MXPA96002851A - Preparacion de microcapsulas huecas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para formar microcápsulas que comprenden (i) proveer una solución de una proteína en un solvente acuoso y (ii) rociar la solución en un gas de tal manera que el solvente acuosos se evapore, formando asímicrocápsulas huecas, caracterizado porque la solución acuosa contiene un líquido de mayor volatibilidad que el agua;la proteína es preferiblemente albúmina y el líquido volátil es preferiblemente etanol;las microcápsulas se pueden usar como agentes de contrastes ecogénicos de ultrasonido.

Description

PREPARACIÓN DE MICROCAPSULAS HUECAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la preparación de ic rocáp ulas proteipáceas huecas. Un uso de estas micro-cápsulas es in oeien ar la im gen de ultrasonido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El hecho de que se puedan usar burbujas de aire en el cuerpo para ecocardiograf ía se ha conocido óe&cie hace cierto tiempo. WO 92/lñl6W describe el secado poc aspersión de una solución de un matecial formador de pared, preferiblemente una proteína tal como aJb?mina, para formar mic rorápsulas. En UO 9L./0&627, la presión a la cual la solución es rociada en la cámara calentada se reduce, para formar mic rocáps?las más. geande , o la vida media de las ic acápsulas en el torrente sanguínea se incrementa, poc ejemplo incluyendo un agente tensioactivo en la solución que es rociada, o las ir rocápsulas son dirigidas a una parte seleccionada del cuerpo, poc ejemplo suspend éndolas en una suspensión de un compuesto eléctricamente cargado. US-A-Lf ?+20 U (Sands; PQ Corpn) describe añadir solventes orgánicos a dispersiones de sólidos farmadores de película, antes de que las suspensiones sean secadas por xjpersión para formar mic coesferas huecas, peco los solventes t (pnr ejemplo celosolve o digli a) fueran menos volátiles que el agua.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado que, incluyendo un compuesto volátil en la solución acuosa que se seca por aspersión, se pueden formar miccocápsulas con propiedades mejoradas en un rendimiento superior, con una descripción de tamaño más estrecha y con corazas más delgadas. Un aspecto de la invención provee un procedimiento para formar microcápsulas que comprende (i) proveec una solución de un material acuosamente soluble en un solvente acuoso y (ii) rociar la solución en un gas de tal manera que el solvente acuoso se evapore, formando así miccocápsulas huecas, caracterizado porque la solución acuosa contiene un líquido de ?yor volatilidad que el agua. Los líquidos volátiles adecuados incluyen efcanol (el líquido volátil preferido) (punto de ebullición 7& .3°C) metanol (p.e 6> .50C), y acetona (p.e. 56°C>. El líquido volátil necesita actuar como un solvente para el material formador de pared y puede ser miscible con agua a las relaciones usadas. La proporción de la solución acuosa que es el líquido volátil variará de acuerdo con la identidad del compuesto volátil, la concentración y la identidad del material formador •> . pared, la temperatura y presiones a las cuales la solución es rociada y el producto de microcápsula deseado. Típicamente, entre 0.1 y &Q% v/v, preferiblemente 1-503S v/v y muy preferiblemente 5-30$v/v, por ejemplo, aproximadamente 20% v/v, de la solución es el líquido volátil. Se pueden usar mezclas de líquidos volátiles, en cuyo caso los poc cientos se refieren al contenido total del líquido volátil. El secado por aspersión puede ser un procedimiento de un paso tal co o para proveer el producto de microcápsula deseado inmediatamente. Alternativamente, el producto inmediato se puede someter a pasos de procedimientos posteriores, poc ejemplo, calentando para entrelazar posteriormente e insolubi lizar la coraza de proteína de las miccocápsulas. Esto constituye un procedimiento de dos pasos. Para un producto que va a ser inyectado al torrente sanguíneo humana, por ejemplo coma un agen he de contraste ecogénico en procedimientos de diagnóstico de ultrasonido (que ..s un uso pretendido del producto) el procedimiento total se lleva a cabo preferiblemente bajo condiciones estériles. Por lo tanto, la solución de proteína es estéril y no pirogénica, el gas en la cámara primero se hace pasar a través de un filtro de 0.2 m, el secador de aspersión se esteriliza inicialmente en autoclave, etc. Alternativamente, o adicionalmente, el producto final puede ser esterilizado, por ejemplo exponiéndolo a radiación de ionización.

