MXPA97009642A - Composiciones de enzima liquidas estables y metodos de uso - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones que contienen una enzima oftálmicamente aceptable de pureza i integridad altas en un medio líquido y métodos que involucran el uso de estas composiciones para limpiar lentes de contacto, y en combinación con un agente antimicrobiano para la limpieza y desingección simultáneas de lso lentes de contacto.

Description

COMPOSICIONES DE ENZIMA LÍQUIDOS ESTABLES Y MÉTODOS DE USO La presente solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente de E.U.fl. No. de serie 08/477,000, presentada el 7 de junio de 1995.

ANTECEDENTES DE Lñ INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de limpieza y desinfección de lentes de contacto. En particular, esta invención se refiere a composiciones de enzima líquidas y métodos para limpiar lentes de contacto usados por humanos con aquellas composiciones. La invención se refiere también a métodos para limpiar y desinfectar simultáneamente lentes de contacto combinando las composiciones de enzima líquidas de la presente invención con un agente desinfectante químico. Varias composiciones y métodos para limpiar lentes de contacto se han descrito en la literatura de patentes y científica. Algunos de estos métodos han empleado composiciones que contienen agentes tensioactivos o enzimas para facilitar la limpieza de los lentes. La primera discusión del uso de enzimas proteoliticas para limpiar lentes de contacto fue en un ar+iculo por Lo, y otros en Journal of The Pinerican Optóme* nc flssoc at on, volumen 40, paginas 1106-1109 (1969). Se han descrito métodos para remover depósitos de protema a partir de len+e de con+acto por medio de enzimas proteolitic s en muchas publicaciones desde el primer articulo por Lo, y otros, incluyendo la patente de E.U.fl. No. 3,910,296 (Karageozían y otros) . También se han descrito numerosas composiciones y métodos para desinfectar lentes de contacto. Aquellos métodos pueden caracterizarse por lo general porque involucran el uso de agentes de calor y/o químicos. Los agentes químicos representativos para este proposito incluyen antirnicrobiales orgánicos tales corno cloruro de benzalconio y clorhex dma, y antimicrobiales inorgánicos tales como peróxido de hidrogeno y compuestos que generan peróxido. Las patentes de E.U.fl. Nos. 4,407,791 y 4,525,346 (Stark) describen el uso de compuestos polirnencos de amonio cuaternario para desinfectar lentes de contacto y para conservar productos de cuidado de lentes de contacto. Las patentes de E.U.fl. Nos. 4,758,595 y 4,836,986 (Ogunb yi) describen el uso de biguanidas polirnepcas para el mismo proposito. Se han propuesto varios métodos para limpiar- y desinfectar lentes de contacto al mismo + ?ernpo. Métodos que involucran el uso combinado de enzimas pro+eol iticas y peróxidos para limpiar' y desinfectar len+es de contacto simultáneamente, se describen en la patente de E.U.fl. No. Re 32,672 (Huth, y otros). Un método representa* ívo para lpnp ar y desmfec+ar simult neamente lentes de contacto involucrando el uso de enzimas pro+eoliticas y compuestos de amonio cua+emario se describe en la publicación de paten+e japonesa 57-24526 (Boghosian, y otros). El uso combinado de una b guamda (es decir, clorhexidma) y composiciones de enzima liquidas para limpiar y desinfectar simultáneamente lentes de contacto se describe en la patente canadiense No. 1,150,907 (Lud?ig y otros). Métodos que involucran el uso combinado de enzimas proteoliticas disueltas para limpiar y calor para desinfectar se describen en la patente de E.U.fl. No. 4,614,549 (Ogunbiyi). El uso combinado de enzimas proteolíticas y biguanidas polimepcas o compuestos polimepcos de amonio cuaternario se describen en la solicitud de patente de E.U.fl. comunmente cedida y co-pendiente No. de serie 08/156,043 y en la publicación de solicitud de patente europea correspondiente No. 0 456 467 A2 (Rosenthal y otros), asi co o en la patente de E.U.O. No. 5,096,607 (Mowrey-McKee y otros). La disponibilidad comercial de la mayoría de las combinaciones de enzima/desinfectantes anteriores ha dependido del uso de tabletas de enzima estables. Mas específicamente, el uso de composiciones limpiadoras enzirnaticas sólidas ha sido necesario para asegurar estabilidad de las enzimas antes de usarse, fl fin de usar dichas composiciones, se debe abrir un empaque separ-ado que contiene una tableta, la tableta debe colocarse en un frasco separado que contiene una solución, y la table+a se debe disolver a fin de liberar la enzima en la solución. Esta practica se realiza usualrnente solo una vez a la semana debido al procedimiento tedioso y difícil de manejar y potencial para la filtración y toxicidad. Ademas, las tabletas limpiadoras enzi aticas contienen una cantidad grande de excipientes, tales corno agentes efervescentes (por ejemplo, bicarbonato) y agentes voluminosos por ejemplo, (cloruro de sodio). Corno se explica más adelante, dichos excipientes pueden afectar adversamente tal limpieza y desinfección de los lentes de contacto. Han habido intentos anteriores por usar composiciones de enzima liquidas para limpiar lentes de contacto. Sin embargo, aquellos intentos han sido impedidos por el hecho de que las composiciones de enzima liquidas acuosas son inherentemente inestables. Cuando se coloca una enzima proteolitica en un solución acuosa durante un periodo extenso (es decir, varios meses o mas), la enzima puede perder toda o una porción substanciales de su actividad proteolitica. Se pueden tomar pasos para estabilizar* las composiciones, pero el uso de agentes estabilizantes puede tener un efecto adverso en la actividad de la enzima. Por ejemplo, los agentes estabilizantes pueden proteger enzimas de problemas de inestabilidad química durante el almacenamiento en un liquido acuoso, colocando las enzimas en una conformaci n física latente. Esta conformación es referida en la presente como "parcialmente desnaturalizada". Sin embargo, dichos agentes pueden inhibir +arnb?en la habilidad de las enzimas de hacerse ac+ivas una vez rnas (es decir-, " renaturalizarse" ) al tiempo de usarse. Finalrnen+e, ademas de los problemas generales referidos antes, una preparación de enzima liquida comercialrnente disponible para tratar lentes de contacto debe ser-relativamente no toxica y debe ser compatible con otros agentes químicos usados en el tratamiento de lentes de contacto, particularmente agentes anti icrobianos utilizados para desinfectar los lentes. Las siguientes patentes pueden ser referidas para antecedentes adicionales que conciernen intentos anteriores para estabilizar formulaciones de enzima liquidas: Patentes de E.U.fl. Nos. 4,462,922 (Boskamp); 4,537,706 (Severson); y 5,089,163 (flronson) . Estas patentes describen composiciones detergentes que contienen enzimas. Las composiciones detergentes se pueden usar para tratar lavandería, así corno otros usos industriales. Dichos detergentes