MXPA97006959A - Control de la induccion floral en plantas, y suutilizacion del mismo - Google Patents

Abstract

Se describe el gen Id que controla la evocación de la flor en las plantas de maíz. Elácido nucleico del maíz es similar a los genes que codifican las proteínas reguladoras de dedo de zinc en los animales. También se revelan métodos de aislamiento o preparación de otros genes de la proteína reguladora en las plantas, y sus usos.

Description

Control de la inducción floral en plantas y utilización del mismo Antecedentes de la invención Las plantas superiores tienen un ciclo de vida que consiste en un periodo de crecimiento vegetativo seguido de un desarrollo reproductor. La reproducción en angiospermas consiste en un proceso de desarrollo que comienza con la inducción floral (evocación) . Es el momento en el cual el meristema apical del brote, el conjunto de células en división que dan lugar a la mayoría de las partes de la planta por encima de las raices, deja de crear hojas y comienza a crear flores. Bernier, G. (1988) The control of floral evocation and morphogenesis . Ann.

Rev. Plant. Physiol. Plant iMolec. Biol. 39:175-219. Sin embargo, no se conoce prácticamente nada sobre los controles moleculares y genéticos que inducen la floración de una planta. Existe gran necesidad de mayor información sobre los elementos de regulación de las plantas. Un mayor conocimiento de estos elementos mejorarla de modo significativo la comprensión del mecanismo subyacente mediante el cual los genes inducen el desarrollo reproductor de las plantas. Compendio de la invención La presente invención identifica y proporciona ADN aislado que incluye un gen Id de una planta de maiz, o una porción de la misma, que presenta la función del gen Id. La invención proporciona además ARN codificado por el ADN de los alelos Id o id* y porciones de los mismos, y ADN antisentido (complementario) y/o ARN o porciones del mismo. Los ácidos nucleicos, denominados homólogos o equivalentes de Id, que a) presentan más de un 50% de homología o que hibridan en condiciones de severidad moderada a la región del dedo de zinc del gen Id o b) presenta un 70% o más de homología o que hibridan en condiciones de severidad moderada al gen Id y presentan la función de tipo Id (iniciación de la fase de reproducción) , entran también dentro del marco de la presente invención. Se incluyen también las sondas de ácido nucleico y los cebadores para detectar y/o ampliar genes reguladores en otras plantas. Por lo tanto, el ADN de la presente invención incluye un gen Id, o una porción del mismo, incluyendo el gen Id toda o parte de la SEQ ID N0:1, o ADN homólogo. La presente invención incluye además polipéptidos que son proteínas Id o porciones de una proteina Id de origen vegetal, incluyendo los polipéptidos que se describen aqui. Las proteínas Id de todas las especies vegetales u homólogos que presentan una función reguladora similar (inducción reproductora) entran dentro del marco de la presente invención y el término proteina Id tal como se utiliza aqui. Las secuencias de aminoácido que presentan un 80% o más de homología con respecto a las secuencias de aminoácido que se describen aqui se consideran polipéptidos homólogos. En otro aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a los polipéptidos aqui descritos. Dichos anticuerpos se pueden utilizar para localizar sedes de actividad reguladora de las plantas. Las proteínas de fusión que incluyen la proteina Id y un péptido adicional, como por ejemplo una proteina tag, también se pueden utilizar para detectar sedes de interacción proteina Id/proteina en las plantas. En otro aspecto más, la presente invención proporciona métodos para producir plantas con momentos de transición seleccionados desde el estadio vegetativo al de floración. Los autores de la solicitud han creado un nuevo alelo del gen id, id*, que, cuando está presente un elemento Ac activo que se puede transponer, hace que las plantas detengan el crecimiento vegetativo y florezcan antes que otros mutantes id. Tal como se demuestra aqui, las plantas id*/id* con un elemento Ac activo presentan menos nodulos vegetativos y florecen antes que las plantas id*/id* sin un elemento Ac o plantas que codifican el alelo id. La presente invención se refiere a un nuevo mutante del gen id que codifica un producto que altera la inducción de la flor en plantas y proporciona una secuencia de nucleótido de parte del fragmento Sacl de 4.2 kb de Id derivado de cromosoma 1 de maiz. También se incluye ADN que hibrida en condiciones altamente severas al fragmento Sacl o una porción del mismo y un ARN transcrito a partir de los ADN mencionados o que corresponde a cualquiera de los ADN mencionados. Preferiblemente el ADN es el que se muestra en la figura 4 . (SEQ ID No: 3) . En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir nuevos alelos de Id y métodos para detectar otros alelos de Id u otros genes reguladores de las plantas. Los homólogos del gen Id se pueden identificar dentro de todo el reino vegetal, incluyendo las algas multicelulares y unicelulares. En otro aspecto más de la presente invención se proporcionan plantas, semillas, cultivos de tejidos vegetales y partes de la planta que contienen ADN que incluyen un alelo Id introducido exógenamente o alterado o porción de un alelo Id que altera el momento de inducción de la flor en el crecimiento posterior de la planta, semillas, cultivos de tejido vegetal y/o parte de la planta. La presente invención se refiere también a plantas transgénicas en las que se altera el momento de la evocación floral. Se proporcionan plantas transgénicas en las que el periodo comprendido entre la germinación y el florecimiento es más corto que el de las plantas de tipo silvestre (nativas) naturales correspondientes. Alternativamente, se proporcionan plantas en las que se retrasa o se elimina el florecimiento. Tal como se utiliza aqui, el término plantas transgénicas incluye plantas que contienen tanto ADN como ARN que no se produce naturalmente en las plantas de tipo silvestre (nativas) o en variantes conocidas, o copias adicionales o invertidas de ADN natural y que se introduce tal como se describe aqui, y cualquiera de las alteraciones que se han descrito que tienen como resultado plantas con momentos de evocación floral alterados. Dichas plantas transgénicas incluyen, en un modo de realización, plantas transgénicas que son angiospermas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Entre las plantas transgénicas se incluyen aquellas en las que se ha introducido ADN y su progenie, producida a partir de la semilla, propagación vegetativa, cultivo celular, de tejido o protoplasma o similares. Las plantas transgénicas de la presente invención contienen ADN que codifica toda una proteina, o parte de ella, esencial para la evocación floral y, cuando está presente en las células vegetales, tiene como resultado una evocación floral alterada, tanto por una detención más temprana del crecimiento vegetativo e iniciación del florecimiento que en las plantas no transformadas de la misma variedad, como por una floración tardía o la ausencia de inducción floral. El ADN puede ser ADN exógeno en una orientación de sentido o antisentido que codifica una proteina necesaria para la inducción floral o ADN exógeno que ha sido alterado de manera que codifica una forma alterada de una proteina necesaria para inducción floral. La mutagénesis dirigida o insertada dirigidamente de un ADN endógeno de la planta responsable de la iniciación del florecimiento puede tener como resultado también la alteración de la inducción floral. El ADN exógeno que codifica una proteina alterada necesaria para la evocación floral y el ADN endógeno necesario para la evocación floral que ha sido mutado por mutagénesis dirigida se diferencia del ADN de tipo silvestre (natural) correspondiente en que estas secuencias contienen una sustitución, eliminación o adición de al menos un nucleótido y codifican proteínas que se diferencian de la proteina de tipo silvestre correspondiente por al menos un radical de aminoácido. (Tal como se utiliza aqui, el término "nucleótido" se emplea indistintamente como "ácido nucleico") . La inserción de elementos genéticos, como por ejemplo secuencias Ds con secuencias Ac activas o sin ellas, resulta especialmente útil. Se introduce el ADN exógeno en las células vegetales de una planta objetivo a través de métodos conocidos, como por ejemplo transformación mediada por Agrobacterium, bombardeo de microproyectiles, microinyección o electroporación (véase más adelante) . Estas células que transportan el ADN exógeno introducido o ADN de Id endógeno mutado por mutagénesis directa se pueden utilizar para regenerar plantas transgénicas con la inducción floral alterada, convirtiéndose asi en fuentes de plantas adicionales tanto por producción a través de las semillas como por mecanismos reproductores asexuales sin semilla (v.g. cortes, cultivo de tejido y similares) . La presente invención se refiere también a métodos de producción de plantas con momentos de inducción floral alterados, ARN o ADN exógeno cuya presencia en la planta tiene como resultado una alteración de la inducción floral, y vectores o constructos que incluyen ADN o ARN útil para la producción de plantas recombinantes con un desarrollo floral alterado. Las semillas producidas por las plantas que contienen ARN o ADN exógeno que codifican una proteina necesaria para la inducción floral, como ADN de Id en la orientación de sentido o ADN exógeno que ha sido alterado para que codifique una forma alterada de una proteina necesaria para el desarrollo floral, como por ejemplo ADN Id* alterado, también son objeto de la presente invención. El trabajo que se describe aqui proporciona un gen de Id, una secuencia genómica, o una porción de la misma, determinada por los autores de la solicitud y que desempeña un importante papel en la inducción del florecimiento de las plantas. El gen se deriva de una monocotiledónea, especificamente, maiz, una de las hierbas con mayor valor comercial. El polipéptido codificado por este gen es una proteina reguladora que origina una conexión entre el crecimiento vegetativo y el desarrollo de los órganos reproductores del maiz. Por otra parte, en el maiz, al igual que en otras muchas plantas, los efectos de esta proteina marcan el comienzo de la senescencia de dichas plantas. El maiz requiere más lluvia que el trigo y la mayor parte de los cultivos de maiz requieren una temporada de crecimiento prolongada. El trabajo que se describe aqui hace posible también que el cultivo de maiz y otras plantas dependientes de la latitud que requieren temporadas de crecimiento prolongadas antes de su florecimiento puedan tener lugar en regiones geográficas con temporadas de crecimiento cortas. Por lo tanto, se puede inducir el florecimiento de las plantas y su siembra antes de las primeras heladas. De manera similar, se puede prolongar la inducción de la flor para plantas de temporada corta que se cultivan en áreas con temporadas de tiempo cálido prolongadas. Gracias a la masa vegetativa adicional y a los hidratos de carbono, estas plantas pueden producir más flores y/o flores más grandes, y como consecuencia, más semillas. Asimismo, se puede evitar que las plantas florezcan, produciendo asi biomasa de ensilaje nutritiva. En otro aspecto más, la invención proporciona un mecanismo para eliminar la necesidad de despendonación en la producción de maiz e híbridos de sorgo.

