MXPA98003131A - Composiciones y metodos para el tratamiento de condiciones deficitarias de los huesos - Google Patents

Abstract

Los compuestos que contienen dos sistemas aromáticos, covalentemente enlazados a través de un enlace que contiene uno o másátomos, o"enlace"definido como que incluye un enlace covalente per se para separar los sistemas aromáticos a una distancia de 1.5-15A, son efectivos en condiciones de tratamiento asociadas con los déficits del hueso. Los compuestos se pueden administrar a sujetos vertebrados solos o en combinación con agentes adicionales que promueven el desarrollo del hueso o que inhiben la resorción del hueso. Estos se pueden seleccionar por la actividad antes de la administración al valorar su capacidad para efectuar la transcripción de un gen reportero acoplado a un promotor asociado con una proteína morfogenética del hueso y/o su capacidad para estimular el desarrollo del hueso calvárico en sistemas de animales modelo.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE CONDICIONES DEFICITARIAS DE LOS HUESOS Campo Técnico La invención se refiere a composiciones y métodos para el uso en la limitación de pérdida de hueso no deseada en un vertebrado en riesgo de tal pérdida de hueso, en el tratamiento de condiciones que se caracterizan por la pérdida de hueso no deseada o por la necesidad por desarrollo del hueso, en el tratamiento de fracturas y en el tratamiento de desórdenes del cartílago. Más específicamente, la invención se refiere al uso de clases especificas de compuestos identificados o caracterizados por un ensayo de selección de alto rendimiento .

Técnica Antecedente El hueso no es un tejido estático. Está sujeto a la descomposición y resintesis constante en un proceso complejo mediado por los osteoblastos, los cuales producen nuevo hueso, y los osteoclastos, los cuales destruyen el hueso. Las actividades de esas células se regulan por un gran número de citocinas y factores de crecimiento, REF: 027280 muchos de los cuales ahora se han identificado y reproducido. Mundy ha descrito el conocimiento actual relacionado a estos factores (Mundy, G.R. Cl in Orthop 324:24-28, 1996, Mundy, G.R. J. Bone Miner Res 8:S505-10, 1993). Aunque existe una gran cantidad de información disponible sobre los factores que influyen la descomposición y resorción del hueso, la información sobre los factores de crecimiento que estimulan la formación del nuevo hueso es más limitada. Los investigadores han buscado fuentes de-tales actividades, y han encontrado que el tejido del hueso mismo es un almacén para los factores que tienen la capacidad para estimular las células del hueso. De esta manera, los extractos de tejido del hueso de bovino, obtenido del matadero o desolladero, contienen no únicamente proteínas estructurales que son responsables por el mantenimiento de la integridad estructural del hueso, sino también factores de crecimiento del hueso, biológicamente activos que pueden estimular que las células del hueso proliferen. Entre estos últimos factores están el factor de crecimiento ß de transformación, los factores de crecimiento de unión de heparina (factor de crecimiento de fibroblastos, acidico y básico) , los factores de crecimiento similares a la insulina (factor de crecimiento similar a la insulina I y factor de crecimiento similar a la insulina II), y una familia de proteínas recientemente descrita, llamadas proteínas morfogenéticas del hueso (BMPs). Todos estos factores de crecimiento tienen efectos sobre otros tipos de células, asi como también sobre células del hueso. Las BMPs son factores novedosos en la superfamilia de factores de crecimiento ß, de transformación extendida. Estos se identificaron primero por Wozney J. y colaboradores Sci en ce (1988) 242:1528-34, utilizando técnicas de reproducción o clonación de genes, seguido por las descripciones más recientes que caracterizan la actividad biológica en extractos de hueso desmineralizado (Urist M. Sci en ce (1965) 150:893-99) . Las BMP2 y BMP4 recombinantes pueden inducir la formación del nuevo hueso cuando éstas se inyectan localmente dentro de los tejidos subcutáneos de ratas (Wozney J. Mol ec Reprod Dev (1992) 32:160-67). Estos factores se expresan por los osteoblastos normales a medida que éstos se diferencian y se ha mostrado que estimulan la diferenciación de los osteoblastos y la formación del nodulo del hueso in vi tro asi como también la formación del hueso in vi vo (Harris S. y col aboradores J. Bone Miner Res (1994) 9:855-63). Esta última propiedad sugiere una utilidad potencial como agentes terapéuticos en enfermedades que dan por resultado la pérdida del hueso. Las células que son reproducibles para la formación del hueso son los osteoblastos. A medida que los osteoblastos se diferencian de los precursores para madurar las células que forman el" hueso, éstos expresan y secretan un número de enzimas y proteínas estructurales de la matriz del hueso, inclusive colágeno del tipo 1, osteocalcina, osteopontina y alcalin fosfatasa (Stein G. y col aboradores Curr Opin Cel l Bi ol (1990) 2:1018-27; Harris S. y colaboradores (1994), supra). Estos también sintetizan un número de péptidos reguladores del crecimiento que se almacenan en la matriz del hueso, y son presumiblemente responsables de la formación del hueso, normal. Estos péptidos reguladores de crecimiento incluyen las BMPs (Harris S. y co l abora dores (1994) s upra ) . En estudios de cultivos primarios de osteoblastos calváricos de rata, fetales, las BMPs 1, 2, 3, 4 y 6 se expresan por las células cultivadas antes de la formación de los nodulos del hueso mineralizado (Harris S. y colaboradores (1994), s upra ) . Similar a la alcalin fosfatasa, osteocalcina y osteopontina, las BMPs se expresan por osteoblastos cultivados a medida que éstos proliferan y se diferencian. Aunque las BMPs son estimuladores potentes de la formación del hueso in vi tro e in vi vo, existen desventajas para su uso como agentes terapéuticos para aumentar la curación del hueso. Los receptores para las proteínas morfogenéticas del hueso se han identificado en muchos tejidos, y las BMPs mismas se expresan en una gran variedad de tejidos en patrones temporales y espaciales, específicos. Esto sugiere que las BMPs pueden tener efectos sobre muchos tejidos diferentes del hueso, que limitan potencialmente su utilidad como agentes terapéuticos cuando se administran sistémicamente. Además, puesto que estas son péptidos, éstas tendrían que ser administradas por inyección. Estas desventajas imponen severas limitaciones al desarrollo de las BMPs como agentes terapéuticos. Existe un exceso de condiciones que se caracterizan por la necesidad de aumentar la formación del hueso. Quizás lo más obvio es el caso de fracturas de hueso, donde seria deseable estimular el desarrollo del hueso y para acelerar y completar la reparación del hueso. Los agentes que aumentan la formación del hueso también serian útiles en los procedimientos de reconstrucción facial. Otras condiciones de déficit del hueso incluyen defectos en segmentos del hueso, enfermedad periodontal, enfermedad del hueso metástatica, enfermedad del hueso osteolitica y condiciones donde la reparación del tejido conectivo seria beneficiosa, tal como la curación o regeneración de defectos o lesión del cartílago. También, la condición crónica de la osteoporosis es de mayor importancia, inclusive la osteoporosis relacionada con la edad y la osteoporosis asociada con el estado de hormonas pos-menopáusicas . Otras condiciones caracterizadas por la necesidad por el desarrollo del hueso incluyen el hiperparatiroidismo primario y secundario, osteoporosis no usual, osteoporosis relacionada con la diabetes, y osteoporosis relacionada con glucocorticoides. Además, o de manera alternativa, los compuestos de la' presente invención pueden modular el metabolismo, proliferación y/o diferenciación de células o tejidos normales o aberrantes . Actualmente no existen planteamientos farmacéuticos, satisfactorios para manejar cualquiera de estas condiciones. Las fracturas del hueso aun se tratan exclusivamente utilizando vendajes enyesados, abrazaderas o ataduras, dispositivos de sujeción y otros medios estrictamente mecánicos. Además, el deterioro del hueso asociado con la osteoporosis pos-menopáusica se ha disminuido o impedido con estrógenos o bisfosfonatos . La patente norteamericana No. 5,280,040 describe una clase de compuestos que son 3,4-diaril crómanos. Estos compuestos se pueden considerar derivados de 2,3,4 trifenil butanol, donde el hidroxi en la posición 1 forma un éter con la posición orto del grupo fenilo sustituido en la posición 4 del butanol. Los 3,4-diarilo crómanos principales no contienen átomos de nitrógeno en las porciones aromáticas o sus enlaces. Un compuesto preferido, centcromano, contiene un sustituyente de nitrógeno únicamente en uno de los sustituyentes en una porción de fenilo.

La presente invención describe compuestos útiles para limitar o tratar condiciones de déficit del hueso, y para otros usos que deben ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas en la presente.

Descripción de la Invención Esta invención proporciona compuestos que se pueden administrar como sustancias farmacéuticas ordinarias y que tienen el efecto metabólico de aumentar el desarrollo del hueso. Los compuestos de la invención se pueden identificar utilizando un ensayo para su capacidad para activar los elementos de control asociados con esos factores. De esta manera, la invención se dirige a métodos y composiciones para estimular el desarrollo del tejido esquelético (hueso), métodos y composiciones que utilizan, como ingredientes activos, los compuestos en donde dos sistemas aromáticos se acoplan para ser separados de entre si por aproximadamente 1.5 a aproximadamente 15 Angstroms. Los sistemas de esta manera enlazados (inclusive el enlace que los acopla) pueden incluir al menos un átomo de nitrógeno diferente de un sustituyente de anillo.

Por lo tanto, los compuestos útiles en la invención se pueden describir como que tienen la fórmula Ar^enlace-Ar2, en donde cada uno de Ar1 y Ar2 es independientemente un sistema aromático y la porción de enlace de la fórmula separa Ar1 y Ar2 por una distancia de aproximadamente 1.5-15 Angstroms. Ar1, Ar2 y el enlace se pueden sustituir opcionalmente con sustituyentes que no interfieren. En los compuestos útiles, puede existir al menos un átomo de nitrógeno en ya sea Ar1, Ar2 y/o el enlace, independiente de cualquiera de los sustituyentes en los mismos. En forma preferente, los compuestos de la invención también contienen al menos un heteroátomo adicional seleccionado del grupo que consiste de N, S y O, independiente de cualquier sustituyente . Otros compuestos de la invención incluyen anillos de cinco miembros, particulares que tienen una separación de carga. De esta manera, la invención se dirige a métodos para tratar desórdenes del hueso utilizando los compuestos descritos y a las composiciones farmacéuticas para este uso.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra la curva de respuesta a la dosis para el compuesto, designado 59-0008. Las Figuras 2 y 3 muestran compuestos ilustrativos de la invención y los resultados obtenidos con los mismos en una prueba in vi tro .

