN a través de métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Mediante la comparación de la secuencia de ADN del alelo obR mutante, con aquella del alelo obR normal, se pueden aseverar las mutaciones responsables de la pérdida o alteración de la función del producto del gen obR mutante. De una manera alternativa, se puede construir una biblioteca genómica utilizando ADN obtenido a partir de un individuo del que se sospeche o se sepa que lleva el alelo obR mutante, o se puede construir una biblioteca de ADNc utilizando ARN de un tejido que se sepa o se sospeche que expresa el alelo obR mutante. El gen obR normal o cualquier fragmento adecuado del mismo, se puede etiquetar entonces, y se puede utilizar como una sonda para identificar el alelo obR mutante correspondiente en estas bibliotecas. Luego se pueden purificar las clonas que contengan las secuencias del gen obR mutante, y se pueden someter a análisis de secuencia, de acuerdo con los métodos bien conocidos por los expertos en este campo. Adicionalmente, se puede construir una biblioteca de expresión utilizando ADNc sintetizado a partir de, por ejemplo, ARN aislado de un tejido que se sepa o se sospeche que expresa un alelo obR mutante en un individuo que se sospeche o se sepa que lleva este alelo mutante. De esta manera, los productos genéticos hechos por el tejido putativamente mutante se pueden expresar y rastrear empleando técnicas de rastreo de anticuerpos convencionales en conjunto con anticuerpos criados contra el producto del gen obR normal, como se describe más adelante en la sección 5.3. (Para las técnicas de rastreo, ver, por ejemplo, Harlow, E. y Lañe, eds., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor) . Adicionalmente, el rastreo se puede realizar mediante el rastreo con proteínas de fusión Ob etiquetadas, tales como, por ejemplo, proteínas de fusión AP-Ob u Ob-AP. En los casos en donde la mutación de obR dé como resultado un producto genético expresado con una función alterada (por ejemplo, como un resultado de una mutación en mal sentido o de cambio de marco) , es posible que un conjunto policlonal de anticuerpos para ObR reaccione cruzadamente con el producto del gen de ObR mutante. Las clonas de la biblioteca detectadas por su reacción con estos anticuerpos etiquetados, se pueden purificar y someter a análisis de secuencia de acuerdo con los métodos bien conocidos por los expertos en la materia. La invención también abarca secuencias de nucleótidos que codifican ObRs mutantes, fragmentos de péptido de la ObR, ObRs truncadas, y proteínas de fusión ObR. Estas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleótidos que codifican ObRs mutantes descritas en la sección 5.2 infra; polipéptidos o péptidos correspondientes al dominio extra celular, al dominio transmembrana, y/o al dominio citoplásmico de ObR o porciones de estos dominios; ObRs truncadas, en donde uno o dos de los dominios están suprimidos, por ejemplo, una ObR soluble que carezca de la región del dominio transmembrana, o de ambas regiones de dominio transmembrana y de dominio citoplásmico, o una ObR no funcional truncada que carezca de toda o una porción de la región del dominio citoplásmico. Los nucleótidos que codifican las proteínas de fusión pueden incluir, pero no se limitan a, ObR de longitud completa, ObR truncada, o fragmentos de péptido de ObR fundidos con una proteína o péptido no relacionado, tales como, por ejemplo, una secuencia transmembrana, que ancle el dominio extra celular de ObR a la membrana celular; un dominio Ig Fe que incremente la estabilidad y la vida media de la proteína de fusión resultante (por ejemplo, ObR-Ig) en la corriente sanguínea; o una enzima, una proteína fluorescente, una proteína luminiscente, que se puede utilizar como un marcador. La invención también abarca (a) vectores de ADN que contienen cualquiera de las secuencias de codificación de ObR anteriores, y/o sus complementos (es decir, anti-sentido) ; (b) vectores de expresión de ADN que contienen cualquiera de las secuencias de codificación de ObR anteriores operativamente asociadas con un elemento regulador que dirige la expresión de las secuencias de codificación; y (c) células anfitrionas genéticamente diseñadas que contienen cualquiera de las secuencias de codificación de ObR anteriores operativamente asociadas con un elemento regulador que dirige la expresión de las secuencias de codificación en la célula anfitriona. Como se utilizan en la presente, los elementos reguladores incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles y no inducibles, mejorados, operadores, y otros elementos conocidos por los expertos en la técnica, que impulsan y regulan la expresión. Estos elementos reguladores incluyen, pero no se limitan a, el -gen temprano inmediato hCMV de citomegalovirus, los promotores tempranos o tardíos de adenovirus SV40, el sistema lac, el sistema trt, el sistema TAC, el sistema TRC, las regiones operadores y promotoras mayores del fago A, las regiones de control de la proteína de recubrimiento fd, el promotor para quinasa de 3-fosfoglicerato, los promotores de fosfatasa de ácido, y los promotores de los factores de acoplamiento de levadura . B. Proteinas y Polipéptidos ObR La proteína, los polipéptidos, y los fragmentos de péptido ObR, las formas truncadas, mutadas, o suprimidas de la ObR y/o de las proteínas de fusión de ObR, se pueden preparar para una variedad de usos, incluyendo, pero no limitándose a, la generación de anticuerpos, como reactivos en ensayos de diagnóstico, la identificación de otros productos genéticos celulares involucrados en la regulación del peso corporal, como reactivos en ensayos para el rastreo de compuestos que se puedan utilizar en el tratamiento de desórdenes del peso corporal, y como reactivos farmacéuticos útiles en el tratamiento de desórdenes en el peso corporal relacionados con la ObR. Las Figuras 1 y 6 muestran la secuencia de aminoácidos de una proteína ObR de forma corta y de forma larga de murino, respectivamente. En ambas formas de ObR, la secuencia de señal se extiende desde el aminoácido 1 hasta aproximadamente 22; el dominio extra celular se extiende desde aproximadamente el aminoácido 23 hasta aproximadamente 837; y el dominio transmembrana se extiende desde aproximadamente el aminoácido 838 hasta aproximadamente 860. En la forma corta de ObR de murino, el dominio citoplásmico se extiende desde aproximadamente el aminoácido 861 hasta aproximadamente 894 (o hasta 893 en la segunda forma corta) , mientras que en la forma larga se extiende desde aproximadamente el aminoácido 861 hasta 1162. La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de una ObR humana. La secuencia de señal se extiende desde el residuo de aminoácido 1 hasta aproximadamente 20; el dominio extra celular se extiende hasta aproximadamente el residuo de aminoácido 21 hasta aproximadamente 839; el dominio transmembrana se extiende desde aproximadamente el residuo de aminoácido 840 hasta aproximadamente 862; y el dominio citoplásmico se extiende desde aproximadamente el residuo de aminoácido 863 hasta 1165. La secuencia de ObR empieza con una metionina en un contexto de secuencia de ADN consistente con un sitio de iniciación de traslación, seguida por una secuencia de señal hidrófoba típica de secreción de péptido. El dominio extra celular maduro predicho para ambas formas de ObR de murino, es idéntico y es de 815 aminoácidos de largo, mientras que el dominio extra celular predicho para la ObR humana es de 819 aminoácidos de largo. El dominio extra celular de ObR muestra muchas características de la familia del receptor de citoquina clase I (revisada en Heldin, 1995, Cell 80:213-223), y está más estrechamente relacionado con el componente de transducción de señal gpl30 del receptor de IL-6 (Taga y colaboradores, 1989, Cell 58:573-581), el receptor G-CSF (Fukunaga y colaboradores, 1990, Cell 71:341-350), y el receptor de LIF (Gearing y colaboradores, 1991, Science 255:1434-1437) . De hecho, los datos presentados en la presente demuestran que la ObR de forma larga señala a través de la activación de las proteínas STAT - una indicación de la trayectoria de transducción de señal mediada por la familia de receptores de citoquina tipo IL-6. En la Figura 4 se muestra una alineación entre los dominios extra celular de ObR de murino y gpl30. Aunque la identidad de secuencia de aminoácidos global entre estas dos moléculas es baja (24 por ciento) , son claramente evidentes los residuos de cisteína característicamente conservados, el motivo Trp-Ser-X-Trp-Ser (residuos de aminoácidos 317-321 y 620-624 en la secuencia de murino mostrada en la Figura 1; los residuos de aminoácidos 319-323 y 622-626 en la secuencia humana mostrada en la Figura 3) , y la conservación de otros residuos adentro de este grupo de proteínas (revisada en Kishimoto y colaboradores, 1994, Cell 76:253-262) . Las secuencias de aminoácidos de la ObR de forma corta de murino y de la ObR humana, son altamente homologas a través de toda la longitud de la ObR de forma corta de murino (Figura 5) . De hecho, la identidad de la secuencia de aminoácidos deducida entre la forma corta de murino y las clonas humanas (78 por ciento) es la misma o mayor que aquella que se ve cuando se comparan las formas de murino y humana de gpl30 (Saito y colaboradores, 1992, J. Immunol. 148:4066-4071), el receptor de LIF (Gough y colaboradores, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2623-2627), y el receptor de G-CSF (Fukanaga y colaboradores, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. 87:8702-8706) . De una manera similar, las secuencias de aminoácidos deducidas de las formas largas de murino y humana de ObR, son homologas a través de toda la longitud de la región de codificación, y comparten una identidad del 75 por ciento (Figura 7) . Los sitios de glicosilación N-enlazados potenciales (es decir, el motivo de la secuencia de aminoácidos N-X-S- ó N-X-T) , se encuentran en el dominio extra celular de ObR tanto de murino como humana. Cuando menos se pueden identificar 20 sitios de glicosilación N-enlazados potenciales en la secuencia del dominio extra celular de ObR de murino mostrada en las Figuras 1 y 6 (ver los motivos de tripéptidos que empiezan en los residuos de aminoácidos 23, 41, 56, 73, 81, 98, 187, 206, 276, 347, 397, 433, 516, 624, 659, 670, 688, 697, 728, y 750); mientras que se pueden identificar cuando menos dieciséis sitios de glicosilación N-enlazados potenciales en la secuencia del dominio extra celular de ObR humana mostrada en la Figura 3 (ver los motivos de tripéptidos que empiezan en los residuos de aminoácidos 41, 56, 73, 98, 187, 275, 345, 431, 514, 622, 657, 668, 686, 695, 698, y 726) . El dominio extra celular de la ObR tanto de murino como humana, está seguido por un dominio transmembrana predicho de 23 aminoácidos . El ADNc de murino mostrado en la Figura 1, codifica un dominio citoplásmico corto (de 34 aminoácidos) . Los aminoácidos 5-24 del dominio citoplásmico de ObR de murino (es decir, los residuos de aminoácidos 865 a 884 en la Figura 1) muestran una identidad del 47 por ciento con las secuencias proximales de membrana del dominio intracelular del receptor de LIF, y contienen una secuencia de interacción Jak del cuadro 1 (Narazaki y colaboradores, 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. 91:2285-2289). Es interesante que el ADNc humano codifique una proteína con un dominio intracelular mucho más largo que la ObR de forma corta de murino. Aunque la forma corta de murino y los dominios intracelulares humanos están altamente conservados hasta los cinco residuos finales de la ObR de forma corta de murino, el dominio intracelular humano continúa hasta una longitud similar a aquella de gp!30. Las secuencias de nucleótidos de la forma corta de murino y las clonas humanas, también son muy similares a través de toda la región de codificación de la ObR de forma corta de murino, pero luego divergen completamente cerca del codón de detención de la ObR de forma corta de murino. El dominio citoplásmico corto de los ADNas de forma corta de murino descrito en la presente, es característico de varios polipéptidos receptores de citoquina clase I (revisados en Kishimoto y colaboradores, 1994, Cell 76:253-262). Sin embargo, los resultados reportados en la presente demuestran que la ObR de forma corta no activa la transducción de señal por medio de la trayectoria de STAT que es mediada por la ObR de forma larga. De hecho, los tres receptores en los que la ObR muestra la homología más fuerte, tienen todos dominios citoplásmicos largos importantes en la señalización intracelular. Esto abrió la posibilidad de que la clona de ObR de forma corta de murino aislado era quimérico o codificaba una forma aberrantemente empalmada rara que no representaba la forma principal expresada adentro del plexo coroide. Para resolver este problema, se seleccionaron ocho clonas de murino que se identificaron independientemente en el rastreo de la biblioteca, y cada uno se amplificó (en subgrupos de 150 clonas cada uno) , mediante reacción en cadena de polimerasa, con cebadores hechos para las secuencias 3' del codón de detención. Los resultados verificaron que los ocho clonas contenían estas mismas secuencias no trasladas 3 ' . En adición, se secuenció el término C de cinco clonas independientemente aisladas, y todos mostraron tener el mismo codón de detención. Finalmente, se derivó la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa con ARN total del plexo coroide aislado de una cepa de ratón (C57Bl/KsJ) diferente de aquella de la que se derivó la biblioteca del ADNc, y generó un producto de reacción en cadena de polimerasa idéntico que contenía un codón de detención en la misma localización. Estos datos indicaron que la clona de forma corta de murino aislado no es quimérico ni un evento de empalme aberrante raro, sino que más bien posiblemente es la forma predominante de este receptor en el plexo coroide de murino. Los datos presentados en la presente indican que, en algunos tejidos, existen formas alternativamente empalmadas de ObR de ratón con dominios intracelulares más largos (la forma larga) ; es decir, el gen obR de tipo silvestre se expresa en dos formas, una transcripción de ARNm que tiene un inserto de aproximadamente 100 nucleótidos codifica la ObR que tiene un dominio citoplásmico corto, y otra transcripción de ARNm codifica la ObR que tiene un dominio citoplásmico largo que es homólogo al dominio citoplásmico humano. El ADNc de murino mostrado en la Figura 6 codifica la ObR de forma larga. Como se describió anteriormente, los aminoácidos que codifican el dominio extra celular y el dominio transmembrana de la ObR de forma larga de murino, son idénticos a aquellos para la forma corta de murino. Sin embargo, el ADNc de forma larga de murino, codifica un dominio citoplásmico (de 302 aminoácidos) que es aproximadamente de la misma longitud que el dominio citoplásmico codificado por el ADNc de obR humano. A diferencia de las formas cortas de ObR, la ObR codifica por la secuencia de nucleótidos de la forma larga de murino, continúa siendo similar a aquella de la ObR humana a través de todo el dominio citoplásmico. Los datos presentados en la presente también indican que db es un mutante del gen obR de murino de forma larga. El mutante db expresa una transcripción aberrantemente empalmada que contiene un inserto de aproximadamente 106 nucleótidos en la porción del ARNm que codifica el dominio citoplásmico. Aunque la transcripción es larga, la secuencia insertada produce una mutación que da como resultado una transcripción que codifica una proteína ObR truncada que es idéntica a las formas cortas de ObR, y por consiguiente, carece de la mayor parte del dominio citoplásmico. Los datos mostrados en la presente demuestran que, a diferencia de la ObR de forma larga, la ObR de forma corta, es decir, la forma del receptor asociado con el fenotipo obeso en ratones db/db, no transduce la señal mediada por la trayectoria de STAT. Por consiguiente, parece que la ObR de forma larga competente en señalización, está activamente involucrada en la regulación y el mantenimiento del peso corporal. En resumen, se ha identificado ARN mensajero para varias formas de ObR mayores. El ARNm de ObR predominante encontrado en la mayoría de los tejidos, codifica una proteína transmembrana con un dominio citoplásmico corto de 34 residuos de aminoácidos, referido como la forma corta. En el hipotálamo, existe un ARNm de ObR que codifica una proteína con un dominio extra celular idéntico a la forma corta, pero con un dominio citoplásmico de 302 residuos de largo, referido como la forma larga. La mutación db conduce a la producción de un producto de empalme aberrante de transcripción de forma larga, que da como resultado una proteína con dominio citoplásmico truncado. Es interesante que el ARNm para la forma larga de ObR en el ratón db/db, codifica una proteína con una estructura idéntica a la forma corta que se presenta naturalmente. La pérdida de esta región carboxi-terminal, se propone que hace que la ObR sea inactiva, y se predice que genera el fenotipo obeso en ratones db/db . La información de la secuencia indicó que la ObR podría ejercer una acción de señalización similar a aquella de G-CSFR, LIFR, y gpl30 (Stahl & Yancopoulos, 1993, Cell 74:587-590; Kishimoto y colaboradores, 1995, Blood 86:1243-1254). La señalización por estos receptores implica, entre otras cosas, la activación de las quinasas asociadas con el receptor de la familia de la quinasa Janus, que contribuyen a la fosforilación y activación de la actividad de fijación del ADN de STAT1, STAT3, y STAT5 (Ihle, 1995, Nature 377:591-594; Kishimoto y colaboradores, 1995, Blood 86:1243-1254) . A su vez, este proceso se ha correlacionado con la transcripción inducida de genes que contienen sitios de fijación para las proteínas STAT, tales como los genes hepáticos que codifican proteínas de plasma de fase aguda (Lai y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem. 270:23254-23257) . Para resolver si las isoformas de ObR clonadas realmente son moléculas receptoras de señalización, se introdujo ObR en las líneas celulares de cultivo de tejido establecidas, y se comparó la respuesta de la célula al tratamiento con OB, con aquella mediada por los receptores de citoquina tipo IL-6 estructuralmente relacionados. Los resultados presentados en el ejemplo que se encuentra más adelante, demuestran que la ObR de forma larga es una molécula de transducción de señal. En particular, los resultados muestran que la ObR de forma larga comparte especificidad funcional con los receptores de citoquina tipo IL-6. Los resultados también muestran que la ObR de forma corta no señala por medio de la trayectoria de STAT transducida por la forma larga de ObR. Por consiguiente, parece que la ObR de forma larga, pero no la forma corta, está involucrada en el mantenimiento del peso corporal . Las secuencias de aminoácidos de ObR de la invención incluyen la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), en la Figura 3 (SEQ ID NO : 4 ) , o en la Figura 6, o la secuencia de aminoácidos codificada por la clona de ADNc famj5312, como está depositado en la ATCC, o codificado por la clona de ADNc fahj5312d como está depositado en la ATCC, o codificado por la clona genómica humana h-obR-p87, como está depositada en la ATCC. Además, la invención abarca ObRs de otras especies. De hecho, cualquier proteína ObR codificada por las secuencias de nucleótidos de obR descritas en la sección 5.1 anterior, está dentro del alcance de la invención. La invención también abarca proteínas que son funcionalmente equivalentes a la ObR codificada por las secuencias de nucleótidos descritas en la sección 5.1, como es juzgado por cualquier de un número de criterios, incluyendo, pero no limitándose a, la capacidad para fijar Ob, la afinidad de fijación para Ob, el efecto biológico resultante de la fijación de Ob, por ejemplo, la transducción de señal, un cambio en el metabolismo celular (por ejemplo, flujo iónico, fosforilación de tirosina) , o un cambio en el fenotipo cuando está presente el equivalente de ObR en un tipo de célula apropiado (tal como la aminoración, la prevención, o el retardo de fenotipo obeso, es decir, el fenotipo db u ob) , o pérdida de peso. Estas proteínas ObR de funcionalidad equivalente incluyen, pero no se limitan a, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de nucleótidos de obR descritas anteriormente en la sección 5.1, pero que dan como resultado un cambio silencioso, produciendo de esta manera un producto genético funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer con base en la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina; los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina, e histidina; y los aminoácidos negativamente cargados (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Aunque se pueden hacer mutaciones aleatorias al ADN de obR (empleando técnicas de mutagénesis aleatorios bien conocidas por los expertos en este campo) , y las ObRs mutantes resultantes se prueban para determinar su actividad, se pueden diseñar mutaciones dirigidas al sitio de la secuencia de codificación de obR (utilizando técnicas de mutagénesis dirigida al sitio bien conocidas por los expertos en la materia) para generar ObRs mutantes con una mayor función, por ejemplo, una afinidad de fijación más alta para la Ob, y/o una mayor capacidad de señalización; o con una función disminuida, por ejemplo, una afinidad de fijación más baja para la Ob y/o una capacidad de transducción de señal disminuida. Por ejemplo, en la Figura 5 se muestra la alineación de ObR de forma corta de ratón (Figura 1) , y el homólogo de ObR humana (Figura 3) , en donde se indican los residuos de aminoácidos idénticos mediante una estrella. Las ObRs mutantes se pueden diseñar de tal manera que se mantengan las regiones de identidad (indicadas por las estrellas en la Figura 5) , mientras que los residuos variables (sin estrellas en la Figura 5) se alteran, por ejemplo, mediante supresión o inserción de un residuo de aminoácido, o mediante sustitución de uno o más residuos de aminoácidos diferentes. Se pueden diseñar alteraciones conservadoras en las posiciones variables, con el objeto de producir una ObR mutante que retenga la función; por ejemplo, la afinidad de fijación de Ob, o la capacidad de transducción de señal, o ambas. Se pueden diseñar cambios no conservadores en estas posiciones variables para alterar la función, por ejemplo, la afinidad de fijación de Ob, o la capacidad de transducción de señal, o ambas. De una manera alternativa, en donde se desee la alteración de la función, se pueden diseñar supresión o alteraciones no conservadoras de las regiones conservadas (es decir, los aminoácidos idénticos indicados por las estrellas en la Figura 5) . Por ejemplo, se pueden diseñar supresión o alteraciones no conservadoras (sustituciones o inserciones) del dominio citoplásmico, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 861-894 (Figura 1) de ObR de murino, o los residuos de aminoácidos 863-1165 (Figura 3) de ObR humana, o porciones del dominio citoplásmico, por ejemplo, residuos de aminoácidos 861-884 (Figura 1) de ObR de murino, o los residuos de aminoácidos 863-886 (Figura 3) de la ObR humana (el dominio de interacción Jak del cuadro 1) ) , para producir una ObR mutante que fije la Ob, pero que sea incompetente en la señalización. Se pueden diseñar alteraciones no conservadoras a los residuos con estrella en el dominio extra celular mostrado en la Figura 5, para producir ObRs mutantes con una afinidad de fijación alterada para Ob. Se puede emplear la misma estrategia de mutación también para diseñar ObRs mutantes, basándose en la alineación de la ObR de forma larga de murino, y el homólogo de ObR humana mostrado en la Figura 7, en donde los residuos de aminoácidos idénticos están indicados por un doble asterisco. La Figura 4 muestra la alineación del dominio extra celular de ObR de murino con gpl30 humano, en donde los residuos idénticos están indicados en negro, y los cambios conservadores están indicados en gris. Presumiblemente, las regiones de identidad y conservación son importantes para mantener una estructura terciaria del dominio extra celular, mientras que las regiones variables pueden contribuir a la especificidad de cada receptor para su ligando. Por consiguiente, se pueden diseñar mutantes de ObR con una afinidad de fijación alterada para Ob, mediante la alteración de las regiones variables mostrada en la Figura 4. Estos mutantes de ObR se pueden diseñar para conservar las secuencias de aminoácidos de ObR que están en un cuadro en la Figura 4 (tanto los cuadros negros como grises), o para contener una o más sustituciones conservadoras derivadas a partir de la secuencia de gpl30 mostrada en los cuadros grises de la Figura 4.

Se pueden hacer otras mutaciones a la secuencia de codificación de obR, para generar ObRs que sean más adecuadas para la expresión, la escala hacia arriba, etcétera, en las células anfitrionas seleccionadas. Por ejemplo, los residuos de cisteína pueden suprimidos o sustituidos con otros aminoácidos, con el objeto de eliminar los puentes de bisulfuro; los sitios de glicosilación N-enlazados se pueden alterar o eliminar para lograr, por ejemplo, la expresión de un producto homogéneo que se recupere más fácilmente y se purifique de los anfitriones de levadura que se sabe que hiperglicosilan los sitios N-enlazados. Para este fin, una variedad de sustituciones de aminoácidos en una o ambas de las primera o tercera posiciones de aminoácidos de cualquiera o más de las secuencias de reconocimiento de glicosilación que se presentan en el dominio extra celular (N-X-S ó —T) , y/o una supresión de aminoácidos en la segunda posición de cualquiera o más de estas secuencias de reconocimiento en el dominio extra celular, impedirán la glicosilación de la ObR en la secuencia de tripéptido modificada. (Ver, por ejemplo, Miyajima y colaboradores, 1986, EMBO J. 5 ( 6) : 1193-1197 ) . Los péptidos correspondientes a uno o más dominios de la ObR (por ejemplo, dominio extra celular, dominio transmembrana, o dominio citoplásmico) , las ObRs truncadas o suprimidas (por ejemplo, ObR en donde se suprime el dominio transmembrana y/o el dominio citoplásmico) , así como las proteínas de fusión en donde se funde la ObR de longitud completa, un péptido ObR, u ObR truncada con una proteína no relacionada, también están dentro del alcance de la invención, y se pueden diseñar con base en las secuencias de nucleótidos de obR y de aminoácidos de ObR dadas a conocer en esta sección y en la Sección 5.1 anterior. Estas proteínas de fusión incluyen, pero no se limitan a, fusiones IgFc que estabilizan la proteína o el péptido ObR y prolongan la vida media en vivo; o fusiones con cualquier secuencia de aminoácidos que permita que la proteína de fusión se ancle a la membrana celular, permitiendo que se exhiba el dominio extra celular sobre la superficie celular; o fusiones con una enzima, proteína fluorescente, o proteína luminiscente, que proporcionan una función marcadora. Aunque los polipéptidos y péptidos de ObR se pueden sintetizar químicamente (por -ejemplo, ver Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman & Co . , N.Y.), los polipéptidos grandes derivados a partir de la ObR, y la ObR de longitud completa misma, convenientemente se pueden producir mediante tecnología de ADN recombinante, empleando técnicas bien conocidas en este campo para la expresión de secuencias del gen obR que contienen ácido nucleico, y/o secuencias de codificación. Estos métodos se pueden emplear para construir vectores de expresión que contengan las secuencias de nucleótidos de obR descritas en la Sección 5.1, y señales de transcripción y de control de traslación apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética en vivo. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y colaboradores, 1989, supra, y Ausubel y colaboradores, 1989, supra . De una manera alternativa, se puede sintetizar químicamente ARN capaz de codificar secuencias de nucleótidos de obR utilizando, por ejemplo, sintetizadores . Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en "Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M.J. ed., IRL Press, Oxford, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Se pueden utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión del anfitrión para expresar las secuencias de nucleótidos de obR de la invención. En donde el péptido o polipéptido ObR sea un derivado soluble (por ejemplo, péptidos ObR correspondientes al dominio extra celular; ObR truncada o suprimida en donde se suprimen el dominio transmembrana y/o el dominio citoplásmico) , el péptido o polipéptido se puede recuperar a partir del cultivo, es decir, a partir de la célula anfitriona, en los casos en donde no se secrete el péptido o polipéptido ObR, y a partir del medio de cultivo en los casos en donde el péptido o polipéptido ObR sea secretado por las células. Sin embargo, los sistemas de expresión también abarcan células anfitrionas diseñadas que expresan la ObR o los equivalentes funcionales en el sitio, es decir, anclados en la membrana celular. La purificación o enriquecimiento de la ObR a partir de estos sistemas de expresión, se puede realizar utilizando detergentes y micelios de lípidos apropiados, y métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Sin embargo, estas células anfitrionas diseñadas mismas se pueden utilizar en situaciones en donde sea importante no solamente retener las características estructurales y funcionales de la ObR, sino evaluar la actividad biológica, por ejemplo, en los ensayos de rastreo de fármacos. Los sistemas de expresión que se pueden utilizar para los propósitos de la invención incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis ) , transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido, o ADN de cósmido que contengan secuencias de nucleótidos de obR; levadura (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contengan las secuencias de nucleótidos de obR; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contengan las secuencias de obR; sistemas de células de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) , o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contengan secuencias de nucleótido de obR; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que alojen construcciones de expresión recombinantes que contengan promotores derivados a partir del genoma de las células del mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) , o a partir de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K de virus de vacuna) . En los sistemas bacterianos, convenientemente se pueden seleccionar un número de vectores de expresión, dependiendo del uso pretendido para el producto de gen obR que se esté expresando. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de esta proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de la proteína ObR, o para criar anticuerpos para la proteína ObR, por ejemplo, vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifiquen fácilmente, pueden ser deseables. Estos vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther y colaboradores, 1983, EMBO J. 2:1791), en donde la secuencia de codificación de obR se puede ligar individualmente en el vector adentro del marco, con la región de codificación lacZ , de tal manera que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye e Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509); y similares. También se pueden utilizar vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con S-transferasa de glutationa (GST) . En general, estas proteínas de fusión son solubles, y se pueden purificar fácilmente a partir de células Usadas, mediante adsorción a granulos de glutationa-agarosa, seguida por elución en la presencia de glutationa libre. Los vectores PGEX se diseñan para incluir sitios de disociación de proteasa de trombina o factor Xa, de tal manera que el producto de gen objetivo clonado se pueda liberar la fracción GST. En un sistema de insecto, se utiliza virus de polihidrosis nuclear Autoarapha californica (AcNPV) como un vector para expresar genes extraños . El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificación del gen obR se puede clonar individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina, y se puede poner bajo el control de un promotor AcPNV (por ejemplo, el promotor de polihedrina) . La inserción con éxito de la secuencia de codificación del gen obR, dará como resultado la inactivación del gen de polihedrina, y la producción del virus recombinante no ocluido (es decir, el virus que carece del recubrimiento proteináceo codificada por el gen de polihedrina. Estos virus recombinantes se utilizan entonces para infectar las células de Spodoptera frugiperda, en donde se expresa el gen insertado. (Por ejemplo, ver Smith y colaboradores, 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, patente de los Estados Unidos No. 4,215,051). En las células anfitrionas de mamífero, se pueden utilizar un número de sistemas de expresión de base viral. En los casos en donde se utilice un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia de nucleótidos de obR de interés se puede ligar con un complejo de control de transcripción/traslación de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico se puede insertar entonces en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro ó in vivo . La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región El ó E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar el producto de gen obR en anfitriones infectados. (Por ejemplo, ver Logan y Shenk, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81:3655-3659). También se pueden requerir señales de iniciación específicas para una traslación eficiente de las secuencias de nucleótidos de obR insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en donde se inserte un gen ObR entero o ADNc, incluyendo su propio codón de iniciación y las secuencias adyacentes, en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control de traslación adicionales. Sin embargo, en los casos en donde solamente se inserte una porción de la secuencia de codificación de obR, se deben proporcionar señales de control de traslación exógenas, incluyendo tal vez el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada, para asegurar la traslación de todo el inserto. Estas señales de control de traslación exógenas y codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de elementos mejoradores de transcripción apropiados, terminadores de transcripción, etcétera (ver Bittner y colaboradores, 1987, Methods Enzymol. 153:516-544) . En adición, se puede seleccionar una cepa de célula anfitriona que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto genético en la forma específica deseada. Estas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, disociación) de los productos de proteína, pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células anfitrionas tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento después de la traslación y la modificación de las proteínas y los productos genéticos. Se pueden seleccionar líneas celulares o sistemas anfitriones apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correcto de la proteína extraña expresada. Para este fin, se pueden utilizar células anfitrionas eucarióticas que posean la maquinaria celular para un procesamiento apropiado de la transcripción primaria, glicosilación, y fosforilación del producto genético. Estas células anfitrionas de mamífero incluyen, pero no se limitan a, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, y en particular, líneas celulares del plexo coroide . Para una producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden diseñar líneas celulares que expresen establemente las secuencias de obR descritas anteriormente. En lugar de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes virales de réplica, las células anfitrionas se pueden transformar con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, secuencias mejoradoras, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etcétera), y un marcador seleccionable. En seguida de la introducción del ADN extraño, se puede permitir que las células diseñadas crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido, y luego se cambien a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección, y permite que las células integren establemente el plásmido en sus cromosomas, y crezcan para formar focos, que a su vez se pueden clonar y expandir en líneas celulares. Este método se puede emplear convenientemente para diseñar líneas celulares que expresen el producto del gen obR. Estas líneas celulares diseñadas pueden ser particularmente útiles en el rastreo y la evaluación de compuestos que afecten la actividad endógena del producto del gen obR. Se pueden emplear un número de sistemas de selección, incluyendo, pero no limitándose a, los genes de quinasa de timidina de virus de herpes simplex (Wigler y colaboradores, 1977, Cell 11:223), fosforribosiltransferasa de hipoxantina-guanina (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 48:2026), y fosforribosiltransferasa de adenina (Lowy y colaboradores, 1980, Cell 22:817), que se pueden emplear en las células tk~, hgprt", ó aprt", respectivamente. También, se puede utilizar la resistencia anti-metabolito como la base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y colaboradores, 1980, Nati. Acad. Sci. EUA 77:3567; O'Hare, y colaboradores, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78:1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, y colaboradores, 1981, J. Mol. Biol. 150:1); e higro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y colaboradores, 1984, Gene 30:147). De una manera alternativa, cualquier proteína de fusión se puede purificar fácilmente utilizando un anticuerpo específico para la proteína de fusión que se esté expresando. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht y colaboradores permite la purificación fácil de las proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas celulares humanas (Janknecht y colaboradores, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88 : 8972-8976) . En este sistema, el gen de interés se subclona en el plásmido de recombinación de vacuna, de tal manera que el marco de lectura abierta del gen se funda traslacionalmente con el rótulo amino-terminal consistente en seis residuos de histidina. Los extractos de las células infectadas con el virus de vacuna recombinante, se cargan con columnas de Ni2+»ácido nitriloacético-agarosa y proteínas rotuladas con histidina que se eluyen selectivamente con reguladores que contengan imidazol. Los productos de gen obR también se pueden expresar en animales transgénicos . Se pueden utilizar animales de cualquier especie, incluyendo, pero no limitándose a, ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, cerdos, micro-cerdos, cabras, y primates no humanos, por ejemplo, babuinos, monos, y chimpancés, para generar los animales transgénicos obR. Se puede emplear cualquier técnica conocida en este campo para introducir el transgen obR en animales, para producir las líneas fundadoras de animales transgénicos. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, ^microinyección pronuclear (Hoppe, P.C. y Wagner, -33T.E., 1989, patente de los Estados Unidos No. 4,873,191); transferencia genética mediada por retrovirus en las líneas germinales (Van der Putten y colaboradores, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 82:6148-6152); dirección al gen en células de tallo embriónico (Thompson y colaboradores, 1989, Cell 56:313-321); electroincorporación de embriones (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814); y transferencia genética mediada por esperma (Lavitrano y colaboradores, 1989, Cell 57:717-723); etcétera.

Para una revisión de estas técnicas, ver Gordon, 1989, Transgenic Animáis, Intl. Rev. Cytol . 115:171-229, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. La presente invención proporciona animales transgénicos que llevan el transgen obR en todas sus células, así como animales que llevan el transgen en algunas, pero no en todas, sus células, es decir, animales mosaico. El transgen se puede integrar como un solo transgen o en concatámetros, por ejemplo, hileras de cabeza con cabeza o hileras de cabeza con cola. El transgen también se puede introducir selectivamente, y se puede activar en un tipo de célula particular siguiendo, por ejemplo, la enseñanza de Lasko y colaboradores (Lasko, M. y colaboradores, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:6232-6236). Las secuencias reguladoras requeridas para esta activación específica del tipo de célula, dependerán del tipo de célula de interés particular, y serán aparentes para los expertos en este campo. Cuando se desee que se integre el transgen del gen obR en el sitio cromosómico del gen obR endógeno, se prefiere la dirección al gen. Dicho de una manera breve, cuando se va a utilizar esta técnica, se diseñan vectores que contengan algunas secuencias de nucleótidos homologas para el gen obR endógeno para el propósito de integrar, por medio de recombinación homologa con secuencias cromosómicas, y alterar la función de la secuencia de nucleótidos del gen obR endógeno. El transgen también se puede introducir selectivamente en un tipo de célula particular, inactivando de esta manera el gen obR endógeno, solamente en ese tipo de célula, siguiendo, por ejemplo, la enseñanza de Gu y colaboradores (Gu y colaboradores, 1994, Science 265:103-106). Las secuencias reguladoras requeridas para esta inactivación específica del tipo de célula dependerán del tipo de célula de interés particular, y serán aparentes para los expertos en la materia. Una vez que se han generado animales transgénicos, se puede ensayar la expresión del gen obR recombinante, utilizando técnicas convencionales. El rastreo inicial se puede realizar mediante análisis de mancha Southern, o técnicas de reacción en cadena de polimerasa, para analizar los tejidos animales con el fin de probar si ha tenido lugar la integración del transgen. También se puede evaluar el nivel de expresión de ARNm del transgen en los tejidos de los animales transgénicos, empleando técnicas que incluyen, pero no se limitan a, análisis de mancha Northern de muestras de tejido obtenidos del animal, análisis de hibridación en el sitio, y reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa. Las muestras del tejido que expresa el gen obR también se pueden evaluar inmunocitoquímicamente utilizando anticuerpos específicos para el producto de transgen obR. C . Anticuerpos para las Proteínas ObR Los anticuerpos que reconocen específicamente uno o más epítopes de ObR, o epítopes de variantes conservadas de ObR, o fragmentos de péptido de la ObR, también están abarcados por la invención. Estos anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs) , anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos de una sola cadena, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2f fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) , y fragmentos de fijación de epítope de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar, por ejemplo, en la detección de la ObR en una muestra biológica, y por consiguiente, se pueden utilizar como parte de una técnica de diagnóstico o pronóstico, mediante la cual, se pueden probar los pacientes para determinar las cantidades anormales de ObR. Estos anticuerpos también se pueden utilizar en conjunto con, por ejemplo, esquemas de rastreo de compuesto, como se describe más adelante en la Sección 5.5, para la evaluación del efecto de los compuestos de prueba sobre la expresión y/o la actividad del producto de gen obR. Adicionalmente, estos anticuerpos se pueden utilizar en conjunto con las técnicas de terapia genética descritas más adelante en la Sección 5.6 para, por ejemplo, evaluar las células que expresen ObR normales y/o diseñadas antes de su introducción en el paciente. Estos anticuerpos se pueden utilizar adicionalmente como un método para la inhibición de la actividad de ObR anormal. Por consiguiente, estos anticuerpos se pueden utilizar como parte de métodos de tratamiento de desórdenes de peso. Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar diferentes animales anfitriones mediante inyección con la ObR, un péptido ObR (por ejemplo, uno que corresponda a un dominio funcional del receptor, tal como el dominio extra celular, el dominio transmembrana, o el dominio citoplásmico) , polipéptidos ObR truncados (ObR en donde se han suprimido uno o más dominios, por ejemplo el dominio transmembrana o el dominio citoplásmico), equivalentes funcionales de la ObR, o mutantes de la ObR. Estos: animales anfitriones pueden incluir, pero no se limitan a, conejos, ratones, y ratas, por nombrar solo unos cuantos. Se pueden utilizar diferentes auxiliares para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie de anfitrión, incluyendo, pero no limitándose a, auxiliar de Freund (completo e incompleto) , geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias de actividad superficial, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de limpete de orificio, dinitrofenol, y auxiliares humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium paryum. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivados a partir de los sueros de los animales inmunizados. Los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno particular, se pueden obtener mediante cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma de Kohler y Milstein, (1975, Nature 256:495-497; y la patente de los Estados Unidos No. 4,376,110), la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor y colaboradores, 1983, Immunology Today 4:72; Colé y colaboradores, 1983, Proc. Nati.

