MXPA98003147A

MXPA98003147A - Composiciones de endostatina antiangiogenica terapeutica y metodos de uso

Info

Publication number: MXPA98003147A
Application number: MXPA/A/1998/003147A
Authority: MX
Inventors: S O Reilly Michael; M Folkman Judah
Original assignee: M Folkman Judah; O'reilly Michael S
Priority date: 1995-10-23
Filing date: 1998-04-22
Publication date: 1998-11-12

Abstract

La presente invención se refiere a un inhibidor de la proliferación celular endotelial, capaz de inhibir la angiogénesis y causar la regresión tumoral, que es de aproximadamente 20 kDa y que corresponde a un fragmento C-terminal de colágeno tipo XVIII y métodos para tratar la enfermedad relacionada con angiogénesis.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS ANTIANGIOGENICOS TERAPÉUTICOS Referencia Cruzada con Casos Relacionados Anteriores Esta solicitud reivindica la prioridad para la solicitud provisional Serie No. 60/005,835 presentada el 23 de Octubre de 1995; solicitud provisional Serie No. 60/023,070 presentada el 2 de Agosto de 1996; y solicitud provisional Serie No. 60/026,263 presentada el 17 de Septiembre de 1996. Cada una de las solicitudes mencionadas anteriormente se incorpora en la presente en su totalidad. Campo Técnico Esta solicitud se refiere a un inhibidor novedoso de angiogénesis útil para tratar enfermedades relacionadas con la angiogénesis, tal como cáncer dependiente de angiogénesis. La invención además se refiere a un método y composición novedosa para curar el cáncer dependiente de angiogénesis. Además, la presente invención se refiere a equipos y análisis para la medición de endostatina, a equipos histoquímicos para la localización de endostatina, a pruebas moleculares para monitorear la biosíntesis de endostatina, a anticuerpos que son específicos para la endostatina, al desarrollo de agonistas de péptido y antagonistas para el receptor de endostatina, y a agentes citotóxicos enlazados a péptidos de endostatina. Antecedentes de la Invención Varias líneas de evidencia directa sugieren ahora que la angiogénesis es esencial para el crecimiento y persistencia de tumores sólidos y sus metástasis (Folkman, 1989; Hori y cois, 1991; Kim y cois, 1993; Millauer y cois, 1994) . Para estimular la angiogénesis, los tumores regulan su producción de una variedad de factores angiogénicos, incluyendo los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF y BFGF) (Kandel y cois, 1991) y el factor de crecimiento celular endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF) . Sin embargo, muchos tumores malignos también generan inhibidores de angiogénesis, incluyendo angiostatina y trombospondina (Chen y cois, 1995; Good y cois, 1990; O'Reilly y cois, 1994) . Se postula que el fenotipo angiogénico es el resultado de un balance neto entre estos reguladores positivos y negativos de neovascularización (Good y cois, 1990; O'Reilly y cois, 1994; Parangi y cois, 1996; Rastinejad y cois, 1989) . Se han identificado otros inhibidores endógenos de angiogénesis, aunque no todos se asocian con la presencia de un tumor. Estos incluyen, el factor de plaqueta 4 (Grupta y cois, 1995; Maione y cois, 1990), interferón-alfa, proteína de inteferón-inducible 10 (Angiolillo y cois, 1995); Strieter y cois, 1995), la cual se induce por interleucina-12 y/o interferón-gamma (Voes y cois, 1995) , gro-beta (Cao y cois, 1995), y el fragmento 16 kDa N- terminal de prolactina (Clapp y cois, 1993) . El único inhibidor de la angiogénesis conocido que inhibe específicamente la proliferación de células endoteliales es la angiostatina (O'Reilly y cois, 1994) . La angiostatina es un inhibidor específico de aproximadamente 38 kiloDalton (kDa) de la proliferación celular endotelial. La angiostatina es un fragmento interno de plasminógeno que contiene al menos tres de los cinco kringles de plasminógeno. Se ha mostrado que la angiostatina reduce el peso del tumor y que inhibe la metástasis en ciertos modelos de tumores (O'Reilly y cois, 1994) . Como se utiliza de aquí en adelante, el término "angiostatina" se refiere a la angiostatina como se describió anteriormente; fragmentos de péptido de angiostatina que tienen actividad inhibidora de proliferación celular endotelial; y análogos de angiostatina que tienen homología substancial de secuencia (como se define en la presente) para la secuencia de aminoácido de angiostatina, que tiene actividad inhibidora de proliferación celular endotelial. Sumario de la Invención La presente invención se refierea un inhibidor novedoso de proteína, y método para su uso. La proteína es un inhibidor potente y específico de proliferación endotelial y angiogénesis. La terapia sistémica con el inhibidor causa una supresión casi completa de la angiogénesis que induce el tumor, y exhibe fuerte actividad anti-tumoral . La proteína inhibitoria tiene un peso molecular de aproximadamente 18,000 a aproximadamente 20,000 Daltons (18 a 20 kDa) y es capaz de inhibir la proliferación celular endotelial en células endoteliales cultivadas. La proteína puede caracterizarse además por su secuencia preferida de aminoácidos N-terminal, los primeros veinte (20) de la cual se encuentran como sigue: His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (SEC ID NO: 1) Un inhibidor preferido de proliferación celular endotelial de la invención es una proteína que tiene las características descritas anteriormente, y la cual puede aislarse y purificarse a partir de la línea celular hemangioendotelioma murina EOMA. Esta proteína inhibitoria se ha nombrado endostatina. La presente invención proporciona métodos y composiciones para tratar enfermedades y procesos mediados por la angiogénesis indeseada e incontrolada, mediante la administración a un humano o animal con la angiogénesis indeseada, una composición que comprende un derivado de endostatina o endostatina substancialmente purificada en una dosis suficiente para inhibir la angiogénesis. La presente invención es particularmente útil para tratar o para reprimir el crecimiento de tumores. La administración de endostatina a un humano o animal con tumores metastizados, prevascularizados previene el crecimiento o expansión de esos tumores. La presente invención también incluye equipos y métodos de diagnóstico para la detección y medición de endostatina en tejidos y fluidos biológicos, y para la localización de endostatina en los tejidos. El equipo y método de diagnóstico puede encontrarse en cualquier configuración bien conocida por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. La presente invención también incluye anticuerpos específicos para la endostatina y anticuerpos que inhiben el aglutinamiento de anticuerpos específicos para la endostatina. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos específicos para la endostatina pueden utilizarse en equipos de diagnóstico para detectar la presencia y cantidad de endostatina que es el diagnóstico o pronóstico para la aparición o repetición de cáncer u otras enfermedades mediadas por angiogénesis. Los anticuerpos específicos para endostatina pueden administrarse también a un humano o animal para inmunizar pasivamente al humano o animal contra la endostatina, reduciendo así la inhibición angiogénica. La presente invención también incluye equipos y métodos de diagnóstico para detectar la presencia y cantidad de anticuerpos que aglutinan la endostatina en fluidos corporales. El equipo y método de diagnóstico puede encontrarse en cualquier configuración bien conocida por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. La presente invención también incluye fragmentos de péptido de endostatina que pueden designarse isotópicamente o con otras moléculas o proteínas para usarse en la detección y visualización de sitios de aglutinamiento de endostatina con el estado de las técnicas de la materia, incluyendo pero no limitándose a, tomografía de emisión de positrón, autoradiografía, citometría de flujo, análisis de aglutinamiento de radioreceptores, e inmunohistoquímica . Estos péptidos de endostatina también actúan como agonistas y antagonistas en el receptor de endostatina, aumentando o bloqueando así la actividad biológica de la endostatina. Tales péptidos se utilizan en el aislamiento del receptor de endostatina. La presente invención también incluye endostatina, fragmentos de endostatina, antisueros de endostatina, o agonistas del receptor de endostatina y antagonistas enlazados a agentes citotóxicos para aplicaciones de investigación y terapéuticas. La presente invención incluye pruebas moleculares para el ácido ribonucleico y ácido deoxiribonucléico incorporados en la transcripción y translación de endostatina. Estas pruebas moleculares proporciona medios para detectar y medir la biosíntesis de endostatina en tejidos y células. Un descubrimiento sorprendente es que diversas formas de proteína de endostatina recombinante pueden servir como compuestos de anti-angiogénesis de liberación sostenida cuando se administran a un animal que padece de un tumor. Una forma preferida del compuesto de liberación sostenida es la endostatina producida recombinantemente sin replegar. Además, la presente invención incluye secuencias de ácidos nucleicos que comprende codones de nucleotidos correspondientes que codifican la secuencia de aminoácido expuesta anteriormente y para la endostatina y fragmentos de péptido que inhiben la proliferación celular endotelial de la misma. La presente invención también se refiere a métodos para utilizar la proteína de endostatina y fragmentos de péptido, que corresponden a las secuencias de ácido nucleico, y anticuerpos que se aglutinan específicamente al inhibidor y sus péptidos, para diagnosticar los desordenes y enfermedades relacionadas con la célula endotelial. La invención incluye además un método para identificar receptores específicos para la endostatina, y mediante esto las moléculas receptoras identificada y aisladas . La invención también se refiere a un método para identificar enzimas novedosas capaces de liberar endostatina del colágeno tipo XVIII, y otras moléculas que contienen una secuencia de aminoácidos de endostatina, y péptidos de la misma. Tales enzimas que producen endostatina también son un aspecto de la invención. Un método médico importante es una nueva forma de control de nacimiento, en donde una cantidad efectiva de endostatina se administra a una hembra, de tal manera que la vascularización endometrial uterina se inhibe y no puede ocurrir o sostener la implantación del embrión. Un aspecto particularmente importante de la invención es el descubrimiento de un método efectivo y novedoso para tratar las enfermedades relacionadas con la angiogénesis, particularmente el cáncer dependiente de la angiogénesis en pacientes, y para curar el cáncer dependiente de la angiogénesis en pacientes. El método proporciona inesperadamente el resultado de inhibición médicamente importante de reducción y crecimiento tumoral de la masa del tumor. El método se refiere a la coadministración de la endostatina de la presente invención y otro compuesto de antiangiogenésis, preferentemente angiostatina. De acuerdo con lo anterior, la invención también incluye formulaciones que contienen endostatina, y opcionalmente angiostatina, las cuales son efectivas para tratar o curar los cánceres dependientes de la angiogénesis . De acuerdo con lo anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar una composición que comprende una proteína de endostatina. Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para tratar las enfermedades y procesos que se median por la angiogénesis. Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un método y equipo de diagnóstico o pronóstico para detectar la presencia y cantidad de endostatina en un tejido o fluido corporal. Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un método y composición para tratar enfermedades y proceso que se median por la angiogénesis, incluyendo pero no limitándose a, hemangíoma, tumores sólidos, leucemia, metástasis, esclerodermia de psoriasis de telangiectasia, granuloma piogénico, angiogénesis miocardial, neovascularización de placa, colaterales de coronarias, colaterales cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis del miembro isquémico, enfermedades corneales, rubeosis, glaucoma neovascular, retinopatía diabética, fibroplasia retrolental, artritis, neovascularización diabética, degeneración macular, curación de heridas, ulcera péptica, fracturas, queloides, vasculogénesis, hematopoyesis, ovulación, menstruación y placentación. Es otro objeto de la presente invención proporcionar una composición para tratar o reprimir el crecimiento de un cáncer. Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para detectar y cuantificar la presencia de un anticuerpo específico para una endostatina en un fluido corporal. Todavía es otro objeto de la presente invención proporcionar una composición que consiste de anticuerpos para la endostatina que son selectivos para regiones específicas de la molécula de endostatina. Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método de detección o pronóstico de cáncer. Es otro objeto de la presente invención proporcionar una composición para usarse en la visualización y cuantificación de sitios de aglutinamiento de endostatina in vi vo e in vi tro . Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar una composición para usarse en la detección y cuantificación de biosíntesis de endostatina. Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar una terapia para el cáncer que tiene efectos laterales mínimos. Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que comprende endostatina o un péptido de endostatina enlazado a un agente citotóxico para tratar o reprimir el crecimiento de un cáncer. Estos y otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán aparentes después de una revisión de la siguiente descripción detallada de las modalidades expuestas y las reivindicaciones anexas. Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Inhibici ón de la Proliferaci ón cel ular endotelial Capilar por Medio Condi ci onado de Cél ulas EOMA El medio condicionado colectado a partir de las células EOMA confluentes o el medio base se aplicó a células endoteliales capilares bovinas con 1 ng/ml bFGF en un análisis de proliferación por 72 horas. La proliferación celular endotelial se inhibió por el medio condicionado de EOMA. Cada barra representa el medio ± SEM.

Figura 2: Purificación de un Inhibidor de la Proliferación Endotelial a partir del Medio Condicionado de EOMA. El medio condicionado colectado a partir de las células de EOMA confluentes se fraccionó en una columna de sefarosa de heparina. La actividad que inhiben la proliferación endotelial eluyó a aproximadamente 0.8M NaCl.

Figura 3: Purificación de un Inhibidor de la Proliferación Endotelial por Fil tración de Gel . El inhibidor purificado a partir de la cromatografía de columna de sefarosa de heparina se aplicó a una columna de filtración de gel y se eluyó como un solo pico. Figura 4: Purifi caci ón de un Inhibidor de la Proliferación Cel ular Endotelial por Cromatografía de Col umna de Fase Inversa . El inhibidor purificado por sefarosa de heparina y cromatografía de filtración de gel se aplicó a una columna de fase inversa. El inhibidor se eluyó como una sola banda a partir de la columna en aproximadamente 45% del acetonitrilo. Figura 5: Secuencia de Aminoácidos de N-terminal de un Inhibidor de la Proliferaci ón Cel ular Endotelial . La secuencia N-terminal del inhibidor purificado de la proliferación celular endotelial se muestra en relación con un diagrama esquemático de colágeno tipo 18.