Breve descripción de las figuras La figura 1 es un mapa del cromosoma 1 donde se muestra la localización del indeterminado y genes Bz2 (pigmentación del grano en bronce), y la sede de inserción de transposón para Ds2. La figura 2 es la secuencia genómica (SECUENCIA ID N0:1) que incluye ADN del gen Id. Las figuras 3A-3F son la secuencia genómica de la figura 2 y las secuencias de aminoácido deducidas a, b y c (SEQ ID NO: 4, SEQ ID N0:5 y SEQ ID N0:2, respectivamente). La inserción de transposón Ds2 se produce en el nucleótido 168. La figura 4 es un mapa de restricción del motivo conservado del fragmento Sacl de 4,2 kb que incluye una porción del gen Id.

Se muestran la localización de la inserción de transposón Ds2 y la secuencia genómica (SECUENCIA ID NO: 3) entre las sedes de restricción Nsil y Sacl. En la figura 5 se muestra la secuencia de polipéptido (SECUENCIA ID NO:4) codificada por la SECUENCIA. ID NO:3. (El ORF que muestra parte de la secuencia de proteina es también la porción que presenta homología entre las proteínas de dedo de Zn) . La figura 6 es una comparación del ORF del gen Id de maiz con proteínas de dedo de zinc conocidas de especies animales eucariotas. En la figura 7 se muestran desplazamientos de marco producidos por la escisión de Ds2 del ORF del gen Id, que tiene como resultado dos mutantes nulos, id-Xl e id-X2. Las figuras 8A-8B son representaciones esquemáticas de constructos antisentido de Id en los que se fusiona un promotor débil con el ADNc de Id para la producción de monocotiledóneas (Figura 8A) o dicotiledóneas (figura 8B) transgénicas para retrasar el florecimiento en una linea de floración temprana.

La figura 9A-9B es una representación esquemática del constructo de sentido de Id en el que se fusiona un promotor constitutivo con el ADNc de Id para la producción de monocotiledóneas (figura 9A) o dicotiledóneas (figura 9B) transgénicas para inducir una floración temprana en una linea de florecimiento tardio. La figura 10A-10B es una representación esquemática de constructos antisentido de Id en los que se fusiona un promotor inducido por sequía con el ADNc de Id para la producción de monocotiledóneas (figura 10A) o dicotiledóneas (figura 10B) transgénicas para retrasar el florecimiento en respuesta a la sequia. La figura 11A-11D es una representación esquemática de constructos antisentido de Id en los que se fusiona la sede de unión a GAL4 (GB) con el ADNc de Id en una monocotiledónea (HA) y una dicotiledónea (11B), y se fusiona un gen GAL4 con un promotor fuerte (CaMV 35s) o un promotor débil en una monocotiledónea (11C) o una dicotiledónea (11D) para la producción de plantas transgénicas en las que está ausente o retrasado el florecimiento. Descripción detallada de la invención A lo largo del crecimiento reproductor, la planta pasa por un programa de desarrollo floral que culmina con la fertilización y va seguido de la producción de semillas. Puede producirse después la senescencia o no. Una planta de maiz (o su pariente más próximo, el sorgo) está programada normalmente para generar un número determinado de estructuras vegetativas (v.g. hojas), seguido después de la formación de estructuras reproductoras (flores) produciéndose finalmente la senescencia de la planta. Sin embargo, las plantas de maiz (Zea mays) que son homocigotos para la mutación del indeterminado (id) del gen Id, presentan defectos en la ejecución de este programa y tienen varios fenotipos de desarrollo: 1) la transición desde la fase vegetativa a la reproductora está alterada de manera que se prolonga la fase vegetativa, teniendo esto como resultado plantas con un plazo de vida prolongado (o indeterminado) ; es decir, florecen mucho más tarde que las plantas normales, o no lo hacen en absoluto. 2) La fase vegetativa se solapa con la fase reproductora de desarrollo y origina un desarrollo floral anormal; es decir, la flor femenina (espiga) presenta características vegetativas y es normalmente estéril y la flor masculina (espiga macho) puede experimentar una inversión de desarrollo completa de manera que los nuevos brotes vegetativos emergen desde los tejidos que tienen características de tejidos florales. En este último caso, las células diferenciadas terminalmente que componen los tejidos florales se vuelven a diferenciar en tejido vegetativo y retoman el crecimiento proliferativo. Singleton, .R., J. Heredity, 37:61-64 (1946); Galinat, W.C. and Naylor, A.W (1951) Am. J. Bot. 38:38-47. Estos fenotipos sugieren que la función del gen Id normal consiste en suprimir el crecimiento vegetativo y señalar el comienzo del crecimiento reproductor en un momento especifico del ciclo vital de la planta. La pérdida de la función de Id tiene como resultado un defecto en la realización de esta transición y origina un desarrollo vegetativo prolongado. La función de Id normal es por lo tanto importante para la transición de la fase vegetativa a la reproductora en el maiz; es decir, la inducción o evocación floral. Los datos genéticos y moleculares sugieren que el gen Id codifica una proteina reguladora que desempeña un papel crucial en la conexión entre el desarrollo vegetativo y el reproductor en el maiz y otras plantas. La comprensión del mecanismo de esta regulación proporciona una base para producir plantas especializadas diseñadas para florecer y producir semillas al margen de los controles internos nativos o los efectos del entorno. De hecho, es posible que el mismo mecanismo que usa un homólogo del gen Id controle la producción de esporas de plantas sin semilla, como por ejemplo las algas. El término "Id" significa el gen normal (de tipo silvestre) del maiz; mientras que "id" se refiere a la forma alterada (mutante) del gen Id. El ADN aislado de la planta que codifica polipéptidos que activan la iniciación de la fase reproductora de la planta puede ser genómico o ADNc. El ADN que se incluye en la presente invención es de monocotiledóneas, hierbas; se describe de manera especifica el gen Id del maiz. Los autores de la solicitud han creado un nuevo alelo de la mutación de id que resulta de la interrupción de la función del gen Id normal por inserción de un elemento de Disociación (Ds) que se puede transponer 1,3 kb en el gen. A continuación, se aisló un clon que contenia una porción del gen id mutado, id*, mediante la técnica de etiquetado de transposón utilizando Ds como etiqueta. Hake y cois. EMBO J. , 8:15-22 (1989); Federoff y cois. (1984) PNAS 81:3825-3829. El análisis de la secuencia preliminar de una porción del gen (id* e Id) indica que Id contiene regiones que son homologas a una clase de factor de transcripción que se encuentra en todos los organismos eucariotas. Un elemento genético que se puede transponer (transposón) es un fragmento de ADN que se desplaza de un lugar a otro en un genoma del organismo. Se escinde desde una sede y se inserta en otra sede, ya sea en el mismo cromosoma o en otro diferente. El movimiento de un elemento que se puede transponer puede generar mutaciones o reorganizaciones cromosómicas y afectar asi a la expresión de otros genes. Los transposones Ac y Ds constituyen una familia de elementos que se pueden transponer relacionados presentes en el maiz. Fedoroff, N. (1989) Maize Transposable Elements. En Mobile DNA, M. Ho e and D. Berg, eds, Washington: ASM press. Ac es capaz de promover su propia transposición o la de Ds a otra sede, ya sea en el mismo cromosoma o en otro diferente. Ds no se puede desplazar a no ser que esté presente Ac en la misma célula. Ac es un elemento que se puede transponer autónomo y Ds es un elemento no autónomo de la misma familia. La inserción de Ds en un locus de un gen tiene como resultado una mutación en dicho locus. Por ejemplo, el locus C en granos de maiz fabrica un factor necesario para la síntesis de un pigmento morado. La inserción del elemento Ds en el locus inactiva el gen, haciendo incoloro el grano. No obstante esta mutación es inestable. En presencia del elemento Ac activo, Ds se transpone fuera del locus en algunas células y se invierte la mutación, dando lugar a sectores de células pigmentadas y, por lo tanto, a un grano con manchas moradas. Los autores de la solicitud han utilizado un derivado del elemento que se puede transponer Ds, Ds2, para producir un nuevo mutante del gen Id. Esto se llevó a cabo por escisión de Ds2 (en presencia de Ac activo) a partir de un gen cercano en el cromosoma 1 y su posterior inserción en el gen Id para producir Id*. A través de varias generaciones de cruces y retrocruces, se introdujo id* en entornos genéticos con elementos Ac activos y sin ellos. Los datos de estos experimentos demuestran que las plantas id*/id* con elementos Ac activos tienen un fenotipo menos severo que los de las plantas Id o sin Ac; es decir, presentan menos nodulos vegetativos y florecen antes. Se espera este resultado cuando el elemento Ac interviene en la escisión somática del elemento Ds2 a partir del alelo id* durante el crecimiento. La escisión restaurarla la función de Id y tendría como resultado una restauración parcial del desarrollo normal.

