MXPA97009120A - Metodo y articulo implantable para promover endotelializacion - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un material poroso con una química superficial apropiada que promueve endotelialización capilar. El material tiene una porosidad suficiente para permitir endotelialización capilar y una molécula de adhesión con enlace tenaz que promueve el crecimiento hacia adentro de células endoteliales en la porosidad del material.

Description

METQDO Y ARTICULO IMPLANTABLE PARA CAMPO PB A IMVEWCIQW Esta invención se relaciona al campo de biomateriales, dispositivos médicos implantables y biología celular. En particular, la invención se relaciona a métodos para mejorar el desempeño de dispositivos médicos cuando se implantan en un ambiente biológico. En otro aspecto, la invención se relaciona a dispositivos tales como injertos vasculares implantables. ANTECEPENTES DE LA IMVEMCIOW Por mucho tiempo se han empleado biomateriales en cirugía reconstructiva para reemplazar órganos enfermos o lesionados. La mayoría de los biomateriales actualmente empleados para fabricar dispositivos implantados se desarrollaron originalmente para aplicaciones no-médicas. Inicialmente estos materiales se consideraban adecuados para utilizar en fabricar dispositivos de implante si no eran tóxicos y tenían propiedades fisicas que permitieran la fabricación de dispositivos deseados. Sin embargo, parece que la mayoría si no todos los biomateriales implantados comunmente empleados tienen algún potencial para producir respuestas indeseables en la interfase de material-tejido. Ver por ejemplo Han er, J.S. y B.L. Giammara, "Biomaterials and Biomedical Devices1', (Biomateriales y Dispositivos Biomédicos) Science 212:885-892(1988).

Actualmente, los dispositivos implantados se consideran exitosos en situaciones en donde cualesquiera respuestas superficiales indeseables que puedan ocurrir, no afectan debidamente al huésped o interfieren significativamente con la función primaria del dispositivo. Por ejemplo, la formación de una capa de trombo en la superficie luminal, no afecta típicamente la función de un injerto vascular de gran diámetro, mientras que puede ocluir un injerto de diámetro pequeño. La ivestigación inicial en el desarrollo de materiales que tienen biocompatibilidad mejorada se han enfocado grandemente en la generación de materiales que muestran mínima reacción con el tejido. Aunque este enfoque ha mejorado la función de varios dispositivos, se desean adicionales mejoras en la compatibilidad y desempeño de los dispositivos de implante. Estas mejoras pueden involucrar la generación de superficies del biomateriales que de hecho promueven interacciones de tejido deseables, por ejemplo, adhesión e infiltración por células de tejido deseables o convenientes específicas (Han er y colaboradores). Un tipo de infiltración de tejido conveniente involucra el proceso conocido como "endotelialización", que en el caso de un injerto vascular involucraría la migración de células endoteliales de tejido adyacente sobre la superficie luminal (es decir, la superficie que forra el lumen) y dentro del lumen del injerto.

Como se aplica a un injerto vascular, por ejemplo, dicha endotelialización puede ocurrir por dos mecanismos diferentes (Greisier, H.P., New Bioloaic and Sinthetic Vascular Prostheses . fNuevas Prótesis Vasculares Biológicas v Sintéticas. ) R.G. Landes, Co., Austin, Texas (1991)). Un mecanismo, denominado endotelialización, "transanasto ótica" , involucra promover crecimiento hacia adentro de pannus longitudinalmente al injerto, desde el lumen del vaso sanguíneo dentro del cual se inserta el injerto. La endotelialización por este método resulta en que células endoteliales forren el lumen del injerto, con pocas, de haber, células endoteliales en la porosidad del injerto. El otro mecanismo, denominado endotelialización "transmural" o "transintersticial" involucra promover el crecimiento hacia adentro de capilares y/o células endoteliales capilares a través de la pared del injerto y dentro de la porosidad. Estas células endoteliales se originan en la micro vasculatura de tejido adyacente externo al injerto vascular, y crecen a través de la pared de injerto vascular, en parte por virtud de su porosidad. Bajo condiciones apropiadas, las células endqteliales son capaces de crecer a través de la pared del injerto y colonizar el lumen de injerto. Las células endoteliales de crecimiento hacia adentro, a menudo son capaces de formar entonces capilares dentro de y a través de los poros del material que forma el injerto vascular; sin embargo, esta formación capilar no se ha verificado como un componente esencial del propio proceso. Ya que las células endoteliales en si se originan de capilares, y los capilares a menudo se observan dentro de la porosidad del injerto, en ocasiones la endotelialización transmural se refiere también como "endotelialización capilar". El proceso de endotelialización capilar puede distinguirse por sus etapas celulares secuenciales, incluyendo la conexión inicial de células endoteliales con el material de injerto, seguido por su difusión, migración hacia adentro, y opcionalmente, proliferación. Enfoques físicos para mejorar endotelialización han tendido a concentrarse en la propia superficie, por ejemplo, las cualidades de porosidad o rugosidad de la superficie. Goldon y colaboradores, por ejemplo, reporta que injertos de politetrafluoroetileno ("ePTFE") expandido con una distancia intermodal de 60 gm, proporciona una porosidad óptima para permitir endotelialización transmural en mandriles. (Ver Golden M.A., S.R. Hanson, T.R. Kirkman, P.A. Schneider, y A.W. Clowes, "Healing of Polytetrafluoroethilene Arterial Grafts is Influenced by Graft Porosity" (Sanado de Injertos Arteriales de Politetrafuoroetileno se Influencia por la Porosidad del Injerto), J. Vasc. Sura. ll:838-845f1990 Un tipo similar de injerto ePTFE con la misma intermodal de 60 µm se implanta en pacientes, sin embargo, y no permite endotelialización. (Ver Kohler, T.R., J.R. Stratton, T.R, Kirkman, K.H. Johansen, B.K. Zierler y A.W. Clo es, "Conventional Versus High-Porosity Politetrafluoroethilene Grafts: Clinical Evaluation", (Injertos de Politetrafluoroetileno Convencionales Contra de Alta-porosidad: Evaluación Clínica), Surgery 112:901-907 (1992)). Los solicitantes han establecido que los injertos de ePTFE implantados en pacientes son los diferentes que aquéllos implantados en mandriles, ya que los injertos de ePTFE con pacientes fueron de un tipo modificado que emplea una envoltura exterior de una película refuerzo. El producto conocido como "Injerto Vascular Gore-Tex" (Gore-Tex Vascular Graft) por ejemplo, es describe que tiene una longitud de fibrila promedio de 25 mieras, a fin de permitir incorporación de tejido circundante en el implante de injerto. Este producto particular, sin embargo, también proporciona una película de refuerzo, integral con la superficie exterior de injerto que se dice proporciona soporte externo al injerto, evita dilatación aneurísmica, mejora retención de sutura, y evita un efecto de "cierre de cremallera" problemático. En otros experimentos, la endotelialización transmural en perros se produce por un injerto de ePTFE en donde se crearon ppros de 800 µm con una aguja; sin embargo, la porosidad fue tan grande que se requirió precoagulación, para evitar sangrando excesivo. (Kusaba, A., C.R. Fischer, III, T.J. Matulewski, y T. Matsumoto, "Experimental Study of the Influence of Porosity on Development of Neointima in Gore-TexR Grafts: A Method to Increase Long-term Patency Rate" (Estudio Experimental de la Influencia de Porosidad en el Desarrollo de Neointima en Injertos Gore-Tex"11: Un Método para incrementar la Velocidad de Abertura o Permeabilidad de Largo Plazo), Amerf Sura. 47:347-354(1981). Factores de Crecimiento. Además de los enfoques físicos para lograr la endotelialización, por igual se han desarrollado otros enfoques químicos. Estos han tendido a concentrarse en el uso de diversas proteínas, incluyendo factores de crecimiento y proteínas de adhesión celular, o la fórmula de conexión de proteínas a la superficie. Los factores de crecimiento (GF) son polipéptidos solubles (con pesos moleculares que están típicamente en la gama de 5 a 50 kilodaltons) t que son capaces de difundirse a través del cuerpo y estimular la división celular (proliferación) . A la fecha parece que solo un tipo de GF, particularmente FGF-1, se ha reportado que promueve la endotelialización capilar en un injerto vascular. (Greisler, H.P., New Bioloaic and Synthetic Vascular Prostheses (Nuevas Prótesis Vasculares Biológicas y Sintéticas), R.G. Landes, Co., Austin, Texas (1991)). En este reporte, el GF no se inmoviliza en el dispositivo sin embargo, y de hecho se proporciona la forma que le permitiría quedar solubilizado. Específicamente, una mezcla de adhesivo de fibrina, heparina, y FGF*-1 se emplea para llenar los intersticios de un injerto vascular ePTFE con distancia intermodal de 60 µm. El injerto subsecuentemente se implanta en conejos y perros y resulta en endotelialización transmural mejorada. Parece que el adhesivo de fibrina se degrada para liberar FGF-1 soluble, que a su vez estimula la proliferación y migración de células del endoteliales para producir endotelialización capilar. Además de ser soluble, FGF-1 tienen el efecto secundario indeseable de promover la proliferación de células musculares lisas. Estas células también invaden la porosidad del injerto y se vuelven hiperplásticas en el lumen del injerto, un resultado que no sería considerado adecuado para uso médico. Kang, S.S., D. Ren y H.P. Greisler, "Vascular Smooth Muscle Cell Growth on Fibrin Glue Containing Fibrolast Growth Factor-1 and Heparin" ("Crecimiento de Células de Músculo Liso Vascular en Adhesivo de Fibrina que Contiene Factor de Crecimiento de Fibroblastos-1 y Heparina"), Trans. Soc. Biomat. 17:33 (1994). MQXécylas g adhesión, Las moléculas de adhesión típicamente son grandes proteínas, carbohidratos o glicoproteínas (típicamente 100 a 1000 kilodaltons) que sirve ligar a receptores de superficie celular específicos. A su vez, mecánicamente conectan células ya sea a un substrato ("molécula de adhesión superficial", o "SAM = Surface Adhesión Molecule") o a células adyacentes ("molécula de adhesión celular", o "CAM*= Cell Adhesión Molecule"). No parece las CAM's han sido sugeridas o empleadas para la mejora de características de endotelialización en dispositivos de implante. Aunque una cantidad de proteínas SAM ha mostrado mejora de integración de tejidp con dispositivos implantados (por ejemplo, demostrar crecimiento de fibroblastos incrementado, unión incrementada por tejido subcutáneo, inflamación disminuida y necrosis de tejido adyacente, y formación de cápsula fibrosa disminuida alrededor de los dispositivos implantados) parece que ninguno ha demostrado que mejora la endotelialización capilar. Ver, por ejemplo, Okada, T. , e Y. Ikada, "Tissue Reactions to Subcutaneously Implanted, Surfade-Modified Silicones", (Reacciones de Tejido a Siliconas Modificadas Superficialmente, Implantadas en Forma Sub-cutánea) , Sjomed, Mater, Res. 27:1509-1518(1993); Kirkham, S.M. y M.E. Dangel, "The Keratoprosthesis: Improved Biocompatability Through Design and Surface Modification" (La Queratoprótesis: Biocompatibilidad Mejorada a través de Diseño y Modificación Superficial), Ophth. Surgf. 22:455-461 (1991); Clapper, D.L., S.M. Kirkham and P.E. Guire, "ECM Proteins Coupled to Device Surfaces Improve in vivo Tissue Integration" (Proteínas ECM Acopladas a Superficies de Dispositivo Mejoran Integración de Tejido in vivo) , J. Cell, Biochem. 1£C.:283 (1994); y Kito, H. , N. Nakajima y T. Matsuda, "Differentiated Biocompatible Design of Luminal and Outer Graft Surfaces. Photocurable Extracellular Matrices, Fabrication, and Cellular Response" (Diseño Biocompatible Diferenciado de Superficies Luminales y de Injerto Exteriores. Matrices Extra Celulares Foto Curables, Fabricación y Respuesta Celular), ASAIO Journal 39:M506-M511 (1993). Williams y colaboradores demuestra que la adsorción de varias proteínas SAM diferentes (incluyendo fibronectina y una combinación de colágeno tipos I y III) en injertos vasculares mejoran la conexión in vitro de células endoteliales. Las proteínas se agregaron con el propósito de evaluar siembra de células, sin embargo y no hubo indicación de efecto alguno respecto a endotelialización capilar. Similarmente, se reporta la fibronectina adsorbida por Seeger y colaboradores, que produce un incremento ligero (es decir dos veces) en la retención de células endoteliales que se agregaron antes de implante de injertos vasculares en perros. (Ver respectivamente Williams S.K, y colaboradores, "Adult Human Endothelial Cell Compatibility with Prosthetic Graft Material" (Compatibilidad Celular Endotelial para Adulto Humano con Material de Injerto de Prótesis), J. Surg. Res. 38:618-629 (1985) y Seeger, J. M. y N. Klingman, "I proved in Vivo Endothelialization of Prosthetic Grafts by Surface Modification with Fibronectin" (Endotelialización In Vivo Mejorada de Injertos de Prótesis por Modificación Superficial con Fibronectina) , J. Vasc. Sura. 8:476-482 (1988)).