La secuencia N-terminal reveló la identidad del inhibidor a un fragmento C-terminal de aproximadamente 20 kDa (mostrado en sombreado fuerte) para colágeno tipo XVIII. Las cajas abiertas representan los dominios de colagenasa de colágeno tipo XVIII. Figura 6: Tratamiento del Carcinoma de Lewis en pulmón con Inhibidor Recombinante de Endostatina de Ratón . El inhibidor recombinante producido en E. coli se administró a ratones inseminados con carcinoma de Lewis en pulmón que logró un volumen de tumor de aproximadamente 150 mm3. El inhibidor se administró en 20 mg/kg/día. La masa tumoral regresó a niveles no detectables después de aproximadamente 12 días de tratamiento. Figura 7: Terapia Sistémica con Tumores Primari os de Carcinoma de Lewis en pulmón de Regreso de endostatina Recombínante . (A) Los ratones se implantaron de manera subcutánea en el dorso con células de carcinoma de Lewis en pulmón. La terapia sistémica con endostatina recombinante de ratón (20 mg/kg/día) comenzó cuando los tumores fueron de aproximadamente 200 mm3 (1% de peso corporal) . Los tumores en los ratones tratados con el inhibidor de endostatina rápidamente regresaron e inhibieron por >99% en relación a los controles tratados con salina. Cada punto representa el medio ± SEM por 5 ratones. El experimento se repitió con resultados comparables. (B) Ratones representativos que padecen de tumor, tratados y sin tratar después de 11 días de terapia sistémica con endostatina. Los ratones tratados con salina (derecha) tuvieron tumores rojos que crecen rápidamente con superficies ulceradas. Los ratones tratados con endostatina (izquierda) tuvieron pequeños tumores residuales pálidos (flecha) . (C) La enfermedad residual en ratones tratados con endostatina. Tres de cinco ratones tratados con endostatina se sacrificaron después de 16 días de terapia. La autopsia reveló pequeños tumores residuales blancos en el sitio de la implantación primaria original (flechas) . Figura 8: Tratamiento de Fibrosarcoma T241 Murina con Endostatina Recombinante de Ratón a partir de E. coli . A los ratones se les colocaron células de Fibrosarcoma T241. Los ratones del control se trataron con salina. Los ratones experimentales se trataron con 20 mg/kg/día de endostatina recombinante de ratón directa de E. coli . Figura 9: Tratamiento del Melanoma B16F10 Murino con Endosta tina Recombinante de Ratón a partir de E. coli . A los ratones se les colocaron células de melanoma B16F10 murino. Los animales de control se trataron con salina. Los animales experimentales se trataron con 20 mg/Kg/día de endostatina recombinante de ratón directa de E.coli Figura 10: Tratamiento de Hemangi oendotelioma EOMA con Endostatina Recombinante de Ratón a partir de E. coli . A los ratones se les colocaron células de hemangioendotelioma de EOMA. Los animales del control se trataron con salina. Los animales experimentales se trataron con 20 mg/kg/día de endostatina recombinante de ratón directa de E. coil . Figura 11: Tra tamiento de Carcinoma de Lewis en pulmón con Endosta tina Recombinante de Ra tón o Humano directo de E. coli . A los ratones se les colocaron células de Carcinoma de Lewis en pulmón. Los animales del control se trataron con salina. Los animales experimentales se trataron con endostatina recombinante derivada de la secuencia de ratón o de la Endostatina Recombinante directa de la secuencia humana, en donde ambas Endostatinas se producen recombinantemente en el E. coli . La Endostatina de ratón se administró en ya sea 20 mg/kg/día o 2.5 mg/kg/día, y la Endostatina Humana se administró en 20 mg/kg/día. Figura 12: Resul tados de Endostatina en una Inhibición de Angiogénesi s y un Incremento en Apoptosis de Tumores Primarios de Carcinoma de Lewis en pulmón .

Las secciones histológicas de tumores de los ratones tratados con salina contra los ratones tratados con endostatina implantados con carcinomas de Lewis en pulmón se analizaron para la proliferación (PCNA) , apoptosis (TÚNEL) , y angiogénesis (vWF) . No existió una diferencia significativa en el índice proliferativo de las células tumorales (A) en tumores tratados contra tumores sin tratar. En contraste, el índice apóptico de las células del tumor (B) incremento 8 veces (p < 0.001) en los ratones tratados con endostatina. La densidad de vaso (C) se determinó al contar el número de vasos sanguíneos capilares por campo de energía elevada (HPF) en secciones manchadas con anticuerpos contra vWF. La angiogénesis casi se suprimió completamente en los tumores microscópicos residuales de los ratones tratados con endostatina (p <0.001) . Figura 13: Terapia de Dormancia de Ciclo del Carcinoma de Lewi s en pulmón con Endosta tina Recombinante de Ra tón a partir de E. coli . Los ratones fueron implantados subcutáneamente en el dorso con células de carcinoma de Lewis en pulmón. La terapia sistémica con inhibidor recombinante de ratón (endostatina) administrada a una dosis de 20 mg/kg/día comenzó cuando los tumores fueron de aproximadamente 200 mm3 (1% de peso corporal) . Los tumores en los ratones tratados con el inhibidor de endostatina rápidamente regresaron a niveles esencialmente no detectables después de aproximadamente 15 días de terapia. Cuando el tratamiento se término el volumen del tumor aumento rápidamente y fue tratable subsecuentemente a los mismos niveles no detectables por el reinicio del tratamiento. Los picos y valles en la figura muestran el efecto cíclico de inhibición con endostatina. Figura 14: Terapia de Combinación con Endosta tina y Angiosta tina Recombinante de Ratón a partir de E. coli . Los ratones se implantaron subcutáneamente en el dorso con células de carcinoma de Lewis en pulmón. La terapia sistémica con una combinación de endostatina recombinante de ratón (20 mg/kg/día) y angiostatina recombinante de ratón (20 mg/kg/día) comenzó cuando los tumores fueron de aproximadamente 300 mm3. Los tumores en los ratones tratados con la terapia de combinación rápidamente regresaron al nivel esencialmente no detestable en aproximadamente 15 días. De manera importante, los tumores regresados permanecieron en reposo y no se incrementaron en tamaño o masa después de que se detuvo el tratamiento. Esto es un resultado inesperado de significado médico substancial. Descripción Detallada de la Invención. Los solicitantes han descubierto una nueva clase de moléculas de proteína que tienen la habilidad de inhibir la proliferación endotelial cuando se agregan a las células endoteliales que se proliferan in vi tro . De acuerdo con lo anterior, estas moléculas de proteína se han definido funcionalmente como endostatinas, sin embargo, debe entenderse que esta definición funcional de ninguna manera limita la bioactividad de las endostatinas para la inhibición del crecimiento celular endotelial in vi tro o in vivo . Muchas otras funciones de endostatinas son similares. El término "endostatina" se refiere a una proteína que es preferentemente en tamaño de 18 kDa a 20 kDa como se determina por la electroforésis de gel reducida y no reducida, respectivamente. El término endostatina también incluye formas precursoras de la proteína de 18 kDa a 20 kDa. El término endostatina también incluye fragmentos de la proteína de 18 kDa a 20 kDa y péptidos y proteínas modificadas que tienen una secuencia de aminoácido substancialmente similar, y que son capaces de inhibir la proliferación de células endoteliales. Por ejemplo, las substituciones silenciosas de aminoácidos, en donde la colocación de un aminoácido con un aminoácido estructural o químicamente similar no altera significativamente la estructura, conformación o actividad de la proteína, son bien conocidas en la materia. Tales substituciones silenciosas se intenta que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Se apreciará que el término "endostatina" incluye péptidos o proteínas reducidas en donde uno o más aminoácidos se retiran ya sea en ambos extremos de endostatina, o de una región interna de la proteína, así la molécula resultante retiene la actividad inhibidora de la proliferación endotelial. El término "endostatina" también incluye péptidos o proteínas aumentadas en donde uno o más aminoácidos se agregan a uno o ambos extremos de endostatina, o a una localización interna en la proteína, así la molécula resultante retiene la actividad inhibidora de proliferación endotelial. Tales moléculas, por ejemplo con tirosina agregada en la primer posición son útiles para etiquetar tal como radioiodinación con 125iodina para usarse en los análisis. El etiquetado con otros radioisótopos puede ser útil en proporcionar una herramienta molecular para destruir la célula objetivo que contiene receptores de endostatina. Otro etiquetado con moléculas tal como ricina puede proporcionar un mecanismo para destruir células con receptores de endostatina. "Homología de secuencia substancial" significa al menos aproximadamente 70% de homología entre la secuencia del residuo del aminoácido en la secuencia análoga de endostatina y esa de la endostatina, preferentemente al menos aproximadamente 80% de homología, más preferentemente al menos aproximadamente 90% de homología. También incluidas en la definición del término endostatina se encuentran las modificaciones de la proteína de endostatina, sus subunidades y fragmentos de péptidos. Tales modificaciones incluyen substituciones de aminoácidos que ocurren naturalmente en sitios específicos con otras moléculas, incluyendo pero no limitando a aminoácidos que ocurren naturalmente o no naturalmente. Tales substituciones pueden modificar la bioactividad de endostatina y producir antagonistas o agonistas farmacológicos o biológicos. El término endostatina también incluye un fragmento N-terminal de endostatina que consiste de la secuencia de los primeros 20 aminoácidos N-terminal, la cual se muestra en SEQ ID NO:l y se muestra en la Tabla 1. Esta secuencia de los primeros 20 aminoácidos N-terminal corresponde a un fragmento C-terminal de colágeno tipo XVIII identificado recientemente. La tabla 1 muestra la correspondencia de designaciones de aminoácido de 3 letras y 1 letra.

