MXPA96004607A

MXPA96004607A - Ensayos de hibridacion-ligacion para la deteccionde secuencias de acido nucleico especificas

Info

Publication number: MXPA96004607A
Application number: MXPA/A/1996/004607A
Authority: MX
Inventors: Martinelli Richard; Arruda John
Original assignee: Arruda John C; Ciba Corning Diagnostics Corp; Martinelli Richard A
Priority date: 1994-04-04
Filing date: 1996-10-04
Publication date: 1998-02-01

Abstract

La presente invención ha desarrollado un nuevo método para conducir un ensayo de sonda de gen. La técnica preferida involucra (1) utilizar una técnica de amplificación de gen (por ejemplo, RCP) para multiplicar la secuencia de gen de interés y (2) utilizar una metodología de detección de hibridación-ligación, en donde las secuencias de sondas hibridizadas a la secuencia objetivo permiten la separación y detección (por ejemplo, las sondas pueden contener una combinación partículas magnéticas yésteres de acridinio) para determinar si estápresente una secuencia específica.

Description

ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN-LIGACIÓN PARA LA DETECCIÓN DE SECUENCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO ESPECÍFICAS Antecedentes de la Invención Las técnicas de sonda de gen se han convertido en una herramienta analítica importante para predecir la incidencia de enfermedad hered itaria y en las condiciones méd icas existentes de diagnóstico. Sin embargo, las técnicas actualmente utilizadas son lentas, laboriosas e involucran el uso de agentes químicos peligrosos. Algunos procedimientos utilizados en el campo de sonda de gen fueron descritos recientemente por Plaha et al (14 BioTechniques 566, 1993). Las técnicas de sonda de gen actuales involucran típicamente el uso de electroforésis, frecuentemente sobre geles de poliacrilamida grandes. Varios de los agentes químicos a los que está expuesto el personal de laboratorio están considerados como peligrosos. Especialmente, el monómero de acrilamida, parte del cual puede permanecer en el gel polimérico, está considerado como una neurotoxina. El bromuro de etidio utilizado como el agente de tinción es un mutágeno. La electroforésis del gel de poliacrilamida req uiere típicamente de va rias horas, en tanto q ue el análisis que utiliza los geles n uevos descritos en Plaha requieren de 16 horas para una sola operación . Otras técnicas utilizan marcadores rad ioactivos , q ue requieren del uso de controles de manejo especiales y técn icas de elimina ción . Igualmente, los otros aspectos de los procedimientos actuales requieren un período relativamente largo . (Por ejemplo, el proced imiento Southern Biot requ iere de aproximadamente 48 horas para completarse). Además, la técnica de electroforésis por sí misma puede generar resultados inciertos. En primer lugar, las técnicas de bromuro de etidio frecuentemente no son muy sensibles. En segundo lugar, deben desarrollarse las condiciones para separar adecuadamente los diferentes fragmentos de gen . En tercer lugar, los resultados son casi siempre cualitativos, no cuantitativos. Además, la falta de habilidad para disting uir los fragmentos de ADN q ue son de igual o similar tamaño aunq ue d ifieren en secuencia, incluso med iante una base individual , limita tam bién la utilidad de los proced im ientos anteriores. Las limitaciones sobre la sensibilidad inherente a los ensayos en base al ADN pueden superarse mediante la reacción de cadena de polimerasa (RCP). La amplificación de una secuencia específica mediante RCP permite la detección de esa secuencia cuando está presente en una m uestra en cantidades extremadamente bajas (Saiki, et al . , 230 Science 1350 , 1985). Aunque las técnicas de RCP pueden amplificar la secuencia de ADN para superar las limitaciones de sensibilidad que existían antes de que la RCP estuviera disponible, un número de problemas permanecen concu rrentes con el uso de la RCP . Los productos de una reacción de RC P incluyen frecuentemente artefactos debidos a d ímeros-in iciadores y casos de iniciación no específica , especialmente en ausencia de la secuencia de objetivo en la muestra . E n virtud de su intensa sensibilidad , la RCP es susceptible a resultados positivos falsos debido a contaminación . La técnica de RCP por sí misma no permite fácilmente la discriminación de pequeñas diferencias entre las secuencias tales como las mutaciones de punto que pueden provocar enfermedades genéticas, tales como fibrosis cistícas. Como una consecuencia de esas limitaciones, la verificación de la presencia de la secuencia objetiva específica después de la amplificación mediante RCP es una etapa deseable aunque no esencial en el ensayo de ADN . Los primeros operadores han utilizado las técnicas de hibridación y ligación como un avance para analizar muestras de varios geles. (Véase, Landegren et al, 241 Science 1077, 1988). Sin embargo, esas técnicas son lentas, inconvenientes y no son tratables para el uso en instrumentos automatizados. Se ha desarrollado un método analítico novedoso, el cual elimina las desventajas de las técnicas actuales para el análisis de las secuencias de ADN y proporciona resultados más rápidos y más precisos. La técnica novedosa actual puede ser utilizada junto con la RCP para mejorar la precisión en los ensayos de sonda el gen . Breve descripción de la Invención Se ha desarrollado un nuevo método para conducir un ensayo de sonda de gen . La técnica preferida involucra (1 ) utilizar una técnica de amplificación de gen (por ejemplo, RCP) para multiplicar la secuencia del gen de interés y (2) utilizar una metodolog ía de detección de hibridación-ligación , en donde las secuencias de sondas híbrido a la secuencia objetivo que permite la separación y detección (por ejemplo , las sondas pueden contener una combinación de partículas magnéticas y esteres de acrid inio) para determ inar si está presente una secuencia específica . Breve Descripción de los Dibujos Figura 1 : Los formatos de ensayo de sonda utilizados para la detección de los alelos normales y delta F-508. Figura 2: Los resultados de la HLM para la detección simultánea de alelos normales y delta F-508 en nueve muestras de ADN humano que han sido amplificadas med iante RCP. La sonda específica para el alelo F-508 fue etiquetada con DMAE y la sonda específica para el alelo normal fue etiquetada con LEAE . Figura 3: Una porción de la secuencia de exon 10 del gen CFTR en la cercanía de los sitios para las mutaciones delta F-508 y delta I-507. Las secuencias subrayadas son complementarias a las secuencias de sondas inmovilizadas sobre partículas paramagnéticas (PMP .508 o PMP.507) y etiq uetadas con éster de acridinio (508. ÑOR o 507. ÑOR). Figura 4: Los h íbridos formados entre las sondas para el ensayo delta F-508 y delta I-507 y los d iferentes alelos. Figura 5: Los resultados de HLM para la detección de la m utación delta I-507 en n ueve m uestras de ADN humano que han sido amplificadas mediante RCP .