no son apropiados para tratar lentes de contacto. Las composiciones de la presente invención no contienen un detergente, u otros agentes potenciaIrnente dañinos o irritantes al ojo. La Paten+e de E.U.fl. No. 5m281,277 (Nakagaua) y las solicitudes de Patente Japonesa Koka Nos. 92-370197,- 92-143718; y 92-243215 describen composiciones de enzima liquidas para tratar lentes de contacto. Las composiciones de la presente invención se cree que proveen mejoras significativas relativas a las composiciones descritas en dichas publicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee composiciones de enzima liquidas estables para limpiar lentes de contacto y métodos para usar las composiciones. Las composiciones de enzima liquidas de la presente invención contienen enzimas de pureza alta e integridad estructural. Esta pureza alta e integridad limita: 1) el numero de diferentes substancias antigénicas potenciales en un lente de contacto; 2) la cantidad de substancias antigénicas potenciales en un lente de contacto y 3) la característica no estabilizante de la degradación cruzada por enzimas diferentes en composiciones liquidas. Las composiciones de enzima líquidas de la presente invención con+ienen enzimas individuales de integridad y pureza altas, y un vehículo acuoso, fl fin de mejorar rnás las estabilidad de las composiciones, se prefiere el uso de un vehículo acuoso que contiene cantidades críticas de agentes estabilizantes seleccionados. Los agentes estabilizantes son combinaciones de un compuesto de bora+o o ácido bórico y uno o más polioles de 2 a 3 carbonos. Las cantidades de agentes estabilizantes utilizadas se han equilibrado delicadamente, de modo que se logra estabilidad máxima, aunque la actividad máxima se obtiene después cuando la composición se pone en uso. Ademas, el compuesto de bor-ato o acido bórico también conserva las composiciones de enzima liquidas de la presente invenci n de contaminación microbiana cuando las composiciones con empacadas en contenedores de uso múltiple. La presente invención provee también métodos para limpiar lentes de contacto con las composiciones de enzima líquidas antes descritas. A fin de limpiar un lente sucio, el lente se coloca en algunos mililitros de una solución acuosa y una cantidad pequeña, por lo general una a dos gotas, de la composición de enzima se agrega a la solución. Después el lente se enjuaga en la solución de limpieza resultante durante un tiernpo suficiente para limpiar el lente. Las composiciones de enzima líquidas de la presente invención se combinan de preferencia con una solución desinfectante acuosa para limpiar y desinfectar simultáneamente los lentes de contacto. Como se apreciara por aquellos expertos en la técnica, la solución desinfectante debe formularse para ser compatible con los lentes de contacto. La actividad antimicrobiana de muchos agentes desinfectantes químicos es afectada adversamente por solutos iónicos (por ejemplo, cloruro de sodio). Como se explica rnas adelante, las composiciones de enzima líquidas de la presente invención son substancialmente no iónicas, y por lo +anto no afectan adversamente la actividad anti icrobiana de dichos agentes desinfectantes. Se considera que esto es una ven+aja principal de la pr-esente invención. Las composiciones de enzima de la presen+e invención se formulan corno líquidos de mul+idosis concentrados, y por consiguien+e no con+ienen excipien+es de +able+a de enzima convencionales, +ales como cloruro de sodio (agen+e voluminoso) y bicarbonato (agente efervescente) . Las composiciones de enzima liquidas de la presente invención utilizan un vehículo acuoso. Los componentes principales del vehículo son uno o rnas pol oles y agua. Estos componentes son no iónicos. Las composiciones de enzima liquida de la pr-esente invenci n de esta manera son substancialrnente no iónicas, y por lo tanto tienen muy poco impacto en el esfuerzo iónico de una solución desinfectante, y poco a casi nada de efecto en la actividad anti icrobiana de la soluciones desinf-ectantes. Las composiciones y métodos de la presente invención proveen mayor facilidad de uso. Esta facilidad de uso permite a los usuarios de lentes de contacto limpiar sus lentes dos o tres veces a la semana, o rnás preferiblemente cada día. Se ha descubierto que el uso diario de las composiciones de enzima líquidas de la presente invención da como resultado limpieza y seguridad dramaticamen+e mejores, en comparación con los regímenes de limpieza de enzima de una vez por semana que se utilizan en la actualidad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE Lfl INVENCIÓN Las enz unas que se pueden utilizar en las composiciones y métodos de la pr-esente invención incluyen todas las enzimas que: (1) son útiles para remover depósitos (je lentes de contacto; (2) provocan, a lo mucho, solo irritación ocular- menor en el caso de que una cantidad pequeña de enzima haga contacto con el ojo corno resultado de enjuague inadecuado de un lente de contacto; (3) son relativamente estables y efectivas químicamente en presencia de los agentes antimicrobianos descritos mas adelante; y (4) no afectan adversamente las propiedades físicas o químicas de los lentes siendo tratados. Las enzimas proteoliticas usadas en la presente se requieren que sean de pureza e integridad altas. Las enzimas de las composiciones de la presente invención exhiben radiaciones electroforeticas de gel altas. Corno se utiliza en la presen+e, el termino "relaciones electroforeticas de gel altas" se refiere a una relación de por lo menos 99:1 de la cantidad de la banda de una enzima proteolitica de la presente invención a la cantidad de las otras bandas de material separado en el gel. Las enzimas de la presente invención exhiben también una integridad substancialrnente no desnaturalizada. Corno se utiliza en la presente, el termino "integridad substancialrnente no desna+uralizada" se refiere a la actividad relacionada con por lo menos 95% de la proteina total. Se pueden ob+ener enzimas de pureza e integridad altas comercialmente. Varias compañías venden dichas enzimas incluyendo: NovoNordsk (Bagscaerd, Dinamarca) y Sigrna Chemical Co. (St. Louis, Missouri, E.U.A.). Alternativamente, una enzima cruda se puede purificar y seleccionar para porciones substancialrnente no desnaturalizadas rnedian+e métodos típicos conocidos por aquellos exper+os en la técnica. Por ejemplo, el uso de técnicas de cromatografía de columna y cristalización se pueden usar generalmente para purificar las enzimas de la presente invención. Para propósitos de la presente especificación, las enzimas que sa+isfacen los requerimientos anteriores son referidas corno ser "oftálmicamente aceptables". Ejemplos de enzimas proteoliticas adecuadas incluyen, pero no limitan a tripsina, subtil cina, colagenasa, queratinasa, carboxilasa, arninopeptidasa, aspergilo pep+idasa, pronasa E (de S^ griseus) y dispasa (de Bacillus, poly yxa) y mezclas de las mismas. Las enzimas derivadas de