Modos para Llevar a Cabo la Invención Una prueba de selección de rendimiento, rápida para los compuestos capaces de estimular la expresión de un gen reportero enlazado a un promotor de BMP (un substituto para la producción de factores morfogenéticos del hueso que se producen endogénicamente) se describe en la solicitud de patente norteamericana No. de Serie 08/458,434, presentada el 2 de Junio de 1995, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente por referencia. Este ensayo también se describe como una porción de un estudio de osteoblastos de murino, inmortalizados (derivados de un ratón que expresa un transgen compuesto de un promotor de BMP2 que impulsa la expresión del antigeno T) en Ghosh-Choudhery, N. y colaboradores Endocrinol ogy (1996) 137:331-39. En este estudio, las células inmortalizadas se transfectaron de manera estable con un plásmido que contiene un gen reportero de luciferasa impulsado por un promotor de BMP2 de ratón (-2736/114 bp), y respondió de una manera dependiente a la dosis a la BMP2 de humano, recombinante . En resumen, el ensayo utiliza células transformadas permanentemente o transitoriamente con construcciones en las cuales el promotor de una proteina morfogenética del hueso, específicamente BMP2 o BMP4, se acopla a un gen reportero, típicamente luciferasa. Estas células transformadas luego se evalúan para la producción de un producto de gen reportero; los compuestos que activan el promotor de BMP impulsarán la producción de la proteina reportera, que fácilmente se puede ensayar. Sobre 40,000 compuestos se han sujetado a esta técnica de selección rápida, y únicamente un porcentaje muy pequeño son capaces de producir un nivel de producción de luciferasa cinco veces mayor que aquel producido por el vehículo. Los compuestos que activan el promotor de BMP comparten ciertas caracteristicas estructurales no presentes en compuestos inactivos. Los compuestos activos ("compuestos activos promotores de las BMPs" o "compuestos activos") son útiles en la promoción del desarrollo del hueso o del cartílago, y de esta manera en el tratamiento de vertebrados en necesidad del desarrollo del hueso o cartílago. Los compuestos activos promotores de la BMP se pueden examinar en una variedad de otros ensayos que prueban la especificidad y toxicidad. Por ejemplo, los no promotores de la BMP o elementos de respuesta se pueden enlazar a un gen reportero e insertar en una célula huésped, apropiada. La citotoxicidad se puede determinar, por ejemplo, mediante la examinación visual o microscópica de las células que contienen el gen reportero promotor de la BMP y/o no promotor de la BMP. De manera alternativa, la sintesis del ácido nucleico y/o proteina por las células se puede monitorear. Para los ensayos in vi vo , los tejidos se pueden remover y examinar visualmente o microscópicamente, y se pueden examinar opcionalmente en conjunción con tintes y soluciones colorantes que facilitan la examinación histológica. En la valoración de los resultados del ensayo in vi vo, también puede ser útil examinar la biodistribución del compuesto de prueba, utilizando técnicas de modelos de química medicinal/animal, convencionales . Como se utiliza en la presente, "limitar" o "limitante" y "tratar" o "tratamiento" son términos intercambiables. Los términos incluyen un aplazamiento del desarrollo de los síntomas de déficit del hueso y/o una reducción en la gravedad de tales síntomas que son o se esperará que se desarrollen. Los términos además incluyen el mejoramiento que existe en los síntomas de déficit del hueso o cartílago, prevención de síntomas adicionales, mejoramiento o prevención de las causas metabólicas subyacentes de los síntomas, prevención o anulación de la resorción del hueso y/o la estimulación del desarrollo del hueso. De esta manera, los términos denotan que se ha conferido un resultado benéfico a un sujeto vertebrado con un déficit del cartílago, hueso o esqueleto, o con potencial para desarrollar tal déficit. Por "déficit del hueso" se da a entender una desproporción en la relación de la formación del hueso a la resorción del hueso, tal que, si no se modifica, el sujeto exhibirá menos hueso del que se puede desear, o los huesos del sujeto serán menos Íntegros y consistentes de lo que se desea. El déficit del hueso también puede resultar de una fractura, de una intervención quirúrgica o de una enfermedad dental o periodontal. Por "defecto del cartílago" se da a entender un cartílago dañado, menos cartílago que el deseado, o el cartílago que es menos integro y consistente que lo deseado. Los usos representativos de los compuestos de la presente invención incluyen, la reparación de los defectos y deficiencias del hueso, tales como aquellos que ocurren en fracturas cerradas, abiertas y no unidas; el uso profiláctico en la reducción de fracturas cerradas y abiertas; la promoción de la curación del hueso en la cirugía plástica, la estimulación del hueso en crecimiento en las uniones prostéticas e implantes dentales sin pegar, la elevación de la masa del hueso pico en mujeres pre-menopáusicas; el tratamiento de deficiencias de desarrollo; el tratamiento de enfermedad y defectos peridontales y otros procesos para reparar los dientes; el incremento en la formación del hueso durante la osteogénesis de distracción; y el tratamiento de otros desórdenes esqueléticos, tales como osteoporosis relacionada con la edad, osteoporosis pos-menopáusica, osteoporosis inducida por glucocorticoides u osteoporosis no usual y artritis. Los compuestos de la presente invención también puede ser útiles en la reparación de la resección inducida por trauma o quirúrgica, congénica del hueso (por ejemplo, para el tratamiento del cáncer) y en la cirugía cosmética. Además, los compuestos de la presente invención se pueden utilizar para limitar o tratar los defectos o desórdenes del cartílago y pueden ser útiles en la curación de heridas o reparación de tejidos. El déficit o defecto del hueso o cartílago se puede tratar en sujetos vertebrados mediante la administración de los compuestos de la invención que exhiben ciertas características estructurales y funcionales. Las composiciones de la invención se pueden administrar sistémicamente o localmente. Para el uso sistémico, los compuestos en la presente se formulan para el suministro parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo intramuscular, intraperitoneal, intranasal o transdérmico) o enteral (por ejemplo oral o rectal) de acuerdo con los métodos convencionales. La administración intravenosa puede ser por una serie de inyecciones o por la infusión continua durante un período extendido. La administración por inyección u otras rutas de administración discretamente espaciada se puede realizar en intervalos que varían desde semanalmente o una vez a tres veces al día. De manera alternativa, los compuestos descritos en la presente se pueden administrar de una manera cíclica (administración del compuesto descrito; seguido por la no administración; seguido por la no administración; seguido por la administración del compuesto descrito, y similares). El tratamiento continuará-hasta que se logre el resultado deseado. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán un compuesto de la presente invención en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa al 5% en agua, solución salina amortiguada con borato que contiene metales en pequeñísimas partes o similares. Las formulaciones pueden además incluir uno o más excipientes, conservadores, solubilizadores , agentes amortiguadores, albúmina para impedir la pérdida de proteínas en las superficies del frasquito, lubricantes, rellenadores, estabilizadores, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, que se incorpora en la presente por referencia. Las composiciones farmacéuticas para el uso dentro de la presente invención pueden estar en la forma de solución estéril, soluciones o suspensiones liquidas no pirogénicas, cápsulas revestidas, supositorios, polvos liofilizados, parches transdérmicos u otras formas conocidas en la técnica. La administración local puede ser por inyección en el sitio de la lesión o defecto o por inserción o unión de un portador sólido en el sitio, o por la aplicación tópica, directa de un líquido viscoso, o similares. Para la administración local, el vehículo de suministro en forma preferente proporciona una matriz para el desarrollo del hueso o cartílago, y más preferentemente es un vehículo que se puede absorber por el sujeto sin efectos adversos. El suministro de compuestos en la presente a los sitios de herida se puede aumentar por el uso de composiciones de liberación controlada, tal como aquellos descritos en la solicitud de patente norteamericana, pendiente No. 07/871,246 (que corresponde a la publicación de WIPO WO 93/20859, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) . Las películas de este tipo son particularmente útiles como revestimientos para dispositivos prostéticos e implantes quirúrgicos. Las películas, por ejemplo, se pueden envolver alrededor de la superficie exterior de tornillos quirúrgicos, varillas, pasadores, placas y similares. Los dispositivos que se pueden implantar, de este tipo, se utilizan habitualmente en la cirugía ortopédica. Las películas también se pueden utilizar para revestir los materiales de relleno del hueso, tal como bloques de hidroxiapatita, tapones de la matriz del hueso desmineralizado, matrices de colágeno y similares. En general, una película o dispositivo como se describe en la presente, se aplica al hueso en el sitio de la fractura. La aplicación es en general mediante el implante en el hueso o la unión a la superficie utilizando procedimientos quirúrgicos, normales . Además de los copolímeros y portadores observados anteriormente, las películas biodegradables y matrices pueden incluir otros componentes activos o inertes. Aquellos agentes que promueven el desarrollo del tejido o infiltración son de particular interés, tal como los factores de crecimiento. Los factores de crecimiento ejemplares para este propósito incluyen el factor de desarrollo epidérmico (EGF) , factor de desarrollo de fibroblastos (FGF), factor de desarrollo derivado de plaquetas (PDGF), factores de desarrollo de transformación (TGFs), hormona paratiroide (PTH), factor inhibitorio de la leucemia (LIF) y factores de desarrollo similares a la insulina (IGFs) y similares. También se-prefieren los agentes que promueven el desarrollo del hueso, tal como las proteínas morfogenéticas del hueso (solicitud de patente norteamericana No. 4,761,471; publicación del PCT WO 90/11366), osteogenina (Sampath y colaboradores Proc . Na t i . Aca d . Sci . USA (1987) 84:7109-13) y NaF (Tencer y colaboradores, J. Bioipe . Ma t . Res . (1989) 23: 571-89). Las películas o matrices biodegradables incluyen sulfato de calcio, fosfato de tricalcio, hidroxiapatita, ácido poliláctico, polianhídridos , colágeno del hueso o dérmico, proteínas puras, componentes de matriz extracelular y similares y combinaciones de los mismos. Tales materiales biodegradables se pueden utilizar en combinación con materiales no biodegradables, para proporcionar propiedades de interconexión de tejido o matriz, mecánica, cosmética, deseada. Los métodos alternativos para el suministro de los compuestos de la presente invención incluyen el uso de minibombas osmóticas ALZET (Alza Corp., Palo Alto, CA) ; materiales de matriz de liberación sostenida tal como aquellos descritos en Wang y colaboradores (Publicación del PCT WO 90/11366); lechos de dextrano, eléctricamente cargados, como se describe en Bao y' colaboradores (Publicación del PCT WO 92/03125; sistemas del suministro a base de colágeno, por ejemplo, como se describe en Ksander y colaboradores Ann . Surg . (1990) 211(3), 288-94, sistemas de gel de metilcelulosa, como se describe en Beck y colaboradores J. Bone Min . Res . (1991) 6(11) 1257-65 y sistemas en base a alginato, como se describe en Edelman y colaboradores Bioma teria l s (1991) 12 619-26 y similares. Otros métodos bien conocidos en la técnica para el suministro local, sostenido, en el hueso, incluyen prótesis de metal, revestidas, porosas que se puede impregnar y varillas de plástico, sólidas con composiciones terapéuticas incorporadas dentro de éstas.

