MXPA97000828A - Analogos del acido aspartico como inhibidores de la enzima que convierte a la interleucina-1 beta - Google Patents

Abstract

Se describen compuestos, composiciones y métodos para inhibir la actividad de la interleucina-1B proteasa. Los compuestos, acetamida a-sustituidas son de la fórmula (A), en la que:R2=H o alquilo;R3=halo, O(CO)0-1 arilo, OPOR4R5;(a), (b) donde R4 y R5=arilo;R6=H, arilo o aralquilo;R7=seleccionado independientemente de R6, CF3 y CF2CF3;R1=R6-CO, heteroaril-CO, heteroaralquil-CO y aminoácido.

Description

ANÁLOGOS DEL ACIDO ASPARTICO COMO INHIBIDORES DE LA ENZIMA QUE CONVIERTE A LA INTERLEUCINA-1 Beta DESCRIPCIÓN Esta invención se relaciona con una serie de análogos del ácido azaaspártico, el cual presenta inhibición in vitro e in vivo de la enzima que convierte a la interleucina-lß, con composiciones que contienen los análogos del ácido aspártico nuevos y con los métodos para utilidad terapéutica. Más particularmente, los inhibidores de la enzima que convierten a la interleucina-lß, descritos en esta invención, comprenden nuevas acetamidas a-sustituidas del ácido azaaspártico, las cuales poseen utilidad particular en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y enfermedades basadas en el sistema inmune del pulmón, sistema nervioso central y tejidos conectivos. La interleucina lß (IL-lß) proteasa (también conocida como enzima que convierte a la interleucina lß o ICE) es la enzima responsable para el procesamiento del precursor de 31 unidades kD biológicamente inactivo de IL-lß a la forma de 17 unidades kD biológicamente activa (Kostura, M.J.; Tocci, M.J.; Limjuco, G.; Chin, J.; Cameron, P.; Hillman, A.G.; Chartrain, N.A. ; Schmidt, J.A., Proc . Nat . Acad. Sci. , (1989), 86. 5227-5231 y Black, R.A.; Kronheim, S.R.; Sleath, P.R., FEBS Let . , (1989), 247., 386-391). Además de actuar como una de las primeras respuestas del cuerpo a la lesión e infección, la IL-lß también se ha propuesto para actuar como un mediador de una amplia variedad de enfermedades, incluyendo artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad inflamatoria del intestino, sepsis, leucemia mielógena aguda y crónica y osteoporosis (Dinarello, C.A.; olff, S.M., New Enal . J . Med . , (1993), 328 106). Un antagonista del receptor IL-lß que se presenta en forma natural se ha utilizado para demostrar la mediación de la IL-lß en muchas enfermedades en humanos y modelos animal (Hannum, C.H.; Wilcox, C.J.; Arend, .P.; Joslin, G.G.; Dripps, D.J.; Heimdal, P.L.; Armes, L.G.; Sommer, A.; Eisenberg, S . P . ; Thompson, R.C., Nature, (1990), 343 , 336-340; Eisenberg, S.P.; Evans, R.J.; Arend, .P.; Verderber, E.; Brewer, M.T.; Hannum, C.H.; Thompson, R.C., Nature (1990), 343, 341-346; Ohlsson, K.; Bjork, P.; Bergenfeldt, M. ; Hageman, R.; Thompson, R.C., Nature (1990), 348 550-552; akabayashi, G. FASEB , (1991), 338-343; Pacifici, R. ; et al Proc. Nati. Acad. Sci. (1989), 86./ 2398-2402 y Yamamoto, I.; et al. Cáncer Rsh (1989), 49, 4242-4246). El papel específico de la IL-lß en la inflamación y la inmunorregulación está apoyado por la observación reciente de que el virus de la viruela emplea un inhibidor de la ICE para suprimir la respuesta inflamatoria de su huésped (Ray, C.A. et al, Cell, (1992) , 69, 597-604) .

