MXPA97009536A - Metodo para reducir el factor de transcripcion bef-1 - Google Patents

Abstract

Un método para inducir el factor de transcripción comprende administrar a un humano en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la fórmula (I) en donde R1 y R3 son independientemente hidrógeno, -CH3, (a), o (b), en donde Ar es fenilo substituido opcionalmente;R2 es seleccionado del grupo que consiste de pirrolidina, hexametilenamino, y piperidino;o una sal o solvato del mismo, farmacéuticamente aceptable.

Description

MÉTODO PARA INDUCIR EL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN BEF-1 Antecedentes de la Invención El control de todos los procesos biológicos, resulta de un balance entre varios factores actuando positiva y negativamente los cuales interactúan con los elementos reguladores de ADN y con cada uno de los otros. Estos factores de proteínas juegan un papel crítico en el control de la expresión de proteínas, y además son críticos para ambos procesos normales y patológicos. Sobreentendiendo estos factores de proteínas y como modulan la expresión del gen, es la clave de las estrategias para el desarrollo de agentes para el control, de iniciación y progresión en padecimientos. Un número de estas importantes proteínas reguladoras tras-actuantes han sido descritas en la literatura y han sido demostradas por jugar un papel en los procesos patológicos. Uno de estos factores es el NF- B, un niembro de la familia Reí de factores de transcripción eucarióticos. La familia Reí de proteínas controla una amplia variedad de respuestas celulares. Por ejemplo, son clave en las moléculas reguladoras para inducir una señal de respuesta de la expresión del gen, REF: 26290 respuestas huésped defensiva, y respuestas de crecimiento. La capacidad para modular específicamente ios enlaces de NF-kB y otros miembros de la Familia Rei podría ser empleada para el tratamiento de una gran variedad de condiciones en el ámbito de shock sépticos, injertos contra reacciones del hospedante, condiciones inflamatorias aguas, respuestas inflamatorias sistémicas, respuestas de fases agudas, coagulación vascular, daño de repercusión isquémica, arteríosclerosis, infecciones de VIH y cáncer. Otro factor de transcripción de importancia es el BEF-1, un miembro de la familia NF-1 de reguladores transcripcionales. El BEF-1 fue el primero identificado como un represor transcripcional dentro del alcance del virus BK humano. El sitio enlazante por este factor de transcripción ubicuo está presente en las regiones reguladoras de un número de genes humanos. Por ejemplo, se ha mostrado el BEF-1 para controlar la expresión de la apoliproteina E humana, un constituyente mayor de la lipoproteína del plasma que funciona en el transporte lípido y- la redistribución (transporte reverso del colesterol) . El ApoE probablemente también juega un papel importante en la inhibición, el desarrollo y/o progresión de la arteriesclerosis. Ambos, el nivel y la actividad enlazante del BEF-1 se han mostrado por regular vía señalamientos intracelulares, como las demostradas por los efectos mediados a través del oncogen viral Ela, citocinas y también a través de la fosforilación de la tirosina. Se ha encontrado que los sitios enlazantes de BEF-1 pueden coincidir en parte con los sitios enlazantes de NF-kB (por ejemplo, molécula de adhesión vascular 1 VCAM-1). A la inversa, los sitios enlazantes de B F-1 tales como en el promotor apoE pueden enlazar proteínas Reí. Además, ambos, BEF-1 y NF-kB pueden competir para enlazar al mismo sitio. Además, los compuestos que modulan los niveles de la actividad BEF-1 pueden ser efectivos no solo en los genes de modulación controlados por BEF-1, si no también en aquellos controlados por Nf-kB.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención provee métodos para inducir el factor de transcripción BEF-1, que comprende administrar a un humano en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I en donde R1 y R3 son independientemente hidrógenos, O O lf ¡I -CH3, -C- (alquilo C?-C6) , o -C-Ar, en donde Ar es fenilo substituido opcionalmente; R2 es seleccionado del grupo que consiste de pirrolidino, hexametilenoimino, y piperidino; y sales y solvatos del mismo farmacéuticamente aceptables.