Los compuestos de la presente invención también se pueden utilizar en conjunción con agentes que inhiben la resorción del hueso. Los agentes anti-reabsorbedores , tal como estrógeno, bisfosfonatos y calcitonina, se prefieren para este propósito. Más específicamente, los compuestos descritos en la presente se pueden administrar durante un período de tiempo (por ejemplo, meses a años) suficiente para obtener la corrección de una condición de déficit del hueso. Una vez que la condición de déficit del hueso se ha corregido, se-puede administrar al vertebrado un compuesto antiabsorbedor para mantener la condición corregida del hueso. De manera alternativa, los compuestos descritos en la presente se pueden administrar con un compuesto anti-reabsorbedor de una manera cíclica (administración del compuesto descrito, seguido por el anti-reabsorbedor, seguido por el compuesto descrito, y similares). En formulaciones adicionales, se pueden utilizar las preparaciones convencionales tales como aquellas descritas posteriormente. Las suspensiones acuosas pueden contener el ingrediente activo en mezcla con excipientes farmacológicamente aceptables, que comprenden agentes de suspensión, tal como metil celulosa; y agentes humectantes, tales como lecitina, lisolecitina o alcoholes grasos de cadena larga. Las suspensiones acuosas también pueden contener conservadores, agentes colorantes, agentes saborizantes y agentes dulsificantes de acuerdo con los patrones de industrias. Las preparaciones para la aplicación tópica y local comprenden roclos en aerosol, lociones, geles y ungüentos en vehículos farmacéuticamente apropiados que pueden comprender alcoholes alifáticos inferiores, poliglicoles tales como glicerol, polietilenglicol, esteres de ácidos grasos, aceites y grasas y siliconas. Las preparaciones además pueden comprender antioxidantes, tales como ácido ascórbico o tocoferol, y conservadores, tales como esteres de ácido p-hidroxibenzoico . Las preparaciones parenterales comprenden productos particularmente estériles o esterilizados. Las composiciones inyectables se pueden proporcionar conteniendo el compuesto activo y cualquiera de los portadores inyectables, bien conocidos. Estas pueden contener sales para la regulación de la presión osmótica.

Si se desea, los agentes osteogénicos se pueden incorporar en liposomas mediante cualquiera de los métodos reportados de preparación de liposomas para el uso en el tratamiento de diversas condiciones patogénicas. Las presentes composiciones pueden utilizar los compuestos observados anteriormente, incorporados en liposomas a fin de dirigir estos compuestos a los macrófagos, monocitos, otras células y tejidos y órganos que toman la composición liposomal. Los compuestos de la invención incorporados al liposoma se pueden-utilizar mediante la administración parenteral, para permitir el uso eficaz de dosis inferiores de los compuestos. Los ligandos también se pueden incorporar para enfocar adicionalmente la especificidad de los liposomas. Los métodos convencionales, adecuados de preparación de liposomas incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos por Bangham, A.D. y colaboradores J Mol Bi ol (1965) 23:238-252, Olson, F. y col aboradores Bi ochim Bi ophys Acta (1979) 557:9-23, Szoka, F. y colaboradores Proc Na ti Acad Sci USA (1978) 75:4194-4198, Mayhew, E. y colaboradores (1984) 775:169175, Kim, S. y col aboradores Bi ochim Bi ophys Acta (1983) 728:339:348, y Mayer, y colaboradores Bi ochim Bi ophys Ac ta (1986) 858:161-168. Los liposomas se pueden hacer a partir de los presentes compuestos en combinación con cualquiera de los materiales de liposomas fosfolípidos, sintéticos o naturales, convencionales que incluyen fosfolípidos de fuentes naturales tal como el huevo, fuentes de plantas o animales tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, esfingomielina, fosfatidilserina o-fosfatidilinositol . Los fosfolípidos sintéticos que también se pueden utilizar, incluyen, pero no se limitan a: dimiristoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina y distearoilfosfatidicolina y las fosfatidiletanolaminas sintéticas y fosfatidilgliceroles, correspondientes. El colesterol y otros esteróles, hemisuccinato de colesterol, glicolípidos , cerebrósidos, ácidos grasos, gangliósidos , esfingolipidos , 1,2-bis (oleoiloxi ) -3- (trimetil amonio) propano (DOTAP), cloruro de N- [ 1- ( 2 , 3-dioleoil) propil-N, N, N-trimetilamino (DOTMA), y otros lípidos catiónicos se pueden incorporar en los liposomas, como se conoce por aquellos expertos en la técnica. Las cantidades relativas de fosfolípido y aditivos utilizados en los liposomas pueden variar si se desea. Las gamas preferidas son de aproximadamente 60 a 90 por ciento en mol del fosfolípido, colesterol, hemisuccinato de colesterol, ácidos grasos o lípidos catiónicos se pueden utilizar en cantidades que varían de 0 a 50 por ciento en mol. Las cantidades de los presentes compuestos incorporados en la capa de lípido de los liposomas pueden variar con la concentración de los lípidos que varían de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50 por ciento en mol. Utilizando métodos convencionales, aproximadamente 20 a 30% del compuesto presente en solución se puede atrapar en los liposomas, de esta manera, aproximadamente 70 a 80% del compuesto activo se desperdicia. En contraste, donde se incorpora el compuesto en los liposomas, virtualmente todo el compuesto se incorpora en el liposoma, y esencialmente nada del compuesto activo se desperdicia. Los liposomas con las formulaciones anteriores pueden ser aun más específicos para sus objetivos propuestos con la incorporación de anticuerpos monoclonales u otros ligandos específicos para un objetivo. Por ejemplo, se pueden incorporar anticuerpos monoclonales para el receptor de BMP en el liposoma mediante la unión a la fosfatidiletanolamina (PE) incorporada en el liposoma mediante el método de Leserman, L. y col abora dores Na t ure (1980) 288:602-604. También se contemplan usos veterinarios de los compuestos descritos. Tales usos incluirían la limitación o tratamiento de déficit o defectos del hueso o cartílago en animales domésticos, ganado y caballos de pura sangre. Los compuestos descritos en la presente también pueden modificar un ambiente de un tejido u órgano objetivo, para atraer las células que forman el hueso a un ambiente en necesidad de tales células. Los compuestos de la presente invención también se pueden utilizar para estimular el crecimiento de las células que forman el hueso o sus precursores, o para inducir la diferenciación de los precursores de células que forman el hueso, ya sea in vi tro o ex vi vo . Como se utiliza en la presente, el término "célula precursora" se refiere a una célula que se somete a una vía de diferenciación, pero que en general no expresa marcadores o una función como una célula completamente diferenciada, madura. Como se utiliza en la presente, el término "células mesenquimatosas" o "células madre mesenquimatosas" se refiere a células progenitoras pluripotentes que son capaces de dividirse muchas veces, y cuya progenie dará origen a los tejidos esqueléticos, inclusive cartílago, hueso, tendón, ligamento, estroma de médula y tejido conectivo (ver A. Caplan J. Orthop . Res . (1991) 9:641-50). Como se utiliza en la presente, el término "células osteogénicas"-incluye osteoblastos y células precursoras de osteoblastos. Más particularmente, los compuestos descritos son útiles para estimular una población de células que contiene células mesenquimales de médula, con lo cual se incrementa el número de células osteogénicas en esa población de células. En un método preferido, las células hematopoyéticas se remueven de la población de células, ya sea antes o después de la estimulación con los compuestos descritos. A través de la práctica de tales métodos, se pueden expander las células osteogénicas. Las células osteogénicas expandidas se pueden infusionar (o volver a infusionar) en un sujeto vertebrado en necesidad de las mismas. Por ejemplo, unas células madre mesenquimatosas, propias del sujeto, se pueden exponer a los compuestos de la presente invención ex vi vo y las células osteogénicas resultantes podria ser infusionadas o dirigidas a un sitio deseado dentro del sujeto, donde además puede ocurrir la proliferación y/o diferenciación de las células osteogénicas sin el inmunorechazo . De manera alternativa, la población de células expuestas a los compuestos descritos pueden ser células osteoblásticas u osteogénicas, fetal de humano, • inmortalizadas. Si tales células se infusionan o implantan en un sujeto vertebrado, puede ser ventajoso "inmunoprotej er" estas células no similares, o inmunosuprimir (en forma preferente, localmente) el receptor para mejorar el transplante y la reparación del hueso o cartílago. Dentro de la presente invención, una "cantidad efectiva" de una composición es aquella cantidad que produce un efecto estadísticamente significante. Por ejemplo, una "cantidad efectiva" para usos terapéuticos es la cantidad de la composición que comprende un compuesto activo en la presente requerido para proporcionar un incremento clínicamente significante en las proporciones de curación en la reparación de fracturas; inversión o anulación de la pérdida del hueso en la osteoporosis, inversión o anulación de los defectos o desórdenes del cartílago; prevención o retraso del comienzo de la osteoporosis, estimulación y/o aumento de la formación del hueso en la fractura sin uniones y osteogénesis de distracción; incremento y/o aceleración del desarrollo del hueso en los dispositivos prostéticos; y la reparación de defectos dentales. Tales cantidades efectivas serán determinadas utilizando técnicas de optimización derutina y son dependientes de la condición particular a ser tratada, la condición del paciente, la ruta de administración, la formulación, y el ajuste del médico o facultativo y otros factores evidentes para aquellos expertos en la técnica. La dosificación requerida para los compuestos de la invención (por ejemplo, en la osteoporosis donde se desea un incremento en la formación del hueso) se manifiesta como una diferencia estadísticamente significante en la masa del hueso entre los grupos de tratamiento y de control. Esta diferencia en la masa del hueso se puede observar, por ejemplo, como un incremento del 5-20% o más en la masa del hueso en el grupo de tratamiento. Otras mediciones de incrementos clínicamente significantes en la curación pueden incluir, por ejemplo, las pruebas para la resistencia al rompimiento y tensión, resistencia al rompimiento y torsión, doblamiento de 4 puntos, conectividad incrementada en las biopsias del hueso y otras pruebas biomecánicas bien conocidas para aquellos expertos en la técnica. La guía general para los regímenes de tratamiento se obtuvo a partir de los experimentos llevados a cabo en modelos de animal de la enfermedad de interés. La dosificación de los compuestos de la invención variará de acuerdo con el grado y gravedad de la necesidad para el tratamiento, la actividad del compuesto administrado, la salud general del sujeto, y otras consideración bien conocidas para el artesano experto. En general, estos se pueden administrar a un humano típico en una base diaria en una dosis oral de aproximadamente 0.1 mg/kg-1000 mg/kg y en forma más preferente de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg. La dosis parenteral apropiadamente será 20-100% de la dosis oral.

Ensayos selectivos La actividad osteogénica de los compuestos utilizados en los métodos de la invención se puede verificar utilizando técnicas selectivas in vi tro , tal como la valoración de transcripción de un gen reportero acoplado a un promotor asociado con proteínas morfogénicas del hueso, como se describe anteriormente, o en ensayos alternativos tales como el siguiente: Técnica para el Ensayo de la Calvaría de-Ratón Neonatal ( In vi tro ) Este ensayo es similar a aquel descrito por Gowen M. & Mundy G. J Immunol (1986) 136:2478-82. En resumen, cuatro días después del nacimiento, los huesos frontales y parietales de crías de ratón blanco ICR Swiss se removieron mediante la microdisección y se dividieron a lo largo de la sutura sagital. Los huesos se incubaron en el medio BGJb (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) más ß-metilciclodextrina al 0.02% (o concentración inferior) , en donde el medio también contiene sustancias de prueba o control, a 37°C en una atmósfera humidificada de C02 al 5% y aire al 95% durante 96 horas.

