MXPA96005048A - Gonadotropinas con puentes de disulfuros nonativos - Google Patents
Gonadotropinas con puentes de disulfuros nonativosInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a las gonadotropinas que consisten en una subunidad y una subunidad, comprendiendo dichas gonadotropinas puentes de disulfuro no nativos, de preferencia puentes de disulfuro entre subunidades no nativos. Las gonadotropinas de acuerdo con la invención tienen una estabilidad mejorada. La presente invención además considera composiciones farmacéuticas que comprenden dichas gonadotropinas.
Description
GONADOTROPINAS CON PUENTES DE DISULFUROS NO NATIVOS
La invención se refiere a las gonadotropinas , a las composiciones farmacéuticas que comprenden dichas gonadotropinas y al ADN que codifica dichas gonadotropinas. Las gonadatropinas forman una familia de hormonas de glucoproteína relacionadas estructuralmente . Los miembros típicos incluyen la gonadotropina coriónica (CG) , la hormona folículo estimulante (FSH) , la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante de la tiroides (TSH) . La hormona folículo estimulante, la hormona luteinizante, y la hormona estimulante de la tiroides están presentes en la mayoría de las especies de vertebrados y se sintetizan y secretan mediante la pituitaria. La gonadotropina corióniea hasta ahora sólo se ha encontrado en primates, incluyendo humanos, y en caballos y se sintetiza mediante el tejido placentario. Las gonadotopinas son heterodímeros compuestos por dos subunidades diferentes, nombradas a y ß, las cuales se asocian mediante enlaces no covalentes. Dentro de una especie, la subunidad OÍ es esencialmente idéntica para cada miembro de la familia de las gonadotropinas, y también se conserva mucho de especie a especie. Las subunidades ß son diferentes para cada miembro, o sea hormona gonadotropina coriónica, hormona folículo estimulante, hormona estimulante de la tiroides y hormona luteinizante, pero muestran una homología considerable en la estructura. Además, también las subunidades 6 se conservan mucho de especie a especie. En los humanos, la subunidad . consiste en 92 residuos de aminoácidos, mientras que la subunidad ß varía en tamaño para cada miembro: 111 residuos en la hormona folículo estimulante, 121 residuos en la hormona luteinizante, 118 residuos en la hormona estimulante de la tiroides y 145 residuos en la hormona gonadotropina coriónica (Combarnous, Y. (1992) , Endocrine Reviews, 11 670-691, Lustbader, J.W. y colaboradores (1993, Endocrine Reviews, 14, 291-311) . La subunidad ß de la gonadotropina coriónica es sustancialmente más grande que las otras unidades ß porque contiene aproximadamente 34 aminoácidos adicionales en la C-terminal, a la que se hace referencia en la presente como la proteína terminal carboxi (CTP) . Las dos subunidades del heterodímero exhiben muchos enlaces disulfuro intrasubunidad conservados: cinco puentes de disulfuro en la subunidad . y seis puentes disulfuro en la subunidad ß. Los residuos de cisteína correspo dientes se conservan completamente entre todos los miembros de la familia de gonadotropinas . La estructura de la gonadotropina coriónica recientemente obtenida por rayos X muestra que estos enlaces de disulfuro se incluyen en patrones de tres dimensiones típicos llamados nudos de disulfuros. Las gonadotropinas poseen tres o cuatro residuos de asparagina que pueden ser N-glucosilados . Además, el péptido C- erminal (proteína terminal carboxi) de la hormona gonadotropina coriónica puede ser 0-glucosilado en cuatro posiciones de serina. Las gonadotropinas sirven a funciones importantes en una variedad de funciones corporales incluyendo metabolismo, regulación de la temperatura y el proceso reproductor. La gonadotropina hormona folículo estimulante hipofisiaria, por ejemplo, juega un papel de pivote en la estimulación del desarrollo y la maduración de los folículos, mientras que la hormona luteinizante induce la ovulación
(Sharp, R. M. (1990), Clin. Endocrinol . , 33, 787, 807;
Dorrington y Armstrong (1979), Recent. Prog. Hor . Res., 35,
301-342). De manera general, la hormona folículo estimulante se aplica clínicamente, ya sea sola o en combinación con la actividad de la hormona luteinizante, para la estimulación ovárica, o sea, la hiperestimulación ovárica para la fertilización in vi tro y la inducción de la ovulación en vivo en mujeres anovuladoras infértiles (Insler, V. (1988), Int. J. Fertility, 3_3, 85-97, Navot y Rosenwaks (1988), J. ' Vitro Fert . Embryo Transfer, 5, 3-13) , así como para el hipogonadismo masculino. A la fecha, las gonadotropinas destinadas para fines terapéuticos se aislan de fuentes de orina humana y son de muy poca pureza (Morse y colaboradores (1988), Amer. J. Reproduc . Immunol . and Microbiology, 11, 143). En contraste a estas gonadotropinas urinarias, las gonadotropinas recombinantes ofrecen grandes ventajas porque éstas , tienen una calidad constante, o sea, tienen propiedades bioquímicas y biológicas reproducibles . Se prepararon clonas de ADN genómico y codificador para todas las subunidades y se resolvió su estructura primaria. Más aún, se transfectaron células de ovario de hámster china (CHO) con genes de subunidades de gonadotropina humana y se demostró que estas células son capaces de secretar dímeros intactos (por ejemplo, Keene y colaboradores (1989), J. Biol . Chem. , 264, 4769-4775; Van Wezenbeek y colaboradores (1990) , en From Clone to Clinic (eds .Crommelin D.J.A. y Schellekens H.)( 245-251). Desde entonces, se ha demostrado que las características bioquímicas y biológicas de, por ejemplo, la hormona folículo estimulante recombinante son casi idénticas a las de la hormona folículo estimulante natural (Mannaerts y colaboradores (1991), Endocrinology, 129. 2623-2630). Más aún, se lograron embarazos después de la superovulación ovárica controlada usando hormona folículo estimulante recombinante . (Germond y colaboradores (1992), Lancet, 339, 1170, Devroey y colaboradores (1992) , Lancet, 339, 1170-1171) . El ensamblaje adecuado de dos subunidades en el dímero es un requisito previo absoluto para la actividad biológica del dímero. La disociación del heterodímero en las subunidades correspondientes se considera el evento principal en la pérdida de la bioactividad en vivo. Además, los procesos tales como la disociación y desamidación conducen a una vida en estante reducida. Por lo tanto, la estabilidad termodinámica del heterodímero se considera que es un factor importante que afecta la vida media de las gonadotropinas bajo condiciones tanto en vivo como in vi tro . Por consiguiente, hay una necesidad clínica de mejoras adicionales en la estabilidad de las gonadotropinas . La presente invención considera dichas gonadotropinas. Se encontró de manera sorprendente que se podrían introducir uno o más puentes de disulfuro no nativo dentro de las gonadotropinas, dando como resultado una estabilidad aumentada de las gonadotropinas. Los puentes de disulfuro no nativos, como se describen en la presente, son puentes de disulfuros que no ocurren en las gonadotropinas nativas, por consiguiente, los puentes de disulfuro no nativos no abarcan los cinco puentes de disulfuros en la subunidad OÍ ni los seis puentes de disulfuro en la subunidad ß que están presentes en las gonadotropinas nativas. Las gonadotropinas "nativas" son las gonadotropinas que tienen la misma secuencia de aminoácidos que las gonadotropinas aisladas de un tejido relevante . Así, la presente invención considera las gonadotropinas que consisten en una subunidad OÍ y una subunidad ß que comprenden uno o más puentes de disulfuro no nativos. Se pueden introducir puentes de disulfuro no nativos mediante mutagénesis dirigida a un sitio: mutación puntual del residuo de aminoácido nativo en la posición relevante dentro de una cisteína. La mutación puntual se denota como X \y Cys ó X ßy Cys en donde X es el residuo de aminoácido en la posición relevante "y" de la subunidad a ó ß, respectivamente, mutada dentro de la cisteína (se usa el código de tres letras para los aminoácidos) . Las notaciones Cys ay Cys ó Cys ßy Cys se refieren a las posiciones "y" de las cisteínas en la subunidad nativa. Las mutaciones puntuales, de acuerdo con la invención, conducen a cambios sutiles en la conformación de las gonadotropinas . El alcance de la invención también incorpora gonadotropinas en las que sólo se ha introducido una mutación. Una mutación de este tipo se puede introducir en el ADN que codifica a la subunidad OÍ Ó ß, dando como resultado un nuevo residuo de cisteína capaz de formar un puente de disulfuro con un residuo de cisteína ya existente. Una mutación de este tipo de preferencia se introduce en una subunidad a, más preferiblemente, en las posiciones de los aminoácidos 88-92. Los puentes de disulfuro no nativos de acuerdo con la invención pueden estar presentes entre pares de residuos de aminoácidos en donde los residuos de aminoácidos están colocados en diferentes subunidades (entre subunidades) .