microbios, tales como aquellas derivadas de Bacillus, Streptomyces, y flspergillus, representan un tipo de enzima que puede utilizarse en la presente invención. De este subgrupo de enzimas, las mas preferidas son las proteasas alcalinas derivadas de Bacillus genéricamente denominadas enzimas de "subtilicma" . La identificación, separación y purificación de las enzimas se conoce en la técnica. Muchas técnicas de identificación y aislacion exis+en en la litera+ura científica general para la aislacion de enzimas. Las enzimas con+ernpladas por- esta invención pueden obtenerse prontamente rnedian+e técnicas conocidas de fuentes vegetales, animales o microbianas. Con la llegada de técnicas de ADN recornbi nante, se anticipa que estar n disponibles nuevas fuentes y +? os de enzimas proteoliticas estables. Dichas enzimas deben considerarse que caen dentro del alcance de esta invención siempre y cuando cumplan con el criterio para la estabilidad de actividad establecido en la presen+e. Subtilicina y tripsina son enzimas preferidas para usarse en la presente invención. Subtilicina se deriva de la bacteria Bacillus y esta cornercialmente disponible de varias fuentes comerciales incluyendo Novo Industries (Bagscaerd, Dinamarca), Fluka Biochenika (Buchs, Alemania y Boehringer Mannheirn). Tripsina se purifica de varias fuentes animales y esta disponible cornercialrnente de Si rna Chemical Co. y Boehrmger Mannheim. Aunque no se desea limitarse por la teoría, se cree que la estabilidad de las composiciones de enzima liquidas de la pr-esente invención se atribuye a la pureza alta de las enzimas. Mas específicamente, el uso de enzimas que tienen relaciones electroforéticas de gel altas eliminan substancialrnente el riesgo de degradación cruzada por enzimas diferentes. La estabilidad de las composiciones puede rnejorar ademas mediante la desnaturalización parcial de las enzimas. Las enzimas se desnaturalizan parcial men*e formando un complejo con los agen+es estabilizantes. Las enzimas se desnaturalizan a un pun+o en donde las enzimas se mactivan, pero en donde la renaturalizacion se logra facilrnen+e rnedian+e la diluci n del complejo de enzirna/agen+e estabilizan+e en un medio acuoso. Se cree que los agen+es estabilizantes compiten con agua para sitios de unión de hidrógeno en las proteínas. De esta manera, un cier+o porcentaje de estos agentes desplazara efectivamente un cierto porcentaje de moléculas de agua. Corno un resultado, las proteínas cambiaran la conformación (desnaturalización parcial) a una forma inactiva y compleja (con menos agentes estabilizantes). Cuando la enzima esta en una forrna inactiva, es prevenida de la autodegradación y otros eventos químicamente reversibles, espontáneos. Por el otro lado, el desplazamiento de demasiadas moléculas de agua da corno resultado cambios confor acionales de proteina que son irreversibles. 0 fin de obtener una composición de enzima líquida estable de vida en el almacenamiento significativa y de esta manera disponibilidad comercial, se debe lograr un punto de equilibrio delicado de estabilidad máxima y renaturalizacion reversible máxima. Ahora se ha descubierto dicho punto. Se ha descubier+o que el uso de un vehículo acuoso que contiene un poliol en combinación con un compuesto de bor-ato mejora ademas las es+abilidad de las enzimas altarnen+e puras utilizadas en la presente invención. Por lo tanto, se prefiere el uso de este vehículo. Los polioles utilizados en los vehículos preferidos descritos antes son polioles de 2-3 carbonos. Corno se utiliza en la presente, el termino "poliol de 2-3 carbonos" se refiere a un cornpues+o con 2 a 3 átomos de carbono y por lo menos 2 grupos hidroxi. Ejemplos de polioles de 2-3 carbonos son glicerol, 1 , 2-propan?ol ( "prop lenglicol " ) , 1 , 3-propanod?ol y etilenglicol. Propilenglicol es el poliol de 2-3 carbonos prefer do. Los compuestos de borato o acido bórico utilizados en los vehículos preferidos descritos antes incluyen sales de metal alcalino de borato, ácido bórico y bórax. El compuesto de bor-ato o acido bórico rnas preferido es borato de sodio. Corno se mencionó antes, el compuesto de borato o ácido bórico contribuye también a la conservación antimicrobiana de las composiciones de enzima liquidas de la presente invención a un nivel efectivo para dispensación de múltiple uso. El uso de ciertas cantidades de un poliol de 2-3 carbonos y un compuesto de borato o ácido bórico mejora la estabilidad de actividad sostenible requerida en las composiciones de enzima líquidas de la presente invención. Más específicamente, la combinación de 50-70% en volumen/volumen ("%v/v") de un poliol de 2-3 carbonos y 4-8% en peso/volumen ("%p/v") de un compuesto de borato o acido bórico se prefiere para lograr estabilidad mejorada y proveer composiciones de enzimas liquidas particularmente eficaces y disponibles cornercialrnente, corno se describió antes. La combinación de aproximadamente 50% en v/v de un poliol de 2-3 carbonos y aproximadamente 7.6% en v/v de borato de sodio es muy preferida. Los ejemplos 1 y 2 rnas adelante Llustran estas composiciones pietendas de la presen+e invenci n. Las composiciones de enzima liquidas de la presento inven ión tendrán una concentración de enzima su iciente para proveer una cantidad efectiva de enzima para limpiar un lente cuando una cantidad pequeña de la composición se agrega a un diluyente. Como se utiliza en la presente, dicha cantidad es referida como "una cantidad efectiva para limpiar el lente". La cantidad de enzima usada en las composiciones de enzima líquidas de la presente invención variara por lo general de 0.05 a 2% en p/v. La selección de una concentración específica dependerá de varios factores, tales como: la especificidad y eficacia de la enzima seleccionada; el tipo de lentes que se van a limpiar; la frecuencia deseada de limpieza (por ejemplo, diaria o semanal); y la duración destinada de cada limpieza. Durante el almacenamiento, parte de la actividad de la enzima debe perderse, dependiendo de la longitud de almacenamiento y las condiciones de temperatura. De esta manera, las composiciones de enzima liquidas de la presente invención pueden preparase con cantidades iniciales de enzimas que exceden las escalas de concentración descritas en la presente. Las composiciones preferidas de la presente invenci n por lo general contendrán una o rnás enzimas de una cantidad de aproximadamente 300-6000 PAU/rnl. Las composiciones rnas preferiblemente tendrán aproximadamente 900-2200 PAU/rnl, que corresponde a subtilisma en una escala de aproximadamente 0.1 a 0.3% en p/v; y tripsina en la escala de apro imadamente 0.1 a 0.3% en p/v. Para los prop sitos de esta especificaci n, una "unidad de actividad proteolít ica" o " PAU" se define corno l a cantidad de actividad de enzima necesaria para generar un rnicrograrno (mcg) de tirosina por minuto ("rncg Tyr/rnm"), corno se determino por la prueba colonrnetrica de digestión de caseína descrita rnas adelante.