Después de esto, los huesos se remueven del los medios de incubación y se fijan en formalina amortiguada al 10% durante 28-48 horas, se descalcifican en EDTA al 14% durante 1 semana, se procesan a través de alcoholes graduados; y se incrustan en cera de parafina. Se preparan secciones de tres µm de la calvaría. Las secciones representativas se seleccionan para la valoración histomorfométrica de la formación del hueso y resorción del hueso. Los cambios del hueso se miden en secciones de corte de 200 µm. Los osteoblastos y-osteoclastos se identifican por su morfología distintiva . Se pueden utilizar otros ensayos auxiliares como controles para determinar los efectos mediados por el promotor no de BMP de los compuestos de prueba. Por ejemplo, la actividad mitogénica se puede medir utilizando ensayos selectivos que caracteriza un elemento de respuesta al suero (SRE) como un promotor y un gen reportero de luciferasa. Más específicamente, estos ensayos selectivos pueden detectar la señalización a través de las vías mediadas con el SRE, tal como la vía de la proteína cinasa C. Por ejemplo, son útiles para este propósito una selección de SRE-luciferasa del activador de osteoblasto y una selección de SRE-luciferasa mimética de insulina. De manera similar, también se puede ensayar la estimulación del compuesto de prueba de las vías mediadas por el elemento de respuesta a la cAMP (CRE) . Por ejemplo, las células transfectadas con los receptores para PTH y calcitonina (dos agentes activos del hueso) se pueden utilizar en las selecciones de CRE-luciferasa para detectar niveles de cAMP elevados. De esta manera, la especificidad del promotor de la BMP de un compuesto de prueba se puede examinar a-través del uso de estos tipos de ensayos auxiliares .

Ensayo In vi vo de Efectos de los Compuestos sobre el Desarrollo del Hueso Calvárico de Murino Se emplean ratones blancos ICR Swiss, machos, de edad de 4-6 semanas y que pesan 13-16 gm, utilizando 4-5 ratones por grupo. El ensayo de desarrollo del hueso calvárico se realizó como se describe en la solicitud del PCT WO 95/24211, incorporada por referencia. En resumen, el compuesto de prueba o el vehículo de control apropiado se inyectan en el tejido subcutáneo sobre la calvaría derecha de ratones normales. Típicamente, el vehículo de control es el vehículo en el cual el compuesto se solubiliza, y es PBS que contiene DMSO al 5% o es PBS que contiene Tween (2 µl/10 ml) . Los animales se sacrifican en el día 14 y el desarrollo del hueso se midió por histomorfometría . Las muestras del hueso para la cuantificación se limpian de tejidos adyacentes y se fijan en formalina amortiguada al 10% durante 24-48 horas, se descalcifican en EDTA al 14% durante 1-3 semanas, se procesan a través dealcoholes graduados, y se incrustan en cera de parafina. Se preparan secciones de tres a cinco µm de la calvaría, y se seleccionan las secciones representativas para la valoración histomorfométrica de los efectos sobre la formación del hueso y resorción del hueso. Las secciones se midieron al utilizar una unión de cámara lúcida para trazar directamente la imagen microscópica en una placa de digitación. Los cambios del hueso se miden en secciones de corte de 200 µm, sobre 4 campos de 1 x 1 mm, adyacentes en tanto los lados inyectados y no inyectados de la calvaría. El nuevo hueso se identifica por su estructura entrelazada, característica y los osteoclastos y osteoblastos se identifican por su morfología distintiva. El equipo lógico de histomorfometría (OsteoMeasure, Osteometriz, Inc., Atlanta) se utiliza para procesar la entrada del digitalizador para determinar las cuentas de células y las áreas o perímetros medidos.

Ensayos Adicionales In vi vo Los compuestos de guía o principales se pueden analizar adicionalmente en animales intactos utilizando un ensayo de dosificación in vi vo . La-dosificación prototípica se puede realizar mediante la administración subcutánea, intraperitoneal u oral, y se puede realizar por inyección, liberación sostenida u otras técnicas de suministro. El período de tiempo para la administración del compuesto de prueba puede variar (por ejemplo, 28 días así como también 35 días pueden ser apropiados). Un ensayo de dosificación subcutánea, in vi vo, ejemplar se puede conducir como sigue: En un estudio típico, 70 ratas Sprague-Dawley, hembras, de tres meses de edad se igualaron en peso y se dividieron en siete grupos, con diez animales cada grupo. Esto incluye un grupo de control de línea base de animales sacrificados en el inicio del estudio; se le administró únicamente el vehículo a un grupo de control, un grupo de control se trató con PBS, y un grupo de control positivo se le administró un compuesto (proteína o no proteína) conocido para promover el desarrollo del hueso. Tres niveles de dosificación del compuesto a ser analizado se administran a los tres grupos restantes. En resumen, el compuesto de prueba, el compuesto de control positivo, PBS, o el vehículo solo se administra subcutáneamente una vez por día-durante 35 días. Todos los animales se inyectan con calceína nueve días y dos días antes del sacrificio (dos inyecciones de calceína se administraron cada una el día designado) . Los pesos del cuerpo se determinan semanalmente. Al final del ciclo de 35 días, los animales se pesan y se sangraron por punción orbital o cardíaca. Se determinan el calcio, fosfato, osteocalcina y CDCs del suero. Se remueven ambos huesos de la pierna (fémur y tibia) y las vértebras lumbares, se limpian del tejido suave adherido y se almacenan en etanol al 70% para la evaluación, como se realizó por la tomografía computada, cuantitativa, periférica (pQCT; Ferretti, J. Bone (1995) 17 : 353S-64S) , absotiometría de rayos X, de doble energía (DEXA: Laval-Jeantet A. y colaboradores , Cal ci f Ti ssue In tl (1995) 56:14-18; J Casez y colaboradores Bone and Minera l (1994) 26:61-68) y/o histomorfometría . De esta manera se puede evaluar el efecto de los compuestos de prueba sobre la remodelación del hueso . Los compuestos de guía también se analizaron en animales con ovariectomía aguda (modelo de prevención) utilizando un ensayo de dosificación in vivo . Tales ensayos también pueden-incluir un grupo tratado con estrógeno como un control. Un ensayo de dosificación subcutánea, ejemplar se realiza como sigue: En un estudio típico, 80 ratas Sprague- Dawley, hembras, de tres meses de edad se igualaron en peso y se dividieron en ocho grupos, con diez animales en cada grupo. Esto incluye un grupo de control de línea de base de animales sacrificados en el inicio del estudio; tres grupos de control (con ovariectomía falsa (OVX falsa) + vehículo únicamente; ovariectomizados (OVX) + vehículo únicamente; OVX tratados con PBS), y un grupo OVX de control al que se administra un compuesto conocido para promover el desarrollo del hueso.

Tres niveles de dosificación del compuesto a ser analizado se administraron a los tres grupos restantes de animales OVX. Puesto que la ovariectomia (OVX) induce la hiperfagia, todos los animales OVX se alimentaron por pares con animales OVX falsa por todos los 35 días del estudio. En resumen, el compuesto de prueba, el compuesto de control positivo, el PBS, o vehículo solo se administraron subcutáneamente una vez por día durante 35 días. De manera alternativa, el compuesto de prueba se puede formular en-pelotillas implantables que se implantan durante 35 dias, o se pueden administrar oralmente, tal como por cebadura gástrica. Todos los animales, inclusive los grupos de OVX falsa/vehículo y OVX/vehículo, se inyectan intraperitonealmente con calceína nueve días y dos días antes del sacrificio (se administran dos inyecciones de calceína cada día designado, para asegurar el marcado apropiado del hueso recientemente formado) . Se determinan semanalmente los pesos del cuerpo. Al final del ciclo de 35 días, la sangre y tejidos de los animales se procesan como se describe anteriormente .

Los compuestos de guía también se analizaron en animales OVX crónicos (modelo de tratamiento). Un protocolo ejemplar para el tratamiento de la pérdida del hueso establecida en animales ovariectomizados que se puede utilizar para valorar la eficacia de agentes anabólicos, se puede realizar como sigue. En resumen, 80 a 100 ratas Sprague-Dawley, hembras, de seis meses de edad se sujetan a una cirugía falsa (OVX falsa) u ovariectomía (OVX) en el tiempo 0, y 10 ratas se sacrificaron para servir como controles de línea debase. Los pesos del cuerpo se registraron semanalmente durante el experimento. Después de aproximadamente 6 semanas de la depleción del hueso (42 días), 10 OVX falsa y 10 ratas OVX se seleccionaron aleatoriamente para sacrificarse como controles del período de depleción. De los animales restantes, 19 ratas OVX falsa y 10 ratas OVX se utilizaron como controles tratados con placebo. Los animales OVX restantes se trataron con 3 a 5 dosis de fármaco de prueba durante un período de 5 semanas (35 días) . Como un control positivo, un grupo de ratas OVX se puede tratar con un agente tal como PTH, un agente anabólico conocido en este modelo (Kimmel y colabora dores Endocrinol ogy (1993) 132:1577-84). Para determinar los efectos en la formación del hueso, se puede seguir el siguiente procedimiento. Los fémures, las tibias y las vértebras lumbares 1 a 4 se cortan o extirpan y se colectan. Las tibias izquierda y derecha, próximas se utilizan para las mediciones de pQCT, densidad de mineral del hueso canceloso (BMD) (determinación gravimétrica), e histología, mientras que el cuerpo o tallo medio de cada tibia se sujeta a la BMD cortical o histología. Los fémures se preparan para la exploración de pQCT del cuerpo o tallo medio-antes de la prueba biomecánica. Con respecto a las vértebras lumbares (LV) , las LV2 se procesan por BMD (también se puede realizar la pQCT) ; Las LV3 =e preparan para la histología del hueso sin descalcificar; y las LV4 se procesan para la prueba mecánica .