TABLA 1 Aminoácido Residuo Abreviación 1 HIS H 2 THR T 3 HIS H 4 GLN Q 5 ASP D 6 PHE F 7 GLN Q 8 PRO P 9 VAL V 10 LEU L 11 HIS H 12 LEU L 13 VAL V 14 ALA A 15 LEU L 16 ASN N 17 THR T 18 PRO P 19 LEU L 20 SER S La secuencia de aminoácido N-terminal de endostatina corresponde a un fragmento interno de péptido de 20 aminoácidos encontrado en colágeno de ratón tipo XVIII alfa 1 comenzando en el aminoácido 1105 y terminando en el aminoácido 1124. La secuencia de aminoácido N- terminal del inhibidor también corresponde a un fragmento interno de péptido de 20 aminoácidos encontrado en colágeno humano tipo XVIII alfa 1 comenzando en el aminoácido 1132 y terminando en el aminoácido 1151. La endostatina puede aislarse de hemangioendostelioma murina EOMA. La endostatina puede producirse a partir de fuentes recombinantes, a partir de células alteradas genéticamente implementadas dentro de animales, a partir de tumores, y a partir de cultivos de células así como otras fuentes. Se anticipa que la endostatina se forma en células del sistema nervioso. La endostatina puede aislarse a partir de fluidos corporales que incluyen pero no se limitan a, suero, orina, y ascitis, o por métodos biológicos o químicos sintetizados (por ejemplo, cultivo de célula, expresión del gen recombinante, síntesis de péptido y catálisis enzimatica in vi tro de molecular precursoras para producir endostatina activa) . Las técnicas recombinantes incluyen la amplificación del gen a partir de fuentes de DNA utilizando la reacción de cadena de polimerasa (PCR) , y la amplificación del gen a partir de fuentes de RNA utilizando trasncriptasa inversa/PCR. La endostatina específica y reversiblemente inhibe la proliferación celular endotelial. Las moléculas de proteína del inhibidor de la invención son útiles como una droga para el control de nacimiento, y para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis, particularmente tumores y cánceres dependientes de la angiogénesis. Las moléculas de proteína también son útiles para curar tumores y cánceres dependientes de la angiogénesis. La habilidad inesperada y sorprendente de estos compuestos novedosos para tratar y curar los tumores y cánceres dependientes de la angiogénesis responde a una necesidad sin satisfacer sentida por mucho tiempo en las técnicas médicas, y proporciona un importante beneficio a la humanidad. Los términos importantes que se utilizan en la presente se definen como sigue: "Cáncer" significa tumores y cánceres dependientes de la angiogénesis, es decir, tumores que requieren para su crecimiento (expansión en volumen y/o masa) un incremento en el número y densidad de los vasos sanguíneos supliéndolos entonces con sangre. "Regresión" se refiere a la reducción del tamaño y masa del tumor. Las proteínas inhibidoras de la proliferación endotelial de la presente invención, pueden hacerse por metodologías de síntesis de proteína automatizada bien conocidos para un experto en la materia. Alternativamente, las proteínas inhibidoras de la proliferación endotelial, o endostatinas, de la presente invención pueden aislarse a partir de proteínas más grandes conocidas, tal como colágeno humano de tipo XVIII alfa 1 y colágeno de ratón tipo XVIII alfa 1, proteínas que comparten una secuencia de aminoácido N-terminal común o similar. Ejemplos de otros materiales potenciales de fuentes de endostatina que tienen secuencias de aminoácido N-terminal similares incluyen esterasa pregástica de Bos taurus, colágeno humano de tipo 15 alfa 1, dehidrogenasa de formato dependiente de NAD (EC 1.2.1.2) derivada de proteína de hexón s 11459 de Pseudomonas sp, de adenovirus de bovino tipo 3, producto de gen de Caenorhabdi tis elegans F21dl2.3 de CELF21D12 2, proteína VALÍ TGMV ALI derivada a partir de virus mosaico de tomate dorado, proteína de hexón s01730 derivada de adenovirus humano 12, Saccharomyces cerevisiae . Por ejemplo, los péptidos relacionados estrechamente con la endostatina pueden derivarse de la secuencia del gen (BOS TAURUS) de esterasa pregástrica BOVMPE 1 correspondiente a los aminoácidos 502 a 521, y colágeno de tipo 15 alfa 1 de humanos comenzando en el aminoácido 316 y terminando en el 335. Las proteínas y péptidos derivados de estas y otras fuentes, incluyen síntesis de proteína manual o automatizada, puede ser rápida y fácil de probar para la actividad inhibidora de proliferación endotelial utilizando un análisis de actividad biológica tal como el análisis de proliferación celular endotelial capilar bovina. Otros bioanálisis para la actividad inhibidora incluyen el análisis de pollito CAM, el análisis corneal de ratón, y el efecto de las proteínas sintetizadas o aisladas que se administran a tumores implantados. El análisis de pollito CAM se describe por O'Reilly y cois, en "Angiogenic Regulation of Metastatic Growth" Cell, vol 79(2), 21 de Octubre de 1994, pp 315-318, la cual se incorpora para referencia en su totalidad. Brevemente, los embriones de pollo de 3 días con vitelos intactos se separan del huevo y se colocan en una caja de petri. Después de 3 días de incubación un disco de metilcelulosa que contiene la proteína a probarse se aplica al CAM de embriones individuales. Después de 48 horas de incubación, los embriones y los CAMs se observaron para determinar si se inhibió el crecimiento endotelial. El análisis corneal de ratón comprende la implantación de una pastilla que contiene el factor de crecimiento, conjuntamente con otra pastilla que contiene el inhibidor de crecimiento endotelial esperado, en la cornea de un ratón y observando el patrón de capilares que se elaboran en la cornea. La invención de los solicitantes también comprenden secuencias de ácido nucleico que corresponden a y codifican las moléculas de proteína inhibidoras de la proliferación endotelial de la invención, y a anticuerpos monoclonales y policlonales que aglutinan específicamente a tales moléculas de proteína. Las moléculas de proteína biológicamente activas, secuencias de ácido nucleico que corresponden con las proteínas, y anticuerpos que aglutinan específicamente a las proteínas de la presente invención son útiles para modular los procesos endoteliales in vi vo, y para diagnosticar y tratar las enfermedades relacionadas con la célula endotelial, por ejemplo por terapia del gen. Las secuencias de ácido nucleico que corresponden a, y codifican los análogos de endostatina y endostatina pueden prepararse en base al conocimiento de la secuencia del aminoácido, y la técnica reconoce la correspondencia entre codones (secuencias de tres bases de ácido nucleico) , y aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, en donde la tercer base en un codón puede variar todavía el código para el mismo aminoácido, se derivan muchas secuencias de ácido nucleico de diferente codificación posible para cualquier fragmento de péptido o proteína particular. Las secuencias de ácido nucleico se sintetizan utilizando sistemas automatizados bien conocidos en la materia. Ya sea, toda la secuencia puede sintetizarse o una serie de pequeños oligonucleótidos se elaboran y subsecuentemente se ligan juntos para producir la secuencia de longitud completa. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico puede derivarse de un banco de gen que utiliza las pruebas de oligonucleotidos designados en base a la secuencia de aminoácido N-terminal y técnicas bien conocidas para clonar el material genético. La presente invención también incluye la detección de endostatina en tejidos y fluidos corporales para el propósito de diagnóstico o pronóstico de enfermedades mediadas por la angiogénesis tal como cáncer. La presente invención también incluye la detección de sitios que aglutinan endostatina y receptores en células y tejidos. La presente invención también incluye métodos para tratar o prevenir los procesos y enfermedades angiogénicas, incluyendo pero no limitando a, artritis y tumores al simular la producción de endostatina, y/o al administrar endostatina substancialmente purificada, o antagonistas o agonistas de endostatina, y/o antisueros o antisueros de endostatina dirigidos contra el antisuero de endostatina a un paciente. Los métodos de tratamiento adicionales incluyen, la administración de endostatina, fragmentos de endostatina, antisueros de endostatina, o antagonistas y agonistas receptores de endostatina enlazados a agentes citotóxicos. Debe entenderse que la endostatina puede ser de origen animal o humano. La endostatina también puede producirse sintéticamente por reacción química o por técnicas recombinantes en conjunción con sistemas de expresión. La endostatina también puede producirse por moléculas de separación enzimaticamente diferentes, incluyendo, precursores de endostatina, que contiene la secuencia de homología o identidad con segmentos de endostatina para generar péptidos que tienen actividad anti-angiogenésis . La terapia pasiva de anticuerpo que utilizan anticuerpos que aglutina específicamente endostatina pueden emplearse para modular los procesos dependientes del endotelio tales como, la reproducción, desarrollo, y curación de la herida y reparación del tejido. Además, los antisueros dirigidos a las regiones Fab de anticuerpos de endostatina pueden administrarse para bloquear la habilidad de antisueros de endostatina endógena para aglutinar endostatina. Los anticuerpos específicos para análogos de endostatina y endostatina se elaboran de acuerdo a técnicas y reglas bien conocidas en la materia. Los anticuerpos pueden ser ya sea policlonales o monoclonales. Los anticuerpos se utilizan en formatos de inmunoanálisis bien conocidos, tales como inmunoanálisis no competitivas y competitivas, incluyendo ELISA, inmunoanálisis intermedio y radioinmunoanálisis (RIAs) para determinar la presencia o ausencia de los inhibidores de la proliferación endotelial de la presente invención en fluidos corporales. Ejemplos de fluidos corporales incluyen pero no se limitan a, sangre, suero, fluido peritoneal, fluido pleural, fluido cerebroespinal, fluido uterino, saliva y moco. Las proteínas, secuencias de ácido nucleico y anticuerpos de la presente invención son útiles para diagnosticar y tratar las enfermedades y desordenes relacionados con la célula endotelial. Un proceso celular endotelial particularmente importante es la angiogénesis, la formación de vasos sanguíneos. Las enfermedades relacionadas con la angiogénesis pueden diagnosticarse y tratarse utilizando las proteínas inhibidoras de la proliferación celular endotelial de la presente invención. Las enfermedades relacionadas con la angiogénesis incluyen pero no se limitan a, cáncer que depende de la angiogénesis, incluyendo por ejemplo, tumores sólidos, tumores nacientes en la sangre tal como leucemia, y metástasis de tumor; tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas piogénicos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares; por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía prematura, degeneración macular, rechazo por injerto corneal; glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis; Síndrome de Osler-Webber; angiogénesis miocardial; nepvascularización de plaqueta; telangiectasia; juntas hemofílicas; angiofibroma; y granulación de la herida. Las proteínas inhibidoras de la proliferación celular endotelial de la presente invención, son útiles en el tratamiento de la enfermedad de estimulación anormal o excesiva de las células endoteliales. Estas enfermedades incluyen pero no se limitan a, adhesiones intestinales, aterosclerosis, escleroderma, y cicatrices hipertrópicas, es decir, queloides. También son útiles en el tratamiento de enfermedades que tiene la angiogénesis como una consecuencia patológica tal como enfermedad por rasguño de gato (.Róchele minalia quintosa) y ulceras (Hel obacter pylori ) . Las proteínas inhibidoras de la proliferación celular endotelial puede utilizarse como un agente para el control de nacimiento al reducir o prevenir la vascularización uterina requerida para la implantación del embrión. De esta manera, la presente invención proporciona un método para el control de nacimiento efectivo cuando una cantidad suficiente de la proteína inhibidora para prevenir la implantación del embrión se administra a una hembra. En un aspecto del método para el control de nacimiento, una cantidad suficiente de la proteína inhibidora para bloquear la implantación del embrión se administra antes o después de que ha ocurrido la fertilización e intercambio, proporcionando así un método efectivo de control de nacimiento, posiblemente un método de "mañana siguiente". Aunque no se desea limitarse por este establecimiento, se cree que la inhibición de vascularización del endometrio uterino interfiere con la implantación del blastocito. Una inhibición similar de vascularización de la mucosa del tubo uterino interfiere con la implatación del blastocito, previniendo la aparición de un embarazo tubal. Los métodos de administración pueden incluir pero no se limitan a, pildoras, inyecciones (intravenosa, subcutánea, intramuscular) , supositorios, esponjas vaginales, tampones vaginales, y dispositivos intrauterinos. Se cree también que la administración de endostatina interferirá con la vascularización normal aumentada de la placenta, y también con el desarrollo de vasos dentro de un blastocito exitosamente implantado y el desarrollo del embrión y feto. De manera contraria, el bloqueo de los receptores de endostatina con análogos de endostatina, los cuales actúan como antagonistas receptores, pueden promover la endotelialización y vascularización. Tales efectos pueden ser deseables en situaciones de vascularización inadecuda del endometrio uterino e infertilidad asociada, reparación de la herida, curación de corte e incisiones, tratamiento de problemas vasculares en diabéticos, especialmente vasos periféricos y retinales, promoción de vascularización en tejido transplantado incluyendo piel y músculo, promoción de vascularización del músculo cardiaco especialmente siguiendo el transplante de tejido del corazón o corazón y después de la cirugía derivada, promoción de vascularización de tumores sólidos y relativamente avasculares para aumentar la liberación de citotóxina, y el aumento del flujo sanguíneo al sistema nervioso, incluyendo pero no limitando a la corteza cerebral y cordón espinal. Un descubrimiento sorprende es que una endostatina recombinante no soluble y sin replegar también es un compuesto potente anti-angiogénesis que sirve como un depósito cuando se administra a un paciente. La presente invención también se refiere a métodos para usar la endostatina y fragmentos de péptido inhibidores de la proliferación celular endotelial de endostatina, secuencias de ácidos nucleicos correspondientes a la endostatina y fragmentos activos de péptido de la misma, y anticuerpos que se aglutinan específicamente a la endostatina y sus péptidos, para diagnosticar los desordenes y enfermedades relacionadas con la célula endotelial. La invención comprende además un método para identificar los receptores específicos de endostatina, y así las moléculas receptoras identificadas y aisladas. La presente invención también proporciona un método para la cuantificación de receptores de endostatina.

Un aspecto particularmente importante de la invención es el descubrimiento de un método efectivo y novedoso para tratar y curar el cáncer dependiente de la angiogénesis en pacientes. Se encontró inesperadamente que la co-administración de la endostatina y angiostatina en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento del tumor y causar una regresión sostenible de la masa del tumor a tamaño microscópico, cura el cáncer dependiente de la angiogénesis. De acuerdo con lo anterior, la presente invención también incluye formulaciones efectivas para tratar o curar los tumores y cánceres dependientes de la angiogénesis . Más particularmente, la endostatina recombinante de ratón, a partir de células de insectos o E. Coli , potencialmente inhibe la angiogénesis y el crecimiento de metástasis y tumores primarios. En un método novedoso de liberación sostenida, la endostatina recombinante derivada de E. Coli se administró como una suspensión sin plegar en una cantidad suficiente para inhibir la angiogénesis, inhibiendo así el crecimiento del tumor. La masa del tumor se redujo cuando la endostatina recombinante se administró en una cantidad suficiente para causar la regresión del tumor. Los tumores primarios de peso corporal de 1-2% se regresaron por más de 150 veces para volverse lesiones en reposo microscópicas cuando se trataron por endostatina.

El análisis inmunohistoquímico de los tumores en reposo reveló la angiogénesis bloqueada acompañada por proliferación elevada de las células del tumor balanceadas por una velocidad elevada de una apoptósis de la célula del tumor. No hubo evidencia de toxicidad en cualquiera de los ratones tratados con endostatina. Se contempla como parte de la presente invención que la endostatina puede aislarse a partir de un fluido corporal tal como sangre u orina de pacientes o la endostatina puede producirse mediante métodos de DNA recombinantes o métodos químicos de péptidos sintéticos que son bien conocidos para aquellos de experiencia ordinaria en la materia. Los métodos de purificación de proteína son bien conocidos en la materia y un ejemplo específico de un método para purificar la endostatina y analizar la actividad inhibitoria se proporciona en los ejemplos siguientes. El aislamiento de la endostatina endógena de humano se lleva a cabo utilizando técnicas similares. Un ejemplo de un método para producir la endostatina utilizando las técnicas recombinantes de DNA causa las etapas de (1) identificar y purificar una endostatina como se trató anteriormente, y como se describe más completamente abajo, (2) determinar la secuencia de aminoácidos N-terminal del inhibidor purificado, (3) generar sintéticamente una prueba de oligonucleotido de DNA que corresponde a la secuencia del aminoácido N-terminal, (4) generar un banco de gen de DNA a partir de DNA humano u otro mamífero, (5) probar el banco de gen con la prueba de oligonucleotido de DNA, (6) seleccionar clones que hibridizan el oligonucleótido, (7) aislar el gen inhibidor del clon, (8) insertar el gen dentro de un vector apropiado tal como un vector de expresión, (9) insertar el vector que contiene el gen dentro de un microorganismo u otro sistema de expresión capaz de expresar el gen inhibidor, y (10) aislar el inhibidor producido recombinantemente. Las técnicas anteriores se describen más completamente en los manuales de laboratorio tal como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Segunda Edición por Sambrook y cois, Cold Spring Harbor Press, 1989. El gen para endostatina también puede aislarse a partir de células o tejidos (tales como las células del tumor) que expresa niveles elevados de endostatina por (1) mensajero aislante de RNA a partir del tejido, (2) utilizar transcriptasa inversa para generar la secuencia correspondiente de DNA y después (3) utilizar PCR con los iniciadores apropiados para amplificar la codificación de la secuencia de DNA para la secuencia activa de aminoácido de endostatina. Todavía otro método para producir endostatina, o fragmentos biológicamente activos de la misma, es por la síntesis de péptido. Una vez que se encuentra un fragmento biológicamente activo de una endostatina utilizando el sistema de análisis descrito más completamente abajo, puede secuenciarse, por ejemplo por los métodos de secuencia de péptido automatizados. De manera alternativa, una vez que se aisla el gen o la secuencia de DNA que codifica la endostatina, por ejemplo por los métodos descritos anteriormente, la secuencia de DNA puede determinarse, lo cual a su vez proporciona la información que considera la secuencia de aminoácido. De esta manera, si el fragmento biológicamente activo se genera por los métodos específicos, tales como digestos trípticos, o si el fragmento se secuencia N-terminal, la secuencia de aminoácido restante puede determinarse a partir de la secuencia de DNA correspondiente. Una vez que se conoce la secuencia de aminoácido del péptido, por ejemplo, los aminoácidos N-terminal 20, el fragmento puede sintetizarse mediante técnicas bien conocidas en la materia, como se ejemplifica por "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach", E. Atherton y R.C. Sheppard, IRL Press, Oxford Inglaterra. De manera similar, múltiples fragmentos pueden sintetizarse, los cuales se enlazan subsecuentemente juntos para formar fragmentos más grandes. Estos fragmentos sintéticos de péptido también pueden hacerse con substituciones de aminoácido en ubicaciones específicas con el objeto de probar la actividad antagonística y agonística in vi tro e in vivo . Los fragmentos de péptido que poseen un aglutinamiento con afinidad elevada para tejidos pueden utilizare para aislar el receptor de endostatina en las columnas afines. El aislamiento y purificación del receptor de endostatina es una etapa fundamental hacia elucidar el mecanismo de acción de endostatina. Esto facilita el desarrollo de drogas para modular la actividad del receptor de endostatina, la trayectoria final para la actividad biológica. El aislamiento del receptor permite la construcción de pruebas de nucleotidos para monitorear la ubicación y síntesis del receptor, utilizando tecnología de hibridación de solución e in si tu . La endostatina es efectiva en el tratamiento de enfermedades o procesos que se median por, o involucran angiogénesis. La presente invención incluye el método para el tratamiento de la enfermedad mediada por la angiogénesis con una cantidad efectiva de endostatina o antagonistas y agonistas de endostatina. Las enfermedades mediadas por la angiogénesis incluyen pero no se limitan a, tumores sólidos, tumores nacientes en la sangre tal como leucemia, y metástasis de tumor; tumores benignos; por ejemplo hemnagiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas piogénicos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares; por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía prematura, degeneración macular, rechazo por injerto corneal; glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis; Síndrome de Osler-Webber; angiogénesis miocardial; neovascularización de la placa; telangiectasia; juntas hemofilicas; angiofibroma; y granulación de la herida. La endostatina es útil en el tratamiento de la enfermedad de estimulación anormal o excesiva de las células endoteliales. Estas enfermedades incluyen pero no se limitan a, adhesiones intestinales, aterosclerosis, escleroderma, y cicatrices hipertrópicas, es decir, queloides. La endostatina también puede utilizarse como un agente para el control de nacimiento al prevenir la vascularización requerida para la implantación del blastocito y para el desarrollo de la placenta, el blastocito, el embrión y el feto. Los fragmentos de péptido sintéticos de endostatina tienen una variedad de usos. El péptido que se aglutina al receptor de endostatina con avidez y especifidad elevada se emplea y radioetiqueta para la visualización y cuantificación de sitios de aglutinamiento que utilizan técnicas de aglutinamiento de membrana y autoradiográficas. Esta aplicación proporciona importantes herramientas de búsqueda y diagnóstico. El conocimiento de las propiedades de aglutinación del receptor de endostatina facilita la investigación de los mecanismos de transducción enlazados al receptor. Además, estos péptidos etiquetados con isótopos efímeros permiten la visualización de los sitios de aglutinación del receptor in vivo utilizando la tomografía de emisión del positrón u otras técnicas radiográficas modernas con el objeto de ubicar tumores con sitios de aglutinamiento de la endostatina. La substitución sistémica de aminoácidos con estos péptidos sintetizados producen antagonistas y agonistas de péptido con afinidad elevada al receptor de endostatina que aumenta o disminuye la aglutinación de endostatina a su receptor. Tales agonistas se utilizan para suprimir el crecimiento de micrometastasas, limitando así la difusión del cáncer. Los antagonistas para endostatina se aplican en situaciones de vascularización inadecuada, para bloquear los efectos inhibitorios de la angiostatina y posiblemente promover la angiogénesis. Este tratamiento puede tener efectos terapéuticos para promover la curación de la herida en diabéticos. Los péptidos de endostatina se emplean para desarrollar columnas de afinidad para el aislamiento del receptor de endostatina a partir de células tumorales cultivadas. El aislamiento y purificación del receptor de endostatina se sigue mediante la secuencia de aminoácidos.

