MXPA97007235A - Plasmido de acido nucleico contenido en un hibrido favorecido para uso en terapia de genes - Google Patents

Abstract

Construcciones deácidosnucleicos que contienen promotores híbridos para uso en la terapia génica y la manipulación genética. La invención se refiere a una construcción deácido nucleico para la expresión precisa y regulada de genes en células hospedantes, construcción que exhibe al menos una mutación que inhibe la expresión adecuada del gen expresado y exhibe al menos una segunda mutación adicional que realza la inhibición debida a la primera mutación, a una célula aislada que alberga la construcción deácido nucleico, y al uso de la construcción deácido nucleico para preparar productos farmacéuticos y para tratar enfermedades con una proliferación celular excesiva.

Description

PLASMIDO DE ACIDO NUCLEICO CONTENIDO EN UN HÍBRIDO FAVORECIDO PARA USO EN TERAPIA DE GENES.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a construcciones de ácido nucleico que se pueden utilizar en la manipulación genética y, en particular, en la profilaxis o terapia de enfermedades (denominada terapia génica en lo que sigue). En la terapia génica, los genes que se han de expresar en un organismo se introducen en el organismo. La regulación de la expresión de estos genes es de importancia para el efecto profiláctico o terapéutico de la terapia génica. Reguladores de la expresión de un gen se describen en las solicitudes de patente PCT/GB95/02000 , PCT/EP95/03370 , PCT/EP95/03371, PCT/EP95/03368 y PCT/EP95/03339. Estos regu-ladores comprenden una secuencia de activador cuya función es, por ejemplo, la activación específica de la célula o específica del virus de la transcripción basal. La secuencia de ADN de esta secuencia de activador está enlazada por su extremo 3' al extremo 5' de un módulo promotor. A su vez, el gen estructural está enlazado por su extremo 5' al extremo 3' del módulo promotor. El módulo promotor está constituido por secuencias de ácidos nucleicos para la fijación de los factores de transcripción de las familias CDF y CHF o de las familias E2F y CHF. En las fases GO y Gl del ciclo celular, esta fijación conduce a la inhibición de la secuencia de activador situada más arriba y, por consiguiente, a la inhibición o transcripción del gen estructural que está situado más abajo (es decir, en la dirección de transcripción). En las fases GO y Gl de la división celular, el ADN que está contenido en la célula está en el estado diploide. En la fase GO , la célula está en reposo, mientras que en la fase Gl está inhibida su progresión del ciclo celular. La fase Gl es seguida de la fase S, en la que tiene lugar la síntesis de ADN y en la que se replica el genoma. A continuación, sigue la fase G2, en la que la célula está en el estado tetraploi-de. La fase G2 es seguida por la división celular (mitosis = fase M). Las células hijas pasan entonces al estado GO o al estado Gl. La combinación de una secuencia de activador específica de la célula o específica del virus y un módulo promotor que inhibe esta secuencia de activador en las fases GO y Gl hace posible, por consiguiente, regular la expresión de un gen estructural de una manera específica de la célula o específica del virus y, también, específica del ciclo celular (es de-cir, restringida a las fase S y G2). La combinación de una secuencia de activador y un módulo promotor se denomina un promotor quimérico. Mientras que existen muchas posibles aplicaciones para promotores quiméricos en la terapia génica, también existe un cierto número de limitaciones que surgen de una serie de deficiencias. Son ejemplos de estas limitaciones: una débil secuencia de activador que lleva a cabo una transcripción demasiado baja del gen estructural, el uso de una secuencia de activador que no puede ser inhibida por el módulo promotor elegido de una manera suficientemente dependiente del ciclo celular, la restricción a dos reguladores (por ejemplo específico de la célula o específico del virus y específico del ciclo celular) de la transcripción del gen estructural, - un transporte intracelular inadecuado del producto de la transcripción del gen estructural que ha sido introducido en la célula. La presente invención supera las deficiencias de promotores quiméricos conocidos para expresar genes extraños, pro-porcionando las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención que permiten la expresión regulada de genes extraños en células hospedantes.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención poner a disposi-ción construcciones de ácidos nucleicos que permitan la expresión de genes extraños (transgenes) a ser regulados de una manera precisa en células hospedantes. Por lo tanto, la presente invención se refiere a construcciones de ácidos nucleicos en las que la regulación precisa del transgen se consigue mediante al menos una secuencia de ácido nucleico que exhibe una primera mutación que inhibe la expresión adecuada de un transgen, y en la que al menos una secuencia de ácido nucleico adicional exhibe una segunda mutación que abóle la inhibición debida a la mutación en la o las primeras secuencias de ácido nucleico. Más particularmente, la construcción de ácido nucleico de la presente invención regula la expresión de un transgen en una célula hospedante utilizando construcciones alternati-vas. Cuando la secuencia de ácido nucleico que contiene la primera mutación es un transgen (b) que contiene una mutación que inhibe la transcripción y/o la traducción de dicho transgen, o que inhibe la función del compuesto farmacológicamente activo, entonces la construcción de ácido nucleico comprende, además, una primera secuencia de promotor o reforzador (a) que está situada más arriba del extremo 5' del transgen o, alternativamente, cuando la secuencia de ácido nucleico que contiene la primera mutación es una primera secuencia de promotor o reforzador (a'), que contiene una mutación que inhibe la función del primer promotor, entonces la construcción de ácido nucleico comprende, además, un transgen (b') que codifica un compuesto farmacológicamente activo. En cualquier caso, al menos una secuencia de ácido nucleico que contiene la segunda mutación abóle la inhibición debida a la primera mutación. Estas secuencias de nucleótidos se encuentran bajo el control de secuencias de promotor idénticas o diferentes, de modo que un transgen sólo puede ser expresado cuando se activan todas estas secuencias de promotor. Preferiblemente, las nuevas construcciones de ácidos nucleicos comprenden al menos los siguientes componentes, enumerados en la dirección de lectura desde el extremo 5' al extremo 3 ' : una primera- (I) secuencia de promotor o reforzador (a) que es no específica, es específica de la célula o específica del virus o que se puede activar por tetraciclina o metabólicamente y/o de manera específica del ciclo celular, que activa la transcripción de un transgen y que puede contener una mutación (a') que inhibe la función del promotor, un transgen (b') que, en calidad de gen estructural, codifica un compuesto activo y puede contener una mutación (b) que detiene la transcripción y/o la traducción de este gen estructural o inhibe la función del producto del gen est ructural , una segunda (II) secuencia de promotor o activador (c) o (c') que es no específica, es específica de la célula o específica del virus, o que se puede activar metabólicamente y/o de manera específica del ciclo celular, que activa la transcripción basal del componente (d) o (d') y que puede contener una mutación que inhibe la función del promotor, un gen para un ARNt (ARNt supresor) o una proteína reguladora (d) o (d') para realzar la mutación en uno o más de los promotores o en el transgen. La primera (I) secuencia de promotor o secuencia de reforzador (a) y la segunda (II) secuencia de promotor o secuencia de reforzador (c) pueden ser idénticas o diferentes, y al menos uno de los componentes (a) y (c) puede ser activado de manera no específica, de manera específica de la célula o de manera específica del virus, puede ser activado por tetraciclina o metabólicamente, en particular por hipo-xia, o puede ser activado de manera específica del ciclo ce lular . La invención se refiere también a una construcción de ácido nucleico, en la que el componente (b) exhibe una señal de retención nuclear cuyo ADNc está enlazado, en el extremo 5', directa o indirectamente al extremo 3' del gen estructural, y en la que el producto de la transcripción de la señal de retención nuclear exhibe una estructura para la fijación de un factor de exportación nuclear. La invenció-n se refiere también a una construcción de ácido nucleico que, además de los componentes (a) a (d), exhibe los siguientes comoponentes : una secuencia de promotor o reforzador (i) adicional que activa la transcripción basal de un factor de exportación nuclear, y un ácido nucleico que codifica un factor de exportación nuclear (k) que se fija al producto de transcripción de la señal de retención nuclear (h) y, con ello, media en el transporte del producto de transcripción del transgen fuera del núcleo de la célula al citoplasma. Dentro del contexto de la presente invención, al menos una de las secuencias de promotor o secuencias de reforzador (a) y (c) puede ser un promotor quimérico en el que el módulo de promotor CDE-CHR o E2FBS-CHR puede interactuar con una secuencia de activador situada más arriba que se puede activar de manera específica de la célula, de manera específica del virus o metabólicamente y, con ello, puede influir, en particular inhibir, la expresión de un gen situado más abajo. Los componentes a) y c) también pueden ser unidades de promotor que responden al activador. Tales construcciones exhiben también los siguientes componentes: - al menos una secuencia de promotor o reforzador (e) que puede ser activada de manera no específica, de manera específica del virus, metabólicamente, por parte de tetraciclina, o de manera específica de la célula y/o de manera específica del ciclo celular, - al menos una subunidad (f) de activador que está situada más abajo de la secuencia de promotor o reforzador (e) y cuya transcripción es activada por la secuencia de promotor o reforzador (e), un promotor (g) que responde al activador que es acti- vado por los productos de expresión de una subunidad de activador según se describe en (f) o de varias subunida- des (f) de activador idénticas o diferentes. En una realización adicional de la invención, las construcciones ?e ácidos nucleicos son construcciones de ácidos nucleicos en las que la secuencia de promotor o secuencia de reforzador (a) y/o (c) y/o (i) y/o el promotor (g) que responde al activador es un promotor quimérico, y la subunidad (f) de activador es un gen para al menos un factor de transcripción que activa el promotor quimérico del promotor (g) que responde al activador. La invención se refiere también a una construcción de ácido nucleico que contiene un promotor (g) que responde al activador, que es activado por dos subunidades (f, f') de activador; por ejemplo, el operador LexA (monómeros o multímeros) junto con el promotor SV40. La subunidad (f) de acti-vador comprende el ADNc para la proteína de fijación a ADN de LexA, que codifica los aminoácidos 1-81 o 1-202, cuyo extremo 3' está enlazado al extremo 5' del ADNc para la proteína Gal80 (aminoácidos 1-435). La segunda subunidad (f) de activador comprende el ADNc del dominio de fijación de Gal80 de la proteína Gal4, que codifica los aminoácidos 851-881, cuyo extremo 3' está enlazado al extremo 5' del ADNc del antígeno T grande de SV40 que codifica los aminoácidos 126-132, cuyo extremo 3' está enlazado al extremo 5' del ADNc para el dominio de transactivación de HSV-1 VP16, que codifica los aminoácidos 406-488. En otro ejemplo de un promotor (g) que responde al activador que es activado por dos subunidades (f, f) de activador, el operador LexA antes mencionado es reemplazado por la región de fijación de Gal4 (de manera sencilla o dispuesto de manera múltiple en sucesión), y el gen para la proteína de fijación a ADN de LexA está reemplazado por el gen para el dominio de fijación de ADN (AA1 a 147) de la proteína Gal4.

La invención se refiere también a una construcción de ácido nucleico que contiene, como promotor (g) que responde al activador, monómeros y multímeros de la secuencia de fijación para la proteína de fijación Gal4, y la subunidad (f) de activador contiene la señal de localización nuclear (SLN) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126-132; PKKKRKV, SEQ ID NQ: 1), el dominio de transactivación de ácido (DTA) deHSV-1 VP16 (aminoácidos 406-488) y el ADNc para el resto citoplás-mico de la glicoproteína CD4 (aminoácidos 397-435), y la subunidad (f) de activador contiene la señal de localización nuclear (SLN) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126-132; PKKKRKV), el ADNc para el dominio de fijación a ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1-147) y el ADNc para la secuencia de fijación a CD4 de la proteína p56 Ick. (aminoácidos 1-71). En otro ejemplo de una unidad de promotor que responde al activador, en la que el promotor (g) que responde al activador es la secuencia de fijación para Gal4, el ADNc para la proteína Gal80 (aminoácidos 1-435) en la subunidad (f) de ac-tivador está reemplazado por el ADNc para el resto citoplásmico de la glicoproteína CD4 (aminoácidos 397-437; Simpson et al., Oncogene 4: 1141 (1989); Maddon et al., Cell 42: 93 (1985)) y el ADNc del dominio de fijación de Gal80 de la proteína Gal4 (que codifica los aminoácidos 851-881) en la subunidad (f) de activador está reemplazado por el ADNc para la secuencia de fijación a CD4 de la proteína p56 Ick (aminoácidos 1-71; Shaw et al., Cell 59: 627 (1989); Turner et al., Cell 60: 755 (1990); Perl utter et al., J. Cell. Biochem. 38: 117 ( 1988) ) . En una realización preferida adicional, la nueva construcción de ácido nucleico puede exhibir una señal de retención nuclear (SRN) que está enlazada, situada más abajo en la dirección de lectura (es decir, por el extremo 5' de su ADN), a un transgen (b), (es decir, en el extremo 3' del transgen) . En otra realización preferida, el producto de transcripción de la señal de retención nuclear tiene una estructura para fijar un factor de exportación nuclear (FEN). El ADNc para este factor de exportación nuclear está preferiblemente enlazado, por su extremo 5', al extremo 3' de otra secuencia de promotor o secuencia de reforzador que puede ser idéntica a o diferente de las secuencias de promotor a) y/o c). El factor de exportación nuclear (k) es preferiblemente un gen que se selecciona del grupo que consiste en el gen rev de retrovirus, tales como virus VIH-1 o VIH-2, virus visna--maedi, virus de la artritis-encefalitis caprina, virus de la anemia infecciosa equina, virus de la inmunodeficiencia felina, o HTLV, o el gen para la proteína hnRNP-Al, o el gen para el factor de transcripción TFIII-A. Como norma, el ácido nucleico es ADN. Las nuevas cons-trucciones de ácidos nucleicos se emplean habitualmente como vectores, en particular vectores de plásmidos (no víricos) o vectores víricos. Como norma, el transgen es un gen estructural que codifica un compuesto farmacológicamente activo que se selecciona del grupo que consiste en citoquinas, factores de crecimiento, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, receptores para citoquinas o factores de crecimiento, proteínas que tienen un efecto antiproliferante o citostático, enzimas, inhibidores de la angiogénesis, sustancias inductoras de trombosis e inhibidores de la coagulación, proteínas que tienen un efecto fibr inoi í t ico , proteínas del plasma sanguíneo, proteínas activadoras del complemento, proteínas de revestimiento de virus, antígenos bacterianos y antígenos parásitos, antígenos tumorales, proteínas que tienen un efecto sobre la circula-ción sanguínea, hormonas peptídicas y ácidos ribonucleicos, tales como ribozimas y ARN antisentido. En una realización particular, el transgen puede ser un gen estructural que codifica una proteína que desencadena la muerte controlada de la célula. Un ejemplo de estas proteínas es esfingomie 1 inasa. En otra realización, el transgen (b) puede ser un gen estructural que codifica una enzima que escinde un precursor de un fármaco para formar un fármaco. En una realización particular, el transgen puede ser un gen estructural que codifica una proteína de fusión que está constituida por un ligando y una de las proteínas o compuestos activos peptídi-cos previamente mencionados. El ligando puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una citoquina. un factor de crecimiento, una hormona peptídica o un receptor. En una realización particular, el gen estructu-ral puede codificar una proteína de fusión ligando-enzima, escindiendo la enzima un precursor de un fármaco, formando con ello un fármaco, y fijándose el ligando a una superficie de la célula, preferiblemente sobre células endoteliales o células tumorales. La secuencia de promotor, secuencia de reforzador o secuencia de activador se puede seleccionar del grupo de secuencias de nucleótidos reguladoras del gen que se activan en células endoteliales, células de la musculatura lisa, células de la musculatura estriada, macrófagos, linfocitos, células tumorales, células del hígado, células de leucemia y células glia, o de secuencias de promotor de virus HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV o VIH. La secuencia de activador puede ser, además, un operador de tetraciclina en combinación con un correspondiente represor. La invención se refiere a vectores víricos o no víricos que contienen una nueva construcción de ácido nucleico y que se administran de forma local o peroral o se inyectan en pacientes. Adicionalmente, la nueva construcción de ácido nucleico también se puede administrar por vía intravenosa, int raarter ial , en una cavidad del cuerpo, en un órgano o por vía subcutánea. La invención se refiere también a células aisladas o líneas de células que albergan una nueva construcción de ácido nucleico y que se administran localmente a o se inyectan en pacientes. Ejemplos de tales células son células tumorales, células inmunes, tales como un macrófago o un linfocito, o células endoteliales. Células de esta naturaleza también se pueden utilizar para preparar un producto farmacéutico para tratar una enfermedad, comprendiendo la preparación del producto farmacéutico la introducción de la construcción de ácido nucleico en una célula diana. Las nuevas construcciones de ácidos nucleicos permiten utilizar cualesquiera promotores, reforzadores o secuencias de activador. La nueva mutación en o sobre el transgen (b) puede ser el reemplazamiento de la secuencia de ácido nucleico por uno o más aminoácidos de manera que, como resultado de este reemplazamiento, la proteína expresada ya no es capaz de funcionar. En este caso, el componente d) es una secuencia de ácido nucleico que codifica un ARNt que, por una parte, se fija por su anticodón al ARNm de la secuencia de nucleótidos mutada en el transgen (b) y, por otra parte, lleva un grupo extremo que recoge el aminoácido correcto para realzar la mutación en el transgen (b). Sin embargo, la nueva mutación en o sobre el transgen (b) también puede ser un codón de terminación de la traducción en el gen estructural, codón que o bien no se encuentra o sólo se encuentra raramente en células de mamíferos, de modo que el gen estructural no se traduce de manera eficaz. En este caso, el componente d) es una secuencia de ácido nucleico que, por una parte, codifica un ARNt que posee un anticodón que es complementario al codón de terminación y, con ello, realza la inhibición de la traducción que es debida al codón de terminación de la traducción en el gen estructural (b) y, por otra parte, lleva un grupo extremo que recoge el aminoácido correcto para realzar la mutación en el transgen (b ) . En otra realización, la mutación en o sobre el transgen (b) puede ser una mutación de la caja TATA de una secuencia de promotor que está situada más arriba del extremo 5' del gen estructural. Esta mutación bloquea la iniciación de la transcripción del gen estructural. En este caso, el componente d) es una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que se fija a la caja TATA mutada y, con ello, permite que tenga lugar la transcripción.

