MXPA97007002A - Composicion de antigeno contra micoplasma - Google Patents
Composicion de antigeno contra micoplasmaInfo
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Abstract
La presente invención se relaciona a un antígeno de protección contra un Micoplasma preparado por un método que incluye una muestra de un Micoplasma:una sonda de anticuerpo que incluye por lo menos un anticuerpo contra un Micoplasma producido por un método que incluye:proporcionar una muestra biológica tomada en un corto tiempo después de que un animal inmune ha estado expuesto con un Micoplasma o extracto de Micoplasma tomado del sitio de infección o unárea de una lesión o unárea de una lesión o unaárea cercana al sitio de infección o lesión, aislar células de la muestra biológica;cultivar las células in vitro en un medio de cultivo adecuado;y cosechar anticuerpos producidos de las células, sondear la muestra del Micoplasma con la sonda de anticuerpo para detectar por lo menos un antígeno;y asilar el antígeno detectado, también que incluye antígenos de diagnóstico. La preparación del mismo, y su uso en la formación de composiciones de vacunas, particularmente composiciones de vacunas contra infecciones de Mycoplasma hyopneumoniae.
Description
COMPOSICIÓN DE ANTIGENO CONTRA MICOPLASMA
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona a antígenos de protección y de diagnóstico, la preparación de los mismos, y su uso en la formación de composiciones de vacunas. Particularmente, composiciones de vacunas contra infecciones de Mycoplasma hyopneumoniae. El Mycoplasma hyopneumoniae es un patógeno respiratorio de cerdos que se encuentra en todas partes, provocando la neumonía micoplásmica en porcinos (neumonía enzótica de cerdos). La neumonía enzótica de porcinos es probablemente la enfermedad más ampliamente dispersada y económicamente significante en los países del mundo que producen cerdos. Los efectos económicos de la neumonía enzótica de porcinos (SEP) son complejos, y el costo de la enfermedad es severo. En Australia, se estimó en 1988 el costo de la enfermedad de aproximadamente $20,000,000 por año. Las principales razones para el impacto económico de la SEP es la mortalidad incrementada, crecimiento disminuido, peso, conversión de alimentación disminuida, susceptibilidad a infecciones bacteriales secundarias, incremento en los costos de manejo, e incremento en el uso de antibióticos. Mientras que se han producido varias vacunas experimentales, estas resultan en resultados no tan óptimos, y utilizan varias clases de antibióticos tales como tetraciclina, lincamicina y tiamulina es todavía en tratamiento de control más ampliamente distribuido. Tales antibióticos son, sin embargo, de valor terapéutico limitado, debido a que no previenen el establecimiento de una infección y pueden desarrollarse lesiones pulmonares después de finalizado el tratamiento. La Solicitud de Patente Europea 359,919 a ML Technology Ventures L.P. describe una serie de antígenos, 36 kD, 41 kD, 74.5 kD y 96 kD en tamaño y propone el uso de tales antígenos en vacunas. Los resultados presentados sugieren que se alcanza alguna protección en cerdos contra el problema. Sin embargo, permanece una necesidad en la técnica para una vacuna efectiva contra M. hyopneumoniae la cual pueda conferir protección contra la colonización y enfermedad clínica que sigue a la exposición a M. hyopneumoniae y también significa la reducción significativa de la morbilidad y mortalidad a partir de infecciones secundarías. Por consiguiente, es un objeto de la presente invención solucionar, o por lo menos aliviar, una o más de las dificultades y deficiencias en la técnica anterior. Por consiguiente, en un primer aspecto de la presente invención se proporciona un antígeno de protección supuesto contra un Mycoplasma. de preferencia Mvcoplasma hvopneumoniae preparado por un método que incluye proporcionar una muestra de un Mvcoplasma: una sonda del anticuerpo que incluye por lo menos un anticuerpo contra un Mvcoplasma producido por un método que incluye: proporcionar una muestra biológica tomada en un tiempo corto después de que un animal inmune ha estado expuesto con un Mycoplasma o Mycoplasma extraído del sitio de infección o un área de una lesión o un área cercana al sitio de infección o lesión; células aisladas a partir de la muestra biológica; células de cultivo in vitro en un nriedio de cultivo adecuado; y anticuerpos cosechados producidos de las células; sondeando la muestra del Mycoplasma con la sonda del anticuerpo para detectar por lo menos un antígeno; y aislar el antígeno detectado. Los antígenos de protección puede funcionar también como antígenos de diagnóstico como se discute a continuación. Por consiguiente, en un aspecto preferido de la presente invención se proporciona un antígeno de protección supuesto contra Mycoplasma hyponeumoniae. o infecciones relacionadas, seleccionado del grupo de antígenos que tiene un peso molecular aproximadamente de 110-114, 90, 94, 72-75, 60-64, 52-54 y 46-48 kilodaltons (kD), como se describe anteriormente, mutados, derivados y fragmentos de los mismos. El antígeno supuesto de protección puede ser una proteína de superficie. El antígeno supuesto de protección puede ser una lipoproteína de superficie o una proteína de membrana. De preferencia, los antígenos de protección son seleccionados del grupo de antígenos que tienen pesos moleculares aproximados de 110-114, 90-94, 74, 62, 52 y 46 kD.
De preferencia, el antfgeno de 72-75 kD incluye la siguiente secuencia de aminoácido N-terminal. AGXLQKNSLLEEVWYLAL y, opcionalmente, una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos terminales: AKNFDFAPSIOGYKKIAHEL
NLKPEQILQLLG
LLKAEXNKXIEEINTXLDN preferiblemente, el antígeno de 60-64 kD incluye una de las siguientes secuencias de aminoácidos N-terminales: MKLAKLLKGFX(N/L)(M/V)IK ADP(F/I(R/E)Y(V/A)PQG(Q A)X(M/N)VG De preferencia, el antígeno de 52-54 kD incluye la siguiente secuencia del aminoácido N-terminal: AGXWAKETTKEEKS y, opcionalmente, una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos terminales: AWVIADGTVN
AIVTADGTVNDNKPNQWVRKY. De preferencia, el antígeno 46-48 kD incluye la siguiente secuencia de aminoácido N-terminal: AGXGQTESGSTSDSKPQAETLKHKV y opcionalmente, una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos internos: TIYKPDKVLGKVAVEVLRVLIAKKNKASR AEQAIIKIKIEGFDTQ KNSQNKIIDLSPEG El antígeno de 46-48 kD puede ser codificado por un fragmento ácido nucleico: 10 20 30 40 sn !!,_ ¡¿4557890 1234567850 1231567800 1234567690 12345C7E90
ATG?AAAAAA TGCCACTATA CCAGAGGAAA AÜ AGTATA TAAAATAATT 50
AAAATTACAT TTTCrrCATT TCCGCC?O?A l l i l IAAGAA TTAGTACATT ???