Después, las pruebas de nucleotidos se desarrollan para la inserción dentro de vectores para la expresión del receptor. Estas técnicas se conocen bien por aquellos expertos en la materia. La transferencia del receptor de endostatina en células tumoráles aumenta la respuesta de estas células a la endostatina exógena o endógena, reduciendo así la velocidad de crecimiento metastatico. Los agentes citotóxicos, tales como ricina, se enlazan a la endostatina, y tienen fragmentos de péptido de endostatina con afinidad elevada, proporcionando así una herramienta para la destrucción de células que aglutinan la endostatina. Estas células pueden encontrarse en muchas ubicaciones, incluyendo pero no limitándose a, micrometastasas y tumores primarios. Los péptidos enlazados a los agentes citotóxicos se vacían de una manera designada para maximizar el suministro a la ubicación deseada. Por ejemplo, los fragmentos de endostatina con afinidad elevada enlazados con ricina se distribuyen a través de una cánula dentro de los vasos proporcionando el sitio objetivo o directamente dentro del objetivo. Tales agentes también se suministran de una manera controlada a través de bombas osmóticas acopladas con cánulas de infusión. Una combinación de antagonistas de endostatina puede co-aplicarse con estimuladores de angiogénesis para incrementar la vascularización de tejido. Este régimen terapéutico proporciona un medio efectivo para destruir el cáncer metastático. De acuerdo con la presente invención, la endostatina puede utilizarse en combinación con otras composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, un tumor puede tratarse convencionalmente con cirugía, radiación, o quimioterapia combinada con endostatina y después la endostatina se administra subsecuentemente al paciente para extender el reposo de las micrometastasas y para estabilizar cualquier tumor primario residual. La endostatina de la presente invención también puede utilizarse para generar anticuerpos que son específicos para el inhibidor. Los anticuerpos pueden ser ya sea anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos que se aglutina específicamente a la endostatina pueden utilizarse en métodos y equipos de diagnóstico bien conocidos por aquellos expertos ordinarios de la materia para detectar o cuantificar la endostatina en un tejido o fluido corporal. Los resultados de estas pruebas pueden utilizarse para diagnosticar o predecir la aparición o repetición de un cáncer y otras enfermedades mediadas por la angiogénesis. La endostatina también puede utilizarse en un método y equipo de diagnóstico para detectar y cuantificar anticuerpos capaces de aglutinar la endostatina. Estos equipos permitirán la detección de anticuerpos de endostatina circulantes, que indican la difusión de micrometastasas en la presencia de la endostatina oculta por los tumores primarios in si tu . Los pacientes que tienen tales anticuerpos de anti-endostatina circulantes más probablemente pueden ser para desarrollar tumores y cánceres, y más probablemente pueden ser para tener recurrencias de cáncer después de los tratamientos o períodos de remisión. Los fragmentos de Fab de estos anticuerpos de anti-endostatina pueden utilizarse como antigenos para generar antisueros de fragmentos de Fab de anti-endostatina que pueden utilizarse para neutralizar el retiro de endostatina circulante por anticuerpos de anti-endostatina. Otro aspecto de la presente invención es un método para bloquear la acción de la endostatina endógena en exceso. Esto puede hacerse al inmunizar pasivamente un humano o animal, con anticuerpos específicos para la endostatina indeseada en el sistema. Este tratamiento puede ser importante en el tratamiento de placentación, menstruación , y ovulación anormal, y vasculogénesis . Esto proporciona una herramienta útil para examinar los efectos del retiro de endostatina en procesos metastáticos. El fragmento de Fab de anticuerpos de endostatina contiene el sitio de aglutinamiento para la endostatina. Este fragmento se aisla de los anticuerpos de endostatina utilizando técnicas conocidos por aquellos expertos en la materia. Los fragmentos de Fab de antisueros de endostatina se utilizan como antigenos para generar la producción de suero del fragmento de Fab. La infusión de este antisuero contra los fragmentos de Fab de endostatina evita que la endostatina se aglutine en los anticuerpos de endostatina. El beneficio terapéutico se obtiene al neutralizar los anticuerpos de anti-endostatina endógenos al bloquear el aglutinamiento de endostatina a los fragmentos de Fab de anti-endostatina. El efecto neto de este tratamiento es facilitar la habilidad de endostatina circulante endógena para llegar a las células objetivo, reduciendo así la difusión de metastasas Debe entenderse que la presente invención se contempla para incluir cualquier derivado de la endostatina que tenga actividad inhibidora endotelial. La presente invención incluye la proteína de endostatina completa, derivados de la proteína de endostatina y fragmentos biológicamente activos de la proteína de endostatina. Estas incluyen proteínas con actividad de endostatina que tiene substituciones de aminoácido o azúcares u otras moléculas unidas a grupos funcionales de aminoácido. La presente invención también incluye genes que codifican la endostatina y el receptor de endostatina y proteínas que se expresan por esos genes. Las proteínas y los fragmentos de proteína con la actividad de la endostatina descrita arriba pueden proporcionarse como proteínas y fragmentos de proteína substancialmente purificadas y aisladas en formulaciones farmacéuticamente aceptables utilizando métodos de formulación conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. Estas formulaciones pueden administrarse por vías estándar. En general, las combinaciones pueden administrarse por la vía tópica, transdermal, intraperitonal, intracranial, intracerebroventricular, intracerebral, intravaginal, intrauterina, oral, rectal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal, subcutánea o intramuscular) . Además, la endostatina puede incorporarse dentro de polímeros biodegradables permitiendo la liberación sostenida del compuesto, siendo implantados los polímeros en la cercanía en donde se desea la distribución de la droga, por ejemplo en el sitio de un tumor o implantados de tal manera que la endostatina se libera lentamente de manera sistémica. Las minibombas osmóticas también pueden utilizarse para proporcionar la distribución controlada de concentraciones elevadas de endostatina a través de la cánula al sitio de interés, tal como directamente dentro de un crecimiento metastático o dentro del suministro vascular de ese tumor. Los polímeros biodegradables y su uso se describen, por ejemplo, en detalle en Brem y cois, J. Neurosurg, 74:441-446 (1991), la cual se incorpora en la presente en su totalidad para referencia. La dosis de la endostatina de la presente invención dependerá de la condición o estado de la enfermedad siendo tratada y otros factores clínicos tales como peso y condición del humano o animal y la vía de administración del compuesto. Para tratar humanos o animales, pueden administrarse entre aproximadamente 0.5 mg/kilogramos a 500 mg/kilogramos de la endostatina. Un rango más preferentemente es de 1 mg/kilogramos a 100 mg/kilogramos siendo preferido con el rango de 2 mg/kilogramos a 50 mg/kilogramos. Dependiendo de la vida media de la endostatina en el humano o animal particular, la endostatina puede administrarse entre varias veces al día a una vez a la semana. Debe entenderse que la presente invención tiene aplicación tanto para uso humano como veterinario. Los métodos de la presente invención contemplan una única administración así como múltiples administraciones, dadas ya sea simultáneamente o por encima de un periodo de tiempo ampliado. Las formulaciones de endostatina incluyen aquellas adecuadas para la administración oral, rectal, oftálmica (incluyendo intravítrea o intracameral) , nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), intrauterina, vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intradermal, intracranial, intraqueal, y epidural. Las formulaciones de endostatina pueden presentarse convenientemente en forma de dosis de unidad y pueden prepararse por técnicas farmacéuticas convencionales. Tales técnicas incluyen la etapa de llevar hacia la asociación el ingrediente activo y el excipiente (s) o vehículo (s) farmacéutico (s) . En general, las formulaciones se preparan al llevar íntima y uniformemente en asociación el ingrediente activo con vehículos líquidos o dividir finamente los vehículos sólidos, o ambos y después si es necesario, formar el producto. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones de inyección estéril acuosas y no acuosas, las cuales pueden contener anti-oxidantes, reguladores, bacteriostatos y solutos, los cuales vuelven la formulación isotónica con la sangre del recipiente propuesto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas, las cuales pueden incluir agentes de suspensión y agentes de engrosamiento. Las formulaciones pueden presentarse en contenedores de una sola dosis o de múltiples dosis, por ejemplo, viales o ampolletas selladas, y pueden almacenarse en una condición de congelado y después deshidratado en el vacío (liofilizado) que requiere solo de la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de usarse. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporánea pueden preparase de tabletas, granulos y polvos estériles de la clase previamente descrita. Las formulaciones preferidas de una sola dosis son aquellas que contienen una unidad o dosis diaria , subdosis diaria, como se exponen anteriormente, o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente administrado. Debería entenderse que en adición a los ingredientes, particularmente arriba mencionados, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la materia tomando en cuenta el tipo de formulación en cuestión. Los fragmentos de péptido diferentes de la molécula de endostatina intacta pueden sintetizarse para usarse en varias aplicaciones, incluyendo pero no limitadas a las siguientes: como antígenos para el desarrollo de los antisueros específicos, como agonistas y antagonistas activos en los sitios de aglutinamiento de endostatina, como péptidos para enlazarse a los agentes citotóxicos para la muerte objetiva de las células que aglutinan endostatina. Las secuencias de aminoácidos que comprenden estos péptidos se seleccionan en la base a su posición sobre las regiones exteriores de la molécula y son accesibles para el aglutinamiento a los antisueros. El término de carboxilo y amino de la endostatina, así como la región intermedia de la molécula, se representan de manera separada entre los fragmentos a sintetizarse. El término amino distante al aminoácido 20 y el término carboxilo de la endostatina pueden contener o modificarse para contener residuos de tirosina y lisina y se etiquetan con muchas técnicas. Se agrega una tirosina o lisina a los fragmentos que no tienen estos residuos para facilitar el etiquetado de los grupos de hidróxilo o amino reactivos en el péptido. Estas secuencias de péptido se comparan a secuencias conocidas que utilizan los bancos de secuencia de datos para determinar las homologías de secuencia potenciales. Esta información facilita la eliminación de las secuencias que muestran un grado elevado de homología de secuencia para otras moléculas, aumentando así el potencial para la especificidad elevada en el desarrollo de antisueros, agonistas y antagonistas para la endostatina. Los péptidos pueden sintetizarse en una pureza y facilidad microquímica estándar verificada con espectrofotometría de masa y HPLC. Los métodos de síntesis de péptido, la espectrofotometría de masa y la purificación de HPLC se conocen comúnmente por aquellos expertos en estas materias. Los péptidos y la endostatina también se producen en E. coli recombinante, como se describe abajo, o en sistemas de expresión de insectos o levadura y se purifican con la cromatografía de columna. La endostatina y los péptidos derivados de la endostatina pueden acoplarse con otras moléculas utilizando métodos estándar. Tanto el término de amino distante al aminoácido 20 y como el término de carboxilo de la endostatina pueden contener residuos de tirosina y lisina y se etiquetan isotópica y no-isotópicamente con muchas técnicas, por ejemplo, radioetiquetación utilizando técnicas convencionales (residuos de tirosina-cloramina T, iodogen, lactoperoxidasa; residuos de lisina-reactivo de Bolton-Hunter) . Estas técnicas de acoplamiento se conocen bien por aquellos expertos en la materia. La técnica de acoplamiento se elige en la base de los grupos funcionales disponibles en los aminoácidos, incluyendo pero no limitando a, amino, sulfhidral, carboxilo, amida, fenol o i idazola. Diversos reactivos utilizados para efectuar estos acoplamientos incluyen entre otros, glutaraldehído, benzidina de diazotizada, carbodiimida, y p-benzoquinona. Los péptidos de endostatina se acoplan químicamente a isótopos, enzimas, proteínas de vehículo, agentes citotóxicos, moléculas fluorescentes y otros compuestos para una variedad de aplicaciones. La eficiencia de la reacción de acoplamiento se determina utilizando diferentes técnicas apropiadas para la reacción específica. Por ejemplo, la radioetiquetación de una proteína o péptido de endostatina con 125I se lleva a cabo utilizando cloramina T y Na125I de actividad específica elevada. La reacción se termina con metabisulfito de sodio y la mezcla se desala en columnas desechables. El péptido etiquetado se eluye de la columna y se recolectan las fracciones. Las alícuotas se retiran de cada fracción y la radioactividad se midió en un contador gamma. De esta manera, el Na125I sin reaccionar se separa del péptido de endostatina etiquetado. Las fracciones de péptido con la radioactividad específica más elevada se almacenan para uso subsecuente tal como el análisis de la habilidad para aglutinarse a los antisueros de endostatina. Otra aplicación de la conjugación de péptido es para la producción de antisueros policlonales. Por ejemplo, los péptidos de endostatina que contienen residuos de lisina se enlazan a albúmina de suero de bovino purificada utilizando glutaraldehído. La eficiencia de la reacción se determina al medir la incorporación del péptido radioetiquetado. El péptido y glutaraldehído sin reaccionar se separan mediante diálisis. El conjugado se almacena para uso subsecuente.