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención actual concierne al descubrimiento que un grupo selecto de 2-fenil-3-aroilbenzotiofenos (benzotiofenos), aquellos de fórmula I, son empleados para inducir el factor de transcripción BEF-1. Los métodos de usó provistos por esta invención, son practicados por administrar a un humano en necesidad del mismo una dosis de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato del mismo aceptable farmacéuticamente, el cual es efectivo para inducir el factor de transcripción BEF-1. Como tal, el presente método incluye como apropiados a ambos, medicamento terapéutico y/o administración profiláctica. El término "para inducir" incluye sus medios aceptados generalmente, los cuales incluyen incrementar la producción de, incrementar la concentración, o incrementar la presencia de. El Raloxifeno, un compuesto de esta invención, es una molécula reguladora nuclear, en donde en su sal de clorhidrato de un compuesto de fórmula 1, R1 y R3 son hidrógeno y R2 es 1-piperidinilo. El raloxifeno ha sido mostrado por enlazar al receptor de estrógeno y fue originalmente mostrado por ser una molécula cuya función y farmacología era la de un antiestrogeno, por bloquear la capacidad del estrogeno para activar el tejido uterino y cánceres de pecho dependientes del estrógeno. En efecto, el raloxiteno bloquea la acción del estrogeno en algunas células; sin embargo, en otro tipo de células, el raloxifeno activa los mismos genes como lo hace el estrogeno y muestra la misma farmacología, por ejemplo, en osteoporosis y hiperlipidemia. Como resultado, el raloxifeno ha sido referido como un antiestrógeno con propiedades mezcladas agonistas-antagonistas. El único perfil en el cual el raloxifeno se muestra y difiere del estrogeno es ahora mostrado, debido a que es la activación única y/o supresión de las funciones de varios genes por el complejo receptor raloxifeno-estrogeno como opuesto a la activación y/o supresión de genes por el complejo receptor estrogeno-estrogeno. Por lo tanto, aunque el raloxifeno y el estrogeno se utilizan y compiten por el mismo receptor, el resultado farmacológico de la regulación del gen de los dos no es fácilmente predecido y es único para cada uno. En general, el compuesto es formulado con excipientes comunes, diluyentes o portadores, y comprimido en tabletas, o formulado con elixires o soluciones para administración oral conveniente, o administrados por las vías intramuscular o intravenosa. Los compuestos pueden ser administrados transdermalmente, y se pueden formular como formas de dosificación de liberación sostenida y similares. Los compuestos usados en los método de la invención actual pueden ser hechos de conformidad a procedimientos establecidos, tales como aquellos detallados en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,133,814, 4,418,068, y 4,380,635 de las cuales todas son incorporadas en este punto por referencia. En general, el proceso inicia con un benzo[b]tiofeno que tiene un grupo 6-hidroxilo y un grupo 2- (4-hidroxifenilo) . El compuesto inicial es protegido, acilado y desprotegido a partir de los compuestos de fórmula I. Ejemplos de la preparación de tales compuestos son proveídos en las Patentes Norteamericanas discutidas anteriormente. EL Fenilo substituido opcionalmente incluye fenilo y fenilo substituido una o dos veces con alquilo C?-C6, alcoxi Ci-C4, hidroxi, nitro, cloro, fluoro, o tri (cloro o fluoro)metilo. Los compuestos usados en los métodos de esta invención a partir de sales de adición de ácidos y bases aceptables farmacéuticamente, con una gran variedad de ácidos y bases orgánicos e inorgánicos, incluyen las sales aceptables fisiológicamente, las que son usadas frecuentemente en química farmacéutica. Tales sales son también parte de esta invención. Ácidos inorgánicos típicos usados para formar tales sales incluyen ácido clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, hip?f?sf?ric? y los similares. Sales derivadas de ácidos orgánicos, tales como ácido monoalifáticos y dicarboxílicos, ácidos alcanóicos substituidos por fenilo, ácidos hidroxialcanoicos e hidroxialcandioicos, ácidos aromáticos, alifáticos y ácidos sulfónico aromáticos, pueden también ser usadas. Tales sales farmacéuticamente aceptables incluyen además acetato, fenilacetato, trifluoroacetato, acrilato, ascorbato, benzoato, clorobenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato, o-acetoxibenzoato, naftaleno-2-benzoato, bromuro, isobutirato, fenilbutirato, ß-hidroxibutirato, butino-1,4-dioato, hexino-1, 4-dioato, caprato, caprilato, cloruro, cinamato, citrato, formato, fumarato, glicolato, heptanoato, hipurato, lactato, malato, maleato, hidroximaleato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, isoniconinato, nitrato, oxalato, ftalato, teraftalato, fosfato, monihidrogenfosfato, dihidrogeafosfato, metafosfato, pirofosfato, propiolato, propionato, fenilpropionato, salicilato, sebacato, succinato, suberato, sulfato, bisulfato, pirosulfato, sulfito, bisulfito, sulfonato, bencenosulfonato, p-bromofenilsulfonato, clorobencenosulfonato, etanosulfonato, 