La importancia de estas observaciones está bien reconocida por aquellos con habilidad en el arte y varios trabajadores han propuesto y demostrado in vivo la utilidad de los inhibidores de la ICE y modificando ciertas enfermedades mediadas por la IL-lß. Algunos han sugerido el desarrollo y uso terapéutico de un inhibidor de molécula pequeña de la formación de la IL-lß madura (Véase, por ejemplo, Miller, D.K. et al. "The IL-lß Converting Enzyme as a Therapeutic Target" in Immunosuppressive and Antiinflammatory Drugs; Annals of the New York Academv of Sciences; Vol . 696, pp 133-148, 1993). La siguiente revisión del estado actual de la técnica en la investigación de la ICE apoya además tal utilidad de los inhibidores de la ICE: 1) La WO 9309135, publicada el 11 de mayo de 1993, enseña que el ácido aspártico, la arilaciloxi- y arioximetil cetonas a base del péptido son inhibidores potentes de la ICE in vitro. Estos compuestos también inhiben específicamente la ICE en células completas (in vivo) por su capacidad para inhibir la formación de la IL-lß madura en células completas. Estos inhibidores de la ICE también demuestran utilidad en reducir la fiebre e inflamación/inchazón en ratas . 2) Los pacientes con la enfermedad de Lyme algunas veces desarrollaron artritis Lyme. B. burgdorferi, el agente causal de la enfermedad de Lyme, es un inductor potente de la síntesis de IL-1 por las células mononucleares . Miller et al (Miller, L.C.; Lynch, E.A. Isa, S . ; Logan J. .; Diranarello, C.A.; y Steere, A.C., "Balance of synovial fluid IL-lß e IL-1 Receptor Antagonist and Recovery from Lyme arthritis", Lancet (1993) 341 ; 146-148) mostraron que en pacientes quiénes se recuperaron rápidamente de la artritis de Lyme, el balance en el fluido sinovial de IL-lß e IL-lra estuvo a favor de IL-ra. Cuando el balance se desplazó en favor de la IL-lß, tomó significativamente más tiempo para que la enfermedad se remediará. La conclusión fue que el exceso de IL-lra bloqueo los efectos de la IL-lß en los pacientes estudiados. 3) La IL-1 está presente en tejidos afectados en colitis ulcerativa en humanos. En los modelos animales de la enfermedad, los niveles de IL-lß se correlacionan con la severidad de la enfermedad. En el modelo, la administración de IL-lra redujo la necrosis del tejido y el número de células inflamatorias en el colon. Véase, Cominelli, F. Nast, C.C.; Clark, B.D.; Schindler, R. , Llerena, R. Eysselein, V.E.; Thompson, R.C.; y Dinarello, C.A. " Interleukin-1 Gene Expression Synthesis, and Effect of Specific IL-1 Receptor Blockade in Rabbit Immune Complex Colitis" J. Clin. Investigations (1990) Vol. 86/ PP, 972-980. 4) El antagonista del receptor IL-1, Antril (Synergen) , posee actividad antiinflamatoria significativa en pacientes con artritis reumatoide activa. En un estudio del rango de dosis de la Fase II de centros múltiples, 175 pacientes recibieron las dosis subcutáneas de Antril a 20 mg, 70 mg y 200 mg siete veces, tres veces o una vez a la semana. El antagonismo se encontró que es más efectivo cuando se toma diariamente. Después de tres semanas del tratamiento diario, los pacientes mostraron una disminución en la inflamación de la articulación y menos actividad de la enfermedad (Scrip, NO 1873, 1993) . 5) La IL-lra suprime la inflamación de la articulación en el modelo PG-APS de artritis en ratas. Véase Schwab, J.H.; Anderle, S.K.; Brown, R.R.; Dalldorf, F.G. y Thompson, R.C., "Pro-and Anti-Inflammatory Roles of Interelukin-1 in Recurrence of Bacterial Cell all-Induced Arthritis in Rats". Infect . Immun. (1991) 59; 4436-4442. 6) La IL-lra muestra eficacia en una prueba de artritis reumatoide en humano con una marca abierta, pequeña. Véase, Lebsack, M.E.; Paul, C.C.; Bloedow, C.C.; Burch, F.X.; Sack, M.A.; Chase, . , y Catalano, M.A. "Subcutaneous IL-1 Receptor Antagonist in Patients with Rheumatoid Arthritis", Arth. Rheum. (1991) 34; 545. 7) El receptor de IL-1 soluble reduce en forma significativa clínicamente la reacción alérgica de fase tardía, cutánea. Esto se demostró en un estudio controlado con placebo doble ciego, aleatorizado, eventual en 15 sujetos alérgicos. Véase, Mullarkey, M.F. et al "Human Cutaneous Allergic Late-Phase Response is Inhibited by Soluble IL-1 Receptor", J. of Immunology, (1994) 152; 2033-2041. 8) La IL-1 parece ser un factor de crecimiento autócrino para la proliferación de células de leucemia mielógena crónica. Ambas de IL-lra y sIL-lR inhiben el crecimiento de colonias en células retiradas de pacientes con leucemia. Véase, Estrov, Z.; Kurzrock, R. ; etzler, M.; Kantarjian, H.; Blake, M. ; Harris, D. ; Gutterman, J.U.; y Talpaz, M. "Supression of Chronic Myelogenous Leukemia Colony Growth by Interleukin-1 (IL-1) Receptor Antagonist and Soluble IL-1 Receptors : a Novel Application for Inhibitors of IL-1 Activity" . Blood (1991) 78; 1476-1484. 9) Como en 6) anterior, pero para la leucemia mielógena aguda en lugar de la leucemia mielógena crónica. Véase, Estrov, Z.; Kurzrock, R. ; Estey, E.; Wetzler, M. ; Ferrajoli, a.; Harris, D.; Blake, M. ; Guttermann, J.U.; y Talpaz, M. "Inhibition of Acute Myelogenous Leukemia Blast Proliferation by Interleukin-1 (IL-1) Receptor Antagonist and Soluble IL-1 Receptors". (1992) Blood 79; 1938-1945. Una terapia efectiva aún está por desarrollarse por completo, comercialmente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias mediadas por IL-lß, por consiguiente, existe la necesidad de agentes terapéuticos efectivos en el tratamiento y prevención de estas enfermedades .