PRUEBA DE DIGESTIÓN DE CASEÍNA Una porción de 5.0 rnl de subs-t rato de caseína (0,65% de caseína en p/v) se equilibra durante 10 minutos (rnin) ± 5 segundos (seg) a 37°C. Una porción de 1.0 rnl de solución de enzimas (0.2 mg/mm) se agrega después al substrato de caseína y la mezcla hace remolino, después se incuba durante 10 rnin ± seg a 37°C. Después de la incubación, se agr-ega 5.0 rnl de 14% de ácido tricloroacético y la mezcla resultante hace remolino inmediatamente. La mezcla se incuba durante por lo menos otros 30 rnin, después hace remolino y se centrifuga durante 15-20 min (aproximadamente 2000 rprn). El sobrenadante de la muestra centrifugada se filtra en ?n mostrador de filtro de suero y se remueve un alícuota de 2.0 rnl. A la muestra de 2.0 rnl se agrega 5.0 i de 5.3% de Na2C?3. La muestra hace remolino, se agrega 1.0 mi de 0.67 N de reactivo de fenol de Folm, y la muestra vuelve a hacer remolino inmediatamente, después se incuba dur-ante 60 rnin a J7°C. La muestra después es leída en un espectro fotómetro de luz visible a 660 nanorne ros (nrn) contra el agua purificada corno la referencia. La concentración de la muestra se determina después comparando con una curva normal de ti rosina.