Figura 6: Análisis de HLM de tres muestras de ADN humano amplificadas mediante RCP para la presencia de alelos normales, delta F-508 y delta 1-507. Figura 7: Análisis de HLM de tres muestras de ADN humano amplificadas mediante RCP utilizando el protocolo de hibridación-ligación simultáneo con Taq ADN ligasa para la presencia de los alelos normales, delta F-508 y delta 1-507. Figura 8: Discriminación HLM de alelos G542X y Normales. Figura 9: Detección simultánea de mutaciones delta F-508 y G542X mediante HLM. Figura 10: Discriminación de secuencias normal, G551D, G551S y Q552X mediante HLM con 32P-G551 D.NOR o 32P-G551D.CF utilizando T4 ADN ligasa con "00 mM NaCl. Figura 11: HLM con 32P-G551 D.NOR o 32P-G551D.CF utilizando T4 ADN ligasa con 600 mM NaCl. Figura 12: Discriminación de secuencias normal, G551D, G551S y Q552X mediante HLM con 32P-G551 D.NOR o 32P-G551D.CF utilizando Taq ADN ligasa con 200 mM Kcl. Figura 13: Comparación de ensayos para G551D con Taq ADN ligasa bajo diferentes condiciones salinas. Figura 14: El modelo p53 para evaluación sistemática de especificidad de ligación. La secuencia superior es aquella de objetivo (región del codón flanqueador 175 del gen p53). Las secuencias de sonda están en la parte inferior. Las posiciones marcadas "X" e "Y" se variaron sistemáticamente con los cuatro nucleótidos. Figura 15: Ligación por ciento calculada del ensayo delta F-508 de muestras amplificadas RCP. Figura 16: La correlación de ligación por ciento calculada a partir del genotipo de ADN humano amplificado RCP. Las barras de error representan el intervalo de seguridad del 99%. Figura 17: Discriminación de secuencias delta F-508 y delta I-507 con sondas F-508 mediante T4 ADN ligasa como una función de la concentración de NaCl. Figura 18: La Figura 18 representa la discriminación de las desigualdades 5'(2) y 3'(2) utilizando T4 ADN Ligasa y Taq ADN Ligasa en términos de ligación por ciento. Figura 19: La Figura 19 muestra la discriminación de la falta de apareamiento 3'(1) para diferentes pares de base, en términos de la ligación por ciento. Se muestran los datos para dos concentraciones diferentes de T4 ADN Ligasa (1nM y 240 nM). Figura 20: La Figura 20 muestra la discriminación de la falta de apareamiento 5'(1) para diferentes pares de base, en términos de ligación por ciento. Se muestran los datos para 2 diferentes concentraciones de T4 ADN Ligasa (1nM y 240 nM). Descripción detallada de la Invención Se ha desarrollado la técnica novedosa para análisis de sonda de gen. Esta primera etapa de análisis ADN generalmente involucra la utilización de una técnica de amplificación (por ejemplo, RCP) para multiplicar la secuencia de interés. Obviamente, si está presente la cantidad suficiente de secuencia desconocida en la muestra de ensayo, la amplificación puede no ser necesario. Siguiendo al procedimiento de amplificación , se utiliza una metodolog ía de hibridación-ligación (HLM) para confirmar la identidad del producto de amplificación . Para ayudar a identificar la secuencia de gen , se utiliza una partícula fácilmente separable (por ejemplo, una partícula magnética) junto con una porción identificable (por ejemplo, un marcador luminiscente tal como un éster de acridinio). La parte inicial de la técnica involucra el uso de un procedimiento de amplificación para multiplicar la secuencia que se está investigando si está presente una cantidad insuficiente de la secuencia para ser identificada. Se han conocido durante varios años las técnicas RCP . Por ejemplo, Saiki et al describieron una técnica de amplificación enzimática para secuencias de ß-globulina genómica proporcionando 2 iniciadores de oligonucleótido flanqueando la región que se va a amplificar, fijando los iniciadores a las cepas de ADN genómico desnaturalizado y extendiéndolos con ADN polimerasa a partir de E. coli o Thermus acquatic?s y desoxiribonucleosidetrifosfatos y, repitiendo los ciclos de desnaturalización , fijación y extensión (Saiki et al (230 "Science" 1350, 1985); Saiki et al (239 "Science" 487, 1988)). Recientemente se han desarrollado varias técnicas de amplificación (por ejemplo , reacción de cadena de ligasa (RCL) y Qß Replicasa) y, cualquiera de las técnicas de amplificación pueden utilizarse en lugar de RCP o en combinación con una o más de las otras técnicas de amplificación . Además, se anticipa que se desarrollarán otras técnicas de amplificación . La técnica exacta utilizada para la amplificación es ajena a la invención de la presente y, se asume que aquellos con conocimiento en los procedimientos de sonda de gen están familiarizados con las técnicas generales utilizadas en los mismos y las razones para la preferir una técnica sobre otra . El hecho crítico es que la muestra relativamente pequeña de ADN se amplifica de manera que la técnica analítica utilizada sobre la misma es más sensible de io que sería normalmente. Típicamente las técnicas RCP involucran el procedimiento antes descrito. Existen muchas variaciones de esta técnica básica conocida por aquellos con experiencia en la técnica , por ejemplo aquellas descritas en los Protocolos RCP (eds. Innis, MA, Gelfand , DH, Sninsky, JJ, y White, TJ, Academic Press, 1990). Los pormenores de un ejemplo de como se efectúa una reacción de RCP se describen en detalle en los ejemplos de la presente. Una vez que una muestra amplificada está disponible , este materiales analizado mediante HLM. En HLM , la secuencia que es complementaria a parte o a toda la secuencia objetivo se incorpora dentro de 2 o más sondas q ue se hacen reaccionar con el oligon ucleótido de objetivo . G ran parte de la discusión se refiere aquí al uso de solamente 2 sondas, aunq ue pueden utilizarse también más de 2 , como se describe a continuación . Una porción de la secuencia complementaria está unida a un material insoluble que puede separarse fácilmente a partir de una mezcla de reacción . Por ejemplo, puede utilizarse una partícula magnética . Otro material posible es un material que separarse mediante centrifugación a partir de la mezcla de reacción . La segunda porción de la secuencia complementaria está unida a un material que puede ser detectado mediante una técnica analítica. Puede utilizarse, por ejemplo , un material quimioluminiscente, tal como un éster de acridinio . Otros ejemplos son fluoróporos o cromóforos. Esas dos secuencias complementarias son hibridizadas hasta la secuencia objetivo. La solución de hibridación contiene sal , típicamente alrededor de 500 hasta 700 nM de NaCI , con concentraciones de 600 nM siendo las más preferidas. La hibridación se lleva a cabo a temperatura elevada (por ejemplo, 45°C). Después de la hibridación , se utilizan las propiedades insolubles de una de las sondas para separar la sonda hibridizada de la sonda no hibridizada con la etiqueta . Se utiliza después una ligasa para intentar unir las 2 secuencias complementarias de las sondas. Si las 2 secuencias complementarias acoplan con la secuencia objetivo en la región inmediata de la unión de las dos sondas, los ácidos nucleicos terminales están lo suficientemente cerca uno de otro para estar conectados por la ligasa . Por otra parte , si la secuencia objetivo es suficientemente diferente de la secuencia esperada , los ácidos nucleicos sobre las sondas están lo suficientemente alejados uno de otro de manera que no pueden estar unidos por la ligasa . Por ejem plo, si la secuencia objetivo tiene u n nucleótido eliminado en el lugar donde se unen las dos sondas, el terminal nucleótido sobre una sonda pasará sobre la otra sonda y, las dos sondas no estarán ligadas. De manera similar, si la secuencia objetivo tiene un nucleótido insertado, las dos sondas no estarán lo suficientemente cerca una de otra para permitir que ocurra la ligación . Además, si hay una falta de apareamiento en la ubicación donde se unen las dos sondas, las dos sondas no estarán ligadas eficientemente bajo las condiciones aqu í definidas. Au nque la ligación procede como se describió antes, dependiendo de si las bases de terminal de las sondas acoplan o no acoplan con la secuencia objetivo, aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que la falta de apareamiento de las bases sobre la sonda lejos de las posiciones terminales puede tener también algún efecto sobre la unión de la sonda a la secuencia objetivo. Por ejemplo, si una base ubicada sobre la sonda varias posiciones de base lejos de la base terminal no une con la base correspondiente sobre la secuencia objetivo , puede no existir suficiente discordancia entre la sonda y la secuencia objetivo para evitar que se unan las bases de sonda terminales. E l factor esférico y la totalidad de la unión entre la sonda y el objetivo tendrá un efecto sobre si la técnica presente es totalmente efectiva en la determinación de la composición del objetivo . Por otra parte, debe observarse que la discordancia lejos de la unión de las sondas puede ser suficiente de modo que las dos sondas no estarán ligadas. Un ejemplo a continuación muestra un caso en el que la discordancia en un sitio 2 bases alejado de la unión de las sondas provoca suficiente interferencia para que las sondas no estén ligadas. De manera similar, utilizando grupos de sondas que se pretende hibridizar y ligar a una porción de la secuencia normal, es posible determinar si la secuencia objetivo contiene una mutación . Si se encuentra q ue la hibridación o la ligación no ocu rre, puede concluirse que probablemente ocurre la mutación en aquella porción de la secuencia objetivo que se está examinando. Mediante el movimiento a la siguiente porción de la secuencia objetivo, puede efectuarse un experimento similar. Por lo tanto, moviéndose a lo largo de la secuencia objetivo, se puede determinar el o los sitios sobre la secuencia objetivo donde se encontraron las m utaciones y después proceder a diseñar los experimentos para identificar la mutación exacta que ocurre en cada uno de los sitios de mutación.

La ligación se lleva a cabo bajo condiciones que asegurarán la especificidad de la reacción (ver ejemplos a continuación). La ligación se lleva a cabo utilizando uno de los muchos reactivos de ligación disponibles, tales reactivos de ligación logrando típicamente la ligación mediante acción química o enzimática . Una diferencia importante entre las condiciones utilizadas aquí contra las de la técn ica a nterior es que se ha encontrado una concentración m ucho más alta de sal para asegurar la especificidad de ligación . Se había encontrado que la concentración de sal previamente utilizada (200 nM de NaCI) permite la ligación de sondas no acopladas. E n la presente invención , se ha encontrado que las concentraciones de sal más aftas producen una especificidad inesperadamente mejorada . Por ejemplo , para obtener la ligación más específica con T4 ADN ligasa, la concentración de sal es típicamente de alrededor de 500 a 700 mM de NaCI, con concentraciones de alrededor de 600 mM siendo ias más preferidas y siendo utilizables concentraciones de hasta 1000 mM. Son posibles las variaciones en los procedimientos de ligación. Por ejemplo, pueden utilizarse muchos agentes de ligación diferentes y se muestran en la presente, los ejemplos que exhiben el uso de T4 ADN ligasa y Taq ADN ligasa . Además, puede preferirse el incluir en el regulador de Taq ligasa otros componentes que pueden incrementar la sensibilidad de la reacción. Se ha encontrado que, por ejemplo, la inclusión de ARNr reduce la señal de antecedente que es provocada por una unión no específica de la sonda etiquetada. Después de que se emprendió la etapa de ligación, una etapa de desnaturalización separa la secuencia objetivo de aquella de las sondas y ligada desde la sonda no ligada. El material conectado al material insoluble puede ser separado a partir de la mezcla de reacción mediante centrifugación, la aplicación de un campo magnético u otro procedimiento apropiado y puede determinarse la presencia de cualquier etiqueta conectada al material insoluble debido a la acción de la ligasa . Utilizando los com ponentes descritos, la separación del material objetivo puede obtenerse utilizando una técnica diferente de la cromatog rafía o la electroforésis. Por lo tanto la técnica puede llevarse a cabo mucho más rápido q ue si se utilizará la electroforésis o la cromatografía . Además, la técnica de detección puede ser una más cuantitativa , tal como la medición de rad ioactividad , fluorescencia o luminiscencia . Otros métodos de detección pueden utilizar técnicas comúnmente disponibles que perm iten la adición subsecuente de la etiqueta. Por ejemplo, la sonda puede tener químicamente unida a la misma biotina y, después de la separación de las sondas, la etiqueta, que está unida a la avidina o la estreptavidina , puede reaccionar ahí mismo, formando de este modo una sonda enlazada a una etiqueta separable. En tercer lugar, la técnica puede utilizarse ahora en algunos de los instrumentos automatizados, tales como el instrumento ACS 180 fabricado por "Ciba Corning Diagnostics Corp .'' de Medfield , MA. Debe observarse que puede utilizarse una variación de la técnica actual para determinar la información acerca de la secuencia sobre el objetivo. Si, después de la desnaturalización , se encuentra que no hay etiqueta conectada a la sonda insoluble, puede analizarse una alícuota diferente de la mezcla de reacción q ue no ha sido desnaturalizada . En esa muestra , puede separarse el marcador insoluble (por ejemplo, mediante la aplicación de un campo magnético, mediante el uso de centrifugación , etc. ), y la secuencia objetivo puede ser analizad a para determinar si la sonda marcadora está unida a la secuencia objetivo . Si se encuentra que este es el caso, la secuen cia de gra n pa rte del polinucleótido puede predecirse debido a la hibridación de las 2 sondas a la secuencia objetivo y pueden planearse experimentos ad icionales para confirmar la secuencia en aq uella reg ión de la secuencia objetivo (por ejemplo, cerca del punto de ligación). Alternativamente, puede conducirse un análisis similar mediante la desnaturalización de la muestra después de la ligación y separando después la fase sólida . E n esta técnica, se analizaron la fase sólida separada y el sobrenadante para la presencia de la sonda etiquetada. Si la mayor parte de la etiqueta se encuentra solamente en el sobrenadante, puede concluirse que la ligación de las sondas no ocurrió, lo cual es una indicación de una falta de apaream iento en el punto de ligación esperado. Sin embargo, ya que la sonda etiquetada se une al objetivo, puede concluirse que el objetivo tiene la secuencia esperada, o una secuencia cercana a ia esperada , o también la sonda etiquetada no se habría hibridizado a la secuencia objetivo. Por lo tanto , au nque la ligación no haya ocurrido, pude inferirse m ucho acerca de la secuencia objetivo. Además, la suma de las cantidades de la etiqueta en el sobrenadante y sobre la fase sólida debe aproximarse a la cantidad total de la secuencia objetivo en la muestra de ensayo . El porcentaje de la sonda etiquetada que está ligada debe indicar la homocigotocidad o heterocigotocidad de la muestra . Además de la relación de la etiq ueta sobre la fase sólida a la etiq ueta en solución puede indicar más información acerca de la secuencia sobre la sonda , por ejemplo la existencia de enfermedades en donde las porciones de material genético están duplicadas (por ejemplo X frágil). Debe observarse que, al conducir estos ensayos, no se ha encontrado que los datos sean exactamente los valores esperados de manera teórica (es decir, no se encuentra el 100% de la etiqueta en la fase sólida para una muestra homocigótica). (Ver ejemplos a continuación). Por lo tanto, conociendo las m utaciones potenciales que pueden ocurrir en un sitio particular, es posible generar una sonda específica de manera que puede confirmarse la secuencia sobre la secuencia objetivo. Si pueden ocurrir varias mutaciones potenciales en un sitio, también es posible designar varias sondas, cada una con una etiqueta d iferente, para determinar cual de las mutaciones ocurrió si la secuencia es normal y cual, si es una secuencia mutada, . De manera similar, pueden determinarse las mutaciones que ocurren una cerca de otra en una secuencia objetivo. Además, la técnica de utilización de dos o más sondas etiquetadas de manera diferente puede utilizarse en el caso en donde se esperan múltiples formas de la secuencia objetivo , tal como en el caso de X frágil antes descrito. Las dos etiq uetas diferentes utilizadas en el mismo ensayo pueden ser, por ejemplo , un donador fluorescente y un par aceptor fluorescente. En este caso, variando la luz incidente, pueden utilizarse las dos etiquetas para distinguir entre tres posibles resu ltados. S i la luz incidente para la primera sonda da la fluorescencia típica de la primera etiqueta , esta es u na indicación de q ue solamente la primera secuencia objetivo está presente . Si la salida fluorescente es aq uella de la seg unda etiq ueta , están presentes dos alternativas. Si la luz incidente que excita fa primera etiqueta da la fluorescencia a partir de la segunda etiqueta, esta es una indicación de que ambas secuencias objetivo están presentes. Por otra parte, si solamente la luz incidente que excita la segunda etiqueta da la fluorescencia desde la segunda etiqueta, esta es una indicación de que solamente está presente la secuencia objetivo . Por ejemplo, se han encontrado mutaciones múltiples en una cercanía en variaciones de fibrosis cística . Por ejemplo, las mutaciones delta F-508 y delta I-507 son am bas eliminaciones de par de base 3 , las posiciones de esas mutaciones están parcialmente traslapadas en la secuencia del gen CFTR. (Véase Zielenski et al (10 "Genomics" 214, 1991 ) para la secuencia del gen CFTR). El análisis del producto de amplificación RCP que abarca esta secuencia mediante la electroforésis de gel de poliacrilamida no sería capaz de determinar esas dos mutaciones ya que los productos tend rían el mismo tamaño . Sin embargo, esas mutaciones se disting uirían mediante H LM. Además, exon 1 1 del gen CFTR que contiene los sitios de muchas mutaciones C F que incluye ia m utación G542X en la base 1756 (ver NO ID SEC 1 1 ) y la mutación G551 D en la base 1784 (ver NO ID SEC 16). Después de una amplificación RCP individual de la secuencia que abarca los sitios de esas mutaciones, se puede determinar fácilmente la presencia o ausencia de ambas mutaciones mediante HLM .