El material for ador de pared es un material soluble ?' agua, preferiblemente una proteína (el término siendo usado para incluir polip ptidos y poliaminoácidcs que no ocurren naturalmente). Por ejemplo, puede ser colágena, gelatina o albúmina (suero), en cada caso (si las microcápsulas se van a administrar a seres humanos (pref riblemente de origen animal (es decir, derivadas de seres humanos o correspondiendo en estructura a la proteína humana) o polilisina o poligluta ato. Puede ser una albúmina de suero humana (HA) derivada de donaciones sanguíneas o de la fermenta ión de mi roorganismos * incluyendo líneas celulares) que han sido transformadas o tcansinfectadas para expresar HA. Alternativamente, se pueden usar carbohidratos simples o complejos, aminoácidos simples o ácidos grasos simples, por ejemplo, usina, manitol, dextrano, ácido pa.l ítico o ácido behénico. Las técnicas para expresar HA (cuyo término incluye análogos y fragmentos de albúmina humana, por ejemplos aquéllos de EP-A-32209| , y polímeros de albúmina monomérica, (ee .scriben, poc ejemplo, en EP-A-201239 y EP-A-2A6 2W. Todas las referencias se incluyen aquí con fines de referencia» "Análogos y Fragmentos" de HA incluyen todos les polipéptidos (i) que son capaces de formar una microcápsula en el procedimiento de la invención (ii) de los cuales una región continua t'e por lo menos 50% (preferiblemente por lo menos 75%, A0%, 90% o 95%) de la secuencia de aminoácidos es por lo menos AO.% homologa (pref riblemente por lo menos 90%, 95% o 99% homologa) con una región continua de por lo menos 50% (pref riblemente 75%, A0%, * o 95%) de una albúmina de naturaleza idéntica a la humana. Se puede usar HA que es producida por técnicas de ADN reco inante. Por lo tanto, el HA se puede producir expresando una secuencia de nucle?tido codificadores de HA en levadura o en otro microorganismo y purificando el producto, como se conoce en la técnica. Dicho material carece de los aminoácidos asociados con material derivado de suero. Preferiblemente, el HA es substancia.lmente carente de ácidos grasos; es decir, contiene menos de 1% de nivel de ácido graso de material derivado del suero. Fref ribJ emente, el ácicio graso no es detectable en el HA. La solución o dispersión acuosa es preferiblemente de 0.1 a 50% p/v, muy pref riblemente de 1.0 - 25.0 % p/v o 5.0 -30.0% /v de proteína, particularmente cuando el material es aJbú ina. Aproximadamente 5 - 15% es óptimo. Se pueden usar mezclas de materiales formadares de pared, en cuyo caso los por cientos en las últimas dos oraciones se refieren al contenido • ../tal de material for adar de pared. La preparación que se va a rociar puede contener substancias distintas al material formador de pared, agua y líquido volátil. Por lo tanto, la fase acuosa puede contener 1-20% en peso de compuestos hidrofílicos eoJubles en agua como azúcares y polímeros como estabilizadores, v.gr. alcohol polivinílico (PVA) polivinilpirrolidona (PVP) polie ilenglicol (PEG), gelatina, ácido glutámico y polisacáridos tales como almidón, dextrano, agar, xantano y similares. Se pueden incluir agentes funcionales, por ejemplo a 1.0-t+0% p/p, tales como agentes de contraste de rayos X (por ejemplo, Hexabrix) (ácido ioxáglico), Optiray (iovecsol), O nipaque (iahexol) o I avice ( ioparoidol > ) o agentes para formación de imagen mediante resonancia magnética (por ejemplo óxido de fierro coloidal o quelatos de gadalinio, v.gr., ácido gadopententético) . Se pueden usar f s:=s acuosas similares como el ?