La limpieza obtenida con las composiciones de enzima liquidas de la presente invención es una función del tie po. Los tiempos de enjuague utilizados variaran por lo general de alrededor de 1 hora a toda la noche. Sin embargo, si se emplearan periodos de enjuague rnas largos (por ejemplo, 24 horas), se pueden utilizar concentraciones menores de aquellas descritas antes. Los métodos de limpieza de la presente invención involucran el uso de una cantidad pequeña de las composiciones de enzima liquidas antes descritas para facilitar la remoción de proteínas y otros depósitos de lentes de contacto. La cantidad de composición de enzima utilizada en las modalidades particulares de la presente invención puede variar, dependiendo de vanos factores, tales como la especificidad y la eficacia de la enzima utilizada, la duración propuesta de exposición de los lentes a las composiciones, la naturaleza del régimen de cuidado de lentes (por ejemplo, la frecuencia de la desinfección y limpieza de lentes), ei tipo de lentes siendo tratados, y el uso de agentes limpiadores adjuntos (por ejemplo, agentes tensioactivos) . Sin embargo, los métodos de limpieza de la presente invención por lo general emplearán una cantidad en las composiciones de enzima liquidas antes descritas suficientes para proveer- una concentración de enzima final de aproximadamente 5-75 PAU/rnl de solución, siguiendo la dispersión de las composiciones de enzima liquidas en una soluci n desinfectante u otro solvente acuoso. Se prefiere una concentración final de aproximadamente 5-25 PAU/rnl . Corno se indico antes, las composiciones de enzima líquidas de la presente invención contienen cantidades relativamente menores de solutos iónicos. Mas específicamente, las composiciones no contienen agentes voluminosos, agentes efervescentes u otros solutos iónicos contenidos comúnmente en las tabletas de enzima anteriores. Las presentes composiciones contienen los solutos iónicos de compuestos de borato o acido bórico y ácido clorhídrico y/o hidróxido de sodio, pero la concentración de estos solutos en las presentes composiciones es relativamente ba a. Por lo tanto, las composiciones son substancial ente no iónicas. Además, como un resultado del hecho de que las composiciones se formulan como líquidos concentrados de dosis múltiple, solamente una cantidad pequeña de las composiciones, generalmente una o dos gotas, se requiere para limpiar un lente de contacto. Por lo tanto, las presentes composiciones tienen muy poco impacto en el esfuerzo iónico de las soluciones desinfectantes. Corno se explica mas adelante, esta característica de la pr-esente invención es particularmente importante cuando las composiciones de enzima liquidas se combinan con soluciones desinfectantes que contienen agentes antirnicrobianos iónicos, tal corno polyquatermurn~l . La actividad antirnicrobiana de agentes desinfectantes, particularmente compuestos polirnericos de amonio cuaternario tales corno ?olyquatern?urn-1 , es afectada adversamente por concentraciones altas de cloruro de sodio ? otros solutos iónicos. Más específicamente, los compuestos polirnepcos de amonio cuaternario, y particularmente aquellos de la formula (I), mas adelante, pierden actividad antimicrobiana cuando aumenta la concentración de los solutos iónicos en la concentración desinfectante. Por lo tanto, se prefiere el uso de soluciones que tienen esfuerzos iónicos bajos (es decir, concentraciones bajas de solutos iónicos tales corno cloruro de sodio). Ya que tanto los solutos iónicos (por ejemplo, cloruro de sodio) corno los solutos no iónicos (por ejemplo, glicerol) afectan la osmolalidad y tonicidad de una solución, la osnolalidad y tonicidad son medidas indirectas de esfuerzo iónico. Sin embrago, los esfuerzos iónicos bajos utilizados de preferencia en los métodos para limpiar y desinfectar de la presente invención corresponden por lo general a tonicidad/osrnolalidades en la escala de hipotonico a isotonico, y rnás preferiblemente en la escala de 150 a 350 rniliOsrnoles por kilogramo (rnOs/kg). Una escala de 200 a 300 rnOs/l- g se prefiere en particular, y es rnuy preferida una osrnolalidad de aproximadamente 220 rnOs/kg. Las composiciones de enzima liquidas de la presente invención demuestran eficacia de limpieza efectiva al mismo tiempo exhibiendo efectos adversos mínimos o, rnas preferiblemente, efectos mejorados sobr-e la actividad antimicrobiana de las soluciones desinfectantes. Se ha descubierto inesperadamente que las composiciones de enzima liquidas de la presente invención ejoi n la actividad antirnicrobiana de soluciones desinfectantes que contienen ?olyquatern u?n-1 , un agente desinfectante polimepco de amonio cuaternario. Se ha descubierto también que las combinaciones de las composiciones de enzima líquidas y las soluciones desinfectantes de polyquatermurn-1 son aun rnas efectivas que las soluciones desinfectantes de ?olyquatern?um-1 solas cuando se tratan éstas durante períodos extensos de aproximadamente 1 hora a toda la noche, con 4 a 8 horas preferidas. Por conveniencia, ya que los lentes de contacto se enjuagan típicamente durante la noche a fin de ser limpiados con enzimas o desinfectados con agentes químicos, este descubrimiento tiene significado practico. Sin querer ser limitado por ninguna teoría, se cree que la mejora antes descrita de actividad antiricrobiana se debe a la separación o lisis de membranas microbianas por la enzima a lo largo del tiempo. Los métodos de limpieza de la presente invención utilizan un solvente acuoso. El solvente acuoso puede contener vapas sales tales corno cloruro de sodio y cloruro de potasio, agentes reguladores tales corno acido bórico y borato de sodio, y otros agentes tales corno agentes quelatadores y conservador-es. Un ejemplo de un solvente acuoso adecuado es una solución salina, tal corno Un?solR Plus Solution (marca registrada de fllcon Laboratopes) . Los métodos par-a limpiar y desinfectar de la presente invención utilizan una solución desinfectante que con lene un agente antimicrobiano. Los agentes antirnicrobianos pueden ser oxidantes, tales corno per-oxido de hidrogeno, o agentes antunicrobianos pol irner icos no oxidantes que der van su actividad antirnicrobiana a través de una interacción química o fisicoquímica con los organismos. Corno se utiliza en la presente especificación, el termino "agente antirnicrobiano polirnérico" se refiere a cualquier- polímero o copolirnero que contiene nitrógeno que tiene actividad antimicrobiana. Agentes antimicrobianos polirnépcos preferidos incluyen: polyquatern?urn-1 , que es un compuesto polirnepco de amonio cuaternario; y biguanida de polihexametileno ("PHMB") o biguamda de poliammopropilo ("PAPB"), que es una biguamda polirnepca. Estos agentes antirnicrobianos preferidos se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,407,791 y 4,525,346, expedida a Stark, y 4,758,595 y 4,836,986, expedida a Ogunbiyi, respectivamente. Todos los contenidos de las publ caciones anteriores se incorporan a la presente especificación por referencia. Otros agentes antinicrobianos adecuados en los métodos de la presente invención incluyen: otros compuestos de amonio cuaternario, tales corno halogenuro de benzalcomo, y otras biguanidas, tal como clorhexidma. Los agentes antinicrobianos usados en la presente se emplean de preferencia en ausencia de compuestos que contienen mercurio i al corno time- sal . Los agentes nt nicrobianos muy preferidos son compuestos polirnepcos de amonio cuaternario de la estructura: en donde: Rl y R2 pueden ser el mismo o diferente y se seleccionan a partir de: N+(CH2CH2?H)3X_ , N(CH3 )-2 O OH; X- es un anión farmacéuticamente aceptable, de preferencia cloruro; y n = entero de 1 a 50. El compuesto muy preferido de esta estructura es ?olyquatern?urn-1 , que es conocido también corno Onarner MTM (marca registrada de Onyx Chemical Corporation) o como PolyquadR (marca registrada de Alcon Laboratories, Inc.). Polyquatern?urn-1 es una mezcla de los compuestos con referencia anterior, en donde X- es cloruro y Ri y R2 y n son corno se definió antes. Los agentes antiini crob anos antes descritos se utilizan en los métodos de la presente invención en una cantidad efectiva para eliminar substancialmente o par-a reducir si nificativamente el número de microorgani mos viables 00 encontrados en lentes de contacto, de conformidad con los requerimientos de las agencias reguladoras del gobierno, tales corno la administración de alimento y fármaco de los Estados Unidos. Para los propósitos de la presente especificación, la cantidad es referida corno ser "una cantidad efectiva para desinfectar" o "una cantidad anti icrobianarnente efectiva". La cantidad de agente antiricrobiano empleada variará, dependiendo de factores tales corno el tipo de régimen de cuidado de lentes en donde el método se está utilizando. Por ejemplo, el uso de un limpiador diario eficaz del régimen de cuidado de lentes puede reducir substancialrnente la cantidad de material depositado en los lentes, incluyendo microorganismos, y reducir así la cantidad de agente antirnicrobiano requerida para desinfectar los lentes. El tipo de lente siendo tratado (por ejemplo, lentes "duros" contra "blandos") también puede ser un factor-. En general, empleara una concentración en la escala de alr-ededor de 0.000001% a aproximadamente 0.01% en peso de uno o mas de los agentes antirnicrobianos antes descritos. La concentración mas preferida de los compuestos pol unen eos de amonio cuaternario de la for-mula (I) es aproximadamente 0.001% en peso. También se pueden emplear- agentes desi fectantes oxidantes en los métodos de la presente invención. Dichos agentes desinfectantes oxidantes incluyen varios peróxidos que producen oxigeno activo en solución. Los métodos preferidos emplearan peróxido de hidrógeno en la escala de 0.1 a 3.0% para desinfectar los lentes. Métodos que utilizan un sistema desinfectante oxidante se describen en la Patente de E.U.A. No. Re 32,672 (Huth, y otros), todos los contenidos de la cual se incorporan por referencia en la presente especificación. Corno se apreciara por aquellos expertos en la técnica, las soluciones desinfectantes utilizadas en la presente invención pueden contener varios componentes ademas de los agentes antirnicrobianos antes descritos, tales corno agentes reguladores adecuados, agentes quelatadores y/o secuestradores y agentes ajustadores de tonicidad. Las soluciones desinfectantes pueden contener también agentes tensioactivos. Los métodos de la presente invención involucrarán típicamente agregar una cantidad pequeña de una composición de enzima líquida de la presente invención a aproximadamente 2 a 10 rnL de un solvente acuoso o solución desinfectante, colocando los lentes sucios en la enzima/solvente o enzima/solución desinfectante, y ejuagando los lentes durante un periodo efectivo para limpiar o limpiar y desinfectar los lentes. La cantidad de composición de enzima liquida utilizada puede variar con base en factores tales corno la cantidad de solución desinfectante usada, pero generalmente es de aproximadamente 1 a 2 gotas. Métodos preferidos incluyen agregar 1 gota (aproxirnadanent e 30 uL) a 5 rnL de solvente acuoso o solución desinfectante. Los lentes sucios se pueden colocar en el solvente acuoso o solución desinfectante ya sea antes o después de la adición de la composición de enzima líquida.

