MXPA96004194A - Luciferasas - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona proteínas que tienen actividad de luciferasa con mayor estabilidad térmica que la luciferasas de tipo silvestre reemplazando el equivalente de glutamato hasta aquel de la posición 354 de la luciferasa de Photinus pyralis o 356 de las luciferasas Luciola con un aminoácido alternativo, particularmente lisina, ADN, vectores y células que se codifican para y expresan las protéinas que también se proporcionan como estuches de prueba y reactivos para llevar a cabo los ensayos de luminiscencia usando las proteínas de la invención. Las proteínas preferidas tienen un segundo aminoácido reemplazado en una posición equivalente a la posición 215 de la liciferasa de Photinus pylaris o 217 de las luciferasas Luciola.

Description

"LUCIFERASAS" La presente invención se relaciona con proteínas novedosas que tienen actividad de luciferasa y con la codificación de ADN y vectores para su expresión. Particularmente, la presente invención proporciona luciferasas que tienen estabilidad térmica a temperaturas mayores de 30°C. La luciferasa de la luciérnaga cataliza la oxidación de la luciferina en presencia de ATP, Mg2+ y oxígeno molecular con la producción resultante de luz. Esta reacción tiene un rendimiento cuántico de aproximadamente 0.88 (véase DeLuca & McElroy (1978) y Saliger & McElroy (1960) ) y esta propiedad emisora de luz ha conducido a su uso en ensayos luminométricos en donde se están midiendo los niveles de ATP. La luciferasa es obtenible directamente de los cuerpos de los insectos tales como luciérnagas o cocuyos o mediante expresión de microorganismos incluyendo la codificación de construcciones de ADN recombinante para la enzima. Cuatro especies significativas de luciérnagas de las cuales puede obtenerse la enzima, o de la cual puede derivarse la codificación de ADN para la misma, son las luciérnagas Japonesas GENJI y HEIKE, Lucióla cruciata y Lucióla lateralis, la Luciérnaga Europea del Este Lucióla mingrelica y la luciérnaga Norteamericana (Photinus piralis) . El cocuyo Lampyris noctiluca es una fuente adicional con la secuencia de aminoácido de su luciferasa teniendo 84 por ciento de homología con respecto a aquella de Photinus pyralis. La estabilidad térmica de las luciferasas del tipo silvestre y recombinante es de tal manera que pierden actividad bastante rápidamente cuando se expongan a temperaturas en exceso de aproximadamente 30°C, particularmente de más de 35°C. Esta inestabilidad hace deficiente la enzima cuando se usa o se almacena a altas temperaturas ambiente, o si se requiere un aumento inducido por el calor en el régimen de reacción. Se sabe que la luciferasa de la luciérnaga Japonesa puede estabilizarse contra inactivación térmica mutando la misma en su posición 217 para reemplazar un residuo de treonina mediante un residuo de isoleucina (Kajiyama & Nakano (1993) Biochemistry 32 páginas 13795 a 13799) . De esta manera, la estabilidad térmica de pH y la actividad específica de la enzima se aumentaron. La estabilización térmica de las luciferasas de Photinus pyralis y Lucióla mingrelica todavía no se han dado a conocer. Los inventores presentes han proporcionado ahora luciferasas novedosas que tienen estabilidad térmica aumentada en relación con las luciferasas del tipo silvestre reemplazando un residuo de glutamato presente en una secuencia conservada en cada una de Photinus pyralis. Lucióla mingrelica, Lucióla lateralis y Lucióla cruciata con aminoácidos alternativos, particularmente lisina o arginina. Este glutamato se encontró en la posición 354 en la luciferasa de Photinus pyralis, en el tercer aminoácido de la secuencia de aminoácido conservada TPEGDDKPGA encontrada en las luciferasas de esta y otras especies. Por lo tanto, en el primer aspecto de la invención se proporciona una proteína que tiene actividad de luciferasa y que tiene más del 60 por ciento de homología de la secuencia de aminoácido con aquella de Photinus pyralis, Lucióla mingrelica, Lucióla cruciata o Lucióla lateralis, caracterizada porque el residuo de aminoácido que corresponde al residuo 354 de la luciferasa Photinus pyralis y residuo 356 de la luciferasa de Liciola mingrelica, Lucióla cruciata y Lucióla lateralis es un aminoácido que no sea glutamato. El aminoácido puede ser un aminoácido que ocurre de manera natural o puede ser un llamado aminoácido inusitado tal como el aminoácido que ocurre de manera natural modificado o un análogo de mismo. Los análogos de aminoácidos que no sean glutamatos se comprenderá como siendo aquellos compuestos que tienen un efecto equivalente en la proteina con respecto al aminoácido del cual son - A - análogos. Los aminoácidos inusitados típicos son aquellos señalados en los "US and European Patentin Manuals" y las "Rules of Practice in Patent Cases": las exposiciones de aplicación que contienen secuencias de nucleótido y/o aminoácido: aminoácidos modificados inusitados. De preferencia la proteína está caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos XGDDKPGA en donde X es el aminoácido que no sea el glutamato. De mayor preferencia, la proteína comprende la secuencia de aminoácido TPXGDDKPGA y preferiblemente, para termoestabilidad, X es cualquier aminoácido que no sea el ácido aspártico, prolina o glicina; todavía de mayor preferencia es triptofán, valina, leucina, isoleucina o asparagina pero de manera especialmente preferida es lisina o arginina, o un análogo de cualesquiera de estos. Se comprenderá que algunas especies pueden tener luciferasas con uno o dos aminoácidos diferentes en esta región conservada TPXGDDKPA, pero todas las proteínas activas que corresponden a estas luciferasas que están alteradas hasta el grado de que el aminoácido en la posición tres en la secuencia no es glutamato, se proporcionan mediante la presente invención. En formas preferidas de la presente invención, la proteina de la invención también tiene el aminoácido en la posición que corresponde al aminoácido 217 de las luciferasas de la luciérnaga Lucióla o 215 de Photinus pyralis cambiado a un aminoácido hidrofóbico, de preferencia a isoleucina, leucina o valina, como se describe en la Patente Número 0524448 A. Este cambio se ha encontrado que da por resultado un aumento en la termoestabilidad en relación con el cambio 354 solo; por lo tanto, los dos cambios tienen efectos que son esencialmente independientes uno del otro y que pueden usarse juntos. En un segundo aspecto de la invención, se proporciona codificación de ADN para la proteína de la invención y en un tercer aspecto se proporciona un vector, particularmente un plásmido, que comprende un gen l uc (la codificación del gen para luciferasa) de tal forma como para ser capaz de expresar la proteína de la invención. Estas formas son aquellas en donde el vector incluye las secuencias de ADN capaces de controlar la expresión de la proteína de la invención de tal manera que cuando se incorpora en una célula huésped de microorganismo, la proteína puede expresarse fácilmente como se requiere, si es necesario, mediante la adición de agentes de inducción apropiados . Los genes l uc para Photinus pyralis, Lucióla mingrelica, Lucióla cruciata y Lucióla lateralis son todos conocidos y capaces de aislarse mediante técnicas de biología moleculares normales. El gen l uc de Photinus pyralis puede obtenerse comercialmente de Promega como el plásmido pGEM. De esta manera, los métodos y fuentes convenientes para derivar el material de partida para la producción de ADN de la invención son (i) el uso de ADN genómico de la luciérnaga que ocurre de manera natural y amplificando el gen l uc del mismo usando, v.gr, el plásmido PCR, (ii) pGEM y (iii) pGLf37 de Kajiyama & Nakano. La codificación de genes adicionales para proteínas que tienen actividad de luciferasa, es decir, la actividad de luciferina oxidante con la emisión de luz, también serán fuentes apropiadas para material de partida para obtener un ADN, y finalmente a través de la expresión del gen, una proteína de la invención. Los vectores apropiados para usarse en la manipulación del tipo silvestre u otro ADN del gen l uc a fin de producir el ADN de la invención, será cualquier vector en donde el ADN puede quedar contenido dentro del mismo mientras que se lleva a cabo la alteración del glutamato que ocurre de manera natural en un aminoácido alternativo. Para mutagénesis inducida químicamente, v.gr., usando agentes tales como hidroxilamina, esto no es particularmente crítico y se les ocurrirán muchos vectores apropiados a aquellas personas expertas en la técnica que permitirán la manipulación fácil del gen antes y después del proceso mutagénico.