Por otra parte, el hecho de haber observado que estas plantas no presentan modelos de formación de sectores (es decir, una demarcación nitida de tejido normal yuxtapuesto con tejido mutante) hace pensar que Id actúa sin células de forma autónoma. Este resultado implica que el producto del gen Id es un factor que o bien se puede hacer difuso por si mismo o bien regula la producción de un factor que se puede hacer difuso. Estos experimentos, en los que se estudió el efecto de Ac sobre el florecimiento de plantas id*, demuestran que el momento de florecimiento de la planta de maiz se puede regular cuantitativamente por la cantidad del producto de gen id disponible. Las plantas de tipo silvestre (Id) de estas familias florecieron a las 9 a 11 semanas tras haber sido plantadas. Las plantas homocigóticas para id*, sin Ac presente, no hablan florecido al cabo de 25 semanas, momento en el cual terminó el experimento debido a las heladas. Las plantas que eran homocigóticas para id* y que también tenian Ac florecieron en un momento dado entre las 15 y 22 semanas. Se produjeron escisiones de Ds en estas plantas debido a la presencia de Ac. Estas escisiones restauran la función de Id y tienen como resultado un producto de gen Id suficiente como para hacer florecer a las plantas antes que las plantas sin Ac, pero un producto de gen Id insuficiente como para hacerlas florecer tan pronto como las plantas de tipo silvestre. Es de suponer que el gran intervalo de los tiempos de florecimiento refleja la variabilidad intrínseca de los momentos y las frecuencias de las escisiones de Ds de una planta a otra. Fedoroff (1989), supra. En otro experimento se examinó el efecto de Ac sobre plantas id* con mayor detalle. El elemento Ac presenta un efecto de "dosis negativo"; es decir, una copia de Ac provoca muchas más escisiones de Ds que dos o más copias de Ac. Fedoroff (1989), supra. Se determinó el efecto de la dosis de Ac en las plantas id* plantando semillas que eran homocigóticas para id* y que no llevaban Ac, una Ac y dos o más elementos Ac por genoma. Si la cantidad de producto Id disponible regula la floración, entonces era de esperar que las plantas Id* que contienen dos o más elementos Ac florecieran más tarde que las plantas id* con un elemento Ac pero antes que las plantas id* sin elemento Ac. Este experimento fue realizado en condiciones de invernadero y se observó que los controles de tipo silvestre florecieron después de producir 12 a 13 hojas. Ninguna de las plantas id* que carecían de los elementos Ac florecieron incluso después de producir 24 hojas. De las plantas id* que contenían dos o más elementos Ac, un 12,5% florecieron después de producir 21 a 23 hojas, mientras que un 87,5% de las plantas no florecieron incluso después de producir 24 hojas. En contraposición, un 90% de las plantas que llevaban un elemento Ac florecieron después de producir 16 a 24 hojas. Los resultados demuestran que las plantas id* que contienen un elemento Ac (las que tiene un mayor número de escisiones de Ds y por lo tanto, la mayor cantidad de producto Id) florecen antes que las plantas que tienen más de un elemento Ac (si bien no tan pronto como las plantas de tipo silvestre) . Los resultados sugieren también que al variar la cantidad del producto de gen Id funcional, v.g., al variar la frecuencia de escisión Ds por diferentes dosis de Ac, se puede inducir a una variación cuantitativa del momento de florecimiento. El análisis de mancha Southern en el que se utiliza el elemento Ds2 como sonda mostró que un fragmento Sacl de 4,2 kb se co-segrega con el alelo id* en una progenie de más de 120 cruces ensayados. Dicho fragmento está ausente en las plantas que no llevan el alelo id*. La congregación de este fragmento con el alelo id* es una prueba de que el gen está marcado con el transposón Ds2. Se aisló este fragmento por separación del ADN genómico cortado Sacl sobre un gel de agarosa y escisión de una región del gel que contenia el fragmento y subclonación en un vector de plasmidio para hacer una sub-biblioteca de ADN genómico en esta región. Se identificó el clon especifico que transportaba el elemento por sondeo de la sub-biblioteca con la sonda de Ds2. De 60.000 clones analizados, se observó que uno contenia el fragmento Sacl de 4,2 kb. El análisis de restricción demostró que este clon recombinante lleva un fragmento Ds2 flanqueado por ADN de maiz: 165 bp de ADN a un lado del elemento Ds2 y 2,8 kb de ADN en el otro lado del elemento (figura 4). Las manchas Southern de ADN de distintas plantas utilizando ambas regiones de flanqueo como sondas mostraron que las plantas que son homocigóticas para el alelo id* contienen una banda Sacl única de 4,2 kb, mientras que las que contienen solamente ADN normal tienen un fragmento Sacl de 2,9 kb. Por lo tanto, el fragmento de 4,2 kb es el resultado de la inserción del elemento Ds2 de 1,3 kb en el fragmento Sacl de 2,9 kb. Las plantas heterocigóticas contienen ambas bandas. Con un posterior análisis de id* y otros mutantes de id se ha demostrado que estos mutantes son variaciones del gen Id normal que resulta normalmente de la inserción o eliminación de un elemento genético en diferentes sedes dentro de la secuencia de gen Id, o la eliminación de todo o parte del propio gen Id. El ADN de plantas mutantes que llevan el primer alelo id que se identifica, id-R, no presentó hibridación a ninguna de las sondas de flanqueo, lo que indica que este alelo original es el resultado de una eliminación del gen Id. Otro alelo id, id-Compeigne, parece tener una inserción de 3 kb en este fragmento. Estos resultados aportan pruebas convincentes de que los autores de la solicitud han marcado el gen id con Ds2. El análisis de secuencia del ADN que flanquea inmediatamente el elemento Ds2 del gen Id reveló un marco de lectura abierta (ORF) en el que ha sido insertado el transposón (figura 4) . Cuando se sondeó una mancha de ARN con el fragmento de ADN flanqueante que contenia este ORF, se manifestó una banda de aproximadamente 2,0-2,2 kb de poliA + ARN de meristema apical y, menor medida, en la hoja madura. Se detectó una hibridación muy leve en ARN de siembra y no se detectó ninguna en el ARN de las raices. Esto indica que el ORF codifica un transcripto y que el transcripto se expresa diferencialmente en tejidos de la planta especificos. El análisis de la secuencia de aminoácidos deducida codificada por el ORF proporcionó más pruebas de que este ORF es parte del gen Id y de que desempeña un importante papel en el desarrollo de la planta. Una comparación de este ORF con todas las proteínas de las bases de datos actuales demuestra que tiene una homología significativa con las proteínas de tipo "dedo de zinc" identificadas en muchos organismos eucariotas diferentes, incluyendo seres humanos, ratones, ranas (Xenopus) y Drosophila (figura 4) . Se conocen las proteínas de dedo de zinc como una clase de diversos factores de transcripción eucariota que utilizan dominios de unión a ADN que contienen zinc y que son importantes reguladores del desarrollo. Mcknight, S. L. and K.R. Yama oto, eds. (1992) . Transcriptional Regulation. Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, vol. 1 p 580. Las proteínas de dedo de zinc ejercen una función reguladora interviniendo en la transcripción de otros genes. Los resultados que se muestran aqui demuestran que el gen Id es importante en un punto crucial del desarrollo de la planta (es decir, la transición desde el crecimiento vegetativo al reproductor) y que funciona controlando la expresión de otros genes de la planta necesarios para el desarrollo floral. Es claramente un "conector" y ningún otro elemento en el maiz produce este efecto (inducción de la flor) sin afectar a la salud y vigor de la planta. En contraposición, la mutación de Id altera o inhibe la inducción de la flor solamente; de otro modo, los mutantes son sanos y crecen bien. Otra prueba más de que el fragmento de ADN clonado forma parte del gen Id se obtuvo generando dos nuevos alelos de Id por escisión imprecisa del elemento Ds2 a partir del alelo id* original. Al contrario que id*, estos nuevos alelos ya no respondían a Ac; son mutantes nulos que, según parece, no florecen en absoluto. El análisis de secuencia muestra que tienen una secuencia alterada que tiene como resultado un desplazamiento de marco en el marco de lectura abierta de Id causado por la escisión de Ds2 (figura 7) y, por lo tanto, no codifican el mismo polipéptido que el gen Id. En la figura 7 se ilustra el ADN y la secuencia de aminoácido de una porción del ORF de Id normal y su alteración como consecuencia de la inserción de Ds y la escisión. La mutación de Id-Ds en id que se produce por la inserción del transposón Ds presenta la duplicación de la sede objeto de 8 bp (subrayada) que es tipica de la inserción de Ds. Los mutantes nulos, id-Xl e id-X2, son alelos estables derivados de id, producto de la escisión de Ds2. El alelo id-Xl tiene 7 bp de la sede de duplicación que queda y un radical alterado (T a A) . El alelo id-X2 tiene 5 bp de la sede de duplicación que queda con la misma transición T a A que id-Xl. Los radicales de aminoácido resultantes presentan el desplazamiento de marco en el ORF. Se analizó el clon entero que transportaba el fragmento Sacl de 4,2 kb y la secuencia completa del ADN genómico que flanqueaba el elemento Ds2 (SEQ ID NO:l) determinado (figura 2) utilizando la información que se proporciona aqui y los métodos de análisis conocidos entre los especialistas en este campo. La secuencia de 2930 nucleótidos incluye ADN del gen Id. La secuencia de aminoácido deducida (SEC Id NO: 2) codificada por este ADN se muestra como la secuencia (c) en las figuras 3A-3F.