Opcionalrnente, los lentes de contacto son frotados primero con un limpiador de agente tensioactivo diario no enzirnatico antes de la inmersión en la enzima/solvente o enzirna/solucion desinfectante. Los lentes serán enjuagados típicamente durante la noche, pero se contemplan duraciones rnás cortas o mas largas por los métodos de la presente invención. Se prefiere un tiempo de enjuague de 4 a 8 horas. Los métodos de la presente invención permiten el régimen antes descrito para realizarse una vez por semana, pero rnuy preferido, cada día. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar-más, varios aspectos de la presente invención, pero no deben limitar el alcance de la invención en ningún aspecto.

E3EMPL0 1 Se describen rnas adelante una composición de subt iisma liquida específica de la presente invención, y una solución desinfectante adecuada par-a usarse en combinación con dicha composición: A. Composición de Subtili ina Liquida La siguiente formulación de enzima liquida i «presenta una modalidad preferida de la presente invención: * corresponde a una cantidad para ajustar el pH a 6.0 Note: (p/v) significa peso/volurnen; (v/v) significa volumen/volumen; y OS significa cantidad suficiente La formulación anterior se preparó mezclando primero en secuencia propilenglicol, agua purificada, ácido clorhídrico y borato de sodio juntos. La solución se filtró con cera (filtro de 1.2 rnrn) en un tanque receptor estéril, y después filtrado estéril (filtro de 0.2 rnm). La cantidad requerida de subtilisina se disolvió después una cantidad apropiada de agua y la solución se filtró con cera (filtro de 0.6 rnrn). Esta solución de enzima se filtró estéril después (filtro de 0.2 rnm) en el tanque receptor estéril que contiene la solución de propilenglicol/borato de sodio esterilizada. Con mezcla apropiada, los contenidos del tanque receptor fueron llevado después a volumen con una cantidad apropiada de agua. El pH óptimo de la formulación anterior estuvo en la escala de 6-7, es rnuy preferido un pH de 6.