Puede ser preferido mutar específicamente el gen l uc en el glutamato y por lo tanto se requerirá un sitio dirigido a la operación de mutagénesis. Estas operaciones pueden llevarse a cabo muy fácilmente en vectores y estos serán conocidos por aquellas personas expertas en la técnica. Para la expresión de los genes l uc del tipo silvestre y el tipo conocido, y aquellos de la presente invención, los vectores apropiados incluyen pKK223-3, pDR540 (obtenible de Boehringer Mannheim) y pT7-7; los primeros dos tienen el promotor tac bajo el control del represor de lactosa permitiendo que la expresión sea inducida por la presencia de isopropil-tiogalactosido (IPTG). pT7-7 permite el control mediante el promotor de polimerasa T7 ARN y por lo tanto proporciona a la base para un nivel muy elevado de expresión de gen en las células E. coli que contienen polimerasa de T7 ARN. De estos vectores se encuentra que la expresión es más elevada cuando los genes l uc se insertan en el vector pT7-7. La expresión de la luciferasa de un gen l uc insertado en PKK223-3 y pDR540 da por resultado en la expresión que la luciferasa de secuencia N-terminal de tipo silvestre mientras que la expresión de un gen l uc insertado en pT7-7 da por resultado la síntesis de una proteína de fusión con aminoácidos N-terminales extra M-A-R-I-Q. El sitio de ligazón de ribosoma y el codón de partida del gen Juc en cada uno de los vectores con el gen l uc presente (llamadas las construcciones pPW204, pPW116 y pPW304) se muestran en el Cuadro 1 de los Ejemplos. Un tercer aspecto de la presente invención proporciona células capaces de expresar las proteínas de la invención; métodos para producir estas proteínas usando estas células y estuches de prueba y reactivos que comprende las proteínas de la invención. Se proporcionan asimismo métodos de ensayo en donde ATP se mide usando reactivos de luciferina/luciferasa, como es bien conocido en la técnica, caracterizado porque la luciferasa es una proteína de la invención. Las preparaciones de luciferasa de la invención son relativamente termoestables a temperatura de 30°C a 70°C, particularmente de 37°C a 60°C, y especialmente de 40°C a 50°C en comparación con las luciferasas de tipo silvestre y de tipo silvestre recombinante. Cualquier célula capaz de expresar la proteina heterológa usando secuencias de ADN en su ADN, o en vectores tales como los plásmidos contenidos en la célula, se puede usar para expresar las proteínas de la invención. Típicas de estas células serán las células de levadura y bacterianas tales como las células Saccharomyces cerevisiae y Escherichia coli, pero muchos otrsos organismos huéspedes apropiados para el objeto de expresión de proteína se les ocurrirán a aquellas personas expertas en la técnica. Las células del insecto pueden preferirse puesto que la proteína es una proteína del insecto. La proteína puede expresarse como proteína de estructura semejante a las luciferasas nativas y recombinantes conocidas, o puede expresarse como una fusión o conjugado de estas proteínas con otros aminoácidos, péptidos, proteínas u otras entidades químicas, v.gr., la secuencia M-A-R-I-Q anteriormente citada. Se comprenderá por aquellas personas expertas en la técnica que ciertos huéspedes pueden tener preferencias de codón específicas, v.gr., la bacteria en algunos casos usa codones diferentes a la levadura y por lo tanto el ADN incorporado en este huésped y puede alterarse ventajosamente para proporcionar un codón degenerado para un aminoácido determinado que proporcionará una expresión más favorable en ese huésped. Estos ADN degenerados desde luego quedan incluidos en el alcance del ADN de la invención. E. coli BL21(DE3) es un huésped apropiado y tiene la polimerasa de T7 ARN integrada establemente en su cromosoma bajo el control del promotor lacUV5 inducible y es por lo tanto compatible con las construcciones derivadas de pT7-7. Las cepas de E coli B al igual que BL21 carecen de la proteasa Ion y la proteasa de membrana externa o pT. Estas deficiencias pueden ayudar a estabilizar la expresión y acumulación de proteínas extrañas en E. coli. Los ensayos de extractos crudos de E. coli BL21 (DE3) que contienen una de estas tres construcciones de expresión descritas en lo que antecede, indicaron que los niveles de expresión de luciferasa más elevados se obtuvieron de las células que contienen la construcción pPW304 (véase el Cuadro 2) . Las proteínas mutantes de la invención proporcionan ventajas que no sean la termoestabilidad. Se ha encontrado que la mutación del aminoácido en la posición Photinus 354/Luciola 356 proporcionó un cambio en la longitud de onda de la luz emitida durante la oxidación de la luciferina, que depende del aminoácido o análogo con el cual se substituye el glutamato. Por lo tanto, la invención proporciona asimismo luciferasas para usarse como etiquetas de agente de ligazón específico o genes informadores que informan de nuevo la identidad como una longitud de onda de luz específica cuando la oxidación de la luciferina usa sus productos de proteína; esta propiedad proporciona utilidad a estas mutaciones como glicina, prolina y aspartato. Una ventaja adicional de las proteínas de la invención, que se derivan de su termoestabilidad aumentada, es la capacidad para producir las mismas a temperatura más elevada, v.gr, a 37°C o mayor, con un rendimiento correspondientemente aumentado, como se ejemplificará a continuación. Las proteínas, ADN, vectores y células de la invención ahora se describirán a modo de ilustración únicamente haciendo referencia a los siguientes Ejemplos no limitativos, Figuras, Cuadros y Listado de Secuencias. Las proteínas adicionales, conjugados de proteínas, ADN, vectores y células, y ensayos y estuches de prueba que incorporan cualesquiera de los anteriores se les ocurrirán a aquellas personas expertas en la técnica en vista de estas . FIGURAS Figura 1: muestra un mapa de restricción del plásmido pPW204 derivado de pKK223-3 mediante inserción de un gen l uc como se describe en los Ejemplos que se presentan a continuación. Figura 2: muestra un mapa de restricción del plásmido pPW116 derivado de pDR540 mediante inserción de un gen l uc como se describe en los Ejemplos que se presentan a continuación. Figura 3: muestra un mapa de restricción del plásmido pPW304 derivado de pT7-7 mediante inserción de un gen l uc como se describe en los Ejemplos que se proporcionan a continuación.