Acad. Sci. EUA 80:2026-2030), y la técnica de hibridoma EBV (Colé y colaboradores, 1985) , Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96). Estos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de esta invención, se puede cultivar in vitro ó in vivo . La producción de altas titulaciones de anticuerpos monoclonales en vivo hace que este sea el método de producción actualmente preferido. En adición, se pueden emplear técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y colaboradores, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger y colaboradores, 1984, Nature, 312:604-608; Takeda y colaboradores, 1985, Nature, 314:452-454) mediante el empalme de los genes a partir de una molécula de anticuerpo de ratón de una especificidad de antígeno apropiada, junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de una actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en donde diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada a partir de un anticuerpo monoclonal de murino y una región constante de inmunoglobulina humana. De una manera alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (patente de los Estados Unidos No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-426; Huston y colaboradores, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward y colaboradores, 1989, Nature 334:544-546) se pueden adaptar para producir anticuerpos de una sola cadena contra los productos del gen obR. Los anticuerpos de una sola cadena se forman mediante el enlace de fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv por medio de un puente de aminoácido, dando como resultado un polipéptido de una sola cadena. Los fragmentos de anticuerpo que reconocen los epítopes específicos se pueden generar mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero no se limitan a: los fragmentos F(ab')2 que se pueden producir mediante la digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo, y los fragmentos Fab que se pueden generar mediante la reducción de los puentes de bisulfuro de los fragmentos (F(ab')2. De una manera alternativa, se pueden construir bibliotecas de expresión de Fab (Huse y colaboradores, 1989, Science, 246:1275-1281), para permitir una identificación rápida y fácil de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada. A su vez, se pueden utilizar anticuerpos para la ObR, con el fin de generar anticuerpos anti-idiotípicos que "imiten" a la ObR, empleando técnicas bien conocidas por los expertos en este campo. (Ver, por ejemplo, Greenspan y Bona, 1993, FASEB J 7 (5) :437-444; y Nissinoff, 1991, J. Immunol . 147 (8 ): 2429-2438 ) . Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos que se fijen al dominio extra celular de ObR, y que inhiban competitivamente la fijación de Ob a la ObR, para generar anti-idiotipos que "imiten" el dominio extra celular, y por consiguiente, fijen y neutralicen la Ob. Estos anti-idiotipos neutralizantes o fragmentos Fab de estos anti-idiotipos, se pueden utilizar en regímenes terapéuticos para neutralizar la Ob y promover la ganancia de peso . D . Diagnóstico de Anormalidades de Desorden del Peso Corporal Se pueden emplear una variedad de métodos para el diagnóstico y la evaluación de pronóstico de los desórdenes del peso corporal, incluyendo obesidad, caquexia, y anorexia, y para la identificación de sujetos que tengan una predisposición a estos desórdenes. Por ejemplo, estos métodos pueden utilizar reactivos tales como secuencias de nucleótidos de obR descritas en la Sección 5.1, y anticuerpos de ObR, como se describen en la Sección 5.3. Específicamente, estos reactivos se pueden utilizar, por ejemplo, para: (1) la detección de la presencia de mutaciones del gen obR, o la detección de la sobre- ó sub-expresión de ARNm de obR en relación con el estado de desorden que no sea del peso corporal; (2) la detección de una sobre- o una sub-abundancia del producto de gen obR en relación con un estado de desorden que no sea del peso corporal; (3) la detección de perturbaciones o anormalidades en la trayectoria de transducción de señal mediada ObR. Los métodos descritos en la presente se pueden realizar, por ejemplo, mediante la utilización de estuches de diagnóstico previamente empacados que comprendan cuando menos una secuencia de nucleótidos de obR específica, o un reactivo de anticuerpo de ObR descrito en la presente, que se puede utilizar convenientemente, por ejemplo, en establecimientos clínicos, para diagnosticar a los pacientes que exhiban anormalidades de desorden del peso corporal. Para la detección de las mutaciones de obR, se puede utilizar cualquier célula nucleada como una fuente de partida para el ácido nucleico genómico. Para la detección de la expresión del gen obR o los productos del gen obR, se puede utilizar cualquier tipo de célula o tejido en donde se exprese el gen obR, tal como, por ejemplo, células de plexo coroide. Las técnicas de detección basadas en ácido nucleico se describen más adelante en la Sección 5.4.1. Las técnicas de detección de péptido se describen más adelante en la Sección 5.4.2. 1. Detección del Gen ObR y Transcripciones Las mutaciones adentro del gen obR se pueden detectar mediante la utilización de un número de técnicas. Se puede utilizar el ácido nucleico de cualquier célula nucleada como el punto de partida para estas técnicas de ensayo, y se puede aislar de acuerdo con los procedimientos de preparación de ácido nucleico convencionales, que son bien conocidos por los expertos _ en este campo.

Se puede utilizar ADN en los ensayos de hibridación o amplificación de las muestras biológicas, para detectar anormalidades que involucren la estructura del gen obR, incluyendo mutaciones de punto, inserciones, supresiones, y reconfiguraciones cromosómicas . Estos ensayos pueden incluir, pero no se limitan a, análisis Southern, análisis de polimorfismo de conformación de una sola cadena (SSCP) , y análisis de reacción en cadena de polimerasa. Estos métodos de diagnóstico para la detección de mutaciones específicas del gen obR, pueden involucrar, por ejemplo, poner en contacto e incubar ácidos nucleicos, incluyendo moléculas de ADN recombinante, genes clonados, o variantes degeneradas de los mismos, obtenidos de una muestra, por ejemplo, derivados a partir de una muestra de un paciente u otra fuente celular apropiada, con uno o más reactivos de ácido nucleico etiquetados, incluyendo moléculas de ObR recombinante, genes clonados, o variantes degeneradas de los mismos, como se describen en la Sección 5.1, bajo condiciones favorables para el templado específico de estos reactivos a sus secuencias complementarias adentro del gen obR. De preferencia, las longitudes de estos reactivos de ácido nucleico son de cuando menos 15 a 30 nucleótidos. Después de la incubación, se remueven todos los ácidos nucleicos no templados de la molécula híbrida de ácido nucleico : obR . Entonces se detecta la presencia de los ácidos nucleicos que se han hibridado, si existen estas moléculas. Utilizando este esquema de detección, se puede inmovilizar el ácido nucleico a partir del tipo de célula o tejido de interés, por ejemplo, en un soporte sólido, tal como una membrana o una superficie de plástico, tal como aquella de un plato de microtitulación o granulos de poliestireno. En este caso, después de la incubación, se remueven fácilmente los reactivos de ácido nucleico no templados etiquetados del tipo descrito en la Sección 5.1. La detección de los residuos de ácido nucleico de obR etiquetado y templados restantes, se realiza empleando técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la materia. Las secuencias del gen obR a las que se han templado los reactivos de ácido nucleico, se pueden comparar con el patrón de templado esperado de una secuencia de gen obR normal, con el objeto de determinar si está presente una mutación del gen obR. Los métodos de diagnóstico alternativos para la detección de las moléculas de ácido nucleico específicas del gen obR, en muestras de pacientes o en otras fuentes celulares apropiadas, pueden involucrar su amplificación, por ejemplo, mediante reacción en cadena de polimerasa (la modalidad experimental estipulada en Mullís, K.B., 1987, patente de los Estados Unidos No. 4,683,202), seguida por la detección de las moléculas amplificadas empleando técnicas bien conocidas por los expertos en este campo. Las secuencias amplificadas resultantes se pueden comparar con aquellas que se esperarían si el ácido nucleico que se está amplificando contuviera solamente copias normales del gen obR con el objeto de determinar si existe una mutación del gen obR. Adicionalmente, se pueden realizar técnicas de xenotipificar bien conocidas para identificar a los individuos que lleven las mutaciones del gen obR. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, el uso de polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLPs) , que involucra variaciones de secuencia en uno de los sitios de reconocimiento para la enzima de restricción específica utilizada. Adicionalmente, se pueden utilizar métodos mejorados para analizar los polimorfismos de ADN, para la identificación de las mutaciones del gen obR que se han descrito, que capitalizan en la presencia de números variables de secuencias de ADN cortas repetidas en hileras entre los sitios de la enzima de restricción. Por ejemplo, Weber (patente de los Estados Unidos No. 5,075,217, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad) describe un marcador de ADN basado en polimorfismos de longitud en bloques de repeticiones en hilera cortas de (dc-dA) n-dG-dT) n. La separación promedio de los bloques de (dc-dA)n-dG-dT)n se estima en 30,000 a 60,000 pares de bases. Los marcadores que están tan estrechamente separados, exhiben una coherencia de alta frecuencia, y son altamente útiles en la identificación de mutaciones genéticas, tales como, por ejemplo, mutaciones adentro del gen obR, y el diagnóstico de enfermedades y desórdenes relacionados con mutaciones de obR. También, Caskey y colaboradores (patente de los Estados Unidos No. 5,364,759, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad) describen un ensayo de perfilación de ADN para detectar secuencias de repetición de tri- y tetra-nucleótidos cortas. El proceso incluye extraer el ADN de interés, tal como el gen obR, amplificar el ADN extraído, y etiquetar las secuencias de repetición para formar un mapa genotípico del ADN del individuo. También se puede ensayar el nivel de expresión del gen obR, mediante la detección de la medición de la transcripción de obR. Por ejemplo, se puede aislar el ARN de un tipo de célula o tejido conocido, o que se sospeche que expresa el gen obR, tal como el cerebro, especialmente las células del plexo coroide, y se puede probar utilizando técnicas de hibridación o de reacción en cadena de polimerasa, tales como se describieron anteriormente. Las células aisladas se pueden derivar a partir del cultivo celular o de un paciente. El análisis de las células tomado del cultivo puede ser un paso necesario en la evaluación de las células que se van a utilizar como parte de una técnica de terapia genética basada en las células, o alternativamente, para probar el efecto de los compuestos sobre la expresión del gen obR. Estos análisis pueden revelar aspectos tanto cuantitativos como cualitativos del patrón del gen obR, incluyendo la activación o la inactivación de la expresión del gen ObR. En una modalidad de este esquema de detección, se sintetizan ADNcs a partir de ARNs de interés (por ejemplo, mediante transcripción inversa de la molécula de ARN en el ADNc) . Luego se utiliza una secuencia adentro del ADNc como la plantilla para una reacción de amplificación del ácido nucleico, tal como una reacción de amplificación de reacción en cadena de polimerasa, o similar. Los reactivos de ácido nucleico utilizados como reactivos de ácido nucleico utilizados como reactivos de iniciación de síntesis (por ejemplo, cebadores) en los pasos de amplificación de ácido nucleico y de transcripción inversa de este método, se seleccionan de entre los reactivos de ácido nucleico de obR descritos en la Sección 5.1. Las longitudes preferidas de estos reactivos de ácido nucleico son de cuando menos 9 a 30 nucleótidos. Para la detección del producto amplificado, la amplificación del ácido nucleico se puede realizar utilizando nucleótidos radioactivamente o no radioactivamente etiquetados. De una manera alternativa, se puede hacer suficiente producto amplificado, de tal manera que el producto se pueda visualizar mediante teñido con bromuro de etidio estándar, o utilizando cualquier otro método de teñido de ácido nucleico adecuado. Adicionalmente, es posible realizar estos ensayos de expresión del gen obR "en el sitio", es decir, directamente sobre las secciones de tejido (fijadas y/o congeladas) del tejido del paciente obtenido de biopsias o resecciones, de tal manera que no sea necesaria la purificación del ácido nucleico. Se pueden utilizar reactivos de ácido nucleico, tales como aquellos descritos en la Sección 5.1 como sondas y/o cebadores para estos procedimientos en el sitio (ver, por ejemplo, Nuovo, G.J., 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications", Raven Press, NY) . De una manera alternativa, si se puede obtener una cantidad suficiente de las células apropiadas, se puede realizar análisis Northern estándar para determinar el nivel de expresión del ARNm del gen obR. 2. Detección de los Productos del Gen obR Los anticuerpos dirigidos contra los productos del gen obR de tipo silvestre o mutante, o las variantes conservadas o fragmentos de péptido de las mismas, que se describieron anteriormente en la Sección 5.3, también se pueden utilizar como diagnósticos y pronósticos del desorden del peso corporal, como se describe en la presente. Estos métodos de diagnóstico se pueden emplear para detectar anormalidades en el nivel de expresión del gen obR, o anormalidades en la estructura y/o en la localización temporal, de tejido, celular, o subcelular de la ObR, y se pueden realizar in vivo ó in vitro, tal como, por ejemplo, sobre tejido de biopsia. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos dirigidos a los epítopes del dominio extra celular de ObR en vivo para detectar el patrón y el nivel de expresión de la ObR en el cuerpo. Estos anticuerpos se pueden etiquetar, por ejemplo, con un compuesto radio-opaco u otro compuesto apropiado, y se pueden inyectar en un sujeto con el objeto de visualizar la fijación a la ObR expresada en el cuerpo, empleando métodos tales como rayos X, exploraciones CAT, ó MRI . Los fragmentos de anticuerpos etiquetados, por ejemplo, Fab o el anticuerpo de una sola cadena, que comprende la porción más pequeña de la región de fijación del antígeno, son los preferidos para este propósito, con el fin de promover la cruza de la barrera de sangre-cerebro, y permitir la etiquetación de las ObRs expresadas en el plexo coroide. Adicionalmente, se puede administrar cualquier proteína de fusión con ObR o proteína conjugada con ObR cuya presencia se pueda detectar. Por ejemplo, se pueden administrar proteínas de fusión o conjugadas con ObR etiquetadas con un compuesto radio-opaco u otro compuesto apropiado, y se pueden visualizar en vivo, como se describió anteriormente para los anticuerpos etiquetados. Además, estas proteínas de fusión con Ob, tales como las proteínas de fusión AP-Ob u Ob-AP se pueden utilizar para los procedimientos de diagnóstico in vi tro . De una manera alternativa, se pueden utilizar inmunoensayos o ensayos de detección de proteína de fusión, como se describió anteriormente, en muestras de biopsia y autopsia in vitro, para permitir la evaluación del patrón de expresión de la ObR. Estos ensayos no están confinados al uso de anticuerpos que definan el dominio extra celular de ObR, sino que pueden incluir el uso de anticuerpos dirigidos a los epítopes de cualquiera de los dominios de la ObR, por ejemplo, el dominio extra celular, el dominio transmembrana, y/o el dominio citoplásmico. El uso de cada uno o de todos estos anticuerpos etiquetados, producirá información útil con respecto a la traslación y al transporte intracelular de la ObR hasta la superficie celular, y puede identificar defectos en el procesamiento. El tejido o tipo de célula que se va a analizar, generalmente incluirá aquellos que se sepa o se sospeche que expresan el gen obR, tales como, por ejemplo, las células del plexo coroide- Los métodos de aislamiento de proteínas empleados en la presente, por ejemplo, pueden ser tales como los descritos en Harlow y Lañe (Harlow, E. y Lañe, D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) , que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Las células aisladas se pueden derivar a partir del cultivo celular, o a partir de un paciente. El análisis de las células tomadas del cultivo puede ser un paso necesario en la evaluación de las células que se podrían utilizar como parte de una técnica de terapia de gen basada en células, o alternativamente, para probar el efecto de los compuestos sobre la expresión del gen obR. Por ejemplo, los anticuerpos, o los fragmentos de anticuerpos, tales como los descritos anteriormente en la Sección 5.3, útiles en la presente invención, se pueden utilizar para detectar de una manera cuantitativa o cualitativa la presencia de los productos del gen obR, o de variantes conservadas o fragmentos de péptido de los mismos. Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante técnicas de inmunofluorescencia, empleando un anticuerpo fluorescentemente etiquetado (ver más adelante en esta sección) acopladas con detección de microscopio de luz, citometría de flujo, o fluorimétrica . Estas técnicas son especialmente preferidas si los productos de gen de obR se expresan sobre la superficie celular. Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) o las proteínas de fusión o conjugadas con Ob útiles en la presente invención, adicionalmente, se pueden emplear histológicamente, como en ensayos de inmunofluorescencia, de microscopio de inmunoelectrones, o no inmunes, para la detección en el sitio de los productos del gen obR o las variantes conservadas o fragmentos de péptido de los mismos, o para la fijación de Ob (en el caso de la proteína de fusión con Ob etiquetada) . Se puede realizar detección en el sitio mediante la remoción de una muestra histológica de un paciente, y aplicando a la misma un anticuerpo etiquetado o una proteína de fusión de la presente invención. El anticuerpo (o el fragmento) o la proteína de fusión, de preferencia se aplica sobreponiendo el anticuerpo etiquetado (o el fragmento) sobre una muestra biológica. A través del uso de este procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia del producto del gen obR, o las variantes conservadas o fragmentos de péptido, o la fijación de Ob, sino también su distribución en el tejido examinado. Utilizando la presente invención, aquellos de una experiencia ordinaria percibirán fácilmente que se puede modificar cualquiera de una amplía variedad de métodos histológicos (tales como los procedimientos de teñido), con el objeto de lograr la detección en el sitio. Los inmunoensayos y los inmunoensayos para los productos del gen obR o las variantes conservadas o fragmentos de péptido de los mismos, típicamente comprenderán la incubación de una muestra, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recién cosechadas, o usados de células que se hayan incubado en un cultivo celular, en la presencia de un anticuerpo detectablemente etiquetado capaz de identificar los productos del gen obR o las variantes conservadas o fragmentos de péptido de los mismos, y detectando el anticuerpo fijado mediante cualquiera de un número de técnicas bien conocidas en este campo. La muestra biológica se puede poner en contacto con, y se puede inmovilizar sobre, un soporte de fase sólida o un portador, tal como nitrocelulosa, u otro soporte sólido que sea capaz de inmovilizar células, partículas de células, o proteínas solubles . Luego se puede lavar el soporte con reguladores adecuados, seguido por tratamiento con el anticuerpo de ObR detectablemente etiquetado o la proteína de fusión con Ob . El soporte de fase sólida se puede lavar entonces con el regulador una segunda vez para remover el anticuerpo o la proteína de fusión no fijados. La cantidad de etiqueta fijada con el soporte sólido se puede detectar entonces mediante elementos convencionales . "Soporte de fase sólida o portador" significa cualquier soporte capaz de fijar un antígeno o un anticuerpo. Los soportes o portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales o modificadas, poliamidas, gabros, y magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble hasta algún grado, o insoluble para los propósitos de la presente invención. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible, siempre que la molécula acoplada pueda fijarse a un antígeno o anticuerpo. Por consiguiente, la configuración del soporte puede ser esférica, como en un granulo, o cilindrica, como en la superficie interna-de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. De una manera alternativa, la superficie puede ser plana, tal como una lámina, una tira de prueba preferida, etcétera. Los soportes preferidos incluyen granulos de poliestireno. Los expertos en este campo conocerán muchos otros portadores adecuados para fijar el anticuerpo o el antígeno, o podrán aseverar los mismos mediante el uso de experimentación de rutina.

La actividad de fijación de un lote dado de anticuerpo de ObR o proteína de fusión con Ob, se puede determinar de acuerdo con los métodos bien conocidos . Los expertos en este campo podrán determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación, mediante el empleo de una experimentación de rutina. Con respecto a los anticuerpos, una de las maneras en las cuales se puede etiquetar detectablemente el anticuerpo de ObR, es mediante el enlace del mismo con una enzima, y el uso en un inmunoensayo de enzima (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Lunked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2.:l-7, Microbiological Associates Quaterly Publication, Walkersville, MD) ; Voller, A. y colaboradores, 1978, J. Clin. Pathol. 31:507-520; Butler, J.E., 1981, Meth. Enzymol. 73:482-523; Maggio, E. (ed) . , 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Ratón, FL.; Ishikawa, E. y colaboradores, (eds.), 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokio) . La enzima que se fija al anticuerpo reaccionará con un sustrato apropiado, de preferencia un sustrato cromogénico, de tal manera que produzca una fracción química que se pueda detectar, por ejemplo, mediante elementos espectrofotométricos, fluorimétricos, o visuales. Las enzimas que se pueden utilizar para etiquetar detectablemente el anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, deshidrogenasa de malato, nucleasa de estafilococo, isomerasa de delta-5-esteroide, deshidrogenasa de alcohol de levadura, alfa-glicerofosfato, deshidrogenasa, isomerasa de fosfato de triosa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa, oxidasa de glucosa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato, glucoamilasa, y acetilcolinesterasa . La detección se puede realizar mediante métodos colorimétricos que empleen un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también se puede realizar mediante una comparación visual de la extensión de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con los estándares similarmente preparados. La detección también se puede realizar utilizando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, mediante la etiquetación radioactiva de los anticuerpos o de los fragmentos de anticuerpo, es posible detectar la ObR a través del uso de un radioinmunoensayo (RÍA) (ver, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzo de 1986, que se incorpora a la presente como referencia) . El isótopo radioactivo se puede detectar mediante elementos tales como el uso de un contador gamma o un contador de cintilación, o mediante autorradiografía . También es posible etiquetar al anticuerpo con un compuesto fluorescente. Cuando se expone el anticuerpo etiquetado fluorescentemente a la luz de la longitud de onda apropiada, su presencia se puede detectar entonces debido a la fluorescencia.

Entre los compuestos de etiquetación fluorescente más comúnmente utilizados están isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, y fluorescamina . El anticuerpo también se puede detectar de una manera detectable utilizando metales que emiten fluorescencia, tales como 152Eu, u otros de la serie de lantánidos. Estos metales se pueden unir al anticuerpo utilizando grupos quelantes de metal, tales como ácido dietilentriaminapentaacético (DPTA) , o ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) . El anticuerpo también se puede etiquetar de una manera detectable mediante su acoplamiento con un compuesto quimiluminiscente . La presencia del anticuerpo etiquetado de una manera quimiluminiscente se determina entonces mediante la detección de la presencia de luminiscencia que se presente durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de los compuestos de etiquetación quimiluminescente particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato. De la misma manera, se puede utilizar un compuesto bioluminiscente para etiquetar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimiluniniscencia que se encuentra en los sistemas biológicos, en donde una proteína catalítica incrementa la eficiencia de la reacción quimiluminescente . La presencia de una proteína bioluminiscente se determina mediante la detección de la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes importantes para los propósitos de la etiquetación son luciferina, luciferasa, y acuorina. E . Ensayos de Rastreo para Compuestos que Modulan la Expresión o la Actividad de ObR Los siguientes ensayos se diseñaron para identificar los compuestos que interactúan con (por ejemplo, se fijan a) la ObR (incluyendo, pero no limitándose a, el dominio extra celular o el dominio citoplásmico de ObR) , los compuestos que interactúan con (por ejemplo, que se fijan a) las proteínas intracelulares que interactúan con ObR (incluyendo, pero no limitándose a, el dominio transmembrana y el dominio citoplásmico de ObR) , los compuestos que interfieren con la interacción de ObR con las proteínas transmembrana o intracelulares involucradas en la transducción de señal mediada por ObR, y los compuestos que modulan la actividad del gen obR (es decir, que modulan el nivel de la expresión del gen obR) o que modulan el nivel de ObR. Adicionalmente, se pueden utilizar ensayos que identifiquen compuestos que se fijen a las secuencias reguladoras del gen obR (por ejemplo, secuencias promotoras) , y que puedan modular la expresión del gen obR. Ver, por ejemplo, Platt, K.A., 1994, J.

Biol. Chem. 269: 28558-28562, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

Los compuestos que se pueden rastrear de conformidad con la invención incluyen, pero no se limitan a, péptidos, anticuerpos y fragmentos de los mismos, y otros compuestos orgánicos (por ejemplo, peptidomiméticos) que se fijan al dominio extra celular de la ObR, e imitan la actividad desencadenada por el ligando natural (es decir, agonistas), o inhiben la actividad desencadenada por el ligando natural (es decir, antagonistas); así como péptidos, anticuerpos, o fragmentos de los mismos, y otros compuestos orgánicos que imitan el dominio extra celular de la ObR (o una porción del mismo) , y se finan a, y "neutralizan" el ligando natural. Estos compuestos pueden incluir, pero no se limitan a, péptidos, tales como, por ejemplo, péptidos solubles, incluyendo, pero no limitándose a, miembros de las bibliotecas de péptidos aleatorios; (ver, por ejemplo, Lam, K.S. y colaboradores, 1991, Nature 354 : 82-84; Houghten, R. y colaboradores, 1991, Nature 354 : 84-86) , y la biblioteca molecular derivada de química de combinación hecha de aminoácidos en configuración D y/o L, fosfopéptidos (incluyendo, pero no limitándose a, miembros de bibliotecas de fosfopéptidos dirigidos aleatorios o parcialmente degenerados, ver, por ejemplo, Songyand, Z. y colaboradores, 1993, Cell 7.2:767-778) , anticuerpos (incluyendo, pero no limitándose a, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos, o de una sola cadena, y fragmentos de la biblioteca de expresión FAb, F ( ab ' ) 2 r y FAb, y fragmentos de fijación de epítope de los mismos), y moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas . Otros compuestos que se pueden rastrear de conformidad con la invención, incluyen, pero no se limitan a, moléculas orgánicas pequeñas que puedan cruzar la barrera de sangre-cerebro, obtener la entrada hacia una célula apropiada (por ejemplo, en el plexo coroide o en el hipotálamo), y afectar la expresión del gen obR o de algún otro gen involucrado en la trayectoria de transducción de señal de ObR (por ejemplo, mediante la interacción con la región reguladora o los factores de transcripción involucrados en la expresión del gen) ; o los compuestos que afecten la actividad de la ObR (por ejemplo, mediante la inhibición o la mejora de la actividad enzimática del dominio citoplásmico) , o la actividad de algún otro factor intracelular involucrado en la trayectoria de transducción de señal de ObR, tal como, por ejemplo, gpl30. Las tecnologías de modulación y búsqueda por computadora permiten identificar los compuestos, o mejorar los compuestos ya identificados, que pueden modular la expresión o la actividad de ObR. Habiendo identificado este compuesto o composición, se identifican los sitios o regiones activas. Estos sitios activos típicamente podrían ser sitios de fijación de ligando, tales como los dominios de interacción de Ob con la ObR misma. El sitio activo se puede identificar empleando métodos conocidos en este campo, incluyendo, por ejemplo, a partir de las secuencias de aminoácidos de los péptidos, a partir de las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos, o a partir del estudio de complejos del compuesto o composición pertinente con su ligando natural. En el último caso, se pueden emplear métodos cristalográficos de rayos X o químicos para encontrar el sitio activo, al encontrar en donde se encuentre el factor del ligando complejado . En seguida, se determina la estructura geométrica tridimensional del sitio activo. Esto se puede hacer mediante métodos conocidos, incluyendo cristalografía de rayos X, que puede determinar una estructura molecular completa. Por otra parte, se puede utilizar resonancia magnética nuclear en fase sólida o líquida para determinar ciertas distancias intramoleculares. Se puede ampliar cualquier otro método experimental de determinación de estructura para obtener estructuras geométricas parciales o completas . Las estructuras geométricas se pueden medir con un ligando complejado, natural o artificial, que pueda incrementar la precisión de la estructura del sitio activo determinada. Si se determina una estructura incompleta o insuficientemente precisa, se puede emplear modelación numérica basada en métodos de computadora, para terminar la estructura o mejorar su precisión. Se puede emplear cualquier método de remodelación reconocido, incluyendo los modelos parametrizados específicos para biopolímeros particulares, tales como proteínas o ácidos nucleicos, modelos dinámicos moleculares basados en movimientos moleculares de computación, modelos mecánicos estadísticos basados en ensambles térmicos, o modelos combinados. Para la mayoría de los tipos de modelos, se necesitan campos de fuerza molecular estándares, que representan las fuerzas entre los átomos y grupos constitutivos, y se pueden seleccionar a partir de campos de fuerza conocidos en la química física. Las estructuras experimentales incompletas o menos precisas pueden servir como limitaciones sobre las estructuras completas y más precisas calculadas por estos métodos de modulación. Finalmente, habiendo determinado la estructura del sitio activo, bien sea experimentalmente, mediante modelación, o mediante una combinación, se pueden identificar los compuestos moduladores candidatos mediante la búsqueda en bases de datos que contengan compuestos junto con la información sobre su estructura molecular. Esta búsqueda busca los compuestos que tienen estructuras que concuerden con la estructura del sitio activo determinada, y que interactúen con los grupos que definan el sitio activo. Esta búsqueda puede ser manual, pero de preferencia es asistida por computadora. Estos compuestos que se encuentran en esta búsqueda, son compuestos moduladores de ObR potenciales. De una manera alternativa, estos métodos se pueden utilizar para identificar compuestos moduladores mejorados a partir de un compuesto o ligando modulador ya conocido. La composición del compuesto conocido se puede modificar, y se pueden determinar los efectos estructurales de la modificación, o empleando métodos de modelación experimentales y por computadora descritos anteriormente, aplicados a la nueva composición. Luego se compara la estructura alterada con la estructura del sitio activo del compuesto, para determinar si resulta un ajuste mejorado una interacción. De esta manera, se pueden evaluar fácilmente las variaciones sistemáticas en la composición, tal como variando los grupos laterales, para obtener compuestos moduladores modificados o ligandos de una mejor especificidad o actividad. Otros métodos de modelación experimentales y por computadora útiles para identificar los compuestos moduladores, basándose en la identificación de los sitios activos de Ob, ObR, y los factores de transducción y de transcripción relacionados, serán aparentes para los expertos en este campo. Los ejemplos de los sistemas de modelación molecular son los programas CHARMm y QUANTA (Polygen Corporation, Waltham, MA) . CHARMm realiza la minimización de energía y las funciones de dinámica molecular. QUANTA realiza la construcción, la modelación gráfica y el análisis de la estructura molecular. QUANTA permite la construcción interactiva, la modificación, la visualización, y el análisis del comportamiento de las moléculas unas con otras . Un número de artículos revisan la modelación por computadora de fármacos interactivos con proteínas específicas, tales como Rotivinen y colaboradores, 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166; Ripka, New Scientist 54-57 (16 de junio de 1988); McKinaly y Rossman, 1989, Annu. Rev. Pharmacol . Toxicol. 29:111-122; Perry y Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design, páginas 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis y Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236:125-140 y 141-162; y con respecto a un receptor de modelo para los componentes de ácido nucleico, Askew y colaboradores, 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090. Otros programas de computación que rastrean e ilustran gráficamente productos químicos están disponibles en compañías tales como BioDesign, Inc. (Pasadena, CA) , Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canadá), y Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario) . Aunque estos diseñados primariamente para aplicarse a fármacos específicos para proteínas particulares, se pueden adaptar para diseñar fármacos específicos para las regiones del ADN o del ARN, una vez que se identifique esa región . Aunque se describió anteriormente con referencia al diseño y la generación de compuestos que pudieran alterar la fijación, también se podrían rastrear bibliotecas de compuestos conocidos, incluyendo productos naturales o productos químicos sintéticos, y materiales biológicamente activos, incluyendo proteínas, para los compuestos que sean inhibidores o activadores . Los compuestos identificados por medio de ensayos, tales como aquellos descritos en la presente, pueden ser útiles, por ejemplo, en la elaboración de la función biológica del producto del gen obR, y para aminorar los desórdenes del peso corporal. Los ensayos para probar la efectividad de los compuestos, identificados, por ejemplo, mediante técnicas tales como las descritas en la Secciones 5.5.1 a 5.5.3, se describen más adelante en la Sección 5.5.4. 1. Ensayos de Rastreo in vitro para Determinar los Compuestos ue se Fijan a ObR Se pueden diseñar sistemas in vi tro para identificar los compuestos capaces de interactuar con (por ejemplo, fijarse a) ObR (incluyendo, pero no limitándose a, el dominio extra celular o el dominio citoplásmico de ObR) . Los compuestos identificados pueden ser útiles, por ejemplo, en la modulación de la actividad de los productos del gen obR de tipo silvestre y/o mutante; pueden ser útiles para elaborar la función biológica de la obR; se pueden utilizar en rastreos para identificar compuestos que interrumpan las interacciones normales de ObR; o pueden ellos mismos interrumpir esas interacciones. El principio de los ensayos utilizados para identificar los compuestos que se finan a la ObR, involucra preparar una mezcla de reacción de la ObR y el compuesto de prueba, bajo condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir que los dos componentes interactúen y se fijen, formando de esta manera un complejo que se puede remover y/o detectar en la mezcla de reacción. La especie de ObR utilizada puede variar, dependiendo de la meta del ensayo de rastreo. Por ejemplo, en donde se busquen agonistas del ligando natural, la ObR de longitud completa, o una ObR truncada soluble, por ejemplo, en donde se suprima el dominio transmembrana, y/o el dominio citoplásmico de la molécula, se puede utilizar un péptido correspondiente al dominio extra celular, o una proteína de fusión que contenga el dominio extra celular de ObR fundida con una proteína o polipéptido que proporcione ventajas en el sistema de ensayo (por ejemplo, etiquetación, aislamiento del complejo resultante, etcétera) . En donde se busque identificar los compuestos que interactúen con el dominio citoplásmico, se pueden utilizar péptidos correspondientes al dominio citoplásmico de ObR, y proteínas de fusión que contengan el dominio citoplásmico de ObR. Los ensayos de rastreo se pueden conducir en una variedad de maneras. Por ejemplo, un método para conducir este ensayo involucraría anclar la proteína ObR, el polipéptido, el péptido, o la proteína de fusión, o la sustancia de prueba, sobre una fase sólida, y detectar los complejos de ObR/compuesto de prueba anclados sobre la fase sólida al final de la reacción. En una modalidad de este método, el reactivo de ObR se puede anclar sobre una superficie sólida, y el compuesto de prueba, que no se ancla, se puede etiquetar, bien sea directamente o indirectamente . En la práctica, convenientemente se pueden utilizar platos de microtitulación como la fase sólida. El componente anclado se puede inmovilizar mediante uniones no covalentes o covalentes. La unión no covalente se puede realizar simplemente recubriendo la superficie sólida con una solución de la proteína, y secando. De una manera alternativa, se puede utilizar un anticuerpo inmovilizado, de preferencia un anticuerpo monoclonal, específico para la proteína que se vaya a inmovilizar, para anclar la proteína a la superficie sólida. Las superficies se pueden preparar con anticipación, y se pueden almacenar. Con el objeto de conducir el ensayo, el componente no inmovilizado se agrega a la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Después de que se termina la reacción, se remueven los componentes sin reaccionar (por ejemplo, mediante lavado) bajo condiciones tales que cualesquiera complejos formados permanezcan inmovilizados sobre la superficie sólida. La detección de los complejos anclados sobre la superficie sólida se puede realizar en un número de maneras . En donde el componente previamente no inmovilizado se etiquete previamente, la detección de la etiqueta inmovilizada sobre la superficie indica que se formaron complejos. En donde el componente previamente no inmovilizado no se etiquete previamente, se puede utilizar una etiqueta indirecta para detectar los complejos anclados sobre la superficie; por ejemplo, utilizando un anticuerpo etiquetado específico para el componente previamente no inmovilizado (a su vez, el anticuerpo se puede etiquetar directamente o se puede etiquetar indirectamente con un anticuerpo anti-Ig etiquetado) . De una manera alternativa, se puede conducir una reacción en una fase líquida, separándose los productos de reacción de los componentes sin reaccionar, y detectándose los complejos; por ejemplo, utilizando un anticuerpo inmovilizado específico para la proteína ObR, el polipéptido, el péptido, o la proteína de fusión, o el compuesto de prueba, para anclar cualesquiera complejos formados en solución, y un anticuerpo etiquetado específico para el otro componente del posible complejo, para detectar los complejos anclados. De una manera alternativa, se pueden emplear ensayos basados en células para identificar los compuestos que interactúen con la ObR. Para este fin, se pueden utilizar líneas celulares que expresen ObR, o líneas celulares (por ejemplo, células COS, células CHO, fibroblastos, etcétera) que se hayan diseñado genéticamente para expresar ObR (por ejemplo, mediante transfección o transducción del ADN de ObR) . La interacción del compuesto de prueba con, por ejemplo, el dominio extra celular de obR expresado por la célula anfitriona, se puede determinar mediante una comparación o por competición con la Ob nativa . 2. Ensayos para Determinar las Proteínas Intracelulares que Interactúan con la ObR Se puede emplear cualquier método adecuado para detectar las interacciones de proteína-proteína, para identificar las proteínas transmembrana o las proteínas intracelulares que interactúan con ObR. Entre los métodos tradicionales que se pueden emplear están co-inmunoprecipitación, reticulación, y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas de usados celulares o proteínas obtenidas a partir de Usados celulares y la ObR para identificar proteínas en el lisado que interactúen con la ObR. Para estos ensayos, el componente de ObR utilizado puede ser una ObR de longitud completa, un derivado soluble que carezca de la región de anclaje de membrana (por ejemplo, una ObR truncada en donde se suprima el dominio transmembrana, dando como resultado una molécula truncada que contenga el dominio extra celular fundido con el dominio citoplásmico) , un péptido correspondiente al dominio citoplásmico, una proteína de fusión que contenga el dominio citoplásmico de ObR. Una vez aislada, esta proteína intracelular se puede identificar, y a su vez, se puede utilizar, en conjunto con técnicas convencionales, para identificar las proteínas con las que interactúe. Por ejemplo, cuando menos una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteína celular que interactúe con la ObR, se puede aseverar empleando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tales como por medio de la técnica de degradación de Edman (ver, por ejemplo, Creighton, 1983, "Proteins: Structures and Molecular Principies", W.H. Freeman & Co . , N.Y., páginas 34-49) . La secuencia de aminoácidos obtenida se puede utilizar como una guía para la generación de mezclas de oligonucleótidos, que se pueden utilizar para rastrear la secuencia genéticas que codifiquen estas proteínas intracelulares. El rastreo se puede realizar, por ejemplo, mediante técnicas convencionales de hibridación o de reacción en cadena de polimerasa. Las técnicas para la generación de mezclas de oligonucleótidos y el rastreo, son bien conocidas. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra, y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis, M. y colaboradores, eds. Academic Press, Inc., Nueva York). Adicionalmente, se pueden emplear métodos que den como resultado la identificación simultánea de genes que codifiquen las proteínas transmembrana o intracelulares que interactúen con ObR. Estos métodos incluyen, por ejemplo, sondeo, expresión, bibliotecas, de una manera similar a la técnica bien conocida de sondeo de anticuerpos de bibliotecas ?gtll, utilizando proteína ObR etiquetada, o un polipéptido de ObR, o una proteína de fusión, por ejemplo, un polipéptido de ObR o un dominio de ObR fundido con un marcador (por ejemplo, una enzima, flúor, proteína luminiscente, o un tinte), y un dominio Ig-Fc. Un método que detecta las interacciones de proteína en vivo, el sistema de dos híbridos, se describe con detalle para ilustración solamente, y no a manera de limitación. Una versión de este sistema se ha descrito (Chien y colaboradores, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 88.: 9578-9582 ) , y está comercialmente disponible en Clontech (Palo Alto, CA) .

