MXPA98002005A - Moleculas de adn circular con origen de replicacion condicional, su proceso de preparación y su utilización en terapia génica - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una molécula de ADN de forma circular,útil en terapia génica, que comprende al menos una secuencia nucleica de interés, caracterizada porque la región que permite su replicación comprende un origen de replicación donde la funcionalidad en una célula huésped requiera la presencia de al menos una proteína específica y extraña para dicha célula huésped. Esta tiene igualmente por objetivo un procedimiento de preparación correspondiente, de las células que incorporan las moléculas de ADN y sus usos en terapia génica.

Description

MOLÉCULA DE ADN CIRCULAR CON ORIGEN DE REPLICACIÓN CONDICIONAL, SU PROCESO DE PREPARACIÓN Y SU UTILIZACIÓN EN TERAPIA GÉNICA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una nueva molécula de ADN para la replicación condicional, utilizable en terapia génica o para la producción de proteinas recombinantes.

La terapia génica consiste en corregir una deficiencia o una anomalía introduciendo una información genética en la célula o en el órgano afectado. Esta información puede ser introducida ya sea in vi tro en una célula extraida del órgano, y en seguida reinyectada en el organismo, o bien i n vi vo, directamente en el tejido considerado. Tratándose de una molécula de un alto peso molecular y de carga negativa, el ADN tiene dificultades para atravesar espontáneamente las membranas celulares fosfolipidicas . Son pues utilizados diferentes vectores con el fin de permitir la transferencia del gen: los vectores virales por una parte, los vectores REF: 26830 químicos y/o bioquímicos, naturales y sintéticos, por otra parte.

Los vectores virales (retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, etc.) son muy eficaces, principalmente para el paso de las membranas, pero presentan un cierto número de riesgos tales como la patogenicidad, la recombinación, la replicación, la inmunogenicidad, etc.

Los vectores químicos y/o bioquímicos permiten evitar estos riesgos (para revisiones ver Behr, 1993, Cotten y Wagner, 1993) . Éstos son por ejemplo cationes (fosfato de calcio, DEAE-dextrano, etc.) que actúan formando precipitados con el ADN, los cuales pueden ser "fagocitados" por las células. Éstos pueden tratarse igualmente de liposomas en los cuales el ADN es incorporado, y que se fusiona con la membrana plasmídica. Los vectores sintéticos de transferencia de genes son en general los lípidos o los polímeros catiónicos que forman complejos con el ADN y que forman con éste una partícula que incluye cargas positivas en la superficie. A manera ilustrativa de este tipo de vectores, se pueden citar principalmente la dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS, TransfectanMR) o el cloruro de N-[l-(2,3-dioleiloxi) propi1]-N, N, N-trimetilamonio (DOTMA, LipofectinMR) .

No obstante, la utilización de vectores químicos y/o bioquímicos o de ADN desnudo implica la posibilidad de producir cantidades importantes de ADN de pureza farmacológica. En efecto, en las técnicas de terapia génica, el medicamento está constituido del ADN mismo y es esencial poder fabricar, en cantidades adaptadas, los ADNs que tienen propiedades apropiadas para un uso terapéutico en el ser humano.

En el caso de la vectorología no viral, éstos son plásmidos de origen bacteriano que son puestos en operación. Los plásmidos utilizados en general en terapia génica incluyen (i) un origen de replicación, (ii) un gen marcador tal como un gen de resistencia a un antibiótico (kanamicina, ampicilina, etc.) y (iii) uno o varios transgenes con las secuencias necesarias para su replicación (aumentador (es) , promotor (es ) , secuencias de poliadenilación, etc.).

No obstante, la tecnología actualmente disponible no da completa satisfacción.

Por una parte, ésta involucra un riesgo de diseminación en el organismo. Es así que una bacteria presente en el organismo puede, a una frecuencia débil, recibir este plásmido. Éste tiene muchas más oportunidades de pasar tratándose de un tratamiento de terapia génica in vi vo en el cual el ADN puede ser diseminado en el organismo del paciente y puede ponerse en contacto con las bacterias que infectan este paciente, o bien con las bacterias de la flora comensal. Si la bacteria receptora del plásmido es una enterobacteria, tal como E . col i , este plásmido puede replicarse. Un evento de este tipo conduce luego a la diseminación del gen terapéutico. En la medida en donde los genes terapéuticos utilizados en los tratamientos de terapia génica puedan codificar por ejemplo para una linfocina, un factor de crecimiento, un antioncogen, o una proteína cuya función hace falta en el huésped y permite entonces corregir una falla genética, la diseminación de algunos de estos genes, podría tener efectos imprevisibles y preocupantes (por ejemplo si una bacteria patógena adquiriera el gen de un factor de crecimiento humano) .

Por otra parte, los plásmidos utilizados en general en terapia génica no viral poseen también un marcador de resistencia a un antibiótico (ampicilina, kanamicina, etc.) . La bacteria que adquiere un plásmido de este tipo tiene pues una ventaja selectiva innegable puesto que cualquier tratamiento de antibioterapia que utilice un antibiótico de la misma familia que aquella que selecciona el gen de resistencia del plásmido, va a conducir a la selección del plásmido en cuestión. A este respecto, la ampicilina forma parte de las ß-lactamas que es la familia de antibióticos más utilizada en el mundo. La utilización de los marcadores de selección en las bacterias que no sean los genes de resistencia a los antibióticos, sería pues particularmente ventajosa. Esto evitaría la selección de bacterias que hayan podido recibir un plásmido que incluya un marcador de este tipo.

Es pues particularmente importante buscar limitar al máximo la diseminación de los genes terapéuticos y los genes de resistencia.

La presente invención tiene precisamente por objetivo el proponer novedosas moléculas de ADN, utilizables en terapia génica o para la producción de proteínas recombinantes in vi tro, que no se replican más que en células que pueden complementar ciertas funciones de estos vectores no virales.

La invención se refiere igualmente a un método particularmente eficaz para la preparación de estas moléculas de ADN.

Las moléculas de ADN reivindicadas tienen por ventaja eliminar los riesgos ligados a una diseminación del plásmido, tales como (1) la replicación y la diseminación, que pueden entrañar una sobreexpresión no controlada del gen terapéutico, (2) la diseminación y la expresión de los genes de resistencia. La información genética contenida en las moléculas de ADN de acuerdo a la invención comprenden en efecto el o los genes terapéuticos y las señales de regulación de su expresión, un origen de replicación condicional funcional, que limita muy fuertemente el espectro del huésped celular de este plásmido, un marcador de selección de tamaño reducido, de preferencia diferente a un gen que confiere la resistencia a un antibiótico y según el caso, un fragmento de ADN que permita la resolución de multímeros del plásmido. La probabilidad de que estas moléculas (y así pues la información genética que éstas contiene) sean transferidas a un microorganismo, y mantenidas de manera estable, es muy limitada.

Finalmente, los vectores de acuerdo a la invención, igualmente designados miniplásmidos en virtud de su estructura circular, de su tamaño reducido y de su forma superenrollada, presentan las ventajas complementarias siguientes: en virtud de su tamaño reducido con relación a los plásmidos derivados de ColEl clásicamente utilizados, las moléculas de ADN de acuerdo a la invención tienen potencialmente una mejor biodisponibilidad in vi vo . En particular, éstas presentan capacidades de penetración y de distribución celulares mejoradas. De este modo, es reconocido que el coeficiente de difusión en los tejidos es inversamente proporcional al peso molecular (Jain, 1987) . De igual modo, a nivel celular, las moléculas de alto peso molecular tienen una permeabilidad menos buena para atravesar la membrana plasmídica. Por otro lado, para el paso del plásmido al núcleo, indispensable para su expresión, el peso molecular elevado es igualmente un inconveniente, los poros nucleares imponen un límite de tamaño para la difusión hacia el núcleo (Landford y colaboradores, 1986) . La reducción del tamaño de las partes no terapéuticas de la molécula de ADN (origen de replicación y gen de selección principalmente) de acuerdo a la invención, permiten igualmente disminuir el tamaño de las moléculas de ADN. La parte que permite la replicación y la selección de este plásmido en la bacteria (1.1 kb) está disminuida por un factor 3, tomando por ejemplo 3 kb para el origen de replicación y el marcador de resistencia por parte del vector. Esta disminución (i) de peso molecular y (ii) de carga negativa, confiere a las moléculas de la invención capacidades mejoradas de difusión y de biodisponibilidad tisulares, celulares y nucleares.

De manera más precisa, la presente invención se refiere a una molécula de ADN bajo la forma circular, útil en terapia génica, que comprende al menos una secuencia nucleica de interés, caracterizada porque la región que permite su replicación comprende un origen de replicación donde la funcionalidad en una célula huésped requiere la presencia de al menos una proteína específica y extranjera para dicha célula huésped.

Esta molécula de ADN puede presentarse bajo la forma de una sola hebra o de doble hebra y ventajosamente posee una forma superenrollada.

En el sentido de la presente invención, las células huésped puestas en operación pueden ser de diversos orígenes. Se puede tratar de células eucarióticas o procarióticas. De acuerdo a una modalidad de realización privilegiada de la invención, se trata de células procariotas.

Clásicamente, la replicación de los plásmidos bacterianos necesita la presencia de al menos una proteína codificada por el huésped celular del tipo ARN-poli erasa, ARNasa, ADN-polimerasa, etc. Por las razones ya expuestas anteriormente, no se puede evitar totalmente, con este tipo de replicación, los eventuales riesgos de diseminación en el organismo tratado. Ventajosamente, la funcionalidad del origen de replicación de la molécula de ADN de acuerdo a la invención exige la presencia de una proteína específica y extraña para la célula huésped. Esta característica tiene por interés el reducir el espectro de huésped del plásmido reivindicado, a las cepas específicas que expresan esta proteína iniciadora. La molécula de ADN, puesta a punto en el marco de la presente invención, posee pues ventajosamente un origen de replicación denominado condicional .

El origen de replicación condicional puesto en operación de acuerdo a la presente invención, puede provenir de plásmidos o de bacteriófagos, que comparten las características siguientes: contienen en su origen de replicación secuencias repetidas, o iterones y éstos codifican para al menos una proteína iniciadora de la replicación (Rep) que le es específica. A manera de ejemplo, se pueden citar los sistemas de replicación condicional de los plásmidos y bacteriófagos siguientes: De acuerdo a una modalidad de realización preferida de la invención, el origen de replicación puesto en operación en las moléculas de ADN reivindicadas, es proveniente de un plásmido natural de E . col i denominado R6K.

Las funciones de replicación de RßK son reagrupadas en un fragmento de ADN de 5.5 kpb (figura 1) que comprende 3 orígenes de replicación a, ß y ? (? y ß que aseguran 90% de la replicación) y un operón que codifica para las proteínas iniciadoras de la replicación p y la proteína Bis. La información genética mínima necesaria para mantener este plásmido en su número de copias características (15 copias por genoma) está contenida en dos elementos: los 400 pdb del ori y y el gen pi r, cuyo producto es la proteína iniciadora p.

El origen ? puede ser dividido en dos partes funcionales: la parte del núcleo y el elemento activador (figura 1). La parte de núcleo, esencial para la replicación contiene los iterones (7 repeticiones directas de 22 pbd) donde se une la proteína p representada en la SEQ ID No. 1, y los segmentos flanqueantes, objetivos de las proteínas del huésped (IHF, DnaA) .

De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el origen de replicación del vector reivindicado está constituido totalmente o en parte por este origen de replicación ? del plásmido R6k, y más preferentemente totalmente o en parte por la SEQ ID No. 1 o uno de sus derivados.

En el sentido de la presente invención, el término derivado designa cualquier secuencia diferente de la secuencia considerada, en virtud de una degeneración del código genético, obtenida mediante una o varias modificaciones de naturaleza genética y/o química, así como cualquier secuencia que se hibride con estas secuencias o fragmentos de éstas, y donde el producto posea la actividad indicada con respecto a la proteína iniciadora de la replicación, p. Por modificación natural genética y/o química, se puede entender cualquier mutación, sustitución, supresión, adición y/o modificación de uno o varios residuos. El término derivado comprende igualmente las secuencias homologas a la secuencia considerada, provenientes de otras fuentes celulares, y principalmente de células de origen humano, o de otros organismos, y que poseen una actividad del mismo tipo. Tales secuencias homologas pueden ser obtenidas mediante experimentos de hibridación. Las hibridaciones pueden ser realizadas a partir de bancos de ácidos nucleicos, utilizando como sonda la secuencia nativa o un fragmento de ésta, en las condiciones estrictas convencionales (Maniatis y colaboradores, ver técnicas generales de biología molecular) , o de preferencia, en condiciones estrictas elevadas.