Figura 4: muestra un mapa de restricción del plásmido pPW601a derivado de pDR540 y el fragmento BamHl/ Sstl de pGEM-luc con el sitio Xho removido. Figura 5: muestra una gráfica de la inactivación térmica de las luciferasas recombinantes y de tipo silvestre Photinus (Sigma) incubadas a una temperatura determinada durante períodos de 20 minutos como se describe en los Ejemplos que se presentan a continuación. Figura 6: muestra una gráfica de la actividad de la luciferasa en extractos crudos de E. coli BL21 (DE3) pPW304 durante el crecimiento a diferentes temperaturas. Figura 7: muestra una gráfica de la inactivación térmica de la actividad de las luciferasas derivadas de pP 304 y pPW304M-l (plásmido de la codificación de la invención de tal manera que la lisina reemplaza el glutamato 354) . Figura 8: muestra una gráfica de la inactivación que depende del tiempo de las luciferasas recombinantes del tipo silvestre Sigma y pPW304 y pPW304M-l a 37°C. Figura 9: muestra un mapa de restricción de pT7-7 después de Tabor. Figura 10: muestra una gráfica que ilustra la inactivación térmica en un estabilizador de lisis Promega a 40°C de actividad de los extractos de célula crudos de coli que expresa la luciferasa de la invención expresando luciferasas que tienen substituciones de alanina, valina, leucina, isoleucina, tirosina, fenilalanina, triptofán, glutamina, histidina, asparagina, metionina, arginina, lisina, serina, treonina y cisteina respectivamente para el glutamato de tipo silvestre en la posición 354. Figura 11: muestra una gráfica que ilustra la inactivación térmica de la actividad de la luciferasa mutante doble purificada que tiene los cambios de Lisina E354K y Leucina A215L a 47°C en un estabilizador de fosfato en comparación con los mutantes individuales A215L y E354K. Figura 12: muestra una gráfica del porcentaje de actividad inicial del mutante de Lisina E354K, las luciferasas de recombinante de tipo silvestre y nativas que permanecen contra el tiempo a 37°C en el estabilizador pH7.75 HEPES con 0.02 por ciento de azida. Figura 13: muestra una gráfica de la expresión de luciferasa a 37°C para mutantes recombinantes de tipo silvestre, E354K sencillo y E354K+A215L dobles con un aumento en la densidad óptica como una medida de densidad de célula de cultivo trazada contra la actividad de la luciferasa. Figura 14: muestra una gráfica del porcentaje de actividad inicial contra el tiempo de lOng/mililitro de cada una de las luciferasas A215L y E354K sencilla, A215L+E354K doble, recombinante del tipo silvestre Sigma a través de 5 horas en HEPES pH7.75 que contiene 1 por ciento de BSA y 0.02 por ciento de azida a 37°C. Figura 15: muestra una gráfica del porcentaje de actividad inicial contra el tiempo de lOng/mililitro de cada uno de las luciferasas A215L y E354K sencillas, A215L+E354K dobles, recombinantes y de tipo silvestre Sigma a través de 5 horas en HEPES pH7.75 que contiene 1 por ciento de BSA, 0.02 por ciento de azida, 2mM de EDTA y 2mM de DTT a 37°C. LISTADO DE SECUENCIAS: El listado de secuencias que se proporciona al final de esta especificación describe las secuencias de ADN y aminoácido de la siguiente manera: SEQ ID NO 1 : muestra la secuencia de ADN y una codificación de ADN para la luciferasa de la invención en donde el codón de tipo silvestre Photinus pyralis en 1063 a 1065 se somete a mutación; para lisína la base de 1063 se someta a mutación hasta una A. SEQ ID No 2: muestra la secuencia de aminoácido de una proteína de la invención en donde el glumatamato de aminoácido 354 de tipo silvestre Photinus pyralis se ha cambiado a otro aminoácido.

SEQ ID No 3: muestra la secuencia del oligonucleótido usado para la mutación de SDM de pPW601 para proporcionar una lisina en vez de glutamato en la posición 354 en el Ejemplo 2. SEQ ID No. 4: muestra la secuencia del oligonucleótido usado para la mutación de SDM de pPW601 para proporcionar leúcina en la posición 215 en el Ejemplo 5. SEQ ID No. 5: muestra la secuencia de aminoácido de una proteína de la invención en donde el glutamato del aminoácido 354 de tipo silvestre Photinus pyralis se ha cambiado a cualquier otro aminoácido y el aminoácido 215 se cambió a una leucina.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Producción de plásmidos que contienen el ADN de la invención.