Adicionalmente, los puentes de disulfuro no nativos pueden también estar presentes entre pares de residuos de aminoácidos en los cuales ambos residuos de aminoácidos están colocados en la misma subunidad (intrasubunidad) . Opcionalmente, como resultado de la presencia de uno o más puentes de disulfuro no nativos de acuerdo con la invención, se pueden suprimir uno o más de los once puentes de disulfuro nativos. Los puentes de disulfuro no nativos de acuerdo con la invención evitan la disociación del dímero dando como resultado mayores bioestabilidades in vi tro y en vivo y mejoran la vida en anaquel con relación a las glucoproteínas nativas. Además, disminuyen la flexibilidad de la estructura central del polipéptido de las gonadotropinas, haciendo de este modo que estas gonadotropinas sean menos susceptibles a. la desamidación. La desamidación es un proceso espontáneo que ocurre bajo condiciones fisiológicas y que afecta la pureza y la estabilidad de la proteína de una forma negativa. Las gonadotropinas en las cuales está presente una combinación de puentes de disulfuro intra y entre" subunidades no nativos también están en el alcance de la invención. Las gonadotropinas adecuadas de acuerdo con la invención, en las cuales la subunidad a es de origen humano, comprenden un puente de disulfuro intra-subunidad no nativo entre uno o más de los pares de aminoácidos (Phe al8 Cys - lie a25 Cys) , (Gln «20 Cys - Ala a23 Cys) , (Ser a34 Cys - Ser a57 Cys) , (Thr «39 Cys - Thr «54 Cys) , (Ala a62 Cys - His «79 Cys) , y (Lys a63 Cys - Ala a81 Cys) , (Tyr «65 Cys - His a79 Cys) , y (Asn a66 Cys - Asn «78 Cys) . Las gonadotropinas adecuadas de acuerdo con la presente invención, en las cuales la subunidad ß es la subunidad ß de la hormona gonadotropina coriónica, pueden comprender un puente de disulfuro entre-subunidades entre uno o más de los pares de aminoácidos (Gln «5 Cys - Arg ß8 Cys) , (Pro «24 Cys - Gly ß71 Cys) , (Met «29 Cys - Met ß41 Cys) , (Arg «35 Cys - Ala ß35 Cys), (Tyr «37 Cys - He ß33 Cys), (Lys «51 Cys - Asp ß99 Cys) , y (His «90 Cys - Cys ßy Cys) , y/o un puente de disulfuro intrasubunidad entre uno o más de los pares de aminoácidos (Pro ß4 Cys - Pro ß7 Cys) . (Pro ßll Cys - Thr ß32 Cys), (Pro ßll Cys - Ala S85 Cys), (Thr ß32 Cys -. Ala ß85 Cys) , (Arg ß60 Cys - Ser ß87 Cys) , (Arg ß60 Cys - Gln ß89 Cys) , (Asp S61 Cys - Leu ß86 Cys) , (Asp 1561 Cys - Ser ß87 Cys) , (Ser ß66 Cys - Ser S81 Cys) y (Leu ß69 Cys - Pro ß78 Cys) . De preferencia, la hormona gonadotropina coriónica de acuerdo con la invención, comprende un puente de disulfuro no nativo entre subunidades entre los pares de aminoácidos (Met a29 Cys - Met ß41 Cys) , (Tyr «37 Cys - He ß33 Cys) , ó (Lys «51 Cys - Asp ß99 Cys) ó (His a90 Cys - Cys ßy Cys) . Las gonadotropinas adecuadas de acuerdo con la invención, en las cuales la subunidad ß es la subunidad ß de la hormona luteinizante comprenden un puente de disulfuro entre subunidades entre uno o más de los pares de aminoácidos (Gln «5 Cys - Trp ß8 Cys) , (Pro a24 Cys - Gly ß71 Cys) , (Met a29 Cys - Met S41 Cys) , (Arg a35 Cys - Ala ß35 Cys) , (Tyr «37 Cys - He ß33 Cys) , (Lys a51 Cys - Asp ß99 Cys) y (His «90 Cys - Cys ßy Cys) y/o un puente de disulfuro intrasubunidad entre uno o más de los pares de aminoácidos (Pro ß4 Cys - Pro ß7 Cys) , (Pro ßll Cys - Thr ß32 Cys) , (Pro ßll Cys - Ala ß85 Cys) , (Thr ß32 Cys - Ala ß85 Cys) , (Arg ß60 Cys - Ser ß87 Cys) , (Arg ß60 Cys - Arg ß89 Cys) , (Asp S61 Cys - Leu ß86 Cys) , (Asp S61 Cys - Ser ß87 Cys) , (Ser ß66 Cys - Ser S81 Cys) y (Leu ß69 Cys - Pro ß78 Cys) . Una gonadotropina preferida de acuerdo con la invención es la hormona luteinizante que comprende un puente de disulfuro entre los pares de aminoácidos (Met «29 Cys - Met ß41 Cys) , (Tyr a37 Cys - He ß33 Cys) , (Lys «51 Cys - Asp ß99 Cys) ó (His a90 Cys - Cys ßy Cys) . Las gonadotropinas adecuadas de acuerdo con la invención, en las cuales la subunidad ß es la subunidad ß de la hormona folículo estimulante, comprenden un puente de disulfuro entre subunidades entre uno o más de los pares de aminoácidos (Gln a5 Cys - Ser ß2 Cys) , (Pro «24 Cys - Gly ß65 Cys) , (Met «29 Cys - Arg ß35 Cys) , (Arg a35 Cys - Ala ß29 Cys) , (Tyr «37 Cys - Trp ß27 Cys) , (Lys «51 Cys - Asp ß93 Cys) y (His «90 Cys - Cys ßy Cys) y/o un puente de disulfuro intrasubunidad entre uno o más de los pares de aminoácidos (Leu ß5 Cys - Thr ß26 Cys) , (Leu 5 Cys - Ala ß79 Cys) , (Thr ß26 Cys - Ala ß79 Cys) , (Lys ß54 Cys - Gln S81 Cys ) , (Lys ß54 Cys - His ß83 Cys) , (Glu ß55 Cys - Thr ß80 Cys) , (Glu ß55 Cys
- Gln S81 Cys) , (Thr ß60 Cys - Thr ß75 Cys) y (Val ß63 Cys -Ser ß72 Cys) . Una gonadotropina preferida de acuerdo con la invención es la hormona folículo estimulante en la cual la subunidad ß comprende un puente de disulfuro entre subunidades entre el par de aminoácidos (Tyr a37 cys - Trp ß27 Cys) ó (His «90 Cys - Cys ßy Cys) . Las gonadotropinas adecuadas de acuerdo con la invención, en las cuales la subunidad ß es la subunidad ß de la hormona estimulante de la tiroides, comprenden un puente de disulfuro entre subunidades entre uno o más de los pares de aminoácidos (Gln a5 Cys - Phe ßl Cys)_, (Pro «24 Cys - Gly ß66 Cys) , (Met «29 Cys - Arg ß34 Cys) , (Arg a35 Cys - Ala ß28
Cys) , (Tyr «37 Cys - He ß26 Cys), (Lys «51 Cys - Asp ß94 Cys) y (His a90 Cys - Cys ßy Cys) y/o un puente de disulfuro intrasubunidad entre uno o más de los pares de aminoácidos
(Pro ß4 Cys - Thr ß25 Cys) , (Pro ß4 Cys - Ala ß80 Cys) , (Thr ß25 Cys - Ala ß80 Cys) , (Arg ß55 Cys - Ser ß82 Cys) , (Arg ß55 Cys - Lys ß84 Cys), (Asp ß56 Cys - Leu JS81 Cys), (Asp ß56 Cys
- Ser ß82 Cys), (Thr ß61 Cys - Ser ß76 Cys) y (He ß64 Cys -Pro ß73 Cys) . Estará claro que esta invención también abarca las combinaciones de puentes de disulfuro no nativos inter e intra subunidades . Las posiciones de la mutación como se presentaron anteriormente se refieren a la secuencia de aminoácidos de las gonadotropinas humanas. Los puentes de disulfuro no nativos comparables dentro de las subunidades de las gonadotropinas de otras especies también quedan dentro del alcance de la invención. La posición exacta de los residuos de aminoácidos que se van a mutar en una cisteína se pueden derivar de la alineación de la secuencia de las subunidades de la gonadotropina con las subunidades de gonadotropina humana. Debido al papel principal que juega el enlace de disulfuro durante el doblamiento y el ensamble de la subunidad, es muy sorprendente que la introducción de los puentes de disulfuro no nativos de acuerdo con la invención no interfieran con la formación de gonadotropinas duplicadas