íg'-iido portador en el cual el producto de mic ocápsula final es suspendido antes de usarse. Se pueden usar agentes tensioactivos (0.1-5%) incluyendo la mayor parte de los agentes tensioactivos fisiológicamente aceptables, por ejemplo lecitina de huevo o lecitina de soya, o lecitinas sintéticas tales co o .lecitina sintética saturada, por ejemplo, di idistol fosfat idi -Icol i na, dipal itofosfat idi Icol ina o diestearoil-fosf tidi lcolina o lecitinas sintéticas insatucadas, tales como dioleil fosfatidilcolina o dilinoleilfosfat idilcol .i na. Gtros . ge te tensioactivos incluyen ácidos grasos libres, esteces de ácidos grasos con compuestos de polioxialqui leño como pol ioxipropilengl icol y pol ioxiet i lengl icol ; éteres de alcoholes grasos con polioxialqui lenglicol ; steres de ácidos grasos con sorbitán polio ialqui lado; jabones; glicerol-estearato de polialqui leño; glicerol-ricinoleato de polioxietileno; homo y copolímeros de polialquilenglicoles; aceite de soya pol ietoxilado y aceite de ricino así como derivados hidrogenados; esteres y steres de sacarosa u otros fbo idratos con ácidos grasos, alcoholes grasos, siendo estos npciopalmente poliox ialquilados; mono, di y triglicéridos de ácidos grasos saturados o insaturados; glicécidos o aceite de soya y sacarosa. Sin embargo, prefe iblemente el líquido de vehículo no contiene un agente tensioactivo. Se pueden incorporar aditivos a la pared de las mi rocápeulas para modificar les propiedades físicas tales como capacidad de dispersión, elasticidad y permeabilidad l agua. • Entre los aditivos útiles, se pueden citar compuestos que pueden "hi rofobizar" Ja pared para reducir la pecmeabi lidad al agua, tales como grasas, ceras e hidrocarburos de peso molecular alto. Los aditivos que incrementan la capacidad de dispersión de las microcápsulas en el vehículo líquido inyectable son compuestos anfifáticos cawa los f sfolípidos; también in rementan la permeabilidad al agua y la velocidad de biodegradabi 1 idad . Sin embargo, preferiblemente las mi rocápsulas no contienen aditivos que incrementan la ..opacidad de dispersión de las microcápsulas, por lo que se ha encontrado que son innecesarias, por lo menos cuando las mi rocápsulas se hacen de aJbú ina. La cantidad de aditivos que se van a incorporar en la pared es extremadamente variable y depende de las necesidades. En algunos casos no se usa aditivo en absoluto; en otros casos son posibles cantidades de aditivos que pueden alcanzar apro imadamente <+0.0% en peso de la pared. & La solución del material farmador de pared es j izado y secado por aspersión por una técnica adecuada qu« da por resultado mi rocápsulas discretas de 0.05 - 50.0 µm de diámetro. Estas cifras se refieren a por lo menos 90% del volumen de microcápsulas, el diámetro siendo medido con un ult idi ensionador Coulter Multisizer II. Las "mic rocápsulas" significan partículas huecas que encierran un espacio, cuyo espacio es llenado con un gas o vapor pero no con materiales sólidos. Las partículas con forma de panal que se asemejan a ,- as estructuras de confitería vendidas en el Reino Unido como "Malteser" (Regd TM) no se forman. No es necesario que el espacio sea totalmente cerrada (aunque se prefiere) y no es necesario que las mi rocápsulas sean precisamente esféricas, aunque por lo general son esféricas. Si las miccocápsulas no son esféricas entonces los diámetros a los que se hizo referencia anteriormente se relacionan con el diámetro de una microcápsula esférica correspondiente que tiene la misma masa y que encierra el mismo volumen de espacio hueco que la „. crocápsula no esférica. El atomizador comprende la formación de un a rosol de la preparación por ejemplo forzando la preparación a través de poc lo menos un orificio bajo presión hacia, o usando un atomizador centrífugo en una cámara de aire caliente u otro gas inerte. La cámara debe ser suficie teme e grande para que las gotas más grandes expulsadas no golpeen las paredes antes de secarse. Si Jas mi rocápeulas están diseñadas para ser inyectadas en el torrente sanguíneo para imagen de diagnóstico, .onces el gas o vapor en el cámara es limpio (es decir, pref riblemente estiril y simpirógenos) y no tóxico cuando se administra al