Se obtuvieron los plásmidos pKK223-3 y pDR540 de Boehringer Mannheim; el pDR540 también puede obtenerse de Pharmacia. El plásmido pT7-7 (véanse los protocolos actuales en Biología Molecular Volumen II Sección 16.2.1) se obtuvo de Stan Tabor, Departamento de Química Biológica, Escuela Médica Harvard, de Boston, Mass 02115 y (como se muestra en la Figura 8) contiene el promotor l O de polimerasa de T7 ARN y el sitio inicial de translación para la proteína 10 del gen (T7 bp 22857 a 22972) insertado entre los sitios PvuII y Clal de pT7-5. Los sitios de restricción singulares para la creación de proteínas de fusión (después de llenarse en los extremos 5') son Cuadro O: EcoRl; Cuadro 1: Ndel, Smal, Clal; Cuadro 2: BamHl, Salí, HindIII. El sitio Sacl del polienlazador original se remueve mediante supresión y se proporciona un sitio adicional Xbal en aguas arriba del codón inicial. La luciferasa de la luciérnaga (preparada de una suspensión cristalina, Cat No L9009) , la coenzima A y ATP se obtuvieron de Sigma Chemical Co. La sal de potasio de la luciferina del Escarabajo se obtuvo de Promega. Se prepararon extractos de célula como se describe en el boletín técnico de Promega Número 101. Las alícuotas de los cultivos de E. coli se sometieron a lisado en un reactivo de lisis de cultivo de células (25mM Tris-fosfato, pH7.8, 2mM DTT, 2mM EDTA, 10 por ciento de glicerol, 1 por ciento de Tritón X-100, 2.5 miligramos/mililitro de BSA, 1.25 miligramos/mililitro de lisozima) durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se almacenaron en hielo antes del ensayo. La actividad de la luciferasa de las líneas de célula se ensayó supervisando la bioluminiscencia emitida por las colonias transfiriendo estos a filtros de nylon (Hybond N, Amersham) y luego remojando los filtros con 0.5mM de luciferina en lOOmM de un estabilizador de citrato de sodio pH5.0 (Wood & DeLuca, (1987) Anal Biochem 161 p501-507) . Los ensayos de luciferasa in vitro se llevaron a cabo a 25°C usando 125 microlitros del estabilizador del ensayo (20mM de Tricina, lmM de MgSÜ , 0. lmM de EDTA, 33.3mM de DTT, 0.27mM de coenzima A, 0.47mM de luciferina, 0.53mM de ATP y de 1 a 2 microlitros de la muestra) . El pH final del coctel del ensayo fue de 7.8 y se llevaron a cabo mediciones de luz con un luminómetro bioOrbit 1250. Para la producción de mutaciones de ADN químicas no específicas, se trataron los plásmidos que contienen genes l uc de acuerdo con el método de Kironde y otros (1989) Biochem. J. 259, páginas 421 a 426 usando 0.8M de hidroxilamina, lmM de EDTA en 0. lmM de fosfato de sodio de pH de 6.0 durante 2 horas a 65°C. El plásmido mutagenizado se desaló en una columna Nick de calidad de ADN G60 (Pharmacia) seguido por transformación en E. coli BL21 (DE3) . Se llevaron a cabo estudios de inactivación térmica incubando los extractos de célula crudos que tienen actividad de luciferasa a distintas temperaturas durante 20 minutos y midiendo las actividades restantes. En estudios con la luciferasa purificada obtenida de Sigma, la enzima - 1! se diluyó en un estabilizador de lisis Promega antes de la inactivación. Para los estudios de tubos Eppendorf dependen del tiempo que contienen 50 microlitros del extracto de célula cruda o la luciferasa Sigma en un estabilizador de lisis se incubaron a 37°C. Durante distintos períodos de tiempo se removió un tubo y se enfrió en hielo antes del ensayo. La actividad restantes de expresó como porcentaje de la actividad original. Los niveles relativos de la expresión de la luciferasa para cada una de las construcciones pPW204, pPW116 y pP304 son de 0.1:0.5:1.0: de E. coli BL21(DE3). Las células se hicieron crecer en LB a 37°C hasta un OD de 600 de 0.3 y luego se indujeron con IPTG y el crecimiento se dejó continuar durante 4 horas después de la cual el extracto crudo se preparó y se midió la actividad de la luciferasa.

CUADRO 1: Sitios de Ligazón de ribosoma (subrayado) y codones iniciales en las construcciones de expresión usadas en el Ejemplo 1. pPW304 AAGGAGATATACAT ATG* CGT AGA ATT CAÁ ATG pPW116 AGGAAACAGGATCCA ATG* pPW204 AGGAAACAGCAA ATG* La mutagénesis dirigida en el sitio requerida para convertir el glutamato en un aminoácido alternativo se llevó a cabo usando el siguiente protocolo. Debido a que la mutación de glutamato a lisina queda dentro de un sitio de restricción Aval singular, y por lo tanto destruye el mismo, es posible usar un solo oligonucleótido como el oligonucleótido mutagénico y de selección.

Protocolo de Mutagénesis Dirigida en el Sitio: El plásmido seleccionado se desnaturaliza y se recuece con un oligonucleótido de selección/mutagénico para lisina: 5 ' -CATCCCCCTTGGGTGTAATCAG-3 ' con la T subrayada siendo la desadaptación. La cadena de ADN mutante se sintetiza y se liga y toda la restricción primaria se digiere con Aval. La transformación en células, aquí las células de E. coli BMH 71-18 mut S, se llevó a cabo una versión 2-89 de Bio-Rad Gene Pulser. Las células cosechadas y el depósito de plásmido mezclado purificado que contiene los plásmidos mutados y parenterales se proporcionaron y una digestión de restricción secundaria con Aval se llevó a cabo antes de la transformación de células E. coli «JTM109. Estas células se colocaron en medios selectivos (LB agar + 50 microgramos por mililitro de ampicilina) y las clonas se seleccionaron purificando su ADN de plásmido y analizándose para la pérdida del sitio de restricción Aval. El ADN plásmido se purificó en cada caso usando un método de lisis alcalino de Birnboim and Doly (1979) Nucleic Acids Research 7, pl513. Los protocolos precisos fueron como se describe en el Estuche de Mutagénesis Dirigido - Sitio del TransformadorR™ (Versión 2) vendido por Clontech Laboratories Inc (Estados Unidos) catálogo No. K1600-1. El mapa de restricción para pPW601a, una variante de pPW116 derivada de Pharmacia pDR540 y el fragmento de BamHl/Sstl de pGEM-luc con el sitio Xho destruido se muestra en la Figura 4. La mutagénesis dirigida al sitio se llevó a cabo como se describe en lo que antecede en las instrucciones de Clontech tal como para convertir el gen l uc de tipo silvestre de Photinus insertado en el mismo en una secuencia como se muestra en SEQ ID No 1 en donde 1063-1065 es AAG, con la proteína expresada de secuencia de aminoácido modificada en la posición 354 como es muestra en SEQ ID No 2 en Lisina.

EJEMPLO 2: Estabilidad térmica de las luciferasas: La estabilidad térmica de las distintas luciferasas expresadas mediante genes l uc no modificados y modificados, (es decir, de la invención) en los vectores en E. coli producidos como se describe en lo que antecede, se determinó y los resultados se muestran en las Figuras 5 a 8. Una comparación de t1/2 (media vida) de la actividad de 50 microgramos por mililitro de luciferasa a 43.5°C en 50 mM del estabilizador de fosfato de potasio pH7.8, lpiM de EDTA, 0.2 por ciento (en peso/volumen) de BSA, ImM de DTT y 10 por ciento de sulfato de amonio muestra una actividad del 50 por ciento que queda para ser alcanzada durante los tiempos de la siguiente manera: Luciferasa de tipo t1'2 alcanzado en aproximadamente silvestre Sigma: 1.5 minutos pPW601 (354=glutamato) : t^-'2 alcanzado en aproximadamente 5 minutos pPW601aK (354=lisina) : t1/2 alcanzado en aproximadamente 30 minutos Por lo tanto claramente de las cifras anteriormente citadas podrá verse que reemplazando el glutamato 354 con la lisina se aumenta la estabilidad térmica de la luciferasa de por lo menos hasta 43.5°C.