Se notará que, aunque hay algunas similitudes entre la técnica HLM y la reacción de cadena de ligasa (RCL), las técnicas son, en realidad, muy diferentes. La RCL es por sí misma una técnica de amplificación que ha sido conocida durante algún tiempo. Véase, por ejemplo, Wu y Wallace, 4 "Genomics" 560, 1989; también Barany, 88 "Proc. Nati. Acad. Sci. USA" 189, 1991. En la RCL, las dos porciones de oligonucleótidos que son complementarias cada una para cada cadena de una pieza del gen objetivo que se está amplificando (con las dos juntas que corresponden a la porción de gen objetivo completa) se agregan a la muestra de gen que se está amplificando junto con una ligasa. Si los oligonucleótidos agregados complementan la secuencia objetivo, la ligasa unirá los dos oligonucleótidos. La RCL es una técnica de amplificación en donde, conociendo la secuencia que se va a amplificar, es posible agregar a la mezcla de reacción fragmentos que son complementarios para la secuencia objetivo de manera que, cuando se agrega la ligasa, ocurre la ligación y se amplifica la secuencia objetivo. Se pretende que la RCL se repita durante varios ciclos de manera que puedan producirse grandes cantidades de la secuencia deseada. Por otra parte, HLM es una técnica analítica en donde las sondas para una o más secuencias esperadas que son igualmente probables de encontrarse en la secuencia objetivo se agregan a la misma. Las sondas están unidas ya sea a un material que puede ayudar a la separación a partir de la mezcla de reacción o a una etiqueta. Además, se pretende que la reacción se ejecute solamente para un ciclo. Existen muchas variaciones posibles en el procedimiento HLM. Por ejemplo, se puede combinar el procedimiento de detección con la cromatografía de columna. Una de las sondas de oligonucleótido en este procedimiento contiene un substituyente que provocará que se adhiera a un cromatógrafo de columna . Una de las sondas es biotinilada y, los productos ligados se separan sobre avidina-sefarosa . El otro oligonucleótido puede contener un marcador fluorescente. Por lo tanto, cuando la muestra se pasa a través de un cromatógrafo de columna, aquellos oligonucleótidos que han sido ligados se adherirán al cromatógrafo y son fluorescentes. Por tanto la fluorescencia dentro de la columna es un indicador de que ha ocurrido la ligación . El uso del donador de la fluorescencia/par aceptor antes descrito puede emplearse también en la técnica de cromatografía de columna. Otra variación trata sobre las porciones a las que están conectadas las sondas. Aunque en la mayoría de los casos una sonda estará conectada a una porción que permite la separación de las sondas ligadas y la segunda sonda estará unida a una porción de etiqueta , es posible que las dos sondas puedan unirse a otras porciones, tales como otras secuencias. Por ejemplo , las sondas pueden estar conectadas a los dos componentes de la secuencia de midivariancia , si se utiliza el sistema de QB replicasa . En este caso , una sonda está conectada a una porción de la secuencia de midivariancia (por ejemplo, midivariancia A) y la segunda está conectada a la segunda porción de la secuencia de midivariancia (es decir, la midivariancia B). Si se observa la duplicación en la reacción con QB replicasa después de la etapa de ligación, es una indicación de que las dos sondas fueron ligadas. El hecho de que las dos sondas fueran ligadas es una indicación de que las sondas tienen la misma secuencia que la secuencia objetivo. Una variación adicional de esta técnica involucra el control de tiempo para la adición del reactivo de evaporación instantánea cuando se utilizan ciertas etiquetas luminiscentes, tales como esteres de acridinio. Después de la desnaturalización y separación de las sondas ligadas, es posible agregar ADNasa antes de la adición del reactivo de evaporación instantánea. Esto permitirá una prueba más sensible, ya que se ha encontrado que la presencia de la sonda insoluble interfiere en ocasiones con la cantidad de luz emitida cuando se agregan los reactivos de evaporación instantánea. La separación de la sonda insoluble antes de la adición del reactivo de evaporación instantánea permite por lo tanto que sea generada una señal específica más alta. Otra variación se refiere al número de sondas que se utilizaron.