La presente invención se dirige, además, a un método para inhibir la proliferación celular poniendo en contacto células con una cantidad inhibidora de la proliferación celular de la construcción de ácido nucleico que contiene al menos una secuencia de ácido nucleico que contiene una primera mutación que inhibe la expresión adecuada de un transgen, y al menos una secuencia de ácido nucleico que contiene una segunda mutación que abóle la inhibición debida a la primera mutación. La presente invención se dirige también a un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad que implica una proliferación celular excesiva, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad inhibidora de la proliferación celular de la construcción de ácido nucleico de la presente invención. Las enfermedades para las que son particularmente útiles las construcciones de ácidos nucleicos son el tratamiento de tumores y enfermedades cardiovasculares que implican la proliferación de células en vasos sanguíneos.

La presente invención se dirige, adicionalmente, a una composición farmacéutica que contiene una cantidad inhibidora de la proliferación celular de la construcción de ácido nucleico en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las construcciones de ácidos nucleicos descritas en las figuras son meramente ejemplos de realizaciones preferidas y no pretenden limitar la invención a los componentes específicos descritos en ellas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras ÍA y IB muestran la disposición de los componentes individuales en la construcción de ácido nucleico en esquemas alternativos. La figura 2 muestra la disposición de los componentes individuales de una unidad de promotor que responde al activador. La figura 3 muestra una unidad de promotor que responde al activador preferida en una construcción de ácido nucleico.