EJEMPLO 3: Estabilidad Térmica de la Luciferasa: La estabilidad térmica de un número de luciferasas expresadas por genes l uc modificadas SDM que corresponden a otras mutaciones de la posición 354 de la invención en los vectores en E. coli producidos mediante métodos análogos a aquel que se describe en el Ejemplo 1, se determinó y luego los resultados se muestran gráficamente en la Figura 10. Una comparación de t-^'2 a 40°C en el estabilizador de lisis Promega se llevó a cabo y los resultados obtenidos en t^'2 minutos tales como: pPWdOlaK 354 = lisina) -(-1/2 alcanzado en aprox 13 min pPW601aR ' = arginina tl/2 13 ' pPW601aL ' = leucina) tl/2 10 ' pPW601aI = isoleucina) t1/2 10 ' pPWßOlaN = asparagina) t1'2 10 ' pPW601aV 1 _ valina) t1/2 9 ' pPW601aW ' = triptofan) t1/2 8 ' pPW601aA 354 = alanina) t1/2 6.5' pPW601aY = tirosina) t^'2 6.5' pPW601aM = metionina) t^'2 5.5' pPW601aF = fenilalanina) t-^'2 5 ' pPW601aH = histidina) t1/2 4.5' pPW601aT = treonina) t^/2 4.5' pPW601aQ = glutamina) t1'2 4.5' pPW601aC (" = cisteina) t1/2 ' ' ' ' *' 4 " pPW601aS (" = serina) t1/2 ' ' '' '' 3.5'' pPW601aE ( ' ' = ácido glutámico) t1/2 ' ' ' ' ' ' 1 ' ' pPW601aD ( ' ' = ácido aspártico) t1/2 ' ' ** " 1 I 1 pPW601aP ('' = prolina) t1/2 '' •' ' ' 1 I I pPW601aG (" = glicina) t1/2 • ' • • f I <1 EJEMPLO 4: Estabilidad de las Luciferasas a 37°C y temperatura ambiente.

Las luciferasas de la mutación de lisina pPW601k (86 ng/mililitro) de tipo silvestre recombinante (550ng/ mililitro) y del tipo nativo (Sigma) (62.5 ng/mililitro) se incubaron durante 4 horas a 37 °C en 1 por ciento de BSA, el estabilizador HEPES pH7.75 con 0.02 por ciento de azida como el agente de conservación. Para medir la actividad restante se añadió Ing de luciferasa al substrato de D-luciferina y los recuentos luminiscentes por minuto se registraron. Los resultados se mostrarán a continuación en términos de la actividad restante después de la incubación durante 2 horas a 37°C y después de 10 días a temperatura ambiente.

Después de 2 horas a 37°C: Luciferasa mutante E354K 70% de actividad restante Luciferasa Recombinante de Tipo Silvestre 12% Luciferasa Nativa Sigma Después de 10 días a Temperatura Ambiente: Luciferasa mutante E354K 85% ' ' Luciferasa Recombinante de Tipo Silvestre 59% ' ' Luciferasa Nativa Sigma 71% ' ' EJEMPLO 5: Preparación y estabilidad de mutante doble 354K:215L.

Se preparó la Lisina 354 de mutante doble: Leucina 215 de luciferasa pPW601a Photinus pyralis tomando pPW601aE354K como se describe en el Ejemplo 1 y mutando la misma usando el oligonucleótido de SEQ ID No 4 5'GAATCTGACGCAGAGAGTTCTATGCGG-3' , en donde las bases subrayadas representan las desadaptaciones que ocasionan la mutación. Esta mutación se confirmó mediante secuencia de ADN y medición de la termoestabilidad de la luciferasa resultante como se expresa en E . coli mediante un método análogo a aquel que se describe en el Ejemplo 1 que se llevó a cabo como los Ejemplos 2 a 4 usando el estabilizador de fosfato pH7.8 que contiene lmM de EDTA, 0.2 por ciento (en peso/volumen) de BSA, lmM de DTT y 10 por ciento de sulfato de amonio como el medio de inactivación térmico. A temperatura de 43.5°C en el estabilizador de fosfato había menos de 5 por ciento de pérdida de la actividad a través de 32 minutos mientras que a 47°C, el tl/2 era ¿?e aproximadamente 38 minutos. A 50°C, el mutante doble retiene el 15 por ciento de actividad después de 16 minutos de incubación. Los resultados para esta prueba de inactivación se muestran gráficamente en la Figura 12.

EJEMPLO 6: Purificación de las Luciferasas Las células de E .coli JM109 que expresan las luciferasas recombinantes del tipo silvestre o mutantes se hicieron crecer a 30°C en un Caldo Luria (LB) que contiene 50 microgramos por mililitro de ampicilina y se indujeron con IPTG (lmM) durante la fase de logaritmo temprana. Las células se cosecharon en la fase estacionaria intermedia y se resuspendieron en 50mM de Tris-HCl, pH 8.0 que contiene 50mM de KCl, lmM de ditiotreitol, 1.2 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y lmM de EDTA (Estabilizador A) .

Las células se quebraron mediante rotura en un sonificador MSE soniprep 150 (amplitud de 14 micrómetros) y el lisado de la célula se centrifugó a 30000 x g durante 30 minutos. El líquido sobrenandante del extracto crudo luego se sometió a fraccionación con sulfato de amonio con la fracción precipitada entre 35 por ciento y 55 por ciento de saturación que se encontró que contenía la actividad de luciferasa que se disolvió en el Estabilizador A. El extracto se desaló usando una columna Pharmacia PD10 equilibrada en 50mM de Tris-HCl, pH 8.0 que contiene 0.5mM de DTT (Estabilizador B) y el extracto de salado se aplicó a una columna de intercambio de aniones Pharmacia Mono Q y se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 500 mM de NaCl en el Estabilizador B a un régimen de flujo de 4 mililitros por minuto en fracciones de 2 mililitros. La fracción máxima de la actividad de luciferasa se recogió y dializó contra 25 mM del estabilizador de fosfato de sodio de pH de 7.5, que contiene 0.5mM de DTT y 12 por ciento (en volumen/volumen) de glicerol para almacenamiento a largo plazo.

EJEMPLO 7: Inactivación Térmica de las luciferasas purificadas Se preparon los tubos Eppendorf que contienen extractos libres de célula de luciferasa como se describe en el Ejemplo 6. Las preparaciones purificadas de luciferasa (50 microgramos por mililitro) se incubaron en un estabilizador de termoestabilidad que comprende 50 mM del estabilizador de fosfato de potasio de pH de 7.8 que contiene 10 por ciento de sulfato de amonio saturado, lmM de ditiotreitol y 0.2 por ciento de albúmina de suero bovino (BSA) . A los tiempos graduados se removió un tubo y se enfrió en un baño de hielo/agua antes del ensayo con la actividad ensayada restante calculándose como el porcentaje de la actividad inicial. Los trazos de arrenio para las luciferasas recombinantes purificadas de tipo silvestre y termoestable se construyeron midiendo la media vida para inactivación en un estabilizador de termoestabilidad a través de una escala de temperaturas de 42°C a 50°C. El registro o logaritmo natural de tl/2 en minutos luego se trazó contra 1/K. Para un régimen de inactivación equivalente, la mutación de E354K aumenta la termoestabilidad mediante 2°C a temperaturas dentro de esta escala en comparación con un aumento de 5°C con la mutación de A215L y de 6° para el mutante doble E354K+A215L; mostrando el último la naturaleza aditiva de la mutación doble.