Dicho de una manera breve, utilizando este sistema, se construyen plásmidos que codifiquen dos proteínas híbridas: un plásmido que consista en nucleótidos que codifiquen el dominio de fijación de ADN de una proteína activadora de transcripción fundida con una secuencia de nucleótidos de obR que codifique ObR, un polipéptido de ObR, un péptido, o una proteína de fusión, y el otro plásmido consiste en nucleótidos que codifican el dominio de activación de la proteína activadora de transcripción fundido con un ADNc que codifique una proteína desconocida que se ha recombinado en este plásmido como parte de una biblioteca de ADNc. El plásmido de fusión del dominio de fijación de ADN y la biblioteca de ADNc se transforman en una cepa de la levadura Saccharomyces cerevisiae que contiene un gen reportero (por ejemplo, HBS ó lacz) , cuya región reguladora contiene el sitio de activación del activador de transcripción. La proteína híbrida sola no puede activar la transcripción del gen reportero: el híbrido del dominio de fijación de ADN no puede, debido a que no proporciona la función de activación, y el híbrido del dominio de activación no puede debido a que no puede localizar los sitios de fijación del activador. La interacción de las dos proteínas híbridas reconstituye la proteína activadora funcional, y da como resultado la expresión del gen reportero, que se detecta mediante un ensayo para determinar el producto del gen reportero . El sistema de dos híbridos, o una metodología relacionada, se puede utilizar para rastrear las bibliotecas del dominio de activación para las proteínas que interactúan con el producto del gen de "cebo". A manera de ejemplo, y no a manera de limitación, la ObR se puede utilizar como el producto del gen de cebo. Las secuencias genómicas totales o de ADNc se funden con el ADN que codifica un dominio de activación. Esta biblioteca y un plásmido que codifica un híbrido de un producto de gen obR de cebo fundido con el dominio de fijación de ADN, se co-transforman en una cepa reportera de levadura, y los transformantes resultantes se rastrean para determinar aquellos que expresen el gen reportero. Por ejemplo, y no a manera de limitación, una secuencia de gen obR de cebo, tal como el marco de lectura abierta de obR (o un dominio de obR) , como se ilustra en la Figura 1, en la Figura 3, o en la Figura 6, se puede clonar en un vector, de tal manera que se funda traslacionalmente con el ADN que codifique el dominio de fijación de ADN de la proteína GAL4. Estas colonias se purifican, y se aislan los plásmidos de la biblioteca responsable de la expresión del gen reportero. Luego se utiliza secuenciamiento del ADN para identificar las proteínas codificadas por los plásmidos de la biblioteca. Una biblioteca de ADNc de la línea celular a partir de la cual se van a detectar las proteínas que interactúan con el producto de gen obR de cebo, se puede hacer empleando métodos practicados como rutina en la técnica. De acuerdo con el sistema particular descrito en la presente, por ejemplo, los fragmentos de ADNc se puede insertar en un vector, de tal manera que se fundan traslacionalmente con el dominio de activación de transcripción de GAL4. Esta biblioteca se puede co-transformar, junto con el plásmido de fusión de gen obR de cebo-GAL4 en una cepa de levadura que contenga un gen lacz impulsado por un promotor que contenga la secuencia de activación de GAL4. Una proteína codificada por el ADNc, fundida con el dominio de activación de transcripción de GAL4, que interactúe con el producto de gen obR de cebo, reconstituirá una proteína GAL4 activa, y de esta manera impulsará la expresión del gen HIS3. Las colonias que expresan HIS3 se pueden detectar por su crecimiento en platos de petri que contengan medio basado en agar semisólido que carezca de histidina. Luego se puede purificar el ADNc a partir de estas cepas, y se puede utilizar para producir y aislar la proteína de interacción con el gen obR de cebo, empleando técnicas rutinariamente practicadas en este campo. 3. Ensayos para Determinar Compuestos que Interfieran con la Macromolecular ObR/lntracelular ObR/ ransmembrana Interacción Las moléculas que interactúan con la ObR, para propósitos de esta descripción, son referidas como "socios de fijación". Estos socios de fijación tienen posibilidades de estas involucrados en la trayectoria de transducción de señal de ObR, y por consiguiente, en el papel de ObR en la regulación del peso corporal. Por consiguiente, es deseable identificar compuestos que interfieran con, o que interrumpan, la interacción de estos socios de fijación con la Ob, que puedan ser útiles en la regulación de la actividad de la ObR y en el control de los desórdenes del peso corporal asociados con la actividad de ObR. El principio básico de los sistemas de ensayo utilizados para identificar los compuestos que interfieren con la interacción entre la ObR y su socio o socios de fijación, involucra la preparación de una mezcla de reacción que contenga proteína ObR, polipéptido, péptido, o proteína de fusión, como se describe en las Secciones 5.5.1 y 5.5.2 anteriores, y el socio de fijación, bajo condiciones, y durante un tiempo suficientes para permitir que los dos interactúen y se fijen, formando de esta manera un complejo. Con el objeto de probar un compuesto para determinar la actividad inhibidora, la mezcla de reacción se prepara en la presencia y en ausencia del compuesto de prueba. El compuesto de prueba se puede incluir inicialmente en la mezcla de reacción, o se puede agregar en un tiempo subsecuente a la adición de la fracción de ObR y su socio de fijación. Las mezclas de reacción de control se incuban en el compuesto de prueba o con un placebo. La formación de cualesquiera complejos entre la fracción de ObR y el socio de fijación es lo que se detecta entonces. La formación de un complejo en la reacción de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene al compuesto de prueba, indica que el compuesto interfiere con la interacción de la ObR y el socio de fijación interactivo. Adicionalmente, la formación del complejo dentro de las mezclas de reacción que contienen al compuesto de prueba y la proteína ObR normal, también se puede comparar con la formación del complejo adentro de las mezclas de reacción que contienen al compuesto de prueba y una ObR mutante. Esta comparación puede ser importante en aquellos casos en donde sea deseable identificar compuestos que interrumpan las interacciones de las ObRs mutantes pero no las normales . El ensayo para determinar los compuestos que interfieren con la interacción de la ObR y los socios de fijación, se pueden conducir en un formato heterogéneo u homogéneo. Los ensayos heterogéneos involucran anclar el producto de la fracción de ObR o el socio de fijación sobre una fase sólida, y detectar los complejos anclados sobre la fase sólida al final de la reacción. En los ensayos homogéneos, toda la reacción se realiza en una fase líquida. En cualquier planteamiento, el orden de adición de los reactivos se puede variar para obtener diferente información acerca de los compuestos que se estén probando. Por ejemplo, los compuestos de prueba que interfieran con la interacción por competición, se pueden identificar mediante la conducción de la reacción en la presencia de la sustancia de prueba; es decir, mediante la adición de la sustancia de prueba a la mezcla de reacción antes de, o simultáneamente con, la fracción de ObR, y el socio de fijación interactivo . De una manera alternativa, se pueden probar los compuestos con constantes de fijación más altas, que desplacen uno de los componentes del complejo, mediante la adición del compuesto de prueba a la mezcla de reacción, después de que se hayan formado los complejos. Los diferentes formatos se describen brevemente en seguida. En un sistema de ensayo heterogéneo, la fracción de ObR o el socio de fijación interactivo, se ancla sobre una superficie sólida, mientras que la especie no anclada se etiqueta, bien sea directamente o indirectamente. En la práctica, convenientemente se utilizan platos de microtitulación. La especie anclada se puede inmovilizar mediante uniones no covalentes o covalentes. La unión no covalente se puede realizar simplemente mediante el recubrimiento de la superficie sólida con una solución del producto del gen obR, o el sodio de fijación, y secando. De una manera alternativa, se puede utilizar un anticuerpo inmovilizado específico para la especie que se vaya a anclar, con el fin de anclar la especie a la superficie sólida. Las superficies se pueden preparar con anticipación, y se puede almacenar. Con el objeto de conducir el ensayo, el socio de la especie inmovilizada se expone a la superficie recubierta con o sin el compuesto de prueba. Después de que se termina la reacción, se remueven los componentes sin reaccionar (por ejemplo, mediante lavado), y cualesquiera complejos formados permanecerán inmovilizados sobre la superficie sólida. La detección de los complejos anclados sobre la superficie sólida se puede realizar en un número de maneras. En donde la especie no inmovilizada sea previamente etiquetada, la detección de la etiqueta inmovilizada sobre la superficie indica que se formaron complejos. En donde la especie no inmovilizada no esté previamente etiquetada, se puede utilizar una etiqueta indirecta para utilizar los complejos aislados sobre la superficie; por ejemplo, utilizando un anticuerpo etiquetado específico para la especie inicialmente no inmovilizada (a su vez, el anticuerpo se puede etiquetar directamente o se puede etiquetar indirectamente con un anticuerpo anti-Ig etiquetado. Dependiendo del orden de adición de los componentes de reacción, se pueden detectar los compuestos de prueba que inhiban la formación de complejo, o que alteren los complejos previamente formados . De una manera alternativa, la reacción se puede conducir en una fase líquida en la presencia o en ausencia del compuesto de prueba, separándose los productos de la reacción de los componentes sin reaccionar, y detectándose los complejos; por ejemplo, utilizando un anticuerpo inmovilizado específico para uno de los componentes de fijación, para anclar cualesquiera complejos formados en solución, y un anticuerpo etiquetado específico para el otro socio, con el fin de detectar los complejos anclados. Nuevamente, dependiendo del orden de adición de los reactivos a la fase líquida, se pueden identificar los compuestos de prueba que inhiban el complejo o que alteren los complejos previamente formados. En una modalidad alternativa de la invención, se puede emplear un ensayo homogéneo. En este planteamiento, se prepara un complejo previamente formado de la fracción de ObR y el socio de fijación interactivo, en donde se etiquetan la ObR o sus socios de fijación, pero la señal generada por la etiqueta se apaga debido a la formación del complejo (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4,109,496 por Rubenstein, que utiliza este planteamiento para los inmunoensayos) . La adición de una sustancia de prueba que compita con, y desplace, una de las especies del complejo previamente formado, dará como resultado la generación de una señal sobre el fondo. De esta manera, se pueden identificar las sustancias de prueba que alteren la interacción de la ObR/socio de fijación intracelular. En una modalidad particular, se puede preparar una fusión de ObR para la inmovilización. Por ejemplo, la ObR o un fragmento de péptido, por ejemplo, correspondiente al dominio citoplásmico, se puede fundir con un gen de glutationa-S-transferasa (GST) , utilizando un vector de fusión, tal como pGEX-5-1, de tal manera que se mantenga su actividad de fijación en la proteína de fusión resultante. El socio de fijación interactivo se puede purificar y utilizar para criar un anticuerpo monoclonal, empleando métodos practicados como rutina en la técnica, y descritos anteriormente en la Sección 5.3.1. Este anticuerpo se puede etiquetar con el isótopo radioactivo 125I, por ejemplo, mediante métodos rutinariamente practicados en este campo. En un ensayo heterogéneo, por ejemplo, la proteína de fusión GST-ObR se puede anclar a los granulos de glutationa-agarosa. Entonces se puede agregar el socio de fijación interactivo en la presencia o en ausencia del compuesto de prueba de una manera que permita la interacción, y que se presente la fijación. Al final del período de la reacción, el material no fijado se puede lavar, y el anticuerpo monoclonal etiquetado se puede agregar al sistema, y se puede dejar que se fije a los complementos complejados. La interacción entre el producto del gen obR y el socio de fijación interactivo, se puede detectar midiendo la cantidad de radioactividad que queda asociada con los granulos de glutationa-agarosa. Una inhibición con éxito de la interacción por el compuesto de prueba, dará como resultado una disminución en la radioactividad medida. De una manera alternativa, la proteína de fusión GST-ObR y el socio de fijación interactivo, se pueden mezclar entre sí en líquido, en ausencia de los granulos sólidos de glutationa-agarosa. El compuesto de prueba se puede agregar bien sea durante o bien después de que se permite que interactúen las especies. Esta mezcla se puede agregar entonces a los granulos de glutationa-agarosa, y se lava el material no fijado. Nuevamente, el grado de inhibición de la interacción de ObR/socio de fijación, se puede detectar mediante la adición del anticuerpo etiquetado, y midiendo la radioactividad asociada con los granulos . En otra modalidad de la invención, se pueden emplear estas mismas técnicas utilizando fragmentos de péptido que correspondan a los dominios de fijación de la ObR y/o el socio interactivo o de fijación (en los casos en donde el socio de fijación sea una proteína), en lugar de una o ambas proteínas de longitud completa. Se pueden emplear cualquier número de métodos rutinariamente practicados en este campo, para identificar y aislar los sitios de fijación. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis del gen que codifique una de las proteínas, y rastreo para determinar la alteración de la fijación en un ensayo de co-inmunoprecipitación . Entonces se pueden seleccionar mutaciones de compensación en el gen que codifique la segunda especie en el complejo. El análisis de secuencia de los genes que codifiquen las proteínas respectivas, revelerá las mutaciones que correspondan a la región de la proteína involucradas en la fijación interactiva. De una manera alternativa, una proteína se puede anclar a una superficie sólida empleando los métodos descritos anteriormente, y se le permite interactuar con, y fijarse a, su socio de fijación etiquetado, el cual se ha tratado con una enzima proteolítica, tal como tripsina. Después de lavarse, puede quedar un péptido etiquetado corto que comprenda el dominio de fijación asociado con el material sólido, el cual se puede aislar e identificar mediante secuenciamiento de aminoácidos. También, una vez que se obtiene la codificación del gen para el socio de fijación intracelular, se pueden diseñar segmentos de gen cortos para expresar los fragmentos de péptido de la proteína, que entonces se puede probar para determinar la actividad de fijación, y se puede purificar o sintetizar. Por ejemplo, y no a manera de limitación, se puede anclar un producto de gen obR a un material sólido como se describió anteriormente, haciendo una proteína de fusión GST-ObR, y permitiéndole fijarse a granulos de agarosa de glutationa. El socio de fijación interactivo se puede etiquetar con un isótopo radioactivo, tal como 35S, y se puede disociar con una enzima proteolítica tal como tripsina. Luego se pueden agregar los productos de la disociación a la proteína de fusión GST-obR anclada, y se dejan fijarse. Después de lavar los péptidos no fijados, el material fijado y etiquetado, que representa el dominio de fijación del socio de fijación intracelular, se puede eluir, purificar, y analizar, para determinar la secuencia de aminoácidos, mediante métodos bien conocidos. Los péptidos así identificados se pueden producir sintéticamente, o se pueden fundir con proteínas facilitativas apropiadas, empleando tecnología de ADN recombinante. 4. Ensayos para la Identificación de Compuestos que Aminoran los Desórdenes del Peso Corporal Los compuestos, incluyendo, pero no limitándose a, los compuestos de fijación identificados mediante las técnicas de ensayo, tales como aquéllas descritas anteriormente en las Secciones 5.5.1 a 5.5.3, se pueden probar para determinar su capacidad para aminorar los síntomas del desorden del peso corporal, incluyendo la obesidad. Los ensayos escritos anteriormente pueden identificar compuestos que afecten la actividad de ObR (por eiemplo, los compuestos que se fijen a la ObR, que inhiban la fijación del ligando natural, y que activen la transducción de señal (agonistas) , ó que bloqueen la activación (antagonistas) , y compuestos que se fijen al ligando natural de la ObR, y que neutralicen la actividad del ligando) ,-ó compuestos que afecten la actividad del gen obR (al afectar la expresión del gen obR, incluyendo las moléculas, por ejemplo, las proteínas ó las moléculas orgánicas pequeñas, que afecten ó interfieran con los eventos de empalme, de tal manera que se pueda modular la expresión de la longitud completa ó de la forma truncada de la ObR) . Sin embargo, se debe observar que los ensayos descritos también pueden identificar compuestos que modulen la transducción de señal de ObR (por eiemplo, compuestos que afecten los eventos de señalización corriente abajo, tales como inhibidores ó mejoradores de las actividades de quinasa de tirosina ó de fosfatasa que participan en la transducción de la señal activada por la fijación de Ob a la ObR) . La identificación y el uso de estos compuestos que afectan a otro paso en la trayectoria de transducción de señal de ObR, en donde está involucrado el gen obR y/ó el producto del gen obR y, al afectar esta misma trayectoria, pueden modular el efecto de la ObR sobre el desarrollo de los desórdenes del peso corporal, están dentro del alcance de la invención. Estos compuestos se pueden utilizar como parte de un método terapéutico para el tratamiento de los desórdenes del peso corporal . La invención abarca ensayos basados en células y basados en modelos animales para la identificación de los compuestos que exhiban esta capacidad para aminorar los síntomas del desorden del peso corporal. Estos sistemas de ensayo basados en células, también se pueden utilizar como el "estándar de oro" para ensayar, con el fin de determinar la pureza y la potencia del ligando natural, ó de, incluyendo la Ob recombinantemente ó sintéticamente producida, y los mutantes de Ob. Los sistemas basados en células se pueden utilizar para identificar compuestos que puedan actuar para aminorar los síntomas del desorden del peso corporal. Estos sistemas de células pueden incluir, por ejemplo, células recombinantes ó no recombinantes, tales como líneas celulares que expresen el gen obR. Por ejemplo, se pueden utilizar células del plexo coroide, células del hipotálamo, ó lineas celulares derivadas a partir del plexo coroide ó el hipotálamo. En adición, se pueden utilizar células anfitrionas de expresión (por eiemplo, células COS, células CHO, fibroblastos) genéticamente diseñadas para expresar una ObR funcional, y para responder a la activación por el ligando de Ob natural, por eiemplo, medido por un cambio químico ó fenotípico, la inducción de otro gen de la célula anfitriona, un cambio en el flujo iónico (por eiemplo, Ca++) , fosforilación con tirosina de las proteínas de la célula anfitriona, etc, como un punto final en el ensayo. En la utilización de estos sistemas de células, las células se pueden exponer a un compuesto que se sospeche que exhibe una capacidad para aminorar los síntomas del desorden del peso corporal, en una concentración suficiente, y durante un tiempo suficiente para provocar esta aminoración de los síntomas del desorden del peso corporal en las células expuestas . Después de la exposición, las células se pueden ensayar para medir las alteraciones en la expresión del gen obR, por eiemplo, mediante el ensayo de Usados celulares para determinar las transcripciones de ARNm de obR (por eiemplo, mediante análisis Northern) , ó para determinar la proteína de obR expresada en la célula; los compuestos que regulan ó modulan la expresión del gen obR, son buenos candidatos como terapéuticos. De una manera alternativa, las células se examinan para determinar si se ha alterado uno ó más fenotipos celulares de tipo de desorden de peso corporal, para parecerse a un fenotipo de desorden que no sea de peso corporal, de tipo más normal ó más silvestre, ó un fenotipo que tenga más posibilidades de producir una incidencia ó severidad más baja de los síntomas del desorden. Todavía además, se puede ensayar la expresión y/ó la actividad de los componentes de la trayectoria de transducción de señal de la que es parte la ObR, ó la actividad de la trayectoria de transducción de señal de ObR misma. Por ejemplo, después de la exposición, los usados celulares se pueden ensayar para determinar la presencia de fosforilación con tirosina de las proteínas de la célula anfitriona, comparándose con los usados derivados a partir de células de control no expuestas. La capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la fosforilación con tirosina de las proteínas de la célula anfitriona en estos sistemas de ensayo, indica que el compuesto de prueba inhibe la transducción de señal iniciada por la activación de ObR. Los lisados celulares se pueden ensayar fácilmente utilizando un formato de mancha Western; es decir, las proteínas de la célula anfitriona se resuelven mediante electroforesis en gel, se transfieren y se sondean utilizando un anticuerpo de detección anti-fosfotirosina (por eiemplo, un anticuerpo anti-fosfotirosina etiquetado con un compuesto generador de señal, tal como una radioetiqueta, flúor, enzima, etc). (Ver, por eiemplo, Glenney, y colaboradores, 1988, J. Immunol. Métodos 109: 277-285; Frackelton, y colaboradores, 1983, Mol. Cell. Biol. 3.: 1343-1352) . De una manera alternativa, se podría emplear un formato ELISA, en donde se inmovilice una proteína de célula anfitriona particular involucrada en la trayectoria de transducción de señal de ObR, utilizando un anticuerpo de anclaje específico para la proteína de la célula anfitriona objetivo, y se detecta la presencia ó la ausencia de fosfotirosina sobre la proteína de la célula anfitriona inmovilizada, utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina etiquetado. (Ver King, y colaboradores, 1993, Life Sciences 53.: 1465-1472) . En todavía otro planteamiento, se puede medir el flujo iónico, tal como el flujo de ion de calcio, como un punto final para la transducción de señal estimulada por ObR. De una manera alternativa, se puede medir la activación de las proteínas STAT, y el estímulo de la transcripción mediada a través de elementos genéticos que responden a IL-6, para probar la capacidad de un compuesto para regular la transducción de señal mediada por ObR. Por ejemplo, se puede diseñar un vector de expresión recombinante, para que contenga las secuencias del elemento que responde a IL-6 clonadas adyacentes a un gen reportero, y se puede medir la regulación de la actividad de ObR mediante un ensayo para determinar la actividad del gen reportero. Los genes reporteros que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, aquellos que codifican acetiltransferasa de cloranfenicol (CAT) , luciferasa de luciérnaga, u hormona de crecimiento humana. En adición, se pueden utilizar sistemas de desorden de peso corporal basados en animales, los cuales pueden incluir, por ejemplo, ratones ob, db y ob/db, para identificar compuestos capaces de aminorar los síntomas de tipo de desorden de peso corporal. Estos modelos animales se pueden utilizar como sustratos de prueba para la identificación de fármacos, productos farmacéuticos, terapias, e intervenciones, que puedan ser efectivas en el tratamiento de esos desórdenes. Por ejemplo, los modelos animales se pueden exponer a un compuesto, que se sospeche que exhibe una capacidad para aminorar los síntomas del desorden del peso corporal, en una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para provocar esta aminoración de los síntomas del desorden del peso corporal en los animales expuestos. La respuesta de los animales a la exposición se puede monitorear mediante la evaluación de la inversión de los desórdenes asociados con los desórdenes de peso corporal, tales como obesidad. Con respecto a la intervención, cualesquiera tratamientos que inviertan cualquier aspecto de los síntomas de tipo de desorden de peso corporal, deben considerarse como candidatos para la intervención terapéutica del desorden del peso corporal humano. Las dosificaciones de los agentes de prueba se pueden determinar mediante la derivación de curvas de respuesta a la dosis, como se discute en la Sección 5.7.1, más adelante. F. El Tratamiento del Peso Corporal, Incluyendo Desórdenes del Peso Corporal La invención abarca métodos y composiciones para modificar el peso corporal, y para tratar desórdenes del peso corporal, incluyendo, pero no limitándose a, obesidad, caquexia y anorexia. Debido a que una pérdida de la función del producto de gen obR normal da como resultado el desarrollo de un fenotipo obeso, un incremento en la actividad del producto de gen obR, ó una activación de la trayectoria de ObR (por eiemplo, la activación corriente abajo) , facilitaría el progreso hacia un estado de peso corporal normal en los individuos obesos que exhiban un nivel deficiente de expresión del gen obR, y/ó de la actividad de obR. De una manera alternativa, se pueden aminorar los síntomas de ciertos desórdenes del peso corporal, tales como, por ejemplo, caquexia, que involucren un fenotipo de peso corporal más bajo que lo normal, mediante la disminución del nivel de la expresión del gen obR y/ó de la actividad del gen obR y/ó regulando hacia abajo la actividad de la trayectoria de ObR (por ei emplo , dirigiendo eventos de señalización corriente abajo) . Más adelante se discuten diferentes planteamientos. 1. Inhibición de la Expresión de ObR o de la Actividad de ObR para Promover la Ganancia de Peso Se puede ampliar cualquier método que neutralice la Ob, ó que inhiba la expresión del gen obR (bien sea de transcripción ó de traslación) para efectuar la ganancia de peso. Estos planteamientos se pueden emplear para tratar los desórdenes del peso corporal, tales como anorexia ó caquexia. Estos métodos también pueden ser útiles para aplicaciones agrícolas; es decir, para incrementar el peso de los animales de ganado. Por ejemplo, se puede ampliar la administración de péptidos solubles, proteínas, proteínas de fusión, ó anticuerpos (incluyendo anticuerpos anti-ideotípicos) que se fijen a, y "neutralicen" la Ob circulante, el ligando natural para la ObR, con el fin de efectuar la ganancia de peso. Para este fin, se pueden utilizar los péptidos correspondientes al dominio extracelular de ObR, mutantes de supresión solubles de ObR (por eiemplo, mutantes ?TMObR) , ó cualquiera de estos dominios de ObR ó mutantes fundidos con otro polipéptido (por eiemplo, un polipéptido IgFc) . De una manera alternativa, se pueden utilizar anticuerpos anti-ideotípicos ó fragmentos Fab de anticuerpos anti-ideotípicos que imiten el dominio extracelular de ObR y que neutralicen la Ob (ver la Sección 5.3, supra) . Estos péptidos de ObR, proteínas, proteínas de fusión, anticuerpos anti-ideotípicos, ó Fabs, se administran a un sujeto en cantidades suficientes para neutralizar la Ob, y para efectuar la ganancia de peso. Se pueden utilizar los péptidos de ObR correspondientes al dominio extracelular que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 1 ó 6, desde aproximadamente el residuo de aminoácido número 23 hasta aproximadamente 837, ó que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3, desde aproximadamente el residuo de aminoácido número 21 hasta aproximadamente 839. También se podrían utilizar los mutantes ObR ?TM, en donde se encuentre toda ó parte de la secuencia de ancla hidrófoba de 23 aminoácidos (por eiemplo, de aproximadamente el residuo de aminoácido número 838 hasta 870 en las Figuras 1 ó 6, ó de aproximadamente 840 a aproximadamente 862 en la Figura 3) . La fusión de la ObR, el dominio extracelular de ObR, ó la ?TMObR con un polipéptido IgFc, no solamente debe incrementar la estabilidad de la preparación, sino que incrementará la vida media y la actividad de la proteína de fusión ObR-Ig en vivo. Las región Fe de la porción Ig de la proteína de fusión se puede modificar adicionalmente para reducir la función del efector de inmunoglobulina. Ver la Sección 10, infra. En una modalidad específica descrita en la presente, se fundieron los dominios extracelulares de la ObR de ratón ó humana a la región constante de IgG. Como se indica en la Figura 10, la ObR-IgG purificada pudo inhibir potentemente, ó neutralizar la fijación de la proteína de fusión AP-OB a la ObR de la superficie celular. (Ver la Sección 10.4.). En una modalidad alternativa para neutralizar la Ob circulante, las células que se diseñen genéticamente para expresar estas formas solubles ó secretadas de ObR, se pueden administrar a un paciente, sobre lo cual, servirán como "biorreactores" en vivo, para proporcionar un suministro continuo de la proteína neutralizante de Ob. Estas células se pueden obtener del paciente ó de un donador de MHC compatible, y pueden incluir, pero no se limitan a, fibroblastos, células sanguíneas (por eiemplo, linfocitos) , adipocitos, células musculares, células endoteliales, etc. Las células se diseñan genéticamente in vi tro, utilizando técnicas de ADN recombinante, para introducir la secuencia de codificación para el dominio extracelular de ObR, ?TMObR, ó para la proteína de fusión ObR-Ig (por eiemplo, proteínas de fusión ObR-, ECD- ó ?TMObR-IgFc) en las células, por ejemplo, mediante los procedimientos de transducción (utilizando vectores virales, y de preferencia vectores que integren el transgen en el genoma celular) ó de transfección, incluyendo, pero no limitándose a, el uso de plásmidos, cósmidos, YACs, electroincorporación, liposomas, etc. La secuencia de codificación de obR se puede colocar bajo el control de un fuerte promotor constitutivo ó inducible, ó de un promotor/mejorador, para lograr la expresión y la secreción del péptido ObR ó la proteína de fusión. Las células diseñadas que expresen y secreten el producto de ObR deseado, se pueden introducir en el paciente sistémicamente, por eiemplo, en la circulación, intraperitonealmente, en el plexo coroide, ó en el hipotálamo. De una manera alternativa, las células se pueden incorporar en una matriz, y se pueden implantar en el cuerpo, por e emplo, se pueden implantar fibroblastos genéticamente diseñados como parte de un injerto de piel; se pueden implantar células endoteliales genéticamente diseñadas como parte de un injerto vascular. (Ver, por ejemplo, Anderson, y colaboradores, patente de los Estados Unidos No. 5,399,349; y Mulligan y Wilson, patente de los Estados Unidos No. 5,460,959, cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia en su totalidad) . Cuando las células que se van a administrar son células no autólogas, se pueden administrar empleando técnicas bien conocidas que prevengan el desarrollo de una respuesta inmune de la anfitriona contra las células introducidas. Por ejemplo, las células se pueden introducir en una forma encapsulada que, mientras que permita un intercambio de los componentes con el medio ambiente extracelular inmediato, no permita que las células introducidas sean reconocidas por el sistema inmune del anfitrión. En una modalidad alternativa, se puede diseñar una terapia de ganancia de peso para reducir el nivel de expresión del gen obR endógeno, por eiemplo, utilizando planteamientos anti-sentido ó de ribozima, para inhibir ó prevenir la traslación de transcripciones de ARNm de obR; planteamientos de triple hélice para inhibir la transcripción del gen obR, ó recombinación homologa dirigida para inactivar ó "derribar" el gen obR ó su promotor endógeno. Debido a que el gen obR se expresa en el cerebro, incluyendo el plexo coroide y el hipotálamo, las técnicas de aplicación de preferencia deben diseñarse para cruzar la barrera de sangre-cerebro (ver la Publicación Número TCP W089/10134, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad) . De una manera alternativa, las construcciones anti-sentido, de ribozima ó de ADN descritas en la presente, se podrían administrar directamente al sitio que contenga a las células objetivo; por eiemplo, el plexo coroide y/ó el hipotálamo.

Los planteamientos anti-sentido involucran el diseño de oligonucleótidos (bien sea ADN ó ARN) que emplean complementarios para el ARNm de ObR. Los oligonucleótidos anti-sentido se fijarán a las transcripciones de ARNm de obR complementarias, e impedirán la traslación. No se requiere una complementariedad absoluta, aunque se prefiere. Una secuencia "complementaria" para una porción de un ARN, como se refiere en la presente, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para poder hibridarse con el ARN, formando un dúplex estable; en el caso de los ácidos nucleicos anti-sentido de doble cadena, se puede probar de esta manera una sola cadena del ADN dúplex, ó se puede ensayar una formación triplex. La capacidad para hibridarse dependerá tanto del grado de complementariedad, como de la longitud del ácido nucleico anti-sentido. En términos generales, mientras más largo sea el ácido nucleico de hibridación, más malos acoplamientos de base con un ARN puede contener, y todavía formar un dúplex estable (ó triplex, según pueda ser el caso) . Un experto en este campo puede aseverar un grado tolerable de mal acoplamiento, mediante el empleo de procedimientos convencionales para determinar el punto de fusión del complejo hibridado. Los oligonucleótidos que sean complementarios para el extremo 5' del mensaje, por eiemplo, la secuencia no trasladada 5' hasta e incluyendo el codón de iniciación AUG, deben funcionar de una manera más eficiente para inhibir la traslación. Sin embargo, las secuencias complementarias para las secuencias no trasladadas 3 ' de ARNms han demostrado recientemente que son efectivas para inhibir la traslación de ARNms también. Ver en general, Wagner, R. , 1994, Nature 372:333-335. Por consiguiente, se podrían utilizar oligonucleótidos complementarios para cualquiera de las regiones no codificadoras no trasladadas 5 ' ó 3 ' del obR mostrado en la Figura 1 (forma corta de murino) , en la Figura 6 (forma larga de murino) ó en la Figura 3 (forma larga humana) , en un planteamiento anti-sentido, para inhibir la traslación del ARNm de obR endógeno. Los oligonucleótidos complementarios para la región no trasladada 5' del ARNm deben incluir el complemento del codón de inicio AUG. Los oligonucleótidos anti-sentido complementarios para las regiones de codificación del ARNm son inhibidores menos eficientes de la traslación, pero se podrían utilizar de acuerdo con la invención. Ya sea diseñados para hibridarse en 5 ' , en 3 ' , ó en la región de codificación del ARNm de ObR, los ácidos nucleicos anti-sentido deben ser de cuando menos seis nucleótidos de longitud, y de preferencia son oligonucleótidos de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En los aspectos específicos, el oligonucleótido es de cuando menos 10 nucleótidos, de cuando menos 17 nucleótidos, de cuando menos 27 nucleótidos, ó de cuando menos 50 nucleótidos. Independientemente de la elección de la secuencia objetivo, se prefiere que primero se realicen estudios in vi tro para cuantificar la capacidad la capacidad del oligonucleótido anti-sentido para inhibir la expresión del gen. Se prefiere que estos estudios utilicen controles que distingan entre la inhibición del gen anti-sentido, y los efectos biológicos no específicos de los oligonucleótidos. También se prefiere que estos estudios comparen los niveles del ARN objetivo ó la proteína con aquellos de un ARN ó una proteína de control interno. Adicionalmente, se prevé que se comparen los resultados obtenidos utilizando el oligonucleótido anti-sentido, con aquellos obtenidos utilizando un oligonucleótido de control. Se prefiere que el oligonucleótido de control sea de aproximadamente la misma longitud que el oligonucleótido de prueba, y que la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido difiera de la secuencia anti-sentido no más de lo necesario para prevenir la hibridación específica en la secuencia objetivo. Los oligonucleótidos pueden ser ADN ó ARN ó mezclas quiméricas ó derivados ó versiones modificadas de los mismos, de una sola cadena ó de doble cadena. El oligonucleótido se puede modificar en la fracción base, en la fracción de azúcar, ó en la estructura base de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, la hibridación, etc. El oligo-nucleótido puede incluir otros grupos anexados, tales como péptidos (por ejemplo, para dirigir los receptores de la célula anfitriona en vivo) , ó agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular (ver, por ejemplo, Letsinger, y colaboradores, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre, y colaboradores, 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652; la Publicación del TCP Número WO88/09810, publicada el 15 de diciembre de 1988) , ó de la barrera de sangre-cerebro (ver, por ejemplo, la Publicación del TCP Número WO89/10134, publicada el 25 de abril de 1988) , ó los agentes de disociación desencadenada por la hibridación. (Ver, por ejemplo, Krol, y colaboradores, 1988, BioTechniques 6:958-976), ó agentes de intercalación. (Ver, por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549) . Para este fin, el oligonucleótido se puede conjugar con otra molécula, por ejemplo, un péptido, un agente de enlace cruzado desencadenado por la hibridación, un agente de transporte, un agente de disociación desencadenada con la hibridación, etc. El oligonucleótido anti-sentido puede comprender cuando menos una fracción base modificada que se seleccione a partir del grupo que incluye, pero no se limita a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmeti1) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil-uracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometilura-cilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5 ' -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-tiometil-N6-isopenteniladenina, ácido uracilo-5-oxiacético (v) , wibutoxosina, seudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster de ácido metílico de ácido uracilo-5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, y 2 , 6-diaminopurina. El oligonucleótido anti-sentido también puede comprender cuando menos una fracción de azúcar modificada seleccionada a partir del grupo que incluye, pero no se limita a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa. En todavía otra modalidad, el oligonucleótido antisentido comprende cuando menos una estructura base de fosfato modificada seleccionada a partir del grupo que consiste en un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforoamidotioato, un fosforoamidato, un fosforodiamidato, un metilfosfonato, un fosfotriéster alquílico, y un formacetal ó análogo del mismo. En todavía otra modalidad, el oligonucleótido anti-sentido es un oligonucleótido a-anomérico. Un oligonucleótido -anomérico forma híbridos de doble cadena específicos con ARN complementario en donde, contrariamente a las unidades ß usuales, las cadenas corren paralelas una a la otra (Gautier, y colaboradores, 1987, Nucí. Acids Res. 15:6625-6641). El oligonucleótido es un 2 ' -O-metilrribonucleótido (Inoue, y colaboradores, 1987, Nucí. Acids res. 15:6131-6148), ó un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue, y colaboradores, 1987, FEBS Lett. 215:327-330) .