Se sabe que el ácido aspártico es el determinante de la especificidad Pl para la ICE. Esto se ha ejemplificado por el potente inhibidor i irreversible, el cual contiene un residuo de ácido aspártico Pl . En esta invención, se describen inhibidores donde el residuo de ácido aspártico tradicional está sustituido con un residuo de ácido azaaspártico como se indica por ii. En estos agentes nuevos, el átomo de carbono el cual lleva la cadena lateral de ácido aspártico, ha sido reemplazado por un átomo de nitrógeno. (i) inhibidor de la ICE basado en ácido aspártico (Doüe, R.E. ?t al., J. Med. Chem. 37, 563 (1994)) (ü) inhibidor de la ICE basado en ácido azaaspártico (Presente Invención) De acuerdo con la presente invención, se proporciona un compuesto de la fórmula (A) o su sal farmacéuticamente aceptable: en la que : R2 = H o alquilo; R3 = halo.0(00)5.,arilo, OPOR4R5; donde R4 y R5 = arilo; R^ = H, arilo o aralquilo; R7 = seleccionado independientemente de R6 , CF3 y CF2CF3; R1 = R6-C0, heteroaril-CO, heteroaralquil-CO y aminoácido. "Alquilo" se define como un hidrocarburo alifático, saturado el cual puede ser ya sea una cadena lineal o ramificada. Los grupos preferidos tienen no más de aproximadamente 12 átomos de carbono y pueden ser metilo, etilo e isómeros estructurales de propilo, butilo, pentilo, hexilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo. "Arilo" se define como un anillo fenilo o naftilo, el cual puede estar sustituido o sin sustituir, en el que uno o más de los átomos de hidrógeno han sido reemplazados por los mismos o diferente sustituyentes incluyendo halo, alquilo, arilo, nitro, ciano, amino, hidroxilo, alcoxi o haloalquilo . "Aralquilo" significa un radical alquilo sustituido con un anillo arilo. Por ejemplo, bencilo, 4-clorobencilo . "Heteroarilo" significa piridilo, tienilo o furanilo y sus isómeros estructurales. "Heteroaralquilo" significa un radical alquilo sustituido por un anillo heteroarilo. Por ejemplo, 2-tieniletilo . "Halo" significa yodo, bromo, cloro y fluoro. "Aminoácido" se define como un aminoácido o dipéptido natural o no natural disponible comercialmente, donde el grupo a-amino en el aminoácido o dipéptido ha sido protegido con un grupo N-protector. Tales grupos incluyen, amidas, sulfonamidas, carbamatos y ureas como se describió en The Peptides. E. Gross and J. Meienhofer, Eds . , Vol. 2, (1981) Academic Press, NY. La N-benciloxicarbonil-L-valina-L-alanina es un ejemplo.