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AAAAAT7AAA AGTTTT?TCT ?TTTTTTTTA ATCQAAATCC AACCAGGCAI 200
AAATCTTTGT CAC-?A i i I I CAAGTCGGTA TTTTTTCATT ATTTCTACTA 259
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TAGTACTAA? AAAGACAAAT ATTTTTTCCT ATTCTAAGAA AAATTCATTT A5
TGAA?«^ ATTGA'l 1 i r G I AU I ATAAT TTGTTTGTAT AATTGAATTA 500
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ACCACAAÜ' ' GAGACGCTAA AACATAAA T AA TAATGAT TCT?TGCCAA 700
T?GCA TAA CGATCCGGAT AATCCTCGAT GAATTAGTGC CCAAAAAGAT 750
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CAGGGGG.AAA A GAT TATT A7TGCCCCTG ???ATCCAAG TGGAGT GGA &00
ACTGCTQTTA ATACAATIGC T ATAAAGGA ATTCCGATTG TTCCCTATGA 950
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GGAAA?GAAG < ATGGT3CTTT TGATTCAAI r GATCAAATGA ATGAATATCT IIOO
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C0CAAGATOA TAATAATTCC 'AATAI I I ! I ATAATGGTGC ATGAAAGTA 1200
CTTAAAGAAT TAATG?AAAA TTCGCAAAAT AAAATAATTG Al 11 ATCTCC 1?5C
TGAAGGCGAA k AATGÜ^GTTT ATGTG CAGG • ATGAAATTAT GG?ACTGCCG 130C
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TAAACCTGAT A??GTTTT G GAAAAGTTGC TGTTGAAGTT Cl 1 CGGGTTT ?eoo
TAATTGCAAA GAAAAATA GCATCTAGA7 CAG? .GTCCA > AAACGAACTA 11550
AAAGC?AAAC TACCAAATAT TTCATTTAAA " AIGATAATC AAACATATAA 1700
AGTACAAGGT AAAAATATTA AT?C??l l I I AGTAAGTCC eTAATTGTTA 17?U
CAAAAGCTAA. TGTGATAAT v üiGATGCCT AA 17ß2 Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica un antígeno de protección supuesto contra Mycoplasma hyopneumoniae o infecciones relacionadas, el fragmento de ácido nucleico:
30 40 50 I234567ß90 1234567090 1234567890 " 234i)t> HS0 1734567890 ATGAAAAAAA TGCCA TATA CCAGAGGAAA GAGC?GT?TA TAAAATAATT 50
AA??TTACAT TTTCTTCATT TGCGCCA AA N ¡ 1 IAAGAA TTAGTACATT 100
AAAAAGTA A ACAAAAGTTA TT??TCTAAA CATTAGCGCA ATCCTTAAGA 150
AAAAATTAAA AGTTTTATC I A l I TTTTTTA ATCGAAA^G.G AACCAGGCAT 200
AAATCTTTGT C?CTATTTAT CAAGTCGGTA TTT?TCATT ATTTCTA A 250
AAATATTATT í GAATTTGCA TTTTr.CATAA TCTAAAATTT TAC?TTTTTT 300
TATAV C??TT TTTAAAAATT ACTCTTTAAT T-ATALa l AI I TTTTTA' 350
TTA I G IAAA TTATAAAATT ATCTTGAATT TT?TTTG?/^T TTTTATAATT 400 TACTACTAAA AAA?CAAAT ATTI J I I CCT ATCTAAGAA AAATrcATTT 450 TTTAAAAAAA ATTGA7TTTT AT?GT?TAAT TTGTTTGTAT AATTGAATTA 500 ACTGGATTTG AAAÜGkAACA AAATGAAAAA AATGr.TTAGA AAAAAAT'CT 550 TGTATTCATC AGCT?TTT?T CCAACTTCGC TTGCATCAAT TATTGCATTT 600 GTTGCAGCA u GTGTGGÁCA GACAGAATCA GGTTCAACTT CTGATTCTAA 650
ACCACAAGCC CAGACGCTAA AACATAAAGT AAGTAATGAT T TAI ICGAA 700
TAGCACTAAC ?GATCCGGAT AATCCTCGAT GAATT?GTGC CCAAAAAGAT 750
?TTATTI CTT ATGTTGATGA AAGAGAG6CA GUAAG I TCAA CAATTACAAA 800
AAAGG.AGGAT GCACAAAAT? ?CTCACTCAC TCAGCAAGC- AATTTAAGCC 650 AGCGCCAAA AGGA'I M A N AGTGCCCCTG AAAATGÍGAAG TGGAGTTGG? D00
ACTGCTGT'A ?TACAATTGC TGATAAA3GA ATTCCGATTG TTGCCTATGA 950
TCGACTAATT ACTGGATCT ATAA TATGA TTGGTATGTT TCTTTTGATA 1000
ATGAA???CT TGGTGAATTA CAAGGTCTTT CACTTGCTiC ?^b i GAT^A 1050
GGAAAAGAAG ATGGTGCTTT TGATTCAATT GATCAAATGA TCAATATCT -.100
A???TCACA-1" ATGCCCCAAG AGACAATTTC T-I I I I ÁTALA ATC3CGGGTT 1150
LCCAAGATG TAATA?TTCC CAATATTTTT ?T??TCGTGC AATGAAAGTA 1200 CTTAAAG AT TAAT3AAAAA TTCGCAAAAI AAAATAATTG ATTTAT?TCC 1250 T AASGCGAA AATGCTGTTT ATCTCCCAGG A QAAATTAT GGAACTGCCG 13ÚÜ GTCAAAGAAT CLAA f CTTTT CTAACAATTA A AAAGATGC AGCA?GTGGT 1350
AATAAAATCA AAÜCTGTTGG TTCAAAACCA GCTTCTATTT TCAAAGSATT 1400 TCTTGCCCCA AATGATGGAA TGGCCGAACA AGCAATCAC AAATAAAAC 1*50 TTGAAÜüGTT TGATACCCAA ????TCTTTG TAACTCGTCA AGATTATAA 1500 GATAAAGCCA AAACT?TAT CAAAGACGGC GATCAAAATA TGACAATTT? 1550 í AAACrrTGAT AAAGTTrTAC GAAAAGTTGC TGTTGAAGTT I I CG33TTT fiOO TAATTGCAAA GAAAAATAAA GCATCTAGA- CAGAAGTCGA ??ACDAAC A 1650 AAAGCAAAAC TACCAAATAT TTCATTTAAA TAT6A 1 ATC AAACATATAA 1700 AGTACAAGli I AAAAATATTA ATACAATTTT ?GTAACTCCA GTAATOTTA 1750 CAAA/vGCTAA TGTTGATAAT CCTGAl GCL AA 17S2 Se ha documento una protección cruzada entre varios Micoplasma tales como M. hyorhinis y M. synoviae. antígenos similares pueden ser detectados también en otras especies de Micoplasma (Figura
1 ). En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para prevenir la infección por Micoplasma en animales. De preferencia, la enfermedad del Micoplasma e suna enfermedad de Mycoplasma hyopneumoniae tal como la neumonía enzótica de porcinos (SEP). Este método incluye administrar a un animal una cantidad efectiva de por lo menos un antígeno de protección contra el Micoplasma como se describe anteriormente. La presente invención proporciona además una composición de vacuna que incluye una cantidad profilácticamente efectiva de por lo menos un antígeno de protección supuesto contra un Micoplasma como se describe aquí. De preferencia, la composición veterinaria incluye dos o más antígenos de protección como se describen aquí. Por consiguiente, en un aspecto preferido, la presente invención proporciona una composición de vacuna que incluye dos o más antígenos de protección supuestos seleccionados de los antígenos que tienen pesos moleculares aproximados de 110-114, 90-94, 72-75, 60-64, 52-54 y 46-48 kilodaltons. La composición de la vacuna puede incluir cualquier combinación de dos o más antígenos de protección supuestos, seleccionados a partir de antígenos que tienen pesos moleculares aproximados de 110-114, 90-94, 72-75, 60-64, 52-54 y 46-48 kD. Los dos o más antígenos que pueden seleccionarse de los antígenos que caen dentro de uno de los pesos moleculares aproximados especificados y/o antígenos a partir de diferentes pesos moleculares aproximados especificados. La composición puede contener 3, 4, 5 ó 6 antígenos seleccionados a partir de antígenos de protección que tienen pesos moleculares de aproximadamente 110-114, 90-94, 72-75, 60-64, 52-54 y 46-48 kD. Las composiciones de las vacunas de acuerdo a la presente invención pueden ser administradas oralmente o pueden ser administradas parenteralmente (por ejemplo, por inyección intramuscular, subcutánea, intradérmica o intravenosa). La cantidad requerida variará con la antigenicidad del ingrediente activo y necesariamente una cantidad lo suficiente para inducir una respuesta inmune típica de las vacunas existentes. La experimentación reactiva establecerá fácilmente la cantidad requerida. Las dosis iniciales típicas de la vacuna o composiciones veterinarias pueden ser de aproximadamente 0.001-1 mg del ingrediente activo/peso corporal en kg. La relación de dosis puede incrementarse o dosis múltiples pueden ser utilizadas como sea necesario para proporcionar el nivel adecuado de protección. La composición de la vacuna de acuerdo a la presente invención puede incluir adicionalmente un portador, diluyente o excipiente aceptable en veterinaria, para la misma. De preferencia, el ingrediente activo puede estar suspendido o disuelto en un portador. El portador puede ser cualquier solvente o sólido que es no tóxico al animal y compatible con el ingrediente activo. Los portadores adecuados incluyen los portadores líquidos, tales como solución salina normal y otras sales no tóxicas en, o cerca a las concentraciones fisiológicas, y portadores sólidos, tales como talco o sacarosa. De preferencia, la vacuna contiene un adyuvante, tal como el adyuvante de Freund, complejo o incompleto, o pueden ser agregados inmunomodúladores tales como citocinas para mejorar la antigenicidad del antígeno si se desea. Más preferiblemente, el adyuvante es del tipo aceite mineral ya que se ha encontrado que son consistentemente superiores en la inducción de títulos de anticuerpo y respuesta de Hipersensibilidad de Tipo Retardada. Un adyuvante particularmente preferido es el vendido bajo la designación comercial de Montanide ISA-50 y disponible de Sepplc, París, France. Cuando se utilizan para administración vía tubos bronquiales, la vacuna es presentada adecuadamente en la forma de un aerosol. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un conjunto de diagnóstico que incluye un antígeno de diagnóstico contra un Micoplasma. de preferencia Mycoplasma hvopneumoniae. identificado y purificado como se describe anteriormente. Los antígenos de protección supuestos de acuerdo a la presente invención, pueden ser aislados e identificados utilizando los métodos generales descritos en la solicitud de Patente Australiana 49035/90, la descripción total de la cual se incorpora aquí para referencia.
Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para producir por lo menos un anticuerpo contra un Micoplasma. Este método incluye: proporcionar una muestra biológica tomada en un corto tiempo después de que un animal inmune ha sido expuesto con un Micoplasma o extracto de Micoplasma tomado del sitio de infección o un área de una lesión o un área cercana al sitio de infección o lesión; células aisladas a partir de la muestra biológica; células de cultivo in vitro en un medio de cultivo adecuado; y anticuerpos cosechados producidos de las células. El Micoplasma puede ser Mycoplasma hyopneumoniae. El animal puede ser un mamífero incluyendo humanos. El mamífero puede ser un animal doméstico tal como cerdo, oveja o cabra. La muestra biológica del animal puede ser de cualquier tipo adecuado. La muestra biológica puede ser tomada a partir de tejido, órganos, linfa o nodos de linfa animales. La muestra biológica puede ser tomada a partir del sitio de infección, los pulmones del animal, o un área de una lesión, la cual puede ser formada o un área cercana al sitio infectado o una lesión tal como lo nodos linfáticos que drenan de los pulmones. Sin embargo, no se utilizan las muestran de suero/plasma como muestras biológicas de acuerdo a este aspecto de la presente invención.
Se ha encontrado que la mayoría de los anticuerpos encontrados en las muestras de suero/plasma son irrelevantes para protección o diagnosis específica o un Micoplasma o no están relacionados al Micoplasma. Además, otros componentes del suero/plasma, pueden interferir con las reacciones específicas entre los componentes del patógeno y los anticuerpos a los mismos. En contraste, las sondas descritas en la presente invención son enriquecidas altamente en anticuerpos específicos a Micoplasma de importancia particular para inmunidad de protección. Se prefiere que las muestras biológicas sean tomadas de animales en un tiempo predeterminado en el desarrollo de la enfermedad. En general, para una infección con Micoplasma se encuentra que las muestras biológicas deben ser tomadas aproximadamente en los días 2 a 7 después de la exposición con, o después de la administración de los productos obtenidos a partir de un patógeno o con el patógeno por sí mismo. Las células aisladas a partir de la muestra biológica pueden incluir células B. De esta manera, las células preferidas son tomadas en un tiempo corto después de una estimulación in vivo, de preferencia dentro de aproximadamente 2 a 5 días después del mismo, resultando en la inducción in vivo del anticuerpo que forma células las cuales secretan anticuerpos específicos en el medio de cultivo después de la incubación in vitro. La secreción in vitro de anticuerpos en el medio de cultivo por la célula B recientemente activadas puede ser mejorada por la adición de factores auxiliares a los cultivos. Los factores auxiliares pueden ser citocinas utilizadas solas o en combinación, incluyendo interleucina 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8, factores de estimulación de colonias, interferones y cualquier otro factor que muestra tener un efecto mejorado en la secreción de las células B específicas. El método para producir un anticuerpo puede incluir una etapa adicional de activar las células aisladas para proliferar y secretar y/o liberar anticuerpos. La etapa de activación de células puede incluir agregar un agente activador de células al medio de cultivo. El agente activador de células puede ser seleccionado de mitógenos y factores auxiliares producidos por leucocitos o sus equivalentes sintéticos o combinaciones de los mismos. Los mitógenos pueden ser seleccionados del grupo que incluye productos derivados de fitolaca (Phytolacca americana) también conocido como mitógeno de fitolaca (PWM), polivinilpirrolidona (PVP), ácido poliadenílico-poliuridílico (poli(A-U)), derivado de proteína purificada (PPD), ácido poliinosínico-policitidílico (poli(l-C)), lipopolisacárido (LPS), organismos de estafilococos o productos de los mismos, el reactivo de la Bacto-estreptolicina O (SLO), fago lisado de estafilococo (SPL) el virus Epstein-Barr (EBV), mitógeno soluble al agua de Nocardia (NWEM), fotohemaglutinina (PHA), Concanavalina A (Con A), y dextrano-sulfato y sus mezclas. El agente de proliferación de células puede ser cualquier agente que provoca indirectamente o directamente la proliferación de células B y/o la secreción del anticuerpo tal como anti-inmunoglobulina de fase sólida. Los factores auxiliares pueden ser seleccionados del grupo que incluyen las citocinas incluyendo la interleucina 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8, factores de estimulación de colonias, interferones y cualquier otro factor auxiliar que muestre cuando se agrega solo o en combinación con otros factores y agentes, tener un efecto mejorado en la proliferación de la célula B específica y/o secreción del anticuerpo. De esta manera, esto no significa que sea una lista exhaustiva de mitógenos y agentes accionadores de células incluyendo factores auxiliares. El cultivo in vitro de las células puede ser llevado a cabo con o sin las etapas anteriores para separar subpoblaciones de células. La cosecha de anticuerpos puede ser llevada a cabo cosechando del sobrenadante a partir del medio de cultivo. Este sobrenadante contiene anticuerpos secretados por estas células durante el cultivo in vitro o liberados artificialmente a partir de las células B, por ejemplo, por lisis de las células B. Se ha encontrado que los sobrenadantes que contienen anticuerpos pueden ser utilizados directamente para antígenos detectores del Micoplasma. En un aspecto preferido de la presente invención se proporciona un método para identificar un antígeno asociado con un Micoplasma. preferiblemente Mycoplasma hyopneumoniae. Este método incluye proporcionar una muestra de un Micoplasma: y una sonda de anticuerpo que incluye por lo menos un anticuerpo contra un Micoplasma: sondear la muestra de Micoplasma con la sonda de anticuerpo para detectar por lo menos un antígeno; y aislar el antígeno detectado.
La muestra de Micoplasma puede ser mezclada con una solución reguladora estándar y colocada en un soporte estándar tal como un gel de SDS-poliacrilamida para separar las proteínas contenida en la misma (Figura 2). Alternativamente, las proteínas pueden ser seleccionadas utilizando el detergente no iónico Tritón X-114 (TX-114). El material insoluble puede ser eliminado por centrifugación. Las proteínas solubles en la fase TX-114 pueden ser precipitadas entonces de él (Figura 2). Las proteínas separadas pueden ser transferidas entonces a nitrocelulosa, nylon u otras láminas. El sondeo con un anticuerpo adecuado puede incluir además sujetar el producto producido por el mismo a un ensayo de detección. El ensayo de detección puede incluir las técnicas de Western blot. El ensayo de detección puede ser un ensayo de inmunoprecipitación, o un radioinmunoensayo, un inmunoensayo enlazado a enzima o ensayo inmunofluorescente (Figuras 3, 4, y 5). El anticuerpo producido como se describió anteriormente puede ser utilizado simplemente en la forma del sobrenadante cosechado a partir del medio de cultivo. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser separados y purificados. En un aspecto preferido adicional de la presente invención el anticuerpo contenido en el medio de cultivo puede ser utilizado para la purificación de afinidad, preferiblemente purificación de afinidad inmuno del antígeno.