Los nucleótidos 1 a 1890 por lo menos (posiblemente hasta 2150) de la SEC ID NO:l están transcritos. Los nucleótidos 176-1600 representan un intrón. La sede aproximada de la inserción de transposón Ds2 es el nucleótido 168. El ORF localizado entre las sedes de restricción Nsil y Sacl descritas anteriormente (SEQ ID NO: 3) está representado por nucleótidos en las posiciones 1-410 en las figuras 3A-3F. (Nota: la hebra de ADN mostrada en la figura 5 es complementaria a la de las figuras 3A-3F) . La capacidad de reproducción de una planta afecta directamente a su capacidad de producir semillas. Por lo tanto, la capacidad de controlar el momento de florecimiento constituye un importante factor en el ciclo vital de la planta. Los estudios genéticos de la mutación id del maiz que se describen aqui indican que el gen Id codifica una proteina necesaria para la transición al florecimiento. A través del uso del marcado con transposón, los autores de la solicitud han aislado y caracterizado el gen Id y, en particular, una porción de la región reguladora de dedo de zinc de este gen. Por otra parte, el análisis molecular y la comparación con proteínas reguladoras animales eucariotas demuestra que el polipéptido codificado por esta región es parte, si no el componente principal, de la proteina Id reguladora que controla el inicio de la flor y, muy probablemente, también controla la transición entre el estadio de crecimiento vegetativo y el de reproducción de las gimnospermas y las plantas inferiores, incluyendo las algas. El ADN que proporciona la presente invención se puede utilizar para aislar ácidos nucleicos homólogos de otras especies de plantas que codifican genes reguladores para un florecimiento similar en cuanto a su función al gen Id. En este contexto, la homología se refiere a una identidad de secuencia general de al menos un 50%, preferiblemente 70% o más para la porción de dedo de zinc del alelo Id. La identificación y aislamiento de los genes de tipo Id (homólogos de Id) de otras especies vegetales se lleva a cabo con arreglo a los métodos y procedimientos convencionales conocidos entre los especialistas en este campo. Véase, v.g., Sa brook, y cois. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Un ejemplo de esta aplicación se encuentra en el ejemplo 5, más adelante. Al utilizar estas técnicas y otras similares, los especialistas en este campo podrán aislar fácilmente no solamente el gen Id en diferentes células y tejidos del maiz, sino también homólogos del alelo Id de otras especies vegetales. Por ejemplo, los genes Id de las plantas se pueden identificar preparando una biblioteca genómica o de ADNc de una especie vegetal; realizando un sondeo de la biblioteca genómica o de ADNc con parte o todo el homólogo de la SEQ ID NO:l; identificando las secuencias hibridadas; y aislando el ADN hibridado para obtener el gen Id de la planta. Una vez identificados, estos genes se pueden delimitar en un mapa, secuenciar y clonar. En particular, la región de dedo de zinc o fragmentos de la misma resultan especialmente eficaces como sondas, ya que conservan su homología con regiones de dedo de zinc. Se pueden utilizar fragmentos de hasta 20 bp de longitud para hibridar en otras regiones de dedo de zinc. Se entiende por hibridación que se utilizan ADN y/o ARN en un análisis de hibridación para detectar polinucleótidos complementarios en condiciones de severidad moderada según los métodos descritos en Ausubel y cois. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 26, John Wiley & Sons. Inc., Nueva York, NY.

Pueden estar presentes otras proteínas de dedo de zinc que regulan fenómenos distintos a la iniciación del florecimiento en el maiz y otras plantas. Los genes reguladores pueden controlar la germinación de las semillas, la altura y forma de las plantas, el número de hojas y la maduración de los frutos, por mencionar algunas de las posibilidades. El aislamiento y la caracterización de estos genes, al igual que los genes responsables del inicio de la fase reproductora de las plantas es muy importante y valiosa en la producción de flores, alimento y cultivos en general. Dichos genes de dedo de zinc de las plantas se pueden identificar preparando una biblioteca genómica o de ADNc de una especie vegetal; realizando el sondeo de la biblioteca genómica o de ADNc con todo o parte de un homólogo del gen Id, descrito aqui, como por ejemplo SEQ ID NO:l, en las condiciones apropiadas para la hibridación de ADN complementario que identifica el ADN hibridado; y aislamiento del ADN hibridado para obtener el gen de dedo de zinc de la planta. Después, se pueden delimitar en un mapa, secuenciar y clonar los genes de dedo de zinc. La presente invención proporciona también ácidos nucleicos y polipéptidos con estructuras que han sido alteradas por diferentes mecanismos, incluyendo, sin limitarse sólo a ellas, alteraciones mediante el uso de transposones, mutagénesis especifica para una sede y al azar y sustitución, eliminación o adición de nucleótido por ingeniería. Un método de transposón para producir un alelo del gen Id que presente una alteración de una de las funciones de la planta puede incluir: inserción del transposón Ds u otro elemento que se pueda transponer no autónomo en el gen Id y después escisión del transposón Ds con el transposón Ac u otros elementos que se pueden transponer autónomos para producir un alelo Id alterado de la planta.

Un ejemplo más de un método para producir un alelo del gen Id con una función de la planta alterada incluye la alteración de la estructura molecular del gen Id in vitro utilizando técnicas de genética molecular (v.g. mutagénesis especifica de sede) y después la inserción del gen Id alterado en la planta para producir un alelo Id alterado de la planta. Estas técnicas pueden dar lugar a homólogos de Id que presentan funciones enormemente diferentes con respecto a la proteina natural correspondiente. Por ejemplo, se puede aplicar la mutagénesis dirigida a sede para producir alelos Id que codifican sustituciones especificas de radicales de aminoácido y se puede determinar después qué aminoácidos se requieren para producir un gen funcional, cuyo producto induce una respuesta reproductora en las plantas. De igual modo, se pueden producir por ingeniería los alelos Id para producir proteínas que tienen funciones nuevas, como por ejemplo una inducción de la flor más temprana que la de las plantas naturales. Existen muchas variedades de maiz que evolucionan dentro de una amplia gama de momentos de florecimiento dependiendo de las condiciones del entorno en las que se cultivan. En particular, la duración del dia (según la latitud) determina cuándo florece una planta. El gen Id es un determinante del momento de florecimiento de todas estas variedades de maiz y el momento de florecimiento corresponde a las variedades especificas del producto de gen Id. De hecho, el gen Id puede constituir el determinante principal de la evocación floral. Se puede alterar el gen Id o un homólogo del mismo e introducirlo en una planta de maiz para alterar el momento de florecimiento de un tipo de maiz en particular para que crezca en una latitud diferente de aquélla en la que se desarrolló la cepa madre. Por lo tanto, se puede incorporar un gen Id producido por ingeniería en una linea de maiz que haya sido cuidada en otras condiciones (v.g., un alto rendimiento y resistencia a las enfermedades) para producir una linea de maiz que pueda crecer en muchas latitudes diferentes. El descenso del nivel de proteina Id utilizando constructos antisentido o co-supresión (véase más adelante) puede retrasar el momento de la floración, mientras que un aumento en el nivel de Id por sobre-expresión o a través de una producción más temprana (gen Id copulado con un promotor diferente) de la proteina puede inducir a que las plantas florezcan antes. Por otra parte, el hecho de poner el gen Id en una orientación de sentido o de antisentido bajo el control de diferentes promotores inducibles puede permitir el control del momento de florecimiento en unas condiciones del entorno especificas o cuando se aplican productos químicos. Co-supresión se refiere a la sobre-expresión de un gen endógeno o introducido (transgen) , cuando las copias adicionales del gen tienen como resultado que el coordinado silencie el gen endógeno y el transgen, reduciendo o eliminando asi la expresión del rasgo. Véase, por ejemplo, Jorgensen y cois., patentes EE.UU. N° 5.034.323 y N° 5.283.184. Se introduce el transgen en una orientación de sentido y no requiere una secuencia de longitud completa u homología absoluta con la secuencia endógena que se pretende representar. Se puede suprimir asimismo la expresión del gen endógeno a través de la integración de un oligonucleótido que tiene una secuencia idéntica u homologa a la de la hebra de ADN complementaria con la hebra que transcribe el gen endógeno. Los oligonucleótidos antisentido consisten en . una secuencia especifica de nucleótidos que proporcionan un ARN que se une de forma estable con el ARN transcrito desde un gen endógeno, evitando asi la traducción. Véase, Shewmaker y cois, patente EE.UU. N° 5.107.065.