Los oligonucleótidos de la invención se pueden sintetizar mediante métodos convencionales conocidos en este campo, por ejemplo, mediante la utilización de un sintetizador de ADN automatizado (tales como están comercialmente disponibles en Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, los oligonucleótidos de fosforotioato se pueden sintetizar mediante el método de Stein, y colaboradores (1988, Nucí. Acids Res. 16:3209), los oligonucleótidos de metilfosfonato se pueden preparar mediante la utilización de soportes poliméricos de vidrio poroso controlados (Sarin, y colaboradores, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451), etc. Aunque se podrían utilizar nucleótidos anti-sentido complementarios para la secuencia de la región de codificación de obR, se prefieren más aquellos complementarios para la región no trasladada transcrita. Por ejemplo, se pueden utilizar oligonucleótidos anti-sentido que tengan las siguientes secuencias, de conformidad con la invención: a) 5 ' -CATCTTACTTCAGAGAA-3 ' que es complementario para los nucleótidos -14 a +3 en la Figura 3. b) 5 ' -CATCTTACTTCAGAGAAGTACAC-3 ' que es complementario para los nucleótidos -20 a +3 en la Figura 3. c) 5' -CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAA-3 ' que es complementario para los nucleótidos -26 a +3 en la Figura 3. d) 5' -CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCCTCT-3 ' que es complementario para los nucleótidos -32 a +3 en la Figura 3. e) 5' -AATCATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3 que es complementario para los nucleótidos -29 a +6 en la Figura 3. f) 51 -CTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3 que es complementario para los nucleótidos -29 a -1 en la Figura 3. g) 5 ' -TCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3 que es complementario para los nucleótidos -29 a -7 en la Figura 3. h) 5' -AAGTACACCCATAATCC-3 que es complementario para los nucleótidos -29 a -13 en la Figura 3. Las moléculas anti-sentido se deben aplicar a las células que expresen la ObR en vivo, por eiemplo, el plexo coroide y/ó el hipotálamo. Se han desarrollado un número de métodos para aplicar el ADN ó el ARN anti-sentido a las células; por eiemplo, las moléculas anti-sentido se pueden inyectar directamente en el sitio del tejido, ó las moléculas anti-sentido modificadas, diseñadas para dirigirse a las células deseadas (por ejemplo, anti-sentido enlazadas con péptidos ó anticuerpos que fijen específicamente los receptores ó los antígenos expresados sobre la superficie celular objetivo) se pueden administrar sistémicamente . Sin embargo, con frecuencia es difícil alcanzar las concentraciones intracelulares del anti-sentido suficientes para suprimir la traslación de los ARNms endógenos. Por consiguiente, un planteamiento preferido utiliza una construcción de ADN recombinante, en donde el oligonucleótido anti-sentido se pone bajo el control de un fuerte promotor pol III ó pol II. El uso de esta construcción para transfectar las células objetivo en el paciente, dará como resultado la transcripción de cantidades suficientes de ARNs de una sola cadena, que formarán pares de bases complementarios con las transcripciones de obR endógenas, y de esta manera, prevendrán la traslación del ARNm de obR. Por ejemplo, se puede introducir un vector en vivo, de tal manera que sea recuperado por una célula, y dirija la transcripción de un ARN anti-sentido. Este vector puede seguir siendo episomal ó puede llegar a integrarse crornosómicamenté, siempre que se pueda transcribir para producir el ARN anti-sentido deseado. Estos vectores se pueden construir mediante métodos de tecnología de ADN recombinante convencionales en la técnica. Los vectores pueden ser de plásmido, virales u otros conocidos en la técnica, utilizados para la réplica y la expresión en células de mamíferos. La expresión de la secuencia que codifica el ARN antisentido puede ser cualquier promotor conocido en este campo, que actúe en mamíferos, especialmente en células humanas. Estos promotores pueden ser inducibles ó constitutivos. Estos promotores incluyen, pero no se limitan a: la región promotora temprana SV40 (Bernoist y Chambón, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3 ' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto, y colaboradores, 1980, Cell 22:787-797) , el promotor de quinasa de timidina de herpes (Wagner, y colaboradores, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. . 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster, y colaboradores, 1982, Nature 296:39-42), etc. Se puede utilizar cualquier tipo de plásmido, cósmido, YAC ó vector viral para preparar la construcción de ADN recombinante que se pueda introducir directamente en el sitio del tejido; por eiemplo, el plexo coroide ó el hipotálamo. De una manera alternativa, se pueden utilizar vectores virales que infecten selectivamente el tejido deseado; (por ejemplo, para el cerebro, se pueden utilizar vectores de virus de herpes) , en cuyo caso, la administración se puede realizar mediante otra vía (por eiemplo, sistémicamente) . Las moléculas de ribozima diseñadas para disociar catalíticamente las transcripciones de ARNm de obR, también se pueden utilizar para prevenir la traslación del ARNm de obR, y la expresión de ObR. (Ver, por eiemplo, la Publicación Internacional del TCP Número WO90/11364, publicada el 4 de octubre de 1990; Sarver, y colaboradores, 1990, Science 247:1222-1225). Aunque se pueden utilizar ribozimas que disocien el ARNm en las secuencias de reconocimiento específicas del sitio para destruir los ARNms de obR, se prefiere el uso de ribozimas de cabeza de martillo. Las ribozimas de cabeza de martillo disocian los ARNms en localizaciones dictadas por las regiones de flanqueo que forman pares de bases complementarios con el ARNm objetivo. El único requerimiento es que el ARNm objetivo tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3' . La construcción y la producción de ribozimas de cabeza de martillo es bien conocida en la técnica, y se describe más complemente en Haseloff y Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591. Existen cientos de sitios de disociación de ribozima de cabeza de martillo potenciales adentro de la secuencia de nucleótidos del ADNc de obR humano (Figura 3) . De preferencia, la ribozima se diseña de tal manera que el sitio de reconocimiento de disociación se localiza cerca del extremo 5 ' del ARNm de obR; es decir~, para incrementar la eficiencia y minimizar la acumulación intracelular de transcripciones de ARNm no funcionales . Por ejemplo, se pueden utilizar ribozimas de cabeza de martillo que tengan las siguientes secuencias, de conformidad con la invención: a) 5 ' -ACAGAAUUUUUGA(^AAUCAAAGCAGANNNNUCUGAGNAGUCCUUAC UUCAGAGAA-3 ' que disociará el ARNm de obR humano entre los nucleótidos -1 y 1 en la Figura 3. b) 5 ' -GGCCCGGGCAGCCUGCCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCGCCAGA CCGGCUCGUG-3 ' que se disociará entre los nucleótidos -175 y -176 en la Figura 3. c) 5 ' -UGGCAUGCAAGACAAAG(-?GGNNNNCCUGAGNAGUCCUUAAAUCUCC AAGGAGUAA-3 ' que se disociará entre los nucleótidos 102 y 103 en la Figura 3. d) 5 ' -UAUAUGAí-^ ^GCUGUNNNNACAGAGNAGUCCUUGUGUGGUAAAGAC ACG- 3 ' que se disociará entre los nucleótidos 994 y 995 en la Figura 3 . e) 5 ' -AGCACCAAUUGAAUUGAUGGCCAAAGCGGGNNNNCCCGAGNAGUCAA CCGUAACAGUAUGU-3 ' que se disociará entre los nucleótidos 2142 y 2143 en la Figura 3. f) 5 ' -UGAAAUUGUUUCAGGCUCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCAAGAA GAGGACCACAUGUCACUGAUGC-3 ' que se disociará entre los nucleótidos 2736 y 2737 en la Figura 3. g) 5 ' -GGUUUCUUCAGUGAAAUUACACAAAGCAGCNNNNGCUGAGNAGUCAG UUAGGUCACACAUC-3 ' que se disociará entre los nucleótidos 3492 y 3493 en la Figura 3. h) 5 ' -ACCCAUUAUAACACAAAGCUGANNNNUCAGAGNAGUCAUCUGAAGGU UUCUUC-3 ' que se disociará entre los nucleótidos 3521 y 3522 en la Figura 3. Las ribozimas de la presente invención también incluyen endorribonucleasa de ARN (en lo sucesivo "ribozimas tipo Cech"), tales como aquélla que se presenta naturalmente en Tetrahymena Thermophila (conocida como IVS, ó ARN de IVS L-19) , y que ha sido extensamente descrita por Thomas Cech, y colaboradores (Zaug, y colaboradores, 1984, Science, 224:574-578; Zaug y Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug, y colaboradores, 1986, Nature, 324:429-433; solicitud de patente Internacional publicada Número WO 88/04300 por University Patents Inc.; Been y Cech, 1986, Cell, 47:207-216) . Las ribozimas tipo Cech tienen un sitio activo de ocho pares de base que se híbrida en una secuencia de ARN objetivo, después de lo cual, tiene lugar la disociación de la ARN objetivo. La invención abarca aquellas ribozimas tipos Cech que dirigen secuencias de sitio activo de ocho pares de base que están presentes en obR.

Como en el planteamiento anti-sentido, las ribozimas se pueden componer de oligonucleótidos modificados (por eiemplo, para una mejor estabilidad, dirección, etc.), y deben aplicarse a las células que expresen la ObR en vivo, por eiemplo, el hipotálamo y/o el plexo coroide. Un método preferido para aplicar involucra utilizar una construcción de ADN que "codifica" la ribozima bajo el control de un fuerte promotor pol III ó pol II, constitutivo, de tal manera que las células transfectadas produzcan cantidades suficientes de la ribozimas para destruir los mensajes de obR endógenos e inhibir la traslación. Debido a que las ribozimas, a diferencia de las moléculas anti-sentido, son catalíticas, se requiere una concentración intracelular más baja para la eficiencia. La expresión del gen obR endógeno también se puede reducir mediante la inactivación ó la "derribación" del gen obR ó su promotor, utilizando recombinación homologa dirigida, (por eiemplo, ver Smithies, y colaboradores, 1985, Nature 317:230-234; Tomas y Capecchi, 1987, Cell 51:503-512; Thompson, y colaboradores, 1989 Cell 5:313-321; cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia en su totalidad) . Por ejemplo, se puede utilizar una ObR no funcional mutante (ó una secuencia de ADN completamente no relacionada) flanqueada por ADN homólogo para el gen obR endógeno) cualquiera de las regiones de codificación ó de las regiones reguladoras del gen obR) , con ó sin un marcador seleccionable y/ó un marcador seleccionable negativo, para transfectar las células que expresan la ObR en vivo. La inserción de la construcción del ADN por medio de recombinación homologa dirigida, da como resultado la inactivación del gen obR. Estos planteamientos son particularmente adecuados en el campo agrícola, en donde se pueden utilizar modificaciones a las células del ES (tallo embriónico) para generar la progenie animal con una ObR inactiva (por eiemplo, ver Thomas y Capecchi 1987, y Thompson 1989, supra) . Sin embargo, este planteamiento se puede adaptar para utilizarse en seres humanos, en el entendido de que las construcciones de ADN recombinante se administren ó se dirijan directamente al sitio requerido en vivo, utilizando vectores virales apropiados, por eiemplo, vectores de virus de herpes, para aplicarse al tejido del cerebro; por eiemplo, el hipotálamo y/ó el plexo coroide. De una manera alternativa, se puede reducir la expresión del gen obR endógeno, dirigiendo secuencias de desoxirribonucleótidos complementarias para la región reguladora del gen obR, es decir, el promotor y/ó mejoradores de obR para formar estructuras de triple hélice que impidan la transcripción del gen obR en las células objetivo del cuerpo. (Ver en general, Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene C. , y colaboradores, 1992, Ann, N.Y. Accad. Sci., 660:27-36; y Maher, L.J., 1992, Bioassays 14 (12) : 807-15) . En todavía otra modalidad de la invención, se puede reducir la actividad de ObR utilizando un planteamiento "negativo dominante" para efectuar la ganancia de peso. Para este fin, se pueden utilizar construcciones que codifiquen ObRs defectuosas en planteamientos de terapia genética para disminuir la actividad de la ObR en células objetivo apropiadas. Por ejemplo, secuencias de nucleótidos que dirijan la expresión de la célula anfitriona de ObRs, en donde el dominio citoplásmico (por eiemplo, números de residuos de aminoácidos 861-894 de la Figura 1; números de residuos de aminoácidos 861-1162 de la Figura 6; ó números de residuos de aminoácidos 863-1165 de la Figura 3) , ó una porción del dominio citoplásmico (por eiemplo, la secuencia de interacción Jak del cuadro 1; los residuos de aminoácidos 861-884 de las Figuras 1 y 6; ó los residuos de aminoácidos 863-886 de la Figura 3) se suprime ó se muta, se pueden introducir en las células en el plexo coroide ó en el hipotálamo (bien sea mediante los métodos de terapia genética en vivo ó ex vivo descritas anteriormente) . De una manera alternativa, se puede utilizar recombinación homologa dirigida para introducir estas supresiones ó mutaciones en el gen obR endógeno del sujeto, en el hipotálamo ó en el plexo coroide. Las células diseñadas expresarán receptores no funcionales (es decir, un receptor anclado que es capaz de fijar su ligando natural, pero incapaz de transducción de señal) . Estas células diseñadas presentes en el plexo coroide ó en el hipotálamo, deben demostrar una respuesta disminuida al ligando de Ob endógeno, dando como resultado una ganancia de peso. 2. Restauración o Incremento en la Expresión o Actividad de ObR para Promover la Pérdida de Peso Con respecto a un incremento en el nivel de la expresión del gen obR normal, y/ó de la actividad del producto del gen ObR, se pueden utilizar secuencias de ácido nucleico de obR para el tratamiento de desórdenes del peso corporal, incluyendo obesidad. Cuando la causa de obesidad sea una ObR defectuosa, el tratamiento se puede administrar, por ejemplo, en la forma de terapia de reemplazo de gen. Específicamente, se puede insertar una o más copias de un gen obR normal, ó de una porción del gen obR que dirija la producción de un producto de gen obR que exhiba una función normal, en las células apropiadas adentro de un paciente ó de un sujeto animal, utilizando vectores que incluyan, pero no se limiten a, vectores de adenovirus, virus adeno-asociado, retrovirus y virus de herpes, en adición a otras partículas que introduzcan el ADN en las células, tales como liposomas . Debido a que el gen obR se expresa en el cerebro, incluyendo el plexo coroide y el hipotálamo, estas técnicas de terapia de reemplazo de gen deben ser capaces de aplicar secuencias del gen obR a estos tipos de células adentro de los pacientes. Por consiguiente, se deben diseñar las técnicas para aplicar las secuencias del gen obR, para cruzar fácilmente la barrera de sangre-cerebro, que son bien conocidas por los expertos en este campo (ver, por eiemplo, la publicación de la Solicitud TCP Número WO89/10134, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad) , ó, alternativamente, deben involucrar la administración directa de estas secuencias del gen obR al sitio de las células en donde se vayan a expresar las secuencias del gen obR. De una manera alternativa, se puede utilizar una recombinación homologa dirigida para corregir el gen obR endógeno defectuoso en el tejido apropiado; por eiemplo, en el plexo coroide y/ó en el hipotálamo. En los animales, se puede utilizar la recombinación homologa dirigida para corregir el defecto en las células ES, con el objeto de generar la progenie con un rasgo corregido. Los métodos adicionales que se pueden utilizar para incrementar el nivel total de expresión del gen obR y/ó de la actividad de ObR incluyen la introducción de células que expresen ObR apropiadas, de preferencia células autólogas, en un paciente, en posiciones y en números que sean suficientes para aminorar los síntomas de los desórdenes del peso corporal, incluyendo la obesidad. Estas células pueden ser recombinantes ó no recombinantes. Entre las células que se pueden administrar para incrementar el nivel total de la expresión del gen obR en un paciente, son células normales, de preferencia células del plexo coroide, ó células del hipotálamo que expresen el gen obR. Las células se pueden administrar en el sitio anatómico del cerebro, ó como parte de un injerto de tejido localizado en un sitio diferente del cuerpo. Estas técnicas de terapia genética basadas en las células son bien conocidas por los expertos en este campo, ver por eiemplo, Anderson, y colaboradores, patente de los Estados Unidos No. 5,399,349; Mulligan y Wilson, patente de los Estados Unidos No. 5,460,959. Finalmente, se pueden utilizar compuestos, identificados en los ensayos descritos anteriormente, que estimulen ó mejoren la señal transducida por la ObR activada, por eiemplo, mediante la activación de las proteínas de señalización corriente abajo en la cascada de ObR, y derivando de esta manera la ObR defectuosa, para alcanzar la pérdida de peso. La formulación y el modo de administración dependerán de las propiedades físico-químicas del compuesto. La administración debe incluir técnicas conocidas que permitan cruzar la barrera de sangre-cerebro. G. Preparaciones Farmacéuticas v Métodos de Administración Los compuestos que se determinen que afectan la expresión del gen obR, ó la actividad de ObR, se pueden administrar a un paciente en dosis terapéuticamente efectivas para tratar ó aminorar los desórdenes de peso, incluyendo obesidad, caquexia y anorexia. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad del compuesto suficiente para dar como resultado la aminoración de los síntomas de los desórdenes del peso corporal . 1. Dosis Efectiva La toxicidad y la eficacia terapéutica de estos compuestos se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares ó en animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50 por ciento de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50 por ciento de la población) . La proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos, es el índice terapéutico, y se puede expresar como la proporción LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiban grandes índices terapéuticos. Aunque se pueden utilizar compuestos que exhiban efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado de diseñar un sistema de aplicación que dirija estos compuestos hasta el sitio del tejido afectado, con el objeto de minimizar el daño potencial a las células no infectadas, y de esta manera reducir los efectos secundarios . Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y de los estudios de animales, se pueden utilizar en la formulación de un rango de dosificaciones para utilizarse en seres humanos. La dosificación de estos compuestos está de preferencia dentro de una escala de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca ó ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango, dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Se puede formular una dosis en modelos animales para alcanzar un rango de concentración en plasma circulante que incluya la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logre una inhibición media-máxima de los síntomas) , como se determine en el cultivo celular. Esta información se puede utilizar para determinar más precisamente las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía de líquido de alto rendimiento. 2. Formulaciones y Uso Las composiciones farmacéuticas para utilizarse de conformidad con la presente invención, se pueden formular de una manera convencional, utilizando uno ó más vehículos ó excipientes fisiológicamente aceptables . Por consiguiente, los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables, se pueden formular para administrarse mediante inhalación ó insuflación (bien sea a través de la boca ó de la nariz), ó administración oral, bucal, parenteral ó rectal. Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas ó cápsulas preparadas mediante medios convencionales, con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de fijación (por eiemplo, almidón de maíz previamente gelatinizado, polivinilpirrolidona, ó hidroxipropilmetilcelulosa) ; rellenos (por eiemplo, lactosa, celulosa microcristalina ó fosfato ácido de calcio) ; lubricantes (por eiemplo, estearato de magnesio, talco ó sílice) ; desintegrantes (por eiemplo, almidón de papa ó glicolato de almidón de sodio) ; ó agentes humectantes (por eiemplo, laurilsulfato de sodio) . Las tabletas se pueden recubrir mediante métodos bien conocidos en este campo . Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes ó suspensiones, ó se pueden presentar como un producto seco para constituirse con agua u otro vehículo adecuado antes de usarse. Estas preparaciones líquidas se pueden preparar mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (por eiemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa ó grasas comestibles hidrogenadas) ; agentes emulsionantes (por eiemplo, lecitina ó acacia) ; vehículos no acuosos (por eiemplo, aceite de almendras, esteres aceitosos, alcohol etílico ó aceites vegetales fraccionados) ; y conservadores (por eiemplo, p-hidroxibenzoato de metilo ó de propilo, ó ácido sórbico) . Las preparaciones también pueden contener sales reguladoras del pH, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes, según sea apropiado. Las preparaciones para administración oral pueden formularse adecuadamente para dar una liberación controlada del compuesto activo. Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas ó grageas formuladas de una manera convencional . Para administrarse mediante inhalación, los compuestos para utilizarse de conformidad con la presente invención, se aplican convenientemente en la forma de una presentación de rocío en aerosol a partir de paquetes presurizados, ó un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por eiemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetra-fluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para aplicar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por eiemplo, gelatina, para utilizarse en un inhalador ó insuflador, se pueden formular conteniendo una mezcla en polvo del compuesto, y una base de polvo adecuada, tal como lactosa ó almidón. Los compuestos se pueden formular para administración parenteral mediante inyección, por eiemplo , mediante inyección de bolo ó infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en una forma de dosificación unitaria, por eiemplo, en ampolletas ó en recipientes de múltiples dosis, con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar formas, tales como suspensiones, soluciones ó emulsiones, en vehículos aceitosos ó acuosos, y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, de estabilización y/ó de dispersión. De una manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en una forma de polvo para constituirse con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua exenta de pirógeno estéril, antes de usarse. Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales, tales como supositorios ó enemas de retención, por ejemplo, que contengan bases de supositorio convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos. En adición a las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos también se pueden formular como una preparación de depósito. Estas formulaciones de larga acción se pueden administrar mediante implantación (por ejemplo, subcutáneamente ó intramuscularmente) , ó mediante inyección intramuscular. Por consiguiente, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos ó hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) , ó resinas de intercambio de iones, ó como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble. Si se desea, las composiciones se pueden presentar en un paquete ó en un dispositivo dosificador, que puede contener una ó más formas de dosificación unitarias que contengan al ingrediente activo. El paquete, por ejemplo, puede comprender lámina metálica ó de plástico, tal como un paquete de ampolla. El paquete ó el dispositivo dosificador puede estar acompañado por instrucciones para su administración. V . Eiemplo: Localización en el Sitio de ObR En el ejemplo presentado en la presente, se demuestra, mediante estudios de fijación con proteínas de fusión de Ob (leptina) -fosfatasa alcalina (AP) , que está presente un receptor de Ob de alta afinidad en el tejido del plexo coroide del mamífero. Además, se demuestra que la fijación de la proteína de fusión observada fue específica de Ob, y no debida a un artificio basado en fosfatasa alcalina no específico. A. Materiales y Métodos Construcción y Expresión de Proteínas de Fusión de Ob-Fosfatasa Alcalina. Se generaron dos tipos de proteína de fusión. Específicamente, se generaron proteínas de fusión Ob-AP, en donde la porción AP estaba en el término carboxilo de la proteína de fusión, y se generaron proteínas de fusión AP-Ob, en donde la porción AP estaba en término amino de la proteína de fusión. Para producir construcciones de fusión Ob-AP y AP-Ob de ratón y humanas, se amplificaron las secuencias del ADNc mediante procedimientos de reacción en cadena de polimerasa convencionales. Para las fusiones de Ob-AP ó de ratón y humana, se amplificaron respectivamente las secuencias de nucleótidos que codifican todos los marcos de lectura abierta de Ob de ratón y humana, a partir de los ADNcs correspondientes. Los sitios de restricción en el extremo de los cebadores de amplificación se cortan con HindIII y BamHl (ratón) , y se insertan en el sitio del polienlazador de HindIII-BglII de APtag-2, ó BamHl y Bglll (humano) , y se insertaron en el sitio Bglll de APtag-2. Para las construcciones de fusión de AP-Ob de ratón y humana, primero se generó un nuevo vector de fusión AP que expresaba una molécula AP con su propio péptido de señal (APtag-3) , reemplazando las secuencias entre los sitios HindIII y Xhol de APtag-2 con secuencias amplificadas con reacción en cadena de polimerasa de la fosfatasa alcalina placentaria secretada (incluyendo la secuencia de señal) . Se colocó un sito Bglll, de tal manera que las fusiones introducidas en este sitio estuvieran adentro del marco con la proteína AP. Entonces se amplificaron con reacción en cadena de polimerasa las secuencias de las formas maduras predichas de Ob de ratón y humana, a partir de los ADNcs correspondientes. Se cortaron los sitios de restricción en el extremo de los cebadores de amplificación con BamHl y Bglll, y se insertaron en el sitio Bglll de APtag-3. Cada plásmido se transfectó transitoriamente en células COS-7 (11.25 µg/plato de 150 milímetros). Las células se cultivaron hasta la confluencia, y luego se acondicionó el medio durante 3 días. Entonces las células se centrifugaron, se filtraron a través de 0.45 mieras, y se almacenaron a 4°C con 20 mM de Hepes (pH de 7.0) , y azida de sodio al 0.05 por ciento. Los medios acondicionados se probaron y se cuantificaron para determinar la actividad de AP en un lector de plato de 96 cavidades, como es descrito por Flanagan y Leder (Flanagan, J.G. y Leder, P., 1990, Cell 63.: 185-194) , con la excepción de que se omitió la homoarginina de todos los ensayos . Fijación de Protexna de Fusión en el Sitio. Los cerebros de ratón en cuarto, el plexo coroide aislado, las células y las líneas celulares, se enjuagaron una vez con HBHA (solución de cal equilibrada de Hank con 0.5 miligramos/mililitro de albúmina de suero bovino, NaN3 al 0.1 por ciento, 20mM de HEPES [pH de 7.0] ) , en platos de 12 cavidades. Luego el tejido se incubó con los sobrenadantes del cultivo de tejido que contenía la fusión AP-Ob, la fusión Ob-AP, ó los sobrenadantes de control (es decir, sobrenadantes que contenían AP no fundida solamente, que contenían proteínas de fusión AP-OB, u OB-AP más un exceso molar de 80 veces de la OB recombinante derivada a partir de E. coli, ó sobrenadantes de célula COS transfectadas de una manera simulada) , durante 75 minutos, con una rotación ligera a la temperatura ambiente . Las muestras se trataron luego como se describió anteriormente (Cheng, H.J. y Flanagan, J.G., 1994, Cell 79:157-168) . B. Resultados Para buscar el receptor de Ob, se construyeron proteínas de fusión de Ob fosfatasa alcalina, que permitirían la detección colorimétrica de la fijación de Ob. Específicamente, se insertaron moléculas de ADNc que codificaban las proteínas Ob de ratón y humana, en los vectores de expresión APtag-2 y APtag-3, como se describió anteriormente en la Sección 6.1. La inserción en el vector de expresión APtag-2 dio como resultado una proteína de fusión con Ob en el término N de la proteína de fusión, y fosfatasa alcalina (AP) placentaria en el término C. La proteína de fusión resultante es referida como Ob-AP. La inserción en el vector APtag-3, dio como resultado proteínas de fusión con AP en el término N, fundidas con la forma madura predicha de la proteína Ob en el término C. La proteína de fusión resultante es referida como AP-Ob. Ambas formas de proteínas de fusión de murino se secretaron, y ambas se produjeron en el peso molecular predicho de aproximadamente 81 kDa. Se emplearon varias estrategias en un esfuerzo por identificar las células ó los tejidos que expresaban el receptor de Ob. Cada una de las células, líneas celulares y tejidos probados, como se describió en la presente, estuvieron cuando menos potencialmente involucrados en la regulación del peso corporal . La primera estrategia empleada fue tratar de dirigir ensayos de fijación con las proteínas de fusión Ob-Ap y AP-Ob. Las líneas celulares examinadas mediante esta estrategia incluyeron las líneas celulares placentarias Be Wo (ATCC No. CCL98) y JAR (ATCC No. HTB144) ; las líneas celulares de músculo L6 (ATCC No. CRL1458) y BC3H (ATCC No. CRL1443) ; las líneas celulares neurales PCI2 (ATCC No. CRL1721) y NB41A3 (ATCC No. CCL147) ; la línea celular de preadiposa 3T3-L1 (ATCC No. CRL173) ; y la línea celular de hígado Hepal-6 (ATCC No. CRL1830) . Mediante este método, también se probaron los cultivos primarios a partir de hipotálamo, y los cultivos primarios a partir de cerebelo. Ninguno de estos estudios produjo resultados de fijación positivos.

Segundo, se hicieron intentos por identificar las líneas celulares que expresaban el receptor de Ob, examinando los cambios en la expresión del gen en respuesta a la presencia de la proteína Ob recombinante. Aquí la racionalización fue que los cambios en la expresión del gen, ya sea en la expresión del gen obR, ó bien en la expresión de los genes más corriente abajo en la trayectoria de transducción de señal relacionada con Ob/ObR, identificarían las células en donde estuviera presente la ObR. Este análisis se hizo mediante análisis de exhibición diferencial convencional (ver Pardee, y colaboradores, patente de los Estados Unidos No. 5,262,311) de ARN derivado a partir de células tratadas con Ob ó no tratadas. Dicho de una manera breve, se aisló el ARN de las células que se habían ó no expuesto a Ob, y se amplificó por medio de reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa, de una manera que permitió hacer una comparación cuantitativa directa de los niveles de transcripciones individuales presentes en el ARN derivado a partir de las líneas celulares tratadas con Ob en relación con las no tratadas con Ob. Las líneas celulares de Ob probadas mediante este planteamiento fueron INS-1, 3T3-L1, Hepal-6, L6, PC12, NB41A3 y BC3H. En adición, también se probaron cultivos hipotalámicos primarios . Ninguna de las células probada exhibió una diferencia cuantitativa detectable en el patrón de expresión, basándose en si las células habían sido tratadas ó no con Ob. Tercero, se hicieron intentos por identificar las células que expresaban el receptor de Ob, mediante el tratamiento de las células con proteína Ob recombinante, y ensayando para determinar los signos de la activación de la trayectoria de transducción de señal. De una manera específica, se monitorearon los cambios de cAMP por medio de recuperación con 3H, y se ensayaron los cambios de fosforilación de tirosina por medio de manchas Western, tratadas con anticuerpos anti-fosfotirosina. Se examinaron más de veinte líneas celulares de esta manera. Específicamente, estas líneas celulares incluyeron las líneas celulares de ratón Yl (corteza adrenal; ATCC No. CCL79) , BC3H (tumor de músculo liso-cerebro; ATCC No. CRL1443) , P19 (carcinoma embrionario; ATCC No. CRL1825) , 3T3L1 (preadipocito; ATCC No.

CRL173), Hepal-6 (hepatoma; ATCC No. CRL1830) , C2C12 (mioblasto; ATCC No. CRL1772) , NMUMG (glándula mamaria, epitelio normal; ATCC No. CRL1636) , MM5MT (glándula mamaria; ATCC No. CRL1637) , NB41A3 (neuroblastoma; ATCC No. CCL147) , AtT20 (pituitaria; ATCC No.

CCL89) , N MU Ll (hígado; ATCC No. CRL 1638), BNL CL2 (hígado; ATCC N. TIB73), y NCTC-1469 (hígado; ATCC No. CCL91) ; líneas celulares de rata, incluyendo L6 (mioblasto; ATCC No. CRL1458) , PC12 (cromafina adrenal; ATCC No. CRL1721) , y H-4-II-E (hepatoma; ATCC No. CRL1548) ; y líneas celulares humanas, incluyendo SW872 (liposarcoma; ATCC No. HTB92) , Hepa G2 (hígado; ATCC No . HB8065) , y líneas celulares de neuroblastoma, incluyendo SK-N-SH (ATCC No.

HTB11) . Aquí nuevamente, no se observaron diferencias dependientes de Ob en ninguna de las células probadas.

Después de un extensa búsqueda de líneas celulares y tejidos de mamífero, se cortaron en cuartos los cerebros de ratón adultos, se trataron con proteína de fusión AP-Ob, se lavaron, y se probaron para determinar la actividad de AP fijada de la proteína de fusión, utilizando técnicas histológicas, como se describió anteriormente en la Sección 6.1. Se observó una fijación reproducible de la proteína de fusión AP-Ob en el plexo coroide de cerebro de roedor (adentro del ventrículo lateral y del tercer ventrículo cerebral) . Sin embargo, no se observó teñido de AP-Ob en los tejidos de cerebro que rodeaban al plexo coroide . El plexo coroide es un tej ido en gran parte responsable de la generación del fluido espinal cerebral. Además, se considera que el tejido del plexo coroide es uno de los "guardianes" de la barrera de sangre-cerebro . Se realizó teñido de AP de control en tejidos tratados con AP no fundida, y en tejidos que se habían tratado con AP-Ob en la presencia de un exceso de Ob no fundida agregada para competir por la fijación de la proteína de fusión. No se observó un teñido similar al observado para la proteína de fusión AP-Ob en cualquiera de estos controles, demostrando que la fijación de AP-Ob era específica de Ob, y no debida a un artificio basado en AP. Por consiguiente, en resumen, solamente después de emplear varias estrategias, se localizó una molécula de superficie celular que fija la Ob; y esta molécula de superficie celular se encontró adentro de una región específica del cerebro, el plexo coroide. VII. Eiemplo; Clonación del Gen ObR de Murino Más adelante, en la Sección 7.2.1, se describe la clonación de éxito de un ADNc de receptor de Ob de forma corta, famj5312, a partir de bibliotecas de expresión construidas utilizando ARN de plexo coroide de murino. Las bibliotecas de expresión se rastrearon utilizando fijación de proteína de fusión AP-Ob, como se describió anteriormente en el Ejemplo presentado en la Sección 6. La Sección 7.2.2, más adelante, describe la secuencia de nucleótidos de la región de codificación del receptor Ob de forma corta, y además, describe la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora de forma corta Ob. La Sección 7.2.3, más adelante, describe los estudios de fijación competitiva, que demuestran que la proteína codificada por el ADNc aislado, codifica un receptor que exhibe una fijación de alta afinidad, tanto para proteína Ob de ratón como humana. La Sección 7.2.4 describe estudios que verifican la autenticidad de la clona de ADNc de obR aislado. La fijación de Ob de alta afinidad exhibida por la ObR, acoplada con su homología con la familia de receptores de citoquina Clase I, como se describe, más adelante, indica que la ObR está involucrada en el control del peso corporal del mamífero, por medio de la transducción de señal desencadenada por su fijación al ligando de Ob.