Aunque la técnica preferida involucra el uso de dos sondas, una de las cuales ayuda en la separación y una de las cuales ayuda en la detección, debe observarse que pueden utilizarse más de dos sondas. En este caso, una de las sondas contiene la porción de separación y una la porción de detección. Si la porción de separación está sobre una sonda terminal y la porción de etiqueta sobre la otra sonda terminal, las sondas no necesitarán contener entre ellas una etiqueta. En este experimento , si, después de la ligación, la sonda de etiq ueta está unida a la sonda de separación , puede concluirse que las sondas intermedias también hibridizaron a la secuencia objetivo , pero, si este no fuera el caso , la sonda de etiq ueta no estaría ligada a la porción de sonda que incluye la sonda de separación. Otra variación del experimento de sonda múltiple es aquel en donde una sonda que conten ía la porción de separación y todas las demás sondas estaban etiquetadas en este caso , después de la ligación , la cantidad de etiqueta u nida a la porción separada es una indicación de si todas las sondas fueron ligadas. El uso de más de dos sondas, cuando se combinaron con las variaciones antes descritas (por ejemplo, análisis con y sin ligación , análisis antes de la desnaturalización, etc.) conducen a un número de variaciones analíticas q ue serán evidentes para aquellos con experiencia ordinaria en esta área . Además, puede variar la u bicación de la porción de separación o de detección. Aunque se prefiere que estén en un extremo terminal de u na sonda , es posible que estén conectadas a la sonda en cualquier ubicación en tanto q ue no interfieran con la hibridación y la ligación. Una ventaja ad icional de la técnica novedosa es q ue ahora es posible discriminar entre las dos mutaciones que están estrechamente relacionadas entre sí (por ejemplo, las mutaciones q ue ocurren en nucleótidos adyacentes). U na ventaja ad icional de la presente invención es que pueden utilizarse diferentes marcadores sobre diferentes sondas en el mismo experimento . Por lo tanto, puede determinarse por ejem plo , ia presencia de una de las dos mutaciones posibles en una prueba , con cada sonda utilizando un marcad or diferente. Ambos marcadores podrían separase de la mezcla y los dos pod rían distinguirse mediante, por ejemplo, sus diferentes espectros de absorción . Además, utilizando d iferentes partículas insolubles, las dos sondas pueden separarse una de la otra antes del análisis. Por ejemplo, si una sonda q ue cuenta con una partícula no magnética insoluble y la otra utiliza una partícula magnética insolu ble, el campo magnético podría aplicarse primero a fin de remover las partículas magnéticas y los marcadores unidos a las mismas y, la solución restante puede ser centrifugada para remover las partículas no mag néticas insolubles con su marcador un ido . Otras variaciones de esas técnicas de separación serán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica . Por lo tanto, esos dos marcadores pod rían aún d istinguirse uno de otro incluso au nque ambos tengan el m ismo nivel. Com binando en un experimento las variaciones de las técnicas utilizables tanto para la separación como para la detección , es posible determinar la presencia de una de las diversas mutaciones u otras variaciones genéticas en el mismo experimento. Por ejemplo , las partículas magnéticas (M) pueden utilizarse sobre las mismas sondas , las partículas no magnéticas (NM) sobre otras; algunos de los segundos oligonucleótidos en la sonda podrían utilizar material quimioluminiscente A, en tanto que otros podrían utilizar material q uimioluminiscente B. Por tanto, variando solamente esos dos parámetros, podrían detectarse 4 mutaciones en un experimento. (Es decir, cuando ios aductos para las sondas son M-A, NM-A, M-B, NM-B). Utilizando las partículas que pueden separarse una de la otra con diferentes marcadores (es decir, aquellas con diferentes características espectrales u otras), sería posible detectar muchas variaciones genéticas en un experimento . Una ventaja ad icional del procedimiento novedoso es que fa técnica es más sensible que las técnicas previas. Esta sensibilidad mejorada se debe a varios factores. Por ejemplo, las técnicas analíticas para determinar la presencia del material objetivo son más sensibles; ia técnica de solución de separación de la partícula insoluble y el análisis del marcador unido a la misma es mucho más sensible que el procedimiento que utiliza la electroforésis para separar los componentes y para comprender la tinción para determinar cualitativa y cuantitativamente la presencia de la secuencia objetivo . Son posibles variaciones adicionales del procedimiento anterior. Por ejemplo , después de que las partículas insolubles son separadas de la mezcla de reacción , la cantidad de secuencia objetivo presente se puede determinar mediante la medición de la cantidad de marcador, en ta nto que el marcador está unido todavía al material insoluble cuando las partículas insolubles se precipitaron (como, por ejemplo, utilizando un análisis cuantitativo clásico sobre el material insolu ble). Alternativamente, después de que se separaron las partículas insolubles de la mezcla de reacción , las partículas se pueden suspender de nuevo y determinarse el marcador mientras está en la partícula que se suspendió de nuevo. Además, el marcador puede separase de la partícula insoluble y ser medido cuando el marcador y la partícula insoluble están en solución o suspendidos. Asimismo, después de la separación del marcador a partir de la partícula insoluble, la partícula insoluble puede separarse de la solución y el marcador puede ser medido en ausencia de la partícula insoluble. Además de detectar las secuencias ADN específicas, el H LM puede utilizarse también para detectar las secuencias ARN específicas a condición de que la ligasa utilizada pueda ligar sondas que están hibridizadas para un objetivo ARN . La técnica puede utilizarse también para analizar materiales virales y otras secuencias de ácidos polinucléicos. Además, ya que los ejemplos ilustran la habilidad del HLM para disting uir las secuencias que difieren en posiciones en sitios diferentes a los de unión de ligación de las sondas, este método puede adaptarse fácilmente para explorar g randes seg mentos de secuencia incluso hasta genes completos para alteraciones distintas de una secuencia normal. Variaciones adicionales de la invención serán evidentes para aq uellos con experiencia ord ina ria en la técnica . Los siguientes ejemplos ilustran varios aspectos de la invención aunque no pretenden limitar su utilidad. Ejemplo 1: Detección Simultánea de Alelos Normales y Delta F-508 Utilizando Ensayo de Hibridación-Ligación Quimioluminiscente con Sondas Etiquetadas DMAE y LEAE Se probó la habilidad de un método de hibridación-ligación quimiofuminiscente para detectar la mutación delta F-508 (NO ID SEC 1) en la fibrosis cística en muestras de ADN humano amplificadas mediante RCP. Además, la presencia de ambos alelos normal (NO ID SEC 2) y delta F-508 se determinó simultáneamente para cada muestra utilizando sondas específicas para cada alelo aunque etiquetadas con derivados diferentes de éster de acridinio (DMAE y LEAE). El derivado DMAE (éster de dimetil acridinio) que tiene actividad quimioluminiscente en la escala de longitud de onda más baja (400-500 nm) y LEAE (éster de acridinio que emite la longitud de onda más grande) que tiene actividad quimioluminiscente en la escala de longitud de onda más grande (500-600 nm). Nueve muestras de ADN humano (250 ng) obtenidas a partir de un laboratorio externo se amplificaron mediante ia reacción de cadena de polimerasa (ver Saiki et al, 239 Science 487, 1988). Los iniciadores utilizados se obtuvieron de Genset (París, Francia) y tenían las siguientes secuencias: C16B (NO ID Secuencia 3): 5' GTT TTC CTG GAT TAT GCC TGG CAC 3' C 16 (NO ID Secuencia 4): 5' GTT G GC ATG CTT TGA TGA CGC TTC 3' La secuencia objetivo amplificada en la reacción RCP con esos iniciadores constó de 97 pb (97 pb por alelo delta F-508) abarcando las bases 161 1 -1708 del gen CFTR (3). Las reacciones RCP (75 ul) conten ían 30 pmol de cada iniciador, 1 .9 mM de MgCI2, 200 uM cada uno de ATP , TTP , GTP y CTP; y 2.5 U Taq ADN polimerasa . Después de la desnaturalización a 95°C durante 5 minutos, las muestras fueron amplificadas mediante ciclos de RCP que constan de fijación a 60°C durante 45 seg undos, la extensión a 72°C durante 1 minuto y la desnaturalización a 95°C d urante 45 segundos. Después del último ciclo las muestras fueron incubadas a 72°C durante 5 minutos. Se desnaturalizó una alícuota de la reacción RCP y se agregó después a la reacción de detección quimioluminiscente: 100 ul TE , 4X SSC, 0.1 % BSA, 0.02% Tween 20, 5% ae sulfato de dextrano que contiene 10 ug de partículas paramagnéticas (PPM) con la sonda in movilizada (PMP) y 100 fmol de cada sonda de éster etiquetada con éster de acrid inio (508.CF-DMAE y 508. NOR-LEAE). Las secuencias de las sondas de detección fueron : PMP.508 (NO ID SEC 5): 5' CCT AGT CCA AGT ACG GCG CCG AAG AGG CCC TAT CAT AGG AAA CAC CA 3' 508.CF (NO ID SEC 6): 5' ATG ATA TTT TCT TTA ATG GTG CCA 3' 508.ÑOR (NO ID SEC 7): 5' AAG ATG ATA TTT TCT TTA ATG GTG CCA 3' Los formatos de ensayo posibles se resumen como se m uestra en la Figura 1 . Las sondas fueron hibridizadas al producto RCP a 45°C durante minutos Las sondas AE no hibridizadas fueron removidas mediante separación magnética de las partículas y decantando el sobrenadante. Las partículas fueron lavadas con 2X SSC/0.1 % Tween-20. Las sondas hibrid izadas fueron ligadas suspendiendo nuevamente las partículas en 100 ul 50 mM tris, pH 7.6, 10 mM de MgCI2, 1 M de ATP, 1 mM de DDT, 5% de polietilenglicol 8000 y 200 mM de NaCI que contiene 2 U T4 ADN ligasa . Las reacciones fueron incubadas a 37°C durante 15 minutos. Después de la separación y el lavado de las partículas como se describió , las sondas AE hibridizadas aunque no ligadas fueron disociadas suspendiendo de nuevo las partículas en 150 ul H20 e incubando a 65°C durante 10 minutos. Las partículas fueron separadas y se removió el solvente que contiene la sonda AE disociada. Las partícu las fueron lavadas una vez como se describió y después se suspendieron de nuevo en 100 ul 10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCI2, 1 m M EDTA, y 0.05ug/ul Dnasa I (BRL). La suspensión de partícula se evaporó en forma instantánea utilizando reactivos de evaporación instantánea estándares (ver por ejemplo , Law et al , Patente Norteamericana No . 5,241 ,070) y la quimioluminiscencia detectada en un luminómetro de longitud de onda doble de manera que las señales quimioluminiscentes desde las dos etiquetas diferentes se midieron de manera simultánea. Los resultados del ensayo de hibridación-ligación quimioluminiscente para el producto amplificado RCP se muestran en la Figura 2. La señal quimioluminiscente obtenida claramente identificó la presencia de los alelos normal y delta F-508 en los prod uctos amplificados RCP. Como se esperaba , las sondas específicas de alelo hibridizaron a cada muestra sin tener en cuenta el genotipo (datos no mostrados), la etapa de ligación subsecuente d iscriminada entre las secuencias de los dos diferentes alelos ya que la ligación eficiente se observó solamente en la unión de las sondas hibridizadas que fueron perfectamente complementarias con la secuencia objetivo. (Ver Figura 1 ). La detección quimioluminiscente de esos alelos permitió el diagnóstico de esas muestras que estaban en completa conformidad con los análisis de las mismas muestras por parte de un laboratorio independiente con una excepción (Ver Ejemplo 2). Cada muestra fue analizada tanto con alelo normal como delta F-508 específico para el genotipo de las muestras. La magnitud de la q uimioluminiscencia (Figura 2) ind icó también el genotipo de la m uestra en la que se observó un nivel intermedio de quimioluminiscencia para individuos heterócigos (por ejemplo el alelo norma l en las muestras 1 , 7 y 9) con relación a la quimioluminiscencia en los casos homócigos. La muestra 7 fue una muestra excepcional en la q ue la magnitud de la quimioluminiscencia a partir de la sonda 508. NO R-LEAE indicó que la muestra fue heteróciga para esta muestra , aunque la señal a partir de la sonda 508.CF-DMAE indicó que esta muestra fue negativa para la mutación delta F-508. Conjuntando estos resultados se sugirió que el segundo alelo en esta muestra no contenía ni la secuencia delta F-508 ni la secuencia normal sino una segunda mutación de fibrosis cística . Esos productos RCP fueron analizados también mediante electroforésis sobre un gel de 8M urea/10% poliacrilamida y las bandas determinadas se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio (datos no mostrados). Los productos a partir de los alelos normal (97 pb) y CF (94 pb) se determinaron claramente sobre el gel, permitiendo un diagnóstico. Además, las muestras heterócigas también conten ían bandas resultantes a partir de la formación heterodoble que migraron como prod uctos aparentemente mayores. A este respecto, sobre la base del análisis de electroforético, las muestras 1 , 7 y 9 parecen idénticas y estarían asignadas como heterócigos delta F-508 y normal . Como se observó antes, sobre la base de fos datos quimioluminiscentes, aunque la muestra 7 fue heteróciga para el alelo normal, no parece contener el alelo delta F- 508. Esta discrepancia se resolvió en el Ejemplo 2 e ilustró la habilidad del H LM para proporcionar un diagnóstico más preciso comparado con los procedimientos analíticos estándares tales como electroforésis.