Se pueden emplear otros oligonucleótidos de esta invención denominados "ribozimas" para inhibir o prevenir el florecimiento. Al contrario que los oligonucleótidos antisentido y otros oligonucleótidos que se unen a un ARN, un ADN o una proteina, las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas que se pueden unir a un ARN objetivo y escindirlo especificamente, como por ejemplo el producto de transcripción de un gen Id endógeno. Las ribozimas diseñadas para escindir sedes especificas pueden inactivar dicha molécula de ARN. Por lo tanto, la reducción de un producto Id se puede conseguir introduciendo ADN que codifica una ribozima diseñada para escindir especificamente transcriptos de genes Id endógenos de forma endonucleótida. Dentro de las clases de ribozimas conocidas, el grupo I intrón y las ribozimas con cabeza de martillo son candidatos útiles de conversión para escisión dirigida de un transcripto de Id, ya que poseen secuencias de reconocimiento cortas (base de 4-12) ; no obstante, se pueden desarrollar otros tipos de ribozimas para la escisión especifica para una sede de ARNm de Id. Véase, Cech, T.R. (1988) J. Amer. Med. Assoc. 260:3030-3034. Las estrategias descritas para retrasar o suprimir totalmente el florecimiento dependen del uso de tecnologías antisentido o similares. Se puede diseñar una estrategia alternativa basada en el uso de proteínas mutantes "dominante-negativas". Se pueden introducir determinados tipos de mutaciones en las proteínas reguladoras que las hacen no funcionales, pero permiten competir a las proteínas mutantes con las proteínas de tipo silvestre por sus objetivos. Dicha competición de una proteina no funcional significa que la sobre-expresión de la proteina mutante se puede utilizar para suprimir la actividad de la proteina de tipo silvestre. Se han construido mutaciones dominante-negativas de los factores de transcripción de dedo de zinc en moscas de la fruta y en células humanas suprimiendo el dominio activación/silenciador al mismo tiempo que se retiene el dominio de dedo de zinc de unión a ADN. La proteina mutante sobreexpresada compite después con la proteina de tipo silvestre por la unión no productiva a los objetivos de ADN. O'Neill, E.M. y cois. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 92: 6557-6561. En las plantas, se han utilizado las estrategias dominante-negativo con éxito con otros tipos de proteínas reguladoras. Véase Boylan. M. y cois. (1994) Plant Cell 6: 449-460; Rieping, M. y cois. (1994) Plant Cell 6: 1087-1098; y Hemerly, A. y cois. (1995) EMBO J. 14: 3925-3936. Se puede construir un mutante dominante-negativo de la proteina Id utilizando una versión truncada del gen Id que contiene solamente las secuencias que codifican el dominio de dedo de zinc (el presunto dominio de unión a ADN) y se pierde el dominio de activación. Si se introduce este gen truncado en las plantas de maiz bajo control de un promotor fuerte, el resultado será que o bien se retrasa radicalmente el florecimiento de las plantas de maiz o bien las plantas no pueden florecer. Por lo tanto, se puede sustituir el gen Id dominante-negativo truncado por el gen Id antisentido en todos los constructos utilizados para retrasar el florecimiento, tal como se ha descrito. El método del gen Id dominante-negativo posee una ventaja frente al constructo antisentido cuando se producen por ingeniería plantas de florecimiento retrasado en cultivos distintos al maiz. La estrategia antisentido depende de si se clona inicialmente parte o todo el gen Id de cada una de las especies de cultivo, expresando después estos genes en una orientación invertida. La supresión antisentido depende de la expresión de las secuencias de nucleótido complementarias, que variarán de una especie de cultivo a otra. En contraposición, la estrategia dominante-negativa depende solamente de la conservación funcional de la proteina y sus sedes objetivo. En general, es un requisito meaos severo que la conservación de la secuencia de nucleótido. Algunos ejemplos conocidos de genes reguladores que codifican factores de transcripción realizan funciones similares cuando se expresan en especies vegetales enormemente diferentes. Véase, v.g. Lloyd, A.M. y cois. (1992) Science 258: 1773-1775; Irish, V.F. y Y.T. Yamamoto (1995) Plant Cell 7:1635-1644. Este tipo de conservación funcional implica que la versión dominante-negativa del gen Id del maiz puede funcionar de forma similar en otra especie de cultivo también. Se puede esperar ciertamente que funcione en otras especies de cereales y, quizá, en todas las plantas monocotiledóneas. Para su aplicación en las dicotiledóneas, podria resultar ventajoso aislar primero un homólogo de Id más intimamente relacionado de una especie dicotiledónea (v.g., tabaco o Arabidopsis) y construir un derivado dominante-negativo tal como se ha descrito anteriormente (eliminando todas las secuencias distintas al dominio de unión a ADN de dedo de zinc) . Esta versión con dicotiledóneas de Id dominante-negativo se puede utilizar después para todas las plantas dicotiledóneas. Por lo tanto, la aplicación de la tecnología dominante-negativa a un amplio abanico de cultivos se puede conseguir sin necesidad de clonar genes Id de cada uno de los cultivos. Se puede aplicar cualquier técnica adecuada para introducir ácidos nucleicos y constructos de la presente invención para producir plantas transgénicas con una alteración del momento de inducción floral. Para las hierbas como el maiz, se puede emplear el bombardeo de microproyectil (véase por ejemplo, Sanford, J. C. y cois., patente EE.UU. N° 5.100.792 (1992). En este modo de realización, se recubren partículas pequeñas con un constructo de nucleótido o un vector que contiene el constructo y se introducen después en un tejido objetivo (células) por penetración balística a alta velocidad. El vector puede ser cualquier vector que exprese el ADN exógeno de las células de la planta en el que se introduce el vector. A continuación, se cultivan las células transformadas en condiciones apropiadas para la regeneración de las plantas, teniendo como resultado la producción de plantas transgénicas. Se examinan las plantas transgénicas que llevan el constructo para obtener el fenotipo deseado utilizando varios métodos entre los que se incluyen sin limitarse sólo a ellos un productor fenotipico apropiado, como por ejemplo resistencia a los antibióticos o resistencia herbicida, o se observa a simple vista el momento de la inducción floral en comparación con las plantas naturales. Entre otros métodos conocidos se incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (véase por ejemplo Smith, R.H., y cois., patente EE.UU. N° 5.164.310 (1992), electroporación (véase por ejemplo, Calvin, N. patente EE.UU. N° 5.098.843 (1992)), introducción mediante la utilización de haces de láser (véase por ejemplo, Kasuya, T., y cois., patente EE.UU. N° 5.013.660 (1991)) o introducción utilizando agentes como por ejemplo polietilen glicol (véase por ejemplo Golds T., y cois. (1993) Biotechnology, 11:95-97) y similares. En general, las células vegetales se pueden transformar con diversos vectores, tales como vectores virales, episomales, vectores de plasmidio de Ti y similares, de acuerdo con los procedimientos conocidos. El método de introducción del ácido nucleico en la célula vegetal no es critico para la presente invención. La región de iniciación transcripcional puede proporcionar expresión constitutiva o expresión regulada. Se dispone de muchos promotores que son funcionales en las plantas. Entre los ejemplos de promotores se incluyen el promotor octopina sintasa, el promotor nopalina sintasa, promotor de virus de mosaico de coliflor (35S), el promotor de virus de mosaico de higo (FMV), promotores de impacto por calor, subunidad pequeña (ssu) de ribulosa-1, 6-bifosfato (RUBP) carboxilasa, promotores especificos de tejido y similares. La región reguladora puede responder a un estimulo fisico como por ejemplo la luz, al igual que con RUBP carboxilasa ssu, señales de diferenciación o metabolitos. El tiempo y nivel de expresión de la orientación de sentido o antisentido puede tener un efecto definitivo en el fenotipo producido. Por lo tanto, los promotores elegidos, copulados con la orientación del ADN exógeno, determinarán el efecto del gen introducido. Las plantas transgénicas de la presente invención pueden contener un ácido nucleico exógeno que altera el momento de la inducción floral de manera que dicha inducción floral se produce antes que la de una planta de la misma variedad sin dicho ácido nucleico exógeno cuando se cultiva en condiciones idénticas. Alternativamente, se compararon las plantas transgénicas que contenían un ácido nucleico exógeno que altera el momento de la inducción floral de manera que se retrasa o se inhibe la inducción floral con la inducción floral de una planta de la misma variedad sin dichos ácidos nucleicos cuando se cultivan en condiciones idénticas. Por otra parte, la presente invención incluye un método para la producción de una planta transgénica en la que está alterado el momento de inducción de la flor, que incluye la introducción en las células vegetales de un ácido nucleico exógeno cuya presencia en la planta tiene como resultado la alteración del momento de inducción del desarrollo de la flor y el mantenimiento de las células vegetales que contienen el ácido nucleico exógeno en las condiciones de crecimiento apropiadas de las células vegetales, según lo cual se produce una planta con una alteración del momento de inducción de la reproducción. Entre los organismos sobre los cuales se puede aplicar este método se incluyen angiospermas (monocotiledóneas y dicotiledóneas), gimnospermas, plantas que llevan esporas o que se reproducen vegetativamente y las algas. Las plantas transgénicas que contienen los constructos recombinantes de Id se pueden regenerar a partir de células transformadas, tejidos o partes de las plantas a través de los métodos conocidos dentro de la especialidad. Se pretende que el significado de parte de una planta incluya cualquier porción de una planta capaz de producir una planta regenerada. Por lo tanto, la presente invención abarca una célula o células, tejido (sobre todo meristemático y/o tejido embrionario), protoplastos, epicotilos, hipocotilos, cotiledones, nodulos cotiledonarios, polen, óvulos, tallos, raices, hojas y similares. Las plantas se pueden regenerar también a partir de explantes. Los métodos variarán según la especie vegetal. Se puede obtener la semilla a partir de la planta regenerada o a partir de un cruce entre la planta regenerada y una planta adecuada de la misma especie. Alternativamente, se puede propagar vegetativamente la planta cultivando las partes de la planta en condiciones adecuadas para la regeneración de dichas partes de la planta. Se pueden utilizar Id asilados y purificados o proteínas o polipéptidos de id, asi como fragmentos epitópicos de los mismos, para preparar anticuerpos para la localización de sedes de regulación de Id y para analizar vias de desarrollo de las plantas. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos que se unen especificamente a una proteina Id para determinar si se expresa la proteina y cuando se expresa en células o tejidos especificos de la planta. Esta información se puede emplear para determinar cómo actúa Id para inducir el florecimiento y para alterar las vias de inducción de la flor. Los anticuerpos de la invención pueden ser policlonales, monoclonales o fragmentos de anticuerpo, pretendiéndose que el término anticuerpo abarque anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir frente a Id aislado o recombinante o proteínas o polipéptidos de Id o id. La preparación de antigeno de inmunización y la producción de anticuerpos se puede realizar empleando cualquier técnica adecuada. Se han descrito diversos métodos (véase v.g. Harlow, E. and D. Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel y cois. (1994) Current protocols in Molecular Biology, vol.2, capitulo 11 (suppl. 27) John Wiley & Sons: Nueva York, NY) . Los anticuerpos de la presente invención se pueden marcar, o se puede marcar un segundo anticuerpo que se une al primer anticuerpo a través de un mecanismo fisico o químico. La etiqueta puede ser una enzima sometida a ensayo por adición de un sustrato que al reaccionar libera un producto absorbente de la luz visible o ultravioleta o puede ser una sustancia radioactiva, un cromoforo, o un fluorocromo. E. Harlow and D. Lañe (1988), supra. Los polipéptidos aislados de la presente invención se pueden utilizar también para detectar y analizar interacciones proteina/proteina. Las proteínas de fusión para este fin se pueden preparar fusionando ADN de Id que codifica un polipéptido de Id funcional con ADN heterólogo que codifica un polipéptido diferente (uno que no está relacionado o que es homólogo al polipéptido de Id) como por ejemplo una etiqueta de proteina. La proteina de fusión resultante se puede preparar para obtener una célula procariota (v.g., E. coli) , aislada, etiquetada y utilizada esencialmente como los anticuerpos para detectar sedes de unión de alelos Id e interacciones Id/proteina. Véase Ron and Dressler (1992) Biotech 13:866-69; Smith and Johnson (1988) Gene 67:31-40.