2-hidroxietanosulfonato, metanosulfonato, naftalen-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, p-toiuensuitonato, xilensultonato, tartarato y similares. Una sal preferida es la sal de clorhidrato. Las sales de adición del ácido aceptables farmacéuticamente son formadas típicamente al hacer reaccionar un compuesto de fórmula I con una cantidad equimolar o en exceso del ácido. Los reactivos son en general, combinados en un solvente mutuo tal como el éter dietílico o benceno. La sal precipita normalmente de la solución dentro de aproximadamente una hora a 10 días y puede ser aislada por filtración o el solvente puede ser cortado por medios convencionales. Las bases comúnmente usadas para formación de sales incluyen hidróxido de amonio y alcalino y hidróxidos de metales alcalinotérreos, carbonatos, así I como también aminas alifáticas, primarias, secundarias y terciarias, y diaminas alifáticas. Las bases empleadas especialmente en la preparación de sales de adición incluyen hidróxido de amonio, carbonato de potasio, metilamina, dietilamina, etilendiamina y ciclohexilamina. Las sales aceptables farmacéuticamente tienen en general características de solubilidad incrementada, comparada con los compuestos a partir de los cuales se derivan, y además son frecuentemente mas dispuestas para formulaciones como líquidos o emulsiones. Las tormulaciones farmacéuticas pueden ser preparadas por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con excipientes comunes, diluyentes o portadores, y formarse en tabletas, cápsulas, suspensiones, polvos y los similares. Ejemplos de excipientes, diluyentes y portadores que son convenientes para tales formulaciones incluyen a los siguientes: rellenadores y diluentes tales como almidón, azúcar, manitol y derivados silícicos; agentes enlazantes tales como carboximetilcelulosa y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina, y polivinil pirrolidona; agentes humectantes tales como glicerol; agentes desintegradores tales como carbonato de calcio y bicarbonato de sodio; agentes retardadores de disolución tales como parafina; aceleradores de la resorción tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes activos superficialmente tales como alcohol cetílico, monoestearato de glicerol, portadores adsortivos' tales como caolina y bentonita; y lubricantes tales como talco, calcio y estearato de magnesio y polietil glicoles sólidos. Los compuestos también pueden ser formulados como elixires o soluciones para administración oral conveniente o como soluciones apropiadas para administración parenteral, por ejemplo, por vías intramuscular, subcutáneas o intravenosa. Adicionalmente, los compuestos también son adaptados para formulaciones con formas de dosificación de liberación sostenida y similares. Las formulaciones pueden ser así constituidas para que liberen el ingrediente activo solo o preferiblemente en una parte particular del tracto intestinal, posiblemente por un periodo de tiempo. Las cubiertas, envolturas, y matrices protectores pueden hacerse, por ejemplo, a partir de substancias poliméricas o de ceras. La dosificación particular de un compuesto de fórmula I requerida para inducir el factor de transcripción BEF-1, o para cualquier otro uso descrito en este punto y de conformidad a esta invención dependerá de la severidad de la condición, la vía de administración, y de factores relatados que serían decididos por la atención especializada. En general, la dosis diaria aceptada y efectiva será de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1000 mg/día, y más típicamente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 mg/día. Tales dosificaciones se administrarán a un sujeto en necesidad de mismo de una a aproximadamente tres veces al día, o más frecuente como se necesite para inducir efectivamente el factor de transcripción BEF-1, o cualquier otro uso descrito en este punto. Es usualmente preterido administrar un compuesto de fórmula I en la forma de una sal de adición del ácido, como se acostumbre la acministración u orientaciones farmacéuticas del grupo básico, tale como del anillo piperidino. Es también ventajoso administrar tal compuesto por la vía oral. Para tales propósitos, son convenientes las siguientes formas de dosificación oral.