Naturaleza de los Compuestos Útiles en la Invención Todos los compuestos de la invención contienen dos sistemas aromáticos, Ar1 y Ar2, separados por un enlace a una distancia de 1.5-15 Á, y pueden contener al menos un átomo de nitrógeno. Ambos de los sistemas representados por Ar1 y Ar2 pueden contener sustituyentes que no interfieren. Los sustituyentes que no interfieren en el sistema aromático representado por Ar1 y los sustituyentes que no interfieren en el sistema aromático representado por Ar2 se representan en las fórmulas en la presente por R y Rb, respectivamente; sin embargo, se reconoce que la designación de un Ar como Ar1 y el otro como Ar2 es arbitraria. Por facilidad de referencia, cada uno se designa de manera separada, sin embargo, será evidente que los enlaces descritos posteriormente, a menos que sean palindrómicos, de esta manera podrían existir en los compuestos en un orden "inverso" de los átomos. En general, los sustituyentes que no interfieren pueden ser de una amplia variedad. Entre los sustituyentes que no interfieren con el efecto benéfico de los compuestos de la invención sobre el hueso en sujetos tratados se incluyen el alquilo (1 a 6 átomos de carbono, en forma preferente alquilo inferior de 1 a 4 átomos de carbono) , inclusive formas de cadena recta o ramificada de los mismos, alquenilo (1 a 6 átomos de carbono, en forma preferente de 1 a 4 átomos de carbono) , alquinilo (1 a 6 átomos de carbono, en forma preferente 1 a 4 átomos de carbono) , todos los cuales pueden ser de cadena recta o ramificada y pueden contener sustituyentes adicionales; halógenos, inclusive F, Cl, Br e I; siloxi, OR, SR, NR2, OOCR, COOR, NCOR, NCOOR, y benzoilo, CF3, OCF3, SCF3, N(CF3)2, CN, SO, S02R y S03R en donde R es alquilo (1 a 6 átomos de carbono) o es H. Donde dos sustituyentes Ra o dos sustituyentes Rb están en posiciones adyacentes en el sistema aromático, éstos pueden formar un anillo. Además, los anillos se pueden incluir en los sustituyentes que contienen suficientes átomos de carbono y heteroátomos para proporcionar esta posibilidad . Los sustituyentes que no interfieren, preferidos incluyen grupos hidrocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono, inclusive hidrocarbilo lineal o ramificado, saturado e insaturado así como también grupos hidrocarbilo que contienen sistemas de anillo; grupos halo, alcoxi, hidroxi, amino, monoalquil- y dialquilamino donde los grupos alquilo son de 1 a 6 átomos de carbono, CN, CF3 y COOR. Aunque el número de sustituyentes Ra y Rb típicamente pueden ser 0-4 o 0-5 dependiendo de las posiciones disponibles en el sistema aromático, las modalidades preferidas incluyen aquellos en donde el número de Ra es 0, 1 o 2 y de Rb es 0, 1 o 2. El grupo de enlace, L, puede ser un enlace covalente o cualquier grupo que tiene una valencia de al menos dos y que cubre una distancia lineal de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 15 Angstroms, inclusive aquellos que contienen porciones cíclicas, que cumplen con este requerimiento espacial. Los enlaces útiles se dividen, por definición en la presente, en tres categorías-generales: (1) enlaces de no conjugación, flexibles, (2) enlaces de conjugación, flexibles y (3) enlaces restringidos. La selección preferida del enlace dependerá de las selecciones para Ar1 y Ar2. No todos los enlaces definidos posteriormente son adecuados para todas las combinaciones de Ar1 y Ar2. Como se define en la presente, los enlaces de no conj uga ci ón , fl exibl es son aquellos que unen únicamente una posición de Ar1 a una posición de Ar2, y proporciona únicamente un enlace covalente individual o una cadena individual entre Ar1 y Ar2. La cadena puede contener ramificaciones, pero no puede contener uniones p (excepto en las ramificaciones) o porciones cíclicas en la cadena. Los átomos de enlace en la cadena misma giran libremente alrededor de los enlaces covalentes individuales, y de esta manera el enlace tiene más de dos grados de libertad. Los enlaces de no conjugación, flexibles, particularmente útiles, además de un enlace covalente, son aquellos de las fórmulas: -NR-, -CR2-, -S-, o -0-, en donde R es H o alquilo (1 a 6 átomos de carbono), en forma preferente H o alquilo inferior (1 a 4 átomos de carbono) y en forma más preferente H. También-preferidos son aquellos de las fórmulas: -NRCO-, -CONR-, -CR2S-, SCR2-, -OCR2-, CR20-, -NRNR-, -CR2CR2-, -NRS02-, -S02NR-, -CR2CO-, -COCR2- y -NR-NR-C0-CR2- y su complemento -CR2-C0-NR-NR-, inclusive los isoésteres de los mismos. También preferidos son aquellos de las fórmulas: -NR (CR2) 2NR-, -0(CR2)20-, y -S(CR2)2S-, inclusive los isoésteres de los mismos. La selección óptima del enlace dentro de este grupo es dependiente en la naturaleza de Ar1 y Ar2. Los enlaces de conj uga ci ón , fl exibl es son aquellos que unen únicamente una posición de Ar1 a una posición de Ar2, pero se incorpora al menos un enlace doble o triple y/o uno o más sistemas cíclicos y de esta manera tienen únicamente dos grados de libertad. Un enlace de conjugación, flexible puede formar un sistema de enlace de unión p, completamente conjugada entre Ar1 y Ar2, proporcionando de esta manera co-planaridad de Ar1 y Ar2. Ejemplos de enlaces de conjugación, flexibles, útiles incluyen: -RC=CR-; -N=N-, -C=C-; -RC=N-, -N=CR-, -NR-N=CR-, -NR-NR-CO-CR=CR- , y similares, donde R es H o alquilo (1 a 6 átomos de carbono) ; en forma preferente H o alquilo inferior (1-4 átomos de carbono); y en forma más preferente H. Los enlaces restringidos son aquellos que tienen más de un punto de unión a cualquiera o ambos de Ar1 y Ar2 y, de esta manera, en general permiten únicamente un grado de libertad. Los enlaces restringidos forman más frecuentemente porciones cíclicas de 5 o 6 miembros, fusionadas con Ar1 y/o Ar2 donde cualquiera de Ar1 o Ar2 tiene al menos un sustituyente apropiadamente colocado para formar un segundo enlace covalente con el enlace, por ejemplo, donde Ar2 es un grupo fenilo con un sustituyente orto-colocado, reactivo, o se deriva al enlace directamente en la posición orto. (Aunque las porciones aromáticas deben ser referidas apropiadamente como fenileno o naftileno en tales casos, en general el término "fenilo" o "naftilo" se utiliza en la presente para incluir las formas tanto monovalentes y bivalentes de estas porciones). Ejemplos de enlaces restringidos, particularmente útiles incluyen y similares, donde X es O, N, S o CR y Y es CR2 o C=0. Muchos de los compuestos útiles en la invención son comercialmente disponibles y se pueden sintetizar mediante métodos conocidos en la técnica. Aquellos compuestos útiles en la invención que son nuevos compuestos, se puede obtener de manera similar mediante métodos en general conocidos en la técnica.

En un conjunto de compuestos de las invenciones, Ar1 es un sistema aromático sustituido o sin sustituir que contiene un heterociclo de seis miembros y los compuestos útiles en la invención tienen la fórmula: en donde Ra es un sustituyente que no- interfiere; m es un número entero de 0-4; cada línea punteada representa un enlace p opcional; cada Z es independientemente N, NR, O, S, CR o CR2, donde cada R es independientemente H o alquilo (1 a 6 átomos de carbono) . X es O, S, SO o S02; L es un enlace flexible y Ar2 es un anillo aromático de 6 miembros, sustituido o sin sustituir. Un conjunto particularmente preferido de modalidades es de la fórmula; en la cual: R1 se toma del grupo N=NAr, NR6COAr, CONR6Ar, CH2OAr, CH2NR6Ar, donde Ar es un anillo aromático (sin sustituir) sustituido de seis miembros. Los sustituyentes permisibles en este-anillo aromático incluyen: halógeno, alquilo inferior de cadena recta o ramificada, alquenilo o alquinilo opcionalmente sustituidos por un anillo de alquilo cíclico, o de alquenilo cíclico, aromático, de seis miembros, hidroxilo, siloxi, aciloxi, alcoxilo inferior de cadena recta o ramificada, benzoilo, carboalcoxi, carbamoilo opcionalmente sustituido en nitrógeno por alquilo de cadena inferior o fenilo, o carboxi, en el cual R6 se toma del grupo: hidrógeno o alquilo inferior de cadena recta o ramificada; R2 y R5 se toman individualmente del grupo: 5 H, hidroxi, siloxi, aciloxi, halo, ciano, alquilo inferior de cadena recta o ramificada o alcoxilo inferior de cadena recta o ramificada; 10 R3 y R4 se toman individualmente del grupo: H, halógeno, alquilo inferior de cadena recta o ramificada, alquenilo o alquinilo opcionalmente sustituidos por un anillo de 15 alquilo cíclico o alquenilo cíclico, aromático de seis miembros, hidroxilo, siloxi, aciloxi, alcoxilo inferior de cadena recta o ramificada, benzoilo, carboalcoxi, carbamoilo opcionalmente 20 sustituido en nitrógeno por alquilo de cadena inferior o fenilo y carboxi. X y Y son ya sea NR8 y N, respectivamente, caso en el cual X y Y se unen individualmente o CR9 y CR10, respectivamente, caso en el cual X y Y se unen doblemente, en donde R8 es ya sea H o alquilo inferior; R9 y R10 se toman individualmente del grupo: H, halo y alquilo inferior, Z se toma del grupo O, S, SO y S02; o sales de los mismos. Los compuestos de la estructura general I anterior se pueden preparar en una variedad de formas, por ejemplo: a) tratar tiohidrazidas de la estructura general II, o las tiohidrazonas correspondientes, en ácido acético caliente en aire, ;o b) hacer reaccionar los compuestos de la estructura general III con bromo, ; o c) calentar los compuestos de la estructura general IV en un solvente aprótico, ;o d) hacer reaccionar los compuestos de las estructuras generales V o VI con hidruro de sodio, ;o e) hacer reaccionar los compuestos de la estructura general VII con una base, f) hacer reaccionar los compuestos de pírilio de la estructura general VIII con un nucleófilo apropiado, VIII donde R2, R3, R4, R5, son como se definen anteriormente y R se toma del grupo: Ar, NHAr, NHNHAr, COAr, carboalcoxi, alcoxi, NR6COAr, CH2OAr, y CH2NR6Ar, en el cual Ar y R6 son como se describen anteriormente, seguido, opcionalmente, por la conversión de cualquiera de uno o más de los grupos R, R2, R3, R4, R5 en los nuevos grupos R, R2, R3, R4, R5 mediante la desprotección, acoplamiento, adición, sustitución o eliminación, o mediante la oxidación del azufre o sulfóxido o sulfona; y, si se desea, al convertir un compuesto de la estructura general I en su sal o ponerlo libre de su sal.

Ejemplo: La difenil tiohidrazona se calienta a reflujo en ácido acético en aire durante 30 a 90 minutos para dar benzotiadiazeno 1.