Las lineas de maiz que se adaptan a latitudes de temperatura florecen prematuramente cuando se plantan en los trópicos por la duración más corta del dia. El florecimiento prematuro tiene como resultado una producción bastante más reducida. Sala ini, F. (1985) Breeding Strategies for Maize Production Improvement in the Tropics. Brandolini, A. and Salamini, F. eds. Food and Agriculture Organization of U.N., Instituto Agronómico Per L'Oltremare, Florencia, Italia. Los especialistas en la técnica reconocerán que el gen Id clonado se puede utilizar para solucionar este problema. Se pueden generar plantas de maiz transgénicas en las que se inserte el gen -d en la orientación antisentido bajo el control de un promotor débil (figura 8A) . El promotor débil utilizado deberá ser constitutivamente activo durante el desarrollo, al menos en el meristema del brote. Dado que Id no parece ser autónomo de la célula, no es necesaria la especificación exacta de la sede de acción del promotor. Un ejemplo de un promotor débil útil para esta aplicación es el promotor nopalina sintasa (nos) , de T-ADN, que, según se ha demostrado, es débilmente constitutivo en el maiz. Callis, y cois (1987) Genes Dev. 1:1183-1200. Otro es un promotor de ciclina del maiz. Las ciclinas son proteínas de división celular que se encuentran en las plantas, animales y levaduras. Los transcriptos de ciclina de la planta se expresan en meristemas y tejidos con células en proliferación a niveles bajos, pero no se expresan en ningún otro lugar. Renaudin, y cois., (1994) PNAS 91:7375-7379. Los promotores de ciclina se aislan fácilmente utilizando los clones de ADN de longitud completa de los autores de la solicitud para ciclina Ib o ciclina III como sondas, para empujar hacia fuera las secuencias genómicas corriente arriba flanqueantes desde una biblioteca genómica de maiz utilizando un aislamiento patrón y técnicas de clonación. Véase Sambrook, y cois., supra; Freeling and Walbot, supra. Los especialistas en la técnica reconocerán otros promotores débiles, que se pretende que entren dentro del marco de la invención, con las características necesarias para llevar a cabo este modo de realización de la invención. Un ejemplo de un constructo útil para esta aplicación se ilustra en la figura 8A. El ADNc para el gel Id se liga corriente abajo desde el promotor, en la orientación antisentido. Se requiere el intrón ADHl para la estabilidad de ARN, y se añade el extremo 3' del gen nos para asegurar una poliadenilación eficaz. Callis y cois. (1987) supra. Se introduce el ADN en las plantas de maiz a través de métodos convencionales como los que se han descrito anteriormente, utilizando el gen bar para la resistencia al herbicida Basta como el productor de la transformación. Gordon-Kamm y cois. (1990) Plant Cell 2:603-618; Freeling and Walbot (1993) supra. Se puede utilizar cualquier constructo o vector que exprese el ADN exógeno en las células vegetales en las que se introduce, como por ejemplo el vector pMON530 que transporta el promotor 35S. Otro vector o constructo útil para la presente invención es el ADN exógeno que codifica la proteina Id insertada en la orientación antisentido en el vector pMON530 corriente abajo de un promotor débil para retrasar el florecimiento en una variedad de florecimiento temprano. Se pueden utilizar constructos similares para otros cereales, v.g., arroz, cebada y otros cultivos de monocotiledóneas. Para aplicaciones antisentido, puede ser necesario aislar primero el ADNc homólogo de las especies que se van a modificar. Se puede deducir que el clon Id del maiz se puede utilizar como una sonda para este propósito, análisis de selección de homólogos Id a partir de bibliotecas de ADNc de las demás especies de cereales. El homólogo Id para la especie que se va a producir por ingeniería se puede insertar después como una sustitución del gen Id del maiz en los constructos de la figura 8A. Se puede extender la misma técnica a plantas dicotiledóneas también. El retraso del momento del florecimiento de algunos de estos cultivos puede traducirse en ventajas similares a las citadas para el maiz, es decir, un periodo de crecimiento vegetativo más largo que da lugar a una producción más alta de frutas y semillas. Gottschalk and Wolff (1983) Induced Mutations in Plant Breeding, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. Por otra parte, algunas plantas dicotiledóneas son valiosas principalmente por los productos del crecimiento vegetativo (v.g., espinacas, tabaco, etc.) y en estas plantas, la prolongación del crecimiento vegetativo tendrá como resultado una producción más alta y eficaz de estos productos. Se pueden diseñar constructos antisentido utilizando homólogos de Id aislados de estas especies, tal como se muestra en la figura 8B, y plantas transgénicas generadas por transformación de ADN-T, preferiblemente, aplicando técnicas de transformación con Agrobacterium, pero también a través de otras técnicas convencionales. Lycett, G.W. y D. Grierson (1990) Genetic Engineering of Crop Plants, Butterworths, Londres, Setlow, J. K. (1994) Genetic Engineering Principies and Methods, vol. 16, Plenum Press, Nueva York. Las variedades de maiz que se adaptan a latitudes tropicales florecen enormemente tarde cuando se cultivan en latitudes de clima templado (Salamini, supra) , alcanzando alturas de 457,2-609,6 cm (15 a 20 pies), con 30 hojas en el florecimiento (en comparación con aproximadamente 20 hojas en término medio en la variedad de clima templado) . Esto no solamente es un inconveniente para el manejo y la cosecha, sino que hace que las plantas sean vulnerables a los daños por heladas del final de la temporada. Una estrategia para inducir un florecimiento más temprano en estas plantas consiste en expresar el gen Id clonado pronto, en el desarrollo vegetativo de estas variedades insertando el gen en la orientación de sentido bajo un promotor constitutivo (figura 9A) . Se puede utilizar un promotor fuerte o débil como, por ejemplo, el promotor CaMV 35S (fuerte) o el promotor nos (débil) , funcionando ambos en el maiz. Callis, y cois. (1987) supra. Los constructos y los métodos de transformación para este fin son similares a los utilizados en la aplicación antisentido antes descrita, con la excepción para la orientación del gen Id. Se podrá deducir que esta técnica se puede adaptar a otras especies de cereales y a monocotiledóneas, en general, utilizando los mismos constructos o constructos que son similares en principio. De hecho, puede que no sean necesarios los homólogos de Id para una expresión más temprana, ya que un producto de gen Id del maiz podria funcionar adecuadamente en otras monocotiledóneas, incluyendo cereales, para promover un florecimiento más temprano. En otro modo de realización de la presente invención, se puede conseguir una floración más temprana de las plantas dicotiledóneas transformando las plantas o células vegetales objetivo con el producto de gen Id del maiz o un homólogo de Id. Dado que se ha demostrado que los genes del maiz funcionan eficazmente en las dicotiledóneas, tal vez no sea necesario aislar el gen homólogo de las especies que se van a transformar. Por ejemplo, los genes R y C del maiz funcionan en la dicotiledónea Arabidopsis cuando se expresa bajo el control del promotor CaMV 35S. Lloyd y cois. (1992) Science 258:1773-1775. El constructo delineado en la figura 9B se puede utilizar para la expresión de un gen Id u homólogo en una dicotiledónea y se puede insertar con la transformación de ADN-T y otras técnicas convencionales, como las que se han descrito ya.

Los golpes de sequía pueden causar una notable reducción de la producción debido a los daños ocasionados a las plantas. Por otra parte, puede verse afectado el momento de floración. Muchas plantas florecen prematuramente en condiciones extremas. En el caso del maiz, la condición extrema de la sequía puede tener como resultado el desarrollo de espigas macho mucho antes que el de las espigas hembra, lo que supone un rendimiento más reducido o ningún rendimiento. Algunos de estos problemas se pueden aliviar si se retrasa el momento de la floración general de la planta durante el periodo de sequia. Este retraso permitirá a la planta crecer vegetativamente durante un periodo de tiempo más prolongado que el normal, de manera que se pueda recuperar de los daños de la sequia antes de florecer. El gen Id se puede utilizar para este fin, si se introduce en las plantas en la orientación antisentido tal como se ha descrito ya, pero combinado con un promotor inducible por la sequia en lugar de un promotor constitutivo. Se puede utilizar cualquier promotor inducible por la sequia. Por ejemplo, se puede emplear un promotor para el gen RAB-17, que es inducido por la sequia al igual que por otras condiciones extremas, supuestamente como resultado de su regulación mediante la hormona de la planta ABA. Vilardell y cois. (1990) Plant Mol. Biol. 14:423-432. Un segundo tipo de promotor que se puede utilizar es el promotor por impacto por calor hsp70 del maiz, que se induce como respuesta a altas temperaturas, 37° a 42°C. Callis y cois. (1988) Plant Physiol. 88:965-968. Un vector o constructo útil para producir plantas que responden a los efectos del entorno se produce mediante la inserción de ADN exógeno que codifica la proteina Id en la dirección antisentido en el vector pMON530 corriente abajo de un promotor inducido por la sequia para retrasar la floración como respuesta a la sequia. Se ilustran diversos constructos para este fin en la figura 10A. También en este caso, se puede extender esta técnica a monocotiledóneas en general, incluyendo otros cereales, con los mismos constructos que la figura 10A o un constructo similar, pero utilizando el homólogo del gen Id para transformar el cereal en concreto, si es necesario. La extensión de esta técnica a cultivos dicotiledóneos se puede realizar utilizando los promotores que se pueden inducir por la sequia apropiados y que funcionan en plantas dicotiledóneas. El promotor del Arabidopsis Atmyb2 se puede utilizar como un promotor inducido por las condiciones extremas y la seguia que responde a ABA general. Urao, y cois. (1993) Plant Cell 5:1529-1539. También se puede utilizar el promotor de impacto por calor de la soja. Schoffl y cois. (1989) Mol Gen. Genet . 217:246-253. Los constructos incluyendo dichos promotores quedan ilustrados en la figura 10B. Dado que esta aplicación depende de la expresión antisentido, puede que sea necesario el uso del homólogo del gen Id de las especies de cultivo que se están produciendo por ingeniería, en lugar del gen Id del maiz. Las plantas del maiz en las que está completamente ausente el florecimiento resultan particularmente útiles; es decir, cuando está eliminado. Las plantas de maiz que no florecen seguirán creciendo vegetativamente, produciendo una biomasa grande que se puede cosechar después para ser almacenada en silos. Sin embargo, si se destruye totalmente el gen Id para producir ensilaje, las plantas transgénicas no florecerán nunca y no se podrán producir semillas híbridas. Un método de la presente invención para generar semillas híbridas de maiz transgénico consiste en producir plantas transgénicas con el gen Id en la orientación antisentido, pero bajo el control de una secuencia reguladora denominada la sede de unión a GAL4. Como consecuencia, el gen Id antisentido no se expresa a no ser que esté presente la proteina GAL4. GAL4 es un factor de transcripción de la levadura que, tal como se ha demostrado, funciona en plantas como el tabaco (Ma. J. y cois. (1988) Nature 334:631-633) y el maiz (McCarty, D. y cois (1991) Cell 66:895-905. Activa la transcripción de los genes que contienen la sede de unión a GAL4 en el promotor. En este modo de realización, se cruza un endógamo transgénico que contienen el gen Id antisentido silente y la sede de unión a GAL4 con otro endógamo transgénico que expresa el gen GAL4 constitutivamente, o bien bajo un promotor débil (para retrasar el florecimiento para el cultivo de maiz en latitudes más bajas) o bien bajo un promotor fuerte (para eliminar el florecimiento para la producción de ensilaje) . Cada uno de los endógamos florece normalmente. No obstante, el híbrido expresa el Id antisentido, y se retrasa o se elimina la floración, dependiendo del promotor utilizado para conducir el gen GAL4. Se puede realizar una modificación similar para otras plantas, ya sean monocotiledóneas o dicotiledóneas, utilizando el homólogo de Id apropiado. En las figuras HA, 11B, 11C y 11D se ilustran los constructos en los que se utiliza la sede de unión a GAL4. Por lo tanto, en el maiz, se cruza un endógamo que incluye el constructo ilustrado en la figura HA con un endógamo que incluye el constructo de la figura 11C. Se retrasa la floración en el híbrido resultante cuando el gen GAL4 está bajo el control de CaMV 35S (P35s) . Sin embargo, cuando el gen GAL4 está bajo el control de los promotores nos (Pnos) o ciclina (Pciclina), se retrasa la floración solamente en el híbrido. En el caso de las dicotiledóneas se obtienen resultados similares cruzando la planta que incluye el constructo que se muestra en la figura 11C con la planta que incluye el constructo que se muestra en la figura 11D.