La presente invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas y un método para el tratamiento de enfermedades o desórdenes mediados por la IL-lß proteasa en un mamífero que necesita de tal tratamiento, que comprende la administración de inhibidores de la IL-lß proteasa de la fórmula (A) como el agente activo. Estas enfermedades y desórdenes incluyen: enfermedades infecciosas tales como meningitis y salpingitis; choque séptico, enfermedades respiratorias; estados inflamatorios; tales como artritis, colangitis, colitis, encefalitis, endocerolitis, hepatitis, pancreatitis, lesión por reperfusión, enfermedades basadas en el sistema inmune, tales como hipersensibilidad; enfermedades autoinmunes; tales como esclerosis múltiple; enfermedades óseas; y ciertos tumores y leucemias. La presente invención tiene utilidad particular en la regulación del procesamiento de la IL-lß para el tratamiento de la artritis reumatoide. Se sabe que los niveles de la IL-lß están elevados en el fluido sinovial del paciente con la enfermedad. Adicionalmente, la IL-lß estimula la síntesis de enzimas que se cree que están implicadas en la inflamación, tales como colagenasa y PLA2 y produce la destrucción de la articulación, lo cual es muy similar a la artritis reumatoide después de la inyección intra-articular en animales .

En la práctica de esta invención, una cantidad efectiva de un compuesto de la invención o su composición farmacéutica se administra al individuo que necesita de o que desea tal tratamiento. Estos compuestos o composiciones pueden ser administrados por cualquiera de una diversidad de rutas dependiendo del uso final específico, oral, parenteral (incluyendo la administración subcutánea, intra-articular, intra-muscular e intravenosa) , rectal, bucal (incluyendo sublingual), transdérmica o intranasalmente . La ruta más adecuada en cualquier caso dependerá del uso, el ingrediente activo particular y el individuo implicado. El compuesto o composición también puede ser administrado por medio de liberación controlada, implante de un depósito o formulaciones inyectables como se describe más completamente en la presente. En general, para los usos como se describe en la presente invención, es apropiado administrar el ingrediente activo en cantidades entre aproximadamente 0.1 y 100 mg/kg de peso corporal, de mayor preferencia de aproximadamente 0.1 a 30 mg/kg de peso corporal para la terapia humana, el ingrediente activo será administrado de preferencia en el rango de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20-50 mg/kg/día. Esta administración puede ser realizada por una sola administración, por distribución en varias aplicaciones o por liberación lenta para lograr resultados más efectivos. Cuando se administran como una sola dosis, la administración de mayor preferencia estará en el rango de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. La dosis exacta y el régimen para la administración de estos compuestos y composiciones, necesariamente será dependiente de las necesidades del paciente individual que es tratado, el tipo de tratamiento y el grado de aflicción o necesidad. En general, la administración parenteral requiere dosis menores que otros métodos de administración, los cuales son más dependientes de la adsorción. Aún otro aspecto de la presente invención, se relaciona con composiciones farmacéuticas que comprenden como un ingrediente activo un compuesto de la presente invención en mezcla con un portador no tóxico, farmacéuticamente aceptable. Como se mencionó en lo anterior, tales composiciones pueden ser preparadas para utilizarse para la administración parenteral (subcutánea, intraarticular, intramuscular o intravenosa) , particularmente