Formulaciones En las formulaciones que siguen, "el ingrediente activo" sugiere un compuesto de formula I.

Formulación 1: Cápsulas de gelatina Las cápsulas de gelatina sólida se preparan usando lo siguiente: Ingrediente Cantidad (mg/cápsula) Ingrediente activo 0.1 - 1000 Almidón, NF 0 - 650 Polvo proveniente de almidón 0 - 650 350 centistokes de silicona ilíquida 0 - 15 Los ingredientes son mezclados, pasados a través de un tamiz U.S. de malla No.45, y rellenados en cápsulas de gelatina sólida. Ejemplos de formulaciones que se han hecho en cápsulas específicas de raloxifeno, incluyen aquellas mostradas a continuación: Formulación 2: Cápsulas de raloxifeno Ingrediente Cantidad (mg/cápsula) Ingrediente activo 1 Almidón, NF 112 Polvo proveniente de almidón 125.3 350 centistokes de silicona liquida < 7 Formulación 3: Cápsulas de raloxifeno Ingrediente Cantidad (mg/cápsula) Ingrediente activo 5 Almidón, NF 108 Polvo proveniente de almidón 125.3 350 centistokes de silicona liquida ]_ # Formulación 4: Cápsulas de Raloxifeno Ingrediente Cantidad (mg/cápsula) Ingrediente activo 10 Almidón, NF 103 Polvo proveniente de almidón 225.3 350 centistokes de silicona liquida ]_ 7 Formulación 5: Cápsulas de raloxifeno Ingrediente Cantidad (mg/cápsula) Ingrediente activo 50 Almidón, NF 150 Polvo proveniente de almidón 397 350 centistokes de silicona liquida 3 0 Las formulaciones específicas anteriores se pueden cambiar en complicidad con las variaciones razonables provistas.