El origen de replicación descrito anteriormente, que presenta la ventaja de ser de tamaño muy limitado, es funcional únicamente en presencia de una proteína iniciadora específica, la proteína Pi, producida por el gen pi r (SEQ ID No. 2) . Esta proteína que puede actuar en posición trans, es capaz de disociar físicamente el ori gamma del gen pi r que podrá ser introducido en el genoma de la célula elegida como huésped, específica de estos plásmidos. Las mutaciones en p pueden alterar sus funciones inhibidoras (Inuzuka y Wada, 1985) e involucrar un aumento de número de copias de los derivados de R6k, hasta más de 10 veces el número de copias iniciales. Estas sustituciones están todas comprendidas en un dominio de 40 aminoácidos, que parece pues responsable del control por p del número de copias plasmídicas ( figura 2) .

De acuerdo a una modalidad de realización ventajosa de la presente invención, la proteína p expresada en la célula huésped resulta de la expresión del gen representado en la SEQ ID No. 2 o uno de sus derivados tales como se define anteriormente, y más particularmente del gen pi r 116 que comprende una mutación con respecto al gen pi r . Esta mutación corresponde a la sustitución de una prolina por una leucina. En este contexto, el número de copias de los derivados de R6K es del orden de 250 copias por genoma.

Otro origen de replicación condicional tal como el que se define anteriormente, las moléculas de ADN reivindicadas contienen una región que comprende uno (o varios) gen (es) que permiten asegurar la selección de la molécula de ADN en el huésped elegido.

Se puede tratar de un marcador clásico del tipo del gen que confiere una resistencia a un antibiótico, tal como la kanamicina, la ampicilina, el cloranfenicol, la estreptomicina, la espectinomicina, la lividomicina u otros.

No obstante, de acuerdo a una modalidad de realización privilegiada de la invención, esta región es diferente de un gen que confiere la resistencia a un antibiótico. Se puede tratar también de un gen cuyo producto es indispensable para la viabilidad del huésped considerado, en las condiciones de cultivo definidas. Éste puede ser por ejemplo: un gen que codifica para un ARNt supresor, de origen natural o sintético. Se trata más preferentemente de un ARNt de codón ámbar (TAG) un gen cuyo producto es necesario para el metabolismo de la célula, en ciertas condiciones de cultivo: el gen que interviene en la biosíntesis de un metabolito (aminoácido, vitamina, etc.) el gen del catabolismo que permite asimilar una sustancia presente en el medio de cultivo (fuente de nitrógeno o de carbono particulares), etc.

De acuerdo a una modalidad privilegiada de la invención, esta región contiene un cásete de expresión de un gen que codifica para un ARNt supresor de codones específicos. Éste puede ser principalmente elegido entre aquellos que codifican para las bases fenilalanina, cisteína, prolina, alanina e histidina. Se puede tratar más preferentemente de un ARNt supresor de los codones ámbar (TAG) .

En este caso particular, el sistema utilizado para seleccionar, en los huéspedes celulares, las moléculas de ADN que son el objetivo de la presente invención, incluye dos elementos: 1) sobre la molécula de ADN, un gen que codifica para un ARN de transferencia supresor del codón ámbar (TAG) que constituye el marcador de selección, denominado gen (sup) y 2) un huésped específico donde uno de los genes, esencial en ciertas condiciones de cultivo, contiene un codón ámbar TAG. Esta célula podrá crecer, en las condiciones de cultivo para las cuales es esencial el producto del gen contiene el codón TAG, únicamente si el plásmido que permite la expresión de sup está presente en la célula. Las condiciones de cultivo constituyen pues la presión de selección de la molécula de ADN. Los genes sup utilizados pueden ser de origen natural (Glass y colaboradores, 1982) o provenir de una construcción sintética (Normanly y colaboradores, 1986; Kleina y colaboradores, 1990).

Un sistema de este tipo ofrece una gran flexibilidad en la medida donde, de acuerdo al gen que incluye una mutación ámbar, es posible determinar diferentes medios selectivos. En la bacteria La ct ococcus l a c ti s , por ejemplo, el codón ámbar está localizado en un gen de biosíntesis de las purinas. Éste permite la selección del plásmido portador del gen que codifica para el ARNt supresor, cuando las bacterias se multiplican en la leche. Un marcador de este tipo tiene la ventaja de ser de tamaño muy reducido y de no contener secuencias "extrañas", provenientes de los fagos o de los transposones.

De acuerdo a una modalidad de realización particular de la invención, la molécula de ADN comprende además un fragmento de ADN, que es objetivo de las recombinasas específicas del sitio, que permite la resolución de los multímeros de los plásmidos.

De este modo, un fragmento de este tipo, introducido sobre una molécula de ADN circular y donde el origen de replicación es por ejemplo ori gamma, permite resolver los multímeros de un plásmido de este tipo. Tales multímeros son principalmente observados cuando la molécula de ADN es preparada en una cepa que incluye un alelo mutado de pir, que permite aumentar el número de copias de los derivados de R6K, como pir-116.

Esta recombinación puede ser realizada gracias a diversos sistemas que involucran la recombinación específica del sitio entre las secuencias. Más preferentemente, la recombinación específica del sitio, de la invención, es obtenida por medio de secuencias de recombinación intramolecular específica, que son capaces de recombinarse entre ellas en presencia de proteínas específicas, generalmente designada recombinasa. En este caso preciso, se trata de recombinasas XerC y XerD. Por esta razón, las moléculas de ADN de acuerdo a la invención comprenden en general además una secuencia que permite esta recombinación específica del sitio. El sistema de recombinación específica presente en las construcciones genéticas de acuerdo a la invención (recombinasas y sitio de reconocimiento específico) puede ser de diferentes orígenes. En particular, las secuencias específicas y las recombinasas utilizadas pueden pertenecer a diferentes clases estructurales, y principalmente a la familia de la resolvasa del transposón Tn3 o a la familia de la integrasa del bacteriófago lambda. Entre las recombinasas que pertenecen a la familia del transposón Tn3, se pueden citar principalmente la resolvasa del transposón Tn3_ o de los transposones, Tn2-¿. Y Tn52_2 (Stark y colaboradores, 1992); la invertasa Gin del bacteriófago mu o incluso las resolvasas de los plásmidos, tales como aquellos del fragmento par de RP4 (Abert y colaboradores, Mol. Microbiol. 12 (1994) 131) . Entre las recombinasas que pertenecen a la familia de la integrasa del bacteriófago ?, se pueden citar principalmente la integrasa de los fagos lambda (Landy y colaboradores, Science 197 (1977) 1147), P22 y f80 (Leong y colaboradores, J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 de Ha emophi l us infl uenzae (Hauser y colaboradores, J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), la integrasa Cre del fago Pl, la integrasa del plásmido pSAM2 (Patente Europea EP 350 341) o incluso la recombinasa FL-P del plásmido 2µ y las recombinasas XerC y XerD de E. coli.

Preferentemente, las moléculas de ADN que son el objetivo de la presente invención contienen el fragmento cer del plásmido natural de E. coli ColEl. El fragmento cer utilizado es un fragmento Hpall de 382 pares de bases de ColEl, donde éste ha mostrado que permitiría, en posición cis, la resolución de los mult-ímeros de los plásmidos (Summers y colaboradores, 1984; Leung y colaboradores, 1985). Es también posible utilizar un fragmento Hpall-Taql de tamaño más reducido (280 pares de bases) o un fragmento más pequeño (aproximadamente 220 pares de bases), comprendido en el fragmento Hpall, y que posee las mismas propiedades (Summers y Herratt, 1988). Esta resolución pasa por una recombinación intramolecular específica, que hace intervenir cuatro proteínas codificadas por el genoma de E . coli : ArgR, PepA, XerC y XerD (Stirling y colaboradores, 1988, 1989; Colloms y colaboradores, 1990; Blakely y colaboradores, 1993).

De esta manera, es particularmente ventajoso utilizar todo o parte del fragmento cer de ColEl o uno de sus derivados, tales como se definen anteriormente.

De acuerdo a una variante de puesta en operación, las moléculas de ADN de la invención pueden comprender además una secuencia capaz de interactuar específicamente con un ligando. De manera preferente, se trata de una secuencia capaz de formar, mediante hibridación, una triple hélice con un oligonucleótido específico. Esta secuencia permite también purificar las moléculas de la invención mediante hibridación selectiva con un oligonucleótido complementario inmovilizado sobre un soporte (ver la Solicitud Internacional W096/18744). La secuencia puede ser colocada en cualquier sitio de la molécula de ADN de la invención, desde luego que no afecte la funcionalidad del gen de interés y del origen de replicación.

A manera de molécula de ADN representativa de la presente invención, se puede reivindicar más particularmente el plásmido pXL2774 y sus derivados. En el sentido de la invención, se entiende por derivado cualquier construcción que se derive de pXL2774 y que incluya uno o varios genes de interés diferentes al gen de la luciferasa. Se pueden igualmente citar los plásmidos pXL3029 y 3030 que incluyen un cásete de expresión de un gen terapéutico y una secuencia capaz de interactuar específicamente con un ligando.

La presente invención se refiere igualmente a la puesta a punto de un procedimiento, de construcciones de huéspedes celulares específicas, particularmente eficaces para la producción de estas moléculas de ADN terapéuticas.

Otro objetivo de la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de la molécula de ADN circular, caracterizado porque se cultiva una célula huésped que contiene al menos una molécula de ADN tal como se define anteriormente, y una proteína, expresada in si t u o no, que condiciona la funcionalidad del origen de replicación de dicha molécula de ADN, específica y extraña a dicha célula huésped, en las condiciones que permiten la selección de las células huéspedes transformadas por dichas moléculas de ADN.

Más preferentemente, la proteína que condiciona la funcionalidad del origen de replicación de la molécula de ADN, es expresada in si t u a partir de un gen correspondiente. El gen que codifica para la proteína iniciadora de la replicación puede ser llevado por un replicón anexo, compatible con los derivados del origen de replicación condicional, utilizado o bien introducido en el genoma de la célula huésped mediante recombinación, gracias a un transposón, un bacteriófago o cualquier otro vector. En el caso particular donde el gen que expresa la proteína es colocado sobre un replicón anexo, este último contiene igualmente una región promotora de la transcripción funcional en la célula, así como una región situada en posición 3', y que específica una señal de final de la transcripción. Respecto a la región promotora, se puede tratar de una región promotora naturalmente responsable de la expresión del gen considerado, cuando ésta es susceptible de funcionar en la célula. Se puede tratar igualmente de regiones de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o incluso sintéticas) . Principalmente, se puede tratar de secuencias promotoras de los genes procariotes o bacteriófagos. Por ejemplo, se puede tratar de secuencias promotoras provenientes del genoma de la célula.

A manera de genes que codifican para la proteína iniciadora de la replicación, podrán ser utilizados ya sea los genes silvestres, o bien los alelos mutados que permiten obtener un número de copias aumentado de los plásmidos (o derivados) específicos de la proteína iniciadora que condiciona la funcionalidad del origen de replicación puesto en operación en la molécula de ADN.

Tales mutantes han sido principalmente descritos por los plásmidos R6K (Inuzuka y Wada, 1985; Greener y colaboradores, 1990), Rtsl (Terawaki e Itoh, 1985; Terawaki y colaboradores, 1990; Zeng y colaboradores, 1990), F (Seelke y colaboradores, 1982; Helsberg y colaboradores, 1985; Kawasaki y colaboradores, 1991), RK2 (Durland y colaboradores, 1990; Haugan y colaboradores, 1992, 1995), pSClOl (Xia y colaboradores, 1991; Goebel y colaboradores, 1991; Fang y colaboradores, 1993).

En el caso particular donde la molécula de ADN puesta en operación posee un origen de replicación que se deriva del plásmido R6k, la proteína iniciadora es o se deriva de la proteína p de este mismo plásmido. Es particularmente ventajoso expresar una forma mutada de esta proteína, capaz de aumentar principalmente el número de copias iniciales. Para hacer esto, el gen integrado a nivel de la célula huésped es de preferencia representado por toda o parte de la secuencia representada en la SEQ ID No. 2 o uno de sus derivados, y más preferentemente por el gen pirllß. La mutación asociada corresponde a la sustitución de una prolina por una leucina. De acuerdo a una modalidad de realización particular de la invención, este gen pirllß es directamente incorporado en el genoma de la célula huésped.

Ventajosamente, uno de los genes del huésped celular específico, indispensable en las condiciones de cultivo elegidas, contiene un codón específico, reconocido por el ARNt supresor seleccionado a nivel de la molécula de ADN. De acuerdo a una modalidad privilegiada de la invención, se trata de un codón ámbar TAG. En este caso particular, la célula podrá crecer, en las condiciones de cultivo para las cuales es esencial el producto del gen que contiene el codón TAG, únicamente si el plásmido que permite la expresión de sup está presente en la célula huésped. Las condiciones de cultivo constituyen pues la presión de selección de la molécula de ADN.

De preferencia, el gen que incluye el codón ámbar es un gen que interviene en la biosíntesis de un aminoácido, la arginina. Este gen, argE, codifica para una N-acetilornitinasa (Meinnel y colaboradores, 1992) e incluye en este caso un codón TAG correspondiente a una mutación puntual Gln-53 (CAG)-> TAG; la presión de selección del plásmido que incluye el gen sup es luego asegurada mediante cultivo en medio mínimo M9 (Maniatis y colaboradores, 1989) . No obstante éste podría ser también, por ejemplo, un gen de biosíntesis de una vitamina, de una base nucleica o bien un gen que permita utilizar una fuente de carbono o de nitrógeno particular, o cualquier otro gen cuya funcionalidad sea indispensable para la viabilidad celular en las condiciones de cultivo elegidas.