B. Solución Desinfectante La siguiente formulación representa una solución desinfectante preferida: Para preparar la formulación anterior, se mezclaron dihidrato de citra+o de sodio, rnonohidrato de ácido cítrico, edetato de disodio, cloruro de sodio y Polyquatern?urn-1 , en las concentraciones relativas indicadas antes, con agua purificada y los componentes se dejaron disolver mediante agitación con un mezclador. Se agregó agua purificada para llevar la solución a aproximadamente 100%. Se registro el pH a 6.3 y se ajusto a 7.0 con NaOH. Se agrego agua purificada para llevar la solución a 100%. La solución fue agitada y se torno una lectura del pH de 7.0. La solución se filtro después en frascos estériles y tapados en los extremos.

EJEMPLO 2 Se describen mas adelante una composición de tripsina liquida preferida de la presente invención para usarse en combinación con una solución desinfectante adecuada, por ejemplo, EJEMPLO IB: Composiciones de Tripsina Líquida' *corres?onde a una cantidad para ajustar el pH a 6.0 Las composiciones de tripsina liquidas anteriores se hacen en la misma manera corno se hace la composición de subtilisma liquida, descrita en el ejemplo 1.

EJEMPLO 3 Se realizo un estudio de estabilidad comparando tripsina y pancreatma en la composición de enzima liquida del ejemplo 1, en donde tripsina, a 0.3% en peso/volurnen, y pancreatma, a 1.7% p/v fueron substituidas por subtilisina. Los datos se muestran en el cuadro I mas adelante. Se almacenaron alícuotas de las composiciones en una cámara mantenida a 35°C. En el momento indicado, se probaron las alícuotas para actividad de enzima. Se compararon los niveles de actividad con niveles iniciales y expresados corno por ciento de actividad restante.

CUADRO I: ESTABILIDAD DE COMPOSICIONES DE ENZIMA LIQUIDAS QUE CONTIENEN TRIPSINA O QUIMOTRIPSINA ALMACENADAS A 35°C La composición de tripsina demostró un perfil de estabilidad excelente a 35°C, mientras que la pancreatma de enzima múltiple, que contiene tripsina, quirnotripsma, lipasa, amilasa, y carboxipeptidasa, fue menos estable.

EJEMPLO 4 La eficacia desinfectante de una composición de la presente invención se evaluó determinando la velocidad y grado de muerte lograda con un sistema acuoso formado combinando la composición de enzima líquida y solución desinfectante descritas en el ejemplo 1 anterior. Dicho sistema se probó contra Serratia marcescens. Los procedimientos y resultados de la prueba se describen mas adelante. Primero se agregó un volumen de inoculo de 0.1 rnl (108 unidades forrnadoras de colonia/rnL) a un volumen de 10 rnl de la solución desinfectante del ejemplo 1, seguido por la adición de 2 gotas de la composición de enzima líquida del ejemplo 1. Un volumen de 10 rnl inoculado de manera similar de la solución desinfectante del ejemplo 1 se uso corno un control. Las soluciones se mantuvieron a temperatura ambiente a lo largo de la prueba. Cada microorganismo y solución de prueba se probo individualmente. Se probaron series de muestras de cuatro replicas (n - 8) para cada organismo. fl intervalos de tiempo seleccionados de 4 y 24 horas, un volumen de 1 mi de la solución de prueba inoculada se removió y se hicieron diluciones en serie apropiadas en patrones de dilución de solución de cloruro de sodio de 0.9% estériles. Se prepararon placas de vertido con agar de digestión de soya-caseína que contiene 0.07 de flsolectm y 0.5% de Polysorbate 80. Al tiempo 0, se removió un volumen de 1 rnl del control de solución salina y se prepararon placas de vertido de dilución en serie usando el mismo medio de recuperación y los mismos patrones de dilución. El conteo de control de solución salina de tiempo 0 se uso corno el conteo inicial. Después se determino el numero de organismos sobrevivientes en cada intervalo de tiempo. Los resultados se resumen en el cuadro II rnas adelante.