Los representativos específicos de los compuestos de la estructura general I incluyen: 3-fenilazo-lH-4,l,2-benzotiadizina 2-fenilazo-2H-benzopirano Otro grupo de compuestos adecuados para el uso en los métodos de la invención son los compuestos de la fórmula: en donde Ra es un sustituyente que no interfiere ; n es un número entero de 0 y 5; L es un enlace flexible que no contiene nitrógeno; y Ar2 es un fenilo sustituido o sin sustituir o un naftilo sustituido o sin sustituir . Las modalidades particularmente preferidas de este grupo de compuestos son aquellas de la fórmula : en la cual R35 se toman del grupo H, hidroxi, alcoxi, aciloxi y sililoxi; R36 es ya sea Ar o COAr, en la cual Ar es fenilo (sin sustituir) sustituido en el cual los sustituyentes permisibles se toman del grupo: H, hidroxi, alcoxi (sin sustituir) sustituido, aciloxi, siloxi, alquilo (sin sustituir) sustituido, alquenilo (sin sustituir) sustituido, o alquinilo (sin sustituir) sustituido, carboxi, carboalcoxi, carbamoilo opcionalmente sustituido en nitrógeno por alquilo de cadena inferior y arilo, R37 se toma del grupo H, hidroxi, alcoxi, halo, aciloxi y siloxilo; R38 se toma del grupo H, hidroxi, alcoxi, aciloxi, siloxi, alcoxi (sin sustituir) sustituido, aciloxi, siloxi, alquilo (sin sustituir) sustituido, alquenilo (sin sustituir) sustituido y alquinilo (sin sustituir) sustituido, o sales de los mismos. Los compuestos de la estructura general XXXV se pueden preparar mediante el tratamiento de una acetofenona de la estructura general XXXVI con un aldehido apropiado de la estructura general XXXVII bajo condiciones ya sea básicas o acidices, XXXVI XXXVII o mediante el tratamiento de un alquino apropiado de la estructura general XXXVIII con un haluro de ácido de la estructura general XXXIX en la presencia de un catalizador adecuado, tal como tricloruro de aluminio, XXXVIII XXXIX o mediante el tratamiento de haluros de ácido de la estructura general XXXIX con (E) -1,2-bis ( tri-n-butilestanil ) etileno, o con un vinilestanano de la estructura general XL en la presencia de un catalizador adecuado, por ejemplo, un catalizador de paladio.

XL o mediante el tratamiento de una acetofenona de la estructura general XLI con una base fuerte, »37 XLI donde R35, R36, R37 y R38 son como se definen anteriormente, seguido, opcionalmente, por la conversión de cualquiera de uno o más de los grupos R35 , R 3 6 R37 y R38 en los nuevos grupos R35 , R 36 R37 y R 38 mediante la desprotección, acoplamiento, adición, sustitución o eliminación y, si se desea, mediante la conversión de un compuesto de la estructura general XXXV en su sal o ponerlo libre de su sal. Los compuestos representativos, específicos de la estructura general XXXV incluyen: 2, 4-dimetoxi-2' -hidroxicalcone 1- (2-hidroxifenil) -3- (4- metoxifenil)propan-l, 3-diona 1, 4-dioxo-l, 4-difenilbut-2-eno Aun otro grupo de compuestos útiles en la invención son aquellos de la fórmula: en donde Ra es un sustituyente que no interfiere; n es un número entero de 0 y 5, L es un enlace restringido, y Ar es un fenilo sustituido o sin sustituir un naftilo sustituido sin sustituir . Los compuestos particularmente preferidos en este grupo son aquellos de las fórmulas IX, XIV y XX como sigue: en la cual: R11 y R12 se toman individualmente del grupo : H, hidroxi, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, acetiloxi y alquilo (sin sustituir) sustituido de 1 a 12 átomos de carbono; R ,13 , R ,14 y R ,17 se toman individualmente del grupo: H, hidroxi, alcoxi de cadena recta o ramificada de 1 a 6 átomos de carbono, y acetiloxi; R15 se toma del grupo: Hidroxi, alcoxi de 1 a 12 átomos de carbono (sin sustituir) sustituido, alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, alquenilo (sin sustituir) sustituido, y acetiloxi; R16 se toma del grupo: H, hidroxi, alcoxi inferior (sin sustituir) sustituido, acetoxi, alquilo (sin sustituir) sustituido, y alquenilo (sin sustituir) sustituido; donde R11, R12 pueden formar un carbociclo o heterociclo (sin sustituir) sustituido, de 5-7 miembros; donde R15, R16 pueden formar un anillo carbocíclico o heterociclico (sin sustituir) sustituido; X1 es ya sea carbonilo o CH2, y la línea punteada puede ser un enlace doble, en la cual los sustituyentes permisibles en los grupos, sustituidos mencionados anteriormente incluyen: alquilo inferior, alcoxilo inferior, hidroxi, siloxi, halo, carboxilo y arilo, con las siguientes condiciones; si X1 es carbonilo y si R15 es hidroxi y si únicamente uno de R11, R12 o R13 es hidroxi, entonces al menos uno de R14, R16 y R17 debe ser diferente de H; 5 o si R15 es alcoxi, y si R11, R12, R13 conjuntamente son H, entonces R17 no puede ser ni H ni hidroxi, o si R15 es alcoxi (sin sustituir) sustituido y si R11, R12 y R13 conjuntamente consisten de únicamente H, o H y uno o dos alcoxi, y R17 es H, entonces R14 debe ser diferente de H, Me, o hidroximetilo, o si R15 es hidroxi o alcoxi, y si R11, R12, R13 conjuntamente consisten de 15 únicamente H, o H y uno de dos alcoxi, o H y únicamente uno o dos alquilos, y R17 es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, entonces al menos uno de R14 y R16 debe ser diferente de H; 20 o si R15 es hidroxi, y si R11, R12, R13, R14 y R16 todos son H, R17 no debe ser ni H ni hidroxi. o si R15 es iso-propoxi, y si R11, R12 y R13 conjuntamente consisten de únicamente H, o H y uno o dos hidroxis, entonces al menos uno de R±4, Rxo, R1 ' debe ser diferente de H; o s i R15 es 1 , 5-di-alqui lo ( inferior ) alquilo de 5 a 10 átomos de carbono, entonces al menos uno de R11, R12, R13, R14, R16 y R17 debe ser diferente de H; o sales de los mismos. Los compuestos de la estructura general mostrada anteriormente se pueden hacer mediante un procedimiento en donde las cetonas de la estructura (X) mostradas posteriormente: se hacen reaccionar con un ortoformiato de alquilo en la presencia de una base, o se hacen reaccionar con un cloruro de etiloxalilo en la presencia de piridina, seguido por la hidrólisis y descarboxilación, o se hacen reaccionar con un formiato de alquilo en la presencia de un metal alcalino, o se hacen reaccionar con una formamida de N, N-dialquilo en la presencia de oxicloruro de fósforo, o se hacen reaccionar con un cianuro en la presencia de haluro de hidrógeno, o mediante la deshidratación de 2-hidroxi- 10 isoflavanoides de la estructura general (XI ) : o al sujetar los compuestos de la estructura general XII a la hidrogenación catalítica, o al tratar los compuestos de la estructura general XIII, disponibles de la alquilación del acetato de fenilo correspondiente con un haluro de bencilo apropiado, seguido por la reducción, con (PF6)2Rh(EtC5Me4) (C6H6) , en la cual los grupos R11, R12, R13, R14, R15, R16 y R17 son como se definen anteriormente, seguido, opcionalmente, por la conversión de cualquiera de uno o más de los grupos R11, R12, R13, R ,1L4q , R ,1i53, R ,1i6tt y R ,117' en los nuevos grupos R 11 , R ,112¿, R ,113J, R14, R15, R16 y R17 mediante la desprotección, deshidrogenación, adición, sustitución eliminación y, si se desea, mediante la conversión de un compuesto de la estructura general IX en su sal o ponerlos libres de su sal.

Ej emplo : Se deja reaccionar el 1,3,5-trihidroxibenceno con cloruro de iso-pentinilo, seguido por la hidrogenación catalítica para dar el producto 2. El compuesto 2 se deja reaccionar con el cloruro de ácido 3 para proporcionar la cetona 4. La cetona 4 se trata con cloruro de etiloxalilo en piridina a 0°C para dar un éster, que se hidroliza en acetona acuosa que contiene carbonato de sodio para dar el ácido 5. Cuando se calienta en tolueno a reflujo, el ácido 5 se somete a la descarboxilación para dar el compuesto 6, que en el tratamiento con 2 , 3-dicloro-5, 6-diciano-l , 4-benzoquinona da el isoflavanoide 7.

Los compuestos representativos, específicos de la estructura general IX incluyen: tectorigenina robustona éter metílico de robustona 7,2' , 4' -trihidroxiisoflavona 6,2' ,3'-trihidroxi-7,4' dimetoxiisoflavona 8, 4' -dimetoxi-7-hidroxisoflavona Los compuestos de XIV tienen la estructura : en la cual R18 y R19 se toman individualmente del grupo H, hidroxi, alquilo (sin sustituir) sustituido, alcoxi (sin sustituir) sustituido, COR21 carboxi, carboalcoxi, OR22, carbamoilo opcionalmente sustituido en el nitrógeno por alquilo de cadena inferior o fenilo, aciloxi, halo, ciano o azido. R20 se toma del grupo H, hidroxi, halo, alquilo de cadena inferior, aciloxi, y siloxi; en la cual R21 se toma del grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, aralquilo, fenilo (sin sustituir) sustituido, naftilo (sin sustituir) sustituido, tienilo, furanilo y piridilo y R22 está comprendido de una porción de carbohidrato de 1 a 6 átomos de carbono; o sales de los mismos Los compuestos de la estructura general XIV se pueden preparar al hacer reaccionar los iluros de la estructura general XV con cualquiera de los cloruros de ácido de la estructura general XVI o anhídridos de ácido de la estructura general XVII o al tratar los ácidos de la estructura general XVIII con ácido polifosfórico, anhídrido trifluoroacético, o un reactivo similar, XVIII o al tratar calconas de la estructura general XIX con cualquier base, o con la base seguida por el tratamiento con 2 , 3-dicloro-5, 6-diciano-1, 4-benzoquinona, XIX en la cual los grupos R18, R19, R20 son como antes, seguido, opcionalmente por la conversión de cualquiera de uno o más de los grupos R18, R19, R20 en nuevos grupos R18, R19, R20 mediante la desprotección, acomplamiento, adición, sustitución o eliminación y, si se desea, al convertir un compuesto de la estructura general XIV en su sal o ponerlos libres de su sal. Los compuestos representativos, específicos de la estructura general XIV son: 5,4' -dimetil-7-acetilflavona 7-benzoiloxiflavanona acetato de apiína Los compuestos de la estructura XX son de la fórmula: donde R23, R24, R25, R26 se toman individualmente del grupo: 10 H, hidroxi, alcoxi (sin sustituir) sustituido, siloxi, alquilo (sin sustituir) sustituido, alquenilo (sin sustituir ) sustituido, halo, carboxilo y aciloxi y donde R23 y R24 y del mismo modo R25 y R26, conjuntamente pueden ser iguales a un anille carbocíclico o heterocíclico (sin sustituir) sustituido, de 5-7 miembros, y donde los sustituyentes en los grupos opcionalmente sustituidos, mencionados anteriormente pueden incluir alquilo de cadena inferior, alcoxi de cadena inferior, hidroxi, siloxi, aciloxi, halo, benzoilo, carboxi, carboalcoxi y carbamoilo opcionalmente sustituido en nitrógeno con alquilo de cadena inferior, fenilo, tienilo, furilo o piridinilo; Y1 se toma del grupo: 0, -OCH2CH20-, -OCH2CH2S-, -OCH2CH2CH20-, -SCH2CH2CH2S- y -SCH2CH2S-; X2 se toma del grupo CH2, 0 y S; con las siguientes condiciones si X y Y son 0 y R24 o R25 son ya sea ambos alcoxi, o alcoxi y alquilo, sin tener en cuenta el orden, entonces al menos uno de R23 y R26 debe ser diferente de H, o sales de los mismos. Los compuestos de la estructura general XX se pueden preparar al hacer reaccionar amidas de la estructura general XXI con sec-butillitio y tetrametiletilendiamina en THF, seguido por la adición de benzaldehídos de la estructura general XXII, y la adición de ácido. Las lactonas resultantes de la estructura general XXIII se pueden reducir mediante la hidrogenación catalítica o tratamiento con zinc activado en ácido, seguido por la deshidratación con anhídrido trifluoroacético, • -XX o, al tratar éteres de diarilo de la estructura general XXIV con ácido sulfúrico, tricloruro de aluminio, anhidrido trifluoroacético, o un reactivo similar , donde R23, R24, R25, R26 son como se definen anteriormente, seguido, opcionalmente, por la conversión de cualquiera de uno o más de los grupos R23, R24, R25, R26 en los nuevos grupos R23, R24, R25, R26 mediante la desprotección, acoplamiento, adición, sustitución, o eliminación, y, si se desea, al convertir un compuesto de la estructura general XX en su sal o ponerlo libre de su sal.