Puede generarse el antisuero contra la endostatina. Después de la purificación y síntesis del péptido, tanto los antisueros monoclonales como policlonales se producen, utilizando técnicas establecidas, conocidas por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, los antisueros policlonales pueden producirse en conejos, ovejas, cabras u otro animales. Los péptidos de endostatina conjugados a una molécula de vehículo tal como albúmina de suero de bovino, o endostatina por sí misma, se combina con una mezcla auxiliadora, emulsionada o inyectada subcutáneamente en múltiples sitios en la espalda, cuello, costado y algunas veces en la planta de los pies. Las inyecciones de refuerzo se hacen a intervalos regulares tales como cada 2 a 4 semanas. Las muestras de sangre obtienen por venipuntura, por ejemplo, utilizando las venas marginales de la oreja después de la dilación, aproximadamente de 7 a 10 días después de cada inyección. Se permite que las muestras de sangre se coagulen durante la noche a 4°C y se centrifugan en aproximadamente 2400 X a 4°C por aproximadamente 30 minutos. Este suero se retira, en alícuotas y se almacena a 4°C para uso intermedio o a -20 a -90°C para análisis subsecuente. Todas las muestras de suero a partir de la generación de antisueros policlonales, o las muestras medias a partir de la producción de antisueros monoclonales se analizan para la determinación de la concentración. La concentración se establece a través de varios métodos, por ejemplo, utilizando manchas de punto y análisis de densidad y también con la precipitación de complejos de anticuerpo de péptido radioetiquetados utilizando la proteína A, antisuero secundario, entanol frío o carbón vegetal-dextrano seguido por la medición de la actividad con un contador gamma. Los antisueros de las concentraciones más elevadas también se purifican en columnas de afinidad, las cuales se encuentran disponibles comercialmente. Los péptidos de endostatina se acoplan con el gel en la columna de afinidad. Las muestras de antisuero se pasan a través de la columna y los anticuerpos de anti-endostatina permanecen aglutinados a la columna. Estos anticuerpos se eluyen, recolectan y evalúan subsecuentemente para la determinación de la concentración y especificidad. El antisuero de endostatina con la concentración más elevada se prueba para establecer lo siguiente: a) dilución óptima del antisuero para el aglutinamiento específico más elevado del antígeno y el aglutinamiento no específico inferior, b) la habilidad para aglutinar las cantidades crecientes de péptido de endostatina en una curva de desplazamiento estándar, c) la reactividad transversal potencial con las proteínas y péptidos relacionados, incluyendo las especies relacionadas de endostatina, d) la habilidad para detectar los péptidos de endostatina en extractos de plasma, orina, tejidos, y en medios de cultivo celular. Los equipos para la medición de endostatina también se contemplan como parte de la presente invención. Los antisueros que poseen la especificidad y concentración más elevada y que pueden detectar los péptidos de endostatina en extractos de plasma, orina, tejidos y en medios de cultivos celulares, se examinan además para establecer equipos fáciles de usar, para la localización y medición rápida, segura, sensitiva y específica de la angiostatina. Estos equipos de análisis incluyen pero no se limitan a las siguientes técnicas, análisis competitivo y no competitivo, radioinmunoanálisis, análisis de bioluminisencia y quimiluminisencia, análisis fluorométrico, análisis intermedio, análisis inmunoradiométrico, manchas de punto, análisis enlazados a la enzima, incluyendo ELISA, placas de microconcentración, bandas cubiertas al anticuerpo o varillas de nivel para el monitoreo rápido de la orina y sangre, e inmunocitoquímica. Para cada equipo, se establece el rango, sensibilidad, precisión, seguridad, especificidad y reproductibilidad del análisis. Los intra análisis y la variación de los intra análisis se establecen al 20%, 50% y 80% puntos en las curvas estándar de desplazamiento o actividad.

Un ejemplo de un equipo de análisis comúnmente utilizado en la investigación y en la clínica es un equipo de radioinmunoanálisis (RÍA) . Un RÍA de endostatina se ilustra abajo. Después de la purificación y radioiodinación exitosa de la endostatina o un péptido de endostatina, el antisuero que posee la concentración más elevada se agrega en diversas diluciones a los tubos que contienen una cantidad relativamente constante de radioactividad, tal como 10,000 cpm, en un sistema regulador adecuado. Otros tubos contienen un suero preinmune o regulador para determinar el aglutinamiento no específico. Después de la incubación a 4°C por 24 horas, se agrega la proteína A y los tubos son vortexados, incubados a temperatura ambiente • por 90 minutos y centrifguados a aproximadamente 2000-2500 X g a 4°C para precipitar los complejos de anticuerpos aglutinados al antígeno etiquetado. El supernadante se retira mediante aspiración y la radioactividad en las pastillas se cuentan en un contador gamma. La dilución del antisuero se caracteriza además porque aglutina aproximadamente del 10 al 40% del péptido etiquetado después de la substracción del aglutinamiento no específico. Después, un rango de dilución (aproximadamente 0.1 pg a 10 ng) del péptido de endostatina utilizado para el desarrollo del antisuero se evalúa al agregar cantidades conocidas del péptido a los tubos que contienen el antisuero y péptido radioetiquetado. Después de un periodo de incubación adicional, por ejemplo, 24 a 48 horas, la proteína A se agrega y los tubos centrifugados, se retiran del supernadante y de la radioactividad en la pastilla contada. El desplazamiento del aglutinamiento del péptido de endostatina radioetiquetado por el péptido de endostatina sin etiquetar (estándar) proporciona una curva estándar. Se agregan varias concentraciones de otros fragmentos de péptido de endostatina, plasminógeno, endostatina de diferentes especies y péptidos homólogos, a los tubos de análisis para caracterizar la especificidad de los antisueros de endostatina. Se preparan extractos de varios tejidos, incluyendo pero no limitando a tumores primarios y secundarios, carcinoma de Lewis en pulmón, cultivos de células que producen la endostatina, placenta, útero y otros tejidos tal como cerebro, hígado, e intestino, utilizando técnicas de extracción que se han empleado exitosamente para extraer la endostatina. Después de la liofilización o Vac de Velocidad de los extractos de tejido, el regulador de análisis se agrega y las diferentes alícuotas se colocan dentro de los tubos de RÍA. Los extractos de las células conocidas que producen endostatina producen las curvas de desplazamiento que se encuentran paralelas a la curva estándar, en donde los extractos de tejidos que no producen la endostatina no desplazan la endostatina radioetiquetada a partir del antisuero de endostatína. Además, los extractos de orina, plasma y fluido cerebroespinal, de animales con carcinoma de Lewis en pulmón se agregan a los tubos de análisis en cantidades crecientes. Las curvas de desplazamiento paralelas indican la utilidad del análisis de endostatina para medir la endostatina en fluidos corporales y tejidos. Los extractos de tejido que contienen la endostatina se caracterizan además por sujetar alícuotas a la fase inversa de HPLC. Las fracciones eluídas se recolectan, secan en Vac de Velocidad, reconstituyen en el regulador de RÍA, y se analizan en el RÍA de endostatina. La cantidad máxima de inmunoreactividad de endostatina se ubica en las fracciones que corresponden a la posición de extracción de endostatina. El equipo de análisis proporciona instrucciones, antisuero, endostatina o péptido de endostatina y posiblemente endostatina radioetiquetada y/o reactivos para la precipitación de complejos de anticuerpos de endostatina aglutinada-endostatina. El equipo es útil para la medición de endostatina en extractos de tejidos y fluidos biológicos de animales y humanos con o sin tumores. Otro equipo se utiliza para la localización de angiostatina en tejidos y células. Este equipo de la inmunohistoquímica de endostatina proporciona instrucciones, antisuero de endostatina y posiblemente suero de bloqueo y antisuero secundario enlazados a una molécula fluorescente tal como isotiocinata de fluorescina, o a algún otro reactivo utilizado para visualizar el antisuero primario. Las técnicas de la inmunohistoquímica se conocen bien por aquellos expertos en la materia. Este equipo de la inmunohistoquímica de endostatina permite la localización de la endostatina en secciones de tejido y células cultivadas utilizando tanto microscopía de electrón y de luz. Se utiliza tanto para propósitos clínicos como de búsqueda. Por ejemplo, los tumores se biopsian o recolectan y las secciones de tejido se cortan con un microtomo para examinar los sitios de producción de endostatina. Tal información es útil para el diagnóstico y posiblemente para los propósitos terapéuticos en la detección y tratamiento del cáncer. Esta invención se ilustra además por los siguientes ejemplos, los cuales no intentan ser construidos de ninguna manera como limitaciones impuestas en el alcance de la misma. Por el contrario, debe entenderse claramente que el recurso puede tenerse para otras diversas modalidades, modificaciones y equivalentes del mismo, los cuales después de leer la descripción en la presente, pueden sugerirse por si mismos a aquellos expertos en la materia sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o el alcance de las reivindicaciones anexas. EJEMPLO 1 Identificación de un Inhibidor de la Proliferación celular endotelial Capilar a partir de Cél ulas de Hemangioendotelioma Se evaluó una línea de célula de hemangioendotelioma de murina, EOMA (Obeso y cois, 1990) para la evidencia de producción de inhibidores de la proliferación celular endotelial. Muchos de los inhibidores endógenos conocidos de angiogénesis inhiben la proliferación in vi tro de las células endoteliales. Colección del Medio Condicionado: Las células de la línea de célula de hemangioendotelioma de murina EOMA se mantuvieron en DMEM suministrado con 10% de suero de bovino (BCS) y 1% de glutamina-penicilina-estreptomicina (GPS) en una incubadora a 37°C y 10% de C02. El medio condicionado a partir de células de EOMA (es decir, medio cultivado utilizado para el crecimiento de las células de EOMA) se aplico a las células endoteliales capilares del bovino esmitulado con bFGF, en un análisis de proliferación por 72 horas. El medio condicionado inhibió inversamente la proliferación de células endoteliales capilares como se comparó para los controles. El patrón de inhibición fue consistente con la presencia de actividad estimulante e inhibidora de la proliferación celular endotelial (figura 1) • Ejemplo 2 La Actividad Inhibidora de la Proliferación cel ular endotelial no se debe a la Angiostatina Para determinar si el inhibidor de la proliferación celular endotelial capilar producido por las células de EOMA fue la angiostatina, se aplico un medio condicionado mancomunado a una columna de lisina (lisina conjugada con glóbulos de cromatagrofía de Sefarosa™) . La sefarosa de lisina aglutina la angiostatina y se ha utilizado para los propósitos de su purificación (O'Reilly y cois, 1996) . La actividad inhibidora celular endotelial se encontró solo en la fracción a través del flujo y no en la fracción de aglutinamiento (datos no mostrados) . La falta de aglutinamiento de la actividad inhibidora a la sefarosa de lisina sugiere que el inhibidor novedoso de la proliferación celular endotelial no fue la angiostatina. Ejemplo 3 Purificación de una Proteína de 20 kDa a partir del Medio Condicionado de las Cél ulas de EOMA, las cuales inhiben específicamente la Proliferación celular endotelial Debido a que diversos inhibidores de la angiogénesis tienen una afinidad por la heparina, se aplicó a través del flujo desde la columna de sefarosa de lisina a una columna de sefarosa de hepirina. La actividad inhibidora aglutinó la heparina con afinidad relativamente elevada y se eluyó con 0.6-0.8 M de NaCl en 10 mm de Tris 7.4 pH, como se muestra en la figura 2. Para purificar además la actividad inhibidora, la muestra se concentró y aplicó a una columna de filtración de gel (gel fino de BioRad Bio-Gel P-100 o gel de Sepacrilo Farmacéutico S-200HR) (ver figura 3) , seguida por varios ciclos de fase inversa de HPLC con una columna C4. La actividad inhibidora se eluyó de la columna C4 con 40-45% de acetonitrilo en 0.1% de ácido trifluiroacético, como se ejemplifica por la figura 4. Después de la columna final de C4, la actividad inhibidora se asoció con un proteína de masa molecular de aproximadamente 20 kDa (reducida) o 18 kDa (no reducida) , por SDS-PAGE, purificado para homogeneidad aparente. Con respecto a los ejemplos 2 y 3, la Sefarosa de lisina, Sefarosa de Heparina, gel de Sefacrilo de S-200 HR (Farmacia, Uppsala, Suecia) , gel de poliacrilamida fino de Bio-Gel P-100 (Laboratios Bio-Rad, Richmond, CA) , y una columna de fase inversa de C4 de SynChropak RP-4 (100 x 4.6 mm) , (Synchron, Inc., Lafayette, IN) se prepararon de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes. Una columna de Sefarosa de heparina (50 x 2.5 cm) se equilibró con 50 mm de NaCl en 10 mm tris-HCl en pH de 7.4. Se aplicó el medio condicionado combinado y la columna se lavó con el regulador de equilibrio. La columna se eluyó con un gradiente continuo de 50 mM - 2 M NaCl en 10 mM Tris-HCl a 7.4 de pH (200 ml del volumen total) seguida por 100 ml de 2 M de NaCl en 10 piM de Tris-HCl en pH de 7.4. Las fracciones se recolectaron y en una alícuota de cada una se aplico a las células endoteliales capilares. Las fracciones que inhibieron su proliferación se dializaron (MWCO = 6,000-8,000) contra PBS y se concentraron utilizando un concentrado de Nanospina de 4000 MWCO (Ciencias de Gelman, Ann Arbor, Ml) . Una columna de Bio-Gel P-100 o una columna de Sefacrilo S-200 HR (75 x 1.5 cm) se equilibró con PBS. La muestra de la cromatografía de la Sefarosa de heparina se aplico y la columna se plegó con el regulador de equilibrio. Las fracciones se recolectaron y una alícuota de cada una se aplico a las células endoteliales. Las fracciones que inhibieron la proliferación endotelial se concentraron y dializaron como arriba. Una columna de SynChropak RPG (100 x 4.6 mm) se equilibro con H2O/0.1% de ácido trifluoroacético (TFA). Se utilizaron los reactivos de grado de HPLC (Pierce, Rochford, IL) . La muestra a partir de la cromatografía de filtración de gel se aplico a la columna y la columna se plegó con un gradiente de acetonitrilo en 0.1% de TFA a 0.5 ml/minutos y se recolectaron las fracciones. Una alícuota de cada una se evaporó mediante centrifugación al vacío, se volvieron a suspender en PBS y se aplicaron a las células endoteliales capilares. La actividad inhibidora se purificó además para la homogeneidad aparente por al menos dos ciclos subsecuentes en la columna C4 de SynChropak. Para caracterizar además el inhibidor de 20 kDa, se probo en varias líneas de célula de origen endotelial y no endotelial. Para el análisis de BCE, las células endoteliales capilares del bovino se obtuvieron y desarrollaron como se describe previamente (Folkman y cois, 1979) . Para el análisis de proliferación, las células se enjuagaron con PBS y se dispersaron en una solución del 0.05% de tripsina. Una suspensión de la célula (25,000 células/ml) se elaboro con DMEM + 10% de BCS + 1% de GPS, metalizada en 24 placas bien cultivas, gelatinizadas (0.5 mewed) y se incubó (37°C, 10% de C02) por 24 horas. El medio se reemplazó con 0.25 ml de DMEM + 5% de BCS + 1% de GPS y se aplicó la muestra de la prueba. Después de 20 minutos de incubación, el medio y el bFGF se agregaron para obtener un volumen final de 0.5 ml de DMEM + 5% de BCS + 1% de GPS + 1 ng/ml de bFGF. Después de 72 horas, las células se dispersaron en tripsina, se volvieron a suspender en Hematall (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) y se contaron por un contador de Coulter.