Unión CQvalente Factores químicos se han conectado a las superficies de soporte en una variedad de formas, incluyendo por adsorción pasiva como se describe en una variedad de las referencias anteriores. Las Patentes de los É.U.A. Nos. 4,979,959 y 5,263,992 se relacionan a la preparación y uso de dispositivos biocompatibles, en donde un agente biocompatible se liga covalentemente por un grupo fotoreactivo dentro de una porción de enlace químico, don un substrato de biomaterial. Con respecto a SAM's, Kito y colaboradores (anteriormente citado) utiliza fotoquímica para revestir la superficie exterior y llenar la porosidad de injertos vasculares dacrón con gelatina. La superficie luminal luego se reviste con sulfato de condroitina. Después de implante en perros por una semana, los injertos mostraron crecimiento hacia adentro de fibroblastos mejorado desde la superficie exterior a la porosidad de injerto y sin células endoteliales en la superficie luminal. No se reportó endotelialización capilar. En otro estudio, proteínas de adhesión se inmobilizaron por el uso de "foto química" a la superficie de injertos formada ya sea de poliuretano o ePTFE (Clapper, D.L., K.M. Hagen, N.M. Hupfer, J.M. Anderson y P.E. Guire, "Covalentiy Im obilized ECM Proteins Improve Patency and Endothelialization of 4 MM Grafts I planted in Dogs" (Proteínas ECM inmobilizadas covalentemente mejoran la Abertura y Endotelialización de injertos 4 MM implantados en perros), Trans. Soc. Biomat. 16:42 (1993)). Los solicitantes desde ese entonces han establecido que el material de injerto ePTFE particular se proporciona en una forma como se describió anteriormente, es decir que tiene una envoltura exterior de una película de refuerzo externa, integral con la superficie exterior de injerto, que serviría para reducir enormemente la porosidad de la pared. El poliuretano a su vez, tiene pocos poros de haber, que se obtienen completamente a través de las paredes de injerto. Utilizando un modelo de perro, ambos injertos demuestran diversos grados de cobertura de célula endotelial mejorada, cuando se revisten ya sea con fobronectina o colágeno tipo IV o ambos. Las células endoteliales presentes en el lumen de injerto en cada caso igualmente migran desde el lumen de la arteria adyacente por el proceso de endotelialización transanasto ótica. Cada tipo de injerto esencialmente no era poroso y todas las células endoteliales observadas en superficies luminales de injerto fueron parte de capas continuas de células endoteliales que se extienden a los lúmenes de arterias adyacentes. Este patrón de crecimiento celular es consistente con endotelialización transanastomótica en oposición a transmural. Se han reportado ejemplos en donde proteínas sovalente ente inmobilizadas producen integración de tejido mejorada con dispositivos de implante. Por ejemplo, cuando se acoplan a hule de silicona (por una combinación de descarga corona, polimerización de injerto y acoplamiento de carbodiimida) colágeno tipo I fue capaz de reducir el espesor de cápsulas fibrosas que se forman después de implante eub-cutáneo en ratas por 16 semanas (Okada, T. e Y. Ikada, "Tissue Reactions to Subcutaneously I planted, Surface-Modified Silicones" (Reacciones de tejido a silisonas modificadas superfialmente, implantadas a manera sub-cutánea) , J. Bjomed. Mater. Res, 22:1509-1518 (1993)). Colágeno tipo I es trombogénico sin embargo y no será adecuado para utilizar con implantes tales como injertos vasculares. Én otro experimento, se fotoinmobilizó un revestimiento de colágeno tipo IV sobre implantes de pecho a base de hule de silicona e implantó sub-cutáneamente en cerdos por 16 semanas. Los implantes revestidos mostraron mayor unión de tejido a la superficie del dispositivo y cápsulas fibrosas más delgadas (Clapper, 1994), arriba). Los implantes no se describen como porosos, sin embargo y no se describió endotelialización capilar. Aún en otra situación, un revestimiento de colágeno tipo I se aplica a un lente intracorneal de polimetilmetacrilato sólido y se implanta en córneas de conejo por 15 meses. El implante promueve unión de tejido estromal, reducir inflamación adyacente al dispositivo, y necrosis enormemente reducida de tejido córneo sobre el dispositivo (Kirkham y colaboradores arriba). De nuevo, el implante no fue tan poroso y no se describió endotelialización capilar.