Ejemplo 2: Discriminación de Mutaciones Delta F-508 y Delta I-507 mediante Hibridación-Ligación Quimioluminiscente La mutación delta F-508 es la mutación más común en la fibrosis cística (FC), que ocurre en aproximadamente el 68% de los cromosomas de fibrosis cística (3). Esta m utación es una eliminación de tres pares de base en exon 10 del gen CFTR (3). La secuencia de exon 10 q ue circunda a este sitio de mutación se muestra en la Figura 3. La mutación delta I-507 (NO ID SEC 8) es una mutación CF mucho más rara que también es una eliminación de tres pares de base que se sobrepone parcialmente a la mutación delta F-508 (Figura 3). La secuencia de esos dos alelos CF difiere por una base individual. La habilidad del ensayo de hibridación-ligación quimiofuminiscente para distinguir los alelos normal y delta F-508 se demostró en el Ejemplo 1 . La habilidad del ensayo para distinguir los alelos delta F-508 y delta I-507 se demuestra en este ejemplo. Esta aplicación requiere que ia etapa de ligación distinga secuencias que difieren en una sola posición . Además, el sitio de la falta de apareamiento en esos híbridos ocurre en una base removida desde la unión de ligación. Los híbridos formados entre los grupos de sonda delta F-508 y delta I-507 y las secuencias objetivo diferentes se muestran en la Figura 4. Las mismas nueve muestras de ADN humano que habían sido amplificadas med iante la reacción de cadena de polimerasa (ejemplo 1 ) se analizaron para la presencia del a lelo delta I-507. En este ensayo, se siguió un formato similar como en el Ejemplo 1 con la excepción de que la fase sólida y las sondas etiquetadas con éster de acridinio (DMAE) fueron como sigue: PMP.507 (NO ID SEC 9): 5' CCT AGT CCA AGT ACG GCG CCG AAG AGG CCC TAT ATT CAT CAT AGC AAA CAC CAÁ AG 3' 507.CF (NO ID SEC 10): 5' ATA TTT TCT TTA ATG GTG CCA GGC 3' Se analizaron tres muestra adicionales (30, 31 y 32) de ADN humano amplificado RCP para los alelos normal, delta F-508 y delta I-507 utilizando el mismo protocolo así como también un protocolo que utiliza Taq ADN ligasa ("Epicentre Technoligies"). La termoestabilidad de Taq ADN ligasa permitió que la reacción de ligación se llevara a cabo a una temperatura más alta y permitió también que las etapas de hibridación y ligación se llevaran a cabo simultáneamente. El regulador de pH para la hibridación-ligación sim ultáneas constó de 20 mM Tris, pH 8.3, 200 mM KCl, 10 uM ARN t, 10 mM MgCI2, 0.5 mM NAD y, 0.01 % Tritón X-100. Las reacciones contenían 100 unidades de Taq ADN ligasa. Las hibridaciones- ligaciones simultáneas se llevaron a cabo a 60°C durante 30 minutos. El resto del protocolo fue idéntico a aq uel de los ensayos que emplean T4 ADN ligasa . Los resultados del ensayo de hibridación-ligación q uimioluminiscente de las nueve muestras se muestran en la Fig ura 5. Solamente la muestra 7 fue positiva para el alelo delta i-507. Esos resultados tomados junto con aquellos del Ejemplo 1 permiten las siguientes asignaciones para esas muestras: Cuadro 1 GENOTIPO DE MUESTRAS CLÍNICAS J 2 3 4 5 6 l 8 9 508/N 508/508 N/N N/N N/N 508/508 507/N 508/508 508/N Los resultados de las tres muestras ad icionales probadas para loa alelos normal, delta F-508 y delta I-507 se muestran en las Figuras 6 y 7. Las asignaciones hechas para esas muestras fueron confirmadas mediante secuenciamiento. Los resultados mostrados en los Ejemplos 1 y 2 ilustran la habilidad del ensayo de hibridación-ligación quimioluminiscente para discriminar secuencias que difieren por una base individual incluso cuando el sitio de esa diferencia ocurre en una base removida desde el sitio de la unión de ligación. En esta aplicación particular, se distinguieron las mutaciones delta F-508 y delta I-507 de fibrosis cística. Esto hizo posible que muestras que habían sido caracterizadas previamente como delta F-508/N fueran correctamente asignadas como delta I-507/N . La asignación de las muestras 7 y 30 como delta F-508/N heterócigas se habían hecho en base a la movilidad electroforética de los prod uctos RC P de esas muestras. Aunque el análisis de esos prod uctos RCP med iante electroforésis de gel de poliacrilamida no disting ue fácilmente las mutaciones delta F- 508 y delta I-507 , ya q ue ambas mutaciones constan de tres eliminaciones de par de base, los productos RCP a partir de esos alelos son del mismo tamaño. Ejemplo 3: Ensayo para la Mutación G542X de Fibrosis Cística Los ejemplos previos a han demostrado la habilidad del ensayo de hibridación-ligación quimioluminiscente para distinguir los alelos normales y los de fibrosis cística en los sitios de las mutaciones delta F-508 y delta 1-507. Una tercera mutación de fibrosis cística, G542X (NO ID SEC 1 1 ), es una mutación de punto que ocurre en exon 1 1 del gen CFTR. El método actual para detectar esta mutación requiere de secuenciamiento, el cual es un procedimiento prolongado y laborioso. El ensayo de hibridación-ligación quimioluminiscente para detectar esta mutación debe ser capaz de distinguir la substitución de base individual que difiere entre los alelos normal (NO ID SEC 12) y los de fibrosis cística . El mismo ensayo de hibridación-ligación simultáneas que utiliza Taq ADN ligasa como se describe en el Ejemplo 2 se uso en el ensayo G542X. Las secuencias de las sondas G542X fueron: PMP .G542X (NO ID SEC 13): 5' CCT AGT CCA AGT ACG GCG CCG AAG AGG CCA CTC AGT GTG ATT CCA CCT TCT C 3" G542X.CF (NO ID SEC 14): 5' AAA GAA CTA TAT CTT TCT CTG CAÁ 3' G542X.NOR (NO ID SEC 15): 5'CAA GAA CTA TAT TGT CTT TCT CTG CAÁ 3' Los resultados del ensayo se muestran en la figura 8 e indican que la única sonda G542X estuvo ligada con la secuencia G542X y solamente la sonda G542. NO R estuvo ligada con la secuencia normal. En esta muestra, las faltas de apareamiento T-C y G-A en la unión de ligación no fueron eficientemente ligadas. Ejemplo 4: Ensayo Simultáneo para Delta F-508 y G542X El ensayo de hibridación-ligación quimioluminiscente puede utilizarse para la detección simultánea de secuencias múltiples. Una ilustración de esta capacidad fue la detección simultánea de los alelos normal y F-508 en un solo ensayo (Ejemplo 1 ). Otra aplicación es la detección de dos o más mutaciones que provocan una enfermedad hereditaria o cáncer. Por ejemplo, se han descrito más de 200 mutaciones que provocan fibrosis cística . La mutación delta F-508 es la más común , que se presenta en aproximadamente el 68% de los cromosomas de fibrosis cística. La segunda mutación más frecuente de fibrosis cística es la mutación G542X, una mutación de punto que se presenta en exon 1 1 del gen CFTR. En vez de usar las dos etiquetas de éster de acridinio diferentes para detectar simultáneamente los alelos normal y CF en un sitio individual, las mutaciones delta F-508 y G542X pueden ser detectadas en u n ensayo individual. En principio, pueden detectarse en un solo ensayo tantas mutaciones como derivados de éster de acridinio existan con d istintas propiedades q uimiolu min iscentes. Las etiquetas alternativas, tales como fluróporos, pueden permitir que se detecte simultáneamente un número aún mayor de sitios.

Se realizó un ensayo modelo para probar la viabilidad con secuencias objetivo sintéticas. El protocolo de ensayo fue el mismo descrito en el Ejemplo 2 usando Taq ADN ligasa y la hibridación-ligación simultáneas. Se utilizaron las dos fases sólidas y las dos sondas etiquetadas con éster de acridinio , un grupo de cada una para las mutaciones delta F-508 y G542X. Las sondas para la mutación F-508 fueron las mismas descritas en el Ejemplo 1 con la excepción de q ue la etiqueta de éster de acridinio fue LEAE. Las secuencias de las sondas G542X fueron las mismas que se usaron en el Ejemplo 3. Los resultados del ensayo se resumen en fa Figura 9 y muestran que las secuencias delta F-508 y G542X fueron detectadas con cualesquiera combinaciones de objetivos que se emplearon . Esto demuestra la viabilidad de detección de múltiples mutaciones genéticas en el mismo ensayo. Ejemplo 5: Discriminación de Mutaciones G551 D, G551 S y Q552X de Fibrosis Cística Exon 1 1 del gen CFTR contiene los sitios para muchas otras mutaciones de fibrosis cística en adición a la mutación G542X descrita en los ejemplos anteriores. La presencia de múltiples sitios de mutación en la extensión relativamente pequeña de la secuencia de exon 1 1 ha resultado hasta ahora en la necesidad de secuenciamiento del producto RCP a partir de ese exon a fin de detectar y discriminar esas posibles mutaciones. La habilidad del H LM para simplificar el análisis de las mutaciones de fibrosis cística de exon 1 1 requirió que la especificidad de este método hiciera posible la discriminación de sitios de mutación estrechamente agrupados. La mutación G551D (NO ID SEC 16) es una de las mutaciones de fibrosis cística más comunes, que responde por el 0.5% de la frecuencia observada, esta es una mutación de punto en la que G1784 en el gen normal (NO ID SEC 17 se cambia en un A. Cerca del sitio del G551D están G551S(NO ID SEC 18) en la base 1783 y, Q552X (NO ID SEC 19) en la base 178. Además la naturaleza de la mutación G551D requiere la discriminación de un falta de apareamiento G-T mediante HLM, una de las faltas de apareamiento más difíciles de discriminar (ver a continuación). La habilidad de HLM para detectar la mutación y discriminar entre este y los otros sitios de mutación cercanos a éste se demostró en este ejemplo. Las secuencias de las sondas utilizadas en el ensayo G551D fueron como sigue: PMP.G551D (NO ID SEC 20): CCT AGT CCA AGT ACG GCG CCG AAG AGG CCC TAA AGA AAT TCT TGC TCG TTG A G551D.CF (NO ID SEC 21 ): TC TCC ACT CAG TGT GAT TCC AC G551D.NOR (NO ID SEC 22): CC TCC ACT CAG TGT GAT TCC AC En estos ensayos G551D.CF y G551D.NOR fueron etiquetados con 32P en sus terminaciones 5'. La detección del producto de ligación se logró mediante conteo de escintiliación líquida. Los ensayos se ejecutaron utilizando ya sea los protocolos estándares de T4 ADN ligasa y Taq ADN ligasa antes descritos así como las modificaciones a esos protocolos mediante la alteración de las condiciones salinas a fin de mejorar la especificidad de H LM . Para la T4 ADN ligasa , esto involucró incrementar la concentración de NaCI desde 200 hasta 600 mM . El protocolo de Taq ADN ligasa se alteró substituyendo el NaCI por Kcl. Las cond iciones exactas de ligación se ind ican con ias fig uras siguientes. Los resultados del análisis H LM q ue utiliza el protocolo de T4 ADN ligasa con 200 mM NaCI se muestran en la Fig ura 10. Aunque el HLM discriminó entre la secuencia G551 D y las secuencias para las otras mutaciones, esencialmente no hubo d iscriminación entre la secuencia G551 D y la secuencia normal con la sonda G551 D.CF. La especificidad para HLM utilizando T4 ADN ligasa de mejoró al incrementar la concentración de NaCI hasta 600 mM (Fig ura 1 1 ). Incluso se obtuvo una mejor discrim inación empleando el H LM con Taq ADN ligasa (Fig ura 12), bajo esas condiciones las d iferentes secuencias fueron fácilmente discriminadas ya sea con sondas G551 D.CF o G551 D. NO R. Utilizando el protocolo de Taq ADN ligasa con 200 mM Kcl y G551 D.CF, la discriminación fue fácilmente evidente entre las secuencias G551 D y normal, aunque se observó algo de ligación alrededor del antecedente con la secuencia objetivo normal . Esta señal estuvo disponible para ser eliminada mediante substitución de NaCI dentro del protocolo de Taq ADN ligasa (Figura 1 3) .