Por consiguiente, en un aspecto preferido se proporciona un método para purificar el antígeno. Este método incluye: proporcionar una mezcla de antígeno sin purificar: y un anticuerpo contra un Micoplasma inmobilizado en un soporte adecuado; sujetar la mezcla de antígeno sin purificar para cromatografía de afinidad utilizando el anticuerpo inmobilizado; y aislar el antígeno purificado por tanto formado. El anticuerpo es producido por el método descrito anteriormente. El anticuerpo puede ser obtenido a partir de la sonda del sobrenadante del cultivo por métodos convencionales. Por ejemplo, los métodos usualmente utilizados para purificar inmunoglobulina a partir del suero o plasma, por ejemplo, pueden ser utilizados la precipitación con sulfato de amonio, fraccionación con ácido caprílico, cromatografía de intercambio iónico, o por enlace y elución a partir de la proteína G o proteína A inmobilizadas. Por tanto, los anticuerpos obtenidos pueden ser acoplados entonces a soportes adecuados, por ejemplo, Sepharose 4B (Pharmacia) activada-CNBr, gel-Affi (Bio-RAD), u otros soportes de cromatografía de afinidad que permiten enlazar proteínas. El anticuerpo inmobilizado puede ser aplicado entonces a la fraccionación y purificación del antígeno específico a partir de un extracto de Micoplasma complejo por cromatografía de afinidad. Después de enlazar el antígeno al anticuerpo inmobilizado, las especies macromoleculares no enlazadas pueden ser separadas por lavado a partir del soporte sólido con, por ejemplo, soluciones reguladores que contienen NaC1 1.5 M. Subsecuentemente, el antígeno puede ser eluido a partir de la columna de afinidad con por ejemplo, solución reguladora o soluciones reguladoras de pH alto o bajo que contienen iones caotrópicos, por ejemplo, tiocianató de sodio 0.5-3.0 M. La aplicación de la sonda del anticuerpo a la cromatografía de afinidad permite que cantidades suficientes de antígenos específicos sean aislados rápidamente a partir de una mezcla de extracción sin purificar compleja para caracterización bioquímica de secuenciación de aminoácidos y vacunación del animal para estudios de protección limitada. La aplicación de la cromatografía de afinidad para obtener los antígenos evita las dificultades encontradas con frecuencia cuando se aplican técnicas bioquímicas convencionales para la purificación de un antígeno, acerca del cual pocos datos o ninguno se conocen. Esto también obvia la necesidad para elevar los anticuerpos policlonales o monoclonales para el propósito de cromatografía de afinidad "analítica". La preparación a gran escala puede, sin embargo, requerir la preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales. Habiendo identificado la biología molecular de los antígenos, pueden ser utilizadas las técnicas químicas, por ejemplo, técnicas de clonación, para producir cantidades no limitadas de este antígeno, o alternativamente, pueden ser utilizados los péptidos sintéticos que corresponden a diferentes fragmentos de los antígenos identificados como el medio para producir una vacuna.
Por consiguiente, en un aspecto preferido de la presente invención se proporciona un método para preparar un polipéptido antigénico sintético contra el Micoplasma. de preferencia Mycoplasma hyopneumoniae, el método incluye: proporcionar una colección de información del ADNc o colección de información genómica derivada a partir de una muestra de Micoplasma: y una sonda del anticuerpo como se describe anteriormente; generar polipéptidos sintéticos a partir de la colección de información del ADNc o colección de información genómica; sondeando los polipéptidos sintéticos con la sonda del anticuerpo; y aislar el polipéptido antigénico sintético detectado por la misma. Pueden ser utilizadas las colecciones de información de ya sea
ADNc o genómico. Las colecciones de información de ADNc o genómico pueden estar acopladas en los vectores de expresión adecuados que permitirán la transcripción y la expresión subsecuente de la clona ADNc, ya sea en huéspedes procarióticos (por ejemplo, bacterias) o huéspedes eucarióticos (por ejemplo, células de mamífero). Las sondas pueden ser seleccionadas preferiblemente a partir de (i) sondas de oligonucleótido sintético basadas en la secuencia del aminoácido del antígeno identificado y purificado como se describe anteriormente;
(ii) anticuerpos obtenidos a partir del medio de cultivo producido como se describe anteriormente; (iii) anticuerpos monoclonales o policlonales producidos contra el antígeno identificado y purificado como se describe anteriormente; 5 (iv) anticuerpos recombinantes o monoclonales sintéticos o polipéptidos con especificidad para el antígeno, por ejemplo, como se describe por Ward et al., Nature. 241 , páginas 544-540 (1989). El polipéptido antigénico sintético producido de acuerdo con la invención puede ser una proteína de fusión que contiene el péptido i o antigénico sintético y otra proteína. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un fragmento de ADN que codifica un antígeno de protección supuesto contra Micoplasma o infecciones relacionadas, los fragmentos de ADN que tienen una secuencia de ácido nucleico de acuerdo a las Figuras 15 6a o 6b o una secuencia homologa y fragmentos funcionalmente activos de los mismos. En un aspecto preferido adicional de la presente invención se proporciona un clona que incluye un fragmento de ADN que codifica un antígeno de protección supuesto contra Micoplasma o infecciones 20 relacionadas, los fragmentos de ADN que tienen una secuencia del ácido nucleico de acuerdo a las Figuras 6a y 6b, o una secuencia homologa y fragmentos funcionalmente activos de los mismos. De preferencia, el clon es pC1-2. La presente invención será totalmente descrita ahora con 25 referencia a los Ejemplos y dibujos anexos. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción que sigue es únicamente ilustrativa y no debe ser tomada en la forma como una restricción en la generalidad de la invención descrita anteriormente. EN LAS FIGURAS FIGURA 1; Perfiles de gel de SDS-poliacrilamida (12.5%) de extractos de
SDS de especies de micoplasma, teñido como Coomassie R250. Banda 1 Estándares de Peso Molecular Pre-teñidos Banda 2 M. galtisepticum. Banda 3 M. synoviae. Banda 4 M. hyopneumoniae. Banda 5 M. hyorhinis. Banda 6 M. flocculare. FIGURA 2: perfiles de gel de SDS-poliacrilamida (12.5%) de extractos de cepas de M. hyopneumoniae en gel teñido con Coomassie R250. Banda 1 Estándares de Peso Molecular Pre-teñidos Banda 2 Extracto con Tritón X-114 de m. hyopneumoniae cepa de Beaufort Banda 3 Como para la banda 2 Banda 4 Extracto SDS de M. hyopneumoniae cepa de Beaufort Banda 5 Extracto SDS de M. hyopneumoniae cepa 10110. FIGURA 3: Western blots con antígenos extraídos con Tritón X-114 a partir de M. hyopneumoniae, cepa de Beaufort, sondeada con suero y sondas de anticuerpo del sobrenadante. Banda 1 Ningún control de anticuerpo, Banda 2 Control 1/200 de suero de cerdo de raza inferior Banda 3 Sobrenadante 105 de cerdo Banda 4 Sobrenadante 1 de cerdo Banda 5 Sobrenadante de cerdo de raza inferior FIGURA 4: Western blots de antígenos extraídos con SDS a partir de M. 5 hyopneumoniae, cepa de Beaufort sondeada con suero equilibrado y sondas de anticuerpo- lel sobrenadante. Fraccionación de antígenos en el gel de SDS poliacrilamida ( 2.5%). Banda 1 a) sobrenadante 453 de cerdo b) suero 1 /100453 de cerdo i o Banda 2 a) sobrenadante 105 de cerdo b) suero 1/100 105 de cerdo Banda 3 a) sobrenadante 1 de cerdo b) suero 1/100 1 de cerdo Banda 4 a) sobrenadante 15 de cerdo 15 b) suero 1 /100 15 de cerdo Banda 5 a) sobrenadante de cerdo de raza inferior b) suero 1/100 de cerdo de raza inferior Banda 6 Ningún control del anticuerpo. FIGURA 5: Western blot de antígenos extraídos con SDS a partir de M. 20 hyopneumoniae de cepa de Beaufort sondeada con suero apareante y sondas de anticuerpo del sobrenadante. Fraccionación de antígenos en el gel de SDS poliacrilamida (10.0%). Banda 1 a) sobrenadante 453 de cerdo, b) suero 1/100453 de cerdo 25 Banda 2 a) sobrenadante 105 de cerdo.
b) suero 1/100 105 de cerdo. Banda 3 a) sobrenadante 1 de cerdo. b) suero 1/100 1 de cerdo. Banda 4 a) sobrenadante 15 de cerdo. b) suero 1 /100 15 de cerdo. Banda 5 a) sobrenadante de cerdo de raza inferior. b) suero 1/100 de cerdo de raza inferior. Banda 6 Ningún control del anticuerpo. FIGURA 6: Secuencia total del gen 48 k. FIGURA 7: Secuencia de la proteína de 48 kDa de la secuencia del gen 48k. EJEMPLO 1 Medios para Mycoplasma hyopneumoniae Medios de Friss Hovind-hougen, K., Friss, N.F., Research in Veterinary Science, 1991 , 51 , pp. 155-163, "Estudios morfológicos y ultraestructurales de M. flocculare anda M. hyopneumoniae ¡n vitro". 250 mi de BSS de Hanks 140 mi de agua 1.5 g de Infusión Cerebro-Corazón 1.6 g de Caldo PPLO w/o CV Autoclave a 120°C durante 20 minutos 18 mi de Extracto de Levadura (100 g de YSC-2 Sigma en 750 mi) 3.7 mi de ADN al 0.2% y Na2CI3 0.1% 5.14 ml de NAD 1% 0.6 mi de rojo de fenol al 1% Ajustar a pH de 7.3 a 7.4 Filtrar a través de una membrana de 0.45 µm, 0.2 µm, almacenar a 4°C. Agregar suero estéril de caballo o de cerdo para 20% y antibióticos anterior a su uso Medios de Etherid e Etheridge, J.R., Cottew, G.S., Lloyd, L.C. Australian Veterinary Journal 1979, agosto 55, pp 356-359, "aislación de Mvcoplasma hyopneumoniae a partir de lesiones en cerdos infectados experimentalmente Materiales Para 600 mi BSS de Hanks 18.9 mi Caldo Digestivo de Harleys 1.28 g Caldo digestivo de Corazón 1.65 g Hidrólisato de lactalbúmina 2.21 g Glucosa 4.41 g Extracto de levadura autolisada 8.82 mi Suero de Cerdo (filtrado) 163 mi NAD al 1% 6.17 mi Rojo de fenol al 1% 1.32 mi ADN al 0.2% en Na2C030.1% 4.41 mi Llevar a 600 mi con agua MQ (aproximadamente 250-400 mi) Ajustar pH a 7.4 y filtrar a través de 3.0 µm, 0.8 µm, 0.45 µm, 0.2 µm, Almacenar a 4°C.