Análisis de la Proliferación Celular No Endotelial El músculo liso aórtico de bovino (SMC) , epitelial del pigmento retinal del bovino (RPE) , epitelial de pulmón de visón (MLE) , carcinoma de Lewis de pulmón (LLC) , y células de EOMA y fibroblastos de 3T3, se mantuvieron en un 10% de C02 e incubador de 37°C. Para el análisis de proliferación, las células se enjuagaron con PBS y se dispersaron en un 0.05% de solución de tripsina. Las condiciones óptimas para los análisis de la proliferación de la célula se establecieron para cada tipo diferente de célula. El suero de bovino no nato (FCS) se utilizó para las células de LLC, MLE y RPE y el BSC se utilizó para los otros tipos de células. Una suspensión de la célula (20,000 células/ml por SMC, RPE, NLE; 15,000 células/ml por 3T3; 10,000 células/ml por LLC, EOMA), se elaboró con DMEM + 10% de suero de bovino + 1% de GPS, metalizado en 24 placas bien cultivadas (0.5 ml/bien) y se incubó (37°C, 10% de C02) por 24 horas. El medio se reemplazó con 0.5 ml de DMEM + 5% de suero de bovino + 1% de GPS y se aplicó la muestra de la prueba. Después de 72 horas, las células se dispersaron en tripsina, se volvieron a suspender en Hematall (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) y se contaron por un contador de Coulter. Solo las células endoteliales se inhibieron significativamente, como se muestra en la Tabla 2.

TABLA 2 EFECTO DE LA ENDOSTATINA EN LA PROLIFERACIÓN CELULAR ENDOTELIAL Y NO ENDOTELIAL La inhibición se observo primero en dosis de 100 ng/ml con inhibición máxima observada en dosis de 600 ng/ml o mayores. La inhibición no significativa se observó para las células de origen no endotelial en dosis de 1 log de unidad mayores que aquellas utilizadas para inhibir la proliferación celular endotelial capilar (datos no mostrados) . Ejemplo 4 El Análisis de Microsecuencia de la Proteina de 20 kDa revela la Identidad para un Fragmento de Colágeno XVIII El inhibidor de 20 kDa de la proliferación celular endotelial capilar a partir del medio condicionado se purificó para la homogeneidad, como se describe en los ejemplos anteriores, resuelto por SDS-PAGE, electrocurado en PVDF (Bio-Rad, Richmond, CA) , detectado por tinción de Ponceau S y cortado de la membrana con secuencia N-terminal, se determinó por degradación Edman automática en un secuenciador de proteína 470A de Modelo PE/ABD (Foster City, CA) operado con liberación de fase de gas de ácido trifluroacético. Las alineaciones e investigaciones del conjunto de la secuencia se llevaron a cabo contra bases de datos combinadas de GenBnk, Proteína de Brookhaven, SWISS-PROT, y PIR. Las investigaciones se llevaron a cabo en el Centro Nacional de Información de la Biotecnología a través del uso del servicio de red BLAST. El análisis de microsecuencia del inhibidor reveló la identidad para un fragmento C-terminal de colágeno XVIII. La clonación molecular y la secuencia de colágeno XVIII se describe primero por Olsen y sus colaboradores y por Rehn y Pihlajaniemi (Oh y cois, 1994; Rehn y Pihlaj aniemi, 1994) . El colágeno XVIII es un colágeno novedoso, el cual consiste de una región de terminal N con 3 variantes de empalme (Mauragaki y cois, 1995; Rehn y Pihlajaniemi, 1995) , una serie de dominios similares al colágeno con interrupciones y un dominio no colagenoso C-terminal (NCl) de 35 kDa. Un análisis de la microsecuencia N-terminal del aminoácido 18 del inhibidor purificado de la proliferación celular endotelial confirma que es idéntico a un fragmento C-terminal de este dominio de NC1 (figura 5) . Se ha nombrado a este fragmento inhibidor de colágeno XVIII "endostatina" y se incluye en el grupo de moléculas que tiene una actividad de endostatina. Ejemplo 5 Endostatina Recombinante de Ratón (Bacuolovirus o E. coli) Inhibe la Proliferación celular endotelial In Vi tro y la Angiogénesis In Vivo El inhibidor de la proliferación celular endotelial de la presente invención puede expresarse de manera recombinante en cualquier sistema utilizado para expresar proteínas. Los ejemplos no limitantes de tales sistemas de expresión incluyen sistemas de expresión bacterial, sistemas de expresión de levadura y sistemas de expresión viral en insectos. La endostatina recombinante de ratón se expresó utilizando el sistema de expresión de baculovirus BacPAK (Laboratorios CLONTECH) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, un fragmento de cDNA que codifica la secuencia de la señal y la parte C-terminal (región de endostatina) de colágeno XVIII de ratón se insertó en el vector de transferencia pBacPAK 8. El DNA viral de pBacPAK6 (vector de expresión) y el DNA de plásmido del clon de endostatina de pBacPAKd (vector de trasferencia modificado) se contransfirieron dentro de células de insecto Sf21 y el medio que contiene la endostatina de ratón expresada se recolectó. El BacPAK 6 primero se digirió con la enzima BSU36 para hacerlo incompetente para la réplica independiente. El medio que contiene la endostatina expresada de ratón se aplicó a una columna de Sefarosa de heparina de 1.5 x 40 cm, la cual se ha equilibrado con 50 mm de NaCl de 10 mm de Tris de pH 7.4. La columna se enjuagó con el regulador de equilibrio y después se extrajo subsecuentemente con 0.2 M de NaCL, 0.4 M de NaCl, 0.6 M de NaCl, y 1 M de NaCl en 10 mm de Tris de pH 7.4. Toda la cromatografía se llevó a cabo a 4°C. El eluyente de 0.6 M de NaCl (el cual inhibió las células endoteliales capilares de bovino en un análisis de proliferación por 72 horas) se dializó (6-8000 MWCO) contra PBS y después se volvió a aplicar a la columna de Sefarosa de heparina. La columna se eluyó con un gradiente de 50 mm de NaCl - 1.2 M de NaCl en 10 mm de Tris de pH 7.4. Una alícuota de cada fracción se aplicó a las células endoteliales capilares del bovino como arriba y las fracciones que inhibieron la proliferación fueron mancomunadas, se dializaron contra PBS y se concentraron utilizando un concentrador centrífugo de Nanospin Plus (Ciencias de Gelman) (MWCO = 10,000). El SDS-PAGE de la muestra concentrada reveló una banda discreta de Mr aparente de 20 kDa.

Expresión y Purificación de la Endostatina Recombinante de Ratón a partir de E. coli . La parte C-terminal del cDNA de colágeno XVIII se utilizo para amplificar el cDNA de endostatina de ratón, la cual se clonó dentro del vector de pETKHl (derivado de pETlld) (Studier y cois, 1990) . La inducción que resultó en la producción de una proteína de fusión portando la secuencia de aminoácido MARRASVGTD (RRAS = secuencia de reconocimiento A de quinasa de proteína) y 6 residuos de histidina en el término N, seguida por la secuencia de endostatina de ratón (pTB01#8) . El plásmido de pTB01#8 se transformó en BL21:DE3 y la proteína de fusión se purifico en glóbulos de Ni+2-NTA como se describe (QiaExpressionist Handbook, Qiagen). Brevemente, el E.Coli creció hasta que un O.D.600 de 0.8-0.9 y la expresión de la proteína de fusión se indujo después por 3 horas con 1 mm IPTG. La bacteria se aglomeró y se volvió a suspender en 8 m de úrea, 10 mm de Tris-HCl de pH 8.0 que contienen 10 mm de imidazola y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. La suspensión se centrifugo por 15 minutos en 20,000 g y el supernadante incubado con el Ni+2-NTA se formó en gotas por 1 hora a temperatura ambiente. La suspensión se transfirió dentro de una columna y se enjuagó con 8 M de úrea, 0.1 M de Na-fosfato, 10 mm de Tris-HCl de pH 6.25 que contiene 10 mm de imidazola. La proteína se eluyó con el mismo regulador que contiene 250 mm de imidazola. Las fracciones que contienen la endostatina se dializaron extensivamente contra PBS. Durante la diálisis, se precipitó la endostatina. La endostatina precipitada se volvió a suspender en PBS, la concentración de la proteína se ajustó a 2-4 mg/ml y la endostatina se almacenó a -20°C hasta su uso. Para los estudios del ratón, la endostatina se liberó como una suspensión en PBS. Para el análisis corioalantóico del pollito, la endostatina se dializó además contra agua y después se liopolizó. La endostatina recombinante de ratón se produjo tanto en el sistema de expresión de E. Coli como en el sistema de expresión de baculovirus. Utilizando la cromatografía de Sefarosa de heparina secuencial, la endostatina recombinante de ratón se purificó para la homogeneidad aparente a partir del medio de la célula del insecto. Se utilizó Ni+2-NTA-agarosa para purificar la endostatina de ratón derivada de E. coli . El SD-PAGE reveló una banda discreta de aproximadamente 20 kDa o aproximadamente 22 kDa (reducida) purificada para la homogeneidad aparente para las endostatinas recombinantes derivadas de E. coli y de baculovirus, respectivamente (datos no mostrados) . Ambas fueron dializadas contra PBS antes de usarse. Después de la diálisis, el material a partir del sistema de E. coli se precipitó y liberó como una suspensión para estudios subsecuentes in vivo. La endostatina recombinante a partir del baculovirus inhibió específicamente la proliferación de las células endoteliales capilares de bovino en un modo dependiente de la dosis. La inhibición se observó en dosis de 100 ng/ml con inhibición máxima observada a dosis por arriba de 600 ng/ml. La inhibición no significativa de la proliferación de las células de origen no endotelial o las células de EOMA, se observó cuando la endostatina se probó en dosis hasta 1 log de unidad mayores que aquellas utilizadas para inhibir la proliferación celular endotelial . El material precipitado (sin plegar) no se probó in vi tro, debido a su insolubilidad. Sin embargo, un pequeño porcentaje fue soluble en PBS durante diálisis y esta fracción se utilizó para los análisis celular endotelial. Además, después de volverlo a plegar, fue soluble e inhibió la proliferación endotelial (datos no mostrados) . Cuando este material soluble se aplicó a las células endoteliales, se encontró por ser inhibidor en concentraciones comparables tanto a endostatina derivada de baculovirus y endostatina nativa. Para probar la habilidad de la endostatina recombinante de ratón para inhibir in vi vo la angiogénesis, se utilizó un análisis de la membrana corioalantóica de pollito (CAM) (Folkman, 1985; Nguyen y cois, 1994, las cuales se incorporan en la presente para referencia) .

Brevemente, los huevos blancos de Leghorn de 3 días fertilizados (Spafas, Norwich, CT) se rompieron y los embriones con vitelo intacto se colocaron en placas de petri de 100 x 20 mm (Folkman, 1985) . Después de 3 días de incubación (37°C y 3% de C02) , un disco de metilcelulosa (Fisher Scientific, Fair Lawn, N.J) que contiene la endostatina se aplicó al CAM de los embriones individuales. Los discos se elaboraron por desecación de endostatina en µl del 0.45% de metilcelulosa (en H20) en barras de teflón. Después de 48 horas de incubación, los embriones y los CAMs se observaron por medio de un esteromiscroscópio . En dosis del disco de 10-20 µg/10 µg, hubo una inhibición potente de angiogénesis in vivo tanto para la endostatina de E. coli como la endostatina derivada de baculovirus en todos los CAMs probados (n=5/grupo) . El precipitado de endostatina derivada de E. coli se disolvió gradualmente por 5 días y se produjo un efecto antiangiogénico sostenido en los CAMs implantados. En contraste, la endostatina derivada de baculovirus soluble se disolvió dentro de 24 horas y dio un efecto antiangiogénico máximo dentro de un periodo de 48 horas. No hubo evidencia de toxicidad en cualquiera de los embriones de pollito probados.

La endostatina humana se produjo recombinantemente utilizando métodos similares. Ejemplo 6 La Endosta tina Recombinante de Ra tón Inhibe el Crecimiento de Metástasis Debido a que el crecimiento del tumor es dependiente de la angiogénesis, se trató la metástasis del carcinoma de Lewis en pulmón sistémicamente con endostatina recombinante de ratón expresada en el sistema de baculovirus. Los animales con carcinomas Lewis en pulmón de tumores de 600-1200 mm3 se sacrificaron y la piel que cubre el tumor se limpió con betadina y etanol. En un revestimiento de flujo laminar, el tejido del tumor se extirpó bajo condiciones asépticas. Una suspensión de las células del tumor en 0.9% de salina normal, se elaboró por el pasaje de tejido de tumor visible a través de una criba y una serie de agujas hipodérmicas secuencialmente pequeñas de diámetro 22 a 30 galgas. La concetración final se ajustó a 1 x 107 células/ml y la suspensión se colocó en hielo. Después de que el sitio se limpio con etanol, el dorso subcutáneo del ratón en la línea intermedia próxima se inyectó con células de 1 x 106 en 0.1 ml de salina. Cuando los tumores fueron de 1500 mm3 en tamaño, aproximadamente 14 días después del implante, los ratones sufrieron el retiro quirúrgico del tumor. La incisión se cerró con suturas simples interrumpidas. A partir del día de la operación, los ratones recibieron diariamente inyecciones intraperitoneales de salina o endostatina recombinante de ratón (baculovirus) . Los ratones recibieron 0.3 mg/kg/día de endostatina una vez diariamente, a través de inyección subcutánea. Cuando los ratones del control se enfermaron en forma metastática (es decir, después de 13 días de tratamiento) , todos los ratones se sacrificaron y se les hizo la autopsia. Las metástasis en la superficie del pulmón se contaron por medio de un estereomicroscópio en magnitud 4x. El crecimiento de las metástasis del carcinoma de Lewis en pulmón casi se eliminó por completo mediante la administración sistémica de la endostatina en una dosis de 0.3 mg/kg/día dada subcutáneamente (7 ± 3 metástasis/ ratón, n=4, p<0.001). En contraste, en ratones tratados con salina después del retiro de un tumor primario del carcinoma de Lewis en pulmón, las metástasis de pulmón crecieron rápidamente (77 + 7 metástasis/ratón. El peso del pulmón, el cual refleja la carga del tumor, fue de (240 ± 25 mg en los ratones tratados con endostatina contra 760 ± 30 mg en los ratones de control (p < 0.001). Además, no hubo pérdida de peso o evidencia de toxicidad en cualquiera de los ratones tratados con endostatina.