torrente sanguíneo en las cantidades con comitantes con la administración de las microcápsulas en ecocardiograf ía . La velocidad de evaporación de líquido a partir de la preparación de proteína debe ser sufi ientemente alta para formar mi rocápsulas huecas pero no tan alta como para romper las microcápsulas. La velocidad de evaporación se uede controlar variando la velocidad de flujo de gas, una concentración de proteína en la preparación de proteína, la naturaleza del vehículo líquido, la velocidad de alimentación de la solución y lo que es más importante la temperatura del gas encontrado por el aerosol. Se logran distribu iones de tamaño pequeño mediante secado por aspersión en donde hay una combinación de velocidad de flujo de material de alimentac on baja con niveles muy altos de atomización y aire de secada. El efecto es producir mi rocápsulas de tamaño muy definido y distribución de tamaño apretada. Varios investigadores han diseñado ecuaciones para definir el tamaño de gota promedio de boquillas neumáticas; una versión simple de Jos diversos parámetros que afectan el tamaño de gota promedio es el siguiente: D = A/(Va.d-+B. (Mml¡r/ i4„)-to en donde D = Tamaño de gota promedio A = Constante relacionada con el diseño de boqui lia B = Constante relacionada con la viscosidad del líquido V = Velocidad de aire relativa entre el liquido y la boquilla d = Densidad del aire M.lr y Ki±„ = Masa de aire y flujo de líquido a y b = Constantes de diseño de boquilla > (Para evitar dudas, V es cuadrada, Va. d) se eleva a la potencia de a y M.iy Mnq se eleva a la potencia de menos b.) Claramente, para cualquier diseño de boquilla dado, el tamaño de gota es más afectado por la velocidad relativa en la boquilla y concurrentemente la relación en masa de aire a líquido. Para la mayoría de Jos usos de secado comunes, la relación de aire a líquido está en la escala de 0.1-10 y a estas relaciones parece ser que el tamaño de gota promedio es de 15-20µF. Pa ca la producción de micracápsulas en la escala de tamaño que aquí se describe generalmente se usan relaciones de aire a líquido que varían de 20-1000. El efecto es producir partículas a relaciones altas que son excedentemente pequeñas por valores normales comparati os, con distribuciones de tamaño muy estrechas. Para microcápsulas producidas a las relaciones inferiores de aire a líquido se producen partículas ligeramente más grandes, pero sin embargo tienen distribuciones de tamaño apretadas que son superiores a mi rocápsulas producidas por ' ú ic s de emulsión. Con una concentración de albúmina de 5.0-25.0 en agua, una temperatura de gas de entrada de por lo menos aproximadamente 100°C, preferiblemente por lo menos 110°C, por lo general es suficiente para asegurar la formación de hueco y la temperatura puede ser tan alta como 250°C sin que se rompan Jas cápsulas. Aprox madamente lß -24-0°C. pref riblemente alrededor de 210-230°C y muy preferiblemente aproximadamente ^°0°C, es óptima, por lo menas para la albúmina. La temperatura, en una versión de paso del procedimiento de la invención, puede ser suficiente para insolubi lizar por lo menos parte (por lo general el exterior) del material formador de pared y con frecuencia substancialmente todo el material farmador de pared. Puesto que la temperatura del gas encontrado por el a rosol dependerá también de la velocidad a la cual el a rosol es surtido y del contenido de líquido de la preparación de proteína, la temperatura de salida se puede monitorear para asegurar una temperatura adecuada en la cámara. Una temperatura de salida de 40-150°C se ha encontrado adecuada. En el procedimiento de dos pases, si el material formador de pared es una proteína, la micracápsula intermedia comprende típicamente 96-9fi°C de proteína monomérica y retiene la misma solubilidad en agua que el material farmador de pared mismo. Tienen un tiempo de vida