Desarrollos de Cerdos Inmunes Cerdos de baja calidad y puercos simples (Cerdo desapareado designado Dookie). Exponer en numerosas ocasiones, con cultivo crecido de M. hyopneumoniae y homogenado de pulmón . Periodo de exposición intranasalmente e intratraquealmente dado-a partir de septiembre de 1991 al 21 de enero de 1992. Antibiótico tiamulina dado el 31 de enero de 1992 al 4 de febrero, de 1992. Descansando durante aproximadamente 8 semanas. Exposición Infecciosa Se centrifugan 120 mi de cultivo congelado de M. hyopneumoniae de la cepa de Beaufort, (12,000 xg, 20 minutos) y resuspendido en 50 mi de medio completo y cultivado en la noche a 37°C. Este cultivo es centrifugado (12,000 xg, 20 minutos) y se resuspenden las células del Micoplasma en 10 mi del medio de cultivo para Micoplasma libre de suero. Se administran los 10 mi de micoplasma concentrado a cerdos inmunes anestesiados vía un catéter para asegurar que el inoculo sea colocado en la traquea. Tres de cuatro días posteriores a la exposición, son sacrificados los cerdos, y se toman los nodos linfáticos que drenan los pulmones-estos incluyen los nodos linfáticos izquierdo y derecho tráqueo bronquiales, y los nodos linfáticos ubicados en la bifurcación de la tráquea. Se preparan las sondas de anticuerpos de los nodos linfáticos de cerdo y se utilizan para detectar antígenos de protección como se describe en la Solicitud de la Patente Australiana 49035/90 mencionada en lo anterior. Se obtienen cultivos de células separadas obtenidas a partir de los nodos linfáticos individuales. Se cosechan los sobrenadantes del cultivo después de 5 días de cultivo. Preparación del Antígeno Se cultivo el Mycoplasma hyopneumoniae de la cepa de
Beaufort en el medio de Etheridge hasta que el pH ha disminuido entre 6.8 y 7.0. Se cosechan las células de M. hyopneumoniae a partir del cultivo por centrifugación a 12,000 xg durante 20 minutos, se lava 4 veces con ya sea PBS estéril o NaCI 0.25 M y entonces se extraen las células granuladas con uno de lo siguiente. (») Dodecilsulfato de sodio (SDS) Se resuspende el granulo de célula en SDS a 0.2% y se extrae durante 2 horas a 37°C. Se granula el material insoluble a partir del extracto a 12,000 xg durante 10 minutos, y el extracto soluble se corre en electroforesis por gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). (ii) Triton-X-114 Se utiliza el método de Bordier (J. Bio. Chem. 1981 , 256:1604-1608) para extraer selectivamente proteínas de la membrana utilizando el detergente no iónico Tritón X-114. Se resuspende el granulo de célula en PBS frío para 2 mg/ml de proteína y se agrega una solución precondensada fría de TX-114 para dar una concentración final de TX-114 (v/v) 1%. Se lleva a cabo la extracción por incubación durante la noche a 4°C con mezclado suave. Se elimina el material insoluble por centrifugación a 12,000 xg durante 20 minutos, durante 4°C. Las proteínas de la membrana soluble a Tritón X-114 son obtenidas entonces alcanzando una separación de fase a 37°C. Las proteínas solubles en la fase con TX-114 son precipitadas con etanol al 80% en presencia de un portador de dextrano (de peso molecular 80,000) durante la noche a -70°C. Se recolectan las proteínas por centrifugación a 12,000 xg durante 30 minutos y se disuelven a 500 µg/ml en urea a 4M. Identificación de Antígenos Se identifican seis antígenos utilizando la técnica mencionada anteriormente. Los antígenos identificados son aquellos que son identificados consistentemente por las sondas del anticuerpo a partir de cultivos inmunes y de cerdos de raza inferior. Los resultados se resumen la
Tabla 1. TABLA Peso Molecular Características 110-114 Extraído con SDS 90-94 Extraído con SDS 72-75 Extraído con Triton-X-114 60-64** Extraído con SDS. Divisiones a acuosas fase de extracción con Triton-X-114 52-54 Extraído con Tritón X-114 46-48 Extraído con Tritón X-114 ** Se identifican dos antígenos de peso molecular aproximado de 62 kD. Peso Molecular (kD) Secuencia de Aminoácido 46-48 48 K N-terminal; AGXGQTESGSTSDSKPQAETLKHKV 48 K CNBR F 1 : TIYKPDKVLGKVAVEVLRVLIAKKNKASR 48 K CNBR F 2: AEQAITKLKLEGFDTQ 48 K CNBR F 3: KNSQNKIIDLSPEG 52-54 52 K N-Terminal: AGXWAKETTKEEKS 52 K CNBR F 1 : AWVTADGTVN 52 K CNBR F 2: AIVTADGTVNDNKPNQWVRKY 60-64 62 K N-Terminal: MKLAKLIKGEX (N/I)(M/V)IK 60-64 62 K N-Terminal: ADP(F/I)(R/E)(V/A)PQG(Q/A)X(M/N)VG 72-75 74 K N-Terminal: AGXLQKNSLLEEVWYLAL 74 K CNBR F1 : AKNFDFAPSIQGYKKIAHEL 74 K CNBR F2: NLKPEQILQLLG 74 K CNBR F3: IIKAI-XNKXIFFINTXLDN CNBR - Fragmento de Bromuro de cianógeno X denota un aminoácido determinado (A/B) residuo puede ser A o B PCR del gen 48 kDa Los cebadores del oligonucleótico de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se designan a partir de las secuencias de aminoácidos obtenidos de péptidos derivados del bromuro de cianógeno
(CNBr) N-terminal e interno. Se sustituye la inosina (I) en las posiciones de alta redundancia. Los siguientes cebadores son utilizados en un ensayo de PCR estándar, corridos en un instrumento de Ciclación Térmica Máquina Robótica de Genes Bartelt. Oligo 48 K CNBr F 1 : ACIAACGACGAGAAGCCICAGGC T T A A A Oligo 48 K CNBr F 2: TTIAGCTTIGTGATIGCCTGCTC AT A T T
T Oligo 48 K CNBr F 3: AGGTCGATGATCTTCCAICC AA A A T T T T Se visualizan los productos resultantes de la PCR en un gel de agarosa en 1.5%, suprimidos, y purificados utilizando el Prep-A-Gene (BioRad). Son clonados por técnicas estándar en un vector T con cola de didesoxi (Holton and Graham Nucleic Acids Research 19: 1158, 1991) y se determina la secuencia del ácido nucleico. El producto de la PCR, obtenido a partir de la reacción utilizando los cebadores F1 y F2 mostrados anteriormente, tiene aproximadamente 810 pares bases y se muestra secuenciando para codificar para la secuencia del aminoácido determinado previamente de la proteína nativa purificada de 46-48 kDa. Aislación del Clon Genómico en el gen de 48 k Se aislan y secuencian el gen total 48k y la proteína de 48 kDa
(Figuras 6 y 7). Se obtiene el gen a partir de la colección de información genómica de M. hyopneumoniae construida digiriendo el ADN genómico con la enzima de restricción CLA I y ligando los fragmentos en el vector pBluescript (Stratagene). El producto ligado es entonces electroforado en Escherichia coli e la cepa SURE (Stratagene) y las células colocadas en las placas de agar de caldo de Luria contienen 100 µg/ml de ampicilina (LB-Amp). La colección de información es apantallada por la hibridación del ADN con un producto específico de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por la proteína de 48 kDa. Las clonas positivas crecen en LB-Amp, las células son cosechadas y se aisla el ADN y es secuenciado parcialmente para confirmación. El clon positivo pC1-2 es secuenciado totalmente y se deduce la secuencia de la proteína. Se compara ésta a la secuencia de la proteína obtenida a partir del término N y los fragmentos de Bromuro de cianógeno de la proteína de 48 kDa para mostrar que el gen codifica la proteína deseada. Selección del Adyuvante Son inmunizados cerdos jóvenes, de 5-7 semanas de edad, con antígenos identificados. Los antígenos incluyen proteínas identificadas y extraídas con Tritón X-114 de 46-48, 52-53, 60-64, 70-75, 90-94 y 110-114 kD, ya sea individualmente o en combinación. Se da una dosis de inmunización del antígeno que contiene entre 5-100 µm de proteína, por inyección intramuscular en combinación con un adyuvante. El adyuvante seleccionado a partir de (i) Seppic Montanide ISA-50 (ii) Quitl A y otros derivados de saponina. (¡ii) emulsión de aceite en agua que emplea un aceite mineral tal como Bayol F/Arlacel A, (iv) emulsión de aceite en agua que emplea un aceite vegetal tal como el aceite de maíz. aceite de cártamo u otro con lecitina como emulsificador, (v) gel de hidróxido de aluminio, y (vi) polímero de bloque no iónico tal como Pluronic F-127 producido por BASF (U.S.A.). Las dosis de inmunización se dan a intervalos de 2-4 semanas, el número de dosis depende del adyuvante y la cantidad de antígeno, pero se dan preferiblemente 2 a 3 dosis. Los adyuvantes son tratados en la base de que permiten inducir títulos de anticuerpos, como se mide por ELISA, y por valoración de la inmunidad mediada por células inducidas como se prueba por la reacción de Hipersensibilidad Tipo Retardada (DTH). Los resultados muestran claramente que los adyuvantes de tipo aceite mineral son consistentemente superiores en la inducción de títulos de anticuerpo y respuestas DTH (Tabla 2). En particular, se ha encontrado que es adecuado un adyuvante vendido comercialmente bajo la designación de Montanide ISA-50 y disponible de Seppic, París, France. TABLA 2 GRUPO Número del Respuesta Respuesta Niveles de Antianimal a DTH a a DTH a cuerpo (450 nm) 24 hrs. 48 hrs.