Tomando conjuntamente estos resultados indican la habilidad del HLM para discriminar las secuencias que difieren solamente por una base individual, incluso cuando el sitio de la base individual cambia, ocurre en posiciones removidas de la unión de ligación . Ejemplo 6: Evaluación Sistemática de la Especificidad de la Hibridación-Ligación Utilizando un Modelo p53. Los ejemplos precedentes han establecido la habilidad de HLM para discriminar las secuencias con sutiles diferencias que incluyen eliminaciones, inserciones y mutaciones de punto. En cada uno de los casos examinados se establecieron las condiciones q ue permitieron la especificidad de ligación para d iscriminar esas diferencias de secuencia. En este ejemplo, la especificidad de HLM se evalúa sistemáticamente probando su habilidad para discriminar las secuencias que difieren de todas las combinaciones posibles de faltas de apareamiento. El gen p53 codifica para una proteína que funciona como un supresor de tumor. Las mutaciones en este gen se observaron en una amplia variedad de tumores, las pociones más frecuentes para esas mutaciones se agrupan alrededor de los codones 175 , 245 y 248. Una porción del gen p53 que rodea al codón 175 (NO ID SEC 23) se seleccionó como el modelo para la evaluación sistemática de la especificidad de ligación . Las secuencias objetivo y normal para este modelo se muestran en la Fig ura 14. La h ibridación y las ligaciones se llevaron a cabo en solución . Para los ensayos que utilizan T4 ADN ligasa , las sondas (32P-NO ID SEC 24 Y 25) se mezclaron con secuencias objetivo en el regulador de ligación que contiene la concentración de NaCI indicada . Las reacciones se incubaron a 37°C durante 15 minutos, se ag regó T4 ADN ligasa (1 U) y las reacciones se incubaron a 37°C d urante 15 minutos adicionales. Se analizó una alícuota de las reacciones mediante electroforésis de gel de poliacrilamida (15%) con desnaturalización (8M urea). Las bandas que corresponden al producto de ligación y el oligómero no ligado fueron cortadas y contadas mediante conteo de escintilación líquida y, se calculó el porcentaje del oligómero total ligado. Los ensayos que utilizan Taq ADN ligasa se llevaron a cabo de manera similar excepto porque la ligasa se agregó al inicio de las reacciones. La habilidad de la T4 ADN ligasa para discriminar las faltas de apareamiento q ue ocurren en el 5'fosfato o el nucleótido 3'OH en la unión de ligación en 200 mM NaCI se resumió en el Cuadro II. Las faltas de apareamiento en el nucleótido 3'OH se discriminaron de manera mucho más fácil que las faltas de apareamiento en el nucleótido 5'P . Incrementando la concentración de NaCI hasta 600 mM se mejoró la especificidad de la T4 ADN ligasa sobre aquella observada a 200 mM. A 600 mM NaCI, se discriminaron todas las posibles faltas de apareamiento ya sea en las posiciones 5'P o 3'OH , inclusive las faltas de apareamiento G-T y C-A (Cuadro l l l). La especificidad de Taq ADN ligasa a 45°C en 200 mM Kcl fue mejor que aquella de T4 ADN ligasa (Cuadro IV). La inclusión de NaCI en el reg ulador de Taq ligasa mejoró también de algún modo la especificidad de Taq ADN ligasa (Cuadro V).

CUADRO II ESPECIFICIDAD DE T4 ADN LIGASA EN 200 mM NaCl" BASE BASE DE SONDA 3'OH BASE DE SONDA 5' P OBJETIVO c T A G C T A G G 80 51 1.9. 9.8 52 41 15 31 A 20 72 1.4 3.6 58 65 45 15 T 2.2 4.2 77 8.7 56 54 62 64 C 1.4 11 53 69 10 21 29 40 3 Los resultados resumidos en el cuadro representan los porcentajes de la cantidad total de la sonda limitante que se ligó como se determina mediante el análisis PAGE . El cuadro está dispuesto de manera que los pares complementarios de nucleótidos quedan sobre la diagonal, las entradas fuera de la diagonal son las posibles combinaciones de faltas de apareamiento. Hacer referencia a la Figura 14 para la secuencia de los híbridos formados entre las sondas y las secuencias objetivo .

CUADRO lll ESPECIFICIDAD DE T4 ADN LIGASA EN 600 mM NaCI" BASE BASE DE SONDA 3'OH BASE DE SONDA 5' P OBJETIVO a Los resultados resumidos en el cuadro representan los porcentajes de cantidad total de la sonda limitante que se ligó como se determinó mediante el análisis PAGE. El cuadro está dispuesto de tal modo que los pares complementarios de los nucleótidos quedan sobre la diagonal, las entradas fuera de la diagonal son las combinaciones posibles de faltas de apareamiento. Hacer referencia a la Figura 14 para la secuencia de los híbridos formados entre las sondas y las secuencias objetivo.

CUADRO IV ESPECIFICIDAD DE T4 ADN LIGASA EN 200 MM KCl* BASE BASE DE SONDA 3'OH BASE DE SONDA 5'P OBJETIVO a Los resultados resumidos en el cuadro representan los porcentajes de la cantidad total de la sonda limitante que fue ligada como se determinó mediante el análisis PAGE. El cuadro está dispuesto de manera que los pares complementarios de nucleótidos quedan sobre la diagonal, las entradas fuera de la diagonales son combinaciones posibles de faltas de apareamiento. Hacer referencia a la Figura 14 para la secuencia de los híbridos formados entre las sondas y las secuencias objetivo.

CUADRO V ESPECIFICIDAD DE T4 ADN LIGASA EN 25 MM Kcl/75 mM NaCI8 BASE OBJETIVO BASE DE SONDA 3'OH G 31 0.6 0.7 0.7 A 1.5 46 0.7 2.5 T 0.8 2.5 51 1.7 C 0.8 0.8 0.8 39 3 Los resultados resumidos en el cuadro representan los porcentajes de cantidad total de la sonda limitante que se ligó como se determinó mediante el análisis PAGE. El cuadro está dispuesto de tal modo que los pares complementarios de los nucleótidos quedan sobre la diagonal, las entradas fuera de la diagonal son las combinaciones posibles de faltas de apareamiento. Hacer referencia a la Figura 14 para la secuencia de los híbridos formados entre las sondas y las secuencias objetivo.

Ejemplo 7: Ensayos para los Alelos Normal y delta F-508 en ADN humano amplificado RCP Utilizando el Porcentaje de Ligación como Criterio de Diagnóstico Las muestras de ADN humano amplificadas RCP fueron recibidas de un laboratorio independiente. Los análisis HLM de los alelos delta F-508 (NO ID S EC 1 ) y normal (NO ID SEC 2) se ejecutaron como se describe en los ejemplos previos. En la etapa de desnaturalización para remover la sonda hibridizada aunque no ligada, el sobrenadante que contiene esta sonda liberada fue reservada y sometida a evaporación instantánea por separado , además de someter a evaporación instantánea el PMP q ue conten ía la sonda hibridizada , etiquetada y ligada . La suma de las señales quimioluminiscentes a partir del sobrenadante y PMP proporciona una medid a de la cantidad total de sonda etiquetada q ue hibridizó a ia muestra. Esta a su vez, proporciona una medida de la cantidad total de la muestra ADN en la reacción . Además, la señal quimioluminiscente a partir de PMP dividida entre la suma de las señales q uimioluminiscentes a partir del sobrenadante y PMP proporciona una medida la fracción de la sonda hibridizada q ue fue ligada. Ya que la cantidad de prod ucto RCP obten ido a partir de cad a muestra de ADN humano puede variar de una m uestra a otra, la fracción de sonda etiq uetad a ligada proporciona una d istinción más clara entre las muestras que son homócigas para u n alelo , las muestras que son heterócigas para un alelo y , aquellos que no contienen el a lelo . Además, ya q ue se puede esperar q ue se hibridicen las sondas a alelos delta F-508, normal y delta 1-507, la determinación de la q uimioluminiscencia de la sonda etiquetada liberada en la etapa de desnaturalización, proporciona un med io para determinar que los componentes del ensayo están funcionando adecuadamente aquellas muestras que son negativas a la ligación . Los resultados H LM para el ensayo delta F-508 calculados como porcentaje de ligación se resumen en la Figura 15. Podría hacerse una clara discriminación entre las m uestras homócigas, heterócigas y negativas en base al porcentaje calculado de la sonda etiquetada ligada . Este parámetro calculado resulta ser un índice de d iagnóstico más confiable que los datos quimioluminiscentes inconclusos debido a que se encontró que las muestras varían más de 5 veces en la cantidad total de ADN presente (datos no mostrados). En la Figura 16, resultados de HLM similares para el ensayo del alelo normal se compararon con aquellos del ensayo delta F-508. Ejemplo 8: Efecto de la Concentración de NaCI sobre la Discriminación de Alelos Delta F-508 y Delta I-507 Las secuencias para esos dos alelos difieren en una sola posición . (Ver Figura 4). Utilizando el H LM con T4 ADN ligasa en 200 mM NaCI, fue posible discriminar entre esas dos mutaciones de fibrosis cística (Ver Ejemplos 1 y 2). E n vista de los resultados en el Ejemplo 6 que muestran el efecto de la concentración NaCI de la especificidad de T4 ADN ligasa con las secuencias p53, el efecto de la concentración de NaCI sobre la habilidad de T4 ADN ligasa pa ra discriminar entre las secuencias delta F-508 y delta 1-507 utilizando las sondas delta F-508 que se examinaron. El HLM se efectuó sobre secuencias objetivo sintéticas delta F-508 y delta 1-507 como de describió excepto porque los reguladores de ligación estaban compuestas ya sea con 200, 400, 600, 800 o 1000 mM NaCl. En la etapa de desnaturalización, se reservó el sobrenadante y fue sometido a evaporación instantánea por separado a fin de determinar la cantidad de sonda hibridizada aunque no ligada. El porcentaje de la sonda 508.CF-DMAE que había sido ligada fuera de la cantidad total hibridizada se calculó como se describe en el Ejemplo 7. Los resultados se resumen en la Figura 17. Hubo suficiente discriminación mediante T4 ADN ligasa en 200 mM NaCI para distinguir entre las secuencias delta F-508 y delta I-507.

Incrementando la concentración de sal hasta 600 mM se mejoró ia discriminación entre esas secuencias mediante la supresión de la cantidad de ligación observada con la secuencia delta I-507 en tanto que se mantiene el nivel de ligación con la secuencia delta F-508. A concentraciones de NaCI por arriba de 600 mM, la ligación con la secuencia objetivo F-508 empieza a declinar. Ejemplo 9: Ensayo de Hibridación-Ligación para AF-508 con Sonda Biotinilada y Avidina-PMP. Las reacciones de hibridación y ligación se llevaron a cabo en solución con una sonda biotinilada (Biotin-CFI) y una sonda etiquetada con éster de acridinio (508.CF-AE). Las reacciones de hibridación-ligación se llevaron a cabo en 100 µl de regulador (20 mM Tris, pH 8.3, 100 mM NaCI, 100 mM Kcl, 10 m M MgCI2, 10 µl ARNt, 0.5 mM NAD y 0.01 % Tritón X-100) que contiene 1 pmol de Biotin-CFI, 100 fmol de 508.CF-AE , y 100 unidades Taq ADN ligasa a 50°C . Las reacciones se iniciaron med iante la adición de 1 ) 1 fmol de secuencia objetivo normal, 2) 1 fmol de secuencia objetivo AI-507, 3) 1 fmol de secuencia objetivo AF-508 o 4) sin secuencia objetivo. Las reacciones fueron incubadas a 50°C d urante 1 hora . A cada reacción se agregó 10 ug de avidina-PMP (Promega) y se incubaron durante 10 minutos adicionales. Las partículas se precipitaron mag néticamente, se aspiró el sobrenad ante y las partículas fueron lavadas con 0.2X SSC/0.1 % Tween 20. Se repitieron dos veces los lavados. La avidina-PMP fue suspendida nuevamente en 150 µl de regulador de lavado e incubada a 55°C d urante 10 minutos para remover la sonda hibridizada aunque no ligada. La avidina-PMP fue separada magnéticamente, el sobrenadante removido y sometida a evaporación insta ntánea . La avidina-PMP fue lavada una vez, se suspendió nuevamente en 100 µl 10 mM MgCI2, 50 mM Tris, pH 7.5 que contiene Dnasa I (BRL) y se sometió a evaporación instantánea . Los resultados del ensayo se resumen en el siguiente cuad ro .