apropiadamente. La formación de enlaces de disulfuro adecuados es un evento crítico en la duplicación y maduración de las gonadotropinas funcionales. Especialmente, la formación del enlace de disulfuro en la subunidad ß es crítica: se requieren todos los enlaces de disulfuro para la combinación y duplicación eficientes. Los estudios detallados del doblamiento de la gonadotropina coriónica revelaron que el doblamiento de la molécula no procede mediante una trayectoria de secuencia simple, sino procede independientemente en diferentes dominios de la molécula. Fue por esto que se pensó que la introducción de residuos de cisteína adicionales en las subunidades a y/o ß perturbaría el proceso de doblamiento dando como resultado una pérdida de conformación de la molécula y en consecuencia de lo mismo, pérdida de funcionalidad y bioactividad de la molécula. Especialmente, ya que muchas cisteínas ya están presentes en estas moléculas. Las mutaciones puntuales en las cisteínas de acuerdo con la invención sólo cambian marginalmente la composición global de los aminoácidos y las características de la proteína, así, las gonadotropinas de acuerdo con la invención tienen la ventaja adicional de que su inmunogénesis potencial no diferirá sustancialmente de la inmunogénesis de las gonadotropinas de tipo natural. Especialmente, cuando los puentes de disulfuro no nativos se colocan en la interfaz de dímero de las gonadotropinas, el efecto sobre su inmunogénesis será insignificante. Las gonadotropinas de acuerdo con la invención pueden ser agonistas o antagonistas, dependiendo del sitio de la mutación. Como ya se mencionó antes, el sitio de la mutación puede conducir a cambios sutiles en la conformación de la molécula. Si el sitio de la mutación se selecciona en partes de la proteína que están asociadas con el enlace del receptor y/o la transducción de la señal, los puentes de disulfuro no nativos de acuerdo con la invención pueden conducir a una pérdida parcial o completa de la actividad de transducción de señal en combinación con estabilidades aumentadas de las glucoproteínas. Así, la presente invención considera los antagonistas con estabilidades aumentadas. Si el sitio de la mutación se selecciona en la interfaz de dímero del núcleo interno de la glucoproteína, los puentes de disulfuro no nativos resultantes no efectuarán el enlace receptor y/o la actividad de transducción de la señal, pero conducirán a estabilidades aumentadas con relación a las gonadotropinas nativas. Esas mutaciones darán como resultado agonistas de gonadotropina con estabilidades aumentadas. Las gonadotropinas de acuerdo con la invención pueden comprender otra modificación conocida generalmente en la técnica. En una de las modificaciones preferidas de las gonadotropinas de acuerdo con la invención, el C-término de la secuencia de aminoácidos de una de las subunidades se enlaza, opcionalmente por medio de una porción de enlace, al N-término de la secuencia de aminoácidos de la otra subunidad. De preferencia la porción de enlace es una unidad proteína terminal carboxi completa o parcial o una variante de la misma. Otra modificación de las gonadotropinas de acuerdo con la invención, puede ser una extensión de la subunidad « y/o ß a su respectivo término N ó C con una unidad completa o parcial de proteína terminal carboxi o una variante de la misma. La extensión puede comprender las respectivas unidades de proteína terminal carboxi en formas sencilla o múltiple. De manera alternativa, una unidad de proteína terminal carboxi completa o parcial o múltiples formas de la misma se pueden insertar en el término N o C de dichas subunidades . Además, las gonadotropinas de acuerdo con la invención pueden ser ya sea glucosiladas, parcialmente glucosiladas o no glucosiladas. Las gonadotropinas parcialmente o no glucosiladas de acuerdo con la invención se pueden obtener ya sea por medio de modificación química, modificación enzimática o mediante mutagénesis dirigida a un sitio mediante lo cual se remueven uno o más de los sitios de reconocimiento de la glucosilación en las gonadotropinas. De manera alternativa, el patrón de glucosilación de las gonadotropinas de acuerdo con la invención se puede modificar mediante la introducción de sitios de reconocimiento de glucosilación adicionales y, opcionalmente, la remoción de uno o más sitios de reconocimiento de glucosilación, dando como resultado una glucosilación modificada de dichas gonadotropinas. Un sitio de reconocimiento de glucosilación como se emplea en la presente consiste en la secuencia de aminoácidos Asn-X-Ser/Thr, en donde X puede ser cualquier aminoácido. Como se emplea en la presente, las subunidades « y ß de gonadotropina coriónica, la hormona folículo estimulante, la hormona luteinizante y la hormona estimulante de la tiroides, así como las formas heterodiméricas tienen en general sus definiciones convencionales y se refieren a las proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos conocidas en la técnica por sí mismas, o las variantes alélicas de las mismas, independientemente del patrón de glucosilación exhibido. Formas "nativas" de estas proteínas son aquellas proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos como se aislan del tejido relevante del vertebrado, y tienen esas secuencias conocidas por sí, o las variantes alélicas de las mismas . Estas "variantes" son aquellas proteínas que tienen alteraciones deliberadas en las secuencias de los aminoácidos con relación a las proteínas nativas. Las alteraciones pueden incluir supresiones, inserciones, sustituciones y combinaciones de las mismas sencillas o múltiples, producidas por, por ejemplo, mutagénesis específica de sitio o mediante otras manipulaciones recombinantes, o se pueden preparar sintéticamente. De preferencia estas alteraciones consisten en sustituciones de aminoácidos conservadoras, en las cuales el residuo sustituido es de la misma categoría de aminoácidos generales que aquélla para la cual se hace la sustitución. Esa clasificación de los aminoácidos se conoce generalmente en la técnica y la describen, por ejemplo, Dayhoff, M. y colaboradores, Atlas of Protein Sequences and Structure, 1972, 5, 89-99. Como se emplea en la presente, la "unidad de proteína terminal carboxi" se refiere a la secuencia de aminoácidos encontrada en el término carboxi de la subunidad ß de la hormona gonadotropina coriónica que se extiende desde los aminoácidos 112-118 hasta el residuo 145 en el C-término o a una porción del mismo. Una unidad de proteína terminal carboxi "completa" contiene 28-34 aminoácidos, dependiendo del N-término de la proteína