Ejemplo 7 La Endostatina Recombinante de Ratón Inhibe el Crecimiento de Tumores Primarios . La producción de endostatina a partir del sistema de baculovirus fue menor que la del sistema de E.coli, es decir, 1-2 mg/litros contra 30-40 mg/litros. Por lo tanto utilizamos la endostatina derivada de E.coli para estudiar el efecto de la terapia con endostatina en el crecimiento del tumor primario. Producimos endostatina recombinante de ratón a partir de E.coli en cantidad suficiente para tratar los tumores primarios de carcinoma de Lewis en pulmón. La endostatina se administró como una suspensión de la proteína purificada precipitada a ratones que aglutinan los carcinomas Lewis en pulmón de al menos 100-200 mm3. La proteína se purificó por medios convencionales pero no se replegó antes de su administración al ratón. El precipitado inyectado se absorbió lentamente por 24-48 horas . Nosotros no estamos informados de ningún precedente para el uso de un depósito inyectado de proteína recombinante no plegada como un método de liberación sostenido en animales. Sin embargo, la endostatina se reabsorbe gradualmente in vivo y se proporciona para tener actividad antiangiogénica potente, la cual resultó en una actividad prolongada de anti-tumor y antiangiogénica. Por lo tanto, estos datos sugieren un método general novedoso para la liberación controlada de proteínas recombinantes. En base a esta racionalidad, nosotros liberamos angiostatina recombinante no plegada a partir de E. coli con éxito similar. De acuerdo con lo anterior, un aspecto de la invención es la administración de endostatina recombinante o análogos de endostatina en un estado sin plegar a fin de proporcionar un depósito de liberación sostenida de la proteína que inhibe la proliferación celular endotelial por un periodo de al menos 8 horas, deseablemente al menos 12 horas, más deseablemente al menos 24 horas o al menos 48 horas, dependiendo del paciente y la enfermedad a tratarse. Opcionalmente, la angiostatina sin plegar y recombinante se administra para proporcionar de manera similar un depósito de liberación sostenida de la proteína capaz de liberar la proteína de angiostatina por un periodo de al menos 8 horas, deseablemente al menos 12 horas, más deseablemente al menos 24 horas o al menos 48 horas, dependiendo del paciente y la enfermedad a tratarse. A los ratones se les implantó carcinomas Lewis de pulmón como se describe arriba. Los tumores se midieron con un indicador de calibre y los volúmenes del tumor se determinaron utilizando la fórmula amplitud2 x longitud x 0.52 y la proporción tratada para el control del volumen del tumor (T/C) se determinó por el último punto de tiempo. Después de que el volumen del tumor fue de 100-200 mm3 (0.5 - 1% de peso corporal) , lo cual ocurrió dentro de los 3-7 días, los ratones se aleatorizaron en dos grupos. Un grupo recibió endostatina recombinante de ratón (E.coli) como una suspensión en PBS inyectada subcutáneamente en un sitio distante del tumor una vez, diariamente. El otro grupo recibió inyecciones comparables del vehículo solo. Los experimentos se terminaron y los ratones se sacrificaron y se les hizo la autopsia cuando los ratones del control comenzaron a morir. El crecimiento de los tumores primarios de Lewis en pulmón se eliminaron potencialmente mediante terapia sistémica con endostatina. El incremento de la dosis de endostatina se asoció con la eficiencia mejorada (datos no mostrados) . En una dosis de 10 mg/kg, el crecimiento del tumor se inhibió por el 97% a según se comparó con los ratones del control tratados solo con el vehículo. En una dosis de 20 mg/kg dada una vez diariamente, en dos experimentos separados, casi hubo una regresión completa de tumores primarios establecidos (>99% de inhibición, p <0.001). Estos resultados inesperados y sorprendentes se muestran en las figuras 6 y 7. Las figuras 8, 9, 10 y 11 demuestran la efectividad de la endostatina recombinante de ratón para inhibir el crecimiento del tumor en una variedad de modelos diferentes del tumor. También se demuestra la efectividad de la endostatina derivada a partir del humano para inhibir el crecimiento del tumor. El análisis de inmunohistoquímica (figura 12) de los tumores pequeños residuales mostró una inhibición potente de la angiogénesis en los tumores tratados con endostatina. Además, el índice proliferativo de tumores en los ratones tratados con salina y endostatina fue en el mismo nivel elevado en ambos grupos, mientras que el índice apóptico incrementó 8 pliegues después de la terapia con endostatina. De esta manera, la terapia con endostatina resulta en un patrón similar del reposo del tumor al que nosotros hemos descrito previamente para la angiostatina (Holmgren y cois, 1995; O'Reilly y cois, 1996) . Además, no hubo evidencia de toxicidad relacionada con la droga en cualquiera de los ratones tratados. Después de la discontinuidad de la terapia de endostatina, un tumor recurrente en el sitio primario dentro de 5-14 días, se volvió vascularizado y mató eventualmente a los ratones (datos no mostrados) . Notablemente, encontramos que la endostatina recombinante de ratón derivada de E. coli con una etiqueta de polihistidina C-terminal, el cual se expresó, purifico y administró en una manera comparable al producto marcado N- terminal descrito arriba, no inhibió la angiogénesis en el análisis de CAM y no tuvo efecto en el crecimiento de los carcinomas Lewis en pulmón (datos no mostrados) . Estos datos argumentan fuertemente que la actividad anti-tumor y antiangiogénica de la endostatina recombinante son debido a la estructura específica de la endostatina y no a un contaminante en la muestra. La figura 13 muestra los resultados del tratamiento en ciclos del carcinoma de Lewis en pulmón con endostatina recombinante de ratón derivada de E. coli . Estos resultados muestran claramente la regresión dependiente de la endostatina reproducible de la masa del tumor, seguida por el crecimiento del tumor después del término del tratamiento de endostatina. Estos resultados muestran que un hemangioendotelioma de murino produce un inhibidor de 20 kDa específico y novedoso de la proliferación celular endotelial in vi tro, el cual también es un inhibidor potente de la angiogénesis y el crecimiento del tumor in vivo . La endostatina de la secuencia N-terminal de este inhibidor, es idéntica al fragmento C-terminal de colágeno XVIII. La administración sistémica de la endostatina recombinante, inhibe potencialmente la angiogénesis, mantiene las metástasis en un tamaño microscópico y regresa los tumores primarios a menos de 1 ir-m3, una reducción de por arriba de 150-pliegues . Durante el tiempo que los ratones son tratados, no existe un recrecimiento de tumores, ninguna evidencia de resistencia a la droga y ninguna toxicidad. Es interesante observar que algunos fragmentos del dominio C-terminal de colágeno tipo XVIII que son mayores que la endostatina no inhiben la proliferación celular endotelial (datos no mostrados) . La endostatina se descubrió por la misma estrategia empleada para encontrar la angiostatina (O'Reilly y cois, 1994), es decir, aislamiento de un tumor.

Aunque se cuenta intuitivamente que los tumores deben ser una fuente de los inhibidores de la angiogénesis, los resultados reportados aquí parecen validar esta propuesta. Esto conduce a la pregunta de por qué los inhibidores de la angiogénesis deben presentarse en tumores que son angiogénicos. Una posibilidad es que un inhibidor puede ser 'sobrante' después de la regulación hacia abajo de su producción mediante una célula del tumor que sufre el cambio del fenotipo angiogénico. Esto parece ser el caso para la trombospondina producida por las células Li-Fraumeni, en las cuales el segundo alelo para p53 muta o se elimina (Dameron y cois, 1994). Una segunda posibilidad es que la actividad proteolítica, la cual acompaña el crecimiento del tumor y la cual es un componente importante del crecimiento del vaso sanguíneo capilar, también puede movilizar los inhibidores de la angiogénesis circulantes a partir de las proteínas precursoras, las cuales no son inhibidores por si mismas. La angiostatina, por ejemplo, inhibe la angiogénesis y la proliferación celular endotelial mientras que el plasminógeno nó (O'Reilly y cois, 1996; O'Reilly y cois, 1994) . Para la endostatina, se revela un patrón similar. La histología de los tumores que regresa bajo la terapia con endostatina, mostró el golpe perivascular de las células del tumor rodeando uno o más microvasos, en los cuales se bloqueó la angiogénesis. Las células del tumor desplegaron una proliferación elevada balanceada por apoptósis elevada, sin ganancia neta en el tamaño del tumor. Estos datos son consistentes con un modelo de un nuevo tipo de reposo del tumor propuesto recientemente (Holmgren y cois, 1995) . Además, la endostatina inhibió la proliferación de las células endoteliales in vi tro, pero no tuvo efecto en las células del carcinoma de Lewis en pulmón, u otros tipos de células que incluyen el músculo liso, epitelio, fibroblastos y la línea de la célula de EOMA, a partir de los cuales se purificó. El hecho de que un inhibidor específico de la proliferación celular endotelial pueda regresar un tumor a un tamaño microscópico y mantenerlo en un estado de reposo, a pesar del hecho de que las células del tumor son refractarias al inhibidor desde el principio, indica que la población endotelial puede ejercer control regulador del crecimiento poderoso sobre las células del tumor. Los resultados con endostatina soportan la teoría (Folkman, 1996) de que para propósitos terapéuticos, es fructífero pensar acerca de un tumor en términos de dos distintas poblaciones de células: una población celular del tumor y una población celular endotelial, cada una de las cuales puede estimular el crecimiento de la otra. El crecimiento de cada población celular puede inhibirse opcionalmente por agentes que se dirigen selectiva y específicamente a ese tipo de célula, es decir, quimioterapia citotóxica y terapia antiangiogénica. Además, el tratamiento combinado de ambas poblaciones celularesa puede ser mejor que el tratamiento de cualquier tipo de célula solo. Para probar esta teoría, los ratones se criaron con carcinomas de Lewis en pulmón, y los tumores aglutinantes que mantuvieron un tamaño de aproximadamente 300 mm3, se trataron con una terapia de combinación que comprende angiostatina y endostatina, cada una en una dosis de 20 mg/kg/día por 25 días. Los tumores regresaron a niveles microscópicos por aproximadamente el día 10 del tratamiento. Un descubrimiento completamente inesperado fue que los tumores permanecieron regresados y en reposo por aproximadamente tres meses, aún después de que se terminó todo el tratamiento, como se muestra en la figura 14. Los experimentos de la duración más larga indican que un tratamiento inicial del tumor con una combinación de angiostatina y endostatina provoca un reposo de termino muy largo, el periodo actual del cual se desconoce en este momento . Tal reposo de término largo se considera una cura para un experto en la materia. Por ejemplo, la guidelina de NIH para determinar cuando un tratamiento es efectivo como una cura de cáncer, es que el tumor permanece en reposo (es decir, no incrementa en tamaño) por diez veces el tiempo de duplicación normal del tumor. La longitud de reposo llevada a cabo utilizado una combinación de endostatina y angiostatina excede por mucho este criterio. De acuerdo con lo anterior, un aspecto importante de la invención es una composición que comprende una combinación de angiostatina y endostatina, o un análogo de endostatina, en cantidades suficientes para causar un reposo de larga duración, o cura, de los cánceres dependientes de angiogénesis cuando se administra a los pacientes con cánceres dependientes de la angiogénesis. La administración puede ser sistémicamente, por ejemplo mediante inyección, en cuyo caso la dosis se determina dependiendo del paciente y el cáncer particular, pero la cual generalmente es al menos 0.2 mg/kg/día, deseablemente al menos 2.0 mg/kg/día, más deseablemente al menos 20 mg/kg/día. Generalmente, la composición se administra diariamente por al menos 10 días, deseablemente por al menos 20 días, más deseablemente por al menos 25 días. Las vías de administración sistémica alternativas incluyen, oralmente cuando la composición se formula, por ejemplo en microglóbulos cubiertos, para proteger la proteína de los ambientes digestivos inactivos; transdermalmente; y a través de bomba. Alternativamente, las diferentes dosis y periodos de tratamiento pueden utilizarse si la composición se administra localmente a un sitio dependiente de la angiogénesis, tal como un tumor. Tal administración puede ser, por ejemplo, implantación quirúrgica o inyección local dentro, o cerca del sitio. Ejemplo 8 Aislamiento del receptor putativo para la endostatina Tanto la endostatina como la angiostatina parecen ser inhibidores específicos de la proliferación celular endotelial. Por lo tanto, es probable que la endostatina se aglutine a las estructuras específicas exclusivamente expresadas en la superficie de las células endoteliales.