en la forma de soluciones líquidas o suspensiones; para la administración oral o bucal, particularmente en la forma de tabletas o cápsulas; o intranasalmente, en particular en forma de polvos, gotas o aerosoles nasales. Cuando se administran oralmente, (o rectalmente) los compuestos, usualmente se formularán en una forma de unidad de dosis tal como una tableta, cápsula, supositorio o bolsa. Tales formulaciones incluyen típicamente un portador o diluyente sólido, semisólido o líquido. Los diluyentes y vehículos ejemplares son lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, fosfato de calcio, aceite mineral, manteca de cacao, aceite de teobroma, alginato, goma de tragacanto, gelatina, jarabe, metilcelulosa, monolaurato de polioxietilensorbitan, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco y estearato de magnesio. Como se muestra en el Esquema 1, 1-butil hidrazina ácido acético (Fórmula 1, preparada de acuerdo con Niedrich, H. et al., Chem. Ber. 102, 1557-1569 (1969)) se acetiló ya sea con aminoácido N-protegido o dipéptido ácido o cualquier ácido carboxílico no peptídico deseado. La reacción de acilación se lleva a cabo utilizando un reactivo de copulación de péptido tal como un cloruro de ácido, anhídrido mezclado y otros métodos descritos en The Practice of Peptide Synthesis (M. Bodanszky, Ed., 1984 Springer-Verlag, NY) para producir una acilhidrazona (Fórmula 3) . La acilhidrazona a su vez se hace reaccionar con un cloruro de alfa-haloacetil (Fórmula 4) en presencia de una base tal como N-metilmorfolina . Esta reacción produjo compuestos de la Fórmula 5. Cuando los compuestos de la Fórmula 5 se trataron con ácido trifluoroacético (TFA) en cloruro de metileno (solución de TFA a 25%) durante 3 horas a 25°C, el t-butiléster se hidrolizó y se obtuvieron los inhibidores de la Fórmula 7. Alternativamente, cuando la acilhidrazida de la Fórmula 5 (W=Br) se trata con un fenol, el ácido arilcarboxílico, ácido diarilfosfínico, un derivado del ácido tetrónico o un derivado 5-hidroxi-pirazol en dimetilformamida, contiene fluoruro de potasio, se obtienen los compuestos del tipo descrito por la Fórmula 6. Estos t-butilésteres entonces se tratan con TFA como en lo anterior (Fórmula 5 --> 7) para obtener los inhibidores de la Fórmula 7.

ESQUEMA 1 COOtBu reactivo de copulación aminoácido N-protegido del péptido o dipéptido ácido N-protegido H,N — — H u otro ácido carboxílico no peptí ico Fórmula 1 Fórmula 2 4 Fórmula 5 Fórmula 3 Fórmula COOH COOtBu TFA R, — — — COCH- — R3 -*- R,_ N_N r— COCHj — OY Fórmula 6 Fórmula 7 donde W = halo ; HO-Y = fenol, ácido carboxílico, ácido diarilfosfínico, derivado del ácido tetrónico o derivado de 5-hidroxipirazol ; R1 y R^ son como se definieron previamente.

Los siguientes ejemplos ilustran además los compuestos de la invención.

Ejemplo 1 Z= grupo N-benciloxicarbonilo protector N terminal Acido N-benciloxicarbonil-L-valina-L-alanina-azaasDártico 2.6-diclorobenzoiloximetil cetona .COOtBu ?OT /C00lB? ^N-N-H + Z-Val-Ala-OH 2- Z-Val-Ate-HN-N-H 2 3 Parte A: Z-Val-Ala-OH (2 ) (4.00 g, 12.4 mmoles), hidrazina (1) (2.18 g, 14.9 mmoles) y HOBT (2.09 g, 13.6 mmoles) se disuelven en 25 mi de DMF. El clorhidrato de la 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etil carbodiimida (EDC, 2.61 g, 13.6 mmoles) se agregan entonces en una porción a 0°C y la solución de reacción se agita durante 6 horas. La solución de reacción se vacía entonces en 800 mi de agua y el producto se extrae en acetato de etilo (3x) . La capa orgánica se lava (agua, 0.3 NaKHS04 (2x) , NaHC03 (2x) al 5%, salmuera) se seca sobre Na2S04. La evaporación del solvente produjo (3) como un polvo blanco fino de suficiente pureza: 5.34 g, 95%, PF 115-157°C.