terminal carboxi. Una unidad de proteína terminal carboxi "parcial" es una secuencia de aminoácidos que ocurre entre las posiciones 112-118 hasta 145 inclusive, pero la cual tiene cuando menos un aminoácido suprimido a partir de la unidad de proteína terminal carboxi completa más corta posible (aminoácidos 118-145) . Las unidades de proteína terminal carboxi "múltiples" se entiende que abarcan arreglos de dos, una tras otra, de la unidad de proteína terminal carboxi completa o de la unidad de proteína terminal carboxi parcial o combinaciones de ambas. El ADN que codifica cualquiera de las gonadotropinas de acuerdo con la invención también está dentro del alcance de la invención. Ese ADN de acuerdo con la invención comprende uno o más codones que codifican cisteína que se sustituyeron por los codones que codifican el aminoácido que se va a reemplazar. El ADN de acuerdo con la invención se puede obtener a partir del ADN que codifica las gonadotropinas nativas o variantes de las mismas mediante la sustitución en dicho ADN de uno o más codones que codifican el residuo de aminoácido que se va a reemplazar con un codón que codifica cisteína. Las sustituciones se pueden realizar mediante mutagénesis dirigida al sitio. Los métodos para construir las gonadotropinas de acuerdo con la invención son muy conocidos en la técnica (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, última edición) . La forma de aproximación más práctica es producir estas gonadotropinas mediante la expresión del ADN que codifica la proteína deseada. Todas las técnicas para la mutagénesis dirigida, la ligadura de- secuencias adicionales, la reacción de cadena de polimerasa, y la construcción de sistemas de expresión adecuados son, hasta ahora, muy conocidos en la técnica. Las porciones de todo el ADN que codifica la proteína deseada se pueden construir sintéticamente usando técnicas en fase sólida estándar, preferiblemente para incluir sitios de restricción para facilitar la ligadura. Se pueden proporcionar al ADN que codifica las secuencias, elementos de control adecuados para la transcripción y la traducción de la secuencia codificadora incluida. Como se sabe bien, los sistemas de expresión que ahora están disponibles son compatibles con una amplia variedad de huéspedes, incluyendo huéspedes procarióticos tales como bacterias y huéspedes eucarióticos tales como levadura, células vegetales, células de insectos, células de mamíferos, células de aves y similares. La elección del huésped es dependiente particularmente de eventos posteriores a la traducción, más particularmente de la glucosilación. La posición de la glucosilación se controla más por la naturaleza del sitio de la glucosilación dentro de la molécula. Sin embargo, la naturaleza de los azúcares que ocupan este sitio se controla mucho por la naturaleza del huésped. Las gonadotropinas de acuerdo con la invención se pueden usar para los mismos propósitos clínicos que las gonadotropinas nativas, con la ventaja de que exhiben una estabilidad mejorada. Las gonadotropinas mutadas se pueden usar como agonistas o antagonistas dependiendo del tipo de mutación. Las composiciones farmacéuticas adecuadas de acuerdo con la invención comprenden una o más de las gonadotropinas de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son muy conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, solución salina estéril ,, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrina, agar, pectina, aceite de cacahuate, aceite de oliva, aceite de ajonjolí y agua. Además, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede comprender uno o más estabilizantes tales como, por ejemplo, carbohidratos incluyendo sorbitol, manitol, almidón, sacaro dextrina y glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína, y reguladores como fosfatos alcalinos. Las rutas de administración adecuadas son inyecciones intramusculares, inyecciones subcutáneas, inyecciones intravenosas o inyecciones intraperitoneales, administración oral e intranasal. Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención y de ninguna manera se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención. LEYENDAS PARA LAS FIGURAS FIGURA 1: Organización estructural del pMKS .hCGacßc, plásmido de expresión de la hCGa ßc . SV40 = promotor temprano del Sv40. E = realzador de M-MuLV. MT-IIA = promotor de metalotioneína-IIA humana. hCG«g = hCG« genómico codificador del mini gen para la subunidad hCGa. hCGßc =codificador ADNc para la subunidad hCG6. ß-globina = secuencia de poliadenilación y señales de empalme de ß-globina. de conejo. S = secuencia de terminación de transcripción de SV40. pBR327 = parte del plásmido pBR327 que contiene el origen de la replicación de E. coli y el gen que confiere resistencia a la ampicilina. FIGURA 2 : Análisis de la mancha Western de los sobrenadantes del cultivo de células a partir de la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica, intercadena 2 de la hormona gonadotropina coriónica y el tipo natural de hormona gonadotropina coriónica para la expresión de la hormona gonadotropina coriónica ( uteínas) y formación de los puentes de disulfuro entre subunidades. Sobrenadantes de cultivos de células a partir de combinaciones de transfección resistentes a G418 intercadena 1 de hormona gonadotropina coriónica, intercadena 2 de hormona gonadotropina coriónica y del tipo natural que contiene aproximadamente 0.2 unidades internacionales de hormona gonadotropina coriónica se solubilizaron a temperatura ambiente (Panel A) o a 100°C (Paneles B y C) en regulador de muestra que contiene SDS en ausencia (Paneles A y B) o presencia de 6 mercapto etanol (PaneL C) . En seguida de la electroforesis y transferencia a membranas de PVDF la hormona gonadotropina coriónica se visualizó mediante incubación con un anticuerpo monoclonal específico para la 6-hCG seguida por la incubación con un segundo anticuerpo conjugado HRP y teñido con TMB. Como se puede ver en la solubilización a temperatura ambiente (Panel A, los carriles 1 y 2) y a 100°C (Panel B carriles 1 y 2) ambos dieron como resultado la detección de hormona intacta mientras que en el control (hormona gonadotropina coriónica tipo natural) la ebullición disocia la hormona en sus subunidades (Panel B carril 3) . La adición del agente reductor da como resultado la disociación en subunidades en las tres muestras (Panel C) . Los datos combinados así llevan a la conclusión de que ambas intercadenas de 1 y 2 de la hormona gonadotropina coriónica se estabilizan mediante un puente disulfuro intermolecular. FIGURA 3 : Prueba de desplazamiento de la hormona gonadotropina coriónica de las muteínas entre subunidades de la hormona gonadotropina coriónica. B/B0 = por ciento de la ligadura total... -+-= hormona gonadotropina coriónica tipo natural ( T) -?