A. Materiales y Métodos Aislamiento de ARNm de Plexo Coroide. Se aisló ARN total a partir de 300 plexos coroides de ratón en lotes de 100, utilizando el método de isotiocianato de guanidinio/CsCl de Chirg in, y colaboradores (1979, Biochemistry 1_8:5294) como es descrito por R. Selden en Current Protocols for Molecular Biology (4.2.3 Suplemento 14) . Después de la cuantificación, el ARN se diluyó hasta 1 miligramo/mililitro en agua desionizada destilada, y se incubó durante 30 minutos a 37°C con un volumen igual de solución de ADNsa (20 mM de MgCl2, 2 mM de DTT, 0.1 unidades de ADNsa, 0.6 unidades de inhibidor de ARNsa en TE) , para remover el ADN contaminante. El ARN se extrajo con fenol/cloroformo/iso-amilo, y se precipitó en etanol. Después de la cuantificación a 260 nanómetros, se pasó por electroforesis una alícuota para verificar la integridad. Se purificó un total de 320 microgramos de ARN total. Se aisló ARN de poli A+ utilizando un estuche Oligotex-dT (número de catálogo 70042) de Qiagen (Chats orth, CA) como es descrito por el fabricante. Después de la cuantificación, el ARNm se precipitó en etanol, y se volvió a suspender en un miligramo/ mililitro de agua tratada con DEPC, desionizada, destilada. Se purificó un total de 11 microgramos de ARN de poli A+ . Construcción de la Biblioteca. Se sintetizó ADNc de acuerdo con el método de Gubler y Hoffman (Gene, 1983, 25: 263) utilizando un estuche de síntesis de ADNc de Plásmido Superscript (Número de Catálogo Serie 8248) adquirido en Life Technologies (Gaithersburg, MD) . El ADNc obtenido se ligó en los sitios NotI/Sal I del vector de expresión de mamífero pMET7, una versión modificada del pME18S, que utiliza el promotor SR , como se describió anteriormente (Takebe, Y., y colaboradores, 1988, Mol. Cel. Bio. 8.:466) . Este vector se seleccionó debido a que contiene un fuerte promotor ecuariótico, se expresa en las células C0S7, contiene el gen de resistencia AMP, y solamente es de 3.0 kb de longitud. El tamaño pequeño del vector es importante, debido a que incrementa la probabilidad de clonar ADNcs grandes. Otros vectores comparables son de 4.8 kb y más grandes, incrementando de esta manera las oportunidades de una réplica imperfecta, y reduciendo la probabilidad de clonar ADNcs grandes. El ADNc ligado se precipitó en etanol, y se volvió a suspender en agua tratada con DEPC desionizada y destilada, en 25 nanogramos/ mililitro. Se transformó 1 microlitro del ADN mediante electroincorporación por 40 microlitros de E^ coli DH10B electrocompetente en una cubeta de 0.1 centímetros. El ADNc se sintetizó dos veces, y se utilizó para construir dos bibliotecas de plexo coroide de ratón independientes: mCP (plexo coroide de ratón) A, y mCP D. Preparación del ADN. Basándose en las titulaciones de las transformaciones del ADNc, se inocularon platos de 96 cavidades profundas, con 150 unidades formadoras de colonias/cavidad de transformantes primarios en 1 mililitro de LB-amp. Los transformantes primarios crecieron solamente 1 hora a 37°C antes de que se utilizara la formación de alícuotas para evitar el sobre-crecimiento de las clonas de inserto más pequeñas y, por consiguiente, la sub-representación de las clonas más grandes en los grupos de 150 unidades formadoras de colonias. Los cultivos se cultivaron de 15 a 16 hora a 37°C con aireación. Antes de la preparación, se removieron 100 microlitros de suspensión celular, y se agregaron a 100 microlitros de glicerol al 50 por ciento, se mezclaron y se almacenaron a -80°C (plato de congelación de glicerol) . El ADN se preparó utilizando los WizardMR Minipreps DNA Purification Systems (Promega, Madison, Wl; Número de Catálogo A7100) , empleando modificaciones para un formato de 96 cavidades. El protocolo fue como sigue: 1) Los cultivos se centrifugaron en un plato de 96 cavidades profundas a 3200 rpm durante 10 minutos a 4°C. Se removieron los sobrenadantes . 2) Se agregaron 140 microlitros de cada solución de resuspensión celular (40 mM Tris-HCl, pH de 7.5 , 10 mM EDTA, 100 microgramos/mililitro de ARNsa A) , solución de lisis celular (0.2 M NaOH; SDS al 1.0 por ciento), y solución de neutralización (1.32 M de acetato de potasio, pH de 4.8), en orden, con remolino, 14 segundos después de la adición de cada reactivo, para asegurar una buena mezcla. 3) Los platos se colocaron en agua helada durante 15 minutos . 4) Las muestras se centrifugaron a 3200 rpm durante 10 minutos a 4°C. 5) Los sobrenadantes se transfirieron a un plato de filtro de polipropileno Polyfiltronics de 96 cavidades (10 mieras, 0.8 mililitros). 6) Se agregaron 500 microlitros de resina WP, y se incubaron de 3 a 5 minutos a la temperatura ambiente; se aplicó succión al plato. 7) Las muestras se lavaron tres veces cono 640 microlitros de la solución de resuspensión. 8) Las muestras se centrifugaron a 3200 rpm durante minutos a la temperatura ambiente, para remover el regulador del pH residual. 9) Las muestras se eluyeron de 2 a 5 minutos con 40 microlitros de agua a la temperatura ambiente . 10) El ADN eluido se centrifugó a través del plato de microcavidades a 3200 rpm durante 5 minutos a la temperatura ambiente . 11) Se cuantificó el ADN. Estrategia de Agrupación. La estrategia de agrupación se ideó para proporcionar grupos de tamaño óptimo, de 1200 unidades formadoras de colonias, para la transfección y la detección, y el rompimiento rápido hasta grupos más pequeños de 150. Una vez que se identificó un grupo positivo de 150, se necesitaron entre 400 y 800 clonas individuales para proporcionar la representación del grupo. La utilización de un solo grupo de 1200 unidades formadoras de colonias inicialmente, habría significado menos sondas de ADN, pero habría requerido el uso de más clonas individuales (3200-6400) en el paso de identificación final, requiriendo de esta manera de significativamente más tiempo para identificar una clona positiva. Los ADNs que totalizaban 5 microgramos, se agruparon igualmente a partir de ocho cavidades, una columna, para dar un total de 100 unidades formadoras de colonias. Por consiguiente, cada plato de 96 cavidades dio lugar a 12 ADNs agrupados para la transfección en células COS-7. Cuando se identificó un grupo positivo, se preparó ADN a partir de cada una de las ocho cavidades que constituían el grupo, y se retransfectó en células COS-7. Cuando se identificó una cavidad positiva, la cavidad se descompuso recubriendo una alícuota de la congelación de glicerol de esa cavidad, de tal manera que se obtuvieran varios miles de colonias individuales. Para cavidad positiva, se recogieron entre 400 y 800 colonias, y se arreglaron en un formato de 96 cavidades, se obtuvo el ADN como se describió anteriormente, y se agrupó el ADN de 24 cavidades para la transfección. El ADN que representaba cada clona individual desde una hilera positiva se aisló y se transfectó para la identificación final. Análisis Cuantitativo de Fijación a Superficie Celular de Ob. Se realizaron ensayos cuantitativos de fijación de superficie celular con proteínas de fusión AP-Ob, esencialmente como se describió anteriormente para el Estuche AP (Flanagan, J.G. y Leder, P., 1990, Cell £3:185-194). Protexna Ob . La proteína Ob de murino recombinante utilizada en la presente se ha descrito anteriormente (Campfield, y colaboradores, 1995, Science 2.69.: 546-549) . La proteína Ob humana recombinante utilizada en la presente se purificó a partir de sobrenadantes de Baculovirus, con una columna de anticuerpo monoclonal que contenía anticuerpo monoclonal dirigido contra la Ob humana. La proteína Ob humana recombinante purificada se juzgó mediante teñido con azul Coomasie convencional, para ser más del 95 por ciento pura. Secuenciamiento del ADN. El secuenciamiento y el ensamble de la secuencia se realizaron como se describió anteriormente (International Polycystic Kidney Consortium, 1995, Cell 81 : 289-298) . Análisis Northern. El análisis de mancha Northern de ARNm de poli A+ de diferentes tejidos (Clontech) se sondeó, utilizando técnicas estándar (Chirgwin, J.M. , y colaboradores, 1979, Biochemistry 18.: 5294-5299) , con ADN etiquetado amplificado a partir de las secuencias que codificaban el dominio extracelular de ObR de murino . Reacción en Cadena de Polimerasa de Transcriptasa Inversa. Se realizaron reacciones en cadena de polimerasa de transcripción inversa (rt-PCR) sobre 1 microgramo de ARN total, utilizando técnicas convencionales (Zhang, Y., y colaboradores, 1994, Nature ¿72.: 425-432) . Específicamente, se preparó el ADNc de la primera cadena utilizando hexámeros aleatorios. El ADNc de la primera cadena se amplificó entonces con reacción en cadena de polimerasa utilizando cebadores derivados a partir de secuencias que codificaban el dominio extracelular de ObR, ó cebadores de control G3PDH. B. Resultados 1. Clonación del Receptor de Ob a Partir de Plexo Coroide de Ratón La fuerte fijación específica a Ob de la proteína de fusión AP-Ob al plexo coroide de murino descrita anteriormente, en el Ejemplo presentado en la Sección 6, sugirió que se podía expresar un receptor de Ob en altos niveles adentro de este tejido. Con el objeto de tratar de clonar un ADNc que codificada el receptor de Ob, por consiguiente, se disectaron plexos coroides de 300 ratones, y se aislaron un total de 11 microgramos de ARN de poli A+ a partir del tejido que se iba a utilizar para construir las bibliotecas de ADNc descritas anteriormente, en la Sección 7.1 Inicialmente, se utilizaron 3 microgramos de poli A+ para generar el ADNc, para utilizarse en la construcción de la biblioteca de ADNc de plexo coroide de ratón A. Todos los ADNcs generados que eran mayores de un tamaño de 500 pares de base (261 nanogramos) se agruparon, y se ligaron 90 nanogramos a pMET7. La transformación de este ADNC ligado en E. coli DH10B electro-competente, dio como resultado una biblioteca de aproximadamente 7.2 x 105 unidades formadoras de colonias, con un tamaño promedio de 1 kb. Reconociendo que la biblioteca de ADNc A no contenía un número suficiente de clonas que contuvieran insertos suficientemente grandes para codificar un receptor a una frecuencia estadísticamente razonable, se utilizó un segundo ARN de poli A+ en 3 microgramos, para generar 758 nanogramos de ADNc. Se agruparon 32 nanogramos de ADNc que representaban las dos fracciones más grandes del ADNc, y se ligaron en pMET7. La transformación de estas moléculas de ADNc ligadas dio como resultado la biblioteca de plexo coroide de ratón D, con 2.4 x 105 unidades formadoras de colonias, y un tamaño de inserto promedio de 2 kb. Utilizando solamente las dos fracciones más grandes de ADNc, se aseguró que la biblioteca se forzara hacia los ADNcs grandes. Esto se confirmó mediante la caracterización de los tamaños de insertos de diez clonas; siete clonas tuvieron insertos mayores que 2 kb de longitud, y no se vieron clonas con insertos menores de 1 kb. Esto contrastó con la biblioteca A, en donde 16 de 20 clonas eran más pequeñas que 1 kb. Se preparó ADN que representaba 6 x 105 unidades formadoras de colonias (40 placas) , y se agruparon de la biblioteca de plexo coroide de ratón A. Se preparó ADN que representaba 2.4 x 105 unidades formadoras de colonias (16 placas) de la biblioteca de plexo coroide de ratón D. Para propósitos de rastreo, las bibliotecas se produjeron como grupos de 150 clonas, utilizándose una mezcla de 8 grupos en cada transfección (es decir, 1200 clonas/trans-fección) . El ADN se transfectó transitoriamente en células COS-7, y las células se rastrearon mediante incubación con sobrenadantes que contenían la proteína de fusión AP-Ob de murino, se lavaron, y se tiñeron para determinar la actividad de AP en el sitio, todo como se describió anteriormente en las Secciones 6.1 y 6.2. Una vez que se identificó un grupo positivo, los 8 subgrupos individuales se probaron cada uno por separado, y el subgrupo positivo resultante se subdividió adicionalmente, hasta que se identificó una sola clona positiva. Se derivaron un total de 632 grupos de ADN a partir de las bibliotecas A y D, identificándose un total de 10 grupos positivos independientes. Todos estos grupos positivos se descompusieron con éxito en los subgrupos de 150 clonas cada uno, y un subgrupo positivo se subdividió adicionalmente hasta que se identificó una sola clona positiva. La clona, que contenía un inserto de ADNc de 5.1 kB, se designó como famj5312. . El Receptor de Ob (ObR) y el Gen ObR La clona de ADNc de obR de murino famj5312 aislado, como se describió anteriormente en la Sección 7.2.1, contenía un inserto de aproximadamente 5.1 kb. La secuencia de nucleótidos obtenida a partir de esa clona se ilustra en la Figura 1 (SEQ ID N0:1). La secuencia de nucleótidos de la clona reveló un solo marco de lectura abierta, la secuencia de aminoácidos derivada de ObR que también se ilustra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) . La secuencia de 894 aminoácidos deducida de la proteína ObR de murino, empieza con una metionina, cuyo codón está adentro de una secuencia de ADN que es consistente con un sitio de iniciación de traslación. La secuencia de aminoácidos de ObR empieza con una secuencia de señal hidrofóbica a partir de los residuos de aminoácidos 1-23, típicos de las proteínas que van a asociarse con la membrana ó se van a secretar. La proteína receptora de Ob de murino contiene un solo dominio transmembrana hidrofóbico a partir de los residuos de aminoácidos 838-860, indicando que el receptor de Ob se extiende en la membrana celular una vez . La posición del dominio transmembrana indica que la porción extracelular de la proteína ObR de murino madura se extiende desde el residuo de aminoácido 24 hasta el residuo de aminoácido 837. Una búsqueda en la base de datos revela que el domino extracelular de ObR contiene regiones de homología que ponen la ObR en la familia de receptores de citoquina Clase I (para revisiones, ver, por eiemplo, Heldin, C.-H., 1995, Cell 80:213-223; y Kishimoto, T. y Tetsuya, T., 1994, Cell 76:253- 252) . La ObR parece estar más estrechamente relacionada con el componente de transducción de señal gpl30 del receptor de IL-6, el receptor GSF y el receptor de LIF. Los estudios de alineación de las secuencias de aminoácidos de ObR y gpl30 revelaron que, aunque la identidad de secuencia total entre las dos proteínas es baja, son claramente evidentes por los residuos de cisteína conservados característicos, el motivo Trp-Ser-X-Trp-Ser, y otros residuos de aminoácidos conservados adentro de la familia de la Clase I de proteínas . En seguida del único dominio transmembrana, la proteína Obr de murino contiene un dominio citoplásmico corto de 34 aminoácidos (es decir, los residuos de aminoácidos 861-894) . Las comparaciones de homología también revelan que los primeros veintitrés aminoácidos del domino citoplásmico de ObR, muestran una identidad del 30 por ciento con las secuencias proximales de membrana del receptor de LIF : La amplificación de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa del ARNm de obR a partir de ARN total, confirmó la presencia de la transcripción de obR (una sola banda de aproximadamente 5kb) en el plexo coroide, y también demostró su presencia en el hipotálamo. Además, el análisis de mancha Northern de ARN de poli A+ derivado a partir de varios tejidos de ratón, reveló que el ARNm de obR está presente en tejidos adicionales, tales como pulmón y riñon. 3. El Receptor de Ob Fija Fuertemente la Protexna Ob Se condujo un análisis de la fijación de AP-Ob a la ObR codificada por el ADNc obR descrito anteriormente en la Sección 7.2.2. Los resultados de este análisis, ilustrados en la Figura 2, demuestran que la ObR exhibe una fuerte fijación específica de Ob a la proteína Ob, tanto de ratón como humana. En la Figura 2 se muestra un análisis cuantitativo de la fijación de las proteínas de fusión AP. Después de la transfección transitoria de la clona ObR en células COS, se detecta una fuerte fijación de AP-Ob de murino 1 nM (en relación con las células COS transfectadas simuladamente, o las células COS transfectadas con ObR incubadas con AP no fundidas (Figura 2A) . Esta fijación se inhibe casi completamente mediante la proteína de leptina de ratón humana recombinante no regulada 100 nM, demostrando que este receptor puede fijar la Ob nativa. Una fusión entre AP y Ob humana también fija la ObR de ratón con una alta afinidad, así como una proteína de fusión con leptina de ratón en el término N, y AP en el término C (Ob-AP) . El análisis de Scatchard de la fijación de AP-Ob de ratón (Figura 2B) produjo un valor para la constante de disociación (KD) de 0.7 x 10~9 M. 4. Autenticidad de la Clona famj5312 Se probó la autenticidad de la clona famj5312 de obR aislada de varias maneras. Primero, 8 clonas independientemente aisladas (en subgrupos de 150 clonas cada uno) se amplificaron con reacción en cadena de polimerasa, con cebadores hechos para secuencias de obR 3' de codón de detención. El secuenciamiento verificó que los 8 clonas contenían las mismas secuencias no trasladadas 3 ' . En adición, se secuenciaron las regiones de 5 clonas independientemente aisladas que codificaban el término C de ObR, y cada uno demostró que utiliza el mismo codón de detención. Finalmente, la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (rt-PCR) de ARN total de plexo coroide aislado de una cepa de ratón diferente (C57/BLKsJ) de aquélla a partir de la cual se derivaron las bibliotecas de ADNc, generó un producto de reacción en cadena de polimerasa idéntico que contenía un codón de detención en el mismo lugar. Estos datos indicaron que la clona de ADNc famj5312 aislada no era una clona quimérica ni era el resultado de un evento de empalme aberrante raro, sino, mas bien, representa una clona que codifica la forma predominante del receptor de ObR en el plexo coroide . 5. Clonación de Ácidos Nucleicos gue Codifican ObR de Forma Larga de Ratón Como se describe en la presente, hemos clonado la forma larga de ObR de murino . Con el objeto de encontrar el homólogo de ratón de la forma larga humana del gen obR (Figura 3) , se realizó reacción en cadena de polimerasa semi-anidada sobre el ADNc de la primera cadena aislado de hipotálamo de ratón, Ks, y de plexo coroide, db y Ks, con cebadores 5' desde la región justo antes de que la forma corta de ratón empiece a diverger de la forma larga humana, y se diseñaron cebadores degenerados 3 ' a partir de la región intracelular del homólogo de ObR humana. La transcripción completa se caracterizó adicionalmente mediante 3' RACE.

Se preparó ARNm total a partir de plexo coroide e hipotálamo C57B1/KS (KS) y C57Bl/KS-db (db) . El ADNc se transcribió inversamente a partir de 1 microgramo de ADNc de ARNm, utilizando hexámero aleatorio u oligo dT como cebador con Transcriptasa Inversa Superscript de GIBCO-BRL. Se hicieron un total de 24 microgramos de ADNc. Para la reacción en cadena de polimerasa, el ADNc se diluyó a 1:200, y se utilizaron 3 microgramos del ADNc diluido en una reacción de 25 microlitros. La primera ronda de reacciones en cadena de polimerasa utilizó un cebador 5' que codificaba la secuencia de proteína ObR de ratón PNPKNCSW, y que consistía en los nucleótidos 5' -CCA AAC CCC AAG AAT TGT TCC TGG-3 ' , y un cebador degenerado inverso complementario para la secuencia de nucleótidos que codificada KIMENKMCD, adyacente al término carboxi de la forma larga humana, y consistente en los nucleótidos 5 ' -TC (GA) CA CAT (CT)TT (GA) TT (GATC) CC CAT TAT CTT-3 ' . Para la segunda ronda de reacciones en cadena de polimerasa, el cebador 3' fue el mismo, y el cebador 5', que fue interno al cebador 5 ' anterior, codificó la secuencia de proteína ObR de ratón AQGLNFQK, y consistió en los nucleótidos 5 ' -GCA CAÁ GGA CTG AAT TTC CAÁ AAG-3 ' . Se realizaron reacciones en cadena de polimerasa como se describió anteriormente, con la excepción de que el perfil de la reacción en cadena de polimerasa anidada fue de 94°C durante 3 minutos; 94°C durante 30 segundos; 57°C durante 30 segundos, 72°C durante 40 segundos por 30 ciclos; 72°C durante 5 minutos por un ciclo. Se realizó el secuenciamiento del ADN en el secuenciador de ADN automático ABI 373A y 377, utilizando el estuche de secuenciamiento de ciclo Taq (Applied Biosystems, Foster City, CA) . El análisis de secuencia se realizó utilizando el Sequencher. También se realizó reacción en cadena de polimerasa semi-anidada de los ácidos nucleicos que codificaban el dominio intracelular de la ObR de forma larga de murino, sobre el ARNm aislado a partir de hipotálamo, con el objeto de obtener cantidades suficientes de un producto de reacción en cadena de polimerasa específico que codificara la forma larga de ratón de gen obR. El secuenciamiento del producto de la reacción en cadena de polimerasa (Figura 6) confirmó que este ADN codifica el homólogo de ratón de la forma larga de ObR. Las transcripciones de las formas corta y larga son idénticas hasta el quinto codón 5' del codón de detención de la forma corta, y luego divergen completamente, sugiriendo un empalme alternativo. Las secuencias de aminoácidos deducidas a partir de la forma larga de ratón y de la ObR humana, son homologas a través de toda la longitud de la región de codificación, y comparten una identidad del 75 por ciento (Figura 7) . 6. Perfil de Expresión de ARNm de ObR Como un primer paso en el entendimiento de la distribución de tejido de la ObR, se examinó la expresión de su ARNm en diferentes tejidos de murino. Para este fin, el análisis de mancha Northern de ARNm de poli A+ (2 microgramos/pista) derivado a partir de diferentes tejidos de ratón (corazón, cerebro, bazo, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñon y testículos; Clontech, Palo Alto, CA) se sondeó con ADN etiquetado amplificado a partir de las secuencias que codificaban el dominio extracelular de ObR. Las hibridaciones se hicieron en un regulador Rapid-hyb (Amersham) a 65°C, siguiendo las instrucciones del fabricante. En la mayoría de los tejidos, el ARNm de obR aparece como una sola banda ligeramente mayor de 5kb, indicando que las clonas de ADNc de 5. lkb descritos en la presente son de longitud completa. De los tejidos ensayados, se ve expresión en el pulmón, en el riñon, y en el cerebro total. No se detectó expresión en los testículos. La amplificación de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa del ARNm de obR a partir del ARN total, confirmó la presencia de esta transcripción en el plexo coroide, y también demostró su presencia en el hipotálamo. Las reacciones en cadena de polimerasa de transcripción inversa se realizaron sobre 1 microgramo de ARN total aislado a partir de plexo coroide ó hipotálamo de ratón. Los tejidos se aislaron a partir de ratones db/db (fondo de C57Bl/BLKsJ) ó controles de carnada +/+ . El ADNc de la primera cadena, preparado utilizando hexámeros aleatorios, se amplificó con reacción en cadena de polimerasa, utilizando cebadores derivados a partir de las secuencias que codificaban el dominio extracelular de ObR, ó cebadores de control G3PDH. No se detectaron bandas a partir de la amplificación de los controles de ARN total de transcripción inversa simulada probados en paralelo. VIII. Ejemplo: El Gen obR es el Gen db Los experimentos y estudios descritos más adelante, demuestran que el gen obR se mapea en el lugar db, y que el gen obR en ratones db es una forma mutante de obR que da como resultado la transcripción de un ARNm aberrantemente empalmado, que tiene un inserto de 106 nucleótidos, que da como resultado una proteína ObR de forma larga truncada que es idéntica a la Obr de forma corta de murino . A. El Gen obR se Mapea Dentro del Intervalo Genético de db En el Ejemplo presentado en la presente, se describen estudios que indican que el gen obR se mapea en una región de 4 a 5 cM en el cromosoma de ratón 4, que representa la misma región en la que se mapea el lugar db. 1. Materiales y Métodos Amplificación de Reacción en Cadena de Polimerasa. Se utilizaron los siguientes cebadores derivados de famj5312, para la amplificación del ADN genómico de ratón: cebador hacia adelante: 5 ' -GCTGCACTTAACCTGGC-3 ' cebador inverso : 5 ' GGATAACTCAGGAACG-3 ' .

La mezcla de reacción en cadena de polimerasa contenía 6 microlitros de ADN de plantilla (10 nanogramos/microlitro) , 1.4 microlitros de regulador de reacción en cadena de polimerasa 10 x Perkin Elmer (Norwalk, CT) , 1.12 microlitros de dNTPs (2.5 mM) , 1.05 microlitros de cebador Hacia adelante (6.6 µM) , 1.05 microlitros de cebador Inverso (6.6 µM) , 0.38 microlitros de H20, y 3 microlitros de polimerasa AmpliTaq HotstartMR (Perkin Elmer; 0.5 unidades/microlitro) . El perfil de amplificación fue como sigue: 94°C durante 2 minutos, en cuyo punto se agregó la ampliTaq, luego 30 ciclos de 94 °C durante 40 segundos, 55°C durante 50 segundos, y 72°C durante 30 segundos. Se utilizó un segundo conjunto de cebadores bajo las mismas condiciones, con la excepción de que el ciclo a 55°C se condujo a 52°C. cebador hacia adelante: 5 ' -CACTATTTGCCCTTCAG-3 ' cebador inverso : 5 ' -GCCTGAGATAGGGGTGC-3 ' Electroforesis . Se probaron muestras sobre tanto geles de acrilamida al 8 por ciento no desnaturalizantes a 45 W, a la temperatura ambiente, durante 3 horas, como en geles de SSCP (polimorfismo de conformación de una sola cadena) de acrilamida al 10 por ciento no desnaturalizantes a 20 W, 4°C, durante 2.5 horas . Ambos tipos de geles se tiñeron con SYBR Verde I, y se exploraron en un MD Fluoroimager, y dieron resultados interpretables . 2. Mapeo de Clona de ADNc de obR famj5312 Se diseñaron cebadores de reacción en cadena de polimerasa a partir de la secuencia de codificación del ADNc de famj5312, como se describe en la Sección 8.1. Estos cebadores amplificaron un fragmento de 192 pares de bases a partir del ADN genómico C57B1/6J, consistente con la longitud de pares de bases entre los dos cebadores en el ADNc de obR, y un fragmento de 195 pares de bases a partir de la cepa de Mus spretus SPRET/Ei derivada del tipo silvestre. La inserción de 3 pares de bases en el alelo de Mus Spretus codifica para un Asn adicional entre los aminoácidos #45 y #46. La segregación genética del alelo de Mus spretus de 195 pares de bases de ObR fue seguida en la progenie de 182 retrocruzas de las hembras Fx de cruza (C57B1/6J x Mus spretus) por los machos C57B1/6J, mediante tanto Polimorfismo de Conformación de una Sola Cadena (SSCP) en electroforesis de gel, como en electroforesis de gel no desnaturalizante, para la determinación del tamaño. El patrón de segregación del alelo de Mus spretus se comparó con el patrón de segregación de los otros 226 lugares genéticos que se han mapeado en este panel de retrocruza. Al minimizar el número de cruzas múltiples entre obR y otros marcadores, se determinó que el obR se mapea en el cromosoma de murino 4 , aproximadamente 2.2+_l .6 cM distal del marcador D4Mit9, y 4.6+1.6 cM proximal al marcador D4Mit46. La posición del mapa genético de obR se refino adicionalmente mediante el mapeo de marcadores genéticos adicionales . El gen obR se mapea a 0.6+0.6 cm distal de D4Mit255, y a 0.6+0.6 cM proximal a D4Mitl55; ver la Figura 8. Se diseñaron pares de cebadores adicionales (hacia adelante = CACTATTTGCCCTTCAG; inverso = GCCTGAGATAGGGGTGC) a partir de la secuencia 3' del ADNc de famj5312, que también reveló un polimorfismo sobre geles SSCP entre el ADN genómico C57B1/6J y aquel de la cepa de Mus spretus SPRET/Ei derivada de tipo silvestre. Nuevamente, esto permitió el mapeo genético del ADNc de famj5312, utilizando ahora un fragmento diferente de la clona. El mapeo de este polimorfismo fue el 100 por ciento concordante con el mapeo de famj5312 recortado anteriormente, confirmando ambos el mapeo de obR, e indicando que la clona de ADNc de famj5312 no era quimérico. 3. Definición de la Región Genética db de Murino El gen db de ratón se mapeó originalmente en el cromosoma de ratón 4 (Hummel, K.-P., y colaboradores, 1966, Science 153 : 1127-1128) . Esta localización genética ya se ha refinado (Bahary, N. , y colaboradores, 1990, Proc. natl. Acad. Sci. EUA .87:8642; Bahary, N. , y colaboradores, 1993, Genomics 16:113-122) para colocar db adentro de un intervalo genético de 1.5 cM entre el lugar proximal de descarboxilasa de Ornitina 4 (Odc4) y los marcadores distales anónimos D4Rck22 y D4Rck69.

Bahary, y colaboradores, 1993, también reportan D4Mit205 como 1. lcM proximal a Odc4. Por consiguiente, en relación con D4Mit205, el gen db se mapeó aproximadamente a 2.2cM distal. El alelo db originalmente se presentó en la cepa consanguínea C57Bl/BLKsJ. Subsecuentemente se ha transferido la mutación db a otros fondos genéticos, para formar cepas congénicas . Al tipificar a los animales de la cepa congénica C57Bl/6J-m db, fue posible definir el intervalo genético adentro del cual el gen db tenía que residir sobre el cromosoma de ratón 4. Mediante este análisis, se definió el intervalo que debe contener al gen db como el 4cM aproximado entre el marcador de ADN anónimo proximal de D4Mit255 y los marcadores distales D4Mit331 y D4Mit31. (La distancia genética definida en el mapa Mit; Dietrich, W.F., y colaboradores, 1994, Nature Genetics 7:220-245; Copeland, N.G., y colaboradores, 1993, Science 262:67; Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Genetic Map of the Mouse, Datábase Reléase 10, 28 de abril de 1995) . Se debe notar que el intervalo definido por Bahary, y colaboradores, 1993, supra , parece estar a unos cuantos centimórganos proximal a la región como se define en la presente. Ver la Figura 8, en donde la distancia entre D4Mit255 y D4Mit31 es de aproximadamente 5.1 centímetros. Al comparar los datos de mapeo para famj5312 con los datos de mapeo db descritos anteriormente, la posición en el mapa de famj5312, a 0.6+0.6cM distal de D4Mit255 y 0.6+0.6cM proximal a D4Mitl55, está de acuerdo completamente con que el obR es el gen db.

B. La Mutación de obR en Ratones db da Como Resultado un Receptor de Forma Larga Truncado 1. Materiales y Métodos Se preparó ARNm parcial a partir de C57B1/KS (KS) y C57Bl/KS-db (db) de plexo coroide e hipotálamo. El ADNc se transcribió inversamente a partir de 1 microgramo de ADNc de ARNm utilizando exámero aleatorio u oligo dT como cebador con Transcriptasa Inversa Superscript de GIBCO-BRL. Se hicieron un total de 24 microgramos de ADNc. Por la reacción en cadena de polimerasa, el ADNc se diluyó a 1:200, y se utilizaron 3 microgramos del ADNc diluido en una reacción de 25 microlitros. A partir de la clona de ADNC de forma corta de ratón, famj5312, y la clona de ADNc de forma larga (Figura 6), se diseñaron cebadores que cubrían toda la región de codificación de ambos formas corta y larga del ADNc de obR. Se generaron fragmentos de reacción en cadena de polimerasa traslapados con un tamaño promedio de 600 pares de bases a partir de cada muestra. Los productos de la reacción en cadena de polimerasa se pasaron por electroforesis sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 0.8 por ciento. El ADN se aisló a partir del gel, y se pasó por agarosa. Los fragmentos de ADN pasados por agarosa se secuenciaron con ambos cebadores de extremo, así como con los cebadores internos . Condiciones de la Reacción en Cadena de Polimerasa. La reacción en cadena de polimerasa de 25 microlitros contenía 2 mM MgCl2, 0.5 mM de cada cebador, 200 mM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP, y 0.5 unidades de polimerasa Taq en regulador de polimerasa IX Taq (Perkin-Elmer) . Todas las reacciones en cadena de polimerasa se realizaron en el sistema de reacción en cadena de polimerasa GeneAmp 9600 (Perkin-Elmer) . A menos que se describa de otra manera, el perfil de la reacción en cadena de polimerasa general fue de 94°C durante 3 minutos; 94°C durante 10 segundos, 57°C durante 10 segundos, 72°C durante 40 segundos por 35 ciclos, y 72°C durante 5 minutos por un ciclo. Secuenciamiento de ADN y Análisis de Secuencia. El secuenciamiento del ADN se realizó en el secuenciador de ADN automático ABI 373A y 377, utilizando el estuche de secuenciamiento de ciclo Taq (Applied Biosystems, Foster, City, CA) . El análisis de secuencia se realizó utilizando el Sequencher. 2. Resultados Se realizó reacción en cadena de polimerasa semi-anidada sobre el ARNm aislado a partir de plexos coroides de KS y ratones db. El producto de la reacción en cadena de polimerasa generado utilizando el ADNc de db como plantilla, fue aproximadamente 100 pares de bases más largo que aquél utilizando el ADN de Ks como plantilla. Los productos de la reacción en cadena de polimerasa de ambos se secuenciaron directamente. No se detectó una diferencia de secuencia adentro de la secuencia de codificación de la forma corta de las especies de ARNm expresadas en el plexo coroide de estos ratones. Sin embargo, al secuenciar el producto de la reacción en cadena de polimerasa que se generó empezando a partir del dominio transmembrana compartido por las dos formas y que finaliza en el dominio intracelular específico para la forma larga, notamos una diferencia aparente entre db/db y el control en varios tejidos. Los datos de secuenciamiento mostraron que la forma larga db supuesta de obR tiene una inserción adicional de 106 pares de bases en la transcripción de forma larga normal (Figura 9) . Estos 106 pares de bases incluyen la secuencia que codifica los últimos cinco aminoácidos, el codón de detención, así como 88 pares de bases de la región 3 ' UTR de la forma corta. La forma larga de db produce una proteína ObR truncada idéntica a la forma corta, que carece del dominio intracelular. No detectamos la forma larga normal en ningún tejido de db, ni la forma larga de db en los tejidos de control. Para entender el mecanismo de este error de empalme aparente, comparamos la secuencia genómica de obR entre los ratones db/db y de control . Se descubrió un solo cambio de nucleótido de G?T a 2 pares de bases inmediatamente después del sitio de inserción de 106 pares de bases en los ratones db/db. Este cambio crea un donador de empalme que convierte el fragmento de 106 pares de bases en un exón insertado en la forma larga de db. Debido a esta inserción, la forma larga de db produce solamente una proteína truncada que no tiene el dominio de señal intracelular. Ya que los receptores de citoquina clase I con los que está más estrechamente relacionada la ObR, tienen todos un dominio intercelular largo, el dominio intercelular largo de la forma larga es crucial para iniciar la transducción de señal intracelular. Estos datos apoyan el papel de este receptor en la modulación del peso, y el fracaso para producir la forma larga de ObR como causa del fenotipo obeso severo en los ratones db/db. IX. Ejemplo: Clonación de Ácidos Nucleicos que Codifican ObR Humana En la presente se describe la clonación y la identificación del ADNc y del ADN genómico que codifican la ObR humana . . Clonación de ADNc de Obr Humana Se utilizó el inserto de famj5312 para sondear una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano en el vector Uni-Zap XR obtenido de Stratagene (La Jolla, CA) . Se seleccionó una biblioteca de ADNc derivada a partir de un cerebro fetal humano, debido a la posibilidad de que esta biblioteca contuviera ADNcs presentes en el cerebro entero, incluyendo el plexo coroide, la fuente de tejido del ADNc de obR de ratón, así como los ADNcs presentes en el hipotálamo. La biblioteca de ADNc se recubrió sobre 20 platos con aproximadamente 50,000 unidades formadoras de placas/plato. Se hicieron levantamiento duplicados en filtro sobre cada plato con filtros de membrana de nylon Amersham Hybond-N. Los filtros se desnaturalizaron, se neutralizaron y se reticularon de acuerdo con los procedimientos convencionales. La sonda se etiquetó radioactivamente mediante cebamiento aleatorio en la presencia del nucleótido etiquetado con 32P. Los filtros se hibridaron con la sonda durante la noche a 65°C, en regulador de Church (SDS al 7 por ciento, 250mM de NaHP04 , 2µM de EDTA, BSA al 1 porciento) . Al día siguiente, los filtros se lavaron en 2XSSC/SDS al 0.1 por ciento durante 20 minutos a 65°C, luego en 0.1XSSC/SDS al 0.1 por ciento durante 10 minutos. Entonces se expusieron a películas Kodak a -80°C durante 5 horas. Después de acoplar los filtros duplicados, se obtuvieron 13 señales duplicadas. El recubrimiento secundario fue seguido por el recubrimiento de 10 microlitros de una dilución de 1:1000 de cada tapón primario. Se utilizó la misma sonda y las mismas condiciones de hibridación y lavado que anteriormente. La película se expuso a 80°C durante 2 horas. Solamente 1 de los 13 positivos originales dio señales duplicadas en la película. Se procesaron cuatro placas independientes a partir del plato positivo, y se separaron con el fago auxiliar ExAssist, células XLl-Blue, y células SOLR como es descrito por Stratagene. Luego los productos de la separación se recubrieron sobre platos de LB/Amp, y se incubaron a 37°C durante la noche. Se recogió una colonia blanca de cada plato, y se cultivó en LB/Amp líquido a 37°C durante la noche. Al día siguiente, se hicieron mini-preparaciones con el estuche Promega Wizard Mini-prep. Los tamaños de los insertos se determinaron digiriendo los productos de la mini-preparación con EcoRI y Xhol. Uno de los cuatro clonas (d) tiene un inserto de aproximadamente 6kb. El ADN para el secuenciamiento se preparó utilizando un estuche Qiagen Plasmid Maxi . La Figura 3 ilustra la secuencia de nucleótidos (SEQ. ID. NO: 3) de ADNc de obR humano, que codifica la secuencia de señal (residuos de aminoácidos 1 a aproximadamente 20) , el dominio extracelular (de aproximadamente el residuo de aminoácido 21 a aproximadamente 839) , el dominio transmembrana (de aproximadamente el resido de aminoácido 840 a aproximadamente 862) , y el domino citoplásmico (de aproximadamente el residuo de aminoácido 863 a 1165) . B. Clonación de ADN Genómico de obR Humano Como se describe en la presente, hemos clonado el ADN genómico de obR humano. Se utilizó el inserto de famj5312, para sondear los filtros PAC de alta densidad humanos adquiridos en Genome Systems Inc. (Número de Catálogo FPAC-3386) . La sonda se etiquetó con cebador aleatorio utilizando el estuche Prime-It (Stratagene; Número de Catálogo 300392) . La hibridación se realizó en regulador Amesham Rapid-hyb de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los filtros se lavaron entonces en 2XSSC/SDS al 1 por ciento a 65°C, y se expusieron a película Kodak a -80°C. Inclusive las clonas de PAC positivos supuestos se identificaron. Se determinó su posición en la cuadrícula, y las clonas se adquirieron en Genome Systems, Inc.