Los compuestos representativos, específicos de la estructura general XX incluyen: 3-isopropoxiantrona Otro grupo que es útil en la invención son de la fórmula: XXV en la cual: X3 es NR27, X4 es CR30, X5 es O, X6 es CR31, X7 es O; o X3 es NR30, X4 es CR27 o N, X5 es NR31, X6 es CR28, X7 es O" o S"; o X3 es NR27, X4 es CR30, X5 es NR28, X6 es CR31, X7 es O" o S"; o X3 es NR27, X4 es CR28 o N, X5 es NR30, X6 es CR29, X7 es NR32; o X3 es NR30, X4 es CR27 o N, X5 es NR28, X6 es CR29, X7 es NR32; o X3 es NR27, X4 es CR30, X5 es S, X6 es CR31, X7 es NR32; XJ es NR 30 X4 es CR ¿ i X5 es S, X* es CR28, X7 es NR 32 es S, X es CR 30 x- es NR27, X1 es CR31, X7 es O" XJ es S, Xq es CR 30 X- es NR27, X' es CR28, X7 es NR 32 X3 es S, Xq es CR 27 Xs es NR 30 X* es CR28, X7 es NR32; X3 es S, X4 es CR30, X5 es S, X6 es CR27, X7 es NR32; X3 es S, X4 es CR30, X5 es S, X6 es CR31, X7 es O"; o X3 es NR30, X4 es CR27 o N, X5 es NR31, X6 es N, X7 es O" o S"; 15 X3 es NR27, X4 es CR30, X5 es NR28, X4 es N, X7 es NR32 o CZ2Z3; X3 es NR27, X4 es CR28 o N, X5 es NR30, X4 es N, X7 es NR32 o CZ2Z3; X3 es NR30, X4 es N, X5 es S, X6 es CR31, X7 es O"; X3 es S, X4 es CR27, X5 es NR30, X6 es N, X es NR 32 ,• X3 es S, X4 es CR30, X5 es NR27, X6 es N, X7 es NR32; o X3 es O o S, X4 es N, X5 es NR30, X6 es N, X7 es NR32; en la cual R27, R28 y R29 son individualmente alquilo 5 inferior de cadena recta o ramificada; R30 y R31 se toman individualmente del grupo : hidrógeno, alquilo (sin sustituir) sustituido de cadena recta o ramificada, 10 aromático (sin sustituir) sustituido, en la cual los sustituyentes pueden incluir: Halógeno, alquilo inferior de cadena recta o ramificada, alquenilo, alquinilo opcionalmente sustituido por un anillo de 15 alquilo cíclico, o de alquenilo cíclico, aromático de seis miembros hidroxilo, alcoxilo de cadena recta o ramificada, benzoilo, carboalcoxi, carbamoilo opcionalmente sustituido en nitrógeno por 20 alquilo de cadena inferior o fenilo, o carboxi ; R32 se toma del grupo Ar, COAr, COR33, donde Ar es un anillo aromático (sin sustituir) sustituido, de seis miembros, en la cual los sustituyentes en este anillo pueden incluir: Halógeno, alquilo inferior de cadena recta o ramificada, alquenilo, alquinilo opcionalmente sustituido por un anillo de alquilo cíclico o alquenilo cíclico, aromático, de seis miembros, hidroxilo, alcoxi de cadena recta o ramificada, benzoilo, carboalcoxi, carbamoilo opcionalmente sustituido en nitrógeno por alquilo de cadena inferior o fenilo o carboxi; R33 se toma del grupo Hidrógeno, y alquilo de cadena recta o ramificada, Z2 y Z3 se toman individualmente del grupo; CN y C02R34, R34 se toma del grupo: Hidrógeno, alquilo de cadena recta o ramificada y aromático (sin sustituir) sustituido, o sales de los mismos. Los compuestos de la estructura general XXV anterior se pueden preparar al tratar los compuestos de la estructura general XXVI, donde X8 es NR30 de S, X9 es CR30 o N, X10 es NR30 o S, Z4 es C02H, C02R30 o CN, con cloruros de ácido o anhídridos, X9rXß ,30 XXVI o al hacer reaccionar los compuestos de la estructura general XXVII, donde X 1111 es NR ,3J0U o S, X -12 es N o CR30, X13 es halógeno, SMe, o OEt, con aminas, sulfuros o enolatos, x12-x11 XXVII o al hacer reaccionar los compuestos de la estructura general XXVIII, donde X15 es O o S con isocianatos, isotiocianatos, o disulfuro de carbono, ; R31 XXVIII o al hacer reaccionar los compuestos de la estructura general XXIX con hidróxido de sodio, XXIX o al hacer reaccionar los compuestos de la estructura general XXX con tosilatos de alquilo, tosilatos de arilo o haluros de alquilo, N—N 2 XXX o al hacer reaccionar los compuestos de la estructura general XXXI con dicloruros de isocianuro de arilo, fosgeno, tiofósgeno o 3,3-bis (metiltio) acrilonitrilos, ,27 NR 30 R31 -N NH. XXX I o al hacer reaccionar los compuestos de la estructura general XXXII, donde X16 es O, S, o NH, con etóxido de sodio o HCl en la presencia de cloruros de ácido o HCl en la presencia de anhídridos de ácido.

XXX I I o al hacer reaccionar los compuestos de la estructura general XXXIII, donde X17 es NH o S, con cloruros de ácido, anhídridos de ácido, o HONO, NHR30 XXXIII o al hacer reaccionar los compuestos de la estructura general XXXIV con Cu(acac)2, XXXIV donde R22, R28, R29, R30, R31, R32, R33 y R34 son como • se definen anteriormente, seguido, opcionalmente, por la conversión de cualquiera de uno o más de los grupos R22, R28, R29, R30, R31, R32, R33 y R34 en los nuevos grupos R22, R28, R29, R30, R31, R32, R33 y R34 mediante la desprotección, acoplamiento, adición, sustitución o eliminación, y si se desea, mediante la conversión de un compuesto de la estructura general XXV en su sal o ponerlo libre de su sal.

Los compuestos representativos, específicos de los compuestos de la estructura general XXV incluyen: 3- (4-clorofenil) -1, 2, 3, 4-oxatriazolio-5- (4-clorofenil) aminida 1, 3-di ( 4-metilfenil) -1,2,3,4-tetrazolio- 5-óxido .

Los siguientes ejemplos se proponen para ilustrar, pero no para limitar, la invención.

Ejemplo 1 El compuesto 59-0008 de acuerdo con el procedimiento de McDonald, W. S. y colaboradores Chem Comm (1969) 392-393. Irving H. N. N. H. y colabora dores Ana l Chim Acta (1970) 49:261-266. En resumen, 10.0 g de ditizona se tomaron en 100 ml de EtOH y 50 ml de AcOH y se calentaron a reflujo durante 18 horas. Después del enfriamiento, esto se diluyó primero con 100 ml de agua y luego con 50 ml de NaOH ÍN. Esto luego se neutralizó adicionalmente por la adición de NaOH 6 N para llevar el pH a 5.0. Esta mezcla púrpura obscuro luego se concentró en un cultivador rotatorio para remover las sustancias orgánicas. Una vez que el líquido ha perdido todo su color púrpura, este se filtró para colectar el precipitado obscuro. La purificación mediante la cromatografía instantánea (4.5 x 25.7 cm; EtAc/Hep. (1:4); Rf 0.22) seguido por la recristalización de EtOH dio 2.15 g (rendimiento del 25%) de cristales púrpura obscuro, p.f.= 184-185°C, RMN XH (CDC13) 7.90 (d de d, Jx = 1 . 1 , J2 = 2.2, 2H) , 7.64 (cresta, 1H) , 7.49 (m, 3H) , 7.02 (m, 1H) , 6.91 (m, 2H) , 6.55 (d, J = 8.1, 1H) , EM (El) 254 (47, M+), 105 (26), 77 [100], 51(27). HREM (El, M+) 254.0626 (calculado 254.0626182). Análisis calculado para C?3H10N4S: C, 61.40; H, 3.96; N, 22.03. Encontrado: C, 61.40; H, 4.20; N, 22.06.

Ejemplo 2 Selección de Alto de Rendimiento Se analizaron varios cientos de compuestos en el sistema de ensayo expuesto en la patente norteamericana No. de Serie 08/458,434, presentada el 2 de Junio de 1995, e incorporada en la presente por referencia. El control positivo normal fué un compuesto de la invención 59-0008 (también representado "OS8"),el cual es de la fórmula: En más detalle, se emplearon las células 2T3-BMP-2-LUC, una línea de células osteoblastos, establemente transformadas, descritas en Ghosh-Choudhury y colabora dores Endocrinology (1996) 137:331-39, referenciada anteriormente. Las células se cultivaron utilizando a-MEM, FCS al 10% con penicilina al 1%/estreptomicina y glutamina al 1% ("medio de cultivo en placas"), y se dividieron 1:5 una vez por semana. Para el ensayo, las células se resuspendieron en un medio de cultivo en placas que contiene FCS al 4% se cultivó en placas de microtítulo en una concentración de 5 x 103 células (en 50 µl)/pozo, y se incubaron durante 24 horas a 37CC en C02 al 5%. Para iniciar el ensayo, 50 µl del compuesto de prueba o el control en DMSO se adicionó a una concentración 2X a cada pozo de modo que el volumen final fué 100 µl . La concentración del suero, final fué FCS al 2% y la concentración de DMSO, final fué 1%. El compuesto 59-0008 (10 µM) se utilizó como un control positivo.