- = hormona gonadotropina coriónica intercadena 1. -o- = hormona gonadotropina coriónica intercadena 2. FIGURA 4: Bioactividad in vitro de las muteínas itersubunidades de la hormona gonadotropina coriónica. -+- = I.S 75/537. -?- = hormona gonadotropina coriónica intercadena 1. -o-= hormona gonadotropina coriónica intercadena 2. FIGURA 5 : Niveles de la hormona gonadotropina coriónica en el plasma después de la inyección intramuscular de preparaciones de hormona gonadotropina coriónica recombinante en perras sabueso . FIGURA 6: Actividad de enlace de mutantes del tipo natural de hormona gonadotropina coriónica y de intercadena hormona gonadotropina coriónica con las membranas de células de ovario de hámster chino que expresan de manera estable el receptor de la hormona luteinizante/ gonadotropina coriónica humanas. Las membranas se incubaron con hormona gonadotropina coriónica 125I-etiquetada en ausencia o presencia de concentraciones variantes de la hormona gonadotropina coriónica tipo natural sin etiquetar o de la intercadena de hormona gonadotropina coriónica. Las curvas de desplazamiento se presentan como el porcentaje de máximo enlace a cada dosis de hormona sin etiquetar. FIGURA 7: Actividad biológica in vi tro de las moléculas de la hormona gonadotropina coriónica del tipo natural y de la hormona gonadotropina coriónica intercadena. Se midió la cAMP extracelular mediante RÍA específico después de la estimulación de las células de ovario de hámster chino que expresan de manera estable el receptor humano de la hormona luteinizante/ gonadotropina coriónica. FIGURA 8 : Actividad enlazadora de los mutantes de la hormona gonadotropina coriónica de tipo natural, hormona luteinizante del tipo natural y la hormona gonadotropina coriónica intercadena con las membranas de las células de ovario de hámster chino que expresan de manera estable el receptor humano de la hormona luteinizante/ gonadotropina coriónica. Las membranas se incubaron con hormona gonadotropina coriónica etiquetada con 125I en ausencia o presencia de concentraciones variantes sin etiquetar de hormona gonadotropina coriónica de tipo natural, hormona luteinizante de tipo natural o las intercadenas de la hormona luteinizante. Se presentan las curvas de desplazamiento como el porcentaje del enlace máximo a cada dosis de hormona sin etiquetar. FIGURA 9 : Actividad de enlace de la hormona folículo estimulante y de los mutantes intercadena de la hormona folículo estimulante con las células de ovario de hámster chino que expresan de manera estable el receptor de la hormona folículo estimulante humana. Las membranas se incubaron con hormona folículo estimulante etiquetada con 125I en ausencia o presencia de concentraciones variantes no etiquetadas de la hormona folículo estimulante de tipo natural o las intercadenas de la hormona folículo estimulante. Se presentan las curvas como el porcentaje del máximo enlace a cada dosis de hormona sin etiquetar. EJEMPLOS -Producción de muteínas intercadena Construcción de vectores Se generaron tres construcciones para expresar las muteínas de la gonadotropina coriónica que contienen un enlace de disulfuro entre cadenas adicional. Su estructura y organización global es esencialmente idéntica a la de pKMS . hCG«gßc , el vector usado para la expresión de la gonadotropina coriónica del tipo natural recombinante en las células ovario de hámster chino (FIGURA 1) . Las respectivas gonadotropina coriónica « (Fiddes, J.C. y Goodman, H.M. (1981), J. Mol. Appl. Genet . 1, 3-18) y los genes de la subunidad ß (Fiddes, J.C. y Goodman, H.M. (1980) Nature 286, 684-687) se insertaron en pKMS . Combinando una clona de ADNc con una clona genómica se preparó un gen de hCG« completo "híbrido (Van Wezenbeek y colaboradores. 1990) capaz de expresar la subunidad « natural con la transfección en una célula huésped. Se aisló el ADNc para la hormona gonadotropina coriónica como se describió y se intercambió con la hormona folículo estimulante ß en el vector pKMS.FSH. Se dirigió la tanscripción del gene a desde el promotor temprano SV40 mientras que el gene ß se transcribió desde el promotor de la metalotioneína Ha inducible de metal pesado humana. Se hicieron tres construcciones de intercadena de gonadotropina coriónica (Tabla I) . Para la construcción de la-mutación de la subunidad a en la intercadena 1 de la gonadotropina coriónica, se introdujeron sustituciones de bases específicas en el gen "híbrido de la gonadotropina coriónica « de tal forma que el codón que codifica la tirosina a37 se cambió a un codón que codifica cisteína. Esto se realizó mediante • mutagénesis específica en el sitio y combinando fragmentos de reacción de cadena de polimerasa que se traslapan en las secuencias como las descritas (Erich, H.A. (1989) PCR Technology; Principies and Applications for DNA amplification. Stockton Press, New York, pp 64-66) , usando condiciones de reacción de cadena de polimerasa estándar. Los fragmentos de reacción de cadena de polimerasa se separaron, se subclonaron en pGEM3Z y se checaron usando un secuenciador Automated (Pharmacia) Los cebadores se seleccionaron de tal modo que el fragmento de reacción de cadena de polimerasa subclonado contenía los sitios de restricción apropiados tanto el 3 ' como el 5 ' de las mutaciones, de modo que se podía intercambiar con la secuencia de la cadena « nativa en el pMKS .hCGacßc . Esto se realizó usando técnicas estándar. Para la construcción de la mutación de la subunidad 6 en la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica, se introdujeron sustituciones de bases específicas hCGß de tal modo que el codón que codifica la isoleucina ß33 se cambió a un codón que codifica cisteína. Las reacciones de cadena de polimerasa mutagénicas, se realizaron subclonación y secuenciamiento usando métodos comparables a los usados para la construcción de la mutación de la subunidad «. Para la construcción del plásmido de expresión final de la intercadena 1 de la gonadotropina coriónica, se intercambió el gen del tipo natural hCGßc con el fragmento ß de la gonadotropina coriónica en la construcción pKMS.hCGaqßc que ya contenía la mutación de la subunidad «. Para la construcción de los vectores que codifican la intercadena 2 de la gonadotropina coriónica (en los cuales los codones que codifican Usina «51 y asparagina ß99 se sustituyeron con los codones que codifican cisteína) se siguió una estrategia comparable.