Objetivo Porcentaje de Ligación Normal 0% AF-507 24% AF-508 60% Este formato de ensayo muestra la viabilidad del uso de un reactivo de fase sólida universal (avidina-PMP) con una sonda biotinilada. Este formato puede ser especialmente útil en esquemas de multiplicación donde se espera que los ensayos para un número de sitios genéticos puedan ejecutarse en el mismo tubo. Además, las hibridaciones y ligaciones de fase de solución pueden proceder más rápidamente que aquellas que involucran una sonda inmovilizada sobre PMP. Ejemplo 10: Especificidad de Ligación y Resultados del Modelo G551D Estos resultados amplían aquellos dados en el Ejemplo 5 en la presente solicitud. Los ensayos de hibridación-ligación se llevaron a cabo con T4 ADN y Taq ADN ligasas como se describió previamente. Los resultados de esos ensayos utilizando las sondas AE específicas para ia secuencia G551D y la secuencia normal se resumen en el cuadro. La inclusión de la secuencia objetivo designada R553X proporciona discernimiento adicional en la especificidad de ligación. (Ver Cuadro VI). En el ensayo con la sonda G551D.NOR, se discriminaron las secuencias G551S y Q552X. Esto ilustra la habilidad de las T4 y Taq ADN ligasas para discriminar las faltas de apareamiento en posiciones diferentes a la unión de ligación. Además, en el ensayo con G551D.NOR, la T4 ADN ligasa parece ser capaz de discriminar la secuencia R553X. Esto requiere la enzima para discriminar una falta de apareamiento de 5 bases a partir del lado 3 'hidroxilo de la unión de ligación. Los resultados de este ensayo ilustran la mejora en la discriminación que se puede obtener cuando están presentes dos faltas de apareamiento en oposición a una sola falta de apareamiento. Por ejem plo, en el ensayo con G551 D. NOR, la secuencia R553X no es discriminada por Taq ligasa . Visto de otra manera , la falta de apareamiento 3'(5) T-G no interfiere con la ligación mediante Taq ADN ligasa . En el ensayo con G551 D .CF, el nivel de falta de ligación para la secuencia objetivo normal fue de 5% en tanto que para R553X fue 2% . Esto ilustra la utilidad de introducir una falta de apareamiento en un sitio varias bases separado de la u nión de ligación en la mejora de la discriminación . Finalmente d icha estrategia puede perm itir la discriminación de ias faltas de apareamiento no discriminadas actualmente. Este aspecto puede ilustrarse considerando el ensayo con G551 D.CF y T4 ADN ligasa . Esta enzima no discrim ina la falta de apareamiento G-T en 5'(1 ). Sin embargo se discriminó la combinación de faltas de apareamiento que ocurre en R553X.

CUADRO VI ESPECIFICIDAD DE LIGACIÓN EN EL ENSAYO G551D Sondas Objetivo Falta de Porcen taje de Ligación ApareamienT41 Taq2 to G551D.CF ÑOR 5'(1) G-T 27% 5% G551D 30% 45% G551S 5'(1) G-T 1.0% 0% 5'(2) A-C 1.0% 0% Q552X 5'(1) G-T 1.5% 0.3% 3'(2) T-G R553X 5'(1) G-T 4% 2% 3'(5) T-G G551D.NOR ÑOR 43% 53% G551D 5'(1) A-C 5.2% 8% G551S 5'(2) A-C 5.4% 4% Q552X 3'(2) T-G 1.9% 2% R553X 3'(5) T-G 10% 51% '600 mM NaCI 2100 mM Kcl/100 mM NaCI, 55°C Ejemplo 11 : Discriminación de Faltas de Apareamiento en Posiciones Alejadas de la Unión de Ligación Una evaluación sistemática de las habilidades de T4 y Taq ADN ligasas para discriminar faltas de apareamiento en posiciones removidas una base desde la unión de ligación se emprendieron con el modelo p53 descrito en la solicitud de patente. Esas posiciones se designaron como 5'(2) y 3'(2) dependiendo del lado de la unión de ligación . Los resultados se resumen en fa figura incluida. Todas las faltas de apareamiento se d iscriminaron mediante ambas enzimas en la posición 3'(2). No se d iscriminaron todas las faltas de apareamiento 5'(2) mediante cualq uiera de las enzimas. (Ver Figura 18) Ejemplo 12: Efecto de la Concentración de Enzima Sobre la Especificidad de Ligación Se compararon dos concentraciones diferentes de T4 ADN ligasa : 1 nM contra 240 nM. Se evaluó la habilidad de T4 ADN ligasa para discriminar las faltas de apareamiento 5'(1 ) y 3'(1 ) en el modelo p53. Los resultados se resumen en la Figura . Evidentemente, la especificidad de ligación para las faltas de apareamiento 3'(1 ) mejoró a la concentración de enzima más baja sin una pérdida significativa de ligación para los apareamientos complementarios. También hubo mejora para las faltas de apareamientos 5"(1 ), especialmente para las faltas de apareamiento purina-purina , aunque no tan significativas en general como para las faltas de apareamiento 3'(1 ). (Ver ejemplos 19 y 20).

LISTADO DE SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: Ciba Corning Diagnostics Corp. Martinelli, Richard A. Arruda, John C. (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Ensayos de Hibridación-Ligación para la Detección de Secuencias de Ácido Nucleico Específicas (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 26 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Ciba-Corning Diagnostics Corp. (B) CALLE: 63 North Street (C) CIUDAD: Medfield (D) ESTADO: Massachusetts (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 02052 (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) Tipo de Medio: Diskette 3.50 pulgadas, 1.44 Mb de almacenamiento (B) Compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: IBM DOS 5.0 (E) SOFTWARE: WORD 6.0 (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL (A) NÚMERO DE SOLICITUD: No disponible (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: No disponible (C) CLASIFICACIÓN: No disponible (vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/222,613 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-04-1994 (C) CLASIFICACIÓN: No disponible (viii) INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE (A) NOMBRE: Morgenstern, A.S: (B) NÚMERO DE REGISTRO: 28,244 (C) NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: CCD-113 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELÉFONO: 508-35S-3836 (B) TELEFAX: 508-359-3885 (2) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 47 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: Delta F-508, una porción de la secuencia de exon 10 del gen CFTR que rodea al miembro de base número 1652 con la base 1653- 1655 eliminada. (Xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 1: GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATT GGT GTT TCC TAT GAT GAA TAT AG47 (3) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 50 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: Normal, una porción de la secuencia de exon 10 del gen CFTR que rodea al número de base 1652 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 2: GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC TAT GAT GAA 45 TAT AG 50 (4) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: C16B, bases 1611-1634 de exon 10 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 3: G TTT TCC TGG ATT ATG CCT GGC AC 24 (5) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: C16D, bases 1708-1684 de exon del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 4: GTT GGC ATG CTT TGA TGA CGC TTC 24 (6) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 53 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ADN/ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: PMP.508 bases 1-29 es un separador de ADN sintético; bases 30-53 constan de las bases 1656-1678 de exon 10 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 5: CCTAGTCCAA GTACGGCGCC GAAGAGGCC CT ATA TTC ATC ATA GGA 46 AAC ACC A 53 (7) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: 508. CF, bases 1629-1652 de exon 10 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 6: AT GAT ATT TTC TTT AAT GGT GCC A 24 (8) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: 508. ÑOR, bases 1629-1655 de exon 10 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 7: AA GAT GAT ATT TTC TTT AAT GGT GCC A 27 (9) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 47 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: Delta 1-507, una porción de la secuencia de exon 10 del gen CFTR que rodea al número de base 1652 con la base 1652-1654 eliminada, (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 8: GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC TTT GGT GTT TCC TAT GAT GAA 42 TAT AG 47 (10) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 56 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico/Otro ADN (A) DESCRIPCIÓN: PMP.507: bases 1-29 es un separador de ADN sintético; bases 30-56 constan de bases 1679-1653 de exon 10 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 9: CCTAGTCCAA GTACGGCGCC GAAGAGGCC CT ATA TTC ATC ATA GGA 46 AAC ACC AAA G 56 (11) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: 507. CF, consta de las bases 1626-1649 de exon 10 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 10: AT ATT TTC TTT AAT GGT GCC AGG C 24 (12) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 54 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: G542X, bases 1731-1784 de exon 11 del gen CFTR con T substituida por G en la base 1756 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 11: T GCA GAG AAA GAC AAT ATA GTT CTT TGA GAA GAA GGT GA ATC ACÁ CTG 46 AGT' GGA GG 54 (13) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 54 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: NOR1731.54, bases 1731-1784 de exon 11 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 12: T GCA GAG AAA GAC AAT ATA GTT CTT GGA GAA GGT GGA ATC ACÁ CTG 46 AGT GGA GG 54 (14) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 52 bases (B) TIPO: Otro Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ADN/ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: PMP.G542X, bases 28-52 que constan de las bases 1781-1757 de exon 11 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 13: CCTAGTCCAA GTACGGCGCC GAAGAGGCC ACT CAG TGT GAT TCC ACC 47 TTC TC 52 (15) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: G542X.CF, bases 1756-1730 de exon 11 del gen CFTR con T substituida por C en la base 1756 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 14: A AAG AAC TAT ATT GTC TTT CTC TGC AA 27 (16) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: G542X.NOR, bases 1756-1730 de exon 11 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 15: CAÁ GAA CTA TAT TGT CTT TCT CTG CAÁ 27 (17) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 45 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: G551D, bases 1763-1807 de exon 11 del gen CFTR con A substituida por la G en la base 1784 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 16: GT GGA ATC ACÁ CTG AGT GGA GAT CAÁ CGA GCA AGA ATT TCT TTA G 45 (18) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 45 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: NOR17632.45, bases 1763-1807 de exon 11 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 17: GT GGA ATC ACÁ CTG AGT GGA GGT CAÁ CGA GCA AGA ATT TCT TTA G 45 (19) INFORMACIÓN DE NO ID SEQ: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 45 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: G551S, bases 1763-1807 de exon 11 del gen CFTR con A substituido por G en la base 1783 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 18: GT GGA ATC ACÁ CTG AGT GGA AGT CAÁ CGA GCA AGA ATT TCT TTA G 45 (20) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 45 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: Q552X, bases 1763-1807 de exon 11 del gen CFTR con T substituida por C en la base 1786 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 19: GT GGA ATC ACÁ CTG AGT GGA GGT TAA CGA GCA AGA ATT TCT TTA G 45 (21 INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 52 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ADN/ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: PMP.G551D, bases 30-52 que constan de las bases 1785-1807 de exon 11 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 20: CCTAGTCCAA GTACGGCGCC GAAGAGGCC C TAA AGA AAT TCT TGC 45 TCG TTG A 52 (22) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: G551D.CF, bases 1784-1763 de exon 11 del gen CFTR con T substituida por C en la base 1784 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 21: TC TCC ACT CAG TGT GAT TCC AC 22 (23) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: G551D.NOR, bases 1784-1763 de exon 11 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 22: CC TCC ACT CAG TGT GAT TCC AC 22 (24) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: p53, codón de flanqueo 175 de 35 bases del gen p53 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 23: ATG AGG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GA 35 (25) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: p53.5\ La secuencia de 16 bases que extiende 5' desde el C del codón 175 del gen p53. (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 24: TC ATG GTG GGG GCA GC 16 (26) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: p53.3', La secuencia de 19 bases que extiende 3' desde el G del codón 175 del gen p53. (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 25: G CCT CAC AAC CTC CCT CAT 19 (27) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 45 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (A) DESCRIPCIÓN: R553X, bases 1763-1807 de exon 11 del gen CFTR con T substituida por C en la base 1789 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 26: GT GGA ATC ACÁ CTG AGT GGA GGT CAÁ TGA GCA AGA ATT TCT TTA G 45 (28) INFORMACIÓN DE NO ID SEC: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (A) DESCRIPCIÓN: CF1, bases 1656-1678 de exon 10 del gen CFTR (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 27: CT ATA TTC ATC ATA GGA AAC ACC 24