La célula huésped es de preferencia elegida entre las cepas de E. coli y representada más preferentemente por la cepa E. coli XAC-1.

De acuerdo a una modalidad de realización particular de la invención, la célula huésped puesta en operación en el procedimiento reivindicado, es una célula de la cepa E. coli XAC-1, que comprende en su genoma el gen pir 116 y transformada por el plásmido pXL2774 o uno de sus derivados.

De acuerdo a una variante ventajosa de la invención, la célula huésped puesta en operación en el procedimiento reivindicado es una célula procariota en el cual el gen endAl o un gen homólogo es inactivado. El gen endA codifica para la endonucleasa I de E . coli . Esta enzima periplásmica posee una actividad de corte o escisión no específica del ADN de doble hebra (Lehman, I. R., G. G. Roussos y E. A. Pratt (1962) J. Biol. Chem. 237:819-828; Wright M. (1971) J. Bacteriol. 107:87-94). Un estudio conducido sobre diferentes cepas de Escheri chi a col i (silvestre o endA) ha mostrado que la degradación de ADN plasmídico incubado en los extractos de estas cepas bacterianas existía en las cepas endA+ pero no en los mutantes endA (Wnendt S. (1994) BioTechniques 12-270-272). La calidad del ADN plasmídico aislado de las cepas e dA+ o de los mutantes endA ha sido estudiada por la sociedad Promega utilizando su sistema de purificación (Shoenfeld, T., J. Méndez, D. Storts, E. Portman, B. fPatterson, J. Frederiksen y C. Smith, 1995. Efectos de las cepas bacterianas que poseen el genotipo endAl sobre la calidad del ADN aislado con sistemas de purificación de plásmidos Wizard. Promega notas 53). Su conclusión es la siguiente: la calidad del ADN preparado a partir de los mutantes endA es globalmente mejor que aquella del ADN preparado en las cepas endA+ probadas.

La calidad de las preparaciones de ADN plasmídico es pues afectada por cualquier contaminación por esta endonucleasa (degradación del ADN para más o menos largo plazo) .

La supresión o la mutación del gen endA puede ser considerada sin problema en la medida donde los mutantes no presenten más esta actividad endonucleasa, comportándose globalmente como las bacterias silvestres (Dürwald, H. Y H. Hoffmann-Berling (1968) J. Mol. Biol. 34:331-346) .

El gen endAl puede ser inactivado por mutación, supresión total o parcial, ruptura, etc. La inactivación del gen endA de la cepa de E . coli elegida para producir los plásmidos pCOR, puede ser más particularmente realizada transfiriendo, gracias al bacteriófago Pl, la supresión ?endA: : TcR descrita por Cherepanov y Wackernagel (Cherepanov, P. P. Y W. Wackernagel. 1995. Gene disruption in Escherichia coli : TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excisión of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158:9-14) o intercambiando el alelo silvestre presente en el genoma de la bacteria de interés con un alelo mutado o suprimido de endA, y esto mediante recombinación homologa. La utilización de este tipo de cepa en el marco de la presente invención permite mejorar ventajosamente la calidad del ADN producido.

La invención se refiere igualmente a cualquier célula recombinante que contenga una molécula de ADN tal como se define anteriormente. Se puede tratar de células de orígenes diversos, de tipo eucariótico, procariótico, etc.

Estas células son obtenidas mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia, que permitan la introducción de dicho plásmido en una célula dada. Se puede tratar principalmente de la transformación, electroporación, conjugación, fusión de protoplastos o cualquier otra técnica conocida por el experto en la materia.

Las moléculas de ADN de acuerdo a la invención pueden ser utilizadas en cualquier aplicación de vacunación o de terapia génica y celular, para la transferencia de un gen a un organismo, un tejido o una célula dada, o para la producción de proteínas recombinantes in vi tro .

En particular, éstas pueden ser utilizadas para una administración directa in vi vo, o para la modificación de células in vi tro o ex vi vo, con miras a su implante a un paciente.

A este respecto, otro objetivo de la presente invención se refiere a cualquier composición farmacéutica que comprenda al menos una molécula de ADN tal como se define anteriormente. Esta molécula puede estar o no asociada a un vector químico y/o bioquímico de transfección. Puede tratarse principalmente de cationes (fosfato de calcio, DEAE-dextrano, etc.), de liposomas, etc.. Los vectores sintéticos asociados pueden ser lípidos o polímeros catiónicos. Se pueden citar como ejemplos de tales vectores el DOGS ( Trans fectamMR) o el DOTMA (lipofectinaMR) .

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención pueden ser formuladas con miras a administraciones mediante la vía tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, transdérmica, etc. De preferencia, el plásmido reivindicado es utilizado bajo una forma inyectable, o en aplicación éste puede ser mezclado con cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, principalmente para una inyección directa a nivel del sitio a tratar. Se puede tratar en particular de soluciones estériles, isotónicas, o de composiciones anhidras, principalmente liofilizadas que, mediante adición de acuerdo al caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de solutos inyectables. Se puede tratar principalmente de amortiguadores de Tris o PBS diluidos en glucosa o en cloruro de sodio. Una inyección directa en la región en cuestión del paciente es interesante, puesto que permite concentrar el efecto terapéutico a nivel de los tejidos afectados. Las dosis utilizadas pueden ser adaptadas en función de diferentes parámetros, y principalmente en función del gen, del vector, del modo de administración utilizado, de la patología en cuestión o incluso de la duración del tratamiento buscado .

Las moléculas de ADN de la invención pueden incluir uno o varios genes de interés, es decir uno o varios ácidos nucleicos (ADNc, ADNg, ADN sintético o semisintético, etc.) donde la transcripción y eventualmente la traducción en la célula objetivo generan productos que tienen un interés terapéutico, de vacuna, agronómico, o veterinario.

Entre los genes de interés terapéutico, se pueden citar más particularmente los genes que codifican para las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas: interleucinas, interferones, TNF, etc. (Patente Francesa FR 9203120), los factores de crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, los factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc.; las apolipop-roteínas : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc. (Patente Francesa FR 93 05125), la distrofina o una minidistrofina (Patente Francesa FR 9111947), los genes supresores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc. (Patente Francesa FR 93 04745), los genes que codifican para los factores implicados en la coagulación: Factores VII, VIII, IX, etc., los genes suicidas: timidina-cinasa, citosina-desa inasa, etc.; o incluso toda o parte de una inmunoglobulina natural o artificial (Fab, ScFv, etc.), un ARN ligando (Patente Internacional W091/19813) etc. El gen terapéutico puede igualmente ser un gen o una secuencia antisentido, donde la expresión en la célula objetivo permite controlar la expresión de genes o la transcripción de ARNm celulares. Tales secuencias pueden por ejemplo ser transcritas, en la célula objetivo, en ARNs complementarios de -los ARNm celulares y bloquear así su traducción en proteína, de acuerdo a la técnica descrita en la Patente Europea EP 140 308.

El gen de interés puede también ser un gen para vacuna, es decir un gen que codifica para un péptido antigénico, capaz de generar en el ser humano o en un animal una respuesta inmune, con miras a la realización de vacunas. Se puede tratar principalmente de péptidos antigénicos específicos del virus de epstein barr, del virus VIH, del virus de la hepatitis B (Patente Europea EP 185 573), del virus de la pseudo-rabia, o incluso específicos de tumores (Patente Europea EP 259 212) .

En general, en las moléculas de ADN de la invención, el gen de interés terapéutico, de vacuna, agronómico o veterinario contiene igualmente una región promotora de la transcripción funcional en la célula u organismo objetivo, así como una región situada en dirección 3', y que especifica una señal de final de la transcripción y un sitio de poliadenilación. Respecto a la región promotora, se puede tratar de una región promotora naturalmente responsable de la expresión del gen considerado cuando ésta es susceptible de funcionar en la célula o en el organismo en cuestión. Se puede tratar igualmente de regiones de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o incluso sintéticas). Principalmente, se puede tratar de secuencias promotoras de los genes eucariotes o virales. Por ejemplo, se puede tratar de secuencias promotoras provenientes del genoma de la célula objetivo. Entre los promotores eucariotes, se puede utilizar cualquier promotor o secuencia derivada que estimule o que reprima la transcripción de un gen de manera específica o no, inducible o no, fuerte o débil. Se puede tratar en particular de promotores ubicuos (promotor de los genes HPRT, PGK a-actina, tubulina, etc.), de promotores de los filamentos intermediarios (promotor de los genes GFAP, desmina, vimentina, neurofilamentos, queratina, etc.), de promotores de los genes terapéuticos (por ejemplo el promotor de los genes MDR, CFTR, Factor VIII, ApoAI, etc.), de promotores específicos de los tejidos (promotor del gen de la piruvato-cinasa, vilina, proteína intestinal de unión a los ácidos grasos, a-actina del músculo liso, etc.) o incluso promotores que responden a un estímulo (receptor de las hormonas esteroides, receptor del ácido retinoico, etc.). De igual modo, se puede tratar de secuencias promotoras provenientes del genoma de un virus, tal como por ejemplo los promotores de los genes E1A y MLP de adenovirus, el promotor precoz de CMV, o incluso el promotor de LTR de RSV, etc. Además, estas regiones promotoras pueden ser modificadas mediante adición de secuencias de activación, de regulación, o que permiten una expresión específica del tejido o mayoritaria.

Por otro lado, el gen de interés puede igualmente incLuir una secuencia de señal que dirige el producto sintetizado hacia las vías de secreción de la célula objetivo. Esta secuencia de señal puede ser la secuencia de señal natural del producto sintetizado, pero puede igualmente tratarse de cualquier otra secuencia de señal, funcional, o de una secuencia de señal artificial.

Según el gen de interés, las moléculas de ADN de la invención pueden ser utilizadas para el tratamiento o la prevención de numerosas patologías, incluyendo las enfermedades genéticas (distrofia, fibrosis quística, etc.), las enfermedades neurodegenerativas (alzheimer, parkinson, ALS, etc.), los cánceres, las patologías ligadas a los desórdenes de la coagulación o a las dislipoproteinemias, las patologías ligadas a las infecciones virales (hepatitis, SIDA, etc.), o en los dominios agronómico y veterinario, etc.

Por otro lado, la presente invención concierne igualmente a la utilización de moléculas de ADN para la replicación condicional, para la producción de proteínas recombinantes. Las bacterias pueden ser utilizadas para producir proteínas de orígenes diversos, eucariotes o procariotes. Entre las bacterias, E. coli constituye el organismo de elección para la expresión de genes heterólogos en virtud de su manipulación facilitada, del número importante de los sistemas de expresión disponibles y de las cantidades importantes de las proteínas que se pueden obtener. Se entiende que el sistema de la invención es utilizable en otros organismos, siendo determinado el tropismo por la naturaleza del origen de la replicación, como se indica anteriormente. Para esta utilización, la secuencia nucleica de interés comprende una región codificante bajo el control de las señales de expresión apropiadas para el huésped elegido, en particular un huésped procariote. Se puede tratar por ejemplo de los promotores Plac, Ptrp, PT7, Ptre, Ptac, PL, PR, la secuencia Shine-Dalgarno, etc. (este conjunto constituye el cásete de expresión) . La secuencia de ácido nucleico de interés puede ser cualquier secuencia que codifica para una proteína que presente un interés en los dominios de la farmacia, de la industria agroalimentaria, de la química o de la agroquímica. Se puede tratar de un gen estructural, de una secuencia de ADN complementaria, de una secuencia sintética o semisintética, etc.

El cásete de expresión puede ser introducido sobre el vector para la replicación condicional que es el objetivo de la invención, constituyendo de este modo un vector para la replicación condicional que permite la replicación de proteínas de interés en E. coli. Este vector presenta varias ventajas: la no utilización de antibiótico para la selección en bacterias (menor costo, la no necesidad de estudio en cuanto a la presencia en el producto acabado de antibiótico, o de productos derivados potencialmente tóxicos), la probabilidad prácticamente nula de diseminación del plásmido en la naturaleza (origen de replicación condicional), la posible fermentación en el medio totalmente definido. Los ejemplos presentes muestran las propiedades ventajosas de estos vectores condicionales para la producción de proteínas recombinantes .

La presente invención será más completamente descrita con ayuda de los ejemplos siguientes, que deben de ser considerados como ilustrativos y no limitantes .

Descripción de los Dibujos: Figura 1: Organización funcional de la región de R6K implicada en la replicación.

Figura 2: Organización de los dominios funcionales de la proteína p del plásmido R6K.

Figura 3: Representación del protocolo de introducción del gen pir en el genoma de E. coli XACl.

Figura 4: Esquema de construcción de los vectores pXL2666, 2730 y 2754.

Figura 5: Construcción de pXL2774.

Figura 6: Cinética de crecimiento y de producción en el fermentador de 2 litros.