La figura 4 muestra unidades de promotor que responden al activador utilizando construcciones de promotor quiméricas . Las figuras 5A y 5B muestran la disposición de los componentes individuales en construcciones de ácidos nucleicos adicionales en esquemas alternativos. La figura 6 muestra la disposición de los componentes individuales en una construcción de ácido nucleico adicional. La figura 7 muestra la disposición de los componentes individuales para varias sustancias antitumorales o antiinflamatorias (A, A) idénticas o de sustancias antitumorales (A,B) diferentes en una construcción de ácido nucleico adicional . La figura 8 muestra la disposición de los componentes individuales para la sustancia vírica A y la sustancia ant iví rica B . La figura 9 muestra un promotor híbrido de la presente invención que contiene el Elemento I y el Elemento II enla-zados entre sí . La figura 10 muestra un promotor híbrido de la presente invención que contiene los Elementos Ha, III y IV enlazados entre sí . La figura 11 muestra las secuencias de nucleótidos de una de las unidades de promotor que responden al activador preferidas de la presente invención. La figura 12 muestra la proteína de fusión de la subunidad A de activador. La figura 13 muestra la proteína de fusión de la subunidad B de activador.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES PREFERIDAS La presente invención se dirige a construcciones de ácidos nucleicos para uso en la expresión regulada de transgenes en células hospedantes que contienen al menos una secuencia de ácido nucleico que contiene una primera mutación que inhibe la expresión adecuada del transgen, y al menos una secuencia de ácido nucleico adicional que contiene una segunda mutación que abóle la inhibición debida a la mutación en la o las primeras secuencias de ácido nucleico. Estas secuencias de nucleótidos se encuentran bajo el control de secuencias de promotor idénticas o diferentes, de modo que un transgen sólo puede ser expresado cuando todas estas secuencias de promotor están activadas. Preferiblemente, las nuevas construcciones de ácidos nucleicos comprenden al menos los siguientes componentes, enumerados en un marco de lectura en la dirección del extremo 5' a 3' : una primera secuencia (a) de promotor o reforzador que activa la transcripción del transgen y que, opcionalmente, contiene una mutación que inhibe la función del primer promotor (a'), un transgen (b') que codifica un compuesto farmacológicamente activo que opcionalmente contiene una mutación (b) que detiene la transcripción y/o la traducción del transgen o inhibe la función del compuesto farmacológicamente activo, una segunda secuencia (c) de promotor o reforzador que activa la transcripción basal del componente d) y que, opcionalmente, contiene una mutación que inhibe la función del segundo promotor, un gen para un ARNt (ARNt supresor) o una proteína reguladora (d) para abolir la mutación en al menos uno de los promotores (a) o (c) o en el transgen (b). La disposición de los componentes individuales se muestra a título de ejemplo en las figuras ÍA y IB (Esquemas A y B). Estas figuras muestran realizaciones alternativas de las construcciones de ácidos nucleicos. En las nuevas construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención, las secuencias de promotor o reforzador de los componentes a) o c) pueden ser idénticas o diferentes y, además, los componentes c) y d) pueden estar situados más arriba o más abajo de los componentes a) y b). Como secuencia de promotor o secuencia de reforzador se utiliza preferiblemente al menos una secuencia de promotor o una secuencia de reforzador fuerte, tal como las que se derivan de CMV (documento EP-A-0173177 ) o SV40, o un operador de tetraciclina en combinación con un correspondiente represor, o cualquier otra secuencia de promotor o secuencia de reforzador que ea conocida por el experto en la técnica. En una realización preferida, al menos una secuencia de promotor o una secuencia de reforzador en las nuevas construcciones de ácidos nucleicos se puede activar de manera específica de la célula, metabólicamente (por ejemplo por hypoxia), de manera específica del virus o de manera especí-fica del ciclo celular. Se da una particular preferencia a las siguientes secuencias de promotor o reforzador: las secuencias de promotor o secuencias de reforzador que activan la transcripción de manera específica de la célula en células endoteliales, células de la musculatura lisa, células de la musculatura estriada, células hematopoyéticas, linfocitos, macrófagos, células glia o células tumorales; y/o secuencias de promotor o secuencias de reforzador de los virus HBV, HCV, HSV, HPV, CMV, EBV, HTLV o VIH; y/o secuencias de promotor o secuencias de reforzador que se pueden activar metabólicamente, tales como el reforzador inducible por hipoxia (Semenza et al., PNAS 88, 5680 (1991)) o el promotor inducible por hipoxia (Me Burney et al., Nucleic Acids Res. 19, 5755 (1991); documento WO 95/21927); y/o promotores que pueden ser activados de manera específica del ciclo celular, tal como el promotor del gen cdc25C, del gen de ciclina A, del gen cdc2 (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995), Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995), Zwicker et al., Nucí. Acids Res. 23, 2833 (1995)), del gen B-myb (Lam et al., EMBO J. 12, 2705 (1993)), del gen DHFR (Means et al., Mol. Cell Biol. 12, 1054 (1992)) y del gen E2F-1 (Johnson et al., Genes Dev. -8, 1514 (1994), Hsiao et al., Genes Dev. 8, 15256 (1994)) o demás secuencias para factores de transcrip-ción de la fijación que aparecen o son activadas durante la proliferación celular. Ejemplos de estas secuencias de fijación son monómeros o multímeros de la secuencia de nucleótidos denominada la caja Myc E (Blackwood y Eisenmann, Science 251, 1211 (1991) ) . Además, promotores que pueden ser activados por tetraciclina, tal como un operador de tetraciclina en combinación con un correspondiente represor (Gossen et al., TIBS 18, 471 (1993), Dinger ann et al. EMBO J. 11, 1487 (1992), Gossen et al., Science 268, 1766 (1995)) también pretenden ser utiliza-das dentro del alcance de la presente invención. En otra realización preferida, al menos una secuencia de promotor o una secuencia de reforzador en las nuevas construcciones de ácidos nucleicos es un promotor quimérico. Dentro del significado de esta invención, un promotor quimérico es la combinación de una secuencia de activador situada arriba, que puede ser activada de manera específica de la célula, metabólicamente, o de manera específica del virus, y un módulo de promotor situado más abajo. Preferiblemente, el módulo de promotor comprende una secuencia de nucleótidos que contiene un elemento CDE-CHR o un elemento E2FBS--(Bmyb)-CHR y, con ello, puede inhibir la activación de la secuencia de activador situada más arriba en las fases GO y Gl del ciclo celular (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1994), documento PCT/GB95/02000; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995); Zwicker et' al., Science 271, 1595 (1996)). En otra realización preferida, al menos una secuencia de promotor o una secuencia de reforzador (componente a) o c)) en las nuevas construcciones de ácidos nucleicos es una unidad de promotor que responde al activador. Por su parte, una unidad de promotor que responde al activador está constituida por los siguientes componentes: - una o más secuencias de promotor o reforzador idénticas o diferentes que pueden ser activadas, por ejemplo, de manera es'pecífica del ciclo celular, metabólicamente, de manera específica de la célula o de manera específica del virus, o tanto de manera específica del ciclo celular como metabólicamente, de manera específica de la célula o de manera específica del virus (los denominados "promotores quiméricos), una o más subunidades (f) de activadores idénticas o diferentes que se encuentran, en cada caso, situadas más abajo de las secuencias de promotor o reforzador y cuya transcripción basal es activada por estas últimas secuencias, y un promotor (g) que responde al activador que es activado por los productos.de expresión de una o más subunidades de activador. La disposición de los componentes individuales de una unidad de promotor que responde al activador se muestra, a título de ejemplo, en el Esquema C en la figura 2. La inserción de una unidad de promotor que responde al activador preferida en una nueva construcción de ácido nucleico se muestra, a título de ejemplo, en el Esquema D) en la figura 3. En su forma más simple, las unidades de promotor que responden al activador pueden ser, por ejemplo, construcciones de promotores quiméricos según se muestran en el Esquema E en la figura 4. En otra realización, las unidades de promotor que responden al activador de acuerdo con la invención pueden ser secuencias para fijar factores de transcripción quiméricos que están constituidos por dominios de fijación a ADN, dominios de interacción proteína-proteína y dominios de transactivación. Genes estructurales que se prefieren como compuestos farmacológicamente activos son proteínas y glicoproteínas que se seleccionan del grupo que consiste en citoquinas, factores de crecimiento, receptores para citoquinas o factores de crecimiento, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, proteínas de fusión constituidas por ligandos (por ejemplo anticuerpos o fragmentos de anticuerpos) y citoquinas o factores de crecimiento, proteínas que tienen un efecto antiprolife-rante o citostático, inhibidores de la angiogénesis, proteínas inductoras de trombosis, inhibidores de la coagulación, proteínas del plasma sanguíneo, proteínas activadoras del complemento y sustancias de revestimiento de virus y sustancias de revestimiento de bacterias. De conformidad con la invención, los genes estructurales (componente b) del transgen) en una realización particular se proporcionan con una mutación que evita la expresión de una proteína (o péptido) funcional. Esta mutación puede ser el reemplazamiento de una secuencia de nucleótidos por uno o más aminoácidos de modo que, como resultado de este reemplazamiento, la proteína expresada ya no es capaz de funcionar (mutación de falso sentido), es decir no produce ya ningún compuesto activo ni ninguna enzima funcional. En el caso de una mutación del gen estructural (componente b) del transgen) de esta naturaleza, el componente d) es una secuencia de ácido nucleico que codifica un ARNt que, por una parte, se fija por su anticodón, al lugar de mutación del ARNm del gen estructural (componente b)) y, por otra parte, lleva un grupo extremo que recoge el aminoácido correcto para realzar la mutación en el transgen (ARNt supresor ) . En este contexto, los ARNt's que normalmente se utilizan sólo raramente en células de mamíferos deberían mutarse, en particular, en ARNt's supresores, con el fin de minimizar las consecuencias negativas de la eficacia de la traducción general de la célula. En otra realización, la mutación en el gen estructural es la introducción de uno o más codones de terminación de la traducción (mutaciones sin sentido). En el ARNm, se sabe que las secuencias de nucleótidos UAA, UGA y UAG son codones de terminación de la traducción. Las correspondientes secuencias 1! de ADN para estos codones de terminación son TAA, TGA y TAG/cadena codificadora del ADN. Uno de estos codones de terminación se inserta preferiblemente, en forma de una mutación, en la secuencia de ADN del gen estructural ( compo-nente b ) ) . En el caso de una mutación del gen estructural (componente b)) de esta naturaleza, el componente d) es una secuencia de ácido nucleico que codifica un ARNt (ARNt supresor) que, por una parte, se fija, por su anticodón, a la mutación, es decir al codón de terminación introducido del ARNm del gen estructural (componente b)) y, por otra parte, lleva un grupo extremo que recoge el aminoácido correcto que fue codificado por la secuencia de ADN original en el lugar de la mutación. Secuencias de ácidos nucleicos (b) de esta naturaleza ya han sido descritas para E. coli, células de levaduras y vegetales (Dingermann et al., Mol. Cell Biol. 12, 4038 (1992), EMBO J. 11, 1487 (1992); Gossen et al. TIBS 18, 471 (1993); Gatz et al., Plant. J. 2, 397 (1992)). De conformidad con la invención, los ARNt's que normalmente se utilizan sólo raramente en células de mamíferos deberían ser mutados, también en este caso, en ARNt's supresores. Así, se pueden seleccionar, por ejemplo, las siguientes combinaciones (Lewin comp. Genes IV, Oxford University Press 1990, página 151): Tabla 1: Ami poáci do Codón Mutaci ón ARNt supresor Am noácido Lugar del dß terminación (ant codón) fijado a gen (codón) ARNt suorßßor Tyr UAU UAG CUA Tyr sup F(su+3) Tyr UAC UAA UUA Tyr aup C(au+4) Sar UCG UAG CUA Ser sup D(SU+1) Gln CAG UAG CUA Gln SUP E(811*2) Lyß AAA UAA UUA Lyß sup G(su+5) Lyß AAG UAG UUA Lyß sup G(au+5) Trp UGG UGA UCA Trp sup U(su+7) Trp UGG UCA Trp sup U(su+7) En otra realización, la mutación en o sobre el gen estructural puede ser una mutación de la caja TATA de una secuencia de protomor (componente a)) que está situada más arriba del extremo 5' del gen estructural (componente b)). Se considera que la caja TATA (TATAAA) es un lugar de iniciación central para las ARN-pol imerasas II y III que están presentes en el núcleo de la célula. La transcripción se inicia en la caja TATA por la fijación de la proteína de fijación a la caja TATA (PFT), que está implicada, de una manera esencial, en la transcripción de todas las ARN-poi imerasas (I, II, III) que están presentes en el núcleo de la célula. Un ejemplo de un promotor que es estrictamente dependiente de la caja TATA es el promotor para el gen U6 , que es transcrito por la ARN--polimerasa III y cuyo producto génico está implicado, de una manera esencial, en el corte y empalme de ARNm. De conformidad con esta invención, el promotor (componente a)) que cuelga de una caja TATA mutada, está situado más arriba del extremo 5' del gen estructural (componente b)). Un ejemplo de una mutación de este tipo puede ser TGTAAA. Como resultado de esta mutación, el lugar de fijación al ADN de la PFT normal ya no es reconocido y el gen estructural (b) ya no es transcrito de manera eficaz. En el caso de una mutación de esta naturaleza, el componente d) es una secuencia de ácido nucleico que codifica una PFT comutada. Como resultado de esta comutación, la PFT se fija a la caja TATA mutada (por ejemplo a TGTAAA) en el componente a) y, por consiguiente, da lugar a una transcripción eficaz del gen estructural (componente b)). Tales comutaciones del gen TBP se han descrito, por ejemplo, por Strubin y Struhl (Cell 68, 721 (1992)) y por Heard et al. (EMBO J. 12, 3519 (1993)). En otra realización preferida, se añaden a la nueva construcción de ácido nucleico una señal de retención nuclear (SRN) (h) y, en caso apropiado, una señal de exportación nuclear. La disposición de los componentes individuales en una nueva construcción de ácido nucleico se muestra en los Esquemas F) y G) en la figura 5. En otra realización preferida, las construcciones de ácidos nucleicos que se muestran en los Esquemas F) y G) se combinan una con otra. La combinación de esta manera permite que se incluya ot'ro promotor (promotor IV, componente e)). La disposición de los componentes individuales en esta co bina-ción se muestra, a título de ejemplo, por el Esquema H) en la figura 6. La señal de retención nuclear es una secuencia de nucleótidos que impide el transporte de un ARN pre-mensajero que está enlazado a la misma a través de la membrana nuclear, pero que, por otra parte, constituye una estructura para fijar una proteína de exportación denominada un factor de exportación nuclear. Este factor de exportación nuclear (FEN) media en el transporte del ARN pre-mensajero o mensajero que contiene la SRN fuera del núcleo de la célula al citoplasma. Un ARN pre-mensajero o mensajero que contiene la SRN se segrega, consiguientemente, fuera del núcleo de la célula por fijación al FEN (Fischer et al., Cell 82, 475 (1995)). La SRN (componente h)) es preferiblemente la secuencia del elemento que responde a rev-ret roví rico (ERR). En el caso de VIH-1, este ERR es una secuencia que abarca que abarca 243 nucleótidos (nucleótidos 7362-7595; Muesing et al., Nature 313, 450 (1985)) en el gen env (Malim et al., Nature 338, 254 (1989); Kjems et al., PNAS 88, 683 (1991)). Sin embargo, dentro del significado de la invención, la señal de retención nuclear (SRN) también puede ser cualquier secuencia de nucleótidos homologa y/o funcionalmente similar (análoga), tal como por ejemplo el elemento ERR-equivalente en el virus HBV (Huang et al., Mol Cell Biol. 13, 7476 (1993)). En las nuevas construcciones de ácidos nucleicos, el factor de exportación nuclear (FEN, componente k)) es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que se fija al ARNm de la SRN y media en el transporte del ARN pre--mensajero o ARN mensajero que contiene una SRN fuera del núcleo de la célula al citoplasma (o fuera del citoplasma al núcleo de la célula). Dentro del contexto de la invención, se hace uso, en particular, del gen rev que se deriva de retrovirus, especialmente del virus VIH-1 o del virus VIH-2 (Daly et al., Nature 342. 816 (1989); Emerman et al., Cell 57, 1155 ( 1989) ; "Felber et al., PNAS 86, 1495 (1989): Fischer et al., EMBO J. 13, 4J05 (1994)). La proteína rev del gen rev retrovírico se fija, por su dominio N-terminal ( Zapp et al., Nature 342, 714 (1989); Malim et al., Cell 65, 241 (1991)) al ERR en el ARN pre-m (Iwai et al., Nucí. Acids Res. 20, 6465 (1992)). La fijación entre el ERR y la proteína rev permite que el ARN pre-mensa- jero no cortado ni empalmado y también que cualquier otro ARN que contenga un ERR sea transportado fuera del núcleo de la célula al citoplasma (Fischer et al., EMBO J. 13, 4105 (1994); Fischer et al., Cell 82, 475 (1995)) y, por consiguiente, aumenta sustancialmente la traducción. Dentro del contexto de la invención, también se pueden utilizar como FEN secuencias de nucleótidos que codifican proteínas que son homologas y funcionalmente similares a la proteína rev de VIH-1 (Bogerd et al., Cell 82, 485 (1995)), tal como el gen rev del virus visna-maedi (VVM; Tileyet al., J. Virol. 65, 3867 (1991)) o el gen rev del virus de la artritis-encefalitis caprina (VAEC; Tiley et al., J. Virol. 65, 3877 (1991)). Sin embargo, dentro del contexto de la invención, también se pueden emplear los genes que codifican proteínas que, al tiempo que poseen sólo una ligera homología o ninguna homología con la proteína rev, son funcionalmente similares a la proteína rev de VIH-1. Ejemplos de estos genes son el gen rex de HTLV- 1 (Cullen. Microbiol. Rev. 56, 375 (1992)), el gen rev del virus de la anemia infecciosa equina (VAIE) y el gen rev del virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) (Manusco et al., J. Virol. 68, 1988 (1994)). En una realización alternativa, los FEN ' s también pueden ser secuencias de nucleótidos para proteínas que realizan una secreción de ARN a partir del núcleo, incluso sin que este ARN sea retenido en el núcleo por una SRN. Ejemplos de tales proteínas son el factor de transcripción TFIIIA (Gaddat et al., Cell 60, 619 (1990); Drew et al.. Gene 159, 215 (1995)) o la r ibonucleoproteí na Al nuclear heterogénea (proteína hnRNPAl; Pinol-Roma et al., Nature 355, 730 (1992)). En un sentido más amplio, las proteínas de transporte nuclear también incluyen la proteína de choque térmico 70 (hsc70; Mandell et al., J. Cell Biol. 111, 1775 (1990)) y el inhibidor de la proteína quinasa CPKI (Fantozzi et al., J. Biol. Chem. 269, 2676 (1994), Wen et al., J. Biol. Chem. 269, 32214 (1994)). Las características que poseen en común el FEN y sus proteínas homologas y análogas son un dominio que está situado hacia el extremo amino para fijar la proteína monómera al ARN de la SRN (J. Virol 64, 881 (1990); Kje s et al., EMBO J. 11, 1119 (1992)) y un dominio que es en su mayor parte rico en leucina (hnRNPAl es una excepción a ello) y que se requiere para la función de transporte de FEN (Wen et al., Cell 82, 463 (1995); Fischer et al., Cell 82 475 (1995); Malim et al., J. Virol. 65, 4248 (1991); Venkatesh et al., Virol. 178, 327 (1990)). La expresión del gen FEN (componente k)) puede estar bajo el control de una secuencia de promotor (componente i) = secuencia de promotor y reforzador III) que está situada más arriba en el extremo 5' del gen FEN. Una de las secuencias de ácidos nucleicos, tal como ya ha sido descrita para las secuencias I y 11 de promotor y reforzador (componentes a) y e)) se puede seleccionar como una secuencia III ó IV de promotor y reforzador de conformidad con esta invención (véase el Esqwema H de la figura 6)). Las construcciones de ácido nucleico están constituidas preferiblemente por ADN. La expresión "construcciones de ácido nucleico" ha de entenderse que significa estructuras de ácido nucleico artificiales que pueden ser transcritas en las células diana. Estas se insertan preferiblemente en un vector, siendo particularmente preferidos vectores no víricos, vectores de plásmidos o vectores víricos. Estos vectores se mezclan con vehículos farmacéuticamente aceptables para producir composiciones farmacéuticas parauso en la terapia génica. -Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por las personas expertas en la técnica, y la dosificación óptima de vectores que contienen la construcción de ácido nucleico se puede determinar fácilmente utilizando técnicas convencionales. La composición farmacéutica se administra luego localmente a pacientes para la profilaxis o terapia de una enfermedad, o se inyecta o administra por vía intravenosa, intraarterial . en una cavidad del cuerpo, en un órgano o por via subcutánea. En el caso de tratar tumores, la composición farmacéutica se inyecta directamente en los tumores. Sin embargo, se pueden utilizar otros métodos de suministro conocidos con vehículos apropia-dos, tales como el suministro de genes basado en catéter. El término "tratamiento", según pertenece a administrar los vectores que contienen las construcciones de ácido nucleico de la presente invención a pacientes, se entiende que incluye la administración a pacientes para el propósito de la profilaxis y la mejora de la enfermedad. Estos vectores son particularmente útiles en enfermedades con una proliferación celular excesiva. Las nuevas construcciones de ácidos nucleicos se pueden utilizar para expresar un transgen (componente b)) tanto de manera específica de la célula o de manera específica del virus o bajo condiciones metabólicas definidas o después de la exposición a tetraciclina, como también de manera específica del ciclo celular, siendo preferiblemente el gen estructural un gen que codifica un compuesto farmacológicamente activo o incluso una enzima que escinde un precursor inactivo de un fármaco para formar un fármaco activo. El gen estructural se puede seleccionar de modo que este compuesto farmacológicamente activo o esta enzima se exprese junto con un ligando como una proteína de fusión, y este ligando se fija a la superficie de células, por ejemplo células endoteliales o células tumorales proliferantes.

La presente invención se refiere también a células de levaduras o células de mamíferos que albergan una nueva construcción de ácido nucleico. En una realización particularmente preferida, las construcciones de ácidos nucleicos se introducen en líneas de células que luego se pueden utilizar para expresar el transgen después de la transfección. Por consiguiente, estas células se pueden utilizar para preparar un producto farmacéutico para pacientes y también se pueden administrar localmente a o inyectar en pacientes para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad. Las nuevas construcciones de ácidos nucleicos no se producen de esta forma en la naturaleza, es decir el transgen o gen estructural para el compuesto activo o para una enzima o para una proteína de fusión de ligando/enzima no se muta de forma natural y no se combina de forma natural con una secuencia de ácido nucleico que realza esta mutación; además, tampoco se combina de forma natural con la señal de retención nuclear (SRN) y las dos secuencias no se enlazan de forma natural al promotor I(a) ni al promotor II(c), y esta co -binación no se combina de forma natural, a su vez, con la secuencia de nucleótidos que está constituida por el promotor III y el factor de exportación nuclear (FEN). Los promotores I, II, III y IV y el gen estructural para el compuesto activo (o para la enzima) de las nuevas cons-trucciones de ácidos nucleicos se seleccionan en función de la aplicación. Dependiendo del uso planeado de las construcciones de ácidos nucleicos, se pueden seleccionar las siguientes real izaciones : 1. La terapia de tumores e inflamaciones crónicas inhibiendo el endotelio proliferante 1.1.a) Selección de las secuencias de promotor o activador que están activadas en células endoteliales Dentro del contexto de esta invención, las secuencias de promotor o activador preferidas, constituidas por promotores o reforzadores, incluyen las secuencias reguladoras del gen y/o elementos para genes que codifican proteínas que se pueden detectar, en particular, en células endoteliales (o incluso en células que están en la vecindad inmediata de células endoteliales proliferantes). Algunas de estas proteínas han sido descritas por Borrows et al. (Phar ac. Ther. 64, 155 (1994)) y Píate et al. (Brain Pathol. 4, 207 (1994). Ejemplos particulares de estas proteínas específicas de células endoteliales son: Transportador de glucosa-1 endotelial, específico del cerebro La secuencia de promotor se describió por Murakami et al. (J. Biol. Chem. 267, 9300 (1992)). Endoglina Una parte de la secuencia de promotor se describió por Bellon et al. (Eur. J., Immunol. 23, 2340 (1993)) y Ge et al. (Gene 138, 201 (1994)). Receptores VEGF Se reconocen dos receptores diferentes (Píate et al., Int. J. Cáncer 59, 520 (1994)): • Receptor-1 de VEGF (flt-1) (de Vries et al., Science 255, 989 (1992): Wakiya et al. J. Vascul. Res. 33, 105 (1996)) y el • Receptor-2 de VEGF (flk-1, KDR ) (Terman et al., BBRC 187, 1579 (1992)). Los dos recepotres se encuentran, casi exclusi amente, en células endoteliales (Senger et al., Cáncer Metast. Rev. 12, 303 (1993)). Otras t iros ina-quinasas de receptores específicos de células endoteliales • t i 1— 1 o ti J-2' (Partanen et al., Mol. Cell. Biol. 12, 1698 (1992), Schnürch y Risan. Development 119, 957 (1993), Dumont et al., Oncogene 7, 1471 (1992)) • Receptor B61 (receptor Eck) (Bartley et al., Nature 368, 558 (1994), Pandey et al., Science 268, 567 (1995), van der Geer et al., Ann. Rev. Cell. Biol. 10, 251 (1994)) B61 La molécula- B61 es el ligando para el receptor B61.