Finalmente Kinoshita, Y., T. Kuzuhara, M. Kirigakubo, M. Kobayashi, K. Shimum, Y. Okada, "Soft tissue reaction to collagen-ímmobilized porous polyethylene: subcutaneous implantation in mts for 20 wk" (Reacción de tejido suave a polietileno poroso o inmobilizado con colágeno: implante subcutáneo en ratas por 20 semanas), Biomaterials , Vol. 14, No. 3, 209-215 (1993), describe un material de hoja de polietileno que tiene una gran porosidad (poros de 400 mieras) con colágeno I acoplado sovalentemente por polimerización de injerto. Se encontró que el material mejora el de crecimiento hacia adentro de tejido cuando se implanta sub-cutáneamente en un modelo de rata. El material laminar no se describe que tiene suficientes propiedades (por ejemplo rigidez sin soporte) para la preparación de un injerto vascular, ni se describe que tiene suficiente porosidad para ese propósito. También, como se describió anteriormente, colágeno I de hecho se considera inadecuado para utilizar con un injerto vascular, en vista de su naturaleza trombogenética. A la fecha parece que la técnica aún requiere materiales y métodos relacionados para proporcionar una superficie de implante que es capaz de promover en forma efectiva pronosticable y reproducible la endotelialización transmural o capilar. Parece que nada en la técnica a la fecha sugiere o intenta, mucho menos logra, la conexión covalente de un factor de adhesión conveniente a una superficie de soporte porosa rígida (por ejemplo ein soporte) de un dispositivo implantable, en una forma capaz de promover o mejorar la endotelialización dentro o a través de las paredes del dispositivo. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona Un articulo que comprende un dispositivo médico implantable formado de un biomaterial poroso rígido, que proporciona una superficie que se apoya en una molécula de adhesión in obilizada, en una cantidad y tipo adecuado para promover la endotelialización capilar del dispositivo in vivo . Los solicitantes han encontrado que en vista de la presente invención, pueden proporcionarse biomateriales que tienen la rigidez necesaria por el uso de un implante in vivo , mientras que al mismo tiempo proporcionan la porosidad necesaria para permitir el crecimiento de capilares a través de los poros del biomaterial. La práctica de la presente invención de esta manera evita la necesidad convencional por basarse en productos tales como ePTFE poroso que tiene una película de refuerzo exterior para utilizar en injertos vasculares. Por el contrario, la invención permite el uso de ePTFE poroso mismo, modificado solo por las moléculas de adhesión inmobilizadas aqui descritas. En una modalidad particularmente preferida, el artículo está en la forma de un injerto vascular y el biomaterial se elige del grupo que consiste de polímeros de tetrafluoroetileno (tal como ePTFE) resinas poliéster aromáticas/alifáticas (tales como tereftalato de polietileno ("PET") y poli(butilen tereftalato) ("PBT") poliuretanos y hules de silicona (tales como hules termocurados, y aquellos formados a partir de elastómeros de silicona de "vulcanización a temperatura ambiente" (RTV = room temperature vulcan zing) ) . En una modalidad adicional preferida, la molécula de adhesión se elige del grupo que consiste de fibronectina, laminina y colágeno. Injertos vasculares de la invención exhiben características de desempeño que se aproximan cercanamente a aquellas de vasos naturales, por ejemplo en términos de integridad, resistencia y cobertura de células endoteliales. En una modalidad preferida adicional, el injerto vascular se forma a partir de ePTFE que tiene poros que se extienden a través de la pared de injerto, y exhiben en el orden de 10 a 300 µm como distancia intermodal, como se determina por microscopía electrónica de exploración. En dicha modalidad, las moléculas de adhesión se inmobilizan covalentemente en la superficie, incluyendo las superficies de poro, del implante mediante fotoquímica. Los injertos vasculares de la presente invención se han encontrado que promueven endotelialización significativamente mejorada cuando se evalúan in vivo . Esta mejora puede expresarse en términos ya sea en el número de células que se encuentra colonizan las superficies de poros y la superficie interior del biomaterial, y/o en términos de la velocidad de endotelialización ante contacto con el cuerpo. Injertos preferidos demuestran en el orden de tres veces o más mejora en cualquiera o ambos aspectos en comparación con cotroles no revestidos y de preferencia cuatro veces o mayor. En comparación con otras técnicas conocidas, estos resultados representan mejora significativa. En otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar un dispositivo médico implantable; un dispositivo médico implantable preparado por este método; y un dispositivo médico implantable preparado por dicho método. El dispositivo puede formarse ya sea por pre-tratamiento de un biomaterial con moléculas de adhesión y luego fabricar el dispositivo a partir del biomaterial tratado, o al fabricar primero el dispositivo y luego tratar las superficies expuestas del dispositivo. En una modalidad preferida, el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un dispositivo implantable que se forma a partir de un biomaterial rígido poroso, que proporciona una superficie de contacto de tejido; (b) contactar la superficie con moléculas de adhesión que contienen uno o más grupos fotoreactivos latentes; y (c) activar los grupos fotoreactivos a fin de inmovilizar las moléculas de adhesión en la superficie. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para promover endotelializasión en un dispositivo médico implantado, el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un dispositivo implantable que se forma de un biomaterial rígido poroso, que suministra una superficie de contacto de tejido; (b) contactar la superficie del biomaterial con moléculas de adhesión que contienen uno o más grupos fotoreactivos; (c) activar los grupos fotoreactivos a fin de inmovilizar las moléculas de adhesión en la superficie, y (d) implantar el dispositivo en contacto con fluidos o tejidos corporales. DESCRIPCTPF DfnWA ft PB T-ft TTTVffl tOf La presente invención proporciona un artículo que comprende un dispositivo médico implantable formado de un biomaterial rígido poroso, que proporciona una superficie que contiene una molécula de adhesión inmovilizada en una cantidad y tipo adecuados, para promover endotelialización capilar a través de la superficie y en el dispositivo cuando se utiliza in vivo . Como aquí se emplean, los siguientes términos y palabras habrán de tener los siguientes significados adscritos: "dispositivo medido implantable", que por brevedad se referirá como un "dispositivo" o un "dispositivo médico" se referirá a un Objeto fabricado cuando menos en parte de un biomaterial y pretendido para utilizar en contacto con tejidos corporales, incluyendo fluidos corporales; "biomaterial" se referirá a la composión química del material empleado para separar un dispositivo y que proporciona una o más de superficies de contacto de tejido; "porosidad" y sus inflexiones (tales como "poros" y "poroso") habrá de referirse a un biomaterial que tiene pequeños canales o pasajes que empiezan en una superficie externa (por ejemplo, primera principal) del biomaterial, y se extienden substancialmente a través del biomaterial a una superficie interna (por ejemplo, segundo mayor); "rígido" y sus inflexiones, se referirán a la capacidad de un biomaterial particular, cuando se fabrica en la forma de un dispositivo médico implantable, para soportar las presiones que se encuentran en el curso de su uso, por ejemplo para retener la abertura y estructura de poros in vivo ; "superficie" se referirá a la interfase entre el biomaterial y su ambiente. El término se pretende que incluya el uso de la palabra tanto en su sentido macroscópico (por ejemplo, las dos superficies principales en una hoja de biomaterial), asi como en su sentido microscópico (por ejemplo, el forro de poros que recorren el material) . La superficie es capaz de Servir como un sitio de inmovilización para moléculas de adhesión celular, asi como para conexión y migración de células endoteliales; "moléculas de adhesión" se referirá a loe péptidos, proteínas y glicoproteínas capaces de ligarse a un substrato y/o células a fin de conectar células al subetrato o a células adyacentes; "endotelialización" a menos de que de otra forma se especifique, se empleará en forma intercambiable con la frase "endotelialización capilar" para referirse al crecimiento de células endoteliales substancialmente en todas las superficies que contactan tejidos de un biomaterial utilizadas para formar un dispositivo rígido poroso. PI POSITXVPS Los dispositivos de la presente invención incluyen dispositivos médicos pretendidos para contacto prolongado con fluidos o tejidos corporales y en particular, a aquellos dispositivos que pueden beneficiarse de la endotelialización capilar cuando se emplean en cualesquiera de aplicaciones in vivo o in vitro. Dispositivos preferidos son implantables en el cuerpo, e incluyen injertos vasculares y órganos artificiales, tales como el páncreas, hígado, y ríñones, otros dispositivos de