La clona en la posición de la cuadrícula P298-K6, que hemos designado como hobr-p87, se validó adicionalmente por contener toda la región de codificación de ObR, mediante prueba de reacción en cadena de polimerasa, con pares de cebadores desde los extremos 5' (obRF4 y obRR4 ) y 3' (obRS y obRO) del marco de lectura abierta de obR. Los cebadores utilizados en esta validación fueron como sigue: obRF4 : 5'- CTGCCTGAAGTGTTAGAAGA -3' obRR4 : 5'- GCTGAACTGACATTAGAGGTG -3' obRS : 5'- ACCTATGAGGACGAAAGCCAGAGAC -3 ' ObRO : 5 ' - TGTGAGCAACTGTCCTCGAGAACT -3 ' La clona hobr-p87 se depositó en la ATCC el 28 de diciembre de 1995. X. Ejemplo: Construcción de Proteínas de Fusión de Inmunoglobulina ObR A. Preparación de Proteínas de Fusión OBR-IG La porción extracelular de la ObR humana se prepara como una proteína de fusión acoplada con una región constante de inmunoglobulina. La región constante de inmunoglobulina puede contener modificaciones genéticas, incluyendo aquéllas que reducen ó eliminan la actividad del efector inherente en la estructura de la inmunoglobulina (ver, por eiemplo, la Publicación del TCP Número WO88/07089, publicada el 22 de septiembre de 1988) . Dicho de una manera breve, la extensión de traslape de la reacción en cadena de polimerasa se aplica para unir el ADN que codifica la porción extracelular de la ObR humana con el ADN que codifica la articulación, las regiones CH2 y CH3 de IgGI humana. Esto se realiza como se describe en las siguientes subsecciones. B. Preparación de Fusiones Genéticas Se preparan reacciones en cadena de polimerasa en un volumen final de 100 microlitros compuesto de polimerasa Pfu y regulador (Stratagene) que contiene cebadores (1 µM de cada uno) , dNTPs (200 µM de cada uno) , y 1 nanogramo del ADN de plantilla. Se preparan fragmentos de ADN correspondientes a las secuencias de ADN que codifican el dominio extracelular de ObR, ó una porción del mismo que fija la Ob, mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) , utilizando pares de cebadores diseñados para amplificar las secuencias que codifican todo el dominio extracelular de ObR humana, así como una pequeña cantidad de la secuencia no codificadora 5' . Por ejemplo, el cebador hacia adelante : 5 * -GTCACGATGTCGACGTGTACTTCTCTGAAGTAAGATGATTTG-3 ' corresponde a los nucleótidos -20 a +8 en la Figura 3, con 14 nucleótidos adicionales (que contienen un ciclo Salí) en el término 5 ' . El cebador inverso : 5' - GTCAGGTCAGAAAAGCTTATCACTCTGTGTTTTTCAATATCATCTTGAGTGA A-3' corresponde al complemento de los nucleótidos +2482 a +2517 en la Figura 3, con 18 nucleótidos adicionales (que contienen un sitio HindIII) en el término 5'. Un ADNc que codifica la ObR humana, sirve como la plantilla para amplificar el dominio extracelular. La amplificación de reacción en cadena de polimerasa con estos cebadores genera un fragmento de ADN que codifica el domino extracelular de ObR. En una segunda reacción en cadena de polimerasa, se diseña un segundo conjunto de cebadores para amplificar la región constante de IgG (es decir, la articulación, los dominios CH2 y CH3) , de tal manera que el cebador inverso tiene un sitio de restricción único, y la secuencia del cebador hacia adelante tiene un término 5 ' que es complementario para la región terminal 5 ' del cebador inverso utilizado en la amplificación del dominio extracelular de ObR supra (es decir, 5 ' -AAGCTTTTCTGACCTGACNNN -3 ' ) , y que hará posible que el marco de lectura abierta en la secuencia de nucleótidos que codifica ObR continúe a través de toda la longitud de la secuencia de nucleótidos de IgG que se va a amplificar. El ADN de plantilla en esta reacción es el segmento de 2000 nucleótidos de ADN genómico de cadena pesada de IgG humana (Ellison, y colaboradores, 1982, Nuc. Acids . Res 10:4071-4079) . El segmento de fusión obR-IgG humano completo se prepara mediante una reacción en cadena de polimerasa adicional. Los productos purificados de las dos reacciones en cadena de polimerasa anteriores se mezclan, se desnaturalizan (a 95°C durante 1 minuto) , y luego se renaturalizan (a 54°C durante 30 segundos) , para permitir que se templen los extremos complementarios de los dos fragmentos . Las cadenas se rellenan utilizando dNTPS y polimerasa Taq, y todo el fragmento se amplifica utilizando el cebador hacia adelante de reacción en cadena de polimerasa de la primera reacción en cadena de polimerasa, y el cebador inverso de reacción en cadena de polimerasa de la segunda reacción en cadena de polimerasa. Para mayor conveniencia de la clonación en el vector de expresión, entonces se disocia el fragmento resultante con las enzimas de restricción que reconocen sitios designados únicos en el cebador hacia adelante de reacción en cadena de polimerasa de la primera reacción en cadena de polimerasa, y en el cebador inverso de reacción en cadena de polimerasa de la segunda reacción en cadena de polimerasa. Este fragmento digerido se clona luego en un vector de expresión que también sea tratado con estas enzimas de restricción. Se utiliza análisis de secuencia para confirmar la estructura, y se utiliza la construcción para transfectar células COS con el fin de probar la expresión transitoria. Los expertos en este campo están conscientes de diferentes consideraciones que tienen influencia sobre la selección del vector de expresión en donde se va a clonar el segmento de fusión de obR-IgG, tal como la identidad del organismo anfitrión, y la presencia de los elementos necesarios para lograr el control de transcripción y de traslación deseado. Por ejemplo, si se desea una expresión transitoria, el segmento de fusión de obR-IgG generado supra , se puede clonar en el vector de expresión pcDNA-1 (Invitrogen) . De una manera alternativa, se puede lograr una expresión estable de la proteína de fusión mediante la clonación del segmento de fusión de obR-IgG en el vector de expresión pcDNA-3 (Invitrogen) . De una manera alternativa, se pueden generar proteínas de fusión de obR-IgG de ratón y/ó humanas, utilizando un vector de expresión, tal como el vector CD5-IgGl (descrito por Aruffo, y colaboradores, 1990, Cell, 61: 1303-1313), que ya contiene la región constante de IgG. De acuerdo con este método, el fragmento de ADN que codifica el dominio extracelular de ObR, se genera en una reacción en cadena de polimerasa, de tal manera que el marco de lectura abierta que codifica el dominio extracelular de ObR es continuo y está adentro del marco con aquélla que codifica la región constante de IgG. Por ejemplo, los dominios extracelulares (incluyendo los péptidos de señal) de ObR de ratón y humana, se amplificaron con reacción en cadena de polimerasa, con Extaq (PanVera Corp.) . Se utilizaron los siguientes cebadores para la amplificación de ObR de ratón y humana en las construcciones de expresión de la primera generación: Ratón Cebadora hacia adelante : 5 ' -CCCAATGTCGACATGATGTGTCAGAAATTCTAT-3 ' Cebadora inversa : 5 ' -AAAAAGGATCCGGTCATTCTGCTGCTTGTCGAT-3 ' Humano Cebadora hacia adelante: 5 ' -CCCAATGTCGACATGGTGTACTTCTCTGAAGTA-3 ' Cebadora inversa : 5 ' -TTTTTGGATCCCACCTGCATCACTCTGGTG-3 ' Cada cebadora hacia adelante anterior contiene un sitio de restricción Sal I, y cada cebador inverso anterior contiene un sitio de restricción BamHl . Después de la amplificación utilizando los ADNcs de obR de ratón y humano como plantillas, se clonaron los fragmentos de reacción en cadena de polimerasa resultantes en los sitios Xhol/BamHI del vector CD5-IgG (Aruffo, y colaboradores, 1990, Cell) . Los vectores resultantes se transfectaron transitoriamente en células COS, y se generó un medio acondicionado. La inmunoprecipitación (IP) del medio acondicionado con proteína A, y el análisis mediante SDS-PAGE, revelaron que la fusión de ObR IgG de ratón se expresó en mayores niveles que la ObR-IgG humana. Para mejorar la expresión de la fusión de ObR-IgG humana, se diseñaron cebadores que amplificaron el dominio extracelular de la ObR humana (sin el péptido de señal) , y este fragmento se co-ligó con las secuencias que codificaban el péptido de señal de la ObR de ratón en el vector CD5-IgG. Los siguientes cebadores utilizados para la amplificación del fragmento del dominio extracelular de ObR humana, se fundieron con el péptido de señal de ObR de ratón: Cebador hacia adelante: 5 ' -TTTAACTTGTCATATCCAATTACTCCTTGGAGATTTAAGTTGTCTTGC-3 ' Cebador inverso: 5 ' -TTTTTGGATCCCACCTGCATCACTCTGGTG-3 ' Después de la amplificación, de la digestión con enzima de restricción, y de la subclonación, la construcción resultante se expresó transitoriamente en células COS. El análisis de inmunoprecipitación y SDS-PAGE del medio acondicionado resultante, mostró una expresión con éxito de la fusión ObR IgG humana de 170 KD. Un método alternativo para mejorar la expresión de proteínas de fusión de inmunoglobulina involucra la inserción del dominio extracelular de ObR (que no incluye al péptido de señal) en el vector CD5-IgGl, de tal manera que el péptido de señal CD5 se funde con el dominio extracelular de ObR madura. Se ha demostrado que esta fusión del péptido de señal mejora la expresión de las proteínas de fusión de inmunoglobulina. C. Preparación de Dominios CH2 Modificados La secuencia de nucleótidos de la fusión del gen obR-IgG generada anteriormente, se puede modificar para reemplazar los residuos de cisteína en la región de articulación, con residuos de serina y/ó aminoácidos adentro del dominio CH2, que se cree que se requieren para la fijación de IgG a los receptores Fe, y complementar la activación. La modificación del dominio CH2 para reemplazar los aminoácidos que se cree que está involucrada en la fijación al receptor Fe, se realiza como sigue: La construcción del plásmido generado anteriormente, proporciona la plantilla para las modificaciones del dominio CH2 de ObR-IgC?l. Esta plantilla se amplifica con reacción en cadena de polimerasa, utilizando el cebador de reacción en cadena de polimerasa hacia adelante descrito en la primera reacción en cadena de polimerasa anterior, y un cebador inverso adicionado de tal manera que sea homólogo a la porción terminal 5' del dominio CH2 de IgGl, con la excepción de cinco sustituciones de nucleótidos diseñadas para cambiar los aminoácidos 234, 235 y 237 (Canfield, S.M. y Morrison, S.L. (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491) desde Leu hasta Ala, desde Leu hasta Glu y desde Gly hasta Ala, respectivamente. La amplificación con estos cebadores de reacción en cadena de polimerasa produce un fragmento de ADN que consiste en una porción modificada del dominio CH2. En una segunda reacción en cadena de polimerasa, la plantilla se amplifica con reacción en cadena de polimerasa, con el cebador inverso utilizado en la segunda reacción en cadena de polimerasa anterior, y un cebador hacia adelante que se diseña de tal manera que sea complementario para la porción Ig de la molécula, y que contenga los cinco cambios de nucleótidos complementarios necesarios para los reemplazos de aminoácidos CH2. La amplificación de reacción en cadena de polimerasa con estos cebadores produce un fragmento que consiste en la porción modificada del dominio CH2 , un intrón, el dominio CH3 , y secuencias adicionales 3'. El segmento obR-IgC?l completo, que consiste en un dominio CH2 modificado, se prepara mediante una reacción en cadena de polimerasa adicional. Los productos purificados de las dos reacciones en cadena de polimerasa anteriores se mezclan, se desnaturalizan (a 95°C durante 1 minutos) , y luego se renaturalizan (a 54°C durante 30 segundos) para permitir que se templen los extremos complementarios de los fragmentos. Las cadenas se rellenan utilizando dNTP y polimerasa Taq, y todo el fragmento se amplifica utilizando cebador hacia adelante de reacción en cadena de polimerasa de la primera reacción en cadena de polimerasa, y el cebador inverso de reacción en cadena de polimerasa de la segunda reacción en cadena de polimerasa. Para mayor conveniencia de clonación en el vector de expresión, entonces se disocia el fragmento resultante con enzimas de restricción que reconocen los sitios específicos para el cebador hacia adelante de reacción en cadena de polimerasa de la primera reacción en cadena de polimerasa, y el cebador inverso de reacción en cadena de polimerasa de la segunda reacción en cadena de polimerasa. Luego se clona este fragmento digerido en un vector de expresión que también se ha tratado con estas enzimas de restricción. Se utiliza análisis de secuencia para confirmar la estructura, y se utiliza la construcción para transfectar células COS, con el fin de probar la expresión transitoria. Se utiliza ELIS hlgG para medir/confirmar los niveles de expresión transitoria aproximadamente iguales a 100 nanogramos de proteína/ mililitro de sobrenadante celular para la construcción. Las líneas celulares CHO se transfectan para la expresión permanente de las proteínas de fusión. D. La OBR-Iq Neutraliza la Proteína Ob Para establecer si las proteínas de fusión ObR-IgG eran capaces de fijar y neutralizar la proteína OB (leptina) in vi tro en ratones, se realizaron transfecciones transitorias a gran escala en 293 células, utilizando la proteína de fusión ObR-IgG de ratón. La proteína ObR-IgG se purificó hasta casi la homogeneidad sobre una columna de proteína A, y se analizó para determinar su capacidad para inhibir la fijación de una proteína de fusión de fosfatasa alcalina-OB (AP-OB) a la ObR de superficie celular. Las células COS se transfectaron transitoriamente con ADNc de obR de ratón, y se probaron para determinar su capacidad para fijar 0.5 nM de AP-OB. Como se demuestra en la Figura 10, la ObR-IgG purificada pudo inhibir potentemente, ó neutralizar, la fijación de la proteína de fusión AP-OB a la ObR de superficie celular. La Figura 10, columna 1, muestra los altos niveles de fijación específica observados en ausencia de la proteína de fusión ObR-IgG. Las columnas 2, 3 y 4 muestran la inhibición casi completa de la fijación observada con tres fracciones de columna diferentes de ObR-IgG purificada. XI. La Forma Larga de OBR Tiene Capacidades de Señalización de los Receptores de Citoguina Tipo IL-6 Para resolver si las isoformas de ObR clonadas son competentes en la señalización, se introdujo el gen ObR en líneas celulares de cultivo de tejido establecidas, y se comparó la respuesta celular al tratamiento con OB, con aquélla mediada por los receptores de citoquina tipo IL-6 estructuralmente relacionados. Los resultados presentados en este ejemplo proporcionan una evidencia de que la forma larga de ObR es una molécula de transducción de señal, y comparte especificidad funcional con los receptores de citoquina tipo IL-6. A. Materiales v Métodos 1. Células Se cultivaron células COS-1, COS-7, H-35 (Baumann, y colaboradores, 1989, Ann. N.Y. Acad. Sci. 557:280-297), HepG2 y Hep3B (Lai, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem. 270:23254-23257) , como se describe. Las células se trataron en un medio que contenía suero fetal de becerro al 0.5 por ciento solo ó complementado con 1 µM de dexametasona, 0.1-1000 nanogramos/mililitro de OB humana, 1000 nanogramos/mililitro de OB de ratón, IL-6 (Genetics Institute) ó G-CSF (Immunex Corp.) . Para inhibir la señalización por gpl30, las células se trataron con la combinación de dos anticuerpos monoclonales de bloqueo de pan contra gpl30 humano, de B-R3 (Chevalier, y colaboradores, 1995, N.Y. Acad. Sci. 762:482-484) y 144 (20 microgramos/mililitro) . 2. Vectores de Expresión y Construcciones de Gen Reportero CAT Los vectores de expresión para la forma larga de ObR humana y la forma corta de ObR de ratón se describieron anteriormente (Secciones 7-9) . Se han descrito G-CSFR (27) humana truncada (Ziegler, y colaboradores, 1993, Mol. Cell. Biol, 13:2384-2390) y STAT1, STAT3 y STAT5B de rata (Lai, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem., 270:23254-23257; Ripperger, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem., 270:29998-30006). Se generó ObR con una secuencia de cuadros 3 mutada (Y1141F) mediante reacción en cadena de polimerasa de extensión de traslape utilizando oligonucleótidos sintéticos que codificaban la sustitución de aminoácido especificada (Higuchi, y colaboradores, 1988, Nucleic Acids Res . , 12:5707-5717). La yll41F contiene un reemplazo de la tirosina en la posición 1141 con fenilalanino. El plásmido SV-SPORT1 (Life Technologies, Inc.) que contiene STAT3 de rata truncado por 55 residuos carboxi-terminales, se ha generado mediante la conversión de los codones 716 y 717 en dos codones de detención. Anteriormente se han descrito construcciones del gen reportero CAT, pHRRE-CAT y pIL-6RE-CAT (Lia, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem., 270:23254-23257; Morella, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem., 270:8298-8310) . 3. Transfección de Células y Análisis La células COS-1, H-35 y Hep3B se transfectaron con el ADN del plásmido mediante el método de DEAE-dextrano (Lopata, y colaboradores, 1989, Nucleic Acids Res., 12:5707-5717), las células HepG2 mediante el método de fosfato de calcio (Graham, y colaboradores, 1973, Virology, 52:456-461), y las células COS-7 mediante el método de lipofectamina. Se mantuvieron subcultivos de células COS durante 16 horas en medio exento de suero antes de la activación de las proteínas STAT, mediante tratamiento con citoquina durante 15 minutos. Se determinó la fijación del ADN por las proteínas STAT mediante EMSA sobre extractos celulares enteros, como se describe en Sadowski, y colaboradores (1993, Science, 26:1739-1744) . Los oligonucleótidos de doble cadena para las SIEm67 de alta afinidad (Sadowski, y colaboradores, 1993, Science, 26:1739-1744) y TB-2 (Ripperger, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem, 270:29998-30006) sirvieron como sustratos de EMSA. Los cultivos celulares transfectados como el gen CAT se trataron durante 24 horas con citoquinas ó con OB . Las actividades de CAT se cuantificaron mediante la prueba de diluciones en serie de extractos celulares, normalizados para la expresión del plásmido marcador co-transfectado pIE-MUP (Morella, y colaboradores, J. Biol. Chem., 270:8298-8310), y se expresan en relación con el valor de los cultivos de control no tratados en cada serie experimental (definida como = 1.0) . La fijación de la superficie celular cuantitativa de la proteína de fusión AP-OB (Sección 6) se hizo esencialmente como es ilustrado por Cheng y Flanagan (Cheng y Flanagan, 1994, Cell, 79:157-168). B. Resultados y Discusión 1. La OBR Activa las Proteínas STAT Para determinar si la ObR tiene la capacidad para reclutar la maquinaria de señalización celular, las células COS se transfectaron transitoriamente con vector de expresión para dos formas representativas de ObR, la forma corta de ratón (también correspondiente a una forma mutada detectada en ratones db/db) y la forma larga humana. Dos días después de la transfección, las células se incubaron en InM de fosfatasa alcalina-OB humana ó de ratón, y la expresión de la superficie celular de ObR se detectó como se indica mediante fijación específica de la proteína de fusión de fosfatasa alcalina-OB (AP-OB) . La transfección de la ObR de forma corta dio como resultado una fijación aproximadamente 10 veces más alta que la forma larga. La transformación de Scatchard de los datos de fijación realizada en múltiples concentraciones de AP-OB, indicó que la fijación más baja observada para la forma larga fue principalmente un resultado de una expresión reducida en la superficie celular. La forma corta de ratón se fijó tanto al ligando de murino como humano con un afinidad de 0.7 nM, y la forma larga humana se fijó tanto al ligando de murino como humano con una afinidad de 1.0 nM. Las células COS-1 se co-transfectaron con vectores de expresión para ObR humana ó de ratón (2 microgramos/mililitro) y las diferentes proteínas STAT (3 microgramos/mililitro) . La cotransfección de los vectores de expresión para ObR, y diferentes isoformas de STAT, permitió el análisis de la activación inducida por el ligando de las proteínas STAT específicas . Las células transfectadas se trataron durante 15 minutos sin ó con OB de murino (100 nanogramos/mililitro) , y activación del ADN que fija las proteínas STAT se identificó mediante EMSA, utilizando los sustratos de oligonucleótido de diagnóstico STE ó TB-2. En estos experimentos, solamente la forma larga de ObR activó las proteínas STAT de COS endógenas, ó las STATl, STAT3 ó STAT5B coexpresadas. La activación de todas las isoformas de STAT mediante ObR fue dependiente del ligando. En contraste, la forma corta de ObR no pudo activar proteínas STAT endógenas ó co-transfectadas, a pesar de su alta expresión superficial. Ya que la forma larga de ObR activó todas las proteínas STAT, que también son activadas por G-CSFR, LIFR y gpl30 (Kishimoto, y colaboradores, 1995, Blood, 86:1243-1254; Lia, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem. 270:23254-23257), la ObR de forma larga se predijo que estimula la transcripción con una especificidad de los receptores de citoquina tipo IL-6. 2. Las Señales de OBR Inducen Expresión Genética Anteriormente se han utilizado líneas celulares de hepatoma de roedor y humano para definir la acción inductora del gen de receptores de hematopoyetina ectópicamente expresados (Baumann, y colaboradores, Mol. Cell. Biol., 14:138-146). En consecuencia, se aplicaron tres líneas celulares de hepatoma complementarias para caracterizar la señalización de ObR. Las formas larga ó corta de ObR ó la GCSFR humana, se introdujeron en células H-35 de rata, junto con la construcción del gen reportero HRRE-CAT, cuya expresión se incrementa en estas células por las señales de muchos receptores de hematopoyetina (Morella, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem., 270:8298-8310). Los subcultivos se trataron durante 24 horas con medio exento de suero solo ó conteniendo citoquinas (mOB, LIF ó IL-6) con o sin dexametasona. La forma larga de ObR medió la inducción dependiente del ligando de la expresión del gen CAT. La acción estimulante fue sinergísticamente mejorada por dexametasona. La respuesta celular mediada por ObR fue altamente similar a aquélla de la IL-6R endógena, pero característicamente diferente de la LIFR endógena. En contraste, la forma corta de ObR fracasó para inducir la expresión del gen, indicando que el dominio citoplásmico de 34 residuos, a pesar de la presencia de un motivo relacionado con el cuadro 1, fue inefectivo en el reclutamiento de los componentes de señalización celular. El hecho de que la G-CSFR con un dominio citoplásmico truncado en 27 residuos todavía indujera la transcripción del gen en la presencia del ligando, ilustró que las células eran capaces de responder a la señal derivada de un dominio citoplásmico corto que contenía el cuadro 1 de un receptor de hematopoyetina. La falta de inducción de la expresión del gen CAT en las células de control transfectadas con G-CSFR, demuestra que las células H-35 no responden a la OB en ausencia de la ObR transfectada. 3. La OBR Funciona Independientemente del gpl30 Los resultados descritos anteriormente apoyan el modelo en donde la forma larga de ObR reconstituye una trayectoria de señalización similar a aquélla de IL-6R. Enseguida, para determinar si el gpl30 es parte de la ObR funcional, se introdujo la forma larga de ObR, junto con HRRE-CAT ó IL-6RE-CAT en células HepG2 , y se evaluaron los efectos inhibidores de los anticuerpos anti-gpl30. El tratamiento de las células HepG2 transfectadas con OB de ratón ó humana, produjo una inducción similarmente fuerte que estuvo en el rango de la producida por IL-6 (un estímulo de 30 a 40 veces) . Un análisis de respuesta a la dosis indicó que la máxima regulación se alcanzaba con 100 nanogramos/mililitro de OB . En cuatro experimentos independientes, se estableció que de 1 a 5 nanogramos/mililitro de OB, producían un estímulo medio-máximo, y que 1000 nanogramos/mililitro producían un estímulo que era consistentemente menor que el máximo . En la presencia de anticuerpos monoclonales contra gpl30 humano, que se sabe que impiden la señalización por todos los receptores de citoquina tipo IL-6 (Chevalier, y colaboradores, 1995, N.Y. Acad. Sci. 762:482-484), se abolió el estímulo de la expresión del gen mediante IL-6, como se esperaba, mientras que la regulación por OB no fue afectada. Estos resultados indican que la ObR funciona independientemente del gpl30 (insensible al anti-gpl30) , y que la iniciación del la señal puede ser desencadenada por la homo-oligomerización del receptor. . La Secuencia del Cuadro 3 de OBr y STAT3 Está Involucrada en la Señalización La inducción de transcripción por medio de IL-6 RE es característica de los receptores de hematopoyetina de IL-10R que contienen cuando menos una copia del motivo del cuadro 3 (YXXQ) en sus dóminos citoplásmicos (Lai, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem. 270:23254-23257). Esta secuencia del cuadro 3 se ha implicado en el reclutamiento de STAT3 para el receptor como parte de su activación por medio de las quinasas asociadas con el receptor (Lia, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem. 270:23254-23257; Stahl, y colaboradores, 1995, Science 267-1349-1353) . La forma larga de ObR (Figura 3) contiene, en las posiciones de aminoácidos 1141 a 1144, una copia del motivo del cuadro 3, que podría contar para la activación de STAT3 y el estímulo de transcripción de IL-6RE-CAT. Para evaluar si el motivo del cuadro 3 de ObR y STAT3 está involucrado en el efecto inductor del gen de ObR, se aplicaron dos reactivos complementarios: una ObR mutante del cuadro 3, y una STAT3 negativa dominante. El papel de la secuencia del cuadro 3 en la forma larga de ObR, se determinó mutano tirosina en la posición del aminoácido 1141, con fenilalanina (Y1141F) . Se transfectaron células Hep G2 y H-35 con un vector de expresión para ObR de tipo silvestre u 0bRY1141F (2 microgramos/mililitro) , junto con pHRRE-CAT ó pIL-6RE-CAT. Las células se trataron con OB humana (100 nanogramos/mililitro) , y se determinó el cambio relativo en la actividad del CAT. La ObR mutante transfectada en células HepG2 produjo un estímulo más bajo de ambas construcciones del gen reportero CAT de HRRE e IL- 6RE, que la ObR de tipo silvestre. Por ejemplo, el estímulo de la expresión de HRRE-CAT se redujo 40 veces en las células HepG2 y en las células H-35. El estímulo de I1-6RE-CAT se redujo 20 veces en las células HepG2 y 100 veces en las células H-35. Los experimentos de control indicaron que la actividad de señalización reducida de la ObR mutante no se debía a una expresión superficial comprometida, como se muestra por la fijación de AP-OB. El efecto relativo de la mutación fue más prominente sobre IL-6RE que sobre HRRE. Un experimento similar realizado en células H-35, mostró que la mutación del cuadro 3 estaba correlacionada con una pérdida de regulación de IL-6RE, mientras que se afectó mínimamente la regulación de HRRE. Los resultados son consistentes con las observaciones anteriores en que, en algunas líneas celulares, el reclutamiento de STAT3 fue más importante en la inducción del gen a través de IL-6RE, y luego a través de HRRE (Lai, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem. 270:23254-23257; Morella, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem. 270:8298-8310; Wang, y colaboradores, 1995, Blood 86:1671-1679) . El efecto regulador del gen reducido de la ObR mutante Y1141F, también estuvo correlacionado con una activación más baja desde las proteínas STAT. Cuando se transfectó la ObR mutante en células COS-1, como se hizo para la ObR de tipo silvestre, no se detectó la activación de las proteínas COS STAT endógenas. También, la ObR Y1141F fue aproximadamente 10 veces menos efectiva para activar las STATl y STAT3 sobre-expresada que la ObR de tipo silvestre. Sin embargo, la activación de STAT5B no fue afectada por la mutación. Este perfil de activación de STAT por ObR Y1141F estuvo de acuerdo con aquél observado para el gpl30 deficiente en cuadro 3 (Lai, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem. 270:23254-23257) y G-CSFR (Morella, y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem. 270:8298-8310), y explicaría los cambios específicos en la regulación de las construcciones del gen reportero. Se determinó un papel de transducción de señal de STAT3 utilizando sobre-expresión de STAT3<-55C, una STAT3 mutante con un truncamiento carboxi-terminal de 55 residuos, que actúa como inhibidor negativo dominante de la acción de STAT3 sobre la transcripción del gen. Los ensayos de fijación del ADN, tales como aquellos descritos en la Sección 11.2.1 anterior, verificaron que la forma larga de ObR activó eficientemente la actividad de fijación del ADN de STAT3-55C. La STAT3«55C abolió esencialmente la inducción mediada por ObR de IL-6RE, y redujo aquélla de HRRE por el 50 por ciento. Estos datos indican que, en las células hepáticas la ObR acopla las trayectorias de transducción de señal que también son utilizadas por los receptores de citoquina IL-6, y son sensibles a STAT3«55C. 5. La OBR Puede Utilizar Inducción del Gen Tanto STAT3 Como STAT5B La inducción de las construcciones del gen reportero seleccionadas en células HepG2 ó H-35 es máxima, y no es mejorada de una manera significativa por las proteínas STAT de tipo silvestre sobre-expresadas . Para evaluar si las proteínas STAT activadas por ObR tienen un papel mediador positivo, se transfectaron células Hep3B humanas con ObR humana, junto con pIL-6RE-CAT ó pHRRE-CAT, y el vector de expresión para las proteínas STAT. Se terminó el estímulo de la actividad de CAT por la OB humana (100 nanogramos/mililitro) en relación con el control no tratado (promedio + desviación estándar; N=3 a 4) . Estas células de hepatoma han retenido la expresión de la IL-6R funcional, pero carecen de los receptores para las otras citoquinas tipo IL-6 (Baumann, y colaboradores, 1994, Mol. Cell. Biol. 14:138-146) . Más aún, estas células tienen un nivel relativamente bajo de STAT3 y -5, permitiendo de esta manera la prueba de la señalización de ObR por la ganancia de función a través de la sobre-exprésion de proteínas STAT. Los resultados de estos experimentos indican que la inducción mediada por STAT3 sobre-expresada de IL-6RE, es de 15 veces. La STAT31 y STAT5B sobre-expresadas mejoraron la inducción mediada por ObR de HRRE-CAT 5 veces y 30 veces, respectivamente. C. Conclusión Los resultados presentados anteriormente documentan que la ObR de longitud completa es un receptor de transducción de señal con un modo de acción relacionado con los receptores de citoquina tipo IL-6. Los datos también apoyan la hipótesis de que las variantes de ObR truncadas, tales como la forma corta expresada en muchos tejidos ó codificada por la transcripción mutante db, son incompetentes en señalización, ó ejercen un repertorio de señalización reducido que no es detectable por las herramientas aplicadas en la presente. El hecho de que la reconstitución de una respuesta de OB se logre al nivel de la expresión del gen en las células hepáticas, sugiere fuertemente que puede presentarse un proceso equivalente en las células hipotalámicas ó en otros tipos de células que expresen normalmente la ObR de longitud completa. El enlace de ObR con trayectorias de señalización específicas que utilizan proteína STAT, y el conocimiento de la especificidad de estas proteínas para controlar los genes a través de elementos de fijación de ADN identificables, puede ayudar a identificar los efectos de ObR inmediatos que son pertinentes para entender la acción de la OB en vivo. El sistema experimental presentado anteriormente también se puede utilizar para resolver cuestiones acerca del papel funcional, en su caso, de la forma corta que se presenta naturalmente de ObR en la regulación funcional de la forma larga. 12. Análisis Mutacional de OBR Con el objeto de identificar las regiones de la región citoplásmica de ObR importantes para la activación de los genes, se crearon y se realizaron un número de mutantes de ObR. Estos estudios, descritos más adelante, identificaron dos regiones distintas del dominio citoplásmico de ObR, importantes para la inducción de la expresión del gen. 12. Materiales y Métodos 12.1.1 Células Se cultivaron células COS-1, COS-7 y H-35 como es descrito por Baumann, y colaboradores, 1989, Ann . N. Y. Aca.d. Sci . 557:280-297. Las células se estimularon simuladamente en un medio que contenía suero fetal de becerro al 5.0 por ciento, y 1 µM de dexametasona, ó se trataron en el mismo medio complementado con 100 nanogramos/mililitro de leptina humana (Roche) , IL-6 (Genetics Institute) , ó G-CSF (Immunex Corp.). 12.1.2 Vectores de Expresión y Construcciones de Gen Reportero CAT Los vectores de expresión para la forma larga de la ObR humana se describieron anteriormente (Sección 9), y las STATl, STAT3 y STAT5B de rata se han descrito anteriormente (Lai, y colaboradores, 1995, J. Biol . Chem. 270 : 23254 -23257; Ripperger, y colaboradores, 1995, ". Biol . Chem. 270.-29998-30006) . Se generaron pOB-R?115-1165 , pOB-R?1065-1165 y pOB-R?965-1165 , que codifican todas las ObRs humanas truncadas carboxi-terminales, mediante reacción en cadena de polimerasa. Dicho de una manera breve, se utilizaron oligonucleótidos que extienden el dominio intracelular de la ObR humana, para generar codones de detención adentro del marco 3' para los aminoácidos especificados. Los fragmentos de la reacción en cadena de polimerasa fueron digeridos con EcoRV y Xbal, y se subclonaron en ObR humana que se había digerido con EcoRV y Xbal. Se utilizó una estrategia similar para genera pOB-R?868, pero con cebadores que generaban un fragmento Mscl-Xbal que reemplazó a las secuencias de ObR humanas endógenas. La pOB-RY1141F, que codifica la ObR humana con una secuencia de cuadro 3 mutada, se preparó como se describe en la Sección 11.1.2. Se generaron mutantes de ObR, pOB-R (nucleótidos del cuadro 1) , que contenía cambios de PNP a SNS en el motivo del cuadro 1 de ObR (aminoácidos 876 y 878) , y mutantes pOB-RY986F y pOB-RY1079F, mediante reacción en cadena de polimerasa de extensión traslapada, utilizando oligonucleótidos sintéticos que codificaban las sustituciones de aminoácidos especificadas de Tyr a Phe (Higuchi, y colaboradores, 1988, Nucleic Acids Res . 16: 7351 - 7367) . Las construcciones del gen reportero CAT pHRRE-CAT y pIL-6-CAT se han descrito anteriormente (Lai, y colaboradores, 1995, J. Biol . Chem. 270 : 23254 -23257; Morella, y colaboradores, 1995, J. Biol . Chem . 270 : 8298 -8310) . 12.1.3 Transfección Celular y Análisis Se transfectaron células COS-1 y H-35 mediante el método de DEAE-dextrano (Lopata, y colaboradores, 1984, Nucleic Acids Res . 12 :5707 -5717) , y células COS-7 mediante el método de lipofectamina (Tartaglia, y colaboradores, 1995, Cell 83 : 1263 -1271) . Para el análisis de la activación de la proteína STAT, las células COS se mantuvieron durante 16 horas en medio exento de suero, seguido por tratamiento de las células con 100 nanogramos/mililitro de leptina ó G-CSF durante 15 minutos.