Una formulación en tableta es preparada usando los ingredientes a continuación: Formulación 6: Tabletas Ingrediente Cantidad (mg/tableta) Ingrediente activo 0.1 - 1000 Celulosa microcristalina 0 - 650 dióxido de silicon, gases 0 - 650 ácido estearato 0 - 15 Los compuestos son mezclados y comprimidos para formar tabletas. Alternativamente, cada una de las tabletas que contienen 0.1 - 1000 mg del ingrediente activo son hechas como siguen: Formulación 7: Tabletas Ingrediente Cantidad (mg/tableta) Ingrediente activo 0.1 - 1000 Almidón 45 Celulosa microcristalina 35 Polivinilpirrolidona (como 10% de solución en agua) Carboximetilcelulosa de sodio 4.5 Estearato de magnesio 0.5 Talco 1 El ingrediente activo, almidón, y celulosa son pasados a través de un tamiz U.S. malla No.45 y mezclados completamente. La solución de polivinilpirrolidona es mezclada con los polvos resultantes los cuales son luego pasados a través de un tamiz U.S. de malla No. 45. Los granulos así producidos, son secados a 50-60°C y pasados a través de un tamiz U.S. de malla No. 18. El almidón del carboximetil de sodio, estearato de magnesio, y el talco, son previamente pasados a través de un tamiz U.S. de malla No. 60, luego son añadidos a los granulos en los que , después de mezclarse son comprimidos en una maquina de tabletas para obtener las tabletas. Cada una de las suspensiones que contiene 0.1 -100 mg del medicamento por dosis de 5 mi se hacen como siguen: Formulación 8: Suspensiones Ingrediente Cantidad (mg/5 mL) Ingrediente activo 0.1 - 1000 Carboximetilcelulosa de sodio 50 Suspensión 1.25 Carboximetilcelulosa de sodio 0.10 Saborizante c.v. Colorante c.v. Agua purificada 5 mL El medicamento es pasado a través de un tamiz de malla No. 45 y mezclado con la carboximetilcelulosa de sodio y la suspensión para formar una pasta dental. La solución de ácido benzoico, saborizante y colorante son diluidas con un poco de agua y luego añadidas con agitaciones. Luego se añade agua suficiente para producir el volumen requerido.

Tratamiento de células con el Compuesto A* Células humanas HepG2 fueron cultivadas en una mezcla de 3:1 v/v de un medio Eagle modificado con Dulbecco y nutridas con una mezcla F12 Ham, complementadas con 10 nM de selenio, 50uM 2 aminoetanol, 20 mM HEPES y 50 ug/ml gentamicina y 2.5% de suero de feto de bovino. Cuando las células alcanzaron la confluencia, las monocapas fueron enjuagadas una vez con HBSS y alimentadas con el medio anterior sin FBS, pero con 100 ug/ml de ácido libre de grasa BSA, 0.8 ug/ml de ácido oleics y* con o sin la adición de 10 nM del compuesto A. Después de la incubación por 24 horas, las células fueron procesadas por extractos nucleares, y se realizaron experimentos del factor nuclear como se describió anteriormente y por Reifel-Miller et al. (Reifel-Miller, A. E., Berg, D.T. y Grinnell, B. G. (1991) The Journal of Biological Chemistry 266, 13873-13882) .

Factor nuclear enlazante por el ensayo de la Retraso de Movilidad en Gel Extractos nucleares fueron preparados como describe Digman, J.D., Lebovitz, R.M. y Roeder, R.G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489. Por el ensayo de la Retraso de Movilidad en Gel, el factor nuclear enlazante al sitio para NF-kB fue de VCAM-1 5'-CCTTGAAGGGATTTCCCTCCGCCT -3 y para BEF-1 fue la secuencia prototipo 5'-AGTGCATGACTGGGCAGCCAGCCAGTGGCAG-3' . los oligonucleótidos fueron marcados en sus extremos 5' con quinasa polinucleótida T4 (Bethesda Research Laboratories, Inc.) y (g-32P) ATP (Du Pont-New England Nuclear) . Cualquiera de los extractos nucleares que contiene BEF-1 o las proteínas humanas purificadas NF-kB (p49 y ?50) fueron incubadas con 0.2-0.3 mol de prueba (aproximadamente 10,000 cpm) a 25°C por 30 minutos. Los 10 ul de __la mezcla de reacción también contenían 200 ng de poli (dl-dC)- poli (dl-dC) (Pharmacia), 15 % glicerol, 20 mM HEPES (pH 7.9), 100 mM KCl, 5 M MgC12, 0.2 mM EDTA, y 0.5 mM ditiotreitol. Siguiendo los 30 minutos de incubación, las muestras fueron sometidas a eleccroforesis en un 4% de gel poliacrilamida, de fuerza iónica inferior como se describe por t'ried, M. ? Crothers, D. M. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 6b0b-652b. Después que el gel fue secado, los complejos de proteínas ADN específicos fueron visualizados por auto-radiografía y cuantificados usando un Analizador Betascopio 603 de Mancha o fosfoimagen (Molecular Dynamics) . Los resultados de la cuantificación con el uso de un Analizador Betascopio 603 de Mancha están expresados como la cantidad marcada de la prueba enlace/cantidad de prueba libre por ug de proteína. Los datos de la fosfoimagen fueron analizado con un software TP Lab gel (Ver. 1.5, Signal Analytics Corp.) y están expresados como unidades de intensidad pixel (PIU) .