Tabla I. Los codones de cisteína mutados en la hormona gonadotropina coriónica .
Transfección y selección de las células de ovario de hámster chino. Las células ovario de hámster chino Kl (ATCC CCL61) se transfectaron de manera estable con 10 µg de las construcciones de intercadenas pKMS.hCG usando el reactivo Transfectam (Promega) . Un plásmido de selección que contiene el gen de selección de neomicina se transfectó conjuntamente en una relación molar de 10:1 (exceso de pKMS hCG-entre cadenas) permitiendo la selección de las células en un medio de cultivo que contiene G418 (0.8 miligramos/mililitro). Las células recombinantes de ovario de hámster chino se seleccionaron para la excreción de una proteína inmunorreactiva. Los sobrenadantes del cultivo reaccionaron positivos en una prueba ELISA de emparedado de hormona gonadotropina coriónica usando anticuerpos monoclonales específicos para a y 6. El manchado Western del sobrenadante del cultivo mostró que las muteínas entre cadenas de la hormona gonadotropina coriónica tienen un tamaño de peso molecular comparable al del tipo natural de la hormona gonadotropina coriónica recombinante. Ejemplo 2; Análisis de la formación de disulfuros entre subunidades Con el fin de determinar si las cisteínas introducidas nuevamente se oxidaron en un enlace disulfuro entre subunidades, se disolvieron las muestras de los sobrenadantes de un cultivo celular de combinaciones de transfección resistentes al G418 mediante ebullición en un regulador de muestra que contiene SDS, sometido a electroforesis en gel de SDS poliacrilamida y transferido a una membrana de PVDF: Se visualizó la hormona gonadotropina coriónica usando inmuno-teñido con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la subunidad 6 seguido por la incubación con un segundo anticuerpo conjugado contra peroxidasa de rábano picante (HRP) y teñido con tetrametil bencidina
(TMB) /CO++/H202. Cuando se formó un enlace de disulfuro entre unidades, la ebullición de las muestras en el regulador de muestra de SDS mantendría las dos subunidades juntas mientras que esas condiciones de solubilización causarían la disociación en subunidades en caso de que no se formara el puente de disulfuro. En los experimentos de control, se solubilizaron muestras sin agente reductor a temperatura ambiente (hormona gonadotropina coriónica intacta) y mediante la adición de 6 mercapto etanol (6ME) . En el último caso ocurrirá la desnaturalización en subunidades, independientemente de la presencia del elace disulfuro entre cadenas. Como se puede ver en la FIGURA 2, panel A, la solubilización a temperatura ambiente en ausencia de ßME da como resultado la detección de la hormona gonadotropina coriónica del tipo natural intacta carril 3, masa molecular de aproximadamente 50 kD) así como alguna subunidad 6 libre (masa molecular de aproximadamente 32 kD) . Las muestras de la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica y la intercadena 2 de la hormona gonadotropina coriónica también contienen material inmunorreactivo a aproximadamente los mismos tamaños que indican la presencia de muteína de hormona gonadotropina coriónica intacta. Durante el calentamiento el tipo natural de la hormona gonadotropina coriónica se disocia en subunidades lo que se pone en evidencia mediante la desaparición de la banda de 50 kD (panel B carril 3) . En contraste, esto no parece suceder con los mutantes de la hormona gonadotropina coriónica (panel B, carriles 1 y 2) que indican la presencia de enlace intermolecular, covalente. La adición de ßME finalmente demuestra que el enlace intermolecular entre las dos subunidades se logra mediante un disulfuro ya que la adición de un agente reductor disocia la hormona gonadotropina coriónica y los mutantes en subunidades (panel C) .
Ejemplo 3; Enlace receptor de la hormona luteinizante/ hormona gonadotropina coriónica El enlace para el receptor de la hormona luteinizante/ hormona gonadotropina coriónica es el primer evento en el mecanismo de acción de la hormona gonadotropina coriónica. Se usó una prueba del receptor in vi tro para determinar la potencia relativa de enlace del receptor de las muteínas entre cadenas de la hormona gonadotropina coriónica por medio del desplazamiento de la hormona gonadotropina coriónica yodada a membranas de testículos de rata (Rao, M:C: y colaboradores, Endocrinology (1977) 101:512-523). Con este fin se incubó una cantidad fija de hormona gonadotropina coriónica [1251] con membranas de testículo y cantidades crecientes de muestra a temperatura ambiente durante 18 horas. Se realizaron incubaciones adicionales sin muestra para calcular el enlace máximo. Se determinó el enlace no específico añadiendo un excedente de 1000 veces de ligando no etiquetado (Pregnyl, Organon, West Orange, NJ) . Se terminó la incubación diluyendo las muestras 2 veces con regulador Tris enfriado con hielo complementado con 0.1 por ciento de BSA y centrifugación a temperatura ambiente durante 5 minutos a 150000 x N. kg-1. Después de la aspiración del sobrenadante, se determinó la radioactividad en los granulos usando un contador gama . La intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica muestra una curva de desplazamiento de hormona gonadotropina coriónica yodada comparable a la hormona gonadotropina coriónica recombinante del tipo natural (ver FIGURA 3) . Esto demuestra que el enlace de disulfuro entre subunidades de la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica no tiene efecto sobre el enlace del receptor, indicando que la conformación de esta muteína sin duda es comparable con el tipo natural de la hormona gonadotropina coriónica recombinante. El de la hormona gonadotropina coriónica yodada por la intercadena 2 de la hormona gonadotropina coriónica se disminuye ligeramente. Se supone que esto se debe al hecho de que este puente disulfuro intercadenas se localiza en una área que es importante para el enlace del receptor y la transacción del receptor. Ejemplo 4: Producción de testosterona inducida por la hormona gonado tropina cor i óni ca La hormona gonadotropina coriónica induce la producción de testosterona en las células de ratones Leydig. Una prueba in vitro (Van Damme y colaboradores, Acta Endocrinol . (1974) 77, 655-671) modificada por Mannaerts y colaboradores (Neuroendocrinology of reproduction (1987) , R. Rolland y colaboradores (eds) , Elsevier Science Publishers B.V., 49-58) se usa para determinar la bioactividad de las muteínas de la hormona gonadotropina coriónica que contienen los enlaces de disulfuro intercadena (Figura 4) . El tratamiento de células con la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica dio como resultado incrementos dependientes de la dosis de la producción de testosterona, con la misma potencia que la hormona gonadotropina coriónica recombinante del tipo natural. Por lo tanto, se puede considerar la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica como un agonista completo de la hormona gonadotropina coriónica. En contraste, la capacidad de transducción de señal de la intercadena 2 de la hormona gonadotropina coriónica se redujo a cero, indicando que la intercadena 2 de la hormona gonadotropina coriónica se puede usar como un antagonista completo de la hormona gonadotropina coriónica del tipo natural . Ejemplo 5; Comportamiento farmacocinético en perras sabueso El comportamiento farmacocinético de la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica se probó después de la administración intramuscular a perras sabueso. Dos perras recibieron una sola inyección intramuscular de la intercadena 1 a un nivel de dosis de 25 unidades internacionales/kilogramo (hCG EIA) . Se tomaron muestras de sangre antes de la inyección y a los 30 minutos y l, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240 y 264 horas después de la inyección. Se midieron los niveles de plasma de la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica in unorreactiva con una prueba fluoroinmune resuelta en tiempo específico (hCG-DELFIA) validada para plasma de perro. Las curvas de separación de la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica se muestra en la FIGURA 5. Como comparación también se muestra en la FIGURA 5 la curva de separación de la hormona gonadotropina coriónica (hormona gonadotropina coriónica recombinante; hormona gonadotropina coriónica EIA 25 unidades/kilogramo) después de la administración intramuscular en tres perras. Los parámetros farmacocinéticos AUC (área bajo el nivel del plasma contra la curva de tiempo) , Cmáx (concentración pico) , tmáx (tiempo de la concentración pico) , t^ (vida media de eliminación de suero) y CL (régimen de separación) derivado de las curvas de separación se muestran en la Tabla 2. Se usaron los valores medidos entre los puntos de tiempo entre 144 y 240 horas para determinar la vida media de eliminación del suero. La comparación de la administración intramuscular de la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica con la administración intramuscular de la hormona gonadotropina coriónica recombinante, dio como resultado valores más altos para la AUC y la vida media de eliminación del suero de la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica y valores inferiores para la del régimen de separación, mientras que los valores para Cmáx y tmáx fueron comparables. A partir de la comparación cinética de la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica y la hormona gonadotropina coriónica recombinante, se puede concluir que la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica exhibe un régimen de separación inferior y una vida media prolongada.