CUADRO II EFECTOS DE UNA COMPOSICIÓN DE ENZIMA LIQUIDA QUE CONTIENE SUBTILISINA EN LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE UNA SOLUCIÓN DESINFECTANTE DE POLYQUATERNIUM-1 Como se ilustra en el cuadro II, la composición de enzima liquida que contiene subtilisina tuvo un efecto rnejorador en la actividad antimi crobiana de la solución desinfectante del ejemplo 1 a través de 4 horas de incubación, y un efecto negligente a 24 horas.

EJEMPLO 5 La eficacia desinfectante de o ra modalidad de la presente invención se evaluó determinando la velocidad y grado de muerte lograda con un sistema acuoso formado combinando la composición de tripsina liquida del ejemplo 2 y la solución desinfectante descrita en el ejemplo 1. El sistema se probo contra Serratia arcescens, Staphylococcus aureus, Pseudomoñ s aeruginosa, Candida albicans y Fusariurn solam . Se siguió el procedimiento de prueba en el ejemplo 4. Los tiempos de muestra fueron 4, 6 y 24 horas. Los resultados de la prueba, expresados co o reducciones de log se presentan en el cuadro III rnás adelante.

CUADRO III: EFECTOS DE UNA COMPOSICIÓN DE ENZIMA LIQUIDA QUE CONTIENE TRIPSINA EN LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE UNA SOLUCIÓN DESINFECTANTE DE POLYQUATERNIUM-1 La invención en sus aspectos mas amplios no esta lirni+ada a los detalles específicos mostrados y descritos antes. Se pueden hacer alejamientos de dichos detalles, dentro del alcance de las reivindicaciones anexas sin alejamiento de los principios de la invención y sin sacrificar sus ventajas.

Claims (12)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 5 1.- Una composición de enzima liquida, concentrada, estable para limpiar lentes de contacto que comprende: una enzima en una cantidad efectiva para limpiar los lentes, dicha enzima teniendo una relación electroforética de gel de por lo menos 99:1, y un vehículo acuoso para dicha enzima, en donde la 10 enzima es substancialrnente no desnaturalizada dur-ante la dilución en un solvente acuoso. 2.- Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el vehículo acuoso comprende 4-8% en peso/volumen de un compuesto de 15 borato, 50-70% en peso/volurnen de un pol íol de 2-3 carbonos, y agua. 3.- Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada ademas porque la enzima es t ripsma. 20 4.- Una composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada ademas porque la enzima es ripsina. 5.- Una composición de conformidad con la reivi dicación 2, caracterizada ademas porque el compuesto de -? bor-ato es borato de sodio y el poliol de 2-3 carbonos es 1,2- propanodiol. 6.- Una composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada ademas porque la composición contiene 7.6% en peso/volumen de borato de sodio y 50% en peso/volumen de 1 ,2-pro?anod?ol . 7.- Una composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada ademas porque la enzima es tripsina. 8.- Un método para limpiar lentes de contacto que comprende: colocar- los lentes en un solvente acuoso; dispersaruna cantidad pequeña de una composici n limpiadora de enzima líquida, estable, concentrada en el solvente acuoso para formar-una solución limpiadora enzimática acuosa, dicha composición limpiadora que comprende: una enzima en una cantidad efectiva para limpiar los lentes, dicha enzima que tiene una relación electroforetica de gel de por lo menos 99:1, y un vehículo acuoso para dicha enzima, y enjuagar los lentes en la solución limpiadora enzirnatica durante un periodo suficiente para limpiar los lentes; en donde la enzima esta substancialrnente no desnaturalizada durante la dispersión en el solvente acuoso. 9.- Un método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado ademas porque el vehículo acuoso comprende 50-70% en peso/volumen de un poliol de 2-3 carbonos, 4-8% en peso/volumen de un compuesto de borato y agua. 10.- Un método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado ademas porque la enzima es tripsina. 11.- Un método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado ademas porque la enzima es tripsina. 12.- Un método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el compuesto de borato es borato de sodio y el poliol de 2-3 carbonos es 1,2-?ropanod?ol. 13.- Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la composición contiene 7.6% en peso/volurnen de borato de sodio y 50% en peso/volurnen de 1,2-propanodiol. 14.- Un método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la enzima es tripsina. 15.- Un método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado ademas porque el método se realiza diariamente. 16.- Un método para limpiar y desinfectar lentes de contacto que comprende: colocar los lentes en una solución desinfectante acuosa que contiene una cantidad de un agente antirnicr-obiano efectivo para desinfectar lentes; dispersar una cantidad pequeña de una composición limpiadora de enzima liquida, estable, concentrada en dicha solución desinfectante para formar- una solución desinfectante/enzima acuosa, dicha composición limpiadora que comprende: una enzima en una cantidad efectiva para limpiar los lentes, dicha enzima que tiene una relación electroforetica de gel de por lo menos 99:1, y un vehículo acuoso para dicha enzima, y enjuagar- los lentes en la solución desinfectante/enzima acuosa durante un per-iodo suficiente para limpiar y desinfectar los lentes; en donde la enzima esta substancialrnente no desnaturalizada durante la dispersión en la soluci n desinfectante. 17.- Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado ademas por-que la composición limpiadora comprende 50-70% en peso/volumen de un poliol de 2-3 carbonos, 4-8% en peso/volurnen de un compuesto de borato, y agua. 18.- Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la enzima es tripsina. 19.- Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la enzima es tripsina. 20.- Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el compuesto de borato es bor-ato de sodio y el poliol de 2-3 carbonos es 1,2-pro?anodiol. 21.- Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además por-que la composición contiene 7.6% en peso/volumen de borato de sodio y 50% en peso/volumen de 1,2-propanodiol . 22.- Un método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque la enzima es tripsina. 23.- Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado ademas porque el método se realiza diariamente.