implante convenientes incluyen, pero no están limitados a, dispositivos utilizados para implantar células modificadas genéticamente que suministran proteínas recombinantes para uso terapéutico, e implantes de órganos o tejidos artificiales, tales como piel, articulaciones, y oídos de reemplazo. La significancia de la endotelialización capilar variará con cada dispositivo particular, dependiendo del tipo y propósito del dispoeitivo. Capilares de crecimiento hacia adentro pueden ser útiles para proporcionar perfusión al dispositivo, por ejemplo para transportar nutrientes a células en el dispositivo y extraer productos de desecho. Capilares de crecimiento hacia adentro, también pueden ser útiles para proporcionar células endQtelialee para forrar las superficies de injertos vasculares para mejorada compatibilidad de sangre. Otros dispoeitivos convenientes son capacee de uSo in vitro, tales como aquélloe empleados para generación de órganos sometidoe a ingenería de tejidos. En el curoe de un proceeo de ingeniería de tejido, por ejemplo, un diepositivo externo puede servir como una estructura de andamio para el cultivo de células que a su vez, migrarán, proliferarán y se diferenciarán para formar tejidoe u órganos, que subsecuentemente se implantan en pacientes . BIOMATERIALJES Dispositivos de la presente invención pueden prepararse a partir de una variedad de biomateriales rígidos capaces de proporcionar una superficie para la adhesión y migración de células endoteliales. Una amplia variedad de materiales convenientes puede emplearse como soporte, las consideraciones primarias es que proporcionan una combinación óptima de propiedades como resistencia, área superficial, facilidad de preparación y uso y costo. Materiales de soporte preferidos son polímeros sintéticos, incluyendo oligómeros, homopolímeros y copolímeros que resultan ya sea de polimerizaciones por adición o condensación. Ejemplos de polímeros de adición adecuados, incluyen pero no están limitados a, acrílicos tales como aquellos polimerizados a partir de metil acrilato, metil metacrilato, ácido acrílico, ácido metacrílico, acrilamida, hidroxietil acrilato, hidroxietil metacrilato, gliceril acrilato, gliceril metacrilato, metacrilamida y etacrilamida; vinilos tales como estireno, vinil cloruro, vinil pirrolidona, alcohol polivinílico, y vinil acetato; polímeros formados a partir de etileno, propileno, y tetrafluoroetileno. Ejemplos de polímeros de condensación incluyen, aunque no están limitados a nylons tales como policaprolactama, polilauril lactama, polihexametilen adipa ida, y polihexametilen dodecandiamida, y también poliuretanos, policarbonatos, poliamidas, polisulfonas, poli (etilen) tereftalato, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polidimetilsiloxanos, y poliétercetona. Otros materiales de soporte convenientes incluyen metales y cerámicos. Los metales incluyen, aunque no están limitados a titanio, acero inoxidable, cobalto cromo. Los cerámicos incluyen, aunque no están limitados a nitruro de silicio, carburo de silicio, óxido de circonio, y alúmina, así como vidrio y sílice. ePTFE es un biomaterial preferido para utilizar en fabricar dispositivos implantables de la presente invención, y particularmente para fabricar injertos vasculares. ePTFE conveniente está disponible en la forma de injertos vasculares de fuentes tales como IMPRA, Inc., Tempe, AZ. Los injertos comercialmente disponibles se construyen de ePTFE y suministran en forma estéril en una variedad de configuraciones, incluyendo configuraciones rectas, ahusadas y escalonadas. Estos productos se conoce que son biológicamente inertes, son capaces de evitar respuesta inflamatoria significativa, y pueden prepararse para tener una estructura microporosa controlada. Dichos biomateriales pueden caracterizarse en una cantidad de formas, incluyendo por longitud de fibrila, el control de longitud de fibrila a su vez puede usarse para producir microestructuras que son capace de excluir o aceptar de crecimiento hacia adentro de tejido. RIGIDEZ Y POROSIDAD Biomateriales preferidos son aquéllos que proporcionan suficiente rigidez para sus propósitos pretendidos, in vivo o in vitro . Para utilizar en formar un injerto vascular, por ejemplo, un biomaterial será de rigidez suficiente para permitir que el injerto retenga abertura de injerto y estructura de poro en el curso de su uso pretendido. La rigidez de un biomaterial puede evaluarse por cualquier medio conveniente. Las regiones nodales de ePTFE están compuestas de PTFE no poroso, que sirven para proporcionar resistencia a rasgado (por ejemplo para suturas y resistencia a la dilatación aneurísmica) . Las regiones internodales están compuestas por fibras de PTFE que sirven conectar los nodos, con los espacios entre las fibras que proporcionan la porosidad aquí referida. El tamaño nodal puede expresarse como el porcentaje de superficie de contacto de tejido compuesta por PTFE nodal. La distancia entre los nodos puede expresarse como longitud de fibrila promedio. A su vez, la porosidad se expresa comúnmente como la distancia internodal (es decir la distancia promedio desde la mitad de un nodo a la mitad del nodo adyacente). Materiales ePTFE preferidos tienen nodos de tamaño y frecuencia suficientes para proporcionar resistencia adecuada (por ejemplo, con respecto a dilatación aneurísmica) y regiones intermodal de suficiente frecuencia y longitud de fibras, para proporcionar porosidad adecuada (para permitir endotelialización capilar) . Este material ePTFE es uno que proporciona nodos que comprenden en el orden de 30% o más, y de preferencia a 40% o más de superficie de contacto de tejido. Estos materiales proporcionarán menores nodos, aunque más gruesos, que a su vez conferirán mayor resistencia significativamente in vivo. Dada la presente especificación, aquellos con destreza en la especialidad serán capaces de identificar y fabricar dispoeitivos utilizando biomateriales que tienen una combinación conveniente de porosidad y rigidez. De preferencia los biomateriales son convenientemente porosoe para permitir la conexión y migración de células, que pueden eeguirse por la formación y crecimiento de capilares en la superficie. Poros convenientes pueden existir en la forma de pequeños canales o pasajes que empiezan en una superficie externa y se extienden parcialmente o completamente a través del biomaterial. En dichos casos, las dimensiones en sección transversal de los poros son más grandes que el diámetro de un capilar (5 µm) y típicamente son menos de 1 mm. Se prefieren poros interconectantes a fosos (poros no conectantes) . De preferencia a su vez, el diámetro promedio de estos poros está en la gama de aproximadamente 5 µm a aproximadamente 1 mm. La porosidad debe ser suficientemente grande para permitir endotelialización capilar; por lo tanto el diámetro promedio de poros individuales deberá ser mayor que aproximadamente 5 µm. El valor de tamaño de poros superior no es crítico siempre que el biomaterial retenga rigidez suficiente, sin embargo es poco probable que un dispoeitivo útil tenga un tamaño de poro promedio mayor a aproximadamente 1 mm. Eetas dimensiones de poro pueden cuantificarse por examen microscópico. Con un biomaterial preferido tal material ePTFE la porosidad puede determinarse para las áreas internodales del material. La distan?ia intermodal y los anchos del nodo también son factores útiles, no sólo para determinar la porosidad total, sino para determinar la resistencia del material por igual. MOLÉCULAS PE APHSSiQN Moléculas de adhesión convenientes típicamente son proteínas o carbohidratos de origen natural grandes, con pesos moleculares sobre 100,000 daltons. Las moléculas de adhesión in vivo típicamente son capaces de ligarse a receptores de superficie celular específicos, y conectar mecánicamente células al subetrato o a células adyacentes. Además de promover la conexión celular, moléculas de adhesión convenientes pueden promover otras respuestas celulares incluyendo migración celular y diferenciación celular (que a su vez puede incluir la formación de tubos capilar por células endoteliales). Moléculas de adhesión preferidas para utilizar en la presente invención incluyen moléculas de adhesión de substrato (SAM), tales como las proteínas lamininnas, flbronectina, colágeno, vitronectina, y tenascina, y péptidos de adhesión o análogos sintéticos funcionales derivados de SAM. Otras moléculas de adhesión convenientes incluyen moléculas de adhesión célula a célula (Leva) tales como N-caderina y P-caderina. Proteínas de adhesión principal (o padres) es decir nativas) típicamente tienen uno o más dominios de péptido activo que se ligan a receptores superficiales de células y producen las actividades de conexión, migración, y diferenciación de células de las proteínas de adhesión principales. Estoe dominioe coneisten de secuencias de aminoácidos específicae, varias de las cuales se han sintetizado y reportado que promueven la adhesión de células endoteliales. Estoe dominios y análogos funcionales de estoe dominios se denominan péptidos de adhesión. Péptidos de adhesión convenientemente utilizados en esta invención tienen entre aproximadamente 3 y aproximadamente 30 reeiduoe aminoácidos en sue secuencias de aminoácidos.