Figura 7: Cinética de crecimiento y de producción en el fermentador de 800 litros.

Figura 8: Construcción de pXL3056.

Figura 9: Visualización de la proteína aFGF producida por E. coli XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23 ) después de la inducción. Los extractos celulares totales desnaturalizados son colocados sobre gel de poliacrilamida al 12.5%-SDS. M: marcador de masa molecular (Biorad de bajo rango) . Cada banda es identificada por una flecha y una cifra que indica su masa en kiloDaltones . 1: XAC-lpir-116 (pXL3056+pUC4K) no inducido; 2: XAC-lpir-116 (pXL3056+pUC4K) inducido a 42°C; 3: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23 ) clon 1, no inducido; 4: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23 ) clon 1, inducido a 42°C; 5: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23 ) clon 2, no inducido; 6: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23) clon 2, inducido a 42°C; ti: 1 µg de aFGF purificado; t4: 4 µg de aFGF purificado.

Figura 10: Esquema de construcción de los vectores pXL3029 y pXL3030.

I - MATERIALES Y MÉTODOS A) Materiales 1) Medios de cultivo Los medios completos LB, 2XTY y SOC, el medio mínimo M9 (Maniatis y colaboradores, 1989) han sido utilizados. Los medios gelificados han sido obtenidos mediante adición de 15 g de agar Difco. Además, si es necesario, estos medios han sido complementados con los antibióticos, ampicilina o kanamicina, a las concentraciones respectivas de 100 mg/l y de 50 mg/l. Los sustratos cromógenos X-Gal y X-Gluc han sido µtilizados a la concentración de 40 mg/l. 2) Cepas de E. coli, plásmidos y bacteriófagos Las cepas de E. coli, los plásmidos y los bacterióf gos utilizados son identificados respectivamente en los ejemplos siguientes.

B) Métodos 1) Manipulación del ADN El aislamiento del ADN bacteriano (plasmídico, genómico) y fágico (forma replicativa de M13), las digestiones por las endonucleasas de restricción, las ligaduras de los fragmentos de ADN, la electroforesis en gel de agarosa (en amortiguador TBE) y otras técnicas estándares han sido realizadas siguiendo las recomendaciones de los proveedores, para la utilización de enzimas, o conformándose a los protocolos descritos en "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (Maniatis y colaboradores, 1989) .

Los marcadores de tamaño de ADN utilizados luego de las electoforesis, son los siguientes: escala 1 kpb (BRL) para los fragmentos lineales y el marcador de ADN superenrollado (Stratagene) para los plásmidos no digeridos.

El secuenciamiento ha sido realizado de acuerdo a la técnica de Sanger (sanger y colaboradores, 1977) adaptada al método automatizado que utiliza los didesoxinucleótidos fluorescentes y la ADN-polimerasa Taq (PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems) .

Los oligodesoxinucleótidos utilizados (designados por "seq+n°", ver más adelante) han sido sintetizados sobre el sintetizador "Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthesizer" por el método de las fosforamiditas, utilizando los grupos protectores ß-cianoetilos (Sinha y colaboradores, 1984). Después de la síntesis, los grupos protectores son eliminados mediante tratamiento con amoniaco. Dos precipitaciones con butanol permiten purificar y concentrar el oligonucleótido (Sawadogo y colaboradores, 1991).

Secuencia de los oligonucleótidos utilizados para la amplificación por PCR: SEQ ID No. 3 5' -GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3' SEQ ID No. 4 5' -GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3 ' SEQ ID No. 5 5' -CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3' SEQ ID No. 6 5' -GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3 ' Las reacciones de PCR (Sa?ki y colaboradores, 1985) han sido realizadas en las condiciones siguientes, en un volumen total de 100 µl . La mezcla de reacción comprende 150 ng de ADN genómico de la cepa a estudiar, 1 µg de cada uno de los 2 cebadores oligonucleotídicos (24-mer) , 10 µl de amortiguador 10XPCR, cuya composición es la siguiente "KCl 500 mM, 0.1% de gelatina, MgCl2 20 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 7.5", y 2.5 unidades de ADN-polimerasa Taq (Amplitaq Perkin-Elmer) . Las condiciones de PCR, sobre el aparato ciclador térmico de ADN Perkin-Elmer Cetus, son las siguientes: 2 minutos a 91°C, 30 ciclos sucesivos de desnaturalización (1 minuto a 91°C), de hibridación (2 minutos a 42°C) y de alargamiento (3 minutos a 72°C), y finalmente 5 minutos a 72°C. Los productos obtenidos de este modo, digeridos o no con una enzima de restricción, son analizados mediante electroforesis sobre gel de agarosa.

El análisis de diferentes especies plasmídicas por las ADN-topo-isomerasas ha sido realizado de acuerdo al siguiente protocolo: Las enzimas, purificadas en su laboratorio, son incubadas durante 1 hora a 37°C. Las mezclas de reacción (volumen total: 40 µl) tienen la siguiente composición: 150 ng de plásmido, 300 ng de ADN-topo-isomerasa I, o 150 ng de ADN-girasa de E. coli, o 160 ng de ADN-topo-isomerasa IV de S. aureus y 20 µl de amortiguador específico de cada enzima. La composición de estos amortiguadores es indicada en seguida : para la ADN-topo-isomerasa I: Tris-HCl 50 M, pH 7.7, KCl 40 mM, DTT 1 mM, 100 µg/ml de SAB, MgCl2 3 mM, EDTA 1 mM; para la ADN-topo-isomerasa IV: Tris-HCl 60 mM, pH 7.7, MgCl2 6 mM, DTT 10 mM, 100 µg/ml de SAB, ATP 1.5 mM, glutamato de potasio 350 M; para la ADN-girasa: Tris-HCl 50 mM, pH 7.7, MgCl2 5 mM, ATP 1.5 mM, DTT 5 mM, 100 µg/ml de SAB, KCl M. 2) Transformación de E. coli Ésta ha sido realizada rutinariamente de acuerdo al método TSB (Amortiguador de Transformación y Almacenamiento) descrito por Chung y Miller (1988). Para una cepa como TG1 (Gibson y colaboradores, 1984), la eficacia de la transformación obtenida es del orden de 10 -106 transformantes por µg de pUC4K (Vieira y Messing; 1982). Cuando es necesaria una eficacia de transformación más elevada, las bacterias han sido transformadas mediante electroporación de acuerdo al protocolo postulado por el fabricante del aparato de electroporesis (Biorad) . Este método permite alcanzar eficacias de 108 a 1010 transformantes por µg de pUC4K. 3) Transfección celular mediada por un lipofectante catiónico Las células utilizadas son fibroblastos murinos NIH 3T3, sembrados el día precedente en placas de 24 pozos, a una densidad de 50,000 células por pozo. El medio de cultivo utilizado es el medio DMEM, que contiene 4.5 g/litro de glucosa, complementado con 10% de suero fetal de ternera y 1% de soluciones de glutamina 200 mM y de antibióticos (estreptomicina 5.103 mg/ml, penicilina 5.103 µg/ml) (Gibco). El ADN plasmídico (1 µg en 25 µl de NaCl al 9%) es mezclado, volumen a volumen, con una suspensión de lipofectante. Son probadas cuatro proporciones "cargas de lipofectante/cargas del ADN": 0, 3, 6 y 9. Estas proporciones son calculadas considerando que 1 µg de ADN plasmídico posee 3.1 nmoles de cargas negativas y que el lipofectante posee 3 cargas positivas por molécula. Después de un contacto de 10 minutos que permite la formación del complejo ADN/lípido, se introducen 50 µl de mezcla de ADN-lipofectante sobre las células en medio de cultivo sin suero (500 µl). Las células han sido previamente enjuagadas 2 veces con este mismo medio. La inhibición de la transfección por el suero es de este modo evitada. Después de la incubación (2 horas a 37°C en el incubador con C02) , el medio es adicionado con 10% de suero fetal de ternera. Las células son en seguida puestas a incubar durante 24 horas. 4) Medición de la actividad de luciferasa de las células eucarióticas Ésta se efectúa 24 horas después de la transfección. La luciferasa cataliza la oxidación de la luciferina, en presencia de ATP, de Mg2+ y 02, con producción concomitante de un fotón. La emisión total de luz, medida por un luminómetro, es proporcional a la actividad de luciferasa de la muestra. Los reactivos utilizados son proporcionados por Promega (sistema de ensayo de luciferasa) y utilizados de acuerdo al protocolo proporcionado. Después de la lisis de las células, la fracción insoluble de cada extracto es eliminada mediante centrifugación. La dosificación es efectuada sobre 5 µl de sobrenadante, diluido o no en el amortiguador de lisis de las células .

) Medición de la concentración proteica de los extractos celulares Ésta se efectúa de acuerdo al método BCA (Pierce) utilizando el ácido bicinconínico (Wiechelman y colaboradores, 1988) . El gamma-patrón de SAB es realizado en el amortiguador de lísis (ver III-B-4) . Las muestras a dosificar y aquellas de la gamma son pretratadas, volumen a volumen, con yodoacetamida 0.1 M/amortiguador Tris 0.1 M, pH 8.2, durante 1 hora a 37°C. Este tratamiento permite evitar la interferencia, al momento de la dosificación, del agente reductor (DTT) presente en el amortiguador de lisis. La lectura de la dosificación se efectúa a 562 nm .

EJEMPLO 1 : Construcción de cepas huéspedes XAC-lpir y pir-116 mediante recombinación homologa La cepa puesta en operación es la cepa E. coli XAC-1 (Normanly y colaboradores, 1980). Ventajosamente, el gen argE de esta cepa incluye una mutación de glutamina-53 (CAG) en el codón ámbar (TAG) (Meinnel y colaboradores, 1992) . El gen argE pertenece al operón divergente argECBH y codifica para una enzima de biosíntesis de la arginina, la N-acetilornitinasa . XAC-1 no puede entonces sintetizar la arginina y, en consecuencia, crece en medio de cultivo mínimo. Esta auxotrofía será elevada si la cepa abriga un plásmido que permita la expresión de un ARNt supresor. Será pues posible, mediante cultivo en medio mínimo, seleccionar las bacterias que incluyan un plásmido de este tipo. Para permitir la replicación de los plásmidos derivados de R6K, ha sido necesario introducir, mediante recombinación homologa, el gen pir en el genoma de XAC-1. El gen pir (silvestre o mutado) es introducido en el locus uidA mediante intercambio entre el gen uidA silvestre y una copia interrumpida por el gen pír (o pir-116) . El gen uidA codifica para una ß-glucuronidasa, enzima de hidrólisis de los ß-glucurónidos . Este gen puede ser inactivado sin problema, puesto que éste no es esencial para el crecimiento en los medios sintéticos clásicos, en los cuales los ß-glucurónidos no son utilizados. Además, la actividad ß-glucuronidasa puede ser seguida gracias a un sustrato cromógeno, el X-Gluc, cuya hidrólisis libera un pigmento azul. 1) Construcción de un vector suicida que posee el cásete "KmR-uidA: :pir (o pir-116) Se ha utilizado una estrategia que implica un solo huésped bacteriano y que minimiza las modificaciones del genoma de la cepa de interés. El fago M13mpl0 (Messing y Vieira, 1982) ha sido utilizado como vector suicida (Blum y colaboradores, 1989) . Una mutación ámbar en el gen II, esencial para la replicación, reduce el espectro del huésped de este M13 a las cepas, tal como TG1 { s upE) , que producen un ARNt supresor de ámbar; éste no podrá pues replicarse en las cepas de E. coli s up+ , como XAC-1.

Los casetes BamHl de 3.8 kpb, que contienen el gen de resistencia a la kana icina de Tn5 y _uidA: :pir o pir-116, han sido purificados, respectivamente, a partir de M13wm34 y 33 (Metcalf y colaboradores, 1994). Éstos han sido clonados en M13mpl0 linearizado con BamHl. Los clones recombinantes han sido seleccionados mediante esparcimiento sobre medio gelificado LB+Km, después electroporación en TG1 de las mezclas de ligadura. La conformidad de los clones obtenidos ha sido mostrada mediante análisis del perfil de restricción y mediante secuenciamiento de la región correspondiente a la mutación pi r-11 6. 2 ) Introducción mediante recombinación homologa de los genes pi r o pi r-1 1 6 en el genoma de E. coli XAC-1 La estrategia adoptada y los diferentes eventos implicados se presentan en la Figura 3. a) Primer even t o de recombinaci ón La cepa XAC-1 ha sido transformada mediante electroporación con 10, 100 ó 2000 ng de cada RF (m?l0-_uidA: :pir o pir-116) . Un tercio de cada mezcla de expresión ha sido distribuido sobre cajas LB que contienen kanamicina e incubado toda la noche a 37°C. Los fagos mplO-_uidA: : pir o pir-116 no pueden replicarse en la cepa XAC-1 (sup+) . El marcador KmR no puede entonces mantenerse más que por integración en el genoma de la bacteria, vía una recombinación homologa con la copia silvestre del gen ui dA . Los resultados de las electroporaciones de XAC-1 se presentan en la Tabla 1. La eficacia de transformación obtenida sería de 4 x 109 transformantes por µg de pUC4K.