Para los ensayos de CAT, los cultivos celulares transfectados se subdividieron y se trataron con ligandos durante 24 horas. Se determinaron las actividades del reportero CAT, y se expresan en relación con los valores obtenidos para los cultivos de control no tratados para cada serie experimental. La fijación del ADN por las proteínas STAT se analizó mediante ensayo de cambio de electromovilidad (EMSA) utilizando extractos celulares enteros, como es descrito por Sadowski, y colaboradores (1993, Science 26 : 1739-1744) . Los oligonucleótidos de doble cadena radioetiquetados SIEm67 (para STATl y SAT3) y TB-2 (para STAT5B) sirvieron como sustratos de fijación en el ensayo de cambio de electromovilidad. La expresión del receptor en las células COS se analizó mediante fijación de superficie celular cuantitativa de la proteína de fusión AP-OB, como es descrito por Cheng y Flanagan (1994, Cell 79 : 157-168) . 12.1.4 Inmuno anchado Todo el inmunomanchado se hizo como es descrito por Baumann, y colaboradores (1996, Proc. Nati . Acad. Sci . U. S. A. 93 :x>o -xxx) , y las proteínas inmunorreactivas se visualizaron mediante detección de quimiluminiscencia mejorada, como es descrito por el fabricante (Amersham) . El antisuero policlonal de conejo específico para STAT5B fue de Santa Cruz Biotechnology. 12.2 Resultados v Discusión Como se describió anteriormente, la ObR es un miembro de la superfamilia de receptores de citoquina clase I. Los receptores de esta clase carecen de la actividad de quinasa de quirosina intrínseca, y son activados por homo-dimerización ó heterodimerización del receptor inducida por el ligando. En muchos casos, la activación requiere de una activación de las quinasas asociadas con el receptor de la familia Janus (JAKs) . (Ihle, y colaboradores, 1994, Trends . Biol . Sci . 19 :222-227) . Las JAKs se asocian con el dominio proximal de membrana de la parte intracelular de los receptores de citoquina, y sirven para iniciar las trayectorias de transducción de señal enseguida de la activación del receptor inducida por el ligando. Incluidos entre los objetivos corriente abajo de las proteínas JAK, están los miembros de la familia STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription) (Transductores de Señal y Activadores de Transcripción, por sus siglas en inglés) , de los factores de transcripción (Ihle, y colaboradores, 1994, Trends . Biol . Sci . 19 :222-227) . Los STATs son factores de transcripción de fijación del ADN que contienen dominio de homología de Ser (SH2) que interactúan con las moléculas receptoras a través de los residuos de tirosina fosforilados . Las proteínas STAT se activan mediante fosforilación con tirosina, forman heterodímeros u homodímeros, se traslocan al núcleo, y modulan la transcripción de los genes objetivo . 12.2.1 El Dominio Intracelular de OBR Incluye Cuando Menos Dos Regiones Importantes para la Señalización Para definir las regiones del dominio citoplásmico de ObR requeridas para la señalización, se construyeron una serie de mutantes de supresión C-terminales (Figura HA) . Estos ADNcs que codifican estos mutantes, se co-transfectaron transitoriamente en células H-35, con construcciones de IL-6RE-CAT ó HRRE-reportero CAT, y se ensayaron para determinar su capacidad para estimular la transcripción (Figura 11B) . Los truncamientos C-terminales que remueven las secuencias del cuadro 3 (aminoácidos 1141-1144) de ObR, eliminan la activación de transcripción por medio de IL-6-RE (Figura 11B; panel superior) . Este resultado es consistente con el hecho de que una mutación de Y a F en el motivo sencillo del cuadro 3, ó en ObR, interrumpe completamente la señalización en las células H-35 por medio de IL-6RE (Sección 11.2.4). En contraste, la señalización de ObR a través de HRRE se redujo mínimamente mediante la remoción de las secuencias C-terminales extremas, y no se interrumpió completamente, sino hasta remoción de los aproximadamente 97 aminoácidos entre 868 y 965 (Figura 11B) . Para asegurar que los vectores de expresión para los diferentes mutantes de ObR dirigieron las síntesis de las proteínas receptoras localizadas superficialmente, las células COS transfectadas con cada construcción se ensayaron para determinar la expresión del receptor mediante estudios de fijación de AP-OB. Los truncamientos C-terminales de ObR generan proteínas que se expresan en la superficie y fijan el ligando (Figura 12) . Más aún, el nivel de expresión de la ObR se incrementó con el truncamiento progresivo del dominio intracelular. Como se describió anteriormente, la inducción del gen ObR por medio de IL-6RE se correlaciona con la activación de STATl y STAT3 , mientras que la inducción del gen ObR por medio de HRRE se correlaciona con la activación de STAT5B . Para evaluar adicionalmente la correlación entre el estímulo de HRRE y la activación de STAT5B, se co-transfectaron células COS con plásmidos de expresión para STAT5B y los mutantes de supresión de ObR. El inmunomanchado realizado sobre los extractos preparados a partir de estas células, reveló que la STAT5B se expresó en cantidades relativamente iguales en cada uno de los cultivos transfectados . Las células se trataron con leptina. Se realizó el análisis de ensayo de cambio de electromovilidad, y se cuantificaron los niveles de proteína STAT mediante mancha Western. Los truncamientos C-terminales progresivos de ObR dan como resultado una capacidad reducida para activar STAT5B, y se perdió la activación detectable de STAT5B solamente al remover el segmento de ObR proximal a membrana (construcción pOBR?868-1165) . Por consiguiente, parece haber una correlación entre la pérdida de la activación de STAT5B de ObR y la inducción del gen por medio de HRRE. Para definir la contribución relativa de los residuos de tirosina del dominio intracelular conservados, y del motivo del cuadro 1 proximal de membrana para la señalización mediante ObR por medio de HRRE, se generaron los mutantes 0B-RY1141F, 0B-RY986F, OB-RY1079F y OB- (cuadro Imt) (Figura 13A) . Cuando se analizaron en las células COS, los estudios de fijación de AP-OB demuestran que estos mutantes se expresan en la superficie celular aproximadamente tan bien como la ObR de tipo silvestre. Cuando se transfectaron en células H-35, las OB-RY986F y 0B-RY1079F quedaron sin cambios en su capacidad para regular la HRRE (Figura 13B) . En contraste, la mutación del motivo del cuadro 1 de ObR da como resultado una pérdida completa de la regulación de la inducción del gen a través de este elemento. Por consiguiente, el motivo del cuadro 1 de ObR parece ser un factor determinante importante para la capacidad de la ObR para activar las trayectorias que pueden modular la inducción del gen por medio de HRRE. La inducción del gen mediante ObR a través de IL-6RE requiere de secuencias cerca del término C extremo de ObR (Figura 11B) . En contraste, la inducción del gen ObR a través de HRRE no parece requerir de estas secuencias C-terminales. Más aún, la inducción del gen por medio de este elemento solamente se efectúa de una manera mínima mediante la remoción de las secuencias del dominio intracelular de ObR de aproximadamente 200 aminoácidos, entre los aminoácidos 965 y 1165, pero depende de las secuencias proximales de membrana de los aproximadamente 17 aminoácidos entre los aminoácidos 868 y 965. En consecuencia, el motivo del cuadro 2 propuesto de ObR (Lee y colaboradores, 1996, Nature 379 : 632 -635) (aminoácidos-1066-1075) de ObR humana) no parece contribuir a la inducción del gen a través de HRRE. El análisis de ensayo de cambio de electromovilidad sugiere que la inducción del gen de HRRE se correlaciona con la capacidad de la ObR para activar la STAT5B . Es interesante que la OB-R?965-1165, que se ha suprimido de todos los residuos de tirosina de dominio intracelular y, por consiguiente, de todos los sitios de tratamiento potenciales de SH2 , todavía es capaz de provocar una activación de STAT5B de bajo nivel, y un estímulo de transcripción a través de HRRE. Solamente cuando se remueven las secuencias proximales de membrana de ObR (OB-R?868-1165) , se eliminan completamente tanto la inducción del gen HREE como la activación de STAT5B. Consistentemente con esto, la OB-R (cuadro lmt) , que contiene un motivo de cuadro 1 mutado, es incapaz similarmente de inducir la inducción del gen a través de HRRE, y se prediciría que es incapaz de activar la STAT5B . 13. Multimerización de OBR La estructura primaria de la ObR sugiere que está estrechamente relacionada con las subunidades de señalización de los receptores de citoquina tipo IL-6. Los miembros de este grupo se pueden activar, bien sea mediante heterodimerización u homodimerización (Kishimoto, y colaboradores, 1994, Cell 76:253 -262; Heldin, y colaboradores, 1995, Cell 80 : 213 -223) . Entre los primeros se incluyen los receptores para IL-6, el factor inhibidor de leucemia (LIF) , oncostatina M, IL-11, y factor neurotrófico ciliar (CNTF) , todos los cuales comparten el transductor de señal común, gpl30 (Kishimoto, y colaboradores, 1994, Cell 76:253 -262; Taga, y colaboradores, 1989, Cell 58 : 573 -581) . Sin embargo, anteriormente hemos encontrado que la ObR parece señalar independientemente del gpl30 (Baumann, y colaboradores, 1996, Proc. Nati . Acad. Sci . U. S. A . 93 :xxx-xxx) . Por consiguiente, la ObR puede funcionar en la presencia de otra cadena accesoria, tal como las subunidad de señalización común utilizada por los receptores para IL-3, factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF) , e IL-5 (IL-3Rß) , ó IL-2, IL-4, IL-7 e IL-9 (IL-2R?) . Sin embargo, la ObR señala en las células de hepatoma, que no expresan IL-3Rß ó IL-R? (Wang, y colaboradores, 1995, Blood 86: 1671 -1679; Morella, y colaboradores, 1995, ". Biol . Chem. 270 : 8298 -8310) . De una manera alternativa, la ObR se puede activar mediante homodimerización, como se encuentra para el receptor del factor estimulante de granulocitos (G-CSFR) (Fukanaga, y colaboradores, 1991, EMBO J. 10 :2855-2865; Ishezaka-Ikeda, y colaboradores, 1993, Proc. Nati . Acad. Sci . U. S. A. 90 : 123 -127) . Por consiguiente, para determinar si la ObR tiene la capacidad para dimerizar y señala como un homodímero, se construyeron y se analizaron los receptores quiméricos que codifican el dominio extracelular de G-CSFR unido con el dominio intracelular de ObR ó el receptor recíproco que tiene el dominio extracelular de ObR unido con el dominio intracelular de G-GCSFR (Figura 14A) . 13.1 Materiales y Métodos 13.1.1 Células Se cultivaron células COS-1, COS-7 y H-35, como es descrito por Baumann, y colaboradores, 1989, Ann . N. Y. Acad. Sci . 557 :280 -297. Las células se estimularon simuladamente en un medio que contenía suero fetal de becerro al 0.5 porciento, y 1 µM de dexametasona, ó se trataron en el mismo medio complementado con 100 nanogramos/mililitro de leptina humana (Roche) , IL-6 (Genetics Institute) , o G-CSF (Immunex Corp) . 13.1.2 Vectores de Expresión y Construcciones del Gen Reportero CAT Los vectores de expresión para la forma larga de ObR humana se describieron anteriormente (Sección 9) , el G-CSFR de longitud completa ó el G-CSFR truncado (?cito) (Ziegler, y colaboradores, 1993, Mol . Cell . Biol . 13 . -2384 -2390) , y las STATl, STAT3 y STAT5B de rata, se han descrito anteriormente (Lai, y colaboradores, 1995, J". Biol . Chem. 270 :23254 -23257; Ripperger, y colaboradores, 1995, J. Biol . Chem . 270. -29998-30006) . Como se utiliza en la presente, el término "?cito" significa la supresión del dominio citoplásmico. El receptor quimérico de G-CSFR/ObR se generó mediante reacción en cadena de polimerasa, y codifica el dominio extracelular de G-CSFR humana (aminoácidos 1-598) unida cerca del dominio transmembrana e intracelular de la ObR humana (aminoácidos 829-1165) . El receptor quimérico de ObR/G-CSFR se generó mediante reacción en cadena de polimerasa, y codifica el dominio extracelular de ObR de ratón y las secuencias transmembrana (aminoácidos 1-860) , unidas con el dominio intracelular de la G-CSFR humana (aminoácidos 631-813). Las construcciones del gen reportero CAT, pHRRE-CAT y pIL-6-CAT se han descrito anteriormente (Lai, y colaboradores, 1995, J. Biol . Chem. 270 :23254 -23257; Morella, y colaboradores, 1995, J". Biol . Chem. 270 : 8298-8310) . 13.1.3 Transfección Celular y Análisis Las células COS-1 y H-35 se transfectaron mediante el método de DEAE-dextrano (Lopata, y colaboradores, 1984, Nucleic Acids Res . 12 : 5707-5717) , y las células COS-7 mediante el método de lipofectamina (Tartaglia, y colaboradores , 1984, Cell 83 : 1263 -1271) . Par el análisis de la activación de la proteína STAT, las células COS se mantuvieron durante 16 horas en medio exento de suero, seguido por tratamiento de las células con 100 nanogramos/ mililitro de leptina ó G-CSF durante 15 minutos. Para los ensayos de CAT, los cultivos celulares transfectados se subdividieron y se trataron con ligandos durante 24 horas. Se determinaron las actividades del reportero CAT, y se expresan en relación con los valores obtenidos para los cultivos de control no tratados para cada serie experimental. La fijación del ADN por las proteínas STAT se analizó mediante ensayo de cambio de electromovilidad (EMSA) utilizando extractos celulares enteros, como es descrito por Sadowski, y colaboradores (1993, Science 26: 1739-1744) . Los nucleótidos de doble cadena radioetiquetados SIEM67 (para STATl y STAT3) y TB-2 (para STAT5B) , sirvieron como sustratos de fijación en el ensayo de cambio de electromovilidad. La expresión del receptor en las células COS se analizó mediante fijación de superficie celular cuantitativa de la proteína de fusión AP-OB, como es descrito por Cheng y Flanagan (1994, Cell 79 : 157-168) . 13.1.4 Inmunomanchado Todo el inmunomanchado se hizo como es descrito por Baumann, y colaboradores (1996, Proc. Nati . Acad. Sci . U. S. A. 93 :xxx-xxx) , y las proteínas inmunorreactivas se visualizaron mediante detección de quimiluminiscencia mejorada, como es descrito por el fabricante (Amersham) . El antisuero policlonal de conejo específico para STAT5B fue de Santa Cruz Biotechnology. El antisuero policlonal de cabra contra el dominio extracelular bacterialmente expresado de G-CSF-R se preparó en Roswell Park Cáncer Institute Springville Laboratories. 13.2 Resultados y Discusión Los experimentos descritos más adelante sugieren que, aunque la dimerización del dominio citoplásmico de ObR puede ser suficiente para la transducción de señal, se pueden formar oligómeros de orden más alto en respuesta a la fijación del-ligando. 13.2.1 La Homodimerización de los Dominios Intercelulares de OBR Puede Ser Suficiente Para la Transducción de Señal Ya que se ha probado que los complejos de receptor quiméricos son muy productivos para el análisis del mecanismo de la activación del receptor de citoquina (Morella, y colaboradores, 1995, ". Biol . Chem. 270 : 8298-8310 ; Vigon, y colaboradores, 1993, Oncogene 8. -2607 -2615; Baumann, y colaboradores, 1994, Mol . Cell . Biol . 14 : 138 -146) , se produjeron las primeras ObR/G-CSFR y G-CSFR/ObR, y se estudiaron como un medio para analizar el mecanismo de la señalización de ObR (Figura 14A) . Para analizar si el receptor quimérico de G-CSFR/ObR podría propagar una señal inducida por el ligando comparable a aquélla para la ObR de tipo silvestre, la quimera se probó para determinar la activación de STAT, y para el estímulo de la transcripción. La co-transfección de G-CSFR/ObR con proteínas STAT produjo una activación inducida por G-CSF de STATl, STAT3 y STAT5B. Este resultado similar a la activación de la proteína STAT inducida por OB en las células transfectadas de ObR (Sección 12) . La expresión del receptor quimérico se confirmó mediante análisis de inmunomancha de los cultivos transfectados con G-CSFR/ObR. Estos resultados sugieren que la dimerización mediada por G-CSF de los dominios citoplásmicos de ObR, puede generar una activación de tipo ObR de las proteínas STAT. En adición, se descubrió que la quimera G-CSFR/ObR podía estimular la transcripción, como se detectó mediante la medición de la inducción del gen en células H-35, enseguida de la cotransfección del receptor, con las construcciones de reporteros IL-6RE y HRRE (Figura 14B) . Se descubrió que la respuesta provocada es similar a una inducción de las construcciones del gen reportero mediante ObR ó IL-6R endógena. Estos resultados indican que la homodimerización de dos dominios citoplásmicos de ObR puede iniciar la señalización por ObR, similar al mecanismo que media la señalización por G-CSFR de tipo silvestre. Sin embargo, la quimera G-CSFR/ObR no pudo probar definitivamente que el ligando de OB tuviera la capacidad para dimerizar los dominios extracelulares de ObR. En consecuencia, se analizó la actividad de señalización por la quimera recíproca que contiene el dominio extracelular de ObR unido al dominio intracelular de G-CSFR (Figura 14A) . Realmente, la quimera ObR/G-CSFR pudo mediar la inducción del gen de una manera comparable a aquélla por la ObR de tipo silvestre, G-CSFR/ObR, y G-CSFR de tipo silvestre (Figura 14B) . Por consiguiente, tomados juntos, esto resultados sugieren que la ObR no requiere de una cadena accesoria para la señalización, y que la acumulación de dos dominios intracelulares de ObR parece ser suficiente para la activación del receptor. El hecho de que la acumulación de dos dominios intracelulares de ObR sea suficiente para generar una señal enseguida de la activación inducida por el ligando, sugiere que la ObR puede funcionar mediante homodimerización del receptor. Si es así, la señalización por ObR podría ser "envenenada" mediante la sobre-exprésion de un socio de homodimerización que sea deficiente en señalización, similar a lo que se ha demostrado para los miembros de la familia de quinasa de tirosina del receptor (Paulson, y colaboradores, 1989, ". Biol . Chem. 264 : 17615-17618; Svensson, y colaboradores, 1990, Biol . Chem . 265-20863 -20868; Wen, y colaboradores, 1992, J". Biol . Chem. 267. -2512-2518; Fantl, y colaboradores, 1993, Annu . Rev. Biochem. 62 : 453 -481) . Como se describió anteriormente (Sección 12) , la ObR que contiene solamente los 6 aminoácidos proximales de membrana del dominio citoplásmico, es defectuosa en señalización (Figura 11B) . En consecuencia, se realizaron experimentos para determinar si la expresión de una ObR truncada deficiente en señalización podría interrumpir las señalización por la ObR de longitud completa. Se co-transfectaron las células con cantidades crecientes del receptor truncado OB-R?868-1165 en relación con la ObR de longitud completa, y se ensayó la capacidad de estos complejos para estimular la expresión de una construcción de gen reportero. La co-transfección de cantidades crecientes de ObR truncada, da como resultado una señalización disminuida por el receptor de tipo silvestre (Figura 15A) . Sin embargo, inclusive con un gran exceso de receptor truncado para el de longitud completa, la expresión de señalización observada no se aproximó al grado de reducción observado para la represión de la señalización de G-CSFR mediante la G-CSFR truncada deficiente en señalización y sobre-expresada (?cito) (Figura 15A y Figura 15C) . La diferente sensibilidad a la represión negativa dominante observada para ObR y G-CSFR fue una propiedad de sus dominios extracelulares, que como se muestra por los estudios negativos dominantes con las quimeras receptoras (Figura 15B y Figura 15C) . Una explicación potencial para esta expresión negativa dominante débil de ObR, es que la interacción de dos moléculas de ObR puede requerir de dominios funcionales que residan en la región intracelular del receptor. Para resolver esta posibilidad, se examinó la represión negativa dominante de ObR por un receptor mutante que se hizo defectuoso en señalización mediante una sola sustitución de aminoácido (Y1141F) en el motivo del cuadro 3 de ObR. Como se describió anteriormente, esta mutación eliminó completamente la capacidad de la ObR para modular la inducción del gen por medio de células IL-6RE en H-35 (Sección 12) . En consecuencia, se investigó la capacidad de OB-R(Y1141F) para inhibir la señalización de la ObR de tipo silvestre mediante este elemento mejorador. Estos estudios revelaron que el incremento de la proporción de la OB-RY1141F mutante transfectada al receptor de tipo silvestre, no reprimió fuertemente la señalización (Figura 15E) . Por consiguiente, el mutante del cuadro 3 de ObR y la OB-R?868-1165 se comportan similarmente en su capacidad para trans-reprimir la señalización por la ObR de tipo silvestre. Es interesante que la expresión de bajo nivel del receptor de ObR mutante del cuadro 3 ó truncado genera una ligera mejora de señalización por la ObR de tipo silvestre. Más aún, también se observó un patrón similar para la señalización de ObR/G-CSFR en la presencia de cantidades crecientes de OB-R?868-1165 truncada (Figuras 15A, 15B y 15C) . Como se describió anteriormente (Sección 11) , la ObR puede señalar en células de hepatoma en la presencia de anticuerpos neutralizantes para el componente de transducción de señal gpl30 de los receptores de citoquina tipo IL-6. Más aún, estos hepatomas no expresan las otras cadenas accesorias de receptor de citoquina caracterizadas IL-2R? ó IL-3RS (Wang, y colaboradores, 1995, Blood 86 : 1671 -1679 ; Morella, y colaboradores, 1995, J. Biol . Chem. 270 : 8298-8310) . En consecuencia, es posible que la ObR funcione mediante un mecanismo que involucre la homodimerización del receptor. Entre los miembros de la familia de receptores de citoquina clase I, se predice que la señalización por la G-CSFR es iniciada por la homodimerización del receptor inducida por el ligando (Fukanaga, y colaboradores, 1991, EMBO J. 10 :2855-2865; Ishezaka-Ikeda, y colaboradores, 1993, Proc. Nati . Acad. Sci . U. S. A. 90 : 123 -127) . Como se mencionó anteriormente, se ha probado que los complejos receptores quiméricos son muy productivos para el análisis del mecanismo de la activación del receptor de citoquina (Morella, y colaboradores, 1995, supra; Vigon, y colaboradores, 1993, supra; Baumann, y colaboradores, 1994, supra) , y se produjeron las quimeras ObR/G-CSFR y G-CSFR/ObR, y se estudiaron como un medio para analizar el mecanismo de la señalización de ObR. Estos estudios revelaron que las quimeras G-CSFR/ObR pueden activar fuertemente la transcripción de las construcciones reporteras tanto IL-6RE-CAT como HRRE-CAT (Figura 14B) . Ya que se piensa que la G-CSFR forma un homodímero cuando se fija la G-CSF, esto implica que la acumulación de dos dominios de ObR intracelulares es suficiente para iniciar la señalización del receptor. De una manera similar, la quimera ObR/G-CSFR también media la activación de la transcripción a través de IL-6RE y HRRE (Figura 14B) . Estos resultados muestran que la fijación de leptina puede dimerizar dos cadenas extracelulares de ObR, induciendo de esta manera la asociación de cuando menos dominios intracelulares de G-CSFR, y la activación del complejo receptor. Más aún, estos resultados sugieren que es posible generar moléculas pequeñas ó anticuerpos que actúen como agonistas de ObR a través de una simple reticulación de las dos cadenas de ObR. Como sería predicho para los receptores que son activados mediante una simple homodimerización, la señalización por la G-CSFR de longitud completa y la quimera G-CSFR/ObR, se puede disminuir mucho mediante la co-expresión de un socio de homodimerización deficiente en señalización. Sin embargo, la OB-R?868-1165 fue incapaz de reprimir tan eficientemente la señalización por la ObR de longitud completa ó la quimera ObR/G-CSFR. Por consiguiente, es posible que la fijación de leptina a los receptores de superficie celular pueda dar como resultado una oligomerización de orden más alto (número de receptor>2/complejo) , como se ha demostrado para los complejos receptores de IL-10 (Tan, y colaboradores, 1995, J". Biol . Chem. 21 : 12906-12911) y para los miembros de la familia de Activina/TGF-ßR (Brand, y colaboradores, 1993, J. Biol . Chem. 262 : 11500 -11503 ; Weiser, y colaboradores, 1993, Mol . Cell . Biol . 13 : 7239- 7247; Wrana, y colaboradores, 1994, Cell 71 : 1003 -1014 ; Moustakas, y colaboradores, 1993, J. Biol . Chem . 268 : 22215-22218 ,- Heñís, y colaboradores, 1994, J". Cell Biol . 126. - 139-154) . De acuerdo con este modelo, la fijación del ligando por la ObR de longitud completa o la quimera ObR/G-CSFR puede conducir a una acumulación de más de dos cadenas receptoras, y no obstante, la yuxtaposición de solamente dos dominios intercelulares es suficiente para la generación de señal. Se predeciría que estos complejos serían altamente resistentes a la represión negativa dominante. La fuerte represión de señalización por G-CSFR (?cito) en los complejos que contienen la quimera G-CSFR/ObR demuestra que el dominio intracelular de ObR puede reprimirse eficientemente cuando se coloca en el contexto de una simple estructura homodimérica. Aunque es posible que la OB-R?868-1165 se localice en una región diferente de la membrana que la ObR de tipo silvestre, es poco probable que la mutación de un solo residuo de tirosina del dominio intracelular de ObR (Y1114F) dé como resultado una localización de membrana del receptor alterada. Por consiguiente, nuestra observación de los efectos de represión similares mediados por OB-R?868-1165 u OOB-RY1141F sugiere que nuestros resultados no se deben a una localización de membrana alterada. Los bajos niveles de expresión de OB-R?868-115 y OB-RY1141F generaron una pequeña mejora de la señalización para la ObR de longitud completa y la quimera ObR/G-CSFR. Especulamos que este efecto se puede atribuir a la presentación del ligando (Andrés, y colaboradores, 1989, J. Cell Biol . 109 : 3137-3145; Massaugue, y colaboradores, 1992, Cell 69 : 1067-1070; Lin, y colaboradores, 1993, Trends . Cell Biol . 3 : 14 -19) ó a que el ligando pasa, como se ha observado anteriormente para el receptor del factor de microsis tumoral (tartaglia, y colaboradores, 1993, J. Biol . Chem . 268 : 18542-18548) . Como se observó anteriormente, es posible que las formas cortas de ObR sirvan para una función de transporte ó liberación en el cuerpo (Tartaglia, y colaboradores, 1995, Cell 83 : 1263 -1271) . Sin embargo, la posibilidad de que las formas larga y corta de ObR puedan interactuar funcionalmente sugiere que la forma corta de ObR podría regular las actividades de la forma larga. Esto es apoyado por el hecho de que la forma corta de ObR principal sin señalización que se presenta naturalmente en el ratón (que contiene un dominio intracelular de 34 aminoácidos) , que también corresponde a la ObR mutante que se encuentra en el ratón db/db, puede reprimir la señalización del receptor de forma larga. 14. Depósito de Microorganismos Los siguientes microorganismos se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC) , Rockville, Maryland, en las fechas indicadas, y se les asignó el número de acceso indicado : No. de Acceso Fecha de Microorganismo Clona de ATT depósito E. coli cepa famj5312 69952 22 nov, 1995 5312B4F3 E. coli H-ObRD fahj5312d 69963 5 dic, 1995 E. coli h-ObR-p87 h-ObR-p87 69972 28 dic, 1995 La presente invención no se debe limitar en su alcance por las modalidades específicas descritas en la presente, que se pretenden, ilustraciones de los aspectos individuales de la invención, y los métodos y componentes funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Realmente, los expertos en este campo podrán pensar en diferentes modificaciones de la invención, en adición a las mostradas y descritas en la presente, a partir de la descripción anterior y de los dibujos acompañantes. Se pretende que estas modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 50 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 3097 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN: 61..2742 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 : GTCGACCCAC GCGTCCGGAG GAATCGTTCT GCAAATCCAG GTGTACACCT CTGAAGAAAG 60 ATG ATG TGT CAG AAA TTC TAT GTG GTT TTG TTA CAC TGG GAA TTT CTT 108 Met Met Cys Gln Lys Phe Tyr Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Leu 1 5 10 15 TAT GTG ATA GCT GCA CTT AAC CTG GCA TAT CCA ATC TCT CCC TGG AAA 156 Tyr Val lie Ala Ala Leu Asn Leu Ala Tyr Pro lie Ser Pro Trp Lys 20 25 30 TTT AAG TTG TTT TGT GGA CCA CCG AAC ACÁ ACC GAT GAC TCC TTT CTC 204 Phe Lys Leu Phe Cys Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu 35 40 45 TCA CCT GCT GGA GCC CCA AAC AAT GCC TCG GCT TTG AAG GGG GCT TCT 252 Ser Pro Ala Gly Ala Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser 50 55 60 GAA GCA ATT GTT GAA GCT AAA. TTT AAT TCA AGT GGT ATC TAC GTT CCT 300 Glu Ala lie Val Glu Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly lie Tyr Val Pro 65 70 75 80 GAG TTA TCC AAA ACÁ GTC TTC CAC TGT TGC TTT GGG AAT GAG CAÁ GGT 348 Glu Leu Ser Lys Thr Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly 85 90 95 CAÁ AAC TGC TCT GCA CTC ACÁ GAC AAC ACT GAA GGG AAG ACÁ CTG GCT 396 Gln Asn Cys Ser Ala Leu Thr Asp Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala 100 105 110 TCA GTA GTG AAG GCT TCA GTT TTT CGC CAG CTA GGT GTA AA.C TGG GAC 444 Ser Val Val Lys Ala Ser Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp 115 120 125 ATA GAG TGC TGG ATG AAA GGG GAC TTG AC TTA TTC ATC TGT CAT ATG 492 lie Glu Cys Trp Met Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe lie Cys His Met 130 135 140 GAG CCA TTA CCT AAG AAC CCC TTC AAG AAT TAT GAC TCT AAG GTC CAT 5 0 Glu Pro Leu Pro Lys Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His 145 150 155 160 CTT TTA TAT GAT CTG CCT GAA GTC ATA GAT GAT TCG CCT CTG CCC CCA 588 Leu Leu Tyr Asp Leu Pro Glu Val lie Asp Asp Ser Pro Leu Pro Pro 165 170 175 CTG AAA GAC AGC TTT CAG ACT GTC CA TGC AAC TGC AGT CTT CGG GGA 636 Leu Lys Asp Ser Phe Gln Thr Val Gln Cys Asn Cys Ser Leu Arg Gly 180 185 190 TGT GAA TGT CAT GTG CCG GTA CCC AGA GCC AAA CTC AAC TAC GCT CTT 684 Cys Glu Cys His Val Pro Val Pro Arg Ala Lys Leu Asn Tyr Ala Leu 195 200 205 CTG ATG TAT TTG GAA ATC ACÁ TCT GCC GGT GTG AGT TTT CAG TCA CCT 732 Leu Met Tyr Leu Glu lie Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gln Ser Pro 210 215 220 CTG ATG TCA CTG CAG CCC ATG CTT GTT GTG AAA CCC GAT CCA CCC TTA 780 Leu Met Ser Leu Gln Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu 225 230 235 240 GGT TTG CAT ATG GAA GTC ACÁ GAT GAT GGT AAT TTA AAG ATT TCT TGG 828 Gly Leu His Met Glu Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys lie Ser Trp 245 250 255 GAC AGC CA ACÁ ATG GCA CCA TTT CCG CTT CAÁ TAT CAG GTG AAA TAT 876 Asp Ser Gln Thr Met Ala Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr 260 265 270 TTA GAG AAT TCT ACÁ ATT GTA AGA GAG GCT GCT GAA ATT GTC TCA GCT 924 Leu Glu Asn Ser Thr lie Val Arg Glu Ala Ala Glu lie Val Ser Ala 275 280 285 ACÁ TCT CTG CTG GTA GAC AGT GTG CTT CCT GGA TCT TCA TAT GAG GTC 972 Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val 290 295 300 CAG GTG AGG AGC AAG AGA CTG GAT GGT TCA GGA GTC TGG AGT GAC TGG 1020 Gln Val Arg Ser Lys Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp 305 310 315 320 AGT TCA CCT CA GTC TTT ACC ACÁ CA GAT GTT GTG TAT TTT CCA CCC 1068 Ser Ser Pro Gln Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Val Tyr Phe Pro Pro 325 330 335 AAA ATT CTG ACT AGT GTT GGA TCG AAT GCT TCT TTT CAT TGC ATC TAC 1116 Lys lie Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Cys lie Tyr 340 345 350 AAA AAC GAA AAC CAG ATT ATC TCC TCA AAA CAG ATA GTT TGG TGG AGG 1164 Lys Asn Glu Asn Gln lie lie Ser Ser Lys Gln lie Val Trp Trp Arg 355 360 365 AAT CTA GCT GAG AAA ATC CCT GAG ATA CAG TAC AGC ATT GTG AGT GAC 1212 Asn Leu Ala Glu Lys lie Pro Glu lie Gln Tyr Ser lie Val Ser Asp 370 375 380 CGA GTT AGC AAA GTT ACC TTC TCC AAC CTG AAA GCC ACC AGA CCT CGA 1260 Arg Val Ser Lys Val Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg 385 390 395 400 GGG AAG TTT ACC TAT GAC GCA GTG TAC TGC TGC AAT GAG CAG GCG TGC 1308 Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys 405 410 415 CAT CAC CGC TAT GCT GAA TTA TAC GTG ATC GAT GTC AAT ATC AAT ATA 1356 His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val lie Asp Val Asn lie Asn He 420 425 430 TCA TGT GAA ACT GAC GGG TAC TTA ACT AAA ATG ACT TGC AGA TGG TCA 1404 Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser 435 440 445 CCC AGC ACÁ ATC CAÁ TCA CTA GTG GGA AGC ACT GTG CAG CTG AGG TAT 1452 Pro Ser Thr He Gln Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gln Leu Arg Tyr 450 455 460 CAC AGG CGC AGC CTG TAT TGT CCT GAT AGT CCA TCT ATT CAT CCT ACG 1500 His Arg Arg Ser Leu Tyr Cys Pro Asp Ser Pro Ser He His Pro Thr 465 470 475 480 TCT GAG CCC AAA AAC TGC GTC TTA CAG AGA GAC GGC TTT TAT GAA TGT 1548 Ser Glu Pro Lys Asn Cys Val Leu Gln Arg Asp Gly Phe Tyr Glu Cys 485 490 495 GTT TTC CAG CCA ATC TTT CTA TTA TCT GGC TAT ACÁ ATG TGG ATC AGG 1596 Val Phe Gln Pro He Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp He Arg 500 505 510 ATC AAC CAT TCT TTA GGT TCA CTT GAC TCG CCA CCA ACG TGT GTC CTT 1644 He Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu 515 520 525 CCT GAC TCC GTA GTA .AAA CCA CTA CCT CCA TCT AAC GTA AAA GCA GAG 1692 Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu 530 535 540 ATT ACT GTA AAC ACT GGA TTA TTG AAA GTA TCT TGG GAA AAG CCA GTC 1740 He Thr Val Asn Thr Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val 545 550 555 560 TTT CCG GAG AAT AAC CTT CAÁ TTC CAG ATT CGA TAT GGC TTA AGT GGA 1788 Phe Pro Glu Asn Asn Leu Gln Phe Gln He Arg Tyr Gly Leu Ser Gly 565 570 575 AAA GAA ATA CAÁ TGG AAG ACÁ CAT GAG GTA TTC GAT GCA AAG TCA AAG 1836 Lys Glu He Gln Trp Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys 580 585 590 TCT GCC AGC CTG CTG GTG TCA GAC CTC TGT GCA GTC TAT GTG GTC CAG 1884 Ser Ala Ser Leu Leu Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln 595 600 605 GTT CGC TGC CGG CGG TTG GAT GGA CTA GGA TAT TGG AGT AAT TGG AGC 1932 Val Arg Cys Arg Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser 610 615 620 AGT CCA GCC TAT ACG CTT GTC ATG GAT GTA AAA GTT CCT ATG AGA GGG 1980 Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly 625 630 635 640 CCT GAA TTT TGG AGA AAA ATG GAT GGG GAC GTT ACT AAA AAG GAG AGA 2028 Pro Glu Phe Trp Arg Lys Met Asp Gly Asp Val Thr Lys Lys Glu Arg 645 650 655 AAT GTC ACC TTG CTT TGG AAG CCC CTG ACG AAA AAT GAC TCA CTG TGT 2076 Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Thr Lys Asn Asp Ser Leu Cys 660 665 670 AGT GTG AGG AGG TAC GTT GTG AAG CAT CGT ACT GCC CAC AAT GGG ACG 2124 Ser Val Arg Arg Tyr Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr 675 680 685 TGG TCA GAA GAT GTG GGA AAT CGG ACC AAT CTC ACT TTC CTG TGG ACÁ 2172 Trp Ser Glu Asp Val Gly Asn Arg Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Thr 690 695 700 GAA CCA GCG CAC ACT GTT ACÁ GTT CTG GCT GTC AAT TCC CTC GGC GCT 2220 Glu Pro Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala Val Asn Ser Leu Gly Ala 705 710 715 720 TCC CTT GTG AAT TTT AAC CTT ACC TTC TCA TGG CCC ATG AGT AAA GTG 2268 Ser Leu Val Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val 725 730 735 AGT GCT GTG GAG TCA CTC AGT GCT TAT CCC CTG AGC AGC AGC TGT GTC 2316 Ser Ala Val Glu Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val 740 745 750 ATC CTT TCC TGG AC CTG TCA CCT GAT GAT TAT AGT CTG TTA TAT CTG 2364 He Leu Ser Trp Thr Leu Ser Pro Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu 755 760 765 GTT ATT GAA TGG AAG ATC CTT AAT GAA GAT GAT GGA ATG AAG TGG CTT 2412 Val He Glu Trp Lys He Leu Asn Glu Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu 770 775 780 AGA ATT CCC TCG AAT GTT AAA AAG TTT TAT ATC CAC GAT AAT TTT ATT 2460 Arg He Pro Ser Asn Val Lys Lys Phe Tyr He His Asp Asn Phe He 785 790 795 800 CCC ATC GAG AAA TAT CAG TTT AGT CTT TAC CCA GTA TTT ATG GAA GGA 2508 Pro He Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly 805 810 815 GTT GGA AAA CCA AAG ATA ATT AAT GGT TTC ACC AAA GAT GCT ATC GAC 2556 Val Gly Lys Pro Lys He He Asn Gly Phe Thr Lys Asp Ala He Asp 820 825 830 AAG CAG CAG AAT GAC GCA GGG CTG TAT GTC ATT GTA CCC ATA ATT ATT 2604 Lys Gln Gln Asn Asp Ala Gly Leu Tyr Val He Val Pro He He He 835 840 845 TCC TCT TGT GTC CTA CTG CTC GGA ACÁ CTG TTA ATT TCA CAC CAG AGA 2652 Ser Ser Cys Val Leu Leu Leu Gly Thr Leu Leu He Ser His Gln Arg 850 855 860 ATG AAA AAG TTG TTT TGG GAC GAT GTT CCA AAC CCC AAG AA.T TGT TCC 2700 Met Lys Lys Leu Phe Trp Asp Asp Val Pro Asn Pro Lys Asn Cys Ser 865 870 875 880 TGG GCA CAÁ GGA CTG AAT TTC CAÁ AAG AGA ACG GAC ACT CTT 2742 Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Arg Thr Asp Thr Leu 885 890 TGAAGTCTCT CATGACCACT ACAGATGAAC CCAATCTACC AACTTCCCAA CAGTCCATAC 2802 AATATTAGAA GATGTTTACA TTTTGATGGA GGGAAACAAA CCTAAACTAT GGTTTGAATG 2862 ACTAAGAAAT AACATTTGAT GAGCTTATTA GAGAAGTGTA TATTTTGTGG CCACAATGTA 2922 GGTTTGATGT AGTTCAGTTT GGGACATATG CTTGATTTTC AGGGCATCAA AAATTTAAAG 2982 TTGATATTCA TGGACTCTGC ATTTTATTTC TTAAGTCATA AAATGATAAT GGTGTGACGG 3042 TTGGTGTCAG AACCTATTTG GGTACAGATC ACCAAAATAT GGTAGGTAAT GCCTT 3097 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 894 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : Met Met Cys Gln Lys Phe Tyr Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Leu 1 5 10 15 Tyr Val He Ala Ala Leu Asn Leu Ala Tyr Pro He Ser Pro Trp Lys 20 25 30 Phe Lys Leu Phe Cys Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu 40 45 Ser Pro Ala Gly Ala Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser 50 55 60 Glu Ala He Val Glu Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly He Tyr Val Pro 65 70 75 80 Glu Leu Ser Lys Thr Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly 85 90 95 Gln Asn Cys Ser Ala Leu Thr Asp Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala 100 105 110 Ser Val Val Lys Ala Ser Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp 115 120 125 He Glu Cys Trp Met Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe He Cys His Met 130 135 140 Glu Pro Leu Pro Lys Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His 145 150 155 160 Leu Leu Tyr Asp Leu Pro Glu Val He Asp Asp Ser Pro Leu Pro Pro 165 170 175 Leu Lys Asp Ser Phe Gln Thr Val Gln Cys Asn Cys Ser Leu Arg Gly 180 185 190 Cys Glu Cys His Val Pro Val Pro Arg Ala Lys Leu Asn Tyr Ala Leu 195 200 205 Leu Met Tyr Leu Glu He Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gln Ser Pro 210 215 220 Leu Met Ser Leu Gln Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu 225 230 235 240 Gly Leu His Met Glu Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys He Ser Trp 245 250 255 Asp Ser Gln Thr Met Ala Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr 260 265 270 Leu Glu Asn Ser Thr He Val Arg Glu Ala Ala Glu He Val Ser Ala 275 280 285 Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val 290 295 300 Gln Val Arg Ser Lys Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp 305 310 315 320 Ser Ser Pro Gln Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Val Tyr Phe Pro Pro 325 330 335 Lys He Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Cys He Tyr 340 345 350 Lys Asn Glu Asn Gln He He Ser Ser Lys Gln He Val Trp Trp Arg 355 360 365 Asn Leu Ala Glu Lys He Pro Glu He Gln Tyr Ser He Val Ser Asp 370 375 380 Arg Val Ser Lys Val Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg 385 390 395 400 Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys 405 410 415 His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val He Asp Val Asn He Asn He 420 425 430 Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser 435 440 445 Pro Ser Thr He Gln Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gln Leu Arg Tyr 450 455 460 His Arg Arg Ser Leu Tyr Cys Pro Asp Ser Pro Ser He His Pro Thr 465 470 475 480 Ser Glu Pro Lys Asn Cys Val Leu Gln Arg Asp Gly Phe Tyr Glu Cys 485 490 495 Val Phe Gln Pro He Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp He Arg 500 505 510 He Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu 515 520 525 Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu 530 535 540 He Thr Val Asn Thr Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val 545 550 555 560 Phe Pro Glu Asn Asn Leu Gln Phe Gln He Arg Tyr Gly Leu Ser Gly 565 570 575 Lys Glu He Gln Trp Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys 580 585 590 Ser Ala Ser Leu Leu Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln 595 600 605 Val Arg Cys Arg Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser 610 615 620 Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly 625 630 635 640 Pro Glu Phe Trp Arg Lys Met Asp Gly Asp Val Thr Lys Lys Glu Arg 645 650 655 Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Thr Lys Asn Asp Ser Leu Cys 660 665 670 Ser Val Arg Arg Tyr Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr 675 680 685 Trp Ser Glu Asp Val Gly Asn Arg Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Thr 690 695 700 Glu Pro Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala Val Asn Ser Leu Gly Ala 705 710 715 720 Ser Leu Val Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val 725 730 735 Ser Ala Val Glu Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val 740 745 750 He Leu Ser Trp Thr Leu Ser Pro Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu 755 760 765 Val He Glu Trp Lys He Leu Asn Glu Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu 770 775 780 Arg He Pro Ser Asn Val Lys Lys Phe Tyr He His Asp Asn Phe He 785 790 795 800 Pro He Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly 805 810 815 Val Gly Lys Pro Lys He He Asn Gly Phe Thr Lys Asp Ala He Asp 820 825 830 Lys Gln Gln Asn Asp Ala Gly Leu Tyr Val He Val Pro He He He 835 840 845 Ser Ser Cys Val Leu Leu Leu Gly Thr Leu Leu He Ser His Gln Arg 850 855 860 Met Lys Lys Leu Phe Trp Asp Asp Val Pro Asn Pro Lys Asn Cys Ser 865 870 875 880 Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Arg Thr Asp Thr Leu 885 890 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 3871 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: CADN (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN: 194..3688 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: S?Q ID NO : 3 : GGCACGAGCC GGTCTGGCTT GGGCAGGCTG CCCGGGCCGT GGCAGGAAGC CGGAAGCAGC 60 CGCGGCCCCA GTTCGGGAGA CATGGCGGGC GTTAAAGCTC TCGTGGCATT ATCCTTCAGT 120 GGGGCTATTG GACTGACTTT TCTTATGCTG GGATGTGCCT TAGAGGATTA TGGGTGTACT 180 TCTCTGAAGT AAG ATG ATT TGT CAÁ AAA TTC TGT GTG GTT TTG TTA CAT 229 Met He Cys Gln Lys Phe Cys Val Val Leu Leu His 1 5 10 TGG GAA TTT ATT TAT GTG ATA ACT GCG TTT AAC TTG TCA TAT CCA ATT 277 Trp Glu Phe He Tyr Val He Thr Ala Phe Asn Leu Ser Tyr Pro He 15 20 25 ACT CCT TGG AGA TTT AAG TTG TCT TGC ATG CCA CCA AAT TCA ACC TAT 325 Thr Pro Trp Arg Phe Lys Leu Ser Cys Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr 30 35 40 GAC TAC TTC CTT TTG CCT GCT GGA CTC TCA AAG AAT ACT TCA AAT TCG 373 Asp Tyr Phe Leu Leu Pro Ala Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser 45 50 55 60 AAT GGA CAT TAT GAG ACÁ GCT GTT GAA CCT AAG TTT AAT TCA AGT GGT 421 Asn Gly His Tyr Glu Thr Ala Val Glu Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly 65 70 75 ACT CAC TTT TCT AAC TTA TCC AAA ACÁ ACT TTC CAC TGT TGC TTT CGG 469 Thr His Phe Ser Asn Leu Ser Lys Thr Thr Phe His Cys Cys Phe Arg 80 85 90 AGT GAG CAÁ GAT AGA AAC TGC TCC TTA TGT GCA GAC AAC ATT GAA GGA 517 Ser Glu Gln Asp Arg Asn Cys Ser Leu Cys Ala Asp Asn He Glu Gly 95 100 105 AAG ACÁ TTT GTT TCA ACÁ GTA AAT TCT TTA GTT TTT CAÁ CAÁ ATA GAT 565 Lys Thr Phe Val Ser Thr Val Asn Ser Leu Val Phe Gln Gln He Asp 110 115 120 GCA AAC TGG AAC ATA CAG TGC TGG CTA AAA GGA GAC TTA AAA TTA TTC 613 Ala Asn Trp Asn He Gln Cys Trp Leu Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe 125 130 135 140 ATC TGT TAT GTG GAG TCA TTA TTT AAG AAT CTA TTC AGG AAT TAT AAC 661 He Cys Tyr Val Glu Ser Leu Phe Lys Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn 145 150 155 TAT AAG GTC CAT CTT TTA TAT GTT CTG CCT GAA GTG TTA GAA GAT TCA 709 Tyr Lys Val His Leu Leu Tyr Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser 160 165 170 CCT CTG GTT CCC CAÁ AAA GGC AGT TTT CAG ATG GTT CAC TGC AAT TGC 757 Pro Leu Val Pro Gln Lys Gly Ser Phe Gln Met Val His Cys Asn Cys 175 180 185 AGT GTT CAT GAA TGT TGT GAA TGT CTT GTG CCT GTG CCA ACÁ GCC AAA 805 Ser Val His Glu Cys Cys Glu Cys Leu Val Pro Val Pro Thr Ala Lys 190 195 200 CTC AAC GAC ACT CTC CTT ATG TGT TTG AAA ATC ACÁ TCT GGT GGA GTA 853 Leu Asn Asp Thr Leu Leu Met Cys Leu Lys He Thr Ser Gly Gly Val 205 210 215 220 ATT TTC CAG TCA CCT CTA ATG TCA GTT CAG CCC ATA AAT ATG GTG AAG 901 lie Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Val Gln Pro He Asn Met Val Lys 225 230 235 CCT GAT CCA CCA TTA GGT TTG CAT ATG GAA ATC ACÁ GAT GAT GGT AAT 949 Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu His Met Glu He Thr Asp Asp Gly Asn 240 245 250 TTA AAG ATT TCT TGG TCC AGC CCA CCA TTG GTA CCA TTT CCA CTT CAÁ 997 Leu Lys lie Ser Trp Ser Ser Pro Pro Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln 255 260 265 TAT CAÁ GTG AAA TAT TCA GAG AAT TCT ACÁ ACÁ GTT ATC AGA GAA GCT 1045 Tyr Gln Val Lys Tyr Ser Glu Asn Ser Thr Thr Val He Arg Glu Ala 270 275 280 GAC AAG ATT GTC TCA GCT ACÁ TCC CTG CTA GTA GAC AGT ATA CTT CCT 1093 Asp Lys He Val Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser He Leu Pro 285 290 295 300 GGG TCT TCG TAT GAG GTT CAG GTG AGG GGC AAG AGA CTG GAT GGC CCA 1141 Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gly Pro 305 310 315 GGA ATC TGG AGT GAC TGG AGT ACT CCT CGT GTC TTT ACC ACÁ CAÁ GAT 1189 Gly He Trp Ser Asp Trp Ser Thr Pro Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp 320 325 330 GTC ATA TAC TTT CCA CCT AAA ATT CTG ACÁ AGT GTT GGG TCT AAT GTT 1237 Val He Tyr Phe Pro Pro Lys He Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Val 335 340 345 TCT TTT CAC TGC ATC TAT AAG AAG GAA AAC AAG ATT GTT CCC TCA AAA 1285 Ser Phe His Cys He Tyr Lys Lys Glu Asn Lys He Val Pro Ser Lys 350 355 360 GAG ATT GTT TGG TGG ATG AAT TTA GCT GAG AAA ATT CCT CAÁ AGC CAG 1333 Glu He Val Trp Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys He Pro Gln Ser Gln 365 370 375 380 TAT GAT GTT GTG AGT GAT CAT GTT AGC AAA GTT ACT TTT TTC AAT CTG 1381 Tyr Asp Val Val Ser Asp His Val Ser Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu 385 390 395 AAT GAA ACC AAA CCT CGA GGA AAG TTT ACC TAT GAT GCA GTG TAC TGC 1429 Asn Glu Thr Lys Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys 400 405 410 TGC AAT GAA CAT GAA TGC CAT CAT CGC TAT GCT GAA TTA TAT GTG ATT 1477 Cys Asn Glu His Glu Cys His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val He 415 420 425 GAT GTC AAT ATC AAT ATC TCA TGT GAA ACT GAT GGG TAC TTA ACT AAA 1525 Asp Val Asn He Asn He Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys 430 435 440 ATG ACT TGC AGA TGG TCA ACC AGT ACÁ ATC CAG TCA CTT GCG GAA AGC 1573 Met Thr Cys Arg Trp Ser Thr Ser Thr He Gln Ser Leu Ala Glu Ser 445 450 455 460 ACT TTG CA TTG AGG TAT CAT AGG AGC AGC CTT TAC TGT TCT GAT ATT 1621 Thr Leu Gln Leu Arg Tyr His Arg Ser Ser Leu Tyr Cys Ser Asp He 465 470 475 CCA TCT ATT CAT CCC ATA TCT GAG CCC AAA GAT TGC TAT TTG CAG AGT 1669 Pro Ser He His Pro He Ser Glu Pro Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser 480 485 490 GAT GGT TTT TAT GAA TGC ATT TTC CAG CCA ATC TTC CTA TTA TCT GGC 1717 Asp Gly Phe Tyr Glu Cys He Phe Gln Pro He Phe Leu Leu Ser Gly 495 500 505 TAC ACÁ ATG TGG ATT AGG ATC AAT CAC TCT CTA GGT TCA CTT GAC CTC 1765 Tyr Thr Met Trp He Arg He Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Leu 510 515 520 CCA CCA ACÁ TGT GTC CTT CCT GAT TCT GTG GTG AAG CCA CTG TCT CCA 1813 Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Ser Pro 525 530 535 540 TCC AGT GTG AAA GCA GAA ATT ACT ATA AAC ATT GGA TTA TTG AAA ATA 1861 Ser Ser Val Lys Ala Glu He Thr He Asn He Gly Leu Leu Lys He 545 550 555 TCT TGG GAA AAG CCA GTC TTT CCA GAG AAT AAC CTT CAÁ TTC CAG ATT 1909 Ser Trp 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1105 1110 1115 CAG GAC AGT TGC TCA CAC TTT GTA GAA AAT AAT ATC AAC TTA GGA ACT 3589 Gln Asp Ser Cys Ser His Phe Val Glu Asn Asn He Asn Leu Gly Thr 1120 1125 1130 TCT AGT AAG AAG ACT TTT GCA TCT TAC ATG CCT CAÁ TTC CAÁ ACT TGT 3637 Ser Ser Lys Lys Thr Phe Ala Ser Tyr Met Pro Gln Phe Gln Thr Cys 1135 1140 1145 TCT ACT CAG ACT CAT AAG ATC ATG GAA AAC AAG ATG TGT GAC CTA ACT 3685 Ser Thr Gln Thr His Lys He Met Glu Asn Lys Met Cys Asp Leu Thr 1150 1155 1160 GTG TAATTTCACT GAAGAAACCT TCAGATTTGT GTTATAATGG GTAATATAAA 3738 Val 1165 GTGTAATAGA TTATAGTTGT GGGTGGGAGA GAGAAAAGAA ACCAGAGTCC AAATTTGAAA 3798 ATAATTGTTC CCAACTGAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3858 AAAAAAAAAA AAA 3871 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1165 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 4 : Met He Cys Gln Lys Phe Cys Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe He 1 5 10 15 Tyr 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ID NO : 6 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: S?Q ID NO:6: Trp Ser Xaa Trp Ser 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: CATCTTACTT CAGAGAA 17 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 8 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 8 : CATCTTACTT CAGAGAAGTA CAC 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 9 : (i) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 9 : CATCTTACTT CAGAGAAGTA CACCCATAA 29 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: CATCTTACTT CAGAGAAGTA CACCCATAAT CCTCT 35 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: AATCATCTTA CTTCAGAGAA GTACACCCAT AATCC 35 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 12 : CTTACTTCAG AGAAGTACAC CCATAATCC 29 (2) INFORMACIÓN PARA S?Q ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN D? LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: TCAGAGAAGT ACACCCATAA TCC 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 14 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA S?CU?NCIA: SEQ ID NO: 14: AAGTACACCC ATAATCC 17 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 56 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: RNA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: ACAGAAUUUU UGACAAAUCA AAGCAGANNN NUCUGAGNAG UCCUUACUUC AGAGAA 56 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 57 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO D? MOLÉCULA: RNA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 16 : GGCCCGGGCA GCCUGCCCAA AGCCGGNNNN CCGGAGNAGU CGCCAGACCG GCUCGUG 57 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 56 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: RNA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17: UGGCAUGCAA GACAAAGCAG GNNNNCCUGA GNAGUCCUUA AAUCUCCAAG GAGUAA 56 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 50 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: RNA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: UAUAUGACAA AGCUGUNNNN ACAGAGNAGU CCUUGUGUGG UAAAGACACG 50 (2) INFORMACIÓN PARA FOR SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 61 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: RNA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: AGCACCAAUU GAAUUGAUGG CCAAAGCGGG NNNNCCCGAG NAGUCAACCG UAACAGUAUG 60 U 61 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 69 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: RNA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20: UGAAAUUGUU UCAGGCUCCA AAGCCGGNNN NCCGGAGNAG UCAAGAAGAG GACCACAUGU 60 CACUGAUGC 69 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 61 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: RNA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: GGUUUCUUCA GUGAAAUUAC ACAAAGCAGC NNNNGCUGAG NAGUCAGUUA GGUCACACAU 60 C 61 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: RNA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA S?CUENCIA: S?Q ID NO:22: ACCCAUUAUA ACACAAAGCU GANNNNUCAG AGNAGUCAUC UGAAGGUUUC UUC 53 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23: GCTGCACTTA ACCTGGC 17 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECU?NCIA: (A) LONGITUD: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24: GGATAACTCA GGAACG 16 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25: CACTATTTGC CCTTCAG 17 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO D? CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO D? MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECU?NCIA: SEQ ID NO: 26: GCCTGAGATA GGGGTGC 17 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: S?Q ID NO: 27: CACTATTTGC CCTTCAG _ 17 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS D? LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28: GCCTGAGATA GGGGTGC 17 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29: Pro Asn Pro Lys Asn Cys Ser Trp l 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30: CCAAACCCCA AGAATTGTTC CTGG 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: desconocido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31: Lys He Met Glu Asn Lys Met Cys Asp 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) D?SCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32: TCRCACATYT TRTTNCCCAT TATCTT 26 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33: Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34: GCACAAGGAC TGAATTTCCA AAAG 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35: CTGCCTGAAG TGTTAGAAGA 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO D? CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) D?SCRIPCIÓN D? LA S?CUENCIA: SEQ ID NO: 36: GCTGAACTGA CATTAGAGGT G _ 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS D? LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37: ACCTATGAGG ACGAAAGCCA GAGAC 25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN D? LA SECUENCIA: S?Q ID NO: 38: TGTGAGCAAC TGTCCTCGAG AACT 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39: GTCACGATGT CGACGTGTAC TTCTCTGAAG TAAGATGATT TG 42 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40: GTCAGGTCAG AAAAGCTTAT CACTCTGTGT TTTTCAATAT CATCTTGAGT GAA 53 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41: (i) CARACTERÍSTICAS D? LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: S?Q ID NO: 41: AAGCTTTTCT GACCTGACNN N 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42: (i) CARACTERÍSTICAS D? LA S?CUENCIA: (A) LONGITUD: 3854 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO D? CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 61..3546 (xi) DESCRIPCIÓN D? LA S?CUENCIA: SEQ ID NO: 42: GTCGACCCAC GCGTCCGGAG GAATCGTTCT GCAAATCCAG GTGTACACCT CTGAAGAAAG 60 ATG ATG TGT CAG AAA TTC TAT GTG GTT TTG TTA CAC TGG GAA TTT CTT 108 Met Met Cys Gln Lys Phe Tyr Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Leu l 5 10 15 TAT GTG ATA GCT GCA CTT AAC CTG GCA TAT CCA ATC TCT CCC TGG AAA 156 Tyr Val He Ala Ala Leu Asn Leu Ala Tyr Pro He Ser Pro Trp Lys 20 25 30 TTT AAG TTG TTT TGT GGA CCA CCG AAC ACÁ ACC GAT GAC TCC TTT CTC 204 Phe Lys Leu Phe Cys Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu 35 40 45 TCA CCT GCT GGA GCC CCA AAC AAT GCC TCG GCT TTG AAG GGG GCT TCT 252 Ser Pro Ala Gly Ala Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser 50 55 60 GAA GCA ATT GTT GAA GCT AAA TTT AAT TCA AGT GGT ATC TAC GTT CCT 300 Glu Ala He Val Glu Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly He Tyr Val Pro 65 70 75 80 GAG TTA TCC AAA ACÁ GTC TTC CAC TGT TGC TTT GGG AAT GAG CAÁ GGT 348 Glu Leu Ser Lys Thr Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly 85 90 95 CAÁ AAC TGC TCT GCA CTC ACÁ GAC AAC ACT GAA GGG AAG ACÁ 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GAT GTT GTG TAT TTT CCA CCC 1068 Ser Ser Pro Gln Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Val Tyr Phe Pro Pro 325 330 335 AAA ATT CTG ACT AGT GTT GGA TCG AAT GCT TCT TTT CAT TGC ATC TAC 1116 Lys He Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Cys He Tyr 340 345 350 AAA AAC GAA AAC CAG ATT ATC TCC TCA AAA CAG ATA GTT TGG TGG AGG 1164 Lys Asn Glu Asn Gln He He Ser Ser Lys Gln He Val Trp Trp Arg 355 360 365 AAT CTA GCT GAG AAA ATC CCT GAG ATA CAG TAC AGC ATT GTG AGT GAC 1212 Asn Leu Ala Glu Lys He Pro Glu He Gln Tyr Ser He Val Ser Asp 370 375 380 CGA GTT AGC AAA GTT ACC TTC TCC AAC CTG AAA GCC ACC AGA CCT CGA 1260 Arg Val Ser Lys Val Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg 385 390 395 400 GGG AAG TTT ACC TAT GAC GCA GTG TAC TGC TGC AAT GAG CAG GCG TGC 1308 Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys 405 410 415 CAT CAC CGC TAT GCT GAA TTA TAC GTG ATC GAT GTC AAT ATC AAT ATA 1356 His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val He Asp Val Asn He Asn He 420 425 430 TCA TGT GAA ACT GAC GGG TAC TTA ACT AAA ATG ACT TGC AGA TGG TCA 1404 Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser 435 440 445 CCC AGC ACÁ ATC CAÁ TCA CTA GTG GGA AGC ACT GTG CAG CTG AGG TAT 1452 Pro Ser Thr He Gln Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gln Leu Arg Tyr 450 455 460 CAC AGG CGC AGC CTG TAT TGT CCT GAT AGT CCA TCT ATT CAT CCT ACG 1500 His Arg Arg Ser Leu Tyr Cys Pro Asp Ser Pro Ser He His Pro Thr 465 470 475 480 TCT GAG CCC AAA AAC TGC GTC TTA CAG AGA GAC GGC TTT TAT GAA TGT 1548 Ser Glu Pro Lys Asn Cys Val Leu Gln Arg Asp Gly Phe Tyr Glu Cys 485 490 495 GTT TTC CAG CCA ATC TTT CTA TTA TCT GGC TAT ACÁ ATG TGG ATC AGG 1596 Val Phe Gln Pro He Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp He Arg 500 505 510 ATC AAC CAT TCT TTA GGT TCA CTT GAC TCG CCA CCA ACG TGT GTC CTT 1644 He Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu 515 520 525 CCT GAC TCC GTA GTA AAA CCA CTA CCT CCA TCT AAC GTA AAA GCA GAG 1692 Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu 530 535 540 ATT ACT GTA AAC ACT GGA TTA TTG AAA GTA TCT TGG GAA AAG CCA GTC 1740 He Thr Val Asn Thr Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val 545 550 555 560 TTT CCG GAG AAT AAC CTT CAÁ TTC CAG ATT CGA TAT GGC TTA AGT GGA 1788 Phe Pro Glu Asn Asn Leu Gln Phe Gln He Arg Tyr Gly Leu Ser Gly 565 570 575 AAA GAA ATA CAÁ TGG AAG ACÁ CAT GAG GTA TTC GAT GCA AAG TCA AAG 1836 Lys Glu He Gln Trp Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys 580 585 590 TCT GCC AGC CTG CTG GTG TCA GAC CTC TGT GCA GTC TAT GTG GTC CAG 1884 Ser Ala Ser Leu Leu Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln 595 600 605 GTT CGC TGC CGG CGG TTG GAT GGA CTA GGA TAT TGG AGT AAT TGG AGC 1932 Val Arg Cys Arg Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser 610 615 620 AGT CCA GCC TAT ACG CTT GTC ATG GAT GTA AAA GTT CCT ATG AGA GGG 1980 Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly 625 630 635 640 CCT GAA TTT TGG AGA AAA ATG GAT GGG GAC GTT ACT AAA AAG GAG AGA 2028 Pro Glu Phe Trp Arg Lys Met Asp Gly Asp Val Thr Lys Lys Glu Arg 645 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GCC 3372 Gly Val Seu Leu Thr Gly Glu Ala Gly He Leu Cys Thr Phe Pro Ala 1090 1095 1100 CAG TGT CTG TTC ACT GAC ATC AGG ATC CTC CAG GAG AGA TGC TCA CAC 3420 Gln Cys Leu Phe Ser Asp He Arg He Leu Gln Glu Arg Cys Ser His 1105 1110 1115 1120 TTT GTA GAA AAT AAT TTG AGT TTA GGG ACC TCT GGT GAG AAC TTT GTA 3468 Phe Val Glu Asn Asn Leu Ser Leu Gly Thr Ser Gly Glu Asn Phe Val 1125 1130 1135 CCT TAC ATG CCC CAÁ TTT CAÁ ACC TGT TCC ACG CAC AGT CAC AAG ATA 3516 Pro Tyr Met Pro Gln Phe Gln Thr Cys Ser Thr His Ser His Lys He 1140 1145 1150 ATG GAG AAT AAG ATG TGT GAC TTA ACT GTG 3546 Met Glu Asn Lys Met Cys Asp Leu Thr Val 1155 1160 TAATCTCATC CAAGAAGCCT CAAGGTTCCA TTCCAGTAGA GCCTGTCATG TATAATGTGT 3606 TCTTTTATTG TTGTGGATGT GGGAGACAAG TGTCAGAATC TAGTGTGAAA ATGATTGTTT 3666 CCAAACTAAG TGTGTCTATT TTCTCTCAGT AATACANATG AAACATATGA GGAAGCCCTC 3726 ATTAATCTAC TAATGTAGAT GGACTCTTAC TGAATATATT CCCAAGATAC TTGGGGAAGT 3786 CTCCCTAATT CTAGCTAAAA GAANTAGAAC TACTAAACAC TGAATCTGGA AAAAAAAAAA 3846 AAAAAAAG 3854 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1162 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43: Met Met Cys Gln Lys Phe Tyr Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Leu 1 5 10 15 Tyr Val He Ala Ala Leu Asn Leu Ala Tyr Pro He Ser Pro Trp Lys 20 25 30 Phe Lys Leu Phe Cys Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu 40 45 Ser Pro Ala Gly Ala Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser 50 55 60 Glu Ala He Val Glu Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly He Tyr Val Pro 65 70 75 80 Glu Leu Ser Lys Thr Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly 85 90 95 Gln Asn Cys Ser Ala Leu Thr Asp Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala 100 105 110 Ser Val Val Lys Ala Ser Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp 115 120 125 He Glu Cys Trp Met Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe He Cys His Met 130 135 140 Glu Pro Leu Pro Lys Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His 145 150 155 160 Leu Leu Tyr Asp Leu Pro Glu Val He Asp Asp Ser Pro Leu Pro Pro 165 170 175 Leu Lys Asp Ser Phe Gln Thr Val Gln Cys Asn Cys Ser Leu Arg Gly 180 185 190 Cys Glu Cys His Val Pro Val Pro Arg Ala Lys Leu Asn Tyr Ala Leu 195 200 205 Leu Met Tyr Leu Glu He Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gln Ser Pro 210 215 220 Leu Met Ser Leu Gln Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu 225 230 235 240 Gly Leu His Met Glu Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys He Ser Trp 245 250 255 Asp Ser Gln Thr Met Ala Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr 260 265 270 Leu Glu Asn Ser Thr He Val Arg Glu Ala Ala Glu He Val Ser Ala 275 280 285 Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val 290 295 300 Gln Val Arg Ser Lys Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp 305 310 315 320 Ser Ser Pro Gln Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Val Tyr Phe Pro Pro 325 330 335 Lys He Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Cys He Tyr 340 345 350 Lys Asn Glu Asn Gln He He Ser Ser Lys Gln He Val Trp Trp Arg 355 360 365 Asn Leu Ala Glu Lys He Pro Glu He Gln Tyr Ser 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Asn Cys He Ser Ser Asn His Ser Pro Leu Arg Gln Ser Phe Ser 1010 1015 1020 Ser Ser Ser Trp Glu Thr Glu Ala Gln Thr Phe Phe Leu Leu Ser Asp 1025 1030 1035 1040 Gln Gln Pro Thr Met He Ser Pro Gln Leu Ser Phe Ser Gly Leu Asp 1045 1050 1055 Glu Leu Leu Glu Leu Glu Gly Ser Phe Pro Glu Glu Asn His Arg Glu 1060 1065 1070 Lys Ser Val Cys Tyr Leu Glu Val Thr Ser Val Asn Arg Arg Glu Ser 1075 1080 1085 Gly Val Seu Leu Thr Gly Glu Ala Gly He Leu Cys Thr Phe Pro Ala 1090 1095 1100 Gln Cys Leu Phe Ser Asp He Arg He Leu Gln Glu Arg Cys Ser His 1105 1110 1115 1120 Phe Val Glu Asn Asn Leu Ser Leu Gly Thr Ser Gly Glu Asn Phe Val 1125 1130 1135 Pro Tyr Met Pro Gln Phe Gln Thr Cys Ser Thr His Ser His Lys He 1140 1145 1150 Met Glu Asn Lys Met Cys Asp Leu Thr Val 1155 1160 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44: TCRCACATYT TRTTNCCCAT TATCTT 16 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECU?NCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DB CAD?NA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45: CCCAATGTCG ACATGATGTG TCAGAAATTC TAT 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46: AAAAAGGATC CGGTCATTCT GCTGCTTGTC GAT 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN D? LA SECU?NCIA: SEQ ID NO:47: CCCAATGTCG ACATGGTGTA CTTCTCTGAA GTA 33 (2) INFORMACÍÓN PARA SEQ ID NO: 48: (i) CARACT?RÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CAD?NA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48: TTTTTGGATC CCACCTGCAT CACTCTGGTG 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49: (i) CARACT?RÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49: TTTAACTTGT CATATCCAAT TACTCCTTGG AGATTTAAGT TGTCTTGC 48 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA S?CUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO D? CAD?NA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO D? MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: S?Q ID NO: 50: TTTTTGGATC CCACCTGCAT CACTCTGGTG 30