Péptidos de adhesión de fibronectina incluyen, pero no están limitados a, RGD (arg-gly-asp), REDV (arg-glu-asp-val), y C/H-V (WQPPRARI o trp-gln-pro-pro-arg-ala-arg-ile) . Los péptidos de adhesión de la lamihina incluyen, pero no están limitados a, YIGSR (tyr-ile-gly-ser-arg) y SIKVAV (ser-ile-lye-val-ala-val) y F-9 (RYWLPRPVCFEKGMNYTVR o arg-tyr-val-val-leu-pro-arg-pro-val-cys-phe-glu-lys-gly-met-asn-tyr-thr-val-arg) . Péptidos de adhesión de colágeno tipo IV, incluyen pero no están limitados a, Hep-III (GEFYFDLRLKGDK o gly-glu-phe-tyr-phe-asp-leu-arg-leu-lys-gly-aep-lye) . Ver por ejemplo, lae eiguientes descripciones, cada una de las cuales se incorporan aqui por referencia: Kleinman, H.K., B.S. Weeks, H.W. Schnaper, M.C. Kibbey, K. , Ya a ura y D.S Grant "The La inins: A Family of Base ent Membrane Glycoproteins Important in Cell Differenciation and Tumor Metastases" (Las Lamininas: Una Familia de Glicoproteínas de Membrana Baee Importantee en Diferenciación Celular y Metástasis de tumor) , Vitamines and Hormonee (Vjtamjnae y Hormonas) 47:161-186 (1993); Hubbell, J.A., S.P. Massia y P.D. Drumheller, "Surface-grafted Cell Binding Peptides in Tiseue Engineering of the Vaecular Graft" (Péptidoe de Unión Celular Injertados Superficialmente en Ingeniería de Tejido del Injerto Vascular) Am.N.Y. Acad. Scif Éá5_i253-258 (1992); Mooradian, D.L., J.B. McCarthy, A.P.N. Skubitz, J.D. Cameron y L.T. Furcht, "Characterization of FN-C/H-V, a Novel Synthetic Peptide from Fibronectin that Promotes Rabbit Corneal Epithelial Cell Adheeion, Spreading, and Motility" (Un nuevo péptido eintético de fibronestina que promueve adhesión, diseminación y movilidad de células epiteliales córneas de conejo), Invest. Ophth. & Vis. Sci, 11:153-164 (1993); Charonis, A.S., A.P.N. Skubitz, G.G. Koliakoe, L.A. Reger, J. Dege, A.M. Vogel, R. , Wohlhueter y L.T. Furcht, "A Novel Synthetic Peptide from the Bl Chain of Laminin with Heparin-binding and Cell Adheeion-promoting Activiee" (Un péptido eintético novedoso de la cadena Bl de laminina con actividades de promoción de adhesión celular y unión de heparina), J. Cell Biol. 107:1253-1260 (1988), y Koliakoe, G.G., K. Kouzi-Koliakoe, L.T. Furcht, L.A. Reger y E.C. Teilibary, "The Binding of Heparin to type IV collagen: Domain Specificity with identification of Peptide Sequencee from the a (IV) y a2(IV) Which Preferentially bind heparin" (La unión de Heparina a colágeno IV: Especificidad de Dominio con Identificación de secuencias Péptido de al(IV) y a2(IV) Que ligan Preferencialmente Heparina), J. Biol. Chem. 2 :2313-2323 (1989). La densidad de moléculas de adhesión que se tranportan por las superficiee de soporte del dispoeitivo, deberá eer suficiente para promover adhesión y migración de célulae endotelialee. Eeta deneidad puede proporcionarse en la forma de una pluralidad de diferentes tipos de moléculas y/o una pluralidad de moléculas de un tipo particular. RGD, por ejemplo, ee capaz de promover conexión y diseminación de células endoteliales cuando se inmoviliza a 0.001 femtomoles (10-lß molee) por centímetro cuadrado. Éeta ee la deneidad mínima conveniente de oléculae de adhesión (ver, por ejemplo Massia, S.P. y J.A. Hubben, "An RGD Spacing of 440 nm Is Sufficient for Integrin a„ß3-mediated Fibroblast spreading and 140 nm for Focal Contact and Streee Fiber Formation" (Un eepacia iento RGD de 440 nm es Suficiente para diseminación de fibroblastos mediados por a^Ji, de integrina y 140 nm para contacto focal y formación de fibras de tensión, J. Cell Biol. 111:1089-1100 (1991). También, una densidad muy superior se requiere para generar revestimientos producidos por entrelazamiento de moléculas de adhesión adyacentes. Este enfoque requiere 1 a 10 monocapas de moléculas de adhesión en la superficie de soporte, que serán aproximadamente 10"10 a 10"9 moles de péptido o 10~12 a 10"11 moles de proteína por centímetro cuadrado. Por lo tanto, la densidad de moléculas de adheeión convenientemente eetará en la gama de aproximadamente 10"1S a aproximadamente 10"* moles de moléculae de adhesión por centímetro cuadrado de superficie del biomaterial. INMOVILIZACIÓN De preferencia, las moléculas de adhesión ee ligan covalentemente al diepoeitivo poroeo por cualquiera de doe enfoquee. En una modalidad, lae moléculae de adhesión se ligan covalentemente a la superficie del biomaterial. En una modalidad alterna, lae moléculae de adheeión se ligan covalentemente a moléculas de adhesión adyacentes en una forma que produce una red entrelazada de moléculas de adhesión, con la red que está atrapada fieicamente dentro de la poroeidad interconectante del biomaterial. Diepositivos preferidos proporcionan las moléculas de adhesión conectadas en una forma que suminietra actividad efectiva deepuée de implante o en lae condicionee de cultivo celular anteriormente deecritas. Convenientemente, la unión covalente con cualquier enfoque se logra con grupos reactivos latentes. En la modalidad en donde moléculas de adhesión se ligan covalentemente a la superficie del biomaterial, las moléculas se ligan covalentemente en forma conveniente a la superficie a través de un grupo de enlace, el grupo de enlace incluye el residuo de un grupo reactivo latente que se emplea para ligar covalentemente la superficie. En otra modalidad preferida, el revestimiento de moléculas de adhesión se genera por enlace covalente de moléculas de adhesión adyacentes, resultando en una red de moléculas de adhesión entrelazadas que se atrapan físicamente dentro de la porosidad del biomaterial. De preferencia, una densidad adecuada de molécula de adhesión es distribuida de manera uniforme y homogénea en las superficies de material para proporcionar una superficie continua de moléculas de adhesión sobre la cual pueden conectarse y migrar células endoteliales» El termino "grupo reactivo latente" como ee emplea aquí, se refiere a un grupo químico que reeponde a una fuente de energía externa aplicada específica, a fin de someteree a generación de eepecie activa, reeultando en unión covalente con moléculae adyacentee o superficies de biomaterial. Grupos preferidos son suficientemente establee para almacenaree bajo condiciones en donde retienen dichas propiedades, Ver, por ejemplo, Patente de los E.U.A. No. 5,002,582, la descripción de la cual aquí se incorpora por referencia. Grupos reactivos latentes pueden elegiree que responden a diversas porciones del espectro electromagnético, con aquellas que responden a porciones ultravioleta y visible del espectro (referidos aquí como "fotoreactivo") se prefieren particularmente. Grupo reactivos latentes responden a estímulos externos aplicados específicamente para so eteree a generación de eepecie activae con unión covalente resultante a una estructura química adyacente, por ejemplo como se dispone por la misma o una molécula diferente. Grupos reactivos latentes son aquellos grupos de átomos en una molécula que retienen sue enlacee covalentes sin cambio bajo condiciones de almacenamiento pero que, ante activación por una fuente de energía externa, forman uniones covalentes con otras moléculas. Los grupos reactivos latentes generan eepeciee activas talee como radicales libres y particularmente nitrenos, carbenoe y eetadoe excitadoe de cetonas ante absorción de energia eléctrica, electromagnética o cinética (térmica) externa. Grupos reactivos latentes pueden elegirse para responder a diversas porciones del expectro electromagnético, y grupos reactivos reactivos latentes que responden por ejemplo a porciones de ultravioleta y visible del espectro se prefieren y aquí se refieren ocasionalmente como grupos "fotoquímicos". Aril cetonae fotorreactivae talee como acetofenona y benzofenona, o eue derivadoe, ee prefieren ya que estos grupos funcionales, típicamente son fácilmente capaces de someterse al ciclo de activación/inactivación/reactivación aqui descrito. La benzofenona es un grupo fotorreactivo particularmente preferido, ya que es capaz de excitación fotoquímica con la formación inicial de un estado de singlete excitado que ee somete a Cruzamiento intersistema al estado triplete. El estado triplete excitado pueden insertaree en uniones carbono-hidrógeno por extracción de un átomo de hidrógeno (de una superficie de soporte, por ejemplo) creando de esta manera un par de radicalee. Colapso subsecuente del par de radicales lleva a la formación de un nuevo enlace carbono-carbono. Si no está disponible una unión reactiva (carbono-hidrógeno) para enlace, la exitación inducida por luz ultravioleta del grupo benzofenona es reversible y la molécula regresa al nivel de energía de estado basal ante la remoción de la fuente de energía. Aril cetonas fotoactivables talee como beZofenona y acetofenona eon de importancia particular ya que eetos grupos se someten a múltiples reactivaciones en agua y de esta manera proporcionan incrementada eficiencia de revestimiento. Por lo tanto, aril cetonas fotorreactivas se prefieren particularmente. Las azidas conetituyen una claee preferida de grupoe reactivoe latentes e incluyen arilazidas talee como fenil azida y particularmente 4-fluoro-3-nitrofenil azida, acil azidas (-C0-N3) tales como benzoil azida y p-metilbenzoil azida, azido formeatos (-0-C0-N3) tales como etil azidoformeato, fenil azidoformeato o sulfonil azidas (-S02-N3) tales como benzensulfonil azida, y fosforil azidas (R0)2P0N3 tal como difenil fosforil azida y dietil fosforil azida. Compuestoe diazo conetituyen otra clase de grupoe reactívoe latentes e incluyen diazoalkanos (-CHN2) tales como diazometano y difenildiazometano, diazocetonas (-C0-CHN2) tales como diazoacetofenona y 1-trifluorometil-l-diazo-2-pentanona, diazoacetatos (-0-C0-CHN2) tales como t-butil diazocetato y fenil diazocetato, beta-ceto-alfa-diazocetatós (-C0-CN2-C0-0-) , tales como t-butil alfa diazoacetato. Otros grupos reactivos latentes incluyen los compuestos azo alifáticos tales como azobisieobutironitrilo, las diazidinas (-CHN2) talee como 3-trifluorometil-3-fenildiazirina, los cetenos (-CH=C=0) tal como ceteno y difenilceteno. Compuestos peroxi se contemplan como otra clase de grupos reactivos latentes e incluyen dialquil peróxidos tales como di-t-butil peróxido y dicicloxil peróxido y diazil peróxido tales como dibenzoil peróxido y diacetil peróxido y peroxiestirenoe talee como etil peroxibenzoato. Ante activación de loe grupoe reactivoe latentes, las moléculas de adhesión de revestimiento se ligan covalentemente entre sí y/o a la superficie material por enlaces covalentes a través de residuos de los grupoe reactivos latentes. Gupos reactivos latentes ejemplares, y sue residuos ante activación, se ilustran como sigue: Gru o Reactivo atente aril azidas amina R-NH-R' acil azidas amida R-CO-NH-R' azidoformeatos carbonato R-O-CO-NH-R' sulfonil azidas sulfonamida R-S02-NHR' fosforil azidas fosforamida (R0)2P0-NH-R diazoalcanos nuevo enlace C-C diazocetonas nuevo enlace C-C y cetona diazoacetatos nuevo enlace C-C y éeter beta-ceto-alfa-diazoacetatoe nuevo enlace C-C y beta-cetoéeter azo alifático nuevo enlace C-C diazirinas nuevo enlace C-C cßtenos nuevo enlace C-C cetonas fotoactivadas nuevo enlace C-C y alcohol dialquil peróxidos éteres Grupo Reactivo Latente Func onaljdafl de, Resjdup diacil peróxidos ésteree y nuevoe enlaces C-C peroxiésteres éteres, esteres, y nuevos enlaces C-C Moléculas de adhesión útiles en la invención convenientemente tienen un promedio de al menos dos y de preferencia tres o más grupos reactivos latentes por molécula de adhesión. El entrelazamiento entre moléculas adyacentes puede formarse a través del uso de moléculas de adhesión cada una que tienen dos o más grupos reactivos latentes. Dicho entrelazamiento contribuye a la retención de moléculas de adhesión dentro de la porosidad de dispositivos.