(Holzman et al., J. Am. Soc. Nephrol. 4, 466 (1993), Bartley et al., Nature 368. 558 (1994)) Endotelina, especialmente • Endote 1 ina B La secuencia de promotor se describió por Benatti et al., J. Clin. Invest. 91, 1149 (1993). • Endotelina-1 La secuencia de promotor se describió por Wilson et al., Mol. Cell. Biol. 10, 4654 (1990). Receptores de endotelina, en particular el receptor de endote 1 ina B (Webb et al., Mol. Pharmacol. 47, 730 (1995), Haendler et al. J. Cardiovasc. Pharm. 20, 1 (1992)). Receptores de manosa-6-fosfato Las secuencias de promotor han sido descritas por Ludwig et al. (Gene 142, 311 (1994), Oshi a et al., (J. Biol. Chem. 263, 2553 (1988)) y Pohlmann et al. (PNAS USA 84, 5575 (1987)). Factor von Willebrand La secuencia de promotor se describió por Jahroudi y Lynch (Mol. Cell. Biol. 14, 999 (1994)), Ferreira et al. (Biochem. J. 293, 641 (1993)) y Aird et al. (PNAS USA 92, 4567 (1995)). IL-la, IL-lß Las secuencias de promotor se describieron por Hangen et al., Mol. Carcinog, 2, 68 (1986), Turner et al., J. Immunol. 143, 3556 (1989), Fenton et al., J. Immunol. 138, 3972 (1987), Bensi et al., Cell Growth Diff. 1, 491 (1990), Hiscott et al., Mol. Cell. Biol. 13, 6231 (1993) y Mori et al., Blood 84, 1688 (1994). Receptor IL-1 La secuencia de promotor se describió por Ye et al., PNAS USA 90, 2295 (1993) .

Molécula de adhesión de células vasculares (MACV-1) La secuencia de promotor de MACV- 1 se describió por Neish et al.-, Mol. Cell. Biol. 15, 2558 (1995), Ahmad et al.. J. Biol. Chem. 270, 8976 (1995), Neish et al., J. Exp. Med. 176, 1583 (1992), Jademarco et al.. J. Biol. Chem. 267, 16323 (1992) y Cybutsky et al., PNAS USA 88, 7859 (1991). Secuencia de activador sintético Como alternativa a los promotores naturales específicos del endotelio, también se puede hacer uso de secuencias de activadores sintéticos que comprenden lugares de fijación o 1 igomer i zados para factores de transcripción que son de preferencia o selectivamente activos en células endoteliales. Un ejemplo de un factor de transcripción de este tipo es el factor de transcripción GATA-2, cuyo lugar de fijación en el gen endotelio-1 es 5'-TTATCT-3' (Lee et al., Biol. Chem. 266, 16188 (1991), Dorfmann et al., J. Biol. Chem. 267, 1279 (1992) y Wilson et al., Mol. Cell Biol. 10, 4854 (1990)). l.l.b) Selección de secuencias de promotor o activador que son activadas en células en la vecindad de células endoteliales activadas Cuando las células endoteliales están pro 1 i ferando , se hacen accesibles células vecinas, por medio de la apertura de uniones estrechas, a macromoléculas derivadas de la sangre. Como resultado de las interre laciones funcionales y anatómicas, las células que son vecinas de células endoteliales activadas son células diana dentro del significado de esta invención . - VEGF Las secuencias reguladoras del gen para el gen VEGF son • las secuencias de promotor del gen VEGF (región flanqueante 5 ' ) (Michenko et al., Cell. Mol. Biol. Res. 40, 35 (1994), Tischer et al., J. Biol. Chem. 266, 11947 (1991) ) o • la secuencia de reforzador del gen VEGF (región f lanqueante 3 ' ) (Michenko et al., Cell. Mol. Biol. Res. 40, 35 ( 1994) ) o • el gen c-Src (Mukhopadhyay et al., Nature 375. 577 (1995), Bonha et al., Oncogene 8, 1973 (1993), Parker et al., Mol. Cell. Biol. 5, 831 (1985), Anderson et al., Mol. Cell. Biol. 5, 112 (1985)) o • el gen v-Src (Mukhodpadhyay et al., Nature 375, 577 (1995), Anderson et al., Mol. Cell. Biol. 5, 112 (1985), Gibbs et al., J. Virol. 53, 19 (1985)) Receptores de hormonas esteroides y sus elementos promotores (Truss y Beato, Endocr. Rev. 14, 459 (1993)), en particular • el promotor del virus de tumor mamario de ratón La secuencia de ADNc de la región promotora de la región de repetición terminal larga de VTMR ha sido descrita por Chalepakis et al., Cell 53, 371 (1988) y Truss y Beato (Endocr. Rev. 14, 459 ( 1993) . 1.2. Genes estructurales para sustancias antitumorales (o ant inf lamator ias ) 1.2.a) Inhibidores de la proliferación Dentro del significado de esta invención, una sustancia antitumoral o ant inf la ator ia ha de entenderse como la secuencia de ADN de una proteína que inhibe la proliferación de células endoteliales. Ejemplos de estas secuencias de ADN son las secuencias de ADN para: la proteína de retinoblastoma (pRb/pllO) o para sus análogos pl07 y 120 la proteína ?53 la proteína p21 (WAF-1) - la proteína pl6 otros inhibidores de CdK la proteína GADD45 la proteína bak. Con el fin de evitar una rápida inactivación intracelular de estos inhibidores del ciclo celular, se hace uso preferiblemente de los genes que exhiben mutaciones para los lugares de inactivación de las proteínas expresadas, sin que se perjudique con ello la función de estas proteínas. La proteína de retinoblastoma ( Rb ) y las proteínas pl07 a pl30 relacionadas son inactivadas por fosforilación. Por lo tanto, se da preferencia a utilizar una secuencia de ADNc de pRb/pllO, pl07 o pl30 que está mutada en un punto, de modo que los lugares de fosforilación de la proteína codificada son reemplazados por aminoácidos que no pueden ser fosforilados . 1.2.b) Factores inductores de la coagulación e inhibidores de la angiogénesis Una sustancia antitumoral o ant inf lamator ia también ha de entenderse como la secuencia de ADN para una proteína que induce la coagulación y/o inhibe la angiogénesis. Ejemplos de estas proteínas son: Factor tisular (FT) y fragmentos activos de la coagulación del mismo (Morrissey et al., Cell 50, 129 (1987), Scarpati et al., Biochem. 26, 5234 (1987), Spicer et al., PNAS USA 84, 5148 (1987), Rehemtulla et al., Thromb. Haemost. 65, 521 (1991)) Inhibidor-1 del activador de plasminógeno (PAI-1) PAI-2 PAI-3 - Angiostatina y péptidos ant i-angiogénicos similares (O'Reilly et al., Nature Med. 2, 689 (1996); Folkman et al., New Engl. J. Med. 26, 1757 (1995)) Interferones • IFNa • IFNß • IFNy Tromboespondina TNFa Factor de plaquetas 4 IL-12 - TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 Factor inhibidor de leucemia (FIL) 1.2.c) Proteínas citostáticas y citotóxicas Sin embargo, una sustancia antitumoral o ant inf lamator ia también ha de entenderse como una secuencia de ADN para una proteína que exhibe, directa o indirectamente, un efecto citostático sobre tumores. Estas proteínas incluyen, en part i cular : - Anticuerpos y productos de la escisión de anticuerpos Perforina Granzima IL-2 IL-4 - IL-12 Interferones , por ejemplo • IFNa • IFNß • IFN? TNF • TNFa • TNFß Oncostatina M Esf ingomie 1 inasa (Jarvis et al. PNAS-USA 91, 73 (1994)) Magainina y derivados de magainina (Cruciani et al. PNAS 88, 3792 (1991); Jacob et al., Ciba Found. Symp. 186, 197 (1994); Peck-Miller et al., Cáncer Chemother. Pharmac. 32, 109 (1993)) 1.2.d) Inductores de la inflamación Una sustancia antitumoral también ha de entenderse como la secuencia de ADN para una proteína que, además del efecto antitumoral, también puede estimular inflamaciones y, con ello, contribuir a la eliminación de células tumorales. Ejemplos particulares de estas proteínas son: - RANTES (MCP-2) Factor quemotáctico y activante de monocitos ( FQAM ) IL-8 Proteína-1 inflamatoria de macrófagos (MlP-la y -ß) Proteína-2 activante de neutrófilos (NAP-2) - IL-3 IL-4 IL-5 Factor inhibidor de la leucemia humana (FIL) IL-7 - IL-11 IL-13 GM-CSF G-CSF M-CSF - Factor del veneno de cobra (FVC) o secuencias parciales de FVC, que corresponden funcionalmente al factor del complemento humano C3b, es decir que son capaces de fijarse al factor B de complemento y, después de la escisión con el factor D, constituyen una C3 convertasa. La secuencia de ADN para el FVC y sus secuencias parciales han sido publicadas por Frikinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 12775 (1994). Factor C3 de complemento humano y su secuencia parcial C3b. La secuencia de ADN para C3 y sus secuencias parciales han sido publicadas por De Bruijn et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, 708 (1985). Productos de escisión del factor C3 de complemento humano que se asemejan funcional y estructuralmente a FVC. Los productos de escisión de esta naturaleza han sido descritos por O'Keefe et al., J. Biol. Chem. 263, 12690 (1988).

Proteínas bacterianas que activan el complemento o desencadenan inflamaciones, tales como porinas de Salmonella typhimurium (Galdiero et al., Infection and Immunity 46. 55 (1994)). Factores de aglutinación de Staphy lococcus aureus (Espersen Acta Path. Microb. Et Imm. Scandin. Sect C 93, 59 (1985)), modulinas. particularmente las de bacterias Gram-negat ivas (Henderson et al., Inflam. Res. 44, 187 (1995)), proteína principal de la membrana externa de legionelas (Be 11 inger-Kawahara et al., J. Exp. Med. 172, 1201 (1990)) o de Haemophilus influenzae tipo B (Hetherington et al., Infection and Immunity 60, 19 (1992)) o de Klebsiellas (Alberti et al., Infectíonand Immuni ty 61, 852 (1992)), o moléculas M de estreptococus del grupo G (Campo et al., J. Infecí. Dis. 171, 601 (1995)). Las secuencias de ADN para proteínas de fusión que se forman entre las citocinas o los factores de crecimiento enumerados, por una parte, y los ligandos para receptores sobre la membrana celular (tales como un anticuerpo que es específico para células endoteliales o células tumorales, o el resto Fc de la inmunoglobulina humana), por otra parte, también se pueden utilizar como sustancias activas dentro del contexto de la invención. Secuencias de ADN de esta naturaleza y su preparación han sido descritas, por ejemplo, en el documento EP-A-0 464 633 Al. 1.2.e) Enzimas para la activación de precursores de agentes citostáticos Sin embargo, una sustancia antitumoral o ant inf lamator ia también se ha de entender como la secuencia de ADN para una enzima que es capaz de convertir precursores de un compuesto ant i tumora lmente activo en un compuesto ant i tumoralmente act ivo . Enzimas de esta naturaleza, que pueden escindir sustancias precursoras inactivas (profármacos) y, con ello, formar agentes citostáticos activos (fármacos), y los profármacos y fármacos que en cada caso son relevantes, han sido ya revisadas por Deonarain et al. (Br. J. Cáncer 70, 786 (1994)), por Mullen, Pharmac. Ther. 63 , 199 (1994) y por Harris et al. (G«ne Ther. 1, 170 (1994)). Por ejemplo, se ha de utilizar la secuencia de ADN de una de las siguientes enzimas: Timidina-quinasa del virus Herpes simplex (Garapin et al., PNAS USA 76, 3755 (1979), Vile et al., Cáncer Res. 53, 3860 (1993), Wagner et ai., PNAS USA 78 1441 (1981), Moelten et al., Cáncer Res. 46, 5276 (1986), J. Nati. Cáncer Inst. 82, 297 (1990)) Timidina-quinasa del virus de Varicella zoster (Huber et al . , PNAS USA 88, 8039 (1991), Snoeck, Int . J.

Antimicrob. Agents 4, 211 (1994)) Ni t rorreductasa bacteriana (Michael et al., FEMS Microbiol. Letters 125, 195 (1994), Bryant et al., J. Biol. Chem. 266, 4126 (1991), Watanabe et al., Nucleic Acids Res. 18, 1059 (1990)) ß-glucuronidasa bacteriana (Jefferson et al., PNAS USA 83, 8447 (1986)) - ß-glucuronidasa vegetal de Sécale cereale (Schulz et al., Phytochemistry 26, 933 (1987)) ß-glucuronidasa humana (Bosslet et al., Br. J. Cáncer 65, 234 (1992), Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1987)) • Carboxipeptidasa ( CB ) humana, por ejemplo • CB-A de mastocitos (Reynolds et al., J. Clin. Invest. 89, 273 (1992)) • CB-B pancreática (Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 267, 2575 (1992), Catasus et al!, J. Biol. Chem. 270, 6651 (1995)) • Carboxipeptidasa bacteriana (Hamilton et al., J. Bacteriol. 174, 1626 (1992), Osterman et al., J. Protein Chem. 11, 561 (1992)) ß-lactamasa bacteriana (Rodrigues et al . , Cáncer Res. 55, 63 (1995), Hussain et al., J. Bacterio!. 164, 223 (1985), Coque et al., EMBO J. 12, 631 (1993)) ci tos ina-desaminasa bacteriana (Mullen et al., PNAS USA 89, 33 (1992), Austin et al., Mol. Pharmac. 43, 380 (1993), Danielson et al.. Mol. Microbiol. 6, 1335 (1992)) Catalasa o peroxidasa humana (Ezurum et al., Nucí. Acids Res. 21, 1607 (1993)) Fosfatasa, en particular • Fosfatasa alcalina humana (Gum et al., Cáncer Res. 50, 1085 (1990)) • Fosfatasa acida de próstata humana (Sharieff et al., Am. J. Hu . Gen. 49, 412 (1991), Song et al., Gene 129, 291 (1993), Tailor et al., Nucí. Acids Res. 18, 4928 (1990)) • Fosfatasa acida de tipo 5 (Gene 130, 201 (1993)) Oxidasa, en particular • Lisiloxidasa humana (Kimi et al., J. Biol. Chem. 270, 7176 (1995)) • D-aminooxidasa acida humana (Fukui et al., J. Biol. Chem. 267, 18631 (1992)) Peroxidasa, en particular • Glutat ión-peroxidasa humana (Chada et al., Genomics 6, 268 (1990), Ishida et al., Nucí. Acids Res. 15, 10051 (1987)) • Peroxidasa de eosinófilos humanos (Ten et al., J. Exp. Med. 169, 1757 (1989), Saha- aki et al., J. Biol. Chem. 264, 16828 (1989)) • Peroxidasa del tiroides humano (Kimura, PNAS USA 84, 5555 (1987)). Galactos idasa Con el fin de facilitar la secreción de las enzimas enumeradas, la secuencia señal homologa que en cada caso está contenida en la secuencia de ADN, se puede reemplazar por una secuencia señal heteróloga que mejora la secreción extracelular .