Parte B: El cloruro de bromoacetilo (4) (0.71 mi, 8.66 mmoles) se agrega en gotas a una solución a 0°C de hidrazida (3) (3.00 g, 6.66 mmoles) y N-metilmorfolina (1.1 mi, 9.99 mmoles) en diclorometano (80 mi). Después de agitar durante 5 horas a 0°C, la mezcla de reacción se vacía en agua (600 mi) y el producto se extrae en acetato de etilo (3x) . La fase orgánica se lava entonces (agua, 0.3 NaKHS04 (2x) , NaHC03 al 5% (2x) , salmuera) se seca con Na2S04, se filtra y concentra. La recristalización a partir de acetato de etilo/hexanos caliente proporcionó el derivado bromoacetilo (5) (3.11 g, 82%) como un sólido cristalino blanco, PF. 136-138°C.

Parte C: HF en polvo (0.128 g, 2.18 mmoles) se agregan a una solución homogénea del derivado bromoacetilo (5) (0.500 g, 0.874 mmoles) y ácido 2 , 6-diclorobenzoico (8) (0.234 g, 1.20 mmoles) en 5 mi de DMF. Entonces la reacción se calienta a 60°C durante 10 horas. La mezcla de reacción se vacía en 100 mi de agua y los productos se extraen en acetato de etilo (3x) . Entonces la capa de acetato de etilo se lava (agua, 0.3 NKHS04 (2x) , NaHC03 al 5% (2x) , salmuera), se seca con a2S04, se filtra y concentra. La recristalización a partir de EtOAc/hexano caliente proporcionó el derivado diclorobenzoato (9) como un sólido cristalino blanco ( 0 . 510 g , 86 % PF 176 - 178 ° C) .

Parte D: Se agregan tolueno (5 mi) y una solución al 25% de TFA/CH2C12 (100 mi) a un matraz de 250 mi que contiene tBu éster (9) (0.450 g, 0.66 mmoles) . Después de agitar durante 1 hora a RT, se agrega tolueno adicional (50 mi) y todos los solventes se evaporan bajo presión reducida. Dos porciones de 100 mi adicionales de tolueno se agregan y evaporan. La concentración de una solución homogénea del producto en diclorometano y hexanos (2x) produjo un polvo blanco fino. Después de una trituración del doble con varios mi de hexano, el Ejemplo 1 se recolecta en un filtro y se seca bajo alto vacío: 0.411 g, 95%, amorfo.

Análisis calculado para C27, H30Cl2N4O9: C, 51.85, H, 4.83, N, 8.46. Encontrado C, 51.66; H, 5.14; N, 8.51. Siguiendo el procedimiento descrito en el Esquema 1 y por analogía con el Ejemplo 1, se prepararon los siguientes compuestos . Ejemplo 2 Acido N-benciloxicarbonil-L-valina-L-alanina-azaaspártico bromometilcetona Anal. cale, para C20 HtfBrNMOT^r^O: C, 46.29; H, 5.32; N, 10.80. Encontrado: C,46.6, Ht 5.50; N, 10.45.

Example 3 Acido N-benclloxicarbonll-L-valIna-L-alanlna-azaaspártico 4(3-feniptetronlloximet¡lcetona Anal. cale, para C3?H34N4O?o'1 H2?: C, 57.32; H, 5.77; N, 8.91. Encontrado: C, 7.28; H, 5.67; N, 9.02.

Ejemplo 4 Acido N-benciloxicarbonil-L-valina-L-alanina-azaaspártico 5-^1 -fenil-3-thfluoro- metilipirazoloximetil cetona Anal. cale. araC3?H.33F3N6?ß-0.5 H2O: C, 53.65; H, 5.10; N, 12.51. Encontrado: C, 3.94; H, 5.17; N, 12.24.

Ejemplo 5 Acido N-benciloxicarbonil-L-valina-L-alanina-azaaspártico difenilfosfiniloximetil cetona Anal. cale, para C32H37N4O9PO.25 H20: C, 58.49; H, 5.75; N, 8.53. Encontrado: C, 58.23; H, 5.87; N, 8.41.