TABLA 1 En las condiciones probadas, el número de integrantes crece de manera no lineal con la cantidad de ADN. Conociendo la eficacia de transformación y el tamaño de los RF (11.7 kpb) , se puede tener una idea aproximada de la tasa de recombinación. Considerando el punto a 100 ng, se obtiene una frecuencia de recombinación del orden de 10"6. b) Segundo evento de recombinaci ón El segundo evento de recombinación será en seguida seleccionado por la resistencia de las cepas al desoxicolato (DcoR) .

Para hacer esto, 5 integrantes de cada construcción han sido puestos en cultivo en medio 2XTY adicionado de 0.2% de desoxicolato de sodio. Son evidentes dos poblaciones distintas. Ciertos clones dan un problema muy visible después de aproximadamente 8 horas a 37°C (dos clones para la construcción pi r y tres para la construcción pi r-11 6) . Los otros clones han dado un cultivo denso solamente después de una noche a 37°C. Éstos son casi todos Kms como se esperaba. Para cada uno de las electroporaciones estudiadas, han sido sembrados por estrías 50 descendientes Kms sobre LB adicionado de X-Gluc. Después de 48 horas a 37°C, los clones UidA+ eran azul pálido luego de que éstos habían sufrido un reemplazo de alelo (caso No. 1, Figura 3), han quedado blancos sobre este medio (UidA") . La Tabla 2 resume el análisis de los fenotipos de los recombinantes dobles obtenidos .

De 18 a 30% de dobles recombinantes han sufrido un reemplazo de alelo. TABLA 2 cepa número de Kms porcentaje de entre los DocR UidA" entre los Kms XAC-1 pir -2 50/50 18 XAC-1 pi r- 3 50/50 24 XAC-1 pir-4 50/50 34 XAC-1 pi r-1 1 6-1 50/50 32 XAC pir-11 6- 4 35/50 30 3) Control del carácter Pir+ de las cepas obtenidas mediante recombinación Con el fin de asegurar el carácter Pir+ de las cepas obtenidas mediante doble recombinación, se han transformado tres clones de cada construcción mediante pBW30 (Metcalf y colaboradores, 1994). La obtención de transformantes para todas las cepas probadas ha permitido mostrar la funcionalidad de los genes pi r y pi t-11 6 integrados en el genoma de XAC-1.

En las mismas condiciones, ningún transformante es obtenido con la cepa progenitora XAC-1. Se ha proseguido el estudio de 2 clones XAC-lpir (B y C) y 2 clones XAC-lpir-116 (E y D) . 4) Control mediante amplificación por PCR de las cepas obtenidas por recombinación Para confirmar el reemplazo de alelo, se ha controlado mediante amplificación por PCR las regiones genómicas por una parte y la otra del locus ui dA . Cada par de oligonucleótidos está constituido de un oligonucleótido que corresponde a una región interna de pi r y de un segundo oligonucleótido correspondiente a una región, cercana a ui dA cromosómico, pero no comprendida en el fragmento que ha servido para la recombinación. La secuencia de este último oligonucleótido ha sido determinada gracias a la secuencia ECOUIDAA de Genbank (número de acceso: M14641) . Se ha podido verificar de este modo la colocación exacta del gen pi r en el genoma de la bacteria. La naturaleza de los fragmentos amplificados, cuyo tamaño está conforme a aquel que se podría prever, ha sido confirmada mediante digestión con -Afluí.

EJEMPLO 2 Construcción de los vectores plasmídicos derivados de R6K que incluyen el marsador de selección sup Phe Se han construido vectores que incluyen el ori ? de R6K y el gen de resistencia a la kanamicina (pXL2666) . La observación de multímeros de pXL2666 en la cepa BW19610 (pi-r-116) 5 (Metcalf y colaboradores; 1993) ha llevado a estudiar el efecto del fragmento cer de ColEl sobre este fenómeno. Se ha introducido en seguida sobre el vector ori ?-KmR-cer (pXL2730) el cásete de expresión del ARNt supresor fenilalanina { s up Phe) . Este vector, pXL2760, sirve de base para la construcción de vectores utilizables en terapia génica . 1) Construcción y análisis de los vectores que incluyen el ori ? de R6K y el gen de resistencia a la kanamicina a) Construcciones En el primer plásmido construido, pXL2666, el gen de resistencia a la kanamicina proviene de pUC4K (Vieira y Messing; 1982) y el origen de replicación, contenido en un fragmento -EcoRI- amHI de 417 pares de bases, proviene del vector suicida pUT-T7pol (Herrero y colaboradores; 1990) (Figura 4) . La transferencia de pXL2666 en las cepas BW19094 y 19610 (Metcalf y colaboradores; 1994) ha permitido mostrar que la cantidad de plásmido está muy aumentada en una cepa pir-116, con relación al mismo plásmido en una cepa pi r . No obstante, el análisis por electroforesis de los plásmidos no digeridos muestra que este aumento va a la par con la aparición de algunas formas multiméricas . Probablemente, este fenómeno esté ligado a una recombinación intramolecular entre las múltiples copias del plásmido. Asi pues se ha construido pXL2730 clonando sobre pXL2666 el fragmento cer del plásmido natural de E. coli ColEl, donde se había mostrado que permitiría, en posición ci s , la resolución de los dímeros de los plásmidos (Summers y Sherrat, 1984). El fragmento utilizado corresponde a un fragmento Hpa l l de 382 pares de bases de ColEl (Leung y colaboradores, 1985) . Éste contiene un sitio de recombinación intermolecular específico; esto implica únicamente, para ser funcional, las proteínas del huésped con las recombinasas XerC y XerD, y los factores accesorios ArgR y PepA (Stirling y colaboradores, 1988, 1989; Colloms y colaboradores, 1990) . Para asegurar que los efectos observados sean bien debidos al fragmento cer, se ha construido también el plásmido control pXL2754 en el cual el fragmento cer está suprimido de 165 pares de bases.

Esta supresión ha sido mostrada como anuladora de la acción de cer sobre la resolución de los multímeros (Leung y colaboradores, 1985). Las diferentes etapas de clonación que conducen a la construcción de estos plásmidos se presentan en la Figura 4. b) Análisis cuantitativo y cualitativo de las especies plasmídicas «análisis mediante electroforesis en gel de agarosa El análisis mediante electroforesis de los diferentes plásmidos construidos ha permitido la puesta en evidencia de diversas especies plasmídicas, variables que siguen las cepas utilizadas. El tamaño de los plásmidos no digeridos ha sido evaluado con relación al marcador de ADN superenrollado. En la cepa pi r (BW19094), los plásmidos pXL2666, 2754 y 2730 están prácticamente completamente bajo la forma monomérica. Las bandas por arriba de cada banda principal corresponden a diferentes topo-isómeros, ligeramente menos superenrollados, como lo confirma el perfil observado después de la acción de la ADN-girasa con pXL2730.

En el caso de la cepa pir-116 (BW19610), los perfiles son diferentes: se observan con los plásmidos pXL2666 y 2754 diferentes especies que van del monómero a los multímeros (2, 3 ó 4 unidades), siendo mayoritaria la forma dimérica. Después de la digestión con EcoRI, no se encuentra más que el ADN plasmídico lineal; estas especies plasmídicas corresponden ya sea a los multímeros de los plásmidos, o bien a los diversos topo-isómeros. No obstante, el tamaño de las formas determinado después del marcador de ADN superenrollado que es un producto completo de aquel del plásmido monomérico, es muy probable que se trate de -multímeros. La formación de los multímeros es muy probablemente imputable a la mutación pir-116, aunque las dos cepas BW19094 y BW19610 no sean estrictamente isogénicas (BW19610 es recA) . El perfil obtenido con pXL2730 es diferente: aunque las formas multiméricas sean incluso visibles, la forma mayoritaria es la forma monomérica. El fragmento cer puede entonces facilitar la resolución de los multímeros del plásmido que se van a construir, y esto de manera independiente de recA, en BW19610. •análisis después del tratamiento con las ADN-topo-isomerasas Con el fin de desechar la hipótesis según la cual las formas observadas en las cepas que portan el alelo pir-116 serían los topo-isómeros particulares, cada preparación de plásmido ha sido sometida a la acción de las topo-isomerasas de ADN. Las actividades de las diferentes enzimas, en las condiciones experimentales son las siguientes: relajamiento del ADN para la ADN-topo-isomerasa I de E. coli, superenrollamiento negativo del ADN relajado para la ADN-girasa de E. coli, y desenmarañamiento de los ADN entrelazados y relajamiento del ADN superenrollado, con la ADN-topo-isomerasa IV de S . a ureus . La acción de la ADN-topo-isomerasa IV ha permitido mostrar que las formas plasmídicas de alto peso molecular no resultarían del enmarañamiento de varias moléculas de plásmidos; en este caso, éstas habrían sido luego convertidas en la especie monomérica. La funcionalidad de la enzima seguramente ha sido muy bien controlada sobre una preparación de ADN de cinetoplastos, compuesta de moléculas de ADN enmarañadas (no mostradas) . La actividad de relajamiento es también visible puesto que se obtienen especies que migran menos que en los testigos no tratados. La acción de la ADN-girasa ha permitido convertir los topo-isómeros ligeramente relajados en la especie más superenrollada extraída de la bacteria (monómero o dímero principalmente) . Además, ésta ha permitido verificar que los ADN preparados están principalmente bajo la forma superenrollada. Las muestras tratadas de este modo permiten confirmar los resultados precedentes en cuanto a las especies mayoritarias para cada construcción. La ADN-topo-isomerasa I tiene bien relajado el ADN pero de manera parcial. Esto podría ser debido al hecho de que los plásmidos estudiados no incluyen más que pocas zonas de hebra simple, sobre las cuales esta enzima se liga preferentemente (Roca, 1995) . 2) Introducción del marcador de selección s up Phe sobre pXL2730 Se ha utilizado el cásete de expresión del gen de ARNt's supresores, sintéticos (Phe) (Kleina y colaboradores, 1990). Esto introduce en la cadena polipeptídica en formación una fenilalanina, en respuesta a un codón TAG. Además, esto permite la producción en XAC-1 de una proteína ArgE suficientemente activa para permitir un buen crecimiento en medio carente de arginina. Sobre el plásmido pCT-2-F (Normanly y colaboradores; 1986), sup Phe es expresado de manera constitutiva a partir de un promotor sintético derivado de la secuencia del promotor del gen Ipp de E. coli, P?PP. Con dirección 3' de este gen, la detención de la transcripción es asegurada por el terminador sintético del operón rrnC de E. coli, Irme (Normanly y colaboradores, 1986) . Las diferentes etapas de clonación son indicadas en la Figura 5.

Las diferentes subclonaciones han sido realizadas en XAC-1. La funcionalidad del cásete de expresión del ARNt supresor es también controlada gracias a la actividad de la ß-galactosidasa de esta cepa que no existe más que cuando existe una supresión del codón ámbar del gen lacZun8am. La última etapa consiste en la introducción del cásete de expresión de s up Phe sobre pXL2730. Los resultados obtenidos con el fragmento cer [ B- l -b] han hecho elegir a este plásmido primero que pXL2666. Se ha conservado el gen de resistencia a la kanamicina para facilitar la clonación ulterior, principalmente para disponer de una selección suplementaria al momento de la clonación final (pérdida de KmR) .

EJEMPLO 3: Validación del vector plasmidico para aplicaciones en terapia génica mediante transfección de fibroblastos murinos . 1) Construcción del vector reportero pXL2774 Con el fin de probar la validez en terapia génica del sistema de producción de ADN plasmídico, se ha introducido sobre el pXL2760 un gen reportero, utilizable en las células eucariotas. Se ha utilizado el gen l uc que codifica para la luciferasa de Pho tin us pyral i s , puesto que la prueba de medición de la bioluminiscencia es muy sensible, lineal sobre una amplia gama y el ruido de fondo debido a la actividad endógena de las células eucariotas es muy débil. El gen l uc está bajo el control de las secuencias promotoras-amplificadoras de un gen precoz del citomegalovirus humano (promotor CMV) que permite una expresión a una tasa elevada. En dirección 3' de -Zuc se encuentra una región no traducida, proveniente del virus SV40, que contiene la señal de poliadenilación (poli(A)+). Después de una clonación intermediaria que permite aumentar el número de sitios de restricción disponibles, el cásete "promotor CMV-luc-poli(A)+" es introducido sobre el vector mínimo ori ?-cer-s up Phe (pXL2760) en lugar del marcador KmR . El plásmido resultante ha sido denominado pXL2774. La Figura 6 describe las diversas etapas de clonación. Las mezclas de ligadura han sido transformadas mediante electroporación en XAC- lpi r- 1 1 6. La incubación que permite a las bacterias la expresión de los marcadores de selección, se efectúa en medio rico (medio SOC) ; ha sido pues necesario lavar las células dos veces con el medio M9 antes de la difusión. Esto ha permitido eliminar el medio residual que habría entrañado un ruido de fondo de cultivo sobre el medio mínimo.