La capacidad de una superficie por promover endotelialización capilar puede determinarse en cualquier forma conveniente ya eea in vitro o in vivo. Una determinación preferida se logra al realizar un ensayo conocido como el ensayo de "cojín de grasa" de rata, como se describe aquí. Utilizando ensayo in vivo, típicamente se evaluará endotelialización para un biomaterial y dispoeitivo particular - tanto con como ein moléculae de adheeión inmovilizadas. Se ha encontrado que diepsoitivos implantables sin un revestimiento de la presente invención demostrarán poca o ninguna endotelialización capilar.

En comparación, dispoeitivos de la presente invención típicamente demuestran un incremento doble o más y de preferencia triple o más en el número de células o capilares endoteliales presentee en lae euperficiee de contacto de tejido (incluyendo poroe) de un biomaterial en comparación con un control no reveetido. La presente invención mejora la endotelialización en dispositivos al revestir la superficie material con una pluralidad de moléculas de adhesión. Como se describió anteriormente, la endoteliolización capilar en un dispoeitivo poroeo involucra condicionee pretendidas para promover la migración de células endoteliales en la porosidad, la proliferación de las células endoteliales, con o sin la formación en la estructura tubular de capilares. La invención además se ilustra los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 limpviligaióp 4e ?élulag de Adhsión Como se desctibe con mayor detalle a continuación, tres moléculas de adheeión (fibronectina, laminina, y colágeno tipo IV) se obtienen de fuentes comerciales y foto derivan por conexión covalente de un grupo reactivo latente fotoactivable. Las proteínas luego se agregaron a un dispoeitivo de injerto vaecular poroeo formado a partir de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) . Las proteínas se iluminaron para activar los grupos de activos latentes fotoactivables y producir inmovilización covalente al dispositivo ePTFE. ePTFE tiene un bajo contenido de hidrógenos extraíbles; por lo tanto, el mecanismo de fotoinmovilizacíón de las moléculas de adhesión a ePTFE se considera que ocurre priraordialmente por entrelazamiento de moléculas de adhesión adyacentes. A su vez, la red entrelazada csvalente ente de moléculas de adhesión se inmoviliza por atrapamiento fisico dentro de la porosidad de ePTFE. Materiales. Fibronectina de suero humano se obtiene de Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles, CA. Laminina producida de la linea de células de tumor de ratón Engelbreth-Holm-Swarm se obtiene de Collaborative BiomediCal Products, Bedford, MA. Colágeno de tipo IV de placenta humana se obtiene de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Injertos vassularee ePTFE con un diámetro interno de 6 mm o 10 mm un espesor de pared de aproximadamente 0.3 mm a aproximadamente 0.4 mm, una distancia internodal de 30 µm, y sin envoltura externa se obtienen de IMPRA, Inc., Tempe, AZ. Un material de injerto identificado como el producto "80S10TW" y (80 cm de largo, 10 mra de diámetro interior, recto, pared delgada) se emplea para preparar y evaluar discos revestidos como se describe a continuación. Sín esis d= Agen de. Entrelazamiento Heterobifuncional . Un agente de entrelazamiento heterobifuncional (BBA-EAC-NOS) se sintetiza y utiliza para foto derivar cada proteína. BBA-EAC-NOS tiene un grupo foto activable de benzofenona en un extremo (ácido benzoil benzoico BBA), un espaciador a la mitad (ácido épsilon aminocapróico EAC), y un grupo de acoplamiento termoquímico reactivo de amina en el otro extremo (N-oxisucCinimida, "NOS"). BBA-EAC ee sintetiza a partir de cloruro de 4-benzoílbenzoílo y ácido 6-aminocapróico. Luego, el éster NOs de BBA-EAC se sintetiza por esterificasión del grupo carboxi de BBA-EAC por activación de carbodiimida con una N-hidroxieuccinimida para dar BBA-EAC-NOS. Fotoderivación y. RadJc-e iqúe aQ e Moléculas § _ Adhesión. Se fotoderivan fibronectina, la inina y colágeno tipo IV por acoplamiento covalente de aminas primarias en las proteínas por el éster NOS de BBA-EAC-NOS. El BBA-EAC-NOS se agrega en una proporción de 10-15 moles de BBA-EAC-NOS por mol de proteína. Después de la fotoderivatización, se radioetiqueta con tritio una alícuota de cada proteina fotoderivada para utilizar en cuantificar la cantidad de proteína que se fotoinmoviliza en el ePTFE. El procedimiento de radioetiquetado primero consiete de agregar un mol de formaldehído por 5 molee de amina en cada proteina. la base de Schiff reeultante luego se reduce con un mol de borohidruro de sodio (4-20 curies por milimol) por 20 moles de amina en la proteina. Radioetiquetado en exceso se retira por diálisis. Unión covalente de moléculas de adhesión fotoderivadas a ePTFE. Soluciones de proteínas fotoderivadas se agregan a ePTFE, se deja que adsorban por 2 horas a temperatura ambiente e iluminan a de 320 a 340 nm para activar las porciones BBA y producir acoplamiento covalente. Laminina y fibronectina se agregan a 25 µg de proteína por centímetro cuadrado de ePTFE, y colágeno tipo IV se agrega a 100 µg de proteina por centímetro cuadrado de ePTFE. Después de iluminación, proteínas desacopladas se retiran a lavar las muestrae durante la noche en ealino amortiguado con foefato (PBS) que contiene 1 % de Tween 20. Después del lavado con PBS/Tween 20, las muestrae se esterilizan al empapara por 20 inutoe en etanol al 70%. El reeiduo de Tween 20 y etanol luego se retira al lavar en PBS estéril. Niveles inmovilizados de proteínas en ePTFE. Proteínas etiquetadas con tritio se emplean para cuantificar niveles inmovilizados de cada proteina en ePTFE, con cada proteina tritiada que se aplica ya sea después de fotoderivar (para cuantificar la cantidad de proteina inmovilizada por fotoinmovilización) o antes de fotoderivarse (para cuantificar la cantidad de protelna inmovilizada por adeorción) . Como se ilustra en la Tabla 1, superiores niveles de cada proteina se inmovilizaron mediante fotoquímica que por adsorción, con las diferencias respectivae que ee 2.5 vecee euperior con laminina 14 veces superior con colágeno tipo IV y 1.6 veces superios con fibronectina. Bajo estas condiciones, el porcentaje de cada fotoproteína agregada que se fotoinmoviliza (por ciento de eficiencia de acoplamiento) estuvo en la gama de 2.0 a 9.4.