Así. la secuencia señal para ß-glucuronidasa (posición de ADN < 27 a 93; Oshima et al.. PNAS 84, 685 (1987)) puede ser reemplazada,- por ejemplo, por la secuencia señal para inmunoglobulina (posición de ADN < 63 a < 107; Riechman et al., Nature 332, 323 (1988)) o por la secuencia señal para CEA (posición de ADN < 33 a < 134; Schrewe et al., Mol. Cell. Biol. 10, 2738 (1990), Berling et al., C ncer Res. 50. 6534 (1990)) o con la secuencia señal para la glicoproteína del virus del sincitio respiratorio humano (ADNc para los amino-ácidos < 38 a < 50 o 48 a 65: Lichtenstein et al., J. General Virol. 77, 109 (1996)). Además, se da preferencia a seleccionar ADN's para las enzimas que, como resultado de una mutación puntual, se almacenan hasta sólo un ligero grado en lisoso as y se secretan a un grado incrementado. Mutaciones puntuales de esta naturaleza se han descrito, por ejemplo, para ß-glucuronidasa (Shiplex et al., J. Biol. Chem. 269, 12193 (1993)). Una secuencia para un dominio de transmembrana se puede introducir, alternativamente o además de la secuencia señal con el fin de anclar la enzima en la membrana celular de la célula formadora de enzimas. Así, la secuencia de transmembrana del factor estimulante de colonias de macrófagos humano (posición de ADN = 1485 a > 1554; Cosman et al., Behring Inst. Mitt. 83, 15 (1988)) o la secuencia de ADN para la señal y región de transmembrana de la glicoproteína G del virus sincitial respiratorio humano (VSR) (aminoácidos 1 a 63 o sus secuencias parciales, aminoácidos 38 a 63; Vijaya et al., Mol. Cell Biol. 8, 1709, (1988), Lichtenstein et al., J. General Virol. 77, 109 (1996)) o la secuencia de ADN para la región de señal y de transmembrana de la neuraminidasa del virus de la influenza (aminoácidos 7 a 35, las secuencias parciales de los aminoácidos 7 a 27; Brown et al., J. Virol. 62, 3824 (1988)) se puede insertar entre la secuencia de ADN para el promotor y la secuencia de ADN para la enzima ( por ejemplo la ß-glucuronidasa ) .

Con el fin de amplificar la traducción, la secuencia de nucleótidos GCCACC o GCCGCC se puede insertar en el extremo 3' del promotor -y directamente antes del extremo 5' de la señal de partida (ATG) de la secuencia señal o de transmem-brana (Kozak, J. Cell. Biol. 108, 299 (1989)). Sin embargo, la secuencia de nucleótidos para un anclaje de gl icofosfo l í idos también se puede insertar con el fin de anclar la enzima en la membrana celular de las células forma-doras de enzima. Un anclaje de gl icofosfol í pido está insertado en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos para la enzima; esta inserción puede ser además de la inserción de una secuenc ia señal . Se han descrito anclajes de gl icofosfol í pidos , por ejemplo, para CEA (posición de ADN < 893 a > 1079; Berling et al., Cáncer Res. 50, 6534 (1990)), para N-CAM (Cunningham et al., Science 236, 799 (1987)) y para otras proteínas de la membrana, tales como Thy-1 (Clissold, Biochem. J. 2S1, 129 (1992)) o CD16 (Selvaray et al., Nature 333, 565 (1988)). Ferguson et al. (Ann. Rev. Biochem. 57, 285 (1988)) han publicado una revisión de proteínas de la membrana ancladas con gl icofosfol í pidos . Otra opción para anclar enzimas a la membrana celular de conformidad con la presente invención es el uso de una se-cuencia de ADN para una proteína de fusión de ligando-enzima. La especificidad del ligando de esta proteína de fusión está dirigida contra una estructura de la membrana que está presente sobre la membrana celular de células endoteliales proliferantes o de células tumorales. Los ligandos que se fijan a la superficie de células endoteliales proliferantes incluyen, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que están dirigidos contra estructuras de la membrana de células endoteliales según se ha descrito, por ejemplo, por Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al (C ncer Res. 49, 6214 (1989)) y Maruyama et al. (PNAS USA 87, 5744, 1990)). Estas incluyen, en particular, anticuerpos contra los receptores VEGF. Los anticuerpos monoclonales murínicos se han de emplear, preferiblemente, en forma humanizada. La humanización se efectúa de la manera descrita por Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) y Hoogenboom et al. (Rev. Tr . Transfus. Hemobiol. 36 , 19 (1993)). Los fragmentos de anticuerpos se preparan de acuerdo con el estado de la técnica, por ejemplo de la manera descrita por por Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)), Hoogenboom et al. (Ref. Tr . Transfus. Hemobiol. 36 , 19 (1993); Girol. Mol. Immunol. 28, 1379 (1991)) o Huston et al. (Intern. Rev. Immunol. 10, 195 ( 1993) ) . Los ligandos incluyen, además, todos los compuestos activos que se fijan a estructuras de membrana o receptores de la membrana sobre células endoteliales. Estos compuestos activos incluyen, por ejemplo, sustancias que contienen mañosa terminal y, además, IL-1 o factores de crecimiento o sus fragmentos, o secuencias parciales de los mismos, que se fijan a receptores que son expresados por células endotelia-les, tales como PDGF, bFGF, VEGF, TGGß (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)) o quinina y derivados o análogos de quinina. Además, incluyen moléculas de adhesión que se fijan a células endoteliaies activadas y/o proliferantes. Moléculas de adhesión de esta naturaleza, tales como Slex. LFA-1, MAC--1, LeCAM-1, VLA-4 o vitronectína y derivados o análogos de vitronectina ya han sido descritos (revisiones en Augustin--Voss et al., J. Cell. Biol. 119, 483 (1992), Pauli et al., Cáncer Metast. Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cáncer Metast. Rev. 11, 353 (1992); Varner et al., Cell Adhesión and Commun, 3, 367 (1995)). Sin embargo, los ligandos incluyen también anticuerpos o sus fragmentos que están dirigidos contra antígenos específicos de tumores o asociados a tumores sobre la membrana de la célula tumoral. Ejemplos de antígenos de esta naturaleza, y los relevantes anticuerpos, se dan en Sedlacek et al., Contrib. Oncol. 32 (1988) y Contrib. Oncol. 43 (1992). Se han descrito proteínas de fusión de anticuerpo-enzima, por ejemplo, por Bosslet et al., Br. J. Cáncer 65, 234 (1992). Con el fin de facilitar la secreción de las proteínas de fusión de ligando/enzima que han sido citadas. la secuencia de señal homologa, que está contenida en cada caso en la secuencia de ADN para la enzima, puede ser reemplazada, como ya se ha descrito, por una secuencia de señal heteróloga que mejora la secreción extracelular. 1.3 Combinación de varias sustancias antitumorales o ant inf lamator ias La invención se refiere también a construcciones de ácidos nucleicos que contienen una combinación de las secuen-cias de ADN para varias sustancias antitumorales o antiinflamatorias (A, A) idénticas o sustancias antitumorales (A, B) diferentes. Con el propósito de expresar dos secuencias de ADN, el ADNc de un lugar de entrada de ribosoma interno (LERI) se intercala preferiblemente como un elemento regula-dor (véase la figura 7). LERI's de esta naturaleza han sido descritos, por ejemplo, por Mountford y Smith (TIG 11, 179 (1995), Kaufman et al., Nucí. Acids Res. 19, 4485 (1991), Morgan et al., Nucí. Acids Res. 20, 1293 (1992), Dirks et al., Gene 128, 247 (1993), Pelletier y Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) y Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994). Así, el ADNc de la secuencia del LERI de poliovirus (posición < 140 a > 630 del 5' UTR; Pelletier y Sonenberg, Nature 334, 320 (1988)) se puede utilizar para enlazar el ADN de la sustancia ant inf lamator ia A (en el extremo 3') yel ADN de la sustancia ant inf lamator ia B (en el extremo 5'). Dependiendo de la combinación, un compuesto activo de esta naturaleza tiene un efecto aditivo (A+A, A+Bl ) o sinérgico dentro del contexto de la invención.

Compuesto activo para realzar la formación deficiente de glóbulos sanguíneos 2.1. Selección de las secuencias de promotor o activador para células hematopoyéticas En el contexto de la presente invención, una secuencia reguladora de un gen o un elemento de un gen que codifica una proteína que es expresada de manera particularmente intensa o selectiva en células hematopoyéticas se utiliza preferiblemente como la secuencia de promotor o activador constituida por promotores o reforzadores. Estas secuencias reguladoras de genes incluyen secuencias de promotor para genes para una citoquina o su receptor, cuya expresión en las células hematopoyéticas inmaduras (o en células vecinas, tales como el estroma) tiene lugar antes de la de la subsiguiente citoquina que se desea como una sustancia activa y que ejerce un efecto sobre Jas células hematopoyéticas. Ejemplos de citoquinas de esta naturaleza que ejercen un efecto sobre células hematopoyéticas inmaduras son: Factor de células primitivas IL-1 - IL-3 IL-6 GM-CSF 2.2. Selección de los genes estructur les para sustancias activas para células hematopoyéticas En el contexto de la invención, una sustancia activa ha de entenderse como una secuencia de ADN cuya proteína expresada lleva a cabo una proliferación y/o diferenciación de glóbulos sanguíneos. 3. Compuesto activo para la terapia de enfermedades auto- inmunes, alergias e inflamaciones, y para prevenir rechaces de órganos 3.1. Selección de secuencias de promotor o activador para, entre otras, enfermedades autoinmunes Secuencias reguladoras de genes para las proteínas que se forman en una medida acrecentada en macrófagos y/o linfocitos durante la reacción inmune han de utilizarse como secuencias de promotor o activador constituidas por promotores o reforzadores. Ejemplos de proteínas de esta naturaleza son : IL-1 IL-lß receptor IL-1 IL-2 - receptor IL-2 IL-3 receptor IL-3 IFN? IL-4 - receptor IL-4 IL-5 IL-6 FIL IL-7 - IL-10 IL-11 1L-12 IL-13 GM-CSF - receptor GM-CSF proteínas integrina-beta 2 3.2. Selección de los genes para sustancias activas para, entre otras, enfermedades autoinmunes Dentro del contexto de la invención, la sustancia activa es la secuencia de ADN que codifica un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una citoquina, una quemoquina, un factor de crecimiento o uno de sus inhibidores para una proteína del plasma sanguíneo, para una ribozima que es catalítica para el producto de transcripción de una de las secuencias de ADN o para ei producto de transcripción de un gen que codifica una proteína del control del ciclo celular o una secuencia de ADN para un anticuerpo o para una enzima. La selección de la sustancia act iva- depende de la enfermedad básica a tratar y de la secuencia de promotor elegida. 4. Compuesto activo para tratar artritis 4.1. Selección de las secuencias de promotor o de activador para la art r i t is Dentro del contexto de la invención, secuencias de promotor o activador, constituidas por promotores o reforzadores, o secuencias reguladoras de genes han de entenderse como preferidas las que estén asociadas con esos genes con los que los factores de transcripción interactúan y se forman o son activos en células sinoviales y células inflamatorias. Dentro del contexto de esta invención, las secuencias de promotor preferidas incluyen secuencias reguladoras de genes o elementos procedentes de genes que codifican proteínas que son expresadas, en particular, en células sinoviales y células inflamatorias. 4.2. Selección de los genes estructurales para sustancias activas para artritis En el contexto de la invención, una sustancia activa ha de entenderse como una secuencia de ADN cuya proteína expresada inhibe directa o indirectamente la inflamación en una articulación, por ejemplo, y/o fomenta la reconstitución de la matriz extracelular (cartílago, tejido conjuntivo) en la articulación.

. Preparación de un compuesto activo frente a agentes infecciosos El compuesto activo se puede preparar de dos formas que son fundamentalmente diferentes: para la terapia de infecciones víricas e infecciones por parásitos, o bien para la profilaxis de enfermedades infecciosas debidas a virus, bacterias o parásitos. Las vacunas se utilizan para la profilaxis de enfermedades infecciosas .- Sin embargo, las posibilidades para preparar vacunas eficaces de una manera convencional están limitadas (Brown, Int. J. Technol. Assessm. Health Care 10, 161 (1994), Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)), Arnon et al., FASEB J. 6, 3265 ( 1992) ) . Por lo tanto, se desarrolló la tecnología de las vacunas de ADN. Sin embargo, estas vacunas de ADN hacen surgir cuestiones con respecto al grado de eficacia, seguridad y efectos secundarios (Fynan et al., Int. J. Immunopharm. 17, 79 (1995), Donnelly et al., Immunol, 2, 20 (1994)). Dentro del contexto de esta invención, compuestos activos para la profilaxis de enfermedades infecciosas son, teniendo en cuenta su especificidad de la célula y regulación del ciclo celular, notables para un alto grado de seguridad. .1. Selección de las secuencias de promotor o activador 5.1.a) Para la terapia de enfermedades infecciosas Secuencias de promotor de genes celulares cuya actividad esté, en particular, alterada por infecciones con bacterias o parásitos se han de seleccionar como secuencias de activador o se han de seleccionar secuencias de promotor que se derivan de los virus que transforman las células que han infectado y estimulan a Ja proliferación a estas células. Ejemplos de estos virus son HBV, HCV, HSV, HPV, VIH, EBV y HTLV. .2 Selección de los genes estructurales para sustancias act ivas 5.2.a) Para la terapia de enfermedades infecciosas El ADN para una proteína que exhibe efectos citostáticos, citotóxicos, ant íbacter iapos o antivíricos se ha de seleccionar como una sustancia activa. Ejemplos de proteínas citotóxicas o citostáticas ya han sido citados anteriormente. Como ejemplos de proteínas antibacterianas o antivíricas se puede mencionar un anticuerpo o fragmentos de anticuerpos. Cuando se selecciona una enzima, se ha de administrar subsiguientemente el precursor de una sustancia citotóxica antivírica o antiparásita que se puede escindir por parte de esta enzima. Sustancias activas para proteínas antivíricas dentro del contexto de esta invención son, además, citoquinas y factores de crecimiento que exhiben una actividad antivírica. Estos incluyen, por ejemplo, las secuencias de ADN para Jas siguientes sustancias activas: IFNa IFNß IFN? TNFß - TNFa IL-1 TGFß Sin embargo, las secuencias de ADN para proteínas de fusión que se forman entre las citoquinas y los factores de crecimiento enumerados o el resto extracelular de los receptores, por una parte, y un ligando, por otra parte, también se pueden utilizar como sustancias activas dentro del contexto de Ja invención; por ejemplo, en el documento EP-A-0 464 633 Al se han descrito proteínas de fusión que contie-nen el resto Fc de Ja inmunog Jobul ina humana. También se consideran sustancias activas genes para ribozimas que digieren el ARNm de genes para las proteínas del controJ del ciclo celular o el ARNm de virus. Ribozimas que son catalíticas para VIH han sido revisadas, por ejemplo, por Christoffersen et al., J. Med. Chem. 38, 2033 (1995). Además, una sustancia activa dentro dei contexto de esta invención es ia secuencia de ADN para un anticuerpo que tiene una especificidad que inactiva el virus relevante, o sus fragementos que contienen VH_ y VL_ , o sus fragemento V„ y V, que están conectados por medio de un enlazador, fragmentos que se preparan, por ejemplo, de acuerdo con la metodología descrita por Marasco et ai. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90. 7889 (1993)). Ejemplos de anticuerpos que tienen una especificidad de esta naturaleza frente a virus se dan en la Sección 5.2.b). .2.b) Para Ja profilaxis de enfermedades infecciosas La sustancia activa a seleccionar es el ADN para un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que es específico para el agente infeccioso, o el ADN para una proteína que se forma por el agente infeccioso y que conduce, por medio del desencadenamiento de una reacción inmune, es decir debido a la fijación al anticuerpo y/o debido a linfocitos T citotóxicos, a la neutralización y/o destrucción del agente. Los denominados antígenos de neutralización de esta naturaleza ya se han empleado como antígenos para vacunas (véase la revisión en Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)). Ejemplos de secuencias de ADN que codifican antígenos de neutralización se pueden obtener de ias siguientes publicaciones : - Antígeno del virus de la influenza A (Ulmer et al., Science 259, 1745 (1993), Robinson et al., Vaccine 11, 957 (1993), Fyman et al., Int. J.