El medio elegido para diseminar las células sometidas a electroporesis es el medio mínimo M9, que permite seleccionar las bacterias que expresan un ARNt supresor, y así pues la presencia de los plásmidos de la invención. La adición de X-Gal permite, por la coloración azul, visualizar la expresión del ARNt supresor. Las cajas son analizadas después de aproximadamente 20 horas a 37°C. La ausencia de colonias sobre el testigo sin ADN asegura que la selección es correcta, incluso con las siembras densas. Todos los clones examinados por restricción (8) incluyen también un plásmido, correspondiente al perfil esperado. El plásmido construido de este modo, pXL2774, ha sido preparado a partir de un clon cultivado en un litro de medio líquido M9 (aproximadamente 18 horas a 37°C), mediante una técnica que recurre entre otras cosas a un intercambio de iones (equipo Promega, MegaPreps) . La cantidad de ADN recogida es de 2 mg . 2) Análisis del vector reportero pXL2774 transfectado en las células de mamíferos La capacidad de pXL2774 para transfectar las células eucariotas y para permitir la expresión de la luciferasa, es evaluada mediante transfección en los fibroblastos murinos NIH 3T3. El vector elegido como referencia es el plásmido pXL2622 (se trata del plásmido pGL2 de Promega donde el promotor SV40 ha sido reemplazado por el promotor CMV) que incluye el mismo cásete de expresión de la luciferasa que pXL2774, pero sobre un replicón diferente. Este es un derivado de ColEl, de 6.2 kpb, que incluye el gen de 5 resistencia a la ampicilina. Este plásmido sirve de testigo. Las actividades de luciferasa (expresada en RLU, o unidades relativas de luminiscencia) son indicadas en la Tabla 3.

Los mejores resultados han sido obtenidos con una proporción "cargas de lipofectante/cargas de ADN" de 6; en estas condiciones, pXL2622 y 2774 parecen equivalentes .

TABLA 3 (continuación) EJEMPLO 4: Verificación del carácter del vector suicida en E coli de los plásmidos pCOR Ha sido verificado el carácter no replicativo de los plásmidos de R6K tipo pCOR mediante un experimento de electroporación en E. coli JM109 (Yanisch-Perron y colaboradores, 1985) de los plásmidos pUC4K (ori ColEI-KmR, (Vieira y Messing, 1982)) y pXL2730 (ori gamma de R6K-KmR, ver ejemplo 2) . El aparato de electroporesis utilizado es el Gen 5 Pulser Biorad y las células JM109 electrocompetentes son preparadas y utilizadas de acuerdo al protocolo del fabricante ( electrotransformación bacteriana y manual de instrucción del controlador de pulsos, catálogo número 165-2098) .

Las células electrotransformadas han sido diseminadas sobre medio LB adicionado de kanamicina (50 mg/l) e incubadas toda la noche a 37°C. Los resultados obtenidos se presentan en seguida.

Resultados Estos resultados muestran que existe a lo mínimo 5 log de diferencia entre la eficacia de transformación de un derivado de ColEl (pUC4K) con relación a un derivado de R6K (pXL2730) en una cepa que no expresa el gen pi r . En una cepa pir+ como XAClpir-116, la eficacia de electrotransformación de los plásmidos derivados de R6K alcanza o sobrepasa clásicamente los 108 transformantes/µg de plásmido.

EJEMPLO 5: Producción de ADN plasmídico mediante cultivo a alta densidad de la cepa E. coli XAC-lpir-116 (pXL277 : Procedimiento de fermentación .1 Cepas : Producción en E. coli XAC-lpir-116 (Ejemplo 1), de un plásmido mínimo, pXL2774; este plásmido comprende los siguientes elementos: ori R6K-cer-tRNAamsupPhe y un cásete de expresión del gen reportero l uc bajo el control del promotor CMV (Ejemplo 3) . Se ha desarrollado un procedimiento de alta productividad para la producción de este tipo de plásmidos . .2 Medios y condiciones de cultivo: a) Medio de crecimiento: • Composición del medio definido utilizado para los cultivos de inoculo (g/1): Na2HP04 6, KH2P04 3, NaCl 0.5, NH4C1 1, NH4H2P04 3, glucosa 5, MgS04, 7H20, CaCl2, 2H20 0.015, tiamina HCl 0.010.

• Composición del medio complejo utilizado para los cultivos en lote de alimentación (g/1) : KH2P04 8, K2HP04 6.3, Na2HP04 1.7, (NH4)2S04 0.74, NH4C1 0.12, extracto de levadura 3, glucosa 2, MgS04, 7H20 2.4 g/1, CaCl2, 2H20 0.015, tiamina 0.010, solución de sales (Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Cu, B, Al) .

• Composición del medio definido para los cultivos medio de lote de alimentación idéntico al medio complejo, pero el extracto de levadura es reemplazado con 2.5 g/1 de NH4C1. b) Condiciones del cultivo en lote de alimentación: Los estudios en fermentadores de 2 litros (Setric France) que contienen 1 litro de medio han sido realizados con el fin de definir las condiciones óptimas de crecimiento y de producción de ADN plasmídico. El fermentador ha sido sembrado con 80 mi de un cultivo de inoculo llevado al comienzo de la fase estacionaria de crecimiento.

Durante la fermentación, el pH fue controlado y ajustado automáticamente entre 6.9 y 7.0, con amoniaco al 10% (p/v) ; la temperatura es mantenida a 37°C; la aireación ha sido fijada a 75 1/hora ((1.1 vvm) bajo una presión de 0.2 barias y el oxígeno disuelto ha sido controlado a (40%) de la saturación de aire por retroacción sobre la velocidad de agitación y, si es necesario, mediante enriquecimiento con oxígeno puro.

Todos los parámetros (pH, temperatura, agitación, densidad óptica, 02 y C02 en los efluentes gaseosos) han sido recolectados y calculados en línea por mediación de una interconexión HP3852 conectada a un Hewlett-Packard 9000.

La composición de base del medio de alimentación es la siguiente: fuente de carbono 50%, sulfato de magnesio 0.7%, tiamina 0.02%; para el medio complejo, se ha agregado el extracto de levadura a una concentración comprendida de preferencia entre 5 y 10%.

Con el fin de adaptar las condiciones de cultivo a los fermentadores de 800 litros, han sido realizadas las secuencias de producción que incluyen dos cultivos de inoculo sucesivos, a escala de laboratorio: el inoculo I en erlenmeyer agitado y el inoculo II en fermentador de 2 litros (cultivos en lote) , seguido por un cultivo de producción en lote de alimentación, en el fermentador de 7 litros. .3 Resultados Se han estudiado diferentes condiciones de cultivo en medio complejo, en medio definido, y a diferentes proporciones de crecimiento. En todos los casos, después de un cultivo inicial en lote de la cepa bacteriana y consumo de la fuente de carbono, el medio de alimentación ha sido agregado al fermentador gracias a una bomba peristáltica acoplada a un perfil de adición preprogramado. Este perfil ha sido deducido de experimentos anteriores en los cuales la proporción de alimentación había sido dominada ya sea a la proporción de oxígeno disuelto, o bien a una proporción de crecimiento constante.

Además, de manera para extrapolar sin dificultad las condiciones de fermentación de 2 litros para un termentador de 800 litros sin sobreoxigenación del medio, la demanda máxima de oxígeno al final del cultivo ha sido fijada a 2.5-3 mM/minuto. Para esto, la tasa o proporción de crecimiento del microorganismo ha sido reducida, si es necesario, mediante acción sobre el gasto de alimentación de la carga complementaria.

Como lo muestra la Tabla 4, han sido obtenidos muy buenos resultados a la vez en el medio complejo y en el medio definido, cualquiera que sea la escala de laboratorio o la escala de un fermentador de 800 litros; las cinéticas de crecimiento y de producción de ADN plasmídico son además comparables del todo (ver Figuras 6 y 7) .

X=biomasa (peso de las células secas) Los resultados globales hacen destacar que: el cambio de escala del fermentador de 2 litros a aquel de 800 litros puede ser efectuado sin problema alguno, el oxígeno consumido está fuertemente correlacionado a la biomasa producida (1.08 g de 02/g de biomasa producida) , el plásmido es estable durante al menos 50 generaciones sin presión de selección, se puede obtener una biomasa elevada, superior a 40 g de células secas/litro, en medio complejo, la producción de ADN plasmídico alcanza los 100 mg de ADN superenrollado/litro de medio, existe una muy buena correlación entre la producción de ADN y la biomasa: se puede estimar la producción a (1 mg de ADN plasmídico/unidad de densidad óptica), o bien (2.7 mg de ADN plasmídico/g de biomasa) , y cualquiera que sea la duración de la fermentación, la utilización de un medio definido que permite también lograr una biomasa (30 g de células secas/litro) y una producción de ADN plasmídico (100 mg/l) elevadas, y esto sin ninguna pérdida de la productividad.

EJEMPLO 6: Transferencia de pXL2774 en las células animales, in vi tro e in vivo 6.1 Transferencia in vi tro de pXL2774 en las células animales La capacidad del plásmido mínimo pXL2774 para transfectar diferentes líneas celulares ha sido probada in vi tro, tanto sobre las células de origen humano como de origen murino. El plásmido pXL2784 ha sido utilizado como testigo. Éste contiene el mismo cásete de expresión eucariótica (promotor CMV- luciferasa-poliA) que el pXL2774 pero éste es un derivado de ColEl de 6.4 kb que comprende el gen que confiere la resistencia a la kanamicina en E. coli.

Las células probadas son las siguientes: Las condiciones de transfección han sido las siguientes J-l: Siembra de las células a la densidad de 100,000 células por pozo de 2 cm2 (placa de 24 pozos) en medio DMEM (Medio Eagle modificado de Dulbecco) suplementado con 10% de suero fetal de ternera (SVF).

J-3: Transfección de células, con 10 µl de una solución de transfección que contiene: 0.5 µg de ADN, NaCl 150 mM, 5% de glucosa y 3 mmoles de lipofectante RPR120 535 por µg de ADN, en 250 µl de medio de cultivo, adicionado o no con 10% de SVF. Después de una incubación de 2 horas, el medio es reemplazado con 500 µl de medio DMEM adicionado con 10% de SVF.

J-4: Renovación del medio de cultivo J-5: Lavado de las células con PBS y después lisis con 100 µl de amortiguador de Lisis Promega (Amortiguador de Lisis Celular Promega E153 A) . La dosificación de la actividad de luciferasa se efectúa en un luminómetro Lumat LB 9501 (Berthold) sobre 10 µl de lisado, con una duración de integración de 10 segundos. El reactivo utilizado es aquel de Promega (Sustrato de Ensayo de Luciferasa Promega). Los resultados, reportados en las siguientes tablas, son expresados en RLU (Unidad de Luz Relativa) para 10 µl de lisado (promedio de medición sobre 4 pozos) . Los coeficientes de variación (CV) son también indicados.

Los resultados de las transfecciones en ausencia de suero se presentan en seguida.

Los resultados de las transfecciones en presencia de suero (10%) se presentan en seguida: Estos resultados hacen destacar la capacidad de pXL2774 para transfectar, i n vi tro, de manera eficaz, diferentes tipos celulares de origen tanto murino como humano. La expresión del gen reportero l uc permite mostrar que su eficacia de transfección es al menos tan buena como aquella de un plásmido "clásico", derivado de ColEl, que posee el mismo cásete de expresión de la luciferasa. 6.2 Transferencia in vi vo, en animal (ratón), de pXL2774 a) Modelo 1: ADN desnudo en el músculo tibial craneal de ratón El ADN plasmídico desnudo, en solución en "5% de glucosa, NaCl 150 mM", es inyectado en el músculo tibial craneal de ratón OF1. Los músculos son extirpados 7 días después de la inyección, desmenuzados, homogeneizados en 750 µl de amortiguador de lisis (Amortiguador de Lisis Celular Promega E153A) y después centrifugados a 20,000 x g durante 10 minutos .

La dosis de actividad de luciferasa es realizada sobre 10 µl de sobrenadante después de la adición de 50 µl de reactivo (Sustrato de Ensayo de Luciferasa Promega) . La lectura se efectúa sobre el luminómetro Lumat LB9501 (Berthold) con una duración de integración de 10 segundos.

Los resultados se presentan en la Tabla siguiente .

Estos resultados indican que un plásmido con replicación condicional como pXL2774 es muy capaz de transfectar las células musculares de ratón in vi vo y esto con una eficacia comparable, además de que es superior a aquella de un plásmido "clásico", derivado de ColEl, que incluye el mismo cásete de expresión del gen de la luciferasa. b) Modelo 2: modelo tumoral 3T3 HER2 El modelo es el siguiente: Ratón de tipo Swis/desnudo, hembras adultas Tumores experimentales inducidos después de la inyección de 107 células 3T3 HER2 por la vía subcutánea al nivel del flanco La inyección de la mezcla de transfección es realizada 7 días después de la inyección de las células .

Soluciones inyectadas: El ADN es primeramente solubilizado en el amortiguador. Después de la adición de todos los productos, la mezcla contiene, además del ADN, NaCl (150 mM) y D-Glucosa al 5% en agua o el amortiguador HEPES 5 M .