Las aplicaciones descritas ilustran el uso de constructos Id antisentido. Los especialistas en este campo deberán concluir que se pueden sustituir los constructos antisentido por cualquier constructo adecuado, por ejemplo la versión dominante-negativa del gen Id para poner en práctica los métodos de la invención. Aunque se haya aislado el gen Id del maiz, es probable que existan homólogos de Id en otros cultivos de grano, siendo muy probable que exista en todas las demás plantas. Los autores de la solicitud tienen pruebas iniciales de que existe un pariente cercano de Id, tal como se determina por homología de secuencia, en las plantas dicotiledóneas también. Si estos homólogos en otras especies son también importantes para controlar el momento de la floración, entonces será posible la manipulación del momento de la floración de muchos cultivos importantes desde el punto de vista agrícola. Utilizando las composiciones y métodos que se describen aqui, los especialistas en la técnica podrán utilizar procedimientos conocidos para alterar la iniciación de la fase reproductora de otros granos como sorgo, centeno, trigo, etc., además de las plantas importantes desde el punto de vista comercial. Por ejemplo, se pueden aplicar modificaciones en el momento de la floración que afecten al momento de maduración de la fruta, el momento de producción de flores, el tamaño y calidad de la semilla, la latitud a la que se pueden cultivar las distintas variedades y similares. Se puede modular el momento de la floración para iniciar el florecimiento en diferentes momentos o diferentes partes de la planta. La presente invención proporciona también un mecanismo para eliminar la necesidad de despendonar en lo que se refiere a la producción del maiz e híbridos de sorgo. Si bien parece ser que Id no actúa de forma autónoma con respecto a la célula, puede ser que se localice la señal Id en determinadas áreas de la planta y, según esto, Id deberá ser Id transcrito o Id activado por ARNm en varias zonas de la planta para inducir el desarrollo de la flor en cada una de estas áreas. Tanto el maiz como el sorgo producen órganos de la flor masculinos (espigas macho) en la parte superior (ápice) de la planta. Los órganos femeninos de la flor se producen en las porciones inferiores, en las axilas. A través del uso de promotores especificos de tejido u otros promotores selectivos copulados con el gen Id, es posible inhibir o prevenir la producción de polen en el ápice de la planta al mismo tiempo que se induce selectivamente el desarrollo reproductor de los órganos reproductores femeninos en otras partes de la planta. Asimismo, después de la inducción de la flor normal, se puede inhibir el desarrollo de los órganos reproductores masculinos o se puede inducir la inversión de los tejidos o células que producen polen a la fase vegetativa por copulación de la producción antisentido de Id con la formación de células especificas para producción de polen (como, por ejemplo células de tapetum) . Otra aplicación de esta tecnología consiste en aumentar la fase vegetativa (y por lo tanto, aumentar el número de hojas producidas) de los cultivos que se recogen como hojas (v.g., lechuga, coles, espinacas, maiz) y aumentar asi la producción de estos cultivos al retrasar el florecimiento. Por lo tanto, se puede emplear cualquier planta de acuerdo con la presente invención, incluyendo angiospermas, gimnospermas, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Entre las plantas de interés se incluyen cereales como trigo, cebada, maiz, sorgo, triticale, etc.; otros cultivos de valor comercial como los girasoles, frijoles, colza, cañóla, etc.; frutas como los albaricoques, naranjas, manzanas, aguacates, etc.; verduras como zanahorias, lechuga, tomates, brécol, etc.; especies de madera, como álamo, pino, roble, etc.; y flores ornamentales como clemátide, rosas, crisantemos, tulipanes, etc. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar aspectos especificos de la invención y para ilustrar la invención y proporcionar una descripción de los métodos utilizados para aislar e identificar el gen Id. No deberán considerar estos ejemplos como limitativos de la invención en absoluto. Todas las citas mencionadas en la presente solicitud sobre materiales y métodos se incorporan en ella como referencia.

Ejemplo 1 Etiquetado con transposón Se cultivaron plantas en condiciones de campo normales en una granja de meseta Agricultural Field Station, Cold Spring Harbor Laboratory, durante los veranos de 1989 a 1994. Se aplicaron técnicas genéticas para el maiz convencionales en todos los cruces y procedimientos analíticos. Freeling, M. and Walbot, V. (1993) The Maize Handbook. Springer-Verlag, Nueva York; Gottschalk, W. and Wolff, G. (1983) Induced Mutations in Plant Breeding. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg.? El gen I_d se delimita en el mapa cerca del gen de pigmentación del grano, Bz2, en el cromosoma 1. Un alelo mutable del gen Bz2, bz2-m2, es el resultado de una inserción de un transposón Ds2 en este locus. Dooner y cois. (1985) Mol. Gen. Genetics 200:240-246. (Ds2 es un derivado defectuoso de la familia Ac/Ds de elementos que se pueden transponer y es capaz de transponerse solamente en presencia de un elemento Ac que proporciona transposasa) . Aprovechando la proximidad de Id a bz2-m2 y el hecho de que los elementos Ac/Ds se transponen preferencialmente a sedes unidas, los autores de la solicitud seleccionaron mutantes de id de elementos de inversión germinal en la población bz2-m2; es decir, seleccionando granos completamente morados producto de la escisión germinal del elemento Ds2 (es decir bz2-m2 a Bz2) , una población Fl con el elemento Ds2 insertado en todos los lugares donde fue generado. A partir de la población F2 de estos elementos de inversión se aisló un mutante id de 600 familias examinadas y se designó id*. Los cruces de id* con alelos conocidos de id (id-R, por ejemplo) confirmaron que es alélico a la mutación de id en el cromosoma 1. Ejemplo 2 Análisis de ADN: Se realizaron todos los procedimientos biológicos moleculares esencialmente tal como los describe Sambrook, J. y cois. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Los métodos para el análisis del ADN y ARN de maiz se aplicaron según Freeling, M. and Walbot, V. (1993), supra. Para el análisis de mancha de Southern, se restringieron de 2 a 4 mg de ADN de maiz extraído de las hojas con Sacl y se sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% antes de la transferencia a membranas de nitrocelulosa. Para el sondeo de Ds2, se aisló un fragmento de 108 bp interno del transposón Ds2 desde un plasmidio que transportaba esta porción de Ds2 y se cortó con enzimas de restricción BamHI y EcoRI . Se purificó este fragmento en un gel de agarosa de bajo punto de fusión y se incorporaron nucleótidos con contenido en radioisótopo (32P-dATP y 32P-dGTP) en el fragmento por etiquetado con cebador al azar utilizando un equipo de Boehringer-Mannheim. Se utilizó el fragmento etiquetado para el sondeo de manchas de Southern utilizando soluciones de hibridación de formamida patrón que contenían sulfato de dextrano al 10%. Para aislar el fragmento Sacl de 4,2 kb hibridado con Ds2, se digirieron 100 mg de ADN de una planta simple con Sacl y se sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1%. Se realizó la escisión de una región del gel entre 4 y 5 kb, marcada por marcadores laterales y se purificó el ADN contenido en el fragmento. Se ligó el ADN (T4 ADN Ligasa, New England Biolabs) dentro del vector de plasmidio pLITMUS29 (New England Biolabs) que habla sido cortado con Sacl y se trató con fosfatasa (Shrimp Alkaline Phosphatase, U.S. Biochemical) para eliminar los grupos 5' fosfato para evitar la auto-ligadura. Se transformaron plasmidios recombinantes en las células DH10B de E. coli por electroporación y se colocaron sobre plantas de L-agar que contenían 100 µg/ml de ampicilina. Se cultivaron aproximadamente 60.000 colonias resistentes a la ampicilina en placas y después se transfirió la réplica a membranas de nitrocelulosa. Se realizó la lisis de las colonias en filtros y se fijó su ADN en la membrana. Para determinar qué colonias transportaban un plasmidio recombinante que se hibridaba con el elemento Ds2, se sondearon los filtros con una sonda de fragmento Ds2 etiquetada. Hake y cois., (1989) EMBO J. 8:15-22. Se observó que una colonia de 60.000 analizadas por selección tenian un plasmidio que tenia un elemento Ds2. El análisis de restricción de este plasmidio recombinante reveló aproximadamente 2,9 kb de ADN genómico para un lado del elemento Ds2 de 1,3 kb y 165 bp en el otro lado. Se realizó el análisis de secuencia de una porción del ADN flanqueante utilizando cebadores que hibridaron a la secuencia dentro del vector de plasmidio y dentro del propio elemento Ds2. Se empleó el método de secuenciado de terminación de cadena de didesoxi para secuenciar ADN de plasmidio de doble hélice.