Niveles de moléculas de adhesión tritiadas que se inmovilizan en ePTFE. Niveles de proteínas inovilizadas se ilustran como el promedio de tres replicados; S.E.M. indica el error standard del promedio.

Reveetimiento Proteina proteXna % de Eficiencia de Proteina ua/cp S.E.M- de Acoplamiento Laminina 25 0.95 0.12 3.8 Foto-laminina 25 2.34 0.71 9.4 Colágeno Tipo 100 0.24 0.02 0.24 IV Foto-colágeno 100 3.45 0.49 3.4 Tipo IV Fibronectina 25 0.32 0.04 1.3 Foto-fibro- 25 0.50 0.05 2.0 nectina EJEMPLO 2 Actividad biológica in vitro de moléculae de adhesión inmovilizadas. Discos de ePTFE con diámetro 1.4 cm se revistieron con proteínas fotoderivatizadas no tritiadae utilizando el protocolo deecrito anteriormente. Luego ee evaluaron para actividad bilógica in vitro en un eneayo para determinar su capacidad por soportar la proliferación de células endoteliales vasculares. Discos ePTFE sin revestir se evaluaron como controles y los discos restantes se revistieron ya sea con laminina, colágeno tipo IV o fibronectina. Cada uno de los cuatro tipos de discos se coloca en pozos individuales de placas de cultivo celulares de 24 pozos, sembraron con 1500 células por pozo de células endoteliales pulmonares de terneras (células CPAE, que se obtienen de American Type Culture Collection, Rockville, MD) , y cultivaron bajo condiciones de cultivo celular standard que se establecen por American Type Culture Collection. Depués de seis días de cultivo, el número relativo de células en cada pozo se determina utilizando un colorante etabolico de tretrazolio. Cuando el colorante de tetrazolio (MTT) se agrega a células, la actividad metabólica de las células vivas convierte el MTT agragado a un producto de color, con la cantidad de generación de color que es proporcional al número de células viables presentes. Ya que el producto de color de metabolismo MTT absorbe luz a 570 nm, la cantidad relativa de células que crecen en cada disco ePTFE, puede cuantificarse al solubilizar las células en cada disco y medir la absorbancia de la solución resultante en un espectrofotómetro a 570 nm como se describe por "Mosmann, T. , "Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Surviral: Aplication to Proliferation and Cytotoxicity Aseays" (Ensayo Colorimetrico Rápido para Crecimiento Celular y Superviviencia: Aplicación a Ensayos de Proliferación y Citotoxicidad), J. Immunol. Method. 65:55-63 (1983).

La Tabla 2 muestra que ePTFE revestido con Icada tipo de proteína, soporta en el orden de 19 veces o más númeroe de células endotetiales, en comparación con un control no revestido. Puede notarse que cada proteina fotoinmovilizada promueve un nivel similar de crecimiento celular endotelial que es consistente con resultados que se reportan por otros como se describió anteriormente. Crecimiento de células endoteliales en ePTFE previamente revestido con proteínas fotoinmovilizadas. Números de células relativos se expresan en términos de la absorbancia de un colorante de tetrazolio y un (MTT) que se mide a 570 nm con el pomedio de 4 réplicas y error estándar de promedio (S.E.M.) ilustrado.

Revestimiento de Absorbancia MTT a 570 nm proteína Promed o S.E.M. Sin revestir 0.008 0.004 Foto-laminina 1.153 0.002 Foto-colágeno 0.158 0.007 Foto-fibronectina 0.153 0.006 Se realizaron experimentos similares para comparar directamente el crecimiento de células CPAE en ePTFE previamente revestido con proteínas adsorbidas o fotoinmovilizadas. Los niveles inmovilizados de fibronectina y colágeno fueron similares a aquellos reportados en la Tabla 1, y las muestra ePTFE revestidas se evaluaron para crecimiento de células CPAE como se describe para la Tabla 2. Los resultados del crecimiento celular mostraron inesperadamente que el nivel de crecimiento celular que se encuentra con proteínas adsorbidas no fue estadísticamente diferente que el observado para muestras no revestidas. En contraste, las proteínas fotoinmovilizadas promovieron consistentemente el crecimiento CPAE que era mayor que los controles no revestidos, y comparable a aquel observado con las proteínas fotoinmovilizadas en la Tabla 2. Mientras que no se pretende estar ligado por teoría, parece ser que las proteínas adsorbidas se retiran de ePTFE por las células CPAE, produciendo de esta manera una superficie que es comparable con aquella de ePTFE sin revestir. En contraste, proteínas covalentemente inmovilizadas (fotoinmovilizadas) no se retiraron por células CPAE y proporcionan una superficie estable para crecimiento celular. Aún más, se espera que la estabilidad mejorada de estae proteínae covalentemente inmovilizadae mejore similarmente la estabilidad de estoe reveetimientoe después de que se exponen a los rigores del ambiente in vivo .