19 0 0 0.061 11 0 0 0.010 CONTROL 1 - - 0.005 (no vacunados) 15 0 0 0.038 7 0 0 0.005
18 + 0 0.753 QUII A 25 + 0 0.788 17 0 0 0.638 168 - ± 0.642
169 +++ 0 0.316 22 0 0 0.621 ACEITE 4 + 0 0.666 VEGETAL 6 + + 0.239 13 +++ ++ 0.457
14 +++ ++ 1.086 5 +++ ++ 1.024 ACEITE 23 +++ + 0.664 MINERAL 16 +++ 0 0.975 21 + ± 0.954
TABLA 2: Niveles del anticuerpo y respuestas a la DTH en cerdos, medidos a las 2 semanas después de la tercera inyección de antígeno a partir e M. hyopneumoniae (. = ninguna respuesta; ± = enrojecimiento atenuado; + « enrojecimiento atenuado e hinchazón; ++ = enrojecimiento; +++ « hinchazón con o sin enrojecimiento). Prueba Aislada de Protección Se inmunizan grupos de 9 cerdos jóvenes, de 6 semanas de edad, con antígenos purificados y semipurificados como se muestra en la
Tabla 3 a continuación. Se purifican los antígenos en CLAP de fase inversa, utilizando un sistema de solvente de ácido fórmico con un gradiente de acetonitrilo. Se resolubilizan los antígenos en urea al 4 Molar antes de incorporar en el adyuvante de aceite mineral. El horario de la inmunización es como se muestra en la Tabla 2. TABLA 3 Protocolo para Ensayo Aislado de Antígenos de Mycoplasma Hyopneumoniae VACUNACIÓN Y SANGRADOS Tratamiento Número de Días 1a. vacunación 0 2a. vacunación 14 3a. vacunación 50 Exposición infecciosa 64 Matanza 91 DOSIS DEL ANTIGENO Parcialmente purificado 1a. y 2as. vacunaciones, DOSIS DE 50 µg DE ANTIGENO COMPLEJO 62 kD 3a. vacunación-220 µg DE ANTIGENO PURIFICADO PARCIALMENTE/DOSIS (Purificado)74+52kD 1a. vacunación 20 µg de proteína total/DOSIS 2a. vacunación 13 µg de proteína total/DOSIS 3a. vacunación 17 µg de proteína total/DOSIS (Purificado)48kD 1 a. vacunación 20 µg/DOSIS 2a. vacunación 18 µg/DOSIS 3a. vacunación 27 µg/DOSIS ESTIMACIONES DE TODAS LAS PROTEÍNAS HECHAS POR EL ENSAYO DE PROTEINA "BCA" (Pierce, Illinois, U.S.A.). La protección de la infección con Mycoplasma hyopneumoniae se prueba por exposición infecciosa 2 semanas después de la inmunización final. La exposición infecciosa se alcanza por administración intranasal de 10 mi de un homogenado de pulmón al 10% (p/v), preparado a partir de un pulmón infectado y alojando cerdos de prueba con cerdos infectados previamente. Cuatro semanas después de la exposición infecciosa, son sacrificados los animales y se evalúa el grado y extensión de lesiones pulmonares (Tabla 4).
TABLA 4 Prueba Aislada de Antíaenos de Mycoplasma Hvopneumoniae No. de Grupo No. de Pneumonía Clasificación % de Reducción Libre (%) de Lesión Pul- (a partir del monar Promedio promedio)
Controles 1(11) 13 0% 62 kD 0(0) 5 61% 74+52 kD 3(33) 6.75 48% 48 kD 2(22) 6.25 52% REFERENCIA Warren H.S. and Chedid, L.A., Future Prospects for Vaccine Adjuvants CRC
Critical Reviews in Immunology 8: 83-108, 1988. Finalmente, se entiende que pueden realizarse varias otras modificaciones y/o alteraciones sin alejarse del espíritu de la presente invención, como se indica en la presente.
Claims (43)
- REIVINDICACIONES 1. Se prepara un antígeno de protección supuesto contra un Micoplasma, por un método caracterizado porque incluye: proporcionar una muestra de un Micoplasma; una sonda de anticuerpo que incluye por lo menos un anticuerpo contra un Micoplasma producido por un método que incluye: proporcionar una muestra biológica tomada en un tiempo corto después de que un animal inmune ha sido expuesto con un Micoplasma o extracto de Micoplasma extraído a partir del sitio de infección o un área de una lesión o un área cercana al sitio infección o lesión; aislar células a partir de la muestra biológica; cultivar células in vitro en un medio de cultivo adecuado; y cosechar los anticuerpos producidos de las células; sondear la muestra del Micoplasma con la sonda del anticuerpo para detectar por lo menos un antígeno; y aislar el antígeno detectado.
- 2. El antígeno de protección supuesta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el Micoplasma es Micoplasma hyopneumoniae.
- 3. Un antígeno de protección supuesto contra Mvcoplasma hyopneumoniae, o infecciones relacionadas, caracterizado porque se selecciona del grupo de antígenos que tienen pesos moleculares de aproximadamente 110-114, 90-94, 72-75, 60-64, 52-54 y 46-48 kilodaltons (kD), como se describe aquí, derivados, mutantes y fragmentos de los mismos.
- 4. El antígeno de protección supuesto de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque es una proteína de superficie.
- 5. El antígeno de protección supuesto, de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque es una lipoproteína de superficie o proteína de membrana.
- 6. El antígeno de protección supuesto, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, caracterizado porque tiene un peso molecular aproximado de 110-114, 90-94, 74, 62, 52 y 48 kD.
- 7. El antígeno de protección supuesto de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antígeno en la región de 72-75 kD contiene la siguiente secuencia de aminoácido N-terminal: AGXLQKNSLLEEVWYLAL
- 8. El antígeno de protección supuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además incluye una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos N-terminales: AKNFDFAPSIQGYKKIAHEL NLKPEQILQIIG LLKAEXNKXIEEINTXLDN
- 9. El antígeno de protección supuesto, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antígeno en la región de 60-64 kD contiene la siguiente secuencia de aminoácido N-terminal. MKLAKLLKGFX(N/L)(M/V)IL ADP(F/I)(R/E)Y(V/A)PQG(Q/A)X(M/N)VG
- 10. El antígeno de protección supuesto, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antígeno en la región 52-54 kD contiene la siguiente secuencia del aminoácido N-terminal: AGXWAKETTKEEKS
- 11. El antígeno de protección supuesto, de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque además incluye una o más de las siguientes secuencias amino N-terminales: AWVTADGTVN AIVTADGTVNDNKPNQWVRKY.