Ejemplo 6 Acido N-benciloxicarbonil- -valina-L-alanina-azaaspártico clorometil cetona espectro de masa m/z = 471 (M+H} Ejemplo 7 Acido N-(2,6-Dicloro nzoil)-azaaspártico clorometil cetona espectro de masa m/z - 336 (M+H) Prueba In Vitro Velocidades de segundo orden para la inactivación se obtuvieron utilizando el ensayo de la enzima descrito en Dolle, R.E. et al., J. Med. Chem. 37, 563 (1994). Los compuestos en los Ejemplo 1-7 poseen inhibición de la IL-lß proteasa (kobs/1 fueron >5,000 M-1 s"1) . In Vitro La inhibición in vitro (IC50) se determinó como sigue : Los monocitos humanos se aislaron de unidades de leucoféresis heparinizadas obtenidas de Biological Specialty Coporation (Lansdale, PA) . Los monocitos se purificaron por centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) y más del 95% de poblaciones de monocitos puros obtenidos por decantación centrífuga. El ensayo se realiza en muestras por duplicado de monocitos humanos recién aislados, cultivados en suspensión a 37°C y se hacen girar suavemente en tubos de polipropileno de fondo cónico (Sardstedt Inc. Princeton, NJ) . Los monocitos humanos a una concentración de 5 x 10^ células/ml se resuspendieron en 1 mi de RPMI 1640 (un amortiguador de tejido común de M.A. Bioproducts, alkersville, MD) que contiene 1% de suero de ternera fetal (FCS) (HyClone, Logan, UT) y 50 µg/ml de gentamicina (Gibco, Grarid Island, NY) . La célula se trata ya sea con un compuesto de la invención (es decir, compuesto de prueba) o con un no inhibidor (compuesto control, típicamente DMSO al 0.03%) durante 15 minutos y luego se activa con Staphylococcus aureus fijados al 0.01% (The Enzyme Center, Malden, MA) durante 1 hora. Entonces las células se centrifugan y resuspenden en 1 mi de cisteína, medios RPMI sin metionina que contienen FCS dializado al 1% (Hyclone) . Las células se pretratan con un compuesto de prueba o compuesto control durante 15 minutos, después de lo cual S. aureus fijados al 0.01% más 100 µCi de la marca Tran 35-S (ICN, Irvine, CA) se agregan y las células se incuban a 37°C durante 1 hora. Después de la incubación, las células se centrifugan, se lavan una vez en solución salina amortiguada con fosfato y se resuspenden en RPMI de 1 mi que contienen 1% de suero de ternera fetal. Entonces las células se pretratan nuevamente con un compuesto de prueba o control durante 15 minutos y luego 0.01% de S. aureus durante 2 horas. Al final de la incubación, las células se centrifugan y los sobrenadantes se guardan para la inmunoprecipitación. Las células se lavan una vez en solución salina amortiguada con fosfato y luego se lisa en RIPA, amortiguador de medios de células continuas que contienen fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2mM, yodoacetato 10 MM, 1 µg/ml de pepstatina A, 1 µg/ml de leupeptina y 0.5 TIU de aprotinina. Para las inmunoprecipitaciones, un volumen igual de 1% de leche seca en amortiguador RIPA más 50 µL de la proteína A sefarose CL-4B resuspendida (Pharmacia, Piscataway, New York) se agregan a los sobrenadantes y 1 mi de leche seca al 4% que contienen proteína A sefarose CL-4B a los lisados celulares y las muestras se hacen girar durante 30 minutos a 4°C. Las cuentas se centrifugan, las muestras se transfieren a tubos recién preparados y se incuban durante la noche con 40 µg de anticuerpo policlonal y IL-lß antihumano, de conejo (Genzyme, Carbridge, MA) . Las proteínas IL-ß se precipitan entonces con 70 µl de proteína A sefarose, se resuspende en 60µl del amortiguador de muestra SDS y se corre en geles SGD-PAGE al 15%. La autorradiografía se realizó en geles secos y la cantidad de radioactividad (cuentas por minuto, cpm) se cuantificó utilizando un analizador Betascope 603. Análisis de los Datos En el ensayo de detección del pulso de monocito, cada parámetro de prueba se corre