Las células tratadas se incubaron durante 24 horas a 37°C y C02 al 5%. El medio luego se eliminó, y las células se enjuagaron tres veces con PBS. Después de la eliminación del PBS en exceso, se adicionaron 25 µl del reactivo de lisado del cultivo celular IX (Promega #E153A) a cada pozo y se incubó durante al menos diez minutos. Opcionalmente, las placas/muestras se podrían congelar en este punto. A cada pozo se adicionaron 50 µl del substrato de luciferasa (Promega #E152A; 10 ml de amortiguador de ensayo de luciferasa Promega por 7 mg del substrato de ensayo de luciferasa Promega) . La luminiscencia se midió en un luminómetro de 96 pozos, automatizado, y se expresó ya sea como picogramos de actividad de la luciferasa por pozo o como picogramos de actividad de la luciferasa por microgramo de proteína. En este ensayo, el compuesto 59-0008 (3-fenilazo-lH-4, 1, 2-benzotiadiazina) exhibió un patrón de reactividad, como se muestra en la Figura 1. La actividad para el compuesto 59-0008 fué máxima a una concentración de aproximadamente 3-10 µM y, más particularmente, a aproximadamente 3 µM y proporcionó de esta manera una respuesta de aproximadamente 175 unidades de emisión de luz. Por consiguiente, otros compuestos analizados se evaluaron a varias concentraciones y estos resultados se compararon a los resultados obtenidos por 59-0008 a 10 µM (valor que se normalizó a 100). Por ejemplo, cualquier compuesto analizado en la Figura 2 y la Figura 3 que mostró una actividad mayor que 10 µM de 59-0008 daría por resultado un valor sobre 100. Como se muestra en la Figura 2 (39 hojas) y Figura 3 (10 hojas), se encontraron varios compuestos que son particularmente efectivos.

Ejemplo 3 Datos de Desarrollo del Hueso Calvárico In Vi vo El compuesto 59-0008 se ensayó in vi vo de acuerdo con el procedimiento descrito previamente (ver " In vi vo Assay of Effects of Compounds on Murine Calvarial Bone Growth", supra) . Como se comparó a un control del vehículo, el compuesto 59-0008 indujo un incremento de 4 veces del ancho del nuevo hueso calvárico.

Ejemplo 4 Actividad Condrogénica Los compuestos 59-0008, 59-0102 y 50-0197 se ensayaron por los efectos sobre la diferenciación de las células de cartílago, como se comparó a la acción de BMP-2 de humano, recombinante. En resumen, una línea de células condrogénicas, clónales de ratón, TMC-23, se aisló y se clonó del cartílago del costal de ratones transgénicos que contienen la región de control del gen BMP-2 que impulsa el antígeno T, grande, SV-40, generado como se describe en Ghosh-Choudhury y colaboradores Endocrinol ogy 137:331-39, 1996. Estas células se cultivaron en DMEM/FCS al 10%, y se mostró que expresan el antígeno de T, y también para producir aggrecan (coloración de toluidina azul a pH 1.0) y colágeno del Tipo II ( inmunoteñido) por 7 días después de la confluencia . Para la medición de la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) , se empleó la técnica de LF Bonewald y colaboradores J Bi ol Chem (1992) 267:8943-49. En resumen, las células TMC-23 se cultivaron en placas de microtítulo de 96 pozos en DMEM que contiene FCS al 10% en 4 x 103 células/pozo. Dos días después del cultivo en placas, las células fueron confluentes y el medio se reemplazó con el medio nuevo que contiene FCS al 10% y concentraciones diferentes de compuestos o BMP-2 recombinante. Después de 2 o 5 días de incubación, adicionales, las placas se lavaron dos veces con PBS, y luego la solución de lisis (Tritón al 0.05% X-100) se adicionó (100 µl/pozo). Las células se Usaron por tres ciclos de congelación-descongelación de -70°C (30 minutos), seguido por 37°C (30 minutos con agitación). Veinte microlitros de lisados de células se ensayaron con 80 µl de fosfato de p-nitrofenol 5 mM en amortiguador de 2-amino-2-metil-propanol 1.5 M, pH 10.3 (Equipo Sigma ALP, Sigma Chemical Co . , St . Louis, MO) durante 10 minutos a 37°C. La reacción detuvo por la adición de 100 µl de NaOH 0.5 M. La absorbancia espectrofotométrica a 405 nm se comparó a aquella de los estándares de p-nitrofenol para estimar la actividad de ALP en las muestras. Se determinó el contenido de proteína de los lisados de células por el equipo de ensayo de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA) . La actividad especifica se calculó utilizando estos dos parámetros.

En el día 2, los compuestos 59-0008 (10~9 M) , 59-0102 (10~7 M) y 59-0197 (10~9 M) incrementaron los niveles de ALP aproximadamente 3, 2 y 2.5 veces, respectivamente, como se comparó al control de vehículo. La BMP2 recombinante a 100, 50 o 10 ng/ml indujo niveles de ALP de aproximadamente 10, 4 o 1.5 veces, respectivamente, como se comparó al control de vehículo. De lo anterior, será apreciado que, aunque se han descrito en la presente modalidades específicas de la invención para los propósitos de ilustración, se pueden hacer diversas modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, la invención no se limita, excepto como por las reivindicaciones anexas .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

Claims (29)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar una condición en un animal vertebrado que se distingue por una deficiencia en, o necesidad por, el reemplazo del desarrollo del hueso y/o un nivel indeseado de resorción del hueso, el método está caracterizado porque comprende administrar a un sujeto vertebrado en necesidad de tal tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula: en donde Ra es un sustituyente que no interfiere ; m es un número entero de 0-4. cada línea punteada representa un enlace p opcional; cada Z es independientemente N, NR, O, S, CR o CR2, donde cada R es independientemente H o alquilo (1 a 6 átomos de carbono) , X es O, S, SO o S0 , L es un enlace flexible; y Ar2 es un anillo aromático de 6 miembros, sustituido o sin sustituir,

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque L es un enlace conjugado flexible.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque L se selecciona del grupo que consiste de un enlace covalente, -N=N-, -RC=CR-, -RC=N, -N=CR-, -NRCO-, -CONR-, -CR20-, y -CH2NR- donde cada R es independientemente H o alquilo (1 a 6 átomos de carbono.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Ar2 es donde R es un sustituyente que no interfiere y n es un número entero de 0 a 5.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque Ar2 es fenilo sin sustituir.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto es 59-0008.

7. Una composición farmacéutica para el uso en un método para tratar una condición en un animal vertebrado que se distingue por una deficiencia en, o necesidad por, el reemplazo del desarrollo del hueso, y/o un nivel indeseado de resorción del hueso, la composición está caracterizada porque comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula : Ar1 en donde Ra es un sustituyente que no interfiere ; m es un número entero de 0-4. cada linea punteada representa un enlace p opcional; cada Z es independientemente N, NR, 0, S, CR o CR2, donde cada R es independientemente H o alquilo (1 a 6 átomos de carbono) , X es 0, S, SO o S02, L es un enlace flexible; y Ar2 es un anillo aromático de 6 miembros, sustituido o sin sustituir.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque L es un enlace conjugado, flexible.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque L se selecciona del grupo que consiste de un enlace covalente, -N=N-, -RC=CR-, -RC=N, -N=CR-, -NRCO-, -CONR-, -CR20-, y -CH2NR- donde cada R es independientemente H o alquilo (1 a 6 átomos de carbono.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque Ar2 es donde R es un sustituyente que no interfiere y n es un número entero de 0 a 5

11. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque Ar2 es fenilo sin sustituir.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el compuesto es 59-0008.

13. Un método para tratar una condición en un animal vertebrado que se distingue por una deficiencia en, o necesidad por, el reemplazo de desarrollo del hueso y/o un nivel indeseable de resorción del hueso, el método está caracterizado porque comprende administrar a un sujeto vertebrado en necesidad de tal tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula: donde Ra es un sustituyente que no interfiere; n es un número entero de 0 y 5, L es un enlace flexible que no contiene nitrógeno; y Ar2 es un fenilo sustituido o sin sustituir o un naftilo sustituido o sin sustituir .

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque Ra es -NR2 o -COOR, donde R es H o alquilo (1 a 6 átomos de carbono) .

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque Ar2 es fenilo sustituido o sin sustituir.

16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque Ar1 y Ar2 son diferentes.

17. Una composición farmacéutica para el uso en un método para tratar una condición en un animal vertebrado que se distingue por una deficiencia en, o necesidad por, el reemplazo del desarrollo del hueso y/o un nivel indeseable de resorción del hueso, la composición está caracterizada porque comprende administrar un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula: donde Ra es un sustituyente que no interfiere; n es un número entero de 0 y 5, L es un enlace flexible que no contiene nitrógeno; y Ar2 es un fenilo sustituido o sin sustituir o un naftilo sustituido o sin sustituir.

18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque Ra es -NR2 o -COOR, donde R es H o alquilo (1 a 6 átomos de carbono) .

19. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque Ar2 es fenilo sustituido o sin sustituir.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque Ar1 y Ar2 son diferentes.

21. Un método para tratar una condición en un animal vertebrado que se distingue por una deficiencia en, o necesidad por, el reemplazo del desarrollo del hueso y/o un nivel indeseable de resorción del hueso, el método está caracterizado porque comprende administrar a un sujeto vertebrado en necesidad de tal tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula: donde Ra es un sustituyente que no interfiere; n es un número entero de 0 y 5, L es un enlace restringido; y Ar2 es un fenilo sustituido o sin sustituir o un naftilo sustituido o sin sustituir .

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque R1 es -NR2 o -COOR, donde R es H o alquilo (1 a 6 átomos de carbono) .

23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque Ar2 es fenilo sustituido o sin sustituir.

24. Una composición farmacéutica para el uso en un método para tratar una condición en un animal vertebrado que se distingue por una deficiencia en, o necesidad por, el reemplazo del desarrollo del hueso y/o un nivel indeseable de resorción del hueso, la composición está caracterizada porque comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula : donde Ra es un sustituyente que no interfiere; n es un número entero de 0 y 5 , L es un enlace restringido; y Ar2 es un fenilo sustituido o sin sustituir o un naftilo sustituido o sin sustituir

25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque R1 es -NR2 o -COOR, donde R es H o alquilo (1 a 6 átomos de carbono) .

26. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque Ar2 es fenilo sustituido o sin sustituir.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 13 o 21, caracterizado porque la condición es osteoporosis, fractura o deficiencia del hueso, hiperparatiroidismo primario o secundario, enfermedad o defecto periodontal, enfermedad del hueso metastático, enfermedad del hueso osteolítico, cirugía pos-plástica, cirugía de unión pos-prostética o implante pos-dental.

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 13 o 21, caracterizado porque comprende administrar al sujeto uno o más agentes que promueven el desarrollo del hueso o que inhiben la resorción del hueso.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque los agentes se seleccionan del grupo que consiste de factores morfogenéticos del hueso, agentes anti-reabsorbedores , factores osteogénicos , proteínas morfogénicas derivadas del cartílago, hormonas de desarrollo y factores de diferenciación.