Tabla 2. Parámetros farmacocinéticos de la intercadena 1 de la hormona gonadotropina coriónica y la hormona gonadotropina coriónica recombinante
Intercadena 4 de hormona gonadotropina coriónica (Gln «5 Cys - Arg ß8 Cys) Construcción y expresión del vector. Se generó una construcción para expresar una muteína del hormona gonadotropina coriónica que contiene otro enlace de disulfuro de intercadena adicional. su estructura y organización global es esencialmente idéntica a la de pKMS.hCGagßc (FIGURA 1 excepto que se introdujeron nuevas mutaciones. Se introdujeron sustituciones de base específicas en el gen 'híbrido1 hCG« de manera que el codón que codifica glutamina «5 se cambió en un codón que codifica cisteína y en el gen hCGß de manera que el codón que codifica arginina ß8 se cambió en un codón que codifica cisteína. La construcción y la posterior transfección y selección de células de ovario de hámster chino se llevó a cabo de manera semejante a la descrita para otras muteínas. El análisis de proteína como se describe en el ejemplo 2 indicó que el enlace intermolecular entre las 2 subunidades se logró mediante un disulfuro. Bioactividad La actividad de enlace de receptor y la bioactividad in vitro se determinaron en el receptor humano (Jia, X. y colaboradores (1991), Molecular Endocrinology 5, 759-768) como se expresa en la línea de células de ovario de hámster chino establemente transfectada . La actividad de enlace de receptor de la intercadena 4 de la hormona gonadotropina coriónica se cuantificó con una prueba de desplazamiento de receptor de radioligando en fracciones de membrana aisladas de las células que crecen exponencialmente . En un volumen total de 0.5 mililitros, aproximadamente lOOµg de proteína de membrana se incubó con una cantidad fija de hormona gonadotropina coriónica 1251 (20,000 cpm, aproximadamente 12 pM) y cantidades crecientes de la hormona gonadotropina coriónica de competidor durante 18 horas a temperatura ambiente. Se obtuvo hormona gonadotropina coriónica etiquetada con 1251 (NEX-106) en Du Pont de Nemours. El enlace específico fue rutinariamente del 10-12 por ciento del total de la hormona gonadotropina coriónica 1251 añadida. Después de la incubación la hormona ligada y libre se separaron mediante centrifugación. Se usó como estándar la hormona gonadotropina coriónica recombinante. La intercadena 4 de la hormona gonadotropina coriónica muestra un desplazamiento de hormona gonadotropina coriónica yodada que está ligeramente disminuida en comparación con la hormona gonadotropina coriónica del tipo natural (FIGURA 6) . La hormona gonadotropina coriónica induce la producción cAMP en células de ovario de hámster chino que contienen el receptor de hormona luteinizante/gonadotropina coriónica humana. Se utilizó una prueba biológica in vitro para determinar la bioactividad de la hormona gonadotropina coriónica de la intercadena 4 de la hormona gonadotropina coriónica. Incubando células durante 4 horas con concentraciones crecientes de la intercadena 4 de hormona gonadotropina coriónica en la presencia de 0.1 mM 2-isobutil-1-metilxantina dio como resultado un incremento dependiente de la dosis en la producción de cAMP (se determinó la concentración de cAMP extracelularmente mediante RÍA (Immunotech) , con una potencia que es comparable con la hormona gonadotropina coriónica recombinante del tipo natural (FIGURA 7) . Por lo tanto, se puede considerar la intercadena 4 de hormona gonadotropina coriónica como una agonista completa de la hormona gonadotropina coriónica. Ejemplo 7 ínter cadena 5 de hormona gonadotropina coriónica (Arg a35 Cys - Ala ß35 Cys) Se produjo la intercadena 5 de hormona gonadotropina coriónica mediante sustituciones en la posición 35 de la cadena « y 35 de la cadena ß que reemplaza arginina y alanina respectivamente, por residuos de cisteína. Se seleccionaron células de ovario de hámster chino recombinantes como se describió para las otras intercadenas de hormona gonadotropina coriónica para la excreción de una proteína inmunorreactiva. Los sobrenadantes del cultivo reaccionaron como positivos en una prueba ELISA emparedado de hormona gonadotropina coriónica usando anticuerpos monoclonales específicos « y ß. El enlace intermolecular entre las 2 subunidades se hizo mediante un disulfuro como se indicó el análisis de proteína descrito en el ejemplo 2. En la prueba de actividad de enlace de receptor se encontró un desplazamiento de hormona gonadotropina coriónica yodada que se disminuyó ligeramente en comparación con la hormona gonadotropina coriónica del tipo natural (Figura 6) . En la prueba biológica in vitro se mostró la potencia de la intercadena 5 de hormona gonadotropina coriónica como comparable con la hormona gonadotropina coriónica recombinante del tipo natural (FIGURA 7) . Por lo tanto, la intercadena 5 de hormona gonadotropina coriónica se puede considerar como una agonista de hormona gonadotropina coriónica completa. Ejemplo 8; Intercadena 6 de hormona gonadotropina coriónica (His a90 Cys - Cys ßy Cys) La intercadena 6 de la HCG se produjo por la sustitución en la posición 90 de la cadena a reemplazando histidina mediante un residuo de cisteína. Se seleccionaron células de- ovario de hámster chino recombinantes como se describió para las otras intercadenas de hormona gonadotropina coriónica para la excreción de proteína inmunorreactiva. Los sobrenadantes del cultivo reaccionaron como positivos en una prueba ELISA emparedado de hormona gonadotropina coriónica usando anticuerpos monoclonales específicos « y ß. El análisis de proteína como se describió en el ejemplo 2 indicó que el enlace intermolecular entre las 2 subunidades se lleva acabo mediante un disulfuro. En la prueba de actividad de enlace de receptor se encontró un desplazamiento de hormona gonadotropina coriónica yodada el cual fue comparable con la hormona gonadotropina coriónica del tipo natural . En la prueba biológica in vitro se mostró que la potencia de la intercadena 6 es insignificante. Por lo tanto, la intercadena 6 de hormona gonadotropina coriónica se puede considerar como una antagonista de la hormona gonadotropina coriónica. Ejemplo 9; Intercadena 1 de hormona luteinizante (Gln «5 Cys - Trp ß8 Cys) Se generó una construcción para expresar una muteína de hormona