Ejemplo 3 Análisis de ARN Se realizó el análisis de mancha Northern de ARN poliA de varios tejidos de maiz utilizando la región de ADN genómica de 165 bp en el flanco derecho del elemento Ds2 como sonda. Se extrajo el ARN del tejido de meristema apical, tejido de hoja joven y madura y de las puntas de la raiz y se sometió a electroforesis 1 µg de poli A+ ARNm de cada muestra en un gel de agarosa al 1,1% que contenia formaldehido y después se transfirió a membranas de nylon de Genescreen. Se etiquetó el fragmento de 165 pb, tal como se ha descrito anteriormente, y se utilizó como sonda de las manchas. Ejemplo 4 Determinación de la secuencia de gen Id del clon genómico aislado: Se secuenció el clon genómico por el método de didesoxi tal como lo describe Sambrook y cois., supra. La estrategia utilizada se denominó "paseo de cebador". Se utilizaron los cebadores de oligonucleótido que hibridaron al plasmidio para obtener los datos de secuencia iniciales para los extremos del fragmento. Estos datos de secuencia se utilizaron después para sintetizar nuevos cebadores dentro de la región de secuencia, lo que permitió un posterior secuenciado en el clon genómico en un proceso reiterativo hasta secuenciar el fragmento entero. Se leyeron aproximadamente 200 a 350 bp de la secuencia de cada cebador. Ejemplo 5 Identificación y aislamiento de genes reguladores de otras especies de plantas Para identificar y aislar genes reguladores en otras especies de plantas que son homologas al gen Id, se utiliza la secuencia de ADN que codifica el ORF de Id u otro fragmento del gen Id como sonda para el análisis de selección de las bibliotecas de ADNc de la planta compuestas de ARN derivado de tejidos que expresan genes reguladores (Sambrook y cois., (1989) supra; Freeling and Walbot (1993) supra) . Es bastante probable que las bibliotecas construidas a partir de ARNm derivadas de semillas y de tejido inflorescente inmaduro contengan estos genes. Los autores de la solicitud han podido utilizar bibliotecas de maiz similares para obtener clones de ADNc de genes de ciclos de división celular del maiz como cdc2 (Colasanti y cois., (1991) PNAS, 88:3377-3381) y las ciclinas (Renaudin y cois. (1994) PNAS, 91:7375-7379) utilizando sondas de ADN cortas para estos genes. Se identifican y se aislan los clones que se hibridan con las sondas radioactivas y se realiza un análisis de secuencia por métodos convencionales, tal como lo describe Sambrook y cois., supra.

Equivalentes Los especialistas en la técnica podrán reconocer o serán capaces de determinar con el simple empleo de la experimentación de rutina, que existen muchos equivalentes de los modos de realización especificos de la invención aqui descritos de forma especifica. Se pretende que dichos equivalentes entren dentro del marco de las siguientes reivindicaciones.

Claims (29)

1. REIVINDICACIONES 1. ADN aislado que tiene una función reguladora de la inducción de la floración y que incluye un gen Id, o una porción del mismo, incluyendo el gen Id parte o toda la secuencia SEQ ID N0:1, o ADN homólogo.
2. 2. ADN modificado o una porción del mismo relacionado con ADN según la reivindicación 1 por alteraciones mediante el uso de uno entre: transposones; mutagénesis especifica de sede y al azar; y sustitución, eliminación o adición de nucleótido; al mismo tiempo que se retiene la función reguladora de inducción de la flor.
3. 3. ADN modificado o una porción del mismo relacionado con el ADN según la reivindicación 1, mediante la escisión del elemento que se puede transponer Ds2 a partir de un gen Bz2 cercano e inserción del elemento que se puede transponer en el gen Id al mismo tiempo que se retiene la función reguladora de inducción de la flor.
4. 4. ARN aislado o una porción del mismo codificado por el ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3.
5. 5. Un polipéptido o porción del mismo codificado por el ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3.
6. 6. ADNc aislado o una porción del mismo complementario al ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3.
7. 7. ADN aislado de una planta que se hibrida en condiciones de severidad moderada en el ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3 o que presenta al menos un 50% de homología con la región del dedo de zinc del ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3.
8. 8. Un gen Id que codifica un polipéptido que incluye la SEQ ID N0:2.
9. 9. Una planta o parte de la planta que contiene: (a) ADN tal como se ha definido en la reivindicación 2 o en la reivindicación 3; (b) ADN exógeno tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3. (c) ADN que incluye un constructo antisentido de ADNc tal como se ha definido en la reivindicación 6; o (d) ADN según la reivindicación .2 o la reivindicación 3 que codifica una proteina Id mutante dominante-negativa.
10. 10. Una semilla de una planta según la reivindicación 9.
11. 11. Un cultivo de tejido de la planta o parte de la planta según la reivindicación 9.
12. 12. Una planta o parte de la planta según la reivindicación 9, donde la planta es maiz o sorgo o la parte de la planta se deriva de maiz o sorgo.
13. 13. La semilla según la reivindicación 10 donde la semilla es semilla de maiz o sorgo.
14. 14. Un cultivo de tejido según . la reivindicación 11 donde el tejido es tejido de maiz o sorgo.
15. 15. Una planta transgénica, parte de la planta transgénica o célula de la planta transgénica que contiene ADN exógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3, que altera el momento de inducción de la flor.
16. 16. La planta o parte de la planta según la reivindicación 15 donde la planta es maiz o sorgo o la parte de la planta o célula vegetal se deriva de maiz o sorgo.
17. 17. Una planta transgénica que contiene un ADN exógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3 que altera el momento de inducción floral, de manera que la inducción floral se produce antes que la de la misma planta sin dicho ADN exógeno cuando crecen en condiciones idénticas.
18. 18. Una planta transgénica que contiene un ADN exógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3 que altera el momento de la inducción floral de manera que se retrasa o inhibe la inducción floral, en comparación con la inducción floral de la misma planta sin dicho ADN exógeno cuando crecen en condiciones idénticas.
19. 19. Un método para la producción de una planta transgénica que tiene un momento de inducción de la flor alterado, que incluye la introducción en las células vegetales de un ADN exógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3, y mantener las células vegetales que contienen el ADN exógeno en las condiciones adecuadas para el crecimiento de las células de la planta.
20. 20. El método de la reivindicación 19 donde la planta transgénica se selecciona del grupo que consiste en angiospermas, gimnospermas, monocotiledóneas y dicotiledóneas.
21. 21. Un método para identificar un gen Id en una planta que incluye las etapas de: (a) preparación de una biblioteca de ADN genómica o una biblioteca de ADNc de una planta; (b) sondeo de dicha biblioteca de ADN genómica o dicha biblioteca de ADNc con parte o todo el homólogo del gen Id descrito en parte por la SEQ ID N0:1; (c) identificación del ADN hibridado; y (d) clonación del ADN hibridado para obtener el gen Id.
22. 22. Un método de identificación de un gen que codifica una proteina de dedo de zinc en una planta que incluye las etapas de: (a) preparación de una biblioteca de ADN genómica o una biblioteca de ADNc de una planta; (b) sondeo de dicha biblioteca de ADN genómica o dicha biblioteca de ADNc con parte o todo el homólogo de un gen Id tal como se ha definido en la reivindicación 1; (c) identificación del ADN hibridado; y (d) secuenciación del ADN hibridado para obtener el gen que codifica una proteina de dedo de zinc.
23. 23. El método de la reivindicación 22 donde la porción u homólogo del gen Id codifica la porción de dedo de zinc de la proteina Id.
24. 24. Un método para producir un alelo del gen Id con una función alterada en una planta que incluye: (a) inserción de un elemento que se puede transponer no autónomo en un gen Id tal como se ha definido en la reivindicación 1; y (b) escisión del elemento que se puede transponer no autónomo mediante el uso de un elemento que se puede transponer autónomo para producir un alelo de Id alterado en la planta.
25. 25. Un método para producir un alelo del gen Id con una función alterada en una planta que incluye: (a) alteración de la estructura molecular de un gen Id tal como se ha definido en la reivindicación 1 in vitro utilizando técnicas de genética molecular; y (b) inserción del gen Id alterado en una planta para producir un alelo de Id alterado en la planta.
26. 26. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido que incluye SEQ ID NO: 2, o una porción de la misma.
27. 27. Una proteina de fusión Id que incluye parte o toda la SEQ ID NO: 2 o un homólogo, y un polipéptido que no está relacionado u homólogo de la SEQ ID NO: 2.
28. 28. Una ribozima que escinde e inactiva el transcripto de ARN del ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, y 3.
29. 29. Uso del ADN según la reivindicación 1 para el desarrollo de técnicas para la regulación de la inducción de la flor en las plantas.