- 12. El antígeno de protección supuesto de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antígeno en la región de 46-48 kD contiene la siguiente secuencia de aminoácido N-terminal. AGXGQTESGSTSDSKPQAFTLKHKV
- 3. El antígeno de protección supuesto de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque además incluye una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos internos: IIYKPDKVLGKVAVEVLRVLIAKKNKASR AEQAITKIKIEGFDTQ KNSQNKIIDLSPEG
- 14. Un fragmento de ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica un antígeno de protección supuesto contra Mvcoplasma hyopneumoniae o infecciones relacionadas, el fragmento del ácido nucleico que incluye la siguiente secuencia, mutantes, derivados, recombinantes y fragmentos del mismo. 10 20 .?a 40 50 123 56789G 1234GG7B90 123 567T90 I234567T90 l2J4fj67BB0 ATGAAAAAAA GGCCAG.TATA CCAGAGGAAA GAGCAGTATA TA??ATAATT SO A???TTACAT TTTCTTCATT TGCGCCAGAA T?TAAGAA 11 AGTACATT 1D0 AAAAAGTAGA ACAAAAGTTA TTAATGT??? C?TTACCCCA ATCCTTA?GA 150 AAAAATTAAA AGTTTTATCT AGGT? MÍA ATCGAAATCC AAC AGG?AT 200 AAATCTTTGT CAGT?TTTAT CAAGTCGOTA TTTTTTCATT ATTTCTACTA 250 AAATATTATG IÜAATTGGCA TTTGC?AT?A TCTAAAATTT TACAT?TGT 300 T?T??CAATT "TGAAAAATT ACTCTTGAAT TTATAGTATT 1 I I I IAITTT 350 I I AGTCTAAA TTATAAAATT ATCTTGAATT TTATTTGMT TTTTATAATT 400 TAGTACTAAA AAATACAAAT ATTI I I I U I ATTCTAAGAA AAATTCATTT 450 TTAAAA AA ATTGATTTTT ? ?GT?TAAT TTCTTTGTAT AATTGAATTA 500 ACTTGATTTG AAAGGGAACA AAATGAAAAA A'pCTTA AAAAAATTCT 550 TGTATTCATC ?CSTATTTAT GCAACTTCGC TTGCATCAAT TATTGCATTT 6ÜÜ GTTGÜAÜCAG GTrGTr.RAfíA ?ACAGAATCA GGTTCAACTr CTGATTC A? 660 ACC?C?ACCC GATACGCTAA AACATAAAGT AAGT?ATGAT TCTATTCGAA 700 TAGCACTAA CGATCCGOAT ATCCTCOAT GAATT?GTGC CCAAAAAGAT 710 ATTATTTCTT ATG7TGATGA AACAGAGGCA GCAAÜ I I CAÁ CAATTACAAA 800 AAACCAGGAT GCACAA??T? ?CTCACTCAC TCAGCAAGCT AATTTAAGCC ß50 CAGCG CAAA AGG I | .Al f AtTGccpr. G AAAATGGAAG TGGAGTTGGA 000 ACTGCTGTT? ATACAATTGC TGATAAAGGA ATTCCGATT3 TTGCCTATGA 950 TGGAC . AA M AC'Í CTG ATAAATATGA TTGGTATGTT TCI'l 1 IG?T? 1000 ATGAAAAAG1 TGGTGAATTA CAAGGTCTTT CACTTGCTGC GGGTC'IAI IA 1050 GGAAAAGAA AT3GTGCTTT TGATTC??TT G?TC? v?TG? ?TC??TATCT 1100 AAAATCACAT ATGCCCCAA AG?CAATTTC TGGGI?IA "A IL'ÜÜGGGTl 1150 GGCAAGATGA 7AATAATTCC C??T?TT? r ?TAATCCTCC AATGAAAGTA 1200 CTTAAAGAAT TAATGAAAAA I iCGÜAAAAT AAAATAATTG ATTTATCTCC 15 S TGAAGGCGA ??TGCTCTTT A^GTCCCAGG ATGAAATTAT GGAACTGCCG 1300 GTCAAAGAAT GCAAÍCI ! i ! CTAACAATTA ACAAAGATCC AGGAG?TGG" I35D AAT????TC? AA.G TGTTGG TTCAAAACCA GCTT'CTATTT TC?AAG3ATT 1A03 TCTI CCCCA AATGATGGAA TGG?GGAACA A .AATCACC AAATTAAAAC 1153 TTGAAGGGTT 3ATA CCAA AAAATCTTTG TAACTCGTCA AGATTA'I A; 150D *_ATAAAGG A AAAC'T AT C?AAGACGGC ATCAAAATA TGACA?TTT? 1550 T??ACCTGAT A?AGTTpAG GA???GTOC 7G17GAAGTT CTTCGGGTJ ¡ 150." TAATTGCAAA GAAAAATAAA GCATCTAGAT CAGAAGTCG? AAACGAACTA 1050 AAAGCAAAAC TACCAA?T?T TTCATTTAAA TATGAIAAIC; A?ACATATAA 1700 AGTACAAGGT AAAAATA1T? ?TACAATTTT ACTAAGTCCA GTAATTGTTA 1750 CAAAAGCTAA. 'T&TIÜAIAAÍ CCTGATGCCT AA 1782
- 15. El fragmento del ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque codifica un antígeno de protección caracterizado porque el.antígeno está en la región de 46-48 kD que incluye la siguiente secuencia del ácido nucleico, mutantes, derivadas, recombinantes y fragmentos del mismo. 10 20 30 40 50 1234567890 1234567690 1234567590 1234557BS0 1234567ßyü A?6AAAAAAA TRCCACTATA CCAGAGGAAA GAGCAGTATA TAAA?T? TT 50 AAAA TACAT TTTCTTCAT7' TGCGCCAGAA VG?TAAGAA T?AÜÜACAGT 100 AAAAAGTAGA ACAAAAGT? TTAATGT??? C?TTAOCCCA ATCCTT?AGA 150 AAAAATTAAA AGTTTTATCT A I I M 1 I I 1 A AÍCGAAATCC AACCARR^AT 200 AAATCTGTGT C?CTATGTAT CAAGTCGGTA TTG?CATT ATTTCTACTA 25Ü AAATATTAI I TGAATGTGCA TG?CCATAA T?TAAAATTT TACATTTI I I 300 T?TAACAATT TTTAAAAATT ACTCTTTAAT TTATAGTATT TTTTTATT"! I 350 TTAGTCTAAA TTATAAAA^T ATCTTGAATT TTATTTGAAT iTTTAT??TT 430 TAGTACTAAA AA?TACAAAT Al ! 1 I GTCCT A, I IAAGAA AAATTCATTT 45 n TTTAAA?.AAA AttGA'ttrrr ATAGT?T??T TTGTTTGtAT AATTG?ATTA 500 AC7TGA I MG AAAUGGAACA AAATGAAAAA AATGCTTAGA AAAAAATT'C F 550 TGTATTCATC ?GCTATTTAT CCAACTTCGC "T GCATCAAT TATTG CATTT 600 GTI CAGCAG GT^GTRGACA GACARAATCA GG-?"CAACTG CTGATTCTAA. G50 CCACAAGCC GAGACGC7AA AACATAAA3T AAGTAATGAG TCTATTCGAA 70 TAGCA TAAC CG TCCGGAT AATCCTCGAT GAATTAGTGC CC??AAACAT 750 ATTATTTC"rT ATGTTGATGA ?ACAGAGGC? GüAA 1 1 CAÁ CAATTACAAA 900 AAACCAGGA1- GC?CA?A?IA ?C'TCA GC?C TCAGCAAGC"*" AATTTAAGCC 85C CAGCGCCAA? AGGA71 GATT ATTGcr.cr.T AAAATGGAAG TGQAGTTGGA soo ?CTGCTCTTA ATAC??TTGC TGATA?AGGA ATTCCG?TTG TTGCCTATGA ÜSU ICGACTAATT ' ACTGG?T TG ATAAAIATGA TTGGTATG7T TCTTTTG?TA •¡ooa AT3AAAAAGT TGG GG?ATTA CAAGGTCTTT CACTTGC GGC GG I I ATTA -050 GGAAAAGAAG ATGGTGC 11 i TG?TTC??TT C?TCAAATCA ATGAATATCT 1100 AAAATCACAT ATGCU LAAÜ AÜACAA t T 1 C TI TTT ATACA ATCGCG TT 1150 CCCAAGATG? TAATAATTCC CA?T A m i l ATAATGGTGC AATGAAAGTA 12D0 CTTAAAUAA7 TAATGAAAAA TTCGCAAAAT PAAATAATTG ATTTATCTCC 1250 TCAAGGCGAA AAGGCTGTGT ATGGCCCAGG ATGAAAIT T GGA?&TGCCG iju? GTCAAAGAAT r. ?ATrTTTT C7AACAATTA ACAAAGATCC AGCAGGTGG7 13=0 AATAAAATCA ?GGTG TGG TTCA ACC GcrtcTAT~r I AAAGGATT 1400 TCTTGCCCCA .«A'GATGGAA TG3CCGAACA GCAATC?CC ???TT?AAAC 1450 TTGAAGGGTT "1 i ACCCAA AAAA 1 1 I I FAA 1CGTCA GATTATAAT ison GATAAAGCC 'VV.CTTTT?T C???CACCCC CATC AA.ATA TGACAA T A 1550 1 AAACülüAT AAAGHTTAG GAAAAGTTGC TGTTGAAGT7 CTT?GGGTTT 1600 T??TTGC?AA AAAAATAAA GCA7CTAGAT CAGAAGTC 5A AAACGAACTA 1550 AAAGCAAAAC TACr.?AATAT T1 ATT1 AAA TATGATAAT.? A^ACATATAA 1700 AGTACAAGGT ??AAATAT ATACAATTT A3TAAGTCCA GTA .TTGT A "> í$r AAAAGG.TAA TGTTG?TAAT CGTGATGCC^ "732
- 16. Un método para producir un anticuerpo contra un Micoplasma. caracterizado porque incluye proporcionar una muestra biológica tomada en un corto tiempo después de que un animal inmune ha estado expuesto con un Micoplasma o 0 extracto de Micoplasma tomado a partir del sitio de infección o un área de una infección o un área cercana al sitio de infección o lesión, aislar células de la muestra biológica; cultivar las células in vitro en un medio de cultivo adecuado; y cosechar los anticuerpos producidos a partir de las células.