por duplicado. Los datos se recolectan de la Beta Scope utilizando una computadora personal, luego se transfieren al sistema VAX para el cálculo de la cpm promedio y La desviación estándar de la media. Cuando los compuestos de prueba se evaluaron, el porciento de inhibición de liberación de la IL-lß madura se calcula como sigue : lOOx [1- (célula tratada con estímulo + compuesto de prueba - células sin estimularse) / (células tratadas con el estímulo + compuesto control - células sin estimular) ] Estos valores del % de inhibición se utilizan entonces para calcular el valor CI^Q para cada compuesto. Ya que el ensayo de detección del pulso de monocito humano utiliza células primarias de diferentes donadores, cada compuesto de prueba se corrió en 2-3 experimentos separados, utilizando monocitos de 2-3 donadores diferentes. Para los ejemplos dados en lo anterior, las CI50 in vitro están en el rango de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 10 µM.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de la fórmula (A) o su sal farmacéuticamente aceptable: caracterizado porque: R^ = H o alquilo;
2. R3 = halo. O(CO)0_., arilo, OPOR4R5; donde R4 y R5 = arilo; R6 = H, arilo o aralquilo; R7 = R6, CF3 o CF2CF3; R1 = R6-C0, heteroarilo-CO, heteroalquil-CO o aminoácido . 2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: R2 = H; R3 = 0(C0) arilo; y R1 = R6-C0 o aminoácido donde R6 es aralquilo.
3. 3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: R2 = H R3 = halo; y R1 = R6-CO, heteroaril-CO- o aminoácido donde R6 es aralquilo.
4. 4. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: R2 = H; donde R^ = arilo R7 CF3 ; y R1 = R6_CO O aminoácido.
5. 5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: ácido N-benciloxicarbonil-L-valina-L-alanina-azaaspártico 2 , 6-diclorobenzoiloximetilcetona; ácido N-benciloxicarbonil-L-valina-L-alaniña-azaaspártico bromo-metilcetona; ácido N-benciloxicarbonil-L-valina-L-alanina-azaaspártico 3- (2-fenil) -tetroniloximetilcetona; ácido N-benciloxicarbonil-L-valina-L-alanina-azaaspártico 5- (1-fenil-3-trifluorometil) pirazoloximetilcetona; ácido N-benciloxi-carbonil-L-valina-L-alanina-azaaspártico difenilfosfiniloxi-metil cetona; ácido N-benciloxicarbonil-L-valina-L-alanina-azaaspártico clorometilcetona; y ácido N- (2 , 6-dicloro-benzoil) azaaspártico clorometilcetona .
6. 6. Una composición farmacéutica para inhibir la interleucina-lß proteasa, caracterizada porque comprende un compuesto de la fórmula (A) de conformidad con la reivindicación 1 en un portador farmacéuticamente aceptable.
7. 7. Una composición farmacéutica para inhibir la interleucina-lß proteasa, caracterizada porque comprende el compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-5.
8. 8. Un método para inhibir la actividad de la interleucina-lß proteasa en un mamífero que necesita del tratamiento para enfermedades inflamatorias y basadas en el sistema inmune, del pulmón, sistema nervioso central y tejido colectivo, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad inhibidora de la interleucina-lß efectiva de una composición, que comprende un compuesto de la fórmula (A) o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. en la que R2 = H o alquilo ; R3 = halo, O(CO)0.., arilo, OPOR4R5; donde R4 y R5 = arilo; R6 = H, arilo o aralquilo; R7 = R6, CF3 o CF2CF3; R1 = R6-CO, heteroaril-CO, heteroaralquil-CO o aminoácido .
9. 9. Un método para inhibir la actividad de la interleucina-lß proteasa en un mamífero que necesita del tratamiento para enfermedades inflamatorias y basadas en el sistema inmune, del pulmón, sistema nervioso central o tejido colectivo, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad inhibidora de la interleucina-lß efectiva de una composición que comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-5.