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar una secuencia de ácido polinucléico objetivo que comprende: a. seleccionar 2 sondas, de modo que 1. cuando las dos sondas estén ligadas, son complementarias a una parte o a toda la secuencia esperada de dicho ácido polinucléico objetivo, 2. una de las sondas está unida a una porción que permite que está sonda sea fácilmente separada de la mezcla de reacción y, 3. la otra sonda está unida a una etiqueta, b. mezclar las sondas con el ácido polinucléico objetivo de tal manera que las sondas se hibridizarán al ácido polinucléico objetivo, c. agregar un reactivo de ligación, d. desnaturalizar la mezcla de reacción de modo que la sonda se separará del ácido polinucléico objetivo, e. separar la sonda, utilizando la porción que permite la separación, y f. analizar la sonda separada para determinar si la etiqueta está unida a la misma. 2. Un método para identificar una secuencia de ácido polinucléico objetivo que comprende: a. seleccionar 2 sondas, de modo que

1. si las dos sondas estén ligadas, son complementarias a una parte o a toda la secuencia esperada de dicho ácido polinuciéico objetivo,

2. una de las sondas está unida a una porción que permite que está sonda sea fácilmente separada de la mezcla de reacción y, 3. la otra sonda está unida a una etiqueta, b. mezclar las sondas con el ácido polinucléico objetivo de tal manera que las sondas se hibridizarán al ácido polinucléico objetivo, c. analizar la sonda separada para determinar si la etiqueta está unida a la misma.

3. Un método de la reivindicación 1, en donde la porción que permite que la sonda sea separada es una partícula insoluble.

4. Un método de la reivindicación 1, en donde la porción que permite la sonda sea separada es una partícula magnética.

5. Un método de la reivindicación 1, en donde la etiqueta se selecciona del grupo que consta de porciones enzimáticas, porciones radioactivas, porciones fluorescentes, porciones luminiscentes y entidades que permiten la unión subsecuente a una etiqueta.

6. Un método de la reivindicación 5, en donde dichas entidades que permiten la unión subsecuente a una etiqueta son avidina o biotina.

7. Un método de la reivindicación 5, en donde la etiqueta es un material luminiscente.

8. Un método de la reivindicación 1, en donde la etiqueta es un éster de acridinio

9. Un método de la reivindicación 1, en el que la etiqueta es un éster de acridinio y el análisis de la sonda separada para determinar la presencia de la etiqueta comprende la adición de ADNasa antes de la adición del reactivo de evaporación instantánea.

10. Un método de la reivindicación 1, en donde el ácido polinucléico objetivo se selecciona a partir del grupo que consta de ADN o polímeros del mismo, ARN o polímeros del mismo y material viral.

11. Un método de la reivindicación 1, el cual incluye también una etapa para amplificar el ácido polinucléico objetivo antes de que se mezcle con dichas sondas.

12. Un método de la reivindicación 11, en el cual la técnica de amplificación se selecciona a partir del grupo que consta de la reacción de cadena de polimerasa, reacción de cadena de ligasa y QB replicasa.

13. Un método de la reivindicación 1, en el cual el agente de ligación actúa enzimáticamente o químicamente para unir las dos sondas.

14. Un método de la reivindicación 13, en el cual el agente de ligación es ligasa.

15. Un método de la reivindicación 11, en el cual el cloruro de sodio está presente durante fa etapa de ligación, como el cloruro de sodio que está presente a una concentración de 200-1000 mM.

16. Un método de la reivindicación 15, en el cual la concentración de cloruro de sodio es de 500-700mM.

17. Un método de la reivindicación 16, en el cual la concentración de cloruro de sodio es de aproximadamente 600 mM.

18. Un método de la reivindicación 1, en el cual, después de la desnaturalización la muestra es pasada a través de una columna de cromatografía, dicha columna siendo analizada después para determinar si la etiqueta está unida a la misma.

19. Un método para identificar una posible mutación en un ADN objetivo que comprende: a. seleccionar 2 sondas, de modo que 1. si las 2 sondas fueron ligadas, serían complementarias a una parte o a toda la secuencia de dicho ADN objetivo, 2. una de las sondas está unida a una porción que permite que esta sonda sea fácilmente separada de la mezcla de reacción y, 3. la otra sonda está unida a una etiqueta, b. combinar las sondas con el ADN objetivo de tai manera que las sondas se hibridizarán al ácido polinucléico polimérico, c. separar la sonda, utilizando la porción que permite la separación, y d. analizar la sonda separada para determinar si la etiqueta está unida a la misma.

20. Un método para identificar una posible mutación en un ADN objetivo que comprende: a. seleccionar dos sondas, de manera que 1. cuando las dos sondas fueron ligadas, son complementarias a una parte o a toda la secuencia posible de dicho ADN objetivo, 2. una de las sondas está unida a una porción que permite que está sonda sea fácilmente separada de la mezcla de reacción, y 3. la otra sonda está unida a una etiqueta, b. combinar las sondas con el ADN objetivo de tal manera que ias sondas se hibridizarán al ácido polinucléico objetivo. c. agregar un reactivo de ligación, d. desnaturalizar fa mezcla de reacción de manera que la sonda sea separada a partir del ADN, e. separar la sonda, utilizando la porción que permite la separación, y f. analizar la sonda separada para determinar si la etiqueta está unida a la misma.

21. Un método de la reivindicación 20, en donde la mutación es una de las diversas que podrían ocurrir en el ADN objetivo.

22. Un método de la reivindicación 20, en donde se utilizan diferentes sondas, cada una siendo específica para una de las secuencias objetivo esperadas y cada una utilizando una etiqueta o porción que permite la separación de manera que el análisis de la sonda separada permite la identificación de la secuencia o secuencias presentes en el objetivo.

23. Un método para identificar una secuencia de ácido polinucléico objetivo que comprende: a. seleccionar 2 sondas, de modo que 1 . cuando las dos sondas son ligadas, son complementarias a una parte o a toda la secuencia probable de d icho ácido polinucléico, 2. una de las sondas está unida a una subunidad de la secuencia de midivariancia , y 3. la otra sonda está unida a la segunda subunidad de midivariancia , b. combinar las sondas con el ácido polinucléico objetivo en una manera que las sondas hibrid izarán al ácido polin ucléico objetivo, c. agregar un reactivo de ligación , d . opcionalmente desnaturalizar la mezcla de reacción de manera que la sonda sea separada a partir del ácido polinucléico objetivo , e. analizar la sonda separada para determinar si dicha sonda tiene la habilid ad para duplicarse si se coloca en u na mezcla de reacción que contiene QB replicasa .

24. El método de la reivindicación 23, en el cual la QB replicasa se agrega junto con las sondas y, el análisis comprende la determinación de si las sondas se han duplicado.

25. Un método para identificar si la secuencia de un ácido polinucléico objetivo es complementaria a aquella de dos o más sondas que comprende: a. seleccionar dichas sondas, de modo que 1. cuando las sondas están ligadas, son complementarias a una parte o a toda la secuencia esperada del ácido polinucléico objetivo, 2. una de las sondas terminales está unida a una porción que permite que esta sonda sea fácilmente separada a partir de la muestra de reacción, y 3. la otra sonda terminal está unida a una etiqueta, b. combinar las sondas con el ácido polinucléico objetivo de tal manera que las sondas hibridizarán al ácido polinucléico objetivo, c. agregar un reactivo de ligación, d. desnaturalizar la mezcla de reacción separada de manera que la sonda será separada a partir del ácido polinucléico objetivo, e. separar la sonda, utilizando la porción que permite la separación, y f. analizar la sonda separada para determinar si la etiqueta está unida a ella.

26. Un método de la reivindicación 1, en el cual la etiqueta está ubicada en una posición tal que no interfiere con la hibridación y la ligación.

27. Un método de la reivindicación 1, el cual incluye también el procedimiento en donde, antes de la desnaturalización, se remueve una alícuota, dicha alícuota siendo analizada para determinar si la etiqueta es hibridizada al objetivo mediante a. la separación de la sonda que contiene la porción que permite la separación y las otras entidades unidas a la misma y b. el análisis de dicha sonda separada para determinar si la etiqueta está unida a la misma.

28. Un método de la reivindicación 1, el cual incluye también analizar el sobrenadante remanente después de la separación de dicha sonda que contiene la porción que permite la separación para analizar dicho sobrenadante para la presencia de la etiqueta contenida en el mismo.

29. Un método de la reivindicación 1, 14, 20 o 23, en donde el reactivo de ligación se selecciona a partir del grupo que consta de Taq ADN ligasa o T4 ADN ligasa.

30. Un método de la reivindicación 30, en el cual el regulador que contiene dicha Taq ADN ligasa incluye también en el mismo ARNt.

31. Un método de la reivindicación 1, 20, 23 o 25, en donde el reactivo de ligación se agrega al mismo tiempo que las sondas.