Im unopharmac. 17, 79 (1995)) Antígenos de VIH (Wang et al., PNAS USA 90, 4156 (1993)) Antígeno del virus de la rabia (Donnelly et al., Immunol. 2/1, 20 (1994)) Antígenos de HSV (virus Herpes simplex) (Fleckenstein et al., Nature 274, 57 (1978)) - Antígeno de RESV (virus síncitial respiratorio) (Du et al., Bio/Tech. 12, 813 (1994), Hall, Science 265, 1393 (1993)) Antígenro del virus de la parainf luenza (Du et al., Bio/Techn. 12, 813 (1994)) - Antígeno del rotavirus (Albert et al., J. Clin. Microbiol. 25, 183 (1987), Anderson et al., J. Infecí. Dis. 153. 823 (1986), Batíaglia et al., J. Infect. Dis. 155, 140 (1987), Chanock et -al., J. Infecí. Dis. 148, 49 (1983), Dyall- -Smith et al., J. Virol. 38, 1099 (1981), Glass et al., Science 265, 1389 (1994) ) Antígeno de VZV (virus de Varicella zoster) (Straus et al., Ann. Intern. Med. 109, 438 (1988), Gershon, Pediaír. Infecí. Dis. 2, 171 (1991), Kin- chington et al., J. Virol. 64, 4540 (1990)) - Antígeno de CMV (citomegalovirus) (Plotkin, Science 265, 1383 (1994)) Aníígeno del virus del sarampión (Kaíz y Kellin, Science 265, 1391 (1994)) Antígeno de HPV ( papi lomavi rus humano) (Tindl y Frazer, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 186, 217 (1994)) Antígeno de HBV (virus de la hepatitis B) (Valenzuela et al., Nature 280, 815 (1979), Heerman et al. , J. Virol . 52, 396 ( 1984) ) - Antígeno de HCV (virus de la hepatitis C) (Cerny et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol. 189, 169 (1994), Esteban et al., Progr. Liver Dis. 10, 253 (1992), Jung et al., Eur. J. Clin. Invest. 24, 641 ( 1994) ) - Antígeno de HDV (virus de la hepatitis D) (Iwarson, Scand. J. Infect. Dis. 24, 129 (1992), Consolo et al., Nephron. 61, 251 (1992)) Antígeno de HEV (virus de la hepatitis E) (Iwarson, Scand. J. Infect. Dis. 24, 129 (1992), Consolo et al., Nephron. 61, 251 (1992)) Antígeno de HAV (virus de la hepatiíis A) (d'Hondí, Vaccine 10, 48, (1992), Andre, J. Infecí. Dis. 171. 33 (1995), Lemon et al., Vaccine 10, 40 (1992), Melnick et ai., Vaccine 10, 24 (1992), Flehmig, Baillie- res Clin. Gast roeníerol . 4, 707 (1990)) Antígeno de vibrio cholera (Levine y Kaper, Vaccine 11, 207 (1993)) Antígeno de Borrelia burgdorferi (Schaible et al., Immunol. Letlers 36, 219 (1993), Wallich et al., Lab. Med. 17. 669 (1993)) - Antígeno de Helicobacter pylori (Crabtree et al., Lancet 338, 332 (1991), Blaser, J.

Infect. Dis. 161, 626 (1990), Cover y Blaser, J. Biol.

Chem. 267, 10570 (1993), Cover eí al., Infecí. Immunol. 58, 603 (1990), Dunn eí al., J. Biol. Chem. 265, 9464 (1990), Dunn el al., Infecí. Immunol. 60, 1946 (1992), Lage el al., Acia Gaslroeníero 1. Belg. 56 (supl.), 61 (1993), Mobley el al., Scand. J. Gaslroiní. 26 (supl. 187) , 39 ( 1991) ) Anlígeno de la malaria (Nussenzweig y Long, Science 265, 1381 (1994), Maurice, Science 267, 320 (1995), Enders el al., Vaccines 10, 920 (1992), Knapp et al., Infecí. Imm. 60, 2397 (1992)) Sin embargo, dentro del contexío de la invención, sus?ancias activas de esta naturaleza incluyen también el ADN para un anticuerpo ant i-idiol ipo o sus fragmentos de fijación al antígeno, cuyas estrucluras de fijación al antígeno, las regiones determinaní es de complemenlar iedad , consíiluyen copias de la esíruclura de la proleína o de la estructura del hidrato de carbono del antígeno de neutralización del agente infeccioso. Anticuerpos ant i-idiol ipo de esta naturaleza pueden reemplazar, en particular, antígenos de hidratos de carbono en el caso de agentes infecciosos bacterianos. Anticuerpos ant i-idiotí picos de estas naturaleza y sus productos de escisión han sido revisados por Hawkins et al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) y Weslerink y Apicella (Springer Seminars in Immunopalhol . 15, 227 (1993)). .3 Combinación de suslancias acíivas idéníicas o diferenles para la lerapia o la profilaxis de enfermedades infecciosas La invención se refiere, además, a un compueslo activo que comprende una combinación de las secuencias de ADN de sustancias activas idénticas (A, A) o de sustancias activas diferentes (A,B). Con el fin de expresar dos secuencias, el ADNc de un lugar de entrada de ribosoma interno (LERI) está preferiblemente intercalado como un elemento regulador. LERI's de esta naturaleza han sido descritos, por ejemplo, por Montford y Smilh, TIG 11, 179 (1995), Kaufman el al., Nucí. Acids Res. 19, 4485 (1991), Morgan el al., Nucí. Acids Res. 20, 1293 (1992), Dirks el al., Gene 12S. 247 (1993), Pellelier y Sonenberg, Naíure 334, 320 (19SS) y Sugilomo el al., BioTechn. 12, 694 (199¿). Así. el ADNc de la secuencia del LERI del poliovirus (posición < 140 a > 630 del 5' UTR (Pellelier y Sonenberg, Nalure 334, 320 (1988)) se puede ulilizar para enlazar el ADN de la sustancia vírica A (en el exlremo 3') y el ADN de la sus?ancia an?ivírica B (en el exíremo 5') (véase la figura 8). Dependiendo de la combinación, un compueslo acíivo de esla naluraleza exhibe un efeclo adilivo (A+A, A+Bl) sinérgico dentro del contexlo de la invención. Así. para la terapia de enfermedades víricas, por ejemplo, se pueden combinar una con otra dos sustancias activas antivíricas idénticas o dos sustancias activas antivíricas diferentes. En la profilaxis de enfermedades infecciosas se pueden combinar una con otra varias susíancias aclivas que codifican anlígenos diferenles de un agenle infeccioso o de agenles infecciosos diferenles. Además, la suslancia acliva que codifica el aníígeno de un agenle infeccioso se puede combinar con una suslancia acliva que codifica una ciloquina o un receplor de ciloquina. La ciloquina o los receplores de ciloquina que se forman de esla manera (después de la inyección del compueslo aclivo) al mismo liempo que el anlígeno del agente infeccioso pueden influir sobre la naturaleza y resistencia de la reacción inmune que se desarrolla. Secuencias de ADN para citoquinas y receptores de cito-quina que ampli ican la reacción inmune humoral ya han sido descritas en el apartado 5.2.d), mientras que las que amplifican la reacción inmune celular han sido descritas en los apartados 5.2.a) y 5.2.c). Lo que sigue son ejemplos de secuencias de ADN para citoquinas que amplifican la reacción inmune en conjunto: Il-la - (Fenton, Int. J. Immunopharm. 14, 401 (1992), Furntani el al., Nucí. Acids Res. 14, 3167 (1986), Lafage el al., Blood 73, 104 (1989), March et al., Nature 315, 641 ( 1985) ) Il-Iß (Bensi et al., Gene 52, 95 (1987), Auron et al., PNAS 81 , 7907 ( 1984) , Clark et al . , Nucí . Acids Res. 14, 7897 (1986)) 11-2 (Fletscher el al., Ly phok, Res. 6, 45 (1987), Malsui el al., Lymphokines 12, 1 (1985), Tanaguchi el al., Nalure 302, 305 (1983)) GM-CSF (Gough el al., Nalure 309. 763 (1984), Nicola eí al., J. Biol. Chem. 254, 5290 (1979), Wong el al., Science 228, 810 (1985)) 6. Compuesío acíivo para íratar tumores 6.1. Selección de las secuencias de promotor o activador para células tumorales Una secuencia de nucleótidos reguladora de genes con la que interaclúan factores de transcripción que se forman o son activos en células tumorales se designa como la secuencia de promotor o activador. Se prefieren aquellos tumores que estén directa eníe disponibles a las nuevas conslrucciones de ácido nucleico. Eslos lumores son, por ejemplo, células de leucemia (además de células endoteliales proliferantes en la vecindad de tumores sólidos de diferente tipo) después de la administración int ravenosa- de las construcciones de ácidos nucleicos, carcinomas de ovarios y carcinomas pancreáticos, por ejemplo, después de la inyección int raper i loneal de las construcciones, y carcinomas de pulmón, por ejemplo después de la administración int rabronqu ial de las construcciones. Dentro del contexio de esla invención, las secuencias de promolor o acíivador preferidas incluyen secuencias regulado-ras de genes o elementos procedentes de genes que codifican las proteínas que se forman, en particular, en células de leucemia, células cancerígenas o células de sarcoma. Así, el promotor para la proteína N-CAM se utiliza preferiblemente en el caso de carcinomas bronquiales de células pequeñas, mien-tras que el promotor para el receptor del factor de crecimiento de la hepatilis o para L-plaslina se utiliza preferiblemente en el caso de carcinomas de ovarios, el promotor para L-plastina o para mucina epitelial polimórfica (MEP) se uíiliza prefer ib lemente en el caso de carcinomas pancreáti-cos, y el promotor para el antígeno específico de la próstala (AEP) se utiliza preferiblemente en el caso de tumores de la próstala . 6.2. Selección de los genes est ruclurales para sustancias activas para células lumorales Deniro del conlexlo de la invención, una suslancia acliva ha de entenderse como una secuencia de ADN cuya proteína expresada inhibe la proliferación de células, en particular también de células de leucemia. Estos inhibidores del ciclo celular incluyen, por ejemplo, las secuencias de ADN para proleínas ciioslálicas y cilolóxicas inhibidoras, para anlicuerpos o producios de escisión de anlicuerpos y para enzimas, según se ha descrilo ya. Un inhibidor del ciclo celular ha de entenderse, además, como una secuencia de ADN que expresa una proteína que, directa o indi reclámenle , exhibe un efecto citostálico o citolóxico en células tumorales o células de leucemia. Un inhibidor dei ciclo celular ha de entenderse también como la secuencia de ADN para una ribozima que calaliza el ARNm de los genes para las proleínas del conlrol del ciclo celular. Una suslancia acliva para células lumorales ha de entenderse también como una secuencia de ADN cuya proteína o péptido expresados constituyen un antígeno tumoral que desencadena una reacción inmune. 7. Compuesto activo para inhibir la proliferación de células de la musculatura lisa en asociación con oclusiones de los vasos sanguíneos 7.1. Selección de las secuencias de promolor o de aclivador para células de la musculalura lisa Secuencias de promolor o de aclivador consliluidas por promotores o reforzadores que se han de utilizar dentro del contexto de la invención son preferiblemente secuencias reguladoras de genes o elementos procedentes de genes que codifican proteínas que se forman, en particular, en las células de la musculalura lisa. 7.2. Selección de los genes estructurales para sustancias activas para células de la musculatura lisa Dentro del contexto de la invención, una sustancia activa ha de entenderse como una secuencia de ADN cuya proteína expresada inhibe la proliferación de células de la musculatura lisa. Estos inhibidores de la proliferación incluyen las proteínas que ya se han mencionado en los apartados 1.2.a) y 1.2.c). Sin embargo, una sustancia activa también ha de entenderse como la secuencia de ADN para una enzima que convierte un precursor inactivo de un agente citoslático en un agente citostálico (véase el apartado 1.2.e)). Sin embargo, una sustancia activa también ha de enten-derse como la secuencia de ADN para una ribozima que es específica para el ARNm de genes para las proteínas de control del ciclo celular (véase el apartado 1.2.f)). 8. Compuesto activo para ejercer un efecto sobre la coagulac ion 8.1. Selección de los promotores o las secuencias de aclivador para ejercer un efeclo sobre la coagulación Denlro del contexto de la invención, las secuencias de promotor o de activador a utilizar son preferiblemente secuencias reguladoras de genes o elementos procedentes de genes que codifican proteínas que se pueden detecíar en células de la musculalura lisa, en células endoteliales activadas, en macrófagos activados o en linfocitos activados. 8.1.a) Células de la musculatura lisa Ya se han dado ejemplos de secuencias de promotor para genes en la musculatura lisa. 8. l.b) Células endoteliales activadas Ejemplos de proleínas que se forman en células endote-Hales activadas, en particular, han sido descritos por Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155. (1994)). Estas proteínas incluyen, en parlicular, proteínas que aparecen en una medida incrementada en células endoteliales, por ejemplo las proteínas que, junto con las secuencias de promotor para sus genes, ya han sido ciladas anteriormente. 8.1.c) Macrófagos activados y/o linfocitos activados Denlro del coniexto de esla invención, secuencias de aclivador iambién han de enlenderse como secuencias de promolor de los genes para proteínas que se forman en un grado incrementado en macrófagos y/o linfocitos durante la reacción inmune. Ya se han citado proteínas de esta naturaleza. 8.2. Selección de los genes est rucíurales para susíancias aclivas para ejercer un efeclo sobre la coagulación Una sustancia activa a utilizar dentro del contexto de esta invención es una secuencia de ADN que codifica una proteína que, dir-ecta o indirectamente , inhibe la agregación de trombocitos o un factor de coagulación de la sangre o estimula la f ibr inoi is is . Una sustancia activa de esta naturaleza se denomina un inhibidor de la coagulación. Como inhibidores de la coagulación han de emplearse, por ejemplo, genes para plasmina o activadores de plasminógeno (PA's), tales como PA tisular (PAt) o PA similar a uroquinasa (PAu), o proteína C, anti-írombina III, inhibidor C-1S, al-ant i t r ips ina, inhibidor de la vía del factor tisular (IVFT) o hirudina. Sin embargo, una secuencia de ADN que codifica una proteína que favorece la coagulación de la sangre también se ha de utilizar como una sustancia activa dentro del contexto de esta invención. Ejemplos de proteínas de esta naturaleza son proleínas del plasma sanguíneo, íales como F VIII ó F IX o faclor tisular. 9. Compuesto activo para la protección frente a la lesión del sistema nervioso central (SNC) 9.1. Secuencias de promotor o de activador formadas a partir de promotores o reforzadores para un compuesto activo para la prolección frenle a la lesión del SNC 9.1.a) Secuencias de promolor o de aclivador que son aclivados en células endoleliales Estas incluyen, en particular, las secuencias de pro-motor para ios genes para proteínas específicas de células endote 1 iales . 9. l.b) Secuencias de promotor o de aclivador que son activados en células glia Una secuencia de activador preferida también ha de entenderse como una secuencia de nucleótidos (secuencia de promotor o secuencia de reforzador) que interactúa con factores de transcripción que se forman, o son activos, hasta un grado especial, én células glia. 9.2. Elección de los genes estructurales para factores neuroespecíficos Dentro del contexlo de la invención, un faclor neuroes-pecífico ha de eníenderse como una secuencia de ADN que codifica un faclor de crecimiento neuronal. La invención se explica con mayor detalle con ayuda de los siguientes ejemplos, sin estar limitada a estos ejemplos.