in vivo limitado para imagen de ultrasonido. Sin embargo, se pueden usar para formación de imagen de ultrasonido o se pueden almacenar y transportar antes ,¿e que ee lleve a cabo el segundo paso del procedimiento de dos pasos. Por lo tanto forman un aspecto adicional de la inven ión . En el segundo paso del procedimiento, las microcápsulas intermedias preparadas en el primer paso ee fijan y se hacen menos solubles en agua por lo que persisten más tiempo mientras no sean tan insoJubles e inertes que sean no biodegradables. Este paso también refuerza las microcápsulas -/oor lo que pueden resistir mejor los rigores de administración, esfuerzo cortante vascular y presión ventricular. Si las icrocápsulas se rompen, se vuelven menos ecogénicas. Schneider y otros (1992) Invest . Radiol. 27. 331+-139 muestra que las miccaburbu as de albúminas sonicatas de la técnica anterioc no tienen esta resistencia y rápidamente pierden su ecogenizidad cuando son sometidas a presiones típicas del ventrículo izquiecdo. El segundo pasa del procedimiento puede emplear qalor (por ejemplo, calor de i roondas, calor radiante o aire "caliente, por ejemplo en un horno convencional), irradiación de ionización (por ejemplo, con una dosis de 10.0-100.0 KGy de rayos Gamma) o entrelazamiento en solventes usando por ejemplo formaldehído, glutaraldehída, óxido de etilena u otros agente para entrelazar proteínas y se lleva a cabo sobre las microcápsulas intermedias substancialmente secas formadas en el primer paso o sobre una suspensión de dichas microcápsulas en un líquido en el cual las microcápsulas son ineoJubJes, por ejemplo, un solvente adecuado. En la versión de un paso del . ?,ocedimiento, un agente entrelazador tal como glutaraldehída ee puede rociar a Ja cámara de secado por aspersión o ee puede introducir en la preparación de proteína a penas corriente arriba de los medias de aspersión. Alternativamente, la temperatura en Ja cámara puede ser tan alta como para insalubilizar las microcápsulas. El producto final, medido de Ja misma manera que as miccocápsulas intermedias, si se desea, pueden consistir de v icrocápsulas que tienen un diámetro de 0.1 a 50.0 µm, pero escalas de voJu en de 0.1 a 20.0 µtn y especialmente 1.0 a A.O µw se pueden obtener con el procedimiento de la invención y se preparan para ecocardiograf ía. Se necesita considerar el hecho de que el segunda pasa puede alternar el tamaño de las microcápsulas para determinar el tamaño producida en el primer paso. Se ha encontrado que el procedimiento de la invención se puede controlar para obtener microcápsulas con caracte ísticas deseadas. Por lo tanto, la presión a la cual la solución de proteína es suministrada a la boquilla de aspersión puede variar, por ejemplo, de 1.0-20. x 10s Pa, preferiblemente de 5.0-10.0x10* y muy preferibleme e de 7.5 x 10B Pa . De manera si iJar, la velocidad de flujo de líquido se puede variar. Otros parámetros se pueden variar como se describió antes y coma se describe más adelante. De esta forma, se pueden obtener icrocápeulas novedosas. Se ha encontrado que Jas ÍM microcápsulas formadas a partir de material de abastecimiento ae alimentación que contienen componentes volátiles provee cápsulas huecas más intactas, c n superficies más suaves y son más pequeñas que las cápsulas formadas en ausencia de un componente volátil. En particular, se puede o tener un producto que tenga un alto grado de reflect ividad , en relación con la cantidad de material formadsr de pared. Por ejemplo, una suspensión homogénea de J3 pg/ml de mic rocápeuJ s pueden proveer una ' "ef lec ividad a 3.5 MHz de ultrasonido de por la menos -1.0 dB. Las refJ.ect ividades mayores de -0.3 pueden ser innecesarias, y una ref lect ividad de aproximadamente -0.7 a -0.5 es conveni nte. Preferiblemente, por la menas 50% de la proteína en las paredes de las micracápsulas es entrelazada.