EJEMPLO 8: Expresión aumentada de las luciferasas mutantes en comparación con la luciferasa recombinante de tipo silvestre en E.coli.

La expresión de la luciferasa en las células de E. coli «JM109 se supervisó durante el crecimiento en el cultivo líquido a 37°C. Las células que expresan los mutantes termoestables se encontró que acumulaban más luciferasa activa durante el crecimiento, que las células que expresan la enzima recombinante de tipo silvestre. La Figura 13 muestra este efecto gráficamente al trazar la actividad de la luciferasa con densidad óptica aumentada a 600nm piara cultivos del tipo silvestre recombinante, el mutante doble E354K+A215L y E354K. Podrá verse que la termoestabilidad aumentada del mutante simple y doble permite la producción aumentada de luciferasa a una temperatura de cultivo de 37°C.

EJEMPLO 9: Efecto del estabilizador en la estabilidad de las luciferasas mutantes a 37°C.

Soluciones de lOng por mililitro de cada una de las luciferasas recombinantes de tipo silvestre y sigma A215L, E354K, E354+A215L, se llevaron a cabo en un estabilizador HEPES de pH de 7.75 con 1 por ciento de BSA y 0.02 por ciento de azida y termoestabilidad a 37°C en comparación con aquella de las mismas composiciones con la adición de 2mM de EDTA y 2mM de MDTT. Los resultados se muestran gráficamente en las Figuras 14 y 15, indicando que la estabilidad relativa de A215L y E354K varía con el estabilizador a 37°C.

EJEMPLO 10: Efecto de la substitución del aminoácido en la longitud de onda de la luz emitida en la oxidación de la D-luciferina.