Ejemplo 1: Preparación de un promotor híbrido El nuevo promotor híbrido está constiluido por la siguieníe secuencia de nucleótidos diferentes, que siguen una a otra en una dirección hacia abajo: Elemenlo I El promotor del gen del receptor I de VEGF (nucleótidos -1195 a 100: Morishita eí al., J. Biol. Chem. 270, 27948 (1995). La caja TATA (nucleólidos TATAAA en la posición -31 a - 26 ) eslá mulada en TGTAAA) - La secuencia GCCACC (Kodak, J. Cell Biol. 108. 229 (1989)) El ADNc para el pépíido señal de inmunoglobulina (secuencia de nucleolidos 63 a 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) - El ADNc para ß-glucuronidasa (secuencia de nucleótidos 93 a 1982; Oshima et al. , PNAS USA 84. 685 ( 1987) ) Elemento II - El promotor del gen cdc25C (nucleótidos -487 a +121, preferiblemente nucleótidos -487 a +247; Jahroudi y Lynch, Mol. Cell Biol. 14. 999 (1994), en par?icular los nucleólidos -290 a +121) El gen para- la proteína de fijación a la caja TATA (secuencia de nucleótidos +1 a +1001. que está mutada en los nucleótidos 862 (A reemplazado por T), 889 y 890 (GT reemplazado con AC ) y 895 (C reemplazado por G) (Strubin y Slruhl, Cell 68, 721 ( 1992) ; Heard et al . , EMBO J. 12, 3519 (1993)) Las secuencias de nucleótidos del Elemento I y del Elemento II están enlazadas tal como se muestra en el esquema en la figura 9. La construcción de nucleótidos que se ha preparado de esta manera se clona en pUC 18/19 o vectores de plásmidos derivados de Bluescript, que a continuación se utilizan para la administración in vivo, directamente o en sistemas de dispersión coloidal. Los componentes individuales de ía construcción están enlazados a través de lugares de restricción adecuados que se introducen en los extremos de los diferentes elemeníos duranle la amplificación por PCR. El enlace se lleva a cabo ulilizando enzimas que son específicas para los lugares de restricción, y que son conocidas por la persona experta en la materia, y ADN-ligasas. Células endoteliales y fibroblaslos del cordón umbilical humano (Wi-38) que se mantienen en cultivo se transfectan con uno de los plásmidos descritos utilizando un método conocido por la persona experta en la técnica (Lucibello el al., EMBO J. 14, 132 (1995)), y la canlidad de ß-glucuronidasa que se produce por las células endoíeliales se mide ulilizando 4--mel i lumbe 1 i feri 1-ß-glucorónido como suslrato. Con el fin de verificar la especificidad del ciclo celular, células endoteliales se sincronizan en G0/G1 por la separación de metionina a lo largo de 48 horas (Netíelbeck el al., publicación en preparación). El conlenido en ADN de las células se delermina en un clasificador de células aclivado por fluorescencia después de la tinción con Hoechst 33258 (Lucibello et al.. EMBO J. 14, 132 (1995)). Se obtuvieron los siguientes resultados: No se puede- detecíar ningún aumenlo en ß-glucuronidasa en fibroblasíos transfectados en comparación con fibroblastos no transfectados. Las células endoteliales transfectadas expresan sustan-cialmente más ß-glucuronidasa que las células endoteliales no transfectadas. Células endoteliales proliferantes (ADN > 2 S; S = conjunto cromosómico sencillo) segregan sustancialmente más ß-glucuronidasa que las células endoteliales que están sincronizadas en G0/G1 (ADN = 2 S). Por lo tanto, la unidad de promotor múltiple que ha sido descrita da lugar a una expresión específica de la célula y dependiente del ciclo celular del gen estructural de ß-glucuronidasa.

Ejemplo 2: Preparación de un promotor híbrido en combinación con una señal de retención nuclear (SRN) y un factor de exportación nuclear (FEN) El nuevo promotor híbrido está constituido por las siguientes secuencias de nucleótidos diferentes, que siguen una a otra en una dirección descendente: Elemento III El promotor del gen del receptor I de VEGF (nucleótidos -1195 a 100; Morishita et al., J. Biol. Chem. 270, 27948 (1995). La caja TATA (nucleólidos TATAAA en la posición -31 a -26) está mutada en TGTAAA) La secuencia GCCACC (Kodak, J. Cell Biol. 108, 229 (1989)) El ADNc para el péptido señal de inmunog lobu 1 ina (secuencia de nucleotidos 63 a 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 ( 1988) ) El ADNc para ß-glucuronidasa (secuencia de nucleótidos 93 a 1982: Oshima et al., PNAS USA 84, 685-( 1987) ) El ADNc para el virus VIH-1 RER como la señal de re- tención nuclear (SRN) (secuencia de nucleótidos 7357 a 7602; Ratner et al., Nature 313, 277 (1985); Mali et al., Nature 338, 254 ( 1989) ) .

Elemento Ha El promotor del gen cdc25C (nucleótidos -290 a +121; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995); Zwicker et al. Nucí. Acids. Res. 23, 3822 ( 1995) ) - El gen para la proteína de fijación a la caja TATA contiene comutaciones (secuencia de nucleótidos 1-1001, que está mutada en los nucleótidos 862 (A reemplazado por T) , 889 y 890 (GT reemplazado con AC ) y 895 (C reemplazado por G) (Slrubin y Struhl , Ce 11 68, 721 ( 1992 ) : Heard et al . , EMBO J. 12, 3519 ( 1993) ) .

Elemento IV El promotor del gen del factor von Willebrand (vWF) (nucleótidos -487 a +247; Jahroudi y Lynch, Mol Cell Biol. 14, 999 (1994)) El ADNc para el virus VIH-1 REV como el factor de exportación nuclear (FEN) (secuencia de aminoácidos 1-117; Ratner et al., Nature 313, 277 (1985)). Las secuencias de nucleótidos para los elementos II, III y IV están enlazadas tal como se muestra en el esquema en la figura 10. La construcción de nucleótidos que ha sido preparada de esta manera se clona en pUC18/19 o vectores de plásmidos derivados de Bluescript, que se utilizan para la administración in vivo directamente o en sistemas de dispersión coloidal.

Los componentes individuales de la construcción están enlazados a través de lugares de restricción adecuados que se introducen en los extremos de los diferentes elementos durante la amplificación por PCR. El enlace se lleva a cabo utilizando enzimas que son específicas para los lugares de restricción, y que son conocidas por la persona experta en la materia, y ADN-ligasas. Células endoteliales y fibroblastos del cordón umbilical humano (Wi-38) que se mantienen en cultivo se transfeclan con los plásmidos descritos utilizando un método conocido por la persona experta en la materia (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)), y la cantidad de ß-glucuronidasa que se produce por las células endoteliales se mide utilizando 4--met i lumbel i fer i 1-ß-glucorónido como sustralo. Con el fin de verificar la especificidad del ciclo celular, células endoleliales se sincronizan en G0/G1 por la separación de melionina a lo largo de 48 horas (Nellelbeck el al., publicación en preparación). El conlenido en ADN de las células se delermina en un clasificador de células aclivado por fluorescencia después de la íinción con Hoechst 33258 (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)). Se obtienen los siguientes resultados: No se puede deteclar ningún aumento en ß-glucuronidasa en fibroblastos transfectados en comparación con fibroblastos no transfectados. Las células endoteliales transfectadas expresan sustancialmente más ß-glucuronidasa que las células endoteliales no transfecí adas . Células endoteliales proliferantes (ADN > 2 S) segregan sustancialmenle más ß-glucuronidasa que las células endoleliales que eslán sincronizadas en G0/G1 (ADN = 2 S). Por lo lanío, la unidad de promolor múltiple que ha sido descrita da lugar a una expresión específica de la célula y dependiente del ciclo celular del gen estrucíural de ß-glucuronidasa.

Ej emplo 3 : Preparación de un promotor híbrido en combinación con una unidad de promotor que responde al activador La nueva unidad de promotor que responde al activador está constituida por las siguientes secuencias de nucleótidos diferentes que siguen una a otra en una dirección descendente: Elemento V Subunidad A de activador El promotor del gen cdc25C (nucleótidos -290 a +121; Zwicker el al., EMBO J. 14, 4514 (1995); Zwicker et al. Nucí. Acids. Res. 23, 3822 (1995)) El ADNc para el dominio de fijación a ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1 a 147; Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) - El ADNc para Gal80 (aminoácidos 1 a 435; Leuther el al., Science 256, 1333 (1992) ) Subunidad B de activador - El promotor del gen del receptor I de VEGF (nucleótidos -1195 a +100; Morishita el al., J. Biol.

Chem. 270, 27948 (1995), con la mulación TGTAAA en los nucleótidos -31 a -26) El ADNc para el dominio de fijación a Gal80 de Gall4 (aminoácidos 851 a 881; Leuther et al., Science 256, 1333 (1992)) La señal de localización nuclear (SLN) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126 a 132: PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) - El dominio de t ransact i vación del ácido (DTA) de HSV-1 VPl 6 (aminoácidos 406 a 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5-, 190 (1995)) Promotor que responde al aclivador La secuencia de fijación para Gal4 que tiene la secuencia de nucleótidos 5 ' -CGGACAACTGTTGAC CG-3' (SEQ ID NO. : 2, Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol: 10, 2916 (1999)) acoplada al promotor basal de SV40 (nucleótidos 48 a 5191; Tooze (comp.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor Nueva York, Nueva York; Cold Spring Harbor Laboratory) . El orden de las secuencias de nucleótidos de las unidades de promotor que responden al activador se muestra por el esquema en la figura 11. La secuencia de activador descrita funciona como sigue: • El promotor cdc25C regula la transcripción de los ADNc's combinados para la proteína de fijación a Gal4 y para GaI80 de una manera específica del ciclo celular. - El promotor del receptor I de VEGF limita la transcripción del ADNc acoplado para el dominio de fijación a GalSO de Gal4, la SLN de SV40 y la TAP a células endoteliales. Sin embargo, su activación es inhibida por la mutación . - Los productos de expresión de las subunidades A y B de activador dimerizan mediante la fijación del dominio de fijación a Gal80 de Gal4 a GalSO. La dimerización se muestra esquemát icamenle en la figura 12. La proteína dimérica es un factor de transcripción quimérico para la secuencia de ADN de promotor que responde al activador para el dominio de fijación a Gal4/?romotor de SV40. El promolor eslá ahora enlazado, en su exlremo 3', a la secuencia GCCACC (Kocak, J. Cell Biol. 108, 229 (1989)), y ésla úllima está enlazada al ADNc para el péptido señal de inmunoglobul ína (secuencia de nucleótidos 63 a 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)). Esta es seguida por el ADNc para ß-glucuron-idasa (secuencia de nucleólidos 93 a 1982; Oshima el al., PNAS USA 84, 685 (1987)) de acuerdo con el esquema en la figura 13. A su vez, esla unidad eslá conectada, en su extremo 3', al elemento VI, elemento VI que, sin embargo, también se puede añadir al extremo 5' de la construcción de nucleótidos.

Elemento VI El elemento VI comprende: el promotor del gen del factor von Willebrand (nucleótidos -487 a +247; Jahroudi y Lynch, Mol. Cell. Biol. 14, 999 (1994)) - El gen para la proteína de fijación a la caja TATA (secuencia de nucleótidos 1-1001) que está mutado en los nucleótidos 862 (A reemplazado por T), 889 y 890 (GT reemplazado por AC ) y 895 (C reemplazado por G). La comutación en la proteína de fijación a la caja TATA realza la inhibición de la activación del promotor del receptor de VEGF (subunidad B de activador). La construcción de nucleótidos que ha sido preparada de esta manera se clona en pUC18/19 o vectores de plésmidos derivados de Bluescript, que se utilizan para la admipistra-ción in vivo directamente o en sistemas de dispersión coloidal . Los componentes individuales de la construcción están enlazados a través de lugares de restricción adecuados que se incorporan en los extremos de los diferentes elementos durante la amplificación por PCR. El enlace se lleva a cabo utilizando enzimas que son específicas para los lugares de restricción y que son conocidas por la persona experta en la materia, y ADN-ligasas. Células endoteliales y fibroblastos del cordón umbilical humano (Wi-38) que se mantienen en cultivo se transfectan con el plásmido descrito utilizando un método conocido por la persona experta en la materia (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)), y la cantidad de ß-glucuronidasa que se produce por las células endoteliales se mide utilizando 4-- et i lumbe 1 i fer i 1-ß-glucorón ido como sustrato. Con el fin de verificar la especificidad del ciclo celular, células endoteliales se sincronizan en G0/G1 por la separación de metionina a lo largo de 48 horas (Nettelbeck et al., publicación en preparación). El contenido en ADN de las células se determina en un clasificador de células activado por fluorescencia después de la tinción con Hoechst 33258 (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)). Se obtienen los siguientes resultados: No se puede detectar ningún aumento en ß-glucuronidasa en fibroblastos transfectados en comparación con fibroblastos no transfectados. Las células endoteliales transfectadas expresan sustancialmente más ß-glucuronidasa que las células endoteliales no transfectadas . Células endoteliales proliferantes (ADN > 2 S) segregan sustancialmente más ß-glucuronidasa que las células endoteliales que están sincronizadas en G0/G1 (ADN = 2 S). Por lo tanto, la unidad de promotor múltiple que ha sido descrita da lugar a una expresión específica de la célula y dependiente del ciclo celular del gen estructural de ß-glu-curonidasa. Un compuesto activo de acuerdo con la presente invención, según se describe en los Ejemplos I-IH, tiene el efecto de asegurar, después de la administración local, por ejemplo en el lugar del tumor, o después de la administración intracraneal o subaracnoidea, o la administración sistémica, preferiblemente intravenosa o intraarter ial , que, como resultado de la especificidad del ciclo celular o la especificidad de células endoteliales de la unidad de promotor que responde al activador son principalmente, si no exc lus ivamen-te, sólo las células endoteliales proliferantes las que segregan ß-glucuronidasa. Esta ß-glucuronidasa escinde un doxo-rrubicin-ß-glucurónido tolerado ( Jacquesy et al., documento EPO 0 511 917 Al), que ahora se injecta. en doxorrubicina, que tiene un efe-cto citostático. La doxorrubicina inhibe la proliferación de células endoteliales y ejerce un efecto citostático sobre estas células y sobre células tumorales vecinas. Esto da como resultado una inhibición del crecimiento del tumor.