Pref riblemente, por lo menos 75%, 90%, 95%, 9d.0%, 9A.5%, o 99% de la proteína es suficientemente entrelazada para que sea Resistente a la extracción con una eoJución de HCl a 1% durante 2 minutos. La proteína extraída es detectada usando la prueba de proteína de azul de Caomassie, Bradfocd. El grado de entrelazamiento es controlado variando el calentamiento, y radiación o tratamiento químico de la proteína. Durante el procedimiento de entrelazamiento, el monómero de proteína es entrelazado y rápidamente se vuelve indisponible en un simple procedimiento de disolución, co o es detectado poc CLAR de penetración de gel o por eJ ectrof resis de gel, como ee muestra en el ejemplo 3 siguiente. Fl tratamiento continuo conduce a entrelazamiento adicional de material ya entrelazado de tal manera que ee vuelve indisponibJe en la extracción de HCl ante iormente descrita. Durante el calentamiento a 175°C, las microcápsulas de HA de conformidad con la invención pierden apro madamente 99% de la proteína extraíble con HCl durante el curso de 20 minutos, mientras que a 150°C, el calentamiento durante 20 minutos remueve solo apro imadamente 5% de la pcoteína extraíble con HCl, 30 minutos remueven M-7.5%, '+0 minutos d3%, 60 minutos 93%, 60 minutas 97% y 100 minutos remueven 97. ñ% de la proteína extraíble con HCl. Por lo tanto, para lograr buenos niveles de entrelazamie to, las mic rocápsuias ee pueden calentar a 175°C por lo menos durante 17-20 minutos, a 150°C por lo menos durante flO minutos y a otras temperaturas para tiempos correspondientemente más largos o más cortos. Las microcápsulas de la presente invención pueden almacenarse en seco en presencia o ausencia de aditivos para mejorar la conservación, evitar la caa.lesencia o ayudar a la resuspensión. Coma aditivos, se pueden seleccionar de 0.1 a 200.0% en peso de compuestos fisiológicamente aceptables solubles en agua tales co o manitol, galactosa, lactosa o sacarosa o polímeros hidrofilicos como dextrano, xantano, agar, almidón, P P , ácido poliglutá ico, alcohol polivinilo (PVA) y gelatina. El tiempo de vida útil de las microcápsulas en la fase de vehículo líquido inyectable, es decir, el período durante el cual ee observan señales ecográficas útiles, ee ,-¿/ede controlar para que dure de unos cuantos minutos a varios meses dependiendo de las necesidades; esto se puede hacer controlando la porosidad, solubilidad, o grado de entrelazamiento de la pared. Estos parámetros se pueden controlar seleccionando apropiadamente les materiales formadores de pared y aditivos y ajustando la velocidad de evaporación y la temperatura en l a cámara de secado por aspersión . ' * Para reducir al mínimo cualquier aglomeración de las mi rocápsulas, las microcápsulas se pueden moler con un excipiente inerte adecuado usando un molino de pernos centrífugo de Fritsc.h equipado con un tamiz de 0.5 mm, o un molino de chorro de impacto de aire de Glen Crestón. Los excipientes adecuadas son polvos finamente molidas que san inertes y adecuados para uso intravenoso, tales como lactosa, glucosa, manitol, sarbital, galactosa, maltosa o cloruro de sodio. Una vez molida, la mezcla de mic rocápsulas/exc ipiente ee >,uede suspender en medio acuosa para facilitar la remoción de microcápsulas no funcionales/defectuosas o se puede colocar en los contenedores finales para distribución sin procesamiento adicional. Para facilitar la recons itución subsecuente en la fase acuosa, una cantidad mínima de agente tensioactivo se puede incluir en la etapa de molienda y/o en el medio acuoso para evitar aglomeración. Los agentes tensioactivas ap iónicos, cati?nicos y no iónicos adecuados para este propósito incluyen poloxa ercs, esteres de sorbitán, polisorbatos y lecitina. La suspensión de microcápsulas puede dejarse flotar, o puede centrifugarse para sedimentar cualesquiera partículas defectuosas que tengan defectos de superficie que durante el uso hicieran que se llenaran con líquido y ya na fueran ecogén cas. La suspensión de microcápsulas entonces se puede volver a mezclar para asegurar Ja distribución de partículas uniforme, lavadas y recons ituidas en un regulador de pH * ie u da para injección intravenosa tal co o anital isotónico. La suspensión puede proveerse en alícuotas para secado o congelamiento y esterilización subsecuente, por ejemplo, por irradiación de rayos