La longitud de onda de luz emitida durante la oxidación de D-luciferina con las distintas luciferasas de la invención señaladas en el Ejemplo 3 se midió y se encontró que variaba con la mutación de aminoácido. La longitud de onda de luz emitida varió en 5nm entre el tipo silvestre recombinante (E354) y E354K, y aproximadamente en 15nm entre E354K y E354I. Los organismos E. coli de tipo silvestre recombinantes proporcionaron una luminiscencia de color amarillo-verde en presencia de la D-luciferina. Los colores emitidos mediante el mutante E. coli respectivo cuando se proporcionaron con D-luciferina fueron los siguientes: E354G amarillo-verde E354N amarillo-verde E354A verde E354V anaranjado-rojo E354M anaranjado-rojo E354F amarillo-verde E354L amarillo E354Y amarillo-verde E354S amarillo-verde E354C amarillo-verde E354K amarillo E354Q amarillo-verde E354W amarillo-verde E354T amarillo-verde E354P anaranjado E354R amarillo-anaranjado E354H amarillo-verde E354N amarillo E354I rojo LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: EL SECRETARIO DEL ESTADO PARA LA DEFENSA EN SU MAJESTAD BRITÁNICA (B) CALLE: WHITEHALL (C) CIUDAD: LONDRES (E) PAÍS: REINO UNIDO (GB) (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : SW1A 2HB (A) NOMBRE: CHRISTOPHER ROBÍN LOWE (B) CALLE: UNIVERSIDAD DE CAMBRIDGE, TENNIS COURT ROAD (C) CIUDAD: CAMBRIDGE (D) ESTADO: CAMBRIDGESHIRE (E) PAÍS: REINO UNIDO (GB) (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : CB2 1QT (A) NOMBRE: PETER JOHN WHITE (B) CALLE: UNIVERSIDAD DE CAMBRIDGE; TENNIS COURT ROAD (C) CIUDAD: CAMBRIDGE (D) ESTADO: CAMBRIDGESHIRE (E) PAÍS: REINO UNIDO (GB) (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : CB2 1QT (A) NOMBRE: JAMES AUGUSTUS HENRY MURRAY (B) CALLE: UNIVERSIDAD DE CAMBRIDGE; TENNIS COURT ROAD (C) CIUDAD: CAMBRIDGE (D) ESTADO: CAMBRIDGESHIRE (E) PAÍS: REINO UNIDO (GB) (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : CB2 1QT (A) NOMBRE: DAVID JAMES SQUIRRELL (B) CALLE: CBDE, PORTÓN DOWN (C) CIUDAD: SLISBURY (D) ESTADO: WILTSHIRE (E) PAÍS: REINO UNIDO (GB) (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : SP4 OJQ (Ü) TITULO DE LA INVENCIÓN: LUCIFERASAS (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 5 (iv) FORMA LEÍBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO MEDIO: Disquete (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA DE FUNCIONAMIENTO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase a1.0, Versión a1.25 (EPO) (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A NUMERO DE SOLICITUD: GB 9405750.2 <B FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 DE MARZO DE 1994 ( i NUMERO DE SOLICITUD: GB 9501170.6 (B FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 DE ENERO DE 1995 (2 INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1: (i CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A LONGITUD: 1722 pares de base (B TIPO: ácido nucleico (C TIPO DE CADENA: doble (D TOPOLOGÍA: desconocida (ü TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii HIPOTÉTICO: NO (iii ANTI-SENTIDO: NO (vi FUENTE ORIGINAL: (A ORGANISMO: Photinus pyralis (ix PARTICULARIDAD: (A NOMBRE /CLAVE: CDS (B EMPLAZAMIENTO : ..1653 (xi DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: CAAATGGAAG ACGCCAAAAA CATAAAGAAA GGCCCGGCGC CATTCTATCC TCTAGAGGAT 60 GGAACCGCTG GAGAGCAACT GCATAAGGCT ATGAAGAGAT ACGCCCTGGT TCCTGGAACA 120 ATTGCTTTTA CAGATGCACA TATCGAGGTG AACATCACGT ACGCGGAATA CTTCGAAATG 180 TCCGTTCGGT TGGCAGAAGC TATGAAACGA TATGGGCTGA ATACAAATCA CAGAATCGTC 2-40 GTATGCAGTG AAAACTCTCT TCMTTCTTT ATGCCGGTGT TGGGCGCGTT ATTTATCGGA 300 GTTGCAGTTG CGCCCGCGAA CGACATTTAT AATGAACGTG AATTGCTCAA CAGTATGAAC 360 ATTTCGCAGC CTACCGTAGT GTTGTTGCC AAAAAGGGGT TGCAAAAAAT TTTGAACGTG 20 CAAAAAAAAT TACCAATAAT CCAGAAAATG ATTATCATOG ATTCTAAAAC GGATTACCAG 480 CMATGTCAGT CGATGTACAC GTTCQTCACA TCTCATCTAC CTCCCGGTTT TAATGAATAC 540 GAT?TGTAC CAGAGCCTT TGATCGTGAC AAAACAATTG CACTGATAAT GAATTCCTCT 600 GGATCTACTG GGTTACCTAA GGGTGTGGCC CTCCGCATA GAACTGCCTG CGTCAGATTC 660 TCGCATGCCA GAGATCCTAT T?TGGCAAT CAAATCATTC CGGATACTGC GATTTTAAGT 720 GTTGTTCCAT TCCATCACGG TTTTGGAATG TTTACTACAC TCGGATATGT GATATGTGGA 780 TTGCGAGTCG TCTTAATGTA TAGATTTGAA GAAGAGCTGT TTTTACGATC CCTCAGGAT 840 TACAAAATTC AAAGTGCGTT GCTAGACCA ACCCTAT?T CATTCTTCGC CAAAAGCACT 900 CTGATTGACA AATACGATTT ATCTAATTTA CACGAAATTG CGGCTGGGGG CGCACCTCT 960 TCGAAAGAAG TCGGGGAAGC GGTTGCAAAA CGCTTCCATC TTCCAGGGAT ACGACAAGGA 1020 TATGGGCTCA CTGAGACTAC ATCAGCTATT CTGATTACAC CCNNNGGGGA TGATAAACCG 1080 GGCGCGGTCG GTAAAGTTGT TCCATTTTTT GAAGCGAAGG TTGTGGATCT GGATACCGGG 1140 AAAACGCTGG GCGTTAATCA GAGAGGCGAA TTATGTGTCA GAGGACCTAT GATTATGTCC 1200 GGTTATGTAA ACAATCCGGA AGCGACCAAC GCCTTGATTG ACAAGGATGG ATGGCTACAT 1260 TCTGGAGACA TAGCTTACTG GGACGAAGAC GAACACTTCT TCATAGTTGA CCGCTTGAAG 1320 TCTTTAATTA AATACAAAGG ATATCAGGTG GCCCCCGCTG AATTGGAATC GATATTGTTA 1380 CAACACCCCA ACATCTTCGA CGCGGGCGTG GCAGGTCTTC CCGACGATGA CGCCGGTGAA 1440 CTTCCCGCCG CCG1TGTTGT TTGGAGCAC GGAAAGACGA TGACGGAAAA AGAGATCGTG 1500 GATTACGTCG CCAGTCAAGT AACAACCGCG AAAAAGTTGC GCGGAGGAGT TGTGTTTGTG 1560 GACGAAGTAC CGAAAGGTCT TACCGGAAAA CTCGACGCAA GAAAAATCAG AGAGATCCTC 1620 1 ATAAAGGCCA AGAAGGGCGG AAAGTCCAAA TTGTAAAATG TAACTGTATT CAGCGATGAC 1680 ! GAAATTCTTA GCTATTGTAA TCCTCCGAGG CCTCGAGGTC GA 1722 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 550 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Photinus pyralis (ix) PARTICULARIDAD: (A) NOMBRE CLAVE : Sitio modificado (B) EMPLAZAMIENTO: 354 (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : Met Glu Asp Ala Lys Asn He Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro 1 5 10 15 Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg 20 25 30 Tyr Ala Leu Val Pro Cly Thr He Ala Phe Thr Asp Ala His He Glu 35 40 45 Val Asn He Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg He Val Val 65 70 75 80 Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu 85 90 95 Phe He Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp He Tyr Asn Glu Arg 100 105 no Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn He Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val 115 120 125 Ser Lyß Lys Gly Leu Gln Lys He Leu Asn Val Gln Lyß Lys Leu Pro 130 135 110 He He Gln Lys He He He Net Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly 145 150 155 160 Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe 165 170 175 Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phß Asp Arg Asp Lys Thr He 180 185 190 Ala Leu He Met Aßn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val 195 200 205 Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp 210 215 220 Pro He Phe Gly Asn Gln He He Pro Asp Thr Ala He Leu Ser Val 225 230 235 240 Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu 245 250 255 He Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu 260 265 270 Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lye He Gln Ser Ala Leu Leu Val 275 280 285 Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu He Asp Lys Tyr 290 295 300 Asp Leu Ser Asn Leu His Glu He Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser 305 310 315 320 Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly He 325 330 335 Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala He Leu He Thr 340 3í 350 Pro Xaa Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe 355 360 365 Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val 370 375 380 Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met He Met Ser Gly 385 390 395 **00 Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu He Asp Lys Asp Gly 405 410 415 Trp Leu His Ser Gly Asp He Ala Tyr Trp Aßp Glu Aßp Glu Hiß Phe 420 425 130 Phe He Val Asp Arg Leu Lyß Ser Leu He Lyß Tyr Lys Gly Tyr Gln 435 440 *»45 j Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser He Leu Leu Gln Hiß Pro Aßn He 450 455 *60 Phe Aßp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Aßp Aßp Aßp Ala Gly Glu Uu 465 470 175 180 Pro Ala Ala Val Val Val Uu Glu Hiß Gly Lyß Thr Met Thr Glu Lys 485 10 19 Glu He Val Aßp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Uu 500 505 510 Arg Gly Gly Val Val Phe Val Aep Glu Val Pro Lys Gly Uu Thr Gly 515 520 525 Lys Uu Asp Ala rg Lys He Arg Glu He Leu He Lys Ala Lys Lys 530 535 540 Gly Gly Lys Ser Lys Uu 545 550 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 22 pares de baseS (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Photinus pyralis (ix) PARTICULARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: mise- . diferencia (B) EMPLAZAMIENTO: reemplazar ( 10."" ) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: CATCCCCCTT GGGTGTAATC AG 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Photinus pyralis (ix) PARTICULARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_diferencia (B) EMPLAZAMIENTO: reemplazar (16..17, " " ) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: GAATCTGACG CAGAGAGTTC TATGCGG 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 550 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Photinus pyralis (ix) PARTICULARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado (B) EMPLAZAMIENTO: 354 (ix) PARTICULARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado (B) EMPLAZAMIENTO: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: Met Glu Asp Ala Lyß Aßn lie Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro 1 5 10 15 Uu Glu Aßp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lyß Ala Met Lys Arg 20 25 30 Tyr Ala Uu Val Pro Gly Thr He Ala Phe Thr Asp Ala His He Glu 35 10 45 Val Asn He Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Uu Ala 50 55 60 Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg He Val Val 65 70 75 80 Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu 85 90 95 Phe He Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp He Tyr Asn Glu Arg 100 105 no Glu Leu Uu Asn Ser Met Asn He Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val 115 120 125 Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys He Leu Asn Val Gln Lys Lys Uu Pro 130 135 140 He He Gln Lys He He He Met Asp Ser Lvs Thr Asp Tyr Gln Gly 145 10 155 160 Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phß Val Thr Ser His Uu Pro Pro Gly Phe 165 170 175 Aßn Glu Tyr Aßp Phe Val Pro Glu Ser Phe Aßp Arg Aßp Lyß Thr He 180 185 190 Ala Uu He Met Aßn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Uu Pro Lyß Gly Val 195 200 205 Ala Uu Pro Hiß Arg Thr Uu Cyß Val Arg Phe Ser Hiß Ala Arg Asp 210 215 220 Pro He Phe Gly Asn Gln He He Pro Asp Thr Ala He Uu Ser Val 225 230 235 240 Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Uu Gly Tyr Uu 245 250 255 He Cys Gly Phe Arg Val Val Uu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Uu 260 265 270 Phe Leu Arg Ser Leu Gln Aßp Tyr Lys He Gln Ser Ala Uu Uu Val 275 280 285 Pro Thr Uu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu He Asp Lys Tyr 290 295 300 Asp Uu Ser Asn Uu Hiß Glu He Ala Ser Gly Gly Ala Pro Uu Ser 305 310 315 320 Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe Hie Leu Pro Gly He 325 330 335 Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala He Leu He Thr 340 315 350 Pro Xaa Gly Asp Asp Lye Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe 355 360 365 Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lye Thr Leu Gly Val 570 375 380 Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met He Met Ser Gly 385 390 395 400 Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu He Asp Lys Asp Gly 405 410 415 Trp Leu His Ser Gly Asp He Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe 420 425 430 Phe He Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu He Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln 435 440 445 Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser He Leu Leu Gln His Pro Asn He 450 5 460 Phe Aßp Ala Gly Val Ala Gly Uu Pro Asp Aßp Asp Ala Gly Glu Uu 465 170 175 180 Pro Ala Ala Val Val Val Uu Glu His Gly Lys Thr Het Thr Glu Lys 185 190 195 Glu He Val Aßp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lyß Lys Uu 500 505 510 Arg Gly Gly Val Val Phe Val Aßp Glu Val Pro Lyß Gly Uu Thr Gly 515 520 525 Lyß Leu Asp Ala Arg Lys He Arg Glu He Uu He Lys Ala Lyß Lys 530 535 510