Dos días después de la inyección, el tejido tumoral es extraído, pesado y después desmenuzado y homogeneizado en 750 µl de amortiguador de lisis (Amortiguador de Lisis Celular Promega E153 A) . Después de la centrifugación (20 000 x g durante minutos), se obtienen 10 µl de sobrenadante que permiten la evaluación de la actividad de luciferasa.

Esta actividad es determinada mediante la medición de la emisión luminosa total obtenida después del mezclado con 50 µl de reactivo (Sustrato de Ensayo de Luciferasa Promega) en un luminómetro Lumat LB 9501 (Berthold) con una duración de integración de 10 segundos .

La actividad resultante es expresada en RLU (Unidades Luminosas Relativas) estimada en la totalidad del sobrenadante de lisis tumoral.

Resultados Estos resultados indican que un plásmido con replicación condicional, como pXL2774, es muy capaz de transfectar las células tumorales de ratón i n vi vo y esto con una eficacia al menos comparable a aquella de un plásmido "clásico", derivado de ColEl, que incluye el mismo cásete de expresión del gen de la luciferasa.

Estos diferentes experimentos han permitido demostrar que los plásmidos con replicación condicional, y más particularmente pXL2774, presentarían también las características de transfección de las células animales, indispensables para una utilización en terapia génica. De manera más precisa, se ha demostrado: 1) la capacidad de pXL2774 para transfectar eficazmente, i n vi tro, diferentes tipos celulares, de origen humano o murino; 2) la capacidad de pXL2774 para transfectar, in vi vo, el músculo del ratón; 3) la capacidad de pXL2774 para transfectar, in vi vo, las células tumorales implantadas en el ratón.

Los experimentos de electrotransformación, de fermentación y de transfección han permitido pues validar los plásmidos con replicación condicional como el vector, utilizados en terapia génica mostrando: i) que éste no se replicaría de manera detectable en una cepa de E. coli que no exprese el gen pi r (origen de replicación condicional) ; ii) que éstos podrían ser producidos a una escala compatible con una producción industrial, en un medio que puede ser totalmente definido y que no contiene antibióticos; iii) que estos plásmidos podrían transfectar, i n vi tro y sobre todo in vi vo a las células mamíferos.

EJEMPLO 7: Producción de Proteínas recombinantes in vi tro 7.1 Construcción del vector de expresión Con el fin de mostrar la factibilidad de un procedimiento de este tipo, se ha construido un vector de expresión de acuerdo a los criterios descritos anteriormente (Ejemplos 2 y 3) . Este vector, pXL3056, contiene : 1) la parte bacteriana que comprende el origen de replicación condicional (ori gamma) , el fragmento cer de ColEl y el gen que asegura la selección en la bacteria (sup) . 2) el cásete de expresión, basado en el sistema descrito por Studier (Studier y colaboradores, 1990), comprende el promotor del gen 10 del bacteriófago T7, el operador lacO, el gen que codifica para la aFGF 154 (Factor de Crecimiento de Fibroblastos ácido o factor de crecimiento ácido de fibroblastos, forma que incluye 154 aminoácidos) (Jaye y colaboradores, 1986) , el terminador TF del bacteriófago T7. Este cásete de expresión es idéntico a aquel presente sobre el plásmido pXL2434 descrito en la Solicitud Internacional WO96/08572.

La construcción de pXL3056 es presentada en la Figura 8. El fragmento EcoRI-BglII de pXL2434 (1.1 kb) que contiene el cásete de expresión de aFGF es clonado en el vector de replicación condicional pXL2979 (fragmento purificado de 1.1 kb) a los sitios Bglll y EcoRI para generar pXL3056.

PXL2979 resulta de la ligadura de 3 fragmentos: i) fragmento AccI-Xbal de pXL2730 (0.8 kb, que aporta ori gamma y cer); ii) fragmento Narl-Sall de pXL2755 (0.18 kb, que aporta el gen sup Phe); iii) fragmento Sall-Spel de pXL2660 (1.5 kb que aporta el gen que confiere la resistencia a la kanamicina) .

PXL2660 resulta de la clonación del fragmento PstI de 1.2 kb de pUC4K (Vieira y Messing, 1982) en pMTL22 (Chambers y colaboradores, 1988) linearizado con PstI . 7.2 Obtención de la cepa de expresión El plásmido pXL3056 es introducido mediante transformación en la cepa XAC-lpir-116. La cepa resultante es en seguida transformada por el plásmido PT7pol23 (Mertens y colaboradores, 1995), a 30°C. Con el fin de expresar el gen de interés bajo el control del promotor T7, la bacteria debe de contener, en su genoma, sobre un plásmido o un bacteriófago, un cásete que permite la expresión de la ARN-polimerasa del bacteriófago T7. En el ejemplo descrito, se ha utilizado el plásmido PT7pol23, compatible con los derivados de R6K tal como pXL3056, y que permite la expresión inducible por la temperatura de la ARN-polimerasa del bacteriófago T7. No obstante, se puede considerar también el lisogenizar la cepa XAC-lpir-116 por lambda DE3 (Studier y colaboradores, 1990) con el fin de no conservar más que un plásmido e inducir la producción de la ARN-polimerasa de T7 más bien por IPTG que por la temperatura. 7.3 Expresión de aFGF La cepa XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23 ) es cultivada a 30°C, en medio mínimo M9 adicionado con 0.2% de casaminoácidos (DIFCO) y de kanamicina (25 µg/ml), hasta una densidad óptica de 600 nm de 0.6-1. La mitad del cultivo es en seguida colocada a 42°C (inducción de la ARN-polimerasa de T7) mientras que la otra mitad queda a 30°C (testigo negativo) . El mismo experimento es proporcionado con la cepa XAC-lpir-116 (pXL3056+pUC4K) que constituye un testigo de expresión de aFGF en ausencia de ARN-polimerasa de T7.

Los resultados obtenidos son presentados en la Figura 9. Éstos muestran que la producción de aFGF es comparable o superior a aquella observada con BL21 (DE3) (pXL2434) (WO96/08572) lo que muestra muy bien las potencialidades de los plásmidos para la replicación condicional, para la expresión de las proteínas recombinantes in vi tro, principalmente en E. coli .

EJEMPLO 8: Construcción de un vector pCOR que expresa una proteína p53 silvestre o híbrida Este ejemplo describe la construcción de vectores para la replicación condicional de acuerdo a la invención, que contiene un ácido nucleico que codifica para una proteína p53. Estos vectores son utilizables para restaurar una actividad de tipo p53 en las células deficientes (mutadas, suprimidas), principalmente tales como las células tumorales.

El cásete de expresión eucariótico contiene los siguientes elementos: 1) promotor precoz CMV "temprano inmediato" (posiciones -522 a +72) seguido de la secuencia guía del gen de la timidina-cinasa del virus del herpes simple tipo I (posición -60 a +1 del gen, haciendo referencia a la secuencia del artículo McKnight, S.tL. (1980) Nucleic Acids Res. _8: 5949-5964 ) ; 2) un ácido nucleico que codifica para la proteína p53 silvestre o para una variante de p53 tal como se describe en la solicitud PCT/FR96/01111 (variante V325K = V325 con una secuencia Kozal en el ATG) ; 3) la secuencia de poliadenilación poliA de SV40.

Estos elementos han sido colocados bajo la forma de un fragmento Ascl-Xbal sobre el vector pCOR pXL2988 entre los sitios BssHII y Spel . pXL2988 es idéntico a pXL2979 (ejemplo 7.1) aparte de la presencia de un elemento suplementario, una secuencia capaz de formar una triple hélice de ADN compuesta de 17 veces el trinucleótido GAA, colocado en el costado del origen de replicación gamma.

Los plásmidos resultantes son nombrados pXL3029 y 3030 (Figura 10) .

La funcionalidad de estas construcciones ha sido verificada in vi tro sobre las células p53-SAOS2 en cultivo mediante la medición de la actividad del activador transcripcional de p53 o p53superWT BIBLIOGRAFÍA Alting-Mees, M.A., J.A. Sorge, y J. M. Short. 1992.

Methods Enzymol. 216:483-495. Blum, P., D. Holzschu, H. S. Kwan, D. Riggs, y S.

Artz. 1989. J. Bacteriol. 171:538-546. Brosius, J. 1989. Methods Enzymol. 216:469-483. Chambers, S.P., S. E. Prior, D. A. Barstow, y N. P.

Minton. 1988. Gene 68:139-149. Chung, C. T., and R. H. Miller. 1988. Nucleic Acids Res. 16:3580. Colloms, S. D., P. Sykora, G. Szatmari, y D. J.

Sherrat. 1990 J. Bacteriol. 172:6973-6980. Datta, N., y P. Kontomichalou . 1965. Nature 208:239-241. Dickely, F., D. Nilsson, E. B. Hansen, y E. Johansen. 1995. Mol. Microbiol. 15:839-847. Filutowicz, M., S. Dellis, I. Levchenko, M. Urh, F.

Wu, y D. York, 1994. Prog. In Nucleic Acid Res. And Mol. Biol. 48:239-273. Gibson, T. J. 1984. PH . D. Thesis. University of Cambridge . Greener, A., M. Filutowicz, M. McEachern, y D.

Helinski. 1990. Mol. Gen. Genet. 224:24-32.

BIBLIOGRAFÍA (continuación) Herrero, M., V. De Lorenzo, y K. N. Timmis. 1990. J.

Bacteriol. 172:6557-6567. Hodgson, C.P. 1995. Bio/Technology 13:222-225. Inuzuka, M., and Y. Wada . 1985. EMBO J. 4:2301-2307.

Jaye. M. et al., (1986) Science 233:541-5. Kleina, L. G., J. M. Masson, J. Normanly, J. Abelson, y J. H. Miller. 1990. J. Mol. Biol. 213:705-717. Kowalczykowski, S. C, y A. K. Eggleston. 1994. Annu .

Rev. Biochem. 63:9991-10043. Leung, D. W., E. Chen, G. Cachianes, y D. V. Goeddel. 1985. DNA 4:351-355. Maniatis, T., E. F. Fritsch, y J. Sambrook. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Meinnel, T., E. Schmitt, Y. Mechulam, y S. Blanquet. 1992. J. Bacteriol. 174:2323-2331. Mertens, N., E. Re aut y W. Fiers. (1995) Bio/Technology 13:175-179. Messing, J., y J. Vieira. 1982. Gene 19:269-276. Metcalf, W. W., W. Jiang, y B. L. Wanner. 1994. Gene 138:1-7. Miller, V. L., y J. J. Mekalanos. 1988. J. Bacteriol. 170:2575-2583.

BIBLIOGRAFÍA (continuación) Normanly. J., J. M. Masson, L. G. Kleina, J. Abelson, y J. H. Miller, 1986. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83?6548-6552. Normanly, J., L. G. Kleina, J. M. Masson, J. Abelson, y J. H. Miller. 1990. J. Mol. Biol. 213:719-726. Roca, J. 1995. TIBS 20:156-160. -Sa?ki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullís, G. T. Horn, H. A. Erlich, y N. Arnheim. 1985. Science 230: 1350-1354. Sanger. F., S. Nicklen, y A. R. Coulson. 1977. Proc.

Nati. Acad. Sci. USA 74:5463-5467. Sawadogo, M., y M. W. Van Dyke. 1991. Nucleic Acids Res. 19: 674. Scott, J. R. 1984. Microbiol. Rev. 48:1-23. Simoes, D. A., M. Dal Jensen, E. Dreveton, M. 0.

Loret, S. Blanchin-Roland, J. L. Uribelarrea, y J. M.

Masson. 1991. Ann. N. Y. Acad. Sci. 646:254-258. Simón, R., U. Priefer, y A. Pühler. 1983.

Bio/Technology 1:784-791. Sinha, N. D., J. Biernat, J. McManus, y H. Koster. 1984. Nucleic Acids Res. 12:4539-4557. Stirling, C. J., G. Stewart, y D. J. Sherrat. 1988. Mol. Gen. Genet. 214:80-84.

BIBLIOGRAFÍA (continuación) Stirling, C. J. , S. D. Colloms, J. F. Collins, G.

Szatmari, y D. J. Sherrat. 1989. EMBO J. 8:1623-1627. Studier, F. W., A. H. Rosenberg., J. J. Dunn, y J. W.

Dubendorff (1990). Methods Enzymol 185:60-89. Summers, D. K., y D. J. Sherrat. 1984. Cell 36:1097- 1103. Takahashi, K., Y. Sawasaki, J. Hata, K. Mukai y T. Goto (1990) In Vitro Cell Dev. Biol. 26:265-74. Vieira, J., y J. Messing. 1982. Gene 19:259-268. Wiechelman, K., R. Braun, y J. Fitzpatrick. 1988.