Nosotros no estamos informados de la existencia de cualquier otro inhibidor específico de la proliferación celular endotelial. La identificación y aislamiento de las proteínas, las cuales se aglutinan específicamente a la endostatina se acompaña por los métodos bien conocidos en la materia, por ejemplo por cromatografía de afinidad y clonación de expresión. Cromatografía de Afinidad. Las células endoteliales capilares del bovino (BCE) se radioetiquetan con [35S]-metionina, célula total y extractos de membrana preparados y aplicados para las columnas de afinidad preparadas con endostatina. Como un control negativo, los extractos de proteína de fibroblasto se aislan de una manera similar. Las proteínas aglutinadas se extraen de la columna utilizando un gradiente de NaCl y las fracciones diferentes se analizan utilizando el SDS-PAGE estándar y autoradiografía. Este procedimiento produce las proteínas que se aglutinan apretadamente a la columna de endostatina y solo presentan las fracciones derivadas celular endotelial. La comparación de los patrones electroforéticos de los dos tipos de células revelan proteínas expresadas únicas para las células de BCE. Las secuencias de proteína subsecuentemente se determinan y se clonan al gen(es) correspondiente (s) . Un conjunto de cDNA de las células endoteliales capilares del bovino, se prepara y disimula con una técnica de PCR en depósito oligo degenerativo para ubicar el cDNA(s) de la(s) proteína (s) que aglutinan la endostatina específica. La hibridación utilizando los oligonucleótidos degenerativos al cDNA correspondiente, también se utiliza para identificar los genes de las proteínas que aglutinan la endostatina. Otra propuesta es elevar los anticuerpos contra las secuencias de péptidos con métodos descritos anteriormente en la descripción detallada e inmunoocultar el mismo conjunto. Clonación de la Expresión . Se prepara un conjunto de cDNA de las células de BCE. Poli-A mRNA se aisla de las células de BCE cuya proliferación se ha inhibido previamente por la endostatina. Estas células expresan una proteína que aglutina la endostatina. El conjunto de cDNA correspondiente se transfiere en células que permiten la expresión elevada de los diversos cDNAs . La actividad de aglutinamiento de la endostatina para las células que expresan la proteína receptora sobre la superficie, se utiliza como una selección positiva de estas células. Para seleccionar estas células, la endostatina purificada se marca con biotina y consecuentemente se detecta utilizando ya sea estreptavidina acoplada con glóbulos magnéticos o clasificación FACS. Alternativamente, un anticuerpo contra la endostatina se utiliza para ocultamiento. Después de la selección de las células positivas, los plásmidos correspondientes se aislan, amplifican y transfieren de nuevo dentro de las células de expresión elevada. Después de varias vueltas de selección positiva, los plásmidos se analizan para inserciones idénticas utilizando digestión de endonucleasa y PCR. Utilizando estos datos, los grupos de complementación se forman, secuencian y analizan con el programa de red BLAST. Además para computar el análisis, los cDNAs individuales se vuelven a transferir dentro de las células de expresión elevada y se prueban para la actividad que aglutina la endostatina bajo diferentes condiciones (por ejemplo, competición con endostatina no etiquetada, tiempo del curso de aglutinamiento, análisis Scatchard, etc, en otras palabras el uso de procedimientos de caracterización receptores "clasicos" conocidos por aquellos expertos en la materia) . Ejemplo 9 Determinación de la región mínima de la proteína de la endostatina de ratón responsable por su actividad antiangiogénica . Los iniciadores PCR diferentes se designan, los cDNAs correspondientes se clonan dentro del sistema de expresión de E. coli , y los fragmentos de endostatina diferentes se purificaron para la homogeneidad. La ¡7 - longitud completa del cDNA se corta a partir tanto del término N como del término C. Como una primer criba el análisis de la proliferación endotelial capilar y el análisis del embrión de pollito se utilizan para determinar la actividad residual comparada con el fragmento con longitud completa. Ejemplo 10 Determinación de la (s) enzima (s) putativa (s) , la (s) cual (es) puede (n) liberar endostatina a partir del colágeno XVIII. El colágeno XVIII pertenece a la familia de colágenos de tipo no fibrilar y puede encontrarse en tres diferentes variantes de empalme codificando para las proteínas con 1315, 1527 y 1774 residuos de aminoácidos (Rehn, PNAS, 91:4234, 1994). La diferencia se causa por las alteraciones en la parte N-terminal del gen, y por lo tanto todas las tres variantes de empalme podrían ser potencialmente la fuente de la endostatina, la cual por si misma es un fragmento del dominio no colagenoso 11 (NC11) . La función del colágeno XVIII no se conoce, pero debido a su mensaje se expresa substancialmente en órganos elevadamente vascularizados, se ha propuesto una función en el ensamblaje matriz perivascular y/o estrucutra (Oh y cois, Genomics, 19:494, 1994). Una primer indicación acerca de la función del colágeno XVIII proviene de la purificación de la endostatina como un inhibidor potente de la proliferación celular endotelial. A partir de este dato preliminar y a partir de nuestra observación inicial de que la endostatina se purificó a partir de un medio condicionado de un hemangioendotelioma (EOMA), nos preguntamos si la(s) enzima (s) que liberan la endostatina a partir del colágeno XVIII podría (n) identificarse. Los últimos 325 residuos de aminoácidos, que se codifican para el dominio de NCll, se expresan en E.coli y la proteína purificada, del sistema de baculovirus de la célula de insectos, se utiliza como un substrato para identificar la enzimas que clonan esta región de colágeno XVIII. Mediante el PCR, un fragmento de cDNA que codifica el dominio de NCll se clona dentro de un vector de expresión de E.coli (series pET, lo cual permite la expresión elevada de la proteína objetivo después de la inducción con IPTG. Alternativamente, se utiliza un vector adecuado para la expresión de la célula del insecto. Las proteínas se etiquetan con la etiqueta de HIS6 ubicada en el término C para la purificación, utilizando perlas Ni2+-NTA-. Un conjugado de fosfatasa de Ni2+-NTA-alcalino puede detectar el término C mediante el secante de Western. Otra construcción se hace, la cual no solo tiene una etiqueta de HIS6 en el término C, pero también codificará la ¡9 - hemaglutinina (etiqueta de HA en el término N) . Este se detecta por el secante de Western con un anticuerpo monoclonal de HA específico. El término C y N de la proteína seguida después de la incubación con el supernadante de EOMA y los diferentes extractos de metaloproteinasa . El producto de disociación se detecta por el análisis de SDS-PAGE o secante de Western, la proteína se vuelve a purificar utilizando las perlas Ni2+-NTA- eluídas con imidazola, dializadas contra PBS y probadas para la actividad inhibidora en los diversos análisis in vi tro e in vivo (por ejemplo, proliferación celular endotelial, embrión de pollito y análisis corneal de ratón) . Si el producto de disociación purificado muestra actividad inhibidora, la secuencia del aminoácido de término N se ejecuta y compara a la secuencia de inicio original de la endostatina obtenida a partir del supernadante de EOMA. De acuerdo con lo anterior, el procedimiento de disociación puede graduarse para purificar la proteína suficiente para la prueba en ratones que tienen tumor y para comparar su actividad a aquella de la longitud completa del dominio de NCll. Referencias Las siguientes referencias están incorporadas en la presente como referencia en su totalidad.

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LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE (A) NOMBRE: The Children' s Medical Center Corporation (B) CALLE: 300 Longwood Avenue (C) CIUDAD: Boston (D) ESTADO: Massachusetts (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL (CP) : 02115 (G) TELEFONO: (617) 735-7050 (H) TELEFAX: (617) 232-7485 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones y Métodos Antiangiogénicos Terapéuticos (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 1 (iv) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco magnético sensible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0 Versión #1.30 (EPO) (2) IFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 1: (i) CARATERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) TRENZADO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-DETECCIÓN: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Murino (F) TIPO DE TEJIDO: Colágeno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn 1 5 10 15 Thr Pro Leu Ser 20 (2) IFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 1: (i) CARATERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) TRENZADO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-DETECCIÓN: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Murino (F) TIPO DE TEJIDO: Colágeno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn 1 5 10 15 Thr Pro Leu Ser 20

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones. 1. Endostatina aislada 2. La endostatina aislada según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una proteína aislada que es de aproximadamente 18 kDa como se determina por la electrofóresis de gel no reducida, y aproximadamente 20 kDa como se determina por la electrofóresis de gel reducida, en donde la proteína puede aislarse a partir de la línea celular de hemangioendotelioma de murina de EOMA y en donde la proteína se caracteriza además por su habilidad para inhibir específicamente la proliferación de las células endoteliales cultivadas. 3. La endostatina según la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácido N-terminal de la proteína tiene homología de secuencia substancial para Seq. ID No : 1. 4. La endostatina según la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína tiene homología de secuencia substancial para un fragmento de péptido C-terminal de colágeno tipo XVIII. 5. La endostatina según la reivindicación 1, caracterizada porque se elabora mediante un proceso que comprende: la producción recombinante de la proteína de la reivindicación 1 en un sistema recombinante de expresión y el aislamiento de la proteína producida recombinantemente en su forma sin plegar. 6. La endostatina según la reivindicación 5, caracterizada porque el sistema recombinante de expresión es E. Coli o baculovirus 7 Un compuesto que comprende: una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de endostatina. 8. El compuesto según la reivindicación 7, caracterizado porque la proteína de endostatina es de aproximadamente 18 kDa como se determina por la electrofóresis de gel no reducida y aproximadamente 20 kDa como se determina por la electrofóresis de gel reducida, en donde la proteína puede aislarse a partir de la hemangioendotelioma de murina EOMA y en donde la proteína se caracteriza además por su habilidad para inhibir específicamente la proliferación de las células endoteliales cultivadas. 9. El compuesto según la reivindicación 7, caracterizado porque la secuencia de aminoácido N-terminal de la proteína tiene homología de secuencia substancial para Seq. ID No : 1. 10. El compuesto según la reivindicación 7, caracterizado porque la proteína tiene homología de secuencia substancial para un fragmento de péptido C-terminal de colágeno tipo XVIII. 11 Un compuesto que comprende: un anticuerpo aislado capaz de aglutinarse específicamente a la proteína de endostatina. 12. El compuesto según la reivindicación 11, caracterizado porque la proteína de endostatina es de aproximadamente 18 kDa como se determina por la electrofóresis de gel no reducida y aproximadamente 20 kDa como se determina por la electrofóresis de gel reducida, en donde la proteína puede aislarse a partir de la hemangioendotelioma de murina EOMA y en donde la proteína se caracteriza además por su habilidad para inhibir específicamente la proliferación de las células endoteliales cultivadas. 13 El compuesto según la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 14. El compuesto según la reivindicación 11, caracterizado porque la secuencia de aminoácido N-terminal de la proteína de endostatina tiene homología de secuencia substancial para Seq. ID No:l. 15. El compuesto según la reivindicación 11, caracterizado porque la proteína de endostatina tiene homología de secuencia substancial para un fragmento de péptido C-terminal de colágeno tipo XVIII. 16. Una endostatina aislada elaborada por un proceso que comprende: a. colectar un medio de cultivo para crecer la línea celular de hemangioendotelioma de murina EOMA; y b. fraccionar el medio mediante cromatografía de columna de heparina, en donde la endostatina aislada es una proteína de aproximadamente 18 kDa como se determina por la electrofóresis de gel no reducida y aproximadamente 20 kDa como se determina por los electroforos de gel reducida, y la proteína es capaz de inhibir específicamente la proliferación celular endotelial en células cultivadas. 17. Un método para tratar una enfermedad relacionada con la angiogénesis que comprende: la administración a un paciente en necesidad de tal tratamiento de la endostatina de la reivindicación 1 en una cantidad suficiente para inhibir la angiogénesis. 18. El método según la reivindicación 17, caracterizado porque la endostatina es una proteína producida recombinantemente y en donde la proteína producida recombinantemente se administra en su forma sin repliegues . 19. El método según la reivindicación 18, caracterizado porque la endostatina producida recombinantemente proporciona una liberación sostenida de la proteína por arriba de un periodo de al menos 8 horas. 20. El método según la reivindicación 17, caracterizado porque la enfermedad relacionada con la angiogénesis se selecciona del grupo que consiste de cánceres que dependen de la angiogénesis; tumores benignos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares; Síndrome de Osler-Webber; angiogénesis miocardial; neovascularización de la placa; telangiectasia; juntas hemofiliacas; angiofibroma; granulación de la herida; adhesiones intestinales, aterosclerosis, escleroderma, cicatrices hipertróficas, enfermedades de rasguño de gato y úlceras Helobacter pylori . 21. El método según la reivindicación 20, caracterizado porque la enfermedad relacionada con la angiogénesis es cáncer dependiente de la angiogénesis. 22. Un método para tratar un paciente con un tumor canceroso dependiente de la angiogénesis que comprende: la administración a un paciente en necesidad de tal tratamiento de la endostatina de la reivindicación 1 en una cantidad suficiente para causar la regresión del tumor. 23. El método según la reivindicación 22, caracterizado porque la endostatina es una proteína producida recombinantemente y en donde la proteína producida recombinantemente se administra en su forma sin repliegues . 24. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque la endostatina producida recombinantemente proporciona una liberación sostenida de la proteína por un periodo de al menos 8 horas. 25. Un método para curar al paciente con un cáncer dependiente de la angiogénesis que comprende: la administración a un paciente en necesidad de tal cura de una cantidad que cura el cáncer dependiente de la angiogénesis de una composición que comprende: angiostatina combinada con la endostatina de la reivindicación 1, en donde la angiostatina y la endostatina se proporcionan en cantidades de tal manera que la composición es capaz de inhibir de manera efectiva la angiogénesis de los cánceres dependientes de la angiogénesis cuando se administra a pacientes con cánceres dependientes de la angiogénesis. 26. El método según la reivindicación 25, caracterizado porque al menos una de la endostatina y angiostatina es una proteína producida recombinantemente y en donde la proteína producida recombinantemente se administra en su forma sin repliegues. 27. El método según la reivindicación 25, caracterizado porque la proteína producida recombinantemente proporciona una liberación sostenida de la proteína por un periodo de al menos 8 horas. 28. Un método de control de nacimiento que comprende: la administración a una hembra de una cantidad suficiente de la endostatina de la reivindicación 1 para prevenir la implantación del embrión. 29. El método según la reivindicación 28, caracterizado porque la endostatina es una proteína producida recombinantemente y en donde la proteína producida recombinantemente se administra en su forma sin repliegues. 30. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque la proteína producida recombinantemente proporciona una liberación sostenida de la proteína por un período de al menos 8 horas. 31. Una composición que comprende: angiostatina combinada con la endostatina de la reivindicación 1, en donde la angiostatina y la endostatina se proporcionan en cantidades de tal manera que la composición es capaz de regresar de manera efectiva la masa del tumor de los tumores dependientes de la angiogénesis cuando se administra a pacientes con tumores dependientes de la angiogénesis . 32. Un método para elaborar la proteína de endostatina que comprende: expresar recombinantemente una proteína que es de aproximadamente 18 kDa como se determina por la electrofóresis de gel no reducida y aproximadamente 20 kDa como se determina por la electrofóresis de gel reducida y la cual tiene una homología de secuencia substancial para la endostatina, siendo caracterizada además la proteína por su habilidad para inhibir específicamente la proliferación de las células endoteliales cultivadas. 33. El método según la reivindicación 32, caracterizado porque la proteína de endostatma se produce en un sistema de expresión seleccionado del grupo que consiste de sistemas de expresión bacteriales, sistemas de expresión de levadura y sistemas de expresión viral en insectos .