Claims (25)

REIVINDICACIONES:

1. Una proteína que tiene actividad de luciferasa y que tiene más del 60 por ciento de homología de secuencia de aminoácido para la luciferasa de Photinus pyralis, Lucióla mingrelica, Lucióla cruciata o Lucióla lateralis caracterizada porque el residuo de aminoácido que corresponde al residuo 354 de la luciferasa de Photinus pyralis o el residuo 356 de la luciferasa Lucióla mingrelica, Lucióla cruciata y Lucióla lateralis es un aminoácido que no sea glutamato.

2. Una proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácido XGDDKPGA en donde X es el residuo de aminoácido que no es glutamato.

3. Una proteína de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácido TPXGDDKPGA en donde X es el residuo de aminoácido que no sea glutamato.

4. Una proteína de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizada porque el aminoácido X no es glicina, prolina ni ácido aspártico.

5. Una proteína de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 3 caracterizado porque el aminoácido X es uno de triptofan, valina, leucina, isoleucina y asparagina o un análogo o modificación de cualesquiera de estas .

6. Una proteína de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizada porque el aminoácido X es una lisina y arginina o un análogo o modificación de estos.

7. Una proteína que comprende una secuencia de aminoácido como se describe en SEQ ID No 2 en donde Xaa es un aminoácido como se menciona en cualesquiera de las reivindicaciones 5 o 6 o un análogo o modificación del mismo .

8. Una codificación de ADN para una proteína de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un ADN de conformidad con la reivindicación 8, que comprende una secuencia de nucleótido como se describe en SEQ ID No 1 en donde las tres bases N en de 1063 a 1065 forman una codificación de codón para un aminoácido que no sea glutamato.

10. Un ADN de conformidad con la reivindicación 9, en donde el codón se codifica para un aminoácido, un análogo o una modificación como se menciona en la reivindicación 5 o 6.

11. Un vector que comprende una codificación del gen l uc para una proteína de conformidad con la cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. Un vector de conformidad con la reivindicación 11, obtenible tratando un vector que contiene un gen l uc recombinante o de tipo silvestre mediante mutagénesis dirigida al sitio para cambiar el codón responsable para la codificación para el glutamato en la posición 354 de la luciferasa de Photalis pyralis o el glutamato en la posición 356 de la Luciferasa de Lucióla mingrelica, Lucióla cruciata o Lucióla lateralis en un aminoácido alternativo, análogo o modificación del mismo.

13. Un vector de conformidad con la reivindicación 12, en donde el aminoácido alternativo es un aminoácido, análogo o modificación como se menciona en cualesquiera de las reivindicaciones 5 o 6.

14. Un vector de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que se selecciona de pKK223-3, pDR540 y pT7-7 en donde se ha ligado el gen l uc .

15. Una célula capaz de expresar una proteína de conformidad con cualesquiera de las reivindicacines 1 a 7, que comprende un ADN o un vector de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 a 14.

16. Una célula de conformidad con la reivindicación 15 es uña célula de E. coli, de S. cerevisiae o de un insecto.

17. Un estuche de prueba para llevar a cabo un ensayo a través de la medición de ATP caracterizado porque el ensayo comprende una proteína de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7 contenidas dentro de un reactivo luminiscente.

18. Un método de ensayo en donde ATP se mide usando luciferina y luciferasa para generar luz, la cantidad de la cual está relacionada con la cantidad de ATP caracterizado porque la luciferasa es una proteína como se reivindica en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

19. Un método de ensayo de conformidad con la reivindicación 18, en donde el ensayo se lleva a cabo a una temperatura de 30°C a 70°C.

20. Un método de ensayo de conformidad con la reivindicación 18, en donde el ensayo se lleva a cabo a una temperatura de 37°C a 60°C.

21. Un método de ensayo de conformidad con la reivindicación 18, en donde el ensayo de lleva a cabo a una temperatura de 40°C a 50°C.

22. Una preparación de luciferasa que tiene 85 por ciento o más de su actividad de luciferasa cuando se almacena a temperatura ambiente durante 10 días, a temperatura ambiente en ausencia de un agente de termoestabilización.

23. El uso de una luciferasa de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 22, como una etiqueta para un reactivo de ligazón específico.

24. Un estuche de prueba caracterizado porque comprende un reactivo de ligazón específico marcado con una luciferasa de conformidad con cualesquiera de las - reivindicaciones 1 a 7.

25. El uso de un ADN de codificación de luciferasa o vector de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 a 14 con el objeto de informar o dar a conocer la identidad de una célula o un ADN.