luteinizante que contenía un enlace disulfuro de intercadena adicional. Se aisló el ADNc de la hormona luteinizante ß como se describió (Talmadge y colaboradores, Nature (1984) 307 , 37-40) y se intercambió con hormona folículo estimulante ß en el vector pKMS.FSH«gßg (Van Wezenbeek y colaboradores, 1990) . Para la construcción de la mutación de la cadena « en la intercadena 1 de la hormona luteinizante, se introdujeron sustituciones de bases específicas en el gen a 'híbrido' de manera que el codón que codifica glutamina «5 se cambió en un codón que codifica cisteína. En la hormona luteinizante ß se introdujeron sustituciones de bases específicas de manera que el codón que codifica triptofano ß8 se cambió por un codón que codifica cisteína. Las reacciones mutagénicas, reacciones de cadena de polimerasa, subclonación y secuenciamiento se realizaron usando métodos comparables a los descritos para la hormona gonadotropina coriónica. La proteína mutada se expresó en células de ovario de hámster chino Kl transfectadas (ATCC CCL61) . Se seleccionaron células de ovario de hámster chino recombinantes para la excreción de una proteína inmunorreactiva. Los sobrenadantes de cultivo reaccionaron positivos en una prueba ELISA emparedado de hormona luteinizante usando anticuerpos monoclonales específicos « y ß. El análisis de proteínas como se describe en el ejemplo 2 indicaron que el enlace intermolecular entre las 2 subunidades se lleva a cabo mediante un disulfuro. Se determinaron la actividad de enlace de receptor y la actividad biológica in vitro en el receptor humano como se expresó en una línea de células de*.ovario de hámster chino transfectada establemente (Jia y colaboradores) . La intercadena 1 de hormona luteinizante mostró un desplazamiento de hormona gonadotropina coriónica yodada el cual es comparable con la hormona luteinizante del tipo natural (FIGURA 8) . Ejemplo 10; Intercadena 2 de hormona luteinizante (Arg a35 Cys - Ala ß35 Cys) La intercadena 2 de hormona luteinizante se produjo mediante sustituciones en la posición 35 de la cadena « y la 35 de la cadena ß reemplazando arginina y alanina respectivamente por residuos de cisteína.
Se seleccionaron células de ovario de hámster chino recombinante como se describió para las otras intercadenas de hormona gonadotropina coriónica para la excreción de una proteína inmunorreactiva. Los sobrenadantes de cultivo reaccionaron positivos en una prueba ELISA de emparedado de hormona luteinizante usando anticuerpos monoclonales específicos « y ß. En la actividad enlace de receptor se encontró un desplazamiento de hormona gonadotropina coriónica yodada comparable a la hormona gonadotropina coriónica del tipo natural (FIGURA 8) . Ejemplo 11: Intercadena de hormona folículo estimulante (Gln a5 Cys - Ser ß2 Cys) Se generó una construcción para expresar una muteína de hormona folículo estimulante que contenía un enlace disulfuro de intercadena adicional. Su estructura y organización global es esencialmente idéntica a la del pKMS .FSH«gßg, el vector usado para la expresión de la hormona folículo estimulante recombinante del tipo natural en las células de ovario de hámster chino. Se introdujeron sustituciones de bases en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 5 (Gln) y 2 (Ser) de la hormona folículo estimulante de los genes de las subunidades a y ß respectivamente, dando como resultado codones de cisteína (ver para la secuencia del gen ß a Keene y colaboradores, (1989) , J. Biol. chem. 264: 4769-4775. (1989)). Se seleccionaron células de ovario de hámster chino recobinantes transíectadas para la excreción de una proteína inmunorreactiva. Los sobrenadantes del cultivo reaccionaron como positivos en una prueba ELISA emparedado de hormona folículo estimulante usando anticuerpos monoclonales específicos a y ß. Se determinó la actividad de enlace de receptor y la actividad biológica in vitro en el receptor humano como se expresó en la línea de células de ovario de hámster chino transfectada establemente (Minegish y colaboradores (1991) Biochem. Biophys . Res. Comm. 175, 1125-1130). La actividad de enlace de receptor de la intercadena 1 de hormona folículo estimulante se cuantificó con una prueba de desplazamiento de receptor de radioligando en fracciones de membrana aisladas de las células de crecimiento exponencial. En un volumen total de 0.5 mililitros aproximadamente 100 µg de proteína de membrana se incubó con una cantidad fija de hormona folículo estimulante 1251 (20,000 cpm, aproximadamente' 12 pM) y cantidades crecientes de hormona folículo estimulante competidora durante 18 horas a temperatura ambiente. Se obtuvo hormona folículo estimulante etiquetada 1251 (NEX-106) en Du Pont de Nemours. El enlace específico rutinariamente fue del 10-12 por ciento de la hormona folículo estimulante 1251 añadida. Después de la incubación se separaron la hormona enlazada y la libre mediante centrifugación. Se usó como estándar hormona folículo estimulante recombinante, muy purificada. La intercadena 1 de hormona folículo estimulante muestra un desplazamiento de hormona folículo estimulante que es comparable con la hormona folículo estimulante del tipo natural (FIGURA 9) . Ejemplo 12; Tntercadena 2 de la hormona folículo estimulante (Tyr a37 Cys - Trp ß21 Cys) Se produjo una intercadena 2 de la hormona folículo estimulante mediante sustituciones en la posición 37 de la cadena « y 27 de la cadena ß reemplazando tirosina y triptofano respectivamente por residuos de cisteína. Se seleccionaron las células de ovario de hámster chino recombinantes como se describe para las otras intercadenas de la hormona gonadotropina coriónica para la excreción de una proteína inmunorreactiva. Los sobrenadantes del cultivo reaccionaron positivos en una prueba ELISA emparedada de hormona folículo estimulante usando -anticuerpos monoclonales específicos a y ß. En la prueba de actividad de enlace de receptor se encontró un desplazamiento de hormona folículo estimulante comparable con la hormona folículo estimulante del tipo natural (FIGURA 9) .
Claims (1)
1 -15, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Applications Claiming Priority (2)
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| EP95202876 | 1995-10-24 | ||
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