Claims (72)

1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico aislada, que contiene la secuencia de nucleótidos del gen obR.
2. 2. Una molécula de ácido nucleico aislada, la cual codifica un receptor Ob, o un fragmento de éste, teniendo una secuencia de nucleótidos que: codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 o la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc contenido en la clona famj5312 de ADNc, como se depositó en la ATCC teniendo el número de acceso 69952; o codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 6; o codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3 o la secuencia de aminoácidos contenida en la clona fajh5312d de ADNc, como se depositó en la ATCC teniendo número de acceso 69963, o en la clona genómica h-obR-p87, como se depositó en la ATCC; o híbrida bajo condiciones estringentes a la secuencia de nucleótidos (a), (b) o (c) o a su complemento.
3. 3. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido correspondiente al dominio extracelular, de transmembrana o citoplásmico de la proteína receptora Ob, o un mutante de supresión de la proteína receptora Ob en el cual se suprime el dominio de transmembrana o el dominio citoplásmico.
4. 4. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una proteína quimérica que comprende el polipéptido de la reivindicación 3 fusionado a un polipéptido heterólogo.
5. 5. La secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 4, en la cual el polipéptido heterólogo es una región constante de una inmunoglobulina.
6. 6. Un vector nucleótido conteniendo la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, 2, 3, 4 o 5.
7. 7. Un vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, 2, 3, 4 o 5 en asociación operativa con una secuencia regulatoria de nucleótidos que controla la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula anfitriona.
8. 8. El vector de expresión de la reivindicación 7, en el cual dicha secuencia regulatoria es seleccionada del grupo que consiste en el gen temprano inmediato del citomegalovirus hCMV, los promotores temprano o tardío del adenovirus SV40, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, las regiones de operador y promotor mayores del fago ?, las regiones de control de la proteína de revestimiento fd, el promotor para 3-fosfoglicerato quinasa, los promotores de fosfatasa acida, y los promotores de los factores de a-apareamiento de levadura.
9. 9. Una célula anfitriona genéticamente manipulada, que contiene la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, 2, 3, 4 o 5.
10. 10. Una célula anfitriona genéticamente manipulada que contiene la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, 2, 3, 4 o 5 en asociación operativa con una secuencia regulatoria de nucleótidos que controla la expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula anfitriona.
11. 11. La célula anfitriona genéticamente manipulada de la reivindicación 10, en la cual la célula anfitriona es un fibroblasto, una célula de ovario de hámster chino, una célula COS, o una célula VERO, una célula hipotalámica o una célula del plexo coroide.
12. 12. Una proteína receptora Ob aislada.
13. 13. Una proteína receptora Ob aislada que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en las figuras 1, 3 o 6, o una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc contenido en la clona famj5312 de ADNc, como se depositó en la ATCC teniendo número de acceso 69952, o la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc contenida en la clona fahj5312d de ADNc, como se depositó con la ATCC teniendo número de acceso 69963, o la secuencia de aminoácidos codificada por la clona genómica h-obR-p87, como se depositó con la ATCC.
14. 14. Un polipéptido teniendo una secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular, de transmembrana o citoplásmico de la proteína receptora Ob, o un mutante de supresión de la proteína receptora Ob en el cual se suprime el dominio de transmembrana o el dominio citoplásmico.
15. 15. Una proteína quimérica que comprende el polipépti-do de la reivindicación 14 fusionado a un polipéptido heterólogo.
16. 16. La proteína quimérica de la reivindicación 15, en la cual el polipéptido heterólogo es una región constante de una inmunoglobulina .
17. 17. Un anticuerpo que liga inmunoespecíficamente la proteína receptora Ob de la reivindicación 12 o 13.
18. 18. Un anticuerpo que liga inmunoespecíficamente el polipéptido de la reivindicación 14.
19. 19. Un método para diagnosticar desórdenes del peso corporal en un mamífero, que comprende medir la expresión del gen obR en una muestra del paciente.
20. 20. El método de la reivindicación 19, en el cual la expresión es medida detectando transcripciones de ARNm del gen obR.
21. 21. El método de la reivindicación 19, en el cual la expresión es medida detectando el producto del gen obR.
22. 22. Un método para diagnosticar desórdenes del peso corporal en un mamífero, que comprende detectar una mutación del gen obR contenida en el genoma del mamífero.
23. 23. Un método para analizar compuestos útiles para el tratamiento de desórdenes del peso corporal, que comprende poner en contacto un compuesto con una célula anfitriona cultivada que expresa el gen obR, y detectar un cambio en la expresión del gen obR, un cambio en la actividad del producto del gen obR expresado por la célula cultivada, o un cambio en la tirosina fosforilación de una proteína de una célula anfitriona, o un cambio en el flujo iónico en la célula anfitriona.
24. 24. El método de la reivindicación 23, en el cual la expresión del gen obR es detectada midiendo transcripciones de ARNm del gen obR.
25. 25. El método de la reivindicación 23, en el cual la expresión del gen obR es detectada midiendo la proteína receptora Ob.
26. 26. El método de la reivindicación 23, en el cual la tirosina fosforilación de la proteína de la célula anfitriona es ensayada usando un anticuerpo anti-fosfotirosina.
27. 27. Un método para tratar un desorden de bajo peso corporal en un mamífero, que comprende administrar un compuesto al mamífero en una cantidad suficiente para inhibir la activación del receptor Ob por Ob endógena.
28. 28. El método de la reivindicación 27, en el cual el desorden de bajo peso corporal es anorexia, caquexia, bulimia, enflaquecimiento relacionado con SIDA o enflaquecimiento relacionado con cáncer.
29. 29. El método de la reivindicación 27, en el cual el compuesto es entregado al hipotálamo o el plexo coroide.
30. 30. El método de la reivindicación 27, en el cual el compuesto es un antagonista que se liga al receptor Ob e inhibe la activación del receptor.
31. 31. El método de la reivindicación 27, en el cual el compuesto se liga a Ob endógena y neutraliza la actividad de Ob.
32. 32. El método de la reivindicación 31, en la cual el compuesto es un polipéptido que corresponde al dominio extracelular del receptor de Ob o una porción del dominio extracelular que se liga a Ob, una proteína receptora Ob de mutante de supresión que carece del dominio de transmembrana o citoplásmico, o una proteína de fusión quimérica que comprende el dominio extracelular del receptor Ob, o una porción del dominio extracelular que se liga a Ob, o un mutante de supresión de transmembrana fusiónado a un polipéptido heterólogo.
33. 33. El método de la reivindicación 32, en el cual el polipéptido heterólogo de la proteína de fusión quimérica es la región constante de una inmunoglobulina.
34. 34. El método de la reivindicación 32 o 33, en el cual el compuesto es entregado al mamífero administrando una célula anfitriona manipulada genéticamente que expresa y secreta el polipéptido o la proteína de fusión en el mamífero.
35. 35. El método de la reivindicación 31, en el cual el compuesto es un anticuerpo anti-idiotípico, o una porción Fab del mismo, que imita el dominio extracelular del receptor Ob y neutraliza Ob endógena.
36. 36. Un método para tratar un desorden de peso corporal bajo en un mamífero, que comprende administrar un compuesto al mamífero en una cantidad suficiente para inhibir la expresión del receptor Ob in vivo .
37. 37. El método de la reivindicación 36, en el cual el desorden de bajo peso corporal es anorexia, caquexia, bulimia, enflaquecimiento relacionado con SIDA o enflaquecimiento relacionado con cáncer.
38. 38. El método de la reivindicación 36, en el cual el compuesto es entregado al hipotálamo o el plexo coroide.
39. 39. El método de la reivindicación 36, en el cual el compuesto es un oligonucleótido anti-sentido que inhibe la traducción de transcripciones de ARNm que codifican el receptor Ob.
40. 40. El método de la reivindicación 36, en el cual el compuesto es una ribozima que inhibe la traducción de las transcripciones de ARNm que codifican el receptor Ob.
41. 41. El método de la reivindicación 36, en el cual el compuesto es un oligonucleótido que forma una triple hélice con la región regulatoria del gen receptor Ob e inhibe la transcripción.
42. 42. El método de la reivindicación 36, en el cual el compuesto es una construcción de ADN recombinante que inactiva el gen receptor Ob o su región regulatoria vía recombinación homologa objetivada.
43. 43. Un método para tratar un desorden de bajo peso corporal en un mamífero, que comprende administrar un compuesto al mamífero en una cantidad suficiente para inhibir la transduc-ción de señal inducida por ligadura de Ob endógena al receptor Ob.
44. 44. El método de la reivindicación 43, en el cual el desorden de bajo peso corporal es anorexia, caquexia, bulimia, enflaquecimiento relacionado con SIDA o enflaquecimiento relacio-nado con cáncer.
45. 45. El método de la reivindicación 43, en el cual el compuesto es entregado al hipotálamo o al plexo coroide.
46. 46. El método de la reivindicación 43, en el cual el compuesto inhibe la actividad de un mediador intracelular de la transducción de señal inducida por el receptor Ob.
47. 47. El método de la reivindicación 46, en el cual el compuesto inhibe una tirosina quinasa o una tirosina fosfatasa.
48. 48. El método de la reivindicación 43, 44 o 45, en el cual el compuesto es una construcción de oligonucleótidos que codifica un receptor Ob incompetente en señalización controlado por una secuencia regulatoria que dirige la expresión del receptor incompetente en señalización en células objetivo en el cuerpo.
49. 49. El método de la reivindicación 48, en el cual la construcción de oligonucleótido codifica un mutante de supresión incompetente en señalización del receptor Ob en el cual todo o una porción del dominio citoplásmico es suprimido.
50. 50. Un método para tratar la obesidad en un mamífero, que comprende administrar un compuesto a un mamífero en una cantidad suficiente para regular la expresión de un receptor Ob funcional en el mamífero.
51. 51. El método de acuerdo con la reivindicación 50, en el cual el compuesto es entregado al hipotálamo o al plexo coroide .
52. 52. El método de la reivindicación 50 o 51, en el cual el mamífero expresa un receptor Ob defectuoso y el compuesto comprende una construcción de nucleótidos que codifica un receptor Ob funcional controlado por una región regulatoria que dirige la expresión del receptor funcional en células objetivo en el mamífero.
53. 53. El método de la reivindicación 50 o 51, en el cual el mamífero expresa un receptor Ob mutante y el compuesto comprende una construcción de nucleótidos que codifica un receptor Ob tipo salvaje que corrige la mutación endógena vía la recombi-nación homologa objetivada.
54. 54. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor Ob, dicha molécula de ácido nucleico teniendo una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1 a 868 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3.
55. 55. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor Ob, dicha molécula de ácido nucleico teniendo una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1 a 965 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3.
56. 56. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifi-ca un receptor Ob, dicha molécula de ácido nucleico teniendo una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1 a 1065 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3.
57. 57. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor Ob, dicha molécula de ácido nucleico teniendo una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1 a 1115 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3.
58. 58. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor Ob que puede inducir expresión de gen mediada por IL-6RE.
59. 59. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor Ob que puede inducir expresión de gen mediada por HRRE.
60. 60. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 54-57, dicha molécula codificando una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la figura 3.
61. 61. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 59, dicha molécula codificando una secuencia de aminoácidos teniendo al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 965 de la figura 3.
62. 62. Un método para evaluar si un agente de prueba es un agente candidato para tratamiento de desórdenes del peso corporal, que comprende: (a) exponer células eucarióticas que expresan un gen que codifica un polipéptido ObR a dicho agente de prueba; y (b) medir la expresión de dicho gen por dichas células eucarióticas en la presencia de dicho agente de prueba; donde dicho agente de prueba es identificado como un agente candidato para tratamiento de desórdenes del peso corporal cuando la expresión de dicho gen en la presencia de dicho agente de prueba difiere de la expresión de dicho gen por dichas células eucarióticas en la ausencia de dicho agente de prueba.
63. 63. El método de la reivindicación 62, comprendiendo además medir la expresión de dicho gen por dichas células euca-rióticas en la ausencia de dicho agente.
64. 64. Un método para evaluar si un agente de prueba es un agente candidato para tratamiento de desórdenes del peso corporal, que comprende: (a) exponer células eucarióticas que expresan un gen que codifica un polipéptido ObR a dicho agente de prueba; y (b) medir la ligadura de dicho agente de prueba a dichas células eucarióticas; donde dicho agente es identificado como un agente candidato para tratamiento de desórdenes del peso corporal cuando la ligadura de dicho agente de prueba a dichas células eucarióticas difiere de la ligadura de dicho agente de prueba para controlar células eucarióticas que no expresan dicho gen, dichas células eucarióticas de control siendo de otra manera idénticas a dichas células eucarióticas que expresan dicho gen.
65. 65. El método de la reivindicación 64, comprendiendo además medir la ligadura de dicho agente de prueba a dichas células eucarióticas de control.
66. 66. Un método para evaluar si un agente de prueba es un agente candidato para tratamiento de desórdenes del peso corporal, que comprende: (a) exponer un polipéptido obR a dicho agente de prueba; y (b) medir la ligadura de dicho agente a dicho polipéptido obR; donde dicho agente de prueba es identificado como un agente candidato para tratamiento de desórdenes del peso corporal cuando dicho agente de prueba liga selectivamente dicho polipéptido obR.
67. 67. El método de la reivindicación 62, 64, o 66, donde dicho polipéptido obR comprende el dominio citoplásmico de obR.
68. 68. El método de la reivindicación 67, donde dicho dominio citoplásmico comprende los aminoácidos 861 a 1,165 de la figura 3.
69. 69. El método de la reivindicación 67, donde dicho polipéptido obR comprende además el dominio extracelular de obR.
70. 70. El método de la reivindicación 66, donde dicho polipéptido obR está fusionado a una etiqueta detectable.
71. 71. El método de la reivindicación 62 o 64, donde dicha célula eucariótica es una célula del plexo coroide.
72. 72. El método de la reivindicación 62 o 64, donde dicho gen es un gen recombinante.