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES 1.- Una construcción de ácido nucleico para la expresión regulada de una transgen en una célula hospedante, que comprende : al menos una secuencia de ácido nucleico que contiene una primera mutación que inhibe la expresión adecuada de dicho transgen, y al menos una secuencia de ácido nucleico que contiene una segunda mutación que abóle la inhibición debida a la primera mutación. 2.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1 para la expresión regulada de un transgen en una célula hospedante, en la que: (i) cuando dicha secuencia de ácido nucleico que contiene dicha primera mutación es un transgen (b) que contiene una mutación que inhibe la transcripción y/o la traducción de dicho transgen o inhibe la función del compuesto farmacológi-camente activo, entonces dicha construcción de ácido nucleico comprende, además, una primera secuencia (a) de promotor o reforzador que está situada más arriba del extremo 5' de dicho transgen, o (i') cuando dicha secuencia de ácido nucleico que con-tiene dicha primera mutación es una primera secuencia (a') de promotor o reforzador, que contiene una mutación que inhibe la función del primer promotor, entonces dicha construcción de ácido nucleico comprende, además, un transgen (b') que codifica un compuesto farmacológicamente activo. 3.- Una construcción de ácido nucleico para la expresión regulada de un transgen en una célula hospedante de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende, en un marco de lectura en la dirección del extremo 5' a 3', los siguientes componentes : (i) una primera secuencia (a) de promotor o reforzador que activa la transcripción de dicho transgen, o una primera secuencia (a') de promotor o reforzador que contiene una mutación que inhibe la función del primer promotor (a'); (ii) un transgen (b') que codifica un compuesto farmacológicamente activo o un transgen (b) que contiene una muta-ción que inhibe la transcripción y/o la traducción de dicho transgen o inhibe la función del compuesto farmacológicamente activo codificado por dicho transgen: (iii) una segunda secuencia (c) de promotor o reforzador que activa la transcripción basal del componente (d) o que contiene una mutación que inhibe la función del segundo promotor; y (iv) un gen (d) que codifica un ARNt o una proteína reguladora para abolir la mutación en al menos uno de los promotores (a) y (c) o en el transgen (b). 4.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 3, en la que los promotores (a) y (c) son no específicos, específicos de la célula o específicos del virus, y en la que al menos uno de los promotores (a) y (c) puede ser activado por al menos uno de varios mecanismos de activación, incluidos de manera no específica, de manera específica del virus, metabólicamente, por tetraciclina, por hipoxia, de manera específica de la célula y de manera específica del ciclo ce lular . 5.- La construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el transgen (b) contiene una señal de retención nuclear (SRN) que está enlazada, en su extremo 5', directa o indirectamente, al extremo 3' del transgen, y en la que el producto de la SRN proporciona una estructura para fijar un factor de exporta-ción nuclear (FEN). 6.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 5, que comprende, además, los siguientes componentes: (v) una tercera secuencia (i) de promotor o reforzador que activa la transcripción basal del FEN; y (vi) una secuencia de ácido nucleico (k) que codifica el FEN que se fija al producto de transcripción de la SRN, me-diando con ello en el transporte del producto de transcripción del transgen fuera del núcleo de la célula al citoplasma. 1 . - La construcción de ácido nucleico de la reivindica-ción 3 ó 4, en la que las secuencias (a) y (c) de promotor o reforzador son idénticas. 8.- La construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 , en la que al menos una de las secuencias (a) y (c) de promotor o reforzador es un promotor quimérico que contiene el módulo de promotor CDE-CHR o E2FBS-CHR, en que dicho módulo de promotor ejerce un efecto sobre la expresión de un gen situado más abajo e interactúa con una secuencia de activador vecina, situada más arriba. 9.- La construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , en la que la expresión del gen situado más abajo está inhibida de manera específica del ciclo ce lular . 10.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 6. en la que al menos una de las secuencias (a), (c) e ( i ) de promotor o reforzador es una unidad de promotor que responde al activador, que comprende los siguientes componentes : (vii) al menos una secuencia (e) de promotor o reforzador que puede ser activada por al menos uno de varios métodos de activación, incluidos de manera no específica, de manera específica del virus, metabólicamente, por tetraciclina, por hipoxia, de manera específica de la célula y de manera específica del ciclo celular; (viii) al menos una subunídad (f) de activador que está situada más abajo de la secuencia (e) de promotor o reforzador, y en la que la transcripción basal de la subunidad de activador es activada por la secuencia (e) de promotor o reforzador; y (ix) un promotor (g) que responde al activador, que es activado por los productos de expresión de la subunidad (f) de activador o de varias subunidades (f) idénticas o por varias subunidades (f) de activador diferentes. 11.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 10, en la que al menos una de las secuencias (a), (c) o (i) de promotor o reforzador y el promotor (g) que responde al activador es un promotor quimérico, y la subunidad (f) de activador es un gen que codifica al menos un factor de transcripción que activa el promotor quimérico. 12.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 10 u 11, en la que el promotor (g) que responde al acti-vador es monómeros o multímeros del operador LexA en combinación con el promotor SV40 y es activado por dos subunidades (f) y (f) de activador: en donde la subunidad (f) de activador comprende el ADNc que codifica la proteína de fijación a ADN de LexA, cuyo extremo 3' está enlazado al extremo 5' del ADNc que codifica la proteína GalSO; y la subunidad (f') de activador comprende, en un marco de lectura del extremo 5' a 3', el ADNc que codifica el dominio de fijación a Gal80 de la proteína Gal4, codificando el ADNc el antígeno T grande de SV40, y codificando el ADNc el dominio de transactivación de HSV-1 VP16. 13.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 12, en la que el ADNc que codifica la proteína de fijación a ADN de LexA codifica los aminoácidos 1-81 ó 1-202 de la proteína de fijación a ADN de LexA, el ADNc que codifica la proteína GalSO codifica los aminoácidos 1-435 de la proteína Gal80, el ADNc que codifica el dominio de fijación a Gal80 de la proteína Gal4 codifica los aminoácidos 851-881 de la proteína Gal4, el ADNc que codifica el antígeno T grande de SV40 codifica los aminoácidos 126-132 del antígeno T grande de SV40, y el ADNc que codifica el dominio de transactivación codifica los aminoácidos 406-488 de HSV-1 VPl 6. 14.- La construcción de ácido nucleico de la reivindica-ción 12 ó 13, en la que los monómeros o multímeros del operador LexA están reemplazados por monómeros o multímeros de la región de fijación a Gal4, y el ADNc que codifica la proteína de fijación a ADN de LexA está reemplazado por el ADNc que codifica el dominio de fijación a ADN de la proteína Gal4. 15.- La construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en la que el promotor (g) que responde al activador es monómeros o multímeros que codifican la secuencia de fijación para la proteína de fijación Gal4, y la subunidad (f) de activador comprende la señal de localización nuclear (SLN) procedente del antígeno T grande de SV40, y el dominio de transactivación de ácidos (DTA) procedente de HSV-1 VP16, o la subunidad (f) de activador contiene la señal de localización nuclear (SLN) procedente de T grande de SV40 : el ADNc que codifica el dominio de fijación de ADN de la proteína Gal4 y el ADNc que codifica la secuencia de fijación a CD4 de la proteína p56 Ick. 16.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 15, en la que SLN codifica la SEQ ID NQ:1 y el DTA codifica los aminoácidos 406-488 de HSV-1 VP16, el ADNc para el dominio de fijación de ADN de la proteína Gal4 codifica los aminoácidos 1-147 de la proteína Gal4, y el ADNc para la secuencia de fijación a CD4 codifica los aminoácidos 1-71 de la proteína p56 Ick. 17.- La construcción de ácido nucleico de la reivindica-ción 6, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica la SRN se selecciona del grupo consistente en el elemento que responde a Rev (ERR) de VIH-1 o VIH-2, la señal de retención ERR-equi val ente procedente de retrovirus distintos de VIH-1 o VIH-2 y la señal de retención ERR-equivalente procedente de HBV. 18.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 6, en la que el FEN (k) se selecciona del grupo que consiste en el gen rev de retrovirus, el gen que codifica la proteína hnRNP-Al o el gen que codifica el factor de trans-cripción TFIII-A. 19.- La construcción de ácido nucleico de la reivindica-ción 6. en la que el retrovirus se selecciona del grupo que consiste en VIH-1. VIH-2, virus visna-maedi. virus de la art r i t i s-encefal-i t i s caprina, virus de la anemia infecciosa equina, virus de la inmunodeficiencia felina y HTLV. 20.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 10, en la que al menos una secuencia TATA en al menos uno de los promotores (a), (c), (g) e (i) está mutada, y el componente (d) es un gen que codifica una proteína de fijación a TATA (PFT) que está mutada y se fija a la caja TATA mutada, permitiendo la transcripción. 21.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 20, en la que la caja TATA está mutada a TGTAAA, y el gen que codifica la PFT está mutado a T en N862, a A en N889, a C en N890 y a G en N895. 22.- La construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21, que comprende un promotor híbrido que contiene, en un marco de lectura en la dirección del extremo 5' a 3', los siguientes elementos: el Elemento I que comprende: - el promotor del gen del receptor I de VEGF que contiene los nucleótídos -1195 a +100, en donde los nucleótidos de la caja TATA de TATAAA en la posición -31 a -26 están mutados a TGTAAA; - la secuencia GCCACC; - la secuencia de nucleótidos 63 a 107 del ADNc que codifica el péptido señal de inmunoglobulina; y - la secuencia de nucleótidos 93 a 1982 del ADNc que codifica la ß-glucuronidasa; y el Elemento II que comprende: los nucleótidos -487 a +121 del promotor del gen cdc25C; la secuencia de nucleótidos +1 a +1001 de la proteína de fijación a la caja TATA, que está mutada en los nucleótidos 862 (A reemplazado por T) , 889 y 890 (GT reemplazado por AC ) y 895 (C reemplazado por G) . 23.- La construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21, que comprende un promotor híbrido que contiene, en un marco de lectura en la dirección 5' a 3', los siguientes elementos: Elemento III el promotor del gen del receptor I de VEGF que contiene los nucleótidos -1195 a 100, y en donde los nucleótidos de la caja TATA de TATAAA en la posición -31 a -26 están mutados en TGTAAA; - la secuencia GCCACC; - la secuencia de nucleotidos 63 a 107 del ADNc que codifica el péptido señal de inmunoglobulina; y - la secuencia de nucleótidos 93 a 1982 del ADNc que codifica ß-glucuronidasa; y - la secuencia de nucleótidos 7357 a 7602 del ADNc que codifica el virus VIH-1 RER como la señal de retención nu-clear (SRN); y Elemento Ha los nucleótidos -290 a +121 del promotor del gen cdc25C; y - la secuencia de nucleótidos +1 a +1001 de la proteína de fijación a la caja TATA , que está mutada en los nucleótidos 862 (A reemplazado por T), 889 y 890 ( GT reemplazado por AC) y 895 (C reemplazado por G) ; y Elemento IV - los nucleótidos -487 a +247 del promotor del gen del factor von Willebrand ( vWF ) ; y - el ADNc para el virus VIH-1 REV que codifica la secuencia de aminoácidos 1-117 como el factor de exportación nuclear (FEN). 24.- La construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21, que comprende un promotor híbrido y una unidad de promotor que responde al activador en un marco de lectura en la dirección del extremo 5' a 3', que contiene los siguientes elementos: Elemento V, que comprende: 1) subunidad A de activador, que comprende: -los nucleótidos -290 a +121 del promotor del gen cdc25C; - el ADNc para el dominio de fijación a ADN de los aminoácidos 1 a -147 de la proteína Gal4; y - el ADNc que codifica los aminoácidos 1 a 435 para GalSO; 2) subunidad B de activador, que comprende: - el promotor del gen del receptor I de VEGF que contiene los nucleótidos -1195 a +100 con TGTAAA en los nucleótidos -31 a -26; - el ADNc para el dominio de fijación a Gal80 de los aminoácidos 851 a 881 de GaH4; - la señal de localización nuclear (SLN) que codifica la SEQ ID NQ: 1; y - el dominio de transactivación del ácido (DTA) que codifica los aminoácidos 406 a 488 de HSV-1 VP16; y 3) promotor que responde al activador, que comprende: - la secuencia de fijación para Gal4 que tiene la SEQ ID NQ: 2 operativamente enlazada a los nucleótidos 48 a 5191 del promotor basal de SV40; - la secuencia GCCACC; - la secuencia de nucleótidos 63 a 107 del ADNc que codifica el péptido señal de inmunoglobulina; y - la secuencia de nucleótidos 93 a 1982 del ADNc para ß--glucuronidasa; y Elemento VI, que comprende: los nucleótidos -487 a +247 del promotor del gen del factor von Willebrand; y el gen para la proteína de fijación a la caja TATA (secuencia de nucleótidos 1-1001) que está mutado en los nucleótidos 862 (A reemplazado por T), 889 y 890 (GT reemplazado por AC) y 895 (C reemplazado por G). 25.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 20, en la que al menos un gen en al menos uno de los componentes que incluyen el transgen (b), el factor de exportación nuclear (k), PFT (d) y las proteínas de fijación (f) y/o (f) del promotor (g) que responde al activador está mutado, de manera que la proteína expresada es incapaz de funcionar, y en la que el componente d) es un gen para un ARNt que posee -un anticodón que es complementario a la mutación o lleva un grupo extremo que recoge el aminoácido correcto para abolir la mutación en dichos componentes. 26.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 25, en la que al menos uno de los siguientes codones UAU, UUG, UAC, UCG, CAG, AAA, AAG o UUG está mutado en UAG, UAA, UAG, UGA o UGG, y el ARNt supresor (componente d)) es el gen sup F(su+3); sup C(su+4); sup D(su+1); sup E(su+2); sup G(su+5) o sup U(su+7). 27.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico es ADN. 28.- La construcción de ácido nucleico de la reivindica-ción 27, en la que la construcción de ácido nucleico es un vector, tal como un vector de plásmido o un vector vírico. 29.- La construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en la que el transgen (b) es un gen estructural que codifica un compuesto fármaco lógica-mente activo que se selecciona del grupo que consiste en citoquinas, interferones, factores de crecimiento, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos procedentes de receptores para citoquinas o factores de crecimiento, proteínas que tienen un efecto antiproliferante, apóptico, citostático o citolítico, inhibidores de la angiogénesis y/o proteínas inductoras de trombosis, inhibidores de la coagulación, proteínas que tienen un efecto f ibrinol í t ico , proteínas del plasma sanguíneo,' proteínas activadoras del complemento, tales como factor de veneno de cobra, C3b humano, C3b modificado, proteínas bacterianas, proteínas de revestimiento de virus, antígenos bacterianos y antígenos parásitos, antígenos tumorales, proteínas que tienen un efecto sobre la circulación sanguínea, hormonas pept ídicas ,• enzimas , proteínas de fusión constituidas por un ligando y un compuesto activo, ARN antisenti-do y ribozimas. 30.- La construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en la que el transgen (b) es un gen estructural que codifica una enzima que escinde un precursor de un fármaco para formar un fármaco y/o que codifica una proteína de fusión de ligando/enzima. 31.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 30, en la que el ligando se fija a células endoteliales o células tumorales proliferantes y se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos y sus fragmentos, proteínas que contienen mañosa en el extremo, citoquinas, factores de crecimiento y moléculas de adhesión. 32.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 29, en la que las citoquinas son IL-1 o TNF, los factores de crecimiento son PDGF, G-FGF. VEGF o TGFß, y las moléculas de adhesión son SLex , LFA-1, MAC-1, LECAM-1 o VLA-1. 33 . - Una célula aislada que contiene la construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32. 34.- La célula aislada de la reivindicación 33 , en la que la célula es un macrófago, un linfocito, una célula endotelial o una célula tumoral. 35.- Un método para inhibir la proliferación celular, preparando un producto farmacéutico que contiene una cantidad inhibidora de la proliferación celular de la construcción de ácido nucleico para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad que implica una proliferación celular excesiva, tumores, enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunes, alergias, inflamaciones, rechaces de órganos, artritis, enfermedades infecciosas o enfermedades neuronales. 36.- Una composición farmacéutica que contiene una cantidad inhibidora de la proliferación celular de la construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.