EJEMPLO 3 Endotelialización Capilar en ePTFE Revestido en el Modelo de Rata Sistema de implante de colín de arasa de epididimO de rata. Los solicitantee han encontrado que moléculae de adheeión de la presente invención deberán ligarse fuertemente, por ejemplo covalentemente a un subetrato a fin de promover la entotelialización en diepoeitivoe de implante poroeo. A fin de aproximaree máe cercanamente al nivel de endotelializasión necesario para aplicaciones en humanos, y a su vez pronosticar el desempeño de diversas modalidades, puede emplearse un sistema de implante animal conveniente. La mayoría de los dispositivoe para loe cuales la invención ee probablemente empleada en pacientee (por ejemplo injertoe vasculares) se implanta en sitios sub-cutáneoe o eimilaree. Eetos sitios típicamente presentan grandes cantidades de tejido adiposo, A su vez, a menudo 90 % o más de las células presentes en este tejido adiposo son células endoteliales microvasculares, con la mayoría de las células restantes que son células adiposas (ver Williams, S.K. , T.F. Wang, R. Castrillo y B.E. Jarrel, "Liposuction-derived Human Fat Used for Vascular Graft Sodding Contains Endothelial Celle and Not Meeothelial Celle as the Major Cell Type" (Grasa Humana Derivada de Liposucción que se Emplea para Impregando de Injerto Vascular que Contiene Células Endoteliales y no Células Mesoteliales como el Tipo de Célula Principal), J. Vasc. Sura. 19_:916-923 (1994). En constraste con los humanos, sitios sub-cutáneos en animales típicamente contienen poco tejido adiposo, pocas células endoteliales microvascularee y numeroeoe fibroblaetos (Williams, S.K. y L.B. Kleinert, "Differential Healing of EPTFE Implante in Subcutaneous Versue Adipoee Tiesue" (Sanado diferencial de implantes ePTFE en tejido sub-cutáneo contra adipososo) páginas 74-75 del cuaderno de notas del Simposio para superficies en Simposio de Bio-materiales que se efectuó en Scottsdale, AZ (Septiembre 7-10, 1994). Sin embargo, grasa de epididimo de rata tiene una morfología que semeja cercanamente a la grasa subcutánea humana en contenido celular. Aún más, células endoteliales micro vasculares de cojines de grasa de epidídimo de rata pueden asilarse y cultivarse utilizando procedimientos similares a aquellos empleados para células endoteliales microvasculares de tejido de adiposa sub-cutánea humana. A continuación se da un protocolo desarrollado por el Dr. Stuart Williams de la Universidad de Arizona en Tucson, e incorporado aqui para la evaluación de dispositivos revestidos de la presente invención en un modelo animal. Protocolos de Implante« 18 ratas Sprague Dawley adultas se implantaron con discos de diámetro de 1 cm de ePTFE reveetido en la forma descrita para la Tabla 2. También, cuatro tipoe de mueetras como se describe en la Tabla 2 se evaluaron, es decir controles no revestidoe y cada una de tree proteínas fotoinmovilizadas (larainina, colágeno tipo IV y fibronectina). Para la cirugía de implante, cada rata se anestesió con 50 mg/kg Nembutal"*, se practicó una incisión abdominal en línea media y la porción distal de cada cojín de grasa de epidídimo se expuso quirúrgicamente. La capa serosa, de cada cojín de grasa se cortó, y un disco de ePTFE se insertó en cada cojín de grasa; por lo tanto, cada rata recibió dos discos de ePTFE. Los discos de ePTFE se inmovilizaron al suturar la grasa alrededor de cada disco y se cerraron las incisiones abdominales. Cada una de los cuatro variaciones de revestimiento se implantó en nueve ratas diferentes, con las dos variantes implantadas en cada rata que son aleatorizadas. Seie ratae (que contienen tree diecoe con cada variación de revestimiento) se terminaron a l, 3 y 5 semanae, respectivamente. Los discos y el tejido de epidldimo circundantes se explantaron y prepararon para histología e inmunoocitoquímica. Histojoaia. Cada muestra de ePTFE y tejido circundante se fija con 4% de paraformaldehído en salino amortiguado con foefato (pH 7.4) incruetan en parafina, seccionan, desparafinan y manchan para permitir visualización de las células que crecen en la porosidad de ePTFE. Secciones manchadas con hematoxilina y eosina (H&E) mostraron grandes cantidades de capilares en discos ePTFE revestidos con fibronectina o laminima; sin embargo, ee observaron menos capilares en discos revestidos con colágeno tipo IV o discos de control sin revestir. Ya que H&E no puede emplearse para distinguir entre células endoteliales y diversoe otros tipos de células, una mancha inmunocitoquímica específica para células endoteliales vasculares se emplea para verificar que las estructurae que aparecen como capilares (con base en manchado H&E) sin duda estuvieron compueetae de células endoteliales. Se emplea un procedimiento inmunocitoquimico que se basa en la presencia de un carbohidrato de superficie celular única dentro de células endoteliales vasculares que pueden mancharse por la lectina griffonia (ver, por ejemplo Christy, J.P., F.M. Lupinetti, A.H. Mardan y S.A. Thompson, "Endothelial Cell Viability in the Rat Aortic Wall" (Viabilidad de Célulae Endotelialee en Pared Aórtica de Rata), Ann- Tfrprac, Su g. 51:204-207 (1991). El procedimiento de manchado involucra reaccionar eeccionee de tejido con Griffonia etiquetada con fluoresceína y utilizando un microscopio de fluorescencia para identificar las células que muestran la fluorescencia. Para este estudio, el grupo fluorescente en Griffonia fue isotiocianato de fluoresceína (FITC). El manchado con Griffonia etiquetada con fluoresceína produce dos resultados significantee. Primero, el eneayo confirma que las estructuras tipo tubo parecen ser capilares, cuando se evalúan con manchado H&E ein duda estaban compuestas de células endoteliales. Los números relativos de capilares presentes en discoe no revestidos contra aquellos con cada revestimiento de proteina se ilustra en la Tabla 3, y muestran que tres a cuatro veces de capilares crecieron en ePTFE revestido con fibronectina o laminina que en discos sin revestir o discoe revestidos con colágeno tipo IV. En segundo, el eneayo confirmó la preeencia de célulae endoteliales adcionales que no formaron capilaree, aeí como muchae otras células endoteliales que estuvieron presentes en la porsidad de discoe ePTFE revestidos con colágeno tipo IV pero no en discos de control (sin revestir) o en discos revestidoe con fibronectina o laminina. Loe datos eoportan la conclusión de que: l) discos ePTFE sin revestir promueven el crecimiento hacia adentro de pocas células endoteliales y pocos capilares, 2) discoe ePTFE revestidos con colágeno tipo IV promueven el crecimiento hacia adentro de células endoteliales pero la mayoría de estas células endoteliales no forman capilares y 3) discos ePTFE reveetidos con fibronectina o laminina promueven el crecimiento hacia adentro de célulae endotelialee con un nivel significante de formación capilar.

Crecimiento hacia adentro de capilares en muestrae ePTFE reveetidas implantadas en cojines de grasa de rata por 5 Semanas. Tubos capilares se contaron en campos de microscopio de 400 x 400 mieras (0.16 milímetro cuadrado) y convirtieron a partir de números por 0.16 milímetro cuadrado a números por 1 milímetro cuadrado. Los medios son promedios de 5 a 9 determinaciones. S.E.M. es el error standard del promedio. Tubos Capilares por milímetro cuadrado Revestimiento de Promedio S.E.M.

Sin revestir 31 . 2 5. 1 Foto-laminina 95.6 5. 3 Foto-colágeno 30.0 6 . 1 Foto-fibronectina 138 19. 4 Ya que la endotelialización capilar en las paredes de un injerto es un componente clave en el proceso de una endotelialización trasnmural in vivo, revestimientos que son capaces de promover endotelialización capilar en los discos ePTFE implantados en cojines de grasa de epididi o de rata, puede espararse que pr uevan endotelialización transmural de injertos interposicionales implantados en arterias. Los ejemplos demuestran que las proteínas de adhesión pueden ligarse covalentemente a ePTFE a niveles considerablemente superioree que los observados con adsorción simple. Muestran también que cada proteína fotoin ovilizada produce una mejora similar de 19 veces en crecimiento celular endotelial in vitro . Finalmente, los ejemplos demuestran que fibronectina y laminina, pero no colágeno tipo IV, producen endotelialización capilar significativamente mejorada in vivo. Mientras que se ha descrito en estoe eje ploe una modalidad preferida de la presente invención, habrá de entenderee que diversos cambios, adaptaciones y modificaciones pueden practicarse sin apartarse del espíritu de la invención y el alcance de las revindicaciones anexas.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES 1.- Un artículo caracterizado porque comprende un diepósitivo médico implantable formado a partir de un material poroso rígido que proporciona una superficie que contiene una molécula de adhesión inmovilizada en cantidad y tipo convenientes para promover la endotelialización capilar del diepoeitivo in vivo.
2. 2.- Un artículo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el artículo está en la forma de un injerto vascular.
3. 3.- Un articulo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el biomaterial se elige del grupo que consiste de polímeros de tetrafluoroetileno, resinae poliéeter aromáticas/alif ticas, poliuretanos y hules de silicona.
4. 4.- Un articulo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque los polímeros de tetrafluoroetileno comprenden ePTFE, las resinas poliester aromáticas/alifáticas comprenden polietilenterftalato ("PET") o poli (butilentereftalato) ("PBT") y los hules de silicona comprenden hules termo curados o elastómeros de silicona.
5. 5.- Un artículo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el biomaterial es ePTFE.
6. 6.- Un articulo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la molécula de adhesión se elige del grupo que consiete de fibronectina, laminina, colágeno y eus dominios de péptido activo.
7. 7.- Un artículo de conformidad cort la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de adhesión se elige del grupo que consiste de fibronectina, laminina, colágeno y sus dominios de péptido activo.
8. 8.- Un artículo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque ePTFE exhibe distancia internodal en el orden de 10 a 300 mieras.
9. 9.- Un método para preparar un dispositivo médico implantable, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) proporcionar un dispositivo implantable que se forma a partir de un biomaterial rígido poroso, que proporciona una superficie; # contactar la superficie con moléculas de adhesión que contienen uno o más grupos fotoreactivos latentes; y (c) activar los grupos fotoreactivos a fin de inmovilizar las moléculas de adhesión en la superficie para promover endotelialización Capilar del dispoeitivo in vivo.
10. 10.- Un método para utilizar un diepositivo médico implantado, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) proporcionar un dispositivo implantable que se forma a partir de un biomaterial rígido poroso, que proporciona una superficie; (b) contactar la superficie con moléculas de adhesión que contienen uno o más grupos fotoreactivos latentes; y (c) activar los grupos fotoreactivos a fin de inmovilizar las moléculas de adhesión en la superficie para promover endotelialización capilar del dispoeitivo in vivo ; y (d) implantar el dispositivo en contacto con fluidos o tejidos corporales.
11. 11.- Un dispositivo médico implantable preparado por un procedimiento que comprende las etapas de: (a) proporcionar un dispoeitivo implantable que se forma a partir de un biomaterial rígido, poroso, que proporciona una superficie; (b) contactar la superficie con moléculas de adhesión que contienen uno o más grupos fotoreactivos latentee; y (c) activar los grupos fotoreactivos a fin de inmovilizar las moléculas de adhesión en la superficie para promover endotelialización capilar del dispositivo in vivo .
12. 12.- Un dispositivo médico implantable caracterizado porque se prepara por un procedimiento que comprende las etapas de: (a) proporcionar un dispositivo ímplantable que se forma de un biomaterial rígidom poroso, que proporciona una superficie; (b) contactar la superficie con moléculas de adhesión que contienen uno o más grupos fotoreactivos latentes; y (c) activar los grupos fotoreactivos a fin de inmovilizar las moléculas de adhesión en la superficie para promover endotelialización capilar del dispositivo in vivo .