- 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la muestra biológica es tomada en un tiempo predeterminado después de que el animal ha estado expuesto con un Micoplasma, de preferencia 2 a 7 días después de la exposición.
- 18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el cultivo de las células in vitro incluye adicionalmente la adición de factores auxiliares al cultivo, los factores auxiliares seleccionados del grupo que incluyen citocinas utilizadas solas o en combinación, incluyendo interleucina 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8, factores de estimulación de colonia, interferones y cualquier otro factor que muestre tener un efecto mejorado en la secreción de las células B específicas.
- 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-18, caracterizado además porque incluye una etapa de activación celular que incluye activar las células aisladas para proliferar y secretar y/o liberar anticuerpos, la etapa de activación celular que incluye agregar un agente de activación celular al medio de cultivo, el agente de activación celular seleccionado del grupo que incluye mitógenos como se describen aquí y factores auxiliares producidos por leucocitos, o sus equivalentes sintéticos o combinaciones de los mismos.
- 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-19, caracterizado porque el anticuerpo está en la forma del sobrenadante cosechado a partir del medio de cultivo.
- 21. El anticuerpo contra un Micoplasma preparado de conformidad con el método de cualquiera de las reivindicaciones 16-20.
- 22. Un método para identificar un antígeno de protección supuesto, asociado con el Micoplasma. de preferencia Mycoplasma hyopneumoniae. el método está caracterizado porque incluye: proporcionar una muestra de un Micoplasma; y una sonda del anticuerpo que incluye por lo menos un anticuerpo contra un Micoplasma: sondear la muestra de Micoplasma con la sonda del anticuerpo para detectar por lo menos un antígeno; y aislar el antígeno detectado.
- 23. Un método para purificar un antígeno de protección supuesto, asociado con un Micoplasma. de preferencia Mvcoplasma hyopneumoniae. el método está caracterizado porque incluye proporcionar: una mezcla de antígeno sin purificar; y un anticuerpo contra un Micoplasma inmobilizado en un soporte adecuado; sujetar la mezcla del antígeno sin purificar a cromatografía de afinidad utilizando el anticuerpo inmobilizado; y aislar el antígeno purificado por tanto formado.
- 24. Un método para preparar un polipéptido antigénico sintético contra Micoplasma. de preferencia Mycoplasma hyopneumoniae. el método está caracterizado porque incluye proporcionar una colección de información de ADNc o colección de información genómica derivada de una muestra de Micoplasma: y una sonda del anticuerpo que incluye un anticuerpo preparado de conformidad con la reivindicación 16; generar polipéptidos sintéticos a partir de la información recolectada del ADNc o recolección de la información genómica; sondear los polipéptidos sintéticos con la sonda del anticuerpo; y aislar el polipéptido antigénico sintético detectado por la misma.
- 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la sonda del anticuerpo incluye un anticuerpo i incrementado contra un antígeno contra Mycoplasma hyopneumoniae. o infecciones relacionadas, seleccionado del grupo de antígenos que tiene pesos moleculares aproximados de 110-114, 90-94, 72-75, 60-64, 52-54 y 46-48 kilodaltons (kD), como se describe aquí, mutantes, derivados y fragmentos del mismo.
- 26. Un antígeno de protección sintético supuesto, en la región de 72-75 kD producido por un método de conformidad con las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácido N-terminal: AGXLQKNSLLEEVWYLAL
- 27. El antígeno de protección sintético supuesto, de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque además incluye secuencias de aminoácido interno: AKNFDPAPSIQGYKKIAHEL NLKPEQILQIIG LLKAEXNKXIEEINTXLDN
- 28. El antíg no de protección sintético supuesto, en la región de 60-64 kD, producido por un método de conformidad con las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácido N-terminal: MKLAKLLKGFX(N/L)(M/V)IK ADP(P/l)(R/E)Y(V/A)POG(Q/A)X(M/N)VG
- 29. El antígeno de protección sintético supuesto, en I a región de 52-54 kD producido por un método de conformidad con las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácido n-terminal; AGXWAKETTKEEKS
- 30. El antígeno de protección sintético supuesto, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque además incluye las secuencias de aminoácido interno: AWVTADGTVN AIVTADGTVNDNKPNQWVRKY.
- 31. El antígeno de protección sintético supuesto, en la región de 46-48 kD producido por un método de conformidad con las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácido N-terminal: AGXGQTFSGSTSDSKPQAETLKHKV
- 32. El antígeno de protección sintético supuesto, de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque incluye secuencias de aminoácido interno: TIYKPDKVLGKVAVEVLRVLIAKKNKASR AEQAITKLKLEGFDTQ KNSONKIIDISPEG
- 33. Una vacuna o composición veterinaria, caracterizada porque incluye una cantidad profilácticamente efectiva de por lo menos un antígeno de protección contra un Micoplasma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
- 34. La vacuna o composición veterinaria de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque incluye una pluralidad de antígenos de protección seleccionados de antígenos que tienen pesos moleculares aproximados de 110-114, 90-94, 72-75, 60-64, 52-54 y 46-48 kilodaltons.
- 35. Una vacuna o composición veterinaria, caracterizada porque incluye un anticuerpo contra un Micoplasma de conformidad con la reivindicación 21.
- 36. Un conjunto de diagnóstico caracterizado porque incluye un antígeno de diagnóstico o fragmento del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y 26-32.
- 37. Un método para prevenir o tratar una infección por Micoplasma, el método está caracterizado porque incluye administrar a un animal una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de por lo menos un antígeno de protección de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
- 38. Un fragmento de ADN aislado que codifica un antígeno de protección contra Micoplasma o infecciones relacionadas, el fragmento de ADN se caracteriza porque tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la Figura 6 o una secuencia homologa, y fragmentos funcionalmente activos, mutantes, variantes o recombinantes del mismo.
- 39. Una clona, caracterizada porque incluye un fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 26.
- 40. La clona de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque es una clona pC1-2, como se describe anteriormente.
- 41. Una secuencia de aminoácido o equivalente funcional del mismo, caracterizada porque está codificada por el fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 38.
- 42. La secuencia de aminoácido o equivalente funcional de la misma, caracterizada porque tiene la secuencia del aminoácido de la Figura 7.
- 43. Un antígeno de protección o anticuerpo sustancialmente como se describe aquí con referencia a los ejemplos.
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| AUPN1789A AUPN178995A0 (en) | 1995-03-16 | 1995-03-16 | Antigen composition |
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