Resultados Usando el ensayo del factor de transcripción enlazante, se evalúa la capacidad de presentarse el BEF-1 en extractos celulares para enlazar al sitio enlazante VCAM NF-kB y contrariamente, para purificar Nf-kB p49 y p50 para enlazar al sitio de enlace BEF-1. Como se muestra en la Tabla 1 usando dos niveles de BEF-1 que contienen extracto nuclear, se obtiene una concentración enlazante dependiente de BEF-1 al sitio enlazante VCAM-1 Nf-ktí. Como se muestra en la tabla 2, purificando proteínas NF-kB (pbO y p499: Promega) se enlazan al prototipo del sitio enlazante BEF-1, en una concentración de manera dependiente. Como se esperaría estas dos proteínas NF-kB también enlazan al sitio enlazante VCAM NF-kB. El efecto del compuesto A en el nivel del BEF-1 intracelular fue determinado midiendo la actividad enlazante BEF-1 en extractos nucleares preparados a partir del compuesto A en células humanas HepG2 tratadas y sin tratar. Como se muestra en la Tabla 3, en cuatro experimentos separados el tratamiento de células con 10 nM del compuesto A resultaron en un 193 a 293% (sugiriendo de 253 +/- 42) incrementando el nivel de BEF-1. Además, el compuesto A incrementa los niveles del represor intracelular BEF-1, y además puede modular la actividad del control de genes por BEF-1. Adicionalmente, la capacidad de BEF-1 para interactuar a los sitios de enlaces NF-kB, indica que el compuesto A podría ser efectivo en bloques de acción de la molécula reguladora celular importante NF-kB.

Tabla 1. Enlaces de BEF-1 a un sitio enlazante NF-kB Extracto nuclear Sitio enlazante BEF-1/Complejo del conteniendo BEF-1 sitio enlazante (PIU) Ninguno VCAMl (NF-kB) 0 1.4ug VCAM1 (NF-kB) 8.63 2.8 ug VCAM1 (NF-kB) 15.03 Tabla 2. Enlazante de NF-kB purificado a los sitios enlazantes BEF-1 y NF-kB.

Proteínas NK-kB Sitios enlazantes NF-kB/complejo del sitio enlazante (PIU) Ninguna BEF-1 0.88 p50 56pp BEF-1 4.46 p50 112pg BEF-1 11.16 p49 74 pg BEF-1 42.66 p49 148 pg BEF-1 77.73 Ninguna VCAM1 (NF-kB) -0.04 p50 112 pg VCAM1 (NF-kB) 46.19 p49 148 pg VCAM1 (NF-kB) 17.02 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es que resulta claro a partir de los objetos a los que la misma se refiera. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Un método para inducir el factor de transcripción BEF-1, caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la fórmula (I) en donde R1 y R3 son independientemente hidrógeno, 0 0 II // -CH3, - C -(alquilo C?-C6) o - C -Ar, en donde Ar es fenilo substituido opcionalmente; R2 es seleccionado del grupo que consiste de pirrolidina, hexametilenoimino, y piperidino; o una sal del mismo solvato, farmacéuticamente aceptable.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho compuesto es la sal del mismo clorhidrato.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho compuesto es o su sal de clorhidrato.