Anal. Biochem. 175:231-237. Yanisch-Perron, C. Vieira, y J. Messing (1985) Gene 33:103-119 13 LISTADO DE SECUENCIAS INFORMACIÓN GENERAL: i) SOLICITANTE: A) NOMBRE: RHONE POULENC RORER S.A. B) CALLE: 20, Avenue Raymond Aron C) CIUDAD: ANTONY E) PAÍS: FRANCIA F) CÓDIGO POSTAL: 92165 G) TELÉFONO: 40.91.69.22 H) TELECOPIA: (1) 40.91.72.96 ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MOLÉCULA DE ADN CIRCULAR CON ORIGEN DE REPLICACIÓN CONDICIONAL, SU PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN Y SU UTILIZACIÓN EN TERAPIA GÉNICA íii) NUMERO DE SECUENCIAS: 6 iv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: A) TIPO DE MEDIO: Cinta B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (OEB) ) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 1: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 389 pares de bases B) TIPO: nucleótido C) NUMERO DE HEBRAS: simple D) CONFIGURACIÓN: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 1 TGTCAGCCGT TAACTGTTCC TGTGTCACTG AAAATTGCTT TGAGAGGCTC TAAGGGCTTC 60 TCAGTCCCTT ACATCCCTGG CTTGTTGTCC ACAACCGTTA AACCTTAAAA GCTTTAAAAG 120 CCTTATATAT TCTTTTTTTT CTTATAAAAC TTAAAACCTT AGAGGCTATT TAAGTTGCTG 180 ATTTATATTA ATTTTATTGT TCA?ACATGA GAGCTTAGTA CGTGAAACAT GAGAGCTTAG 240 TACGTTAGCC ATGAGAGCTT AGTACGTTAG CCATGAGGGT TTAGTTCGTT AAACATGAGA 300 CCTTACTACG TTAAACATGA GAGCTTAGTA CGTGAAACAT GAGAGCTTAG TACGTACTAT 360 CAACACGTTG AACTGCTGAT CTTCAGATC 389 ) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID No. 2: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 960 pares de bases B) TIPO: nucleótido C) NUMERO DE HEBRAS: simple D) CONFIGURACIÓN: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 2 TATACAGAAT GATGAGCTTT TTTTATGAGA CTCAAGCTCA TCATGGACGT GAACAAAAAA 60 ACGAAAATTC GCCACCC?AA CGAGCTAAAT CACACCCTGG CTCAACTTCC TTTGCCCGCA 120 AAGCGAGTCA TGTATATCGC CCTTCCTCCC ATTGATAGCA AAGAACCTCT TGAACGAGGG 180 CCAGTTTTCA AAATTACGGC TCAAGACCTT GC?GCGCTCG CCAAAATCAC CCCATCGCTT 240 CCTTATCGAC AATTAAAAGA GGGTCCTAAA TTACTTGGTG CCAGCAAAAT TTCGCTAAGA 300 GGGGATGATA TCATTGCTTT AGCTAAAGAG CTTAACCTGC CCTTTACTCC TAAAAACTCC 360 CCTGAAGAGT TAGATCTTAA CATTATTGAG TCGATAGCTT ATTCAAATGA TGAAGGATAC 420 TTGTCTTTAA AATTCACCAG AACCATAGAA CCATATATCT CTAGCCTTAT TGGGAAAAAA 480 AATAAATTCA CAACGCAATT CTTAACGGCA AGCTTACGCT TAAGTAGCCA GTATTCATCT 540 TCTCTTTATC AACTTATCAG GAAGCATTAC TCTAATTTTA AGAAGAAAAA TTATTTTATT 600 ATTTCCGTTG ATGAGTTAA-A GG??GAGTTA ACAGCTTATA CTTTTGATAA AGATGGAAAT 660 ATTGAGTACA AATACCCTCA CTTTCCTATT TT AA?CGG ATGTCTTAAA TA?AGCCATT 720 CCTCAAATTA AA-AAGAAAAC AGAAATATCG TTTGTTGGCT TCACTGTTCA TGAAAAAGAA 780 GGAACAAAAA TTAGTAACCT CAAGTTCCAA TTTGTCCTTG ATGAAGATGA ATTTTCTGGC 840 CATAAAGATG ATGAACCTTT TTTTATGA?T TT?TCTGA?G CTGATGCAGC TTTTCTCAAG 900 GTATTTAATG AAACCCTACC TCCCAAAAAA CCTAAGCGGT G?T?T?TGGC TA?AATTTAC 960 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID No. 3: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 24 pares de bases B) TIPO: nucleótido C) NUMERO DE HEBRAS: simple D) CONFIGURACIÓN: lineal Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 3: GACCAGTATT ATTATCTTAA TGAG 24 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID No. 4: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 24 pares de bases B) TIPO: nucleótido C) NQMERO DE HEBRAS: simple D) CONFIGURACIÓN: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 4: GTATTTAATG AAACCGTACC TCCC 24 2) INFORMACIÓN PARA SECUENCIA SEQ ID No. 5: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 24 pares de bases B) TIPO: nucleótido C) NUMERO DE HEBRAS: simple D) CONFIGURACIÓN: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 5: CTCTTTTAAT TGTCGATAAG CAAG 24 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID No. 6. i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 24 pares de bases B) TIPO: nucleótido C) NUMERO DE HEBRAS: simple D) CONFIGURACIÓN: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 6: GCGACGTCAC CGAGGCTGTA GCCG 24 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (37)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ADN de forma circular, útil en terapia génica, que comprende al menos una secuencia nucleica de interés cuya traducción y eventualmente la traducción en la célula objetivo generan productos que tienen un interés terapéutico, de vacuna, agronómico o veterinario, caracterizada la molécula porque la región que permite su replicación comprende un origen de replicación proveniente de un plásmido o de un bacteriófago, donde la funcionalidad en la célula huésped requiere la presencia de al menos una proteína específica y extraña para dicha célula huésped.

2. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el origen de replicación condicional es proveniente de un plásmido o bacteriófago que posee un origen de replicación, representado por varios iterones, y que codifica para al menos una proteína específica, condicionando la funcionalidad de su origen de replicación.

3. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el origen de replicación condicional puede ser proveniente de los plásmidos o bacteriófagos siguientes RK2, R6K, Rl, pSClOl, Rtsl, F, RSF1010, Pl, P4, lambda, Phi82 y Phi80.

4. La molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizada porque dicho origen de replicación es proveniente del plásmido bacteriano R6K.

5. La molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el origen de replicación está constituido totalmente o en parte por el origen de replicación ? del plásmido R6K.

6. La molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el origen de replicación está representado total o parcialmente por la secuencia SEQ ID No. 1 o cualquier otra secuencia diferente de la secuencia SEQ ID No. 1, en virtud de una degeneración del código genético, o cualquier secuencia que se hibride con esas secuencias o con los fragmentos de éstas, y donde el producto posea la actividad de la proteína específica iniciadora de la replicación.

7. La molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la región que permite la selección de las células huéspedes que incorporan la molécula de ADN, es diferente de un gen de resistencia a un antibiótico.

8. La molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la región que permite la selección de las células huéspedes que incorporan la molécula de ADN, es representada total o parcialmente por un cásete de expresión de un ARN de transferencia supresor de los codones específicos.

9. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque se trata de un cásete de expresión de un ARNt supresor de codones ámbar (TAG) .

10. La molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende además una región objetivo de recombinasa específica del sitio.

11. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque esta región objetivo de recombinasa específica del sitio, puede ser elegida entre las resolvasas de los transposones Tn3_, Tn2JL_ o Tn522; la invertasa del bacteriófago mu, las resolvasas de los plásmidos, como aquel codificado por el fragmento par de RP4, las recombinasas de la familia de la integrasa del bacteriófago lambda, como las integrasas de lambda, Phi80, P22, Hpl, integrasa Cre de Pl, integrasa del plásmido pSAM2, FLP-recombinasa del plásmido 2µ, y las recombinasas XerC y XerD de E. coli.

12. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizada porque esta región objetivo de recombinasa específica del sitio, comprende todo o parte del fragmento cer de ColEl o de un fragmento más pequeño y que posea las mismas propiedades .

13. La molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque se trata del plásmido pXL2774 o cualquier otra construcción que se derive de pXL2774 y que incluya uno o varios genes de interés diferentes al gen de la luciferasa.

14. La molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico de interés codifica para una proteína de interés farmacéutico, agroalimentario o utilizable en biocatálisis .

15. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico de interés codifica para una proteína elegida entre las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas: interleucinas, interferones, TNF, etc., los factores de crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, los factores tróficos como BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, las apolipoproteínas como ApoAI, ApoAIV, ApoE, la distrofina o una minidistrofina, los genes supresores de tumores como p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, los genes que codifican para los factores implicados en la coagulación como Factores VII, VIII, IX, los genes suicidas como la timidina-cinasa, citocina-desaminasa, toda o parte de una inmunoglobulina natural o artificial como Fab, ScFv, un ARN ligando, una secuencia antisentido o péptidos antigénicos específicos del virus de epstein barr, del virus del VIH, del virus de la hepatitis B, del virus de la pseudorrabia, o incluso específicos de tumores.

16. Un procedimiento de producción de una molécula de ADN de forma circular, caracterizado porque se cultiva una célula huésped que contiene al menos : una molécula de ADN de forma circular que comprende al menos una secuencia nucleica de interés y una región que permite su replicación, que comprende un origen de replicación donde la funcionalidad en la célula huésped requiere la presencia de al menos una proteína específica y extraña para dicha célula huésped, y una proteína, expresada in si t u o no, que condiciona la funcionalidad de dicho origen de replicación, específica y extraña para la célula huésped, en condiciones que permite la selección de las células huéspedes transformadas por dichas moléculas de ADN.

17. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el gen que codifica para la proteína iniciadora de la replicación está presente sobre un replicón anexo o incorporado en el genoma de dicha célula.

18. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque se trata de una molécula de ADN que incorpora un origen de replicación tal como se define en las reivindicaciones 4 a la 6, y porque la proteína es o se deriva de la proteína p del plásmido R6K o difiere de esta proteína por modificación de su secuencia codificante o constituye un fragmento de esta proteína, siempre teniendo la misma actividad.

19. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la proteína p o uno de sus derivados es expresada in si t u a partir del gen pir representado en la SEQ ID No. 2 o cualquier secuencia diferente de la SEQ ID No. 2 en virtud de una degeneración del código genético, o :ual uier secuencia que se hibride ccr- estas ;e: e:.:ias o los fragmentos de éstas presentes en la :¿lula uésped, y donde el producto posea la actividad ie la croteina específica iniciadora de la •aplicación .

:edimien o de co fo midad cen icacior. -•. o^, carácter izaao porque ia prcteir-a es exerssada a partir del gen piriiß incorporado en ei a ce-

21. Ei procedimien o de conformidad con cualquiera de las rei indicaciones 16 a ia 21, ca acte izado porque uno de los genes indispensables en las condiciones de cultivo elegidas, de la célula nu sped, contiene un codón específico, reconocible por uoresor seleccionado a nivel de ia molécula

_ .. -» .- z. -. , caracte izado porque es -don ámbar TAG.

Ei procedimiento de conformidad con e u a _ ru i e a ? l s reivin icac iones 15 a l 2 , \ caracterizado porque la célula es elegida entre las cepas de E. coli.

24. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a la 23, caracterizado porque la célula es proveniente de la cepa de E. coli XAC-1.

25. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a la 24, caracterizado porque se pone en operación la cepa de E. coli XAC-1, que integra en su genoma el gen pirll6 y transformada por el plásmido pXL2774 o cualquier otra construcción que se derive de pXL2774 y que incluya uno o varios genes de interés diferentes al gen de la luciferasa.

26. Una célula recombinante, caracterizada porque es transformada por al menos una molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 15, o tal como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a la 25.

27. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una o varias moléculas de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 15.

28. El uso de una molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 15, para la transfección i n vi tro , ex vi vo y/o in vi vo de un gen de interés en una célula huésped.

29. El uso de una molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 15, para la producción de proteínas recombinantes i-n vi tro .

30. El procedimiento de producción de una proteína recombinante, caracterizado porque se cultiva una célula huésped que contiene al menos: una molécula de ADN de forma circular que comprende al menos una secuencia nucleica que codifica para dicha proteína recombinante, y una región que permite su replicación que comprende un origen de replicación donde la funcionalidad en la célula huésped prefiere la presencia de al menos una proteína específica y extraña para dicha célula huésped, y una proteína iniciadora, expresada in si t u o no, que condiciona la funcionalidad del origen de replicación, específica y extraña para dicha célula huésped, después se recolecta la proteína recombinante producida.

31. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el gen que codifica para la proteína iniciadora de la replicación está presente sobre un replicón anexo o incorporado en el genoma de la célula.

32. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 ó 31, caracterizado porque la célula es elegida entre las cepas de E. coli.

33. La molécula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia nucleica de interés codifica para una proteína p53 silvestre o modificada.

34. La molécula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia nucleica de interés codifica para una timidina-cinasa .

35. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la célula es una cepa de E. coli endAl .

36. La molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 15, caracterizada porque comprende además una secuencia capaz de interactuar específicamente con un ligando.

37. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el ácido nucleico de interés codifica para una proteína p53.