gama, calentamiento en seco o con óxido de etileno. Un método alternativo para la desaglomeración de las microcápeulas i neoJ ubi 1 izadas o mixtas consiste en euspentíerJas directamente en un medio acuoso que contiene un agente tensioactivo adecuado, por ejemplo poJ oxa eroe, steres de í,acbitán, palisorbatas y lecitina. La desaglom cae ion entonces se puede lograr usando un hamagener i zad r adecuado. La suspensión de ic rocápsulas entonces se puede dejar flotar o se pueden centrifugar para sedimentar las partículas def ctuosas, igual que antes, y tratarse poste iormente co a antes. En una modalidad preferida de la invención, el producto del paso de fijación con calor es desaglomerado Iñ moliendo igual que antes. Aunque las miccocápsulas de esta invención se pueden comercializar en el estado seco, muy particularmente cuando están diseñadas con un tiempo de vida limitada después de la injección, puede ser conveniente también vender preparaciones listas para usarse, es decir suspensiones de microcápsulas en un vehículo líquido acuoso listo para la injección. Sin embargo, el producto generalmente es suministrado y almacenado como un polvo seco y es suspendido en un líquida ^*'o pirogénico estéril adecuada justo antes de la administración. La suspensión por lo general se administra mediante la injección de aproximadamente 1.0-10.0 mi en una vena adec uada tal como la vena cóbita u otro vaso sanguíneo. Una concentración de microcápsulas de aproximadamente 1.0 x 10B a 1.0 x 10lí2 partículas/ml es adecuada, preferiblemente alrededor de 5.0 x 10* a 5.0 x 10"*. Aunque en la formación de imagen ultrasónica ee D^ieden aplicar a varios sistemas de órganos de animales y humanos, una de sus principales aplicaciones es la obtención de imágenes de tejido de miocardio y la perfusión de patrones de flujo sanguíneo. Las técnicas utilizan equipo de escudriñamiento ultrasónico que consiste de un escudriñador y un aparato formadsr de imágenes. El equipo produce imágenes de visuales de un área predeterminada, en este caso la región cardiaca del cuerpo humano. Típicamente, el transductor es colocado directamente sobre la piel sobre el área de la cual ee va a atener la imagen. El escudriñador aloja varios componentes electróniccs incluyendo transcluctores ultras-ónicos. Fl transductac produce ondas ultrasónicas que realizan un escudriñamiento por sectores de la región del corazón. Las ondas ultrasónicas son reflejadas por las diversas porciones de la región del corazón y son recibidas por el transductar receptor y procesadas de acuerdo con métodos de pulso-eco conocidos en la técnica. Después de procesarse, las señales son """^nviadas al aparato formadar de imágenes (también conocido en la técnica) para visualización. En el método de la presente invención, después de que el paciente está "preparado" y el escudriñador está en su lugar, la suspensión de microcápsulas se inyecta, por ejemplo a través de la v n del brazo. El agente de contraste fluye a través de la vena al Jado venoso del corazón, a través de la arteria pulmonar principal conduciendo a los pulmones, a través c&» los pulmones, a través de los capilares, hacia Ja vena pulmonar y finalmente hacia la aurícula izquierda y la cavidad ventricular izquierda del corazó . Con las mic rocápsulas de esta invención, se pueden hacer observaciones y diagnósticos con respecto a la cantidad de tiempo requerido para que la sangre pase a través de los pulmones, los patrones de fluja de sangre, el tamaño de la aurícula izquierda, la competencia de la válvula mitral (que separa a la aurícula izquierda del ventrículo izquierdo), dimensiones de la cámara en la cavidad ventricular izquierda y anormalidades del movimiento de la pared. Al ser expulsado el agente de contraste del ventrículo izquierdo, Ja competencia de la válvula aorta también se puede analizar, así como la fracción de expulsión o porcentaje de volumen expulsado del ventrículo izquierdo. Finalmente, los patrones de contraste en el tejido indicarán qué áreas, si acaso las hay, na están siendo adecuadamente irrigadas. En resumen, dicho patrón de imágenes ayudará a di gnos icar características de flujo sanguíneo poco usuales dentro del corazón, competencia valvular, tamaños de cámaras y movimiento de pared, y proveerá un indicador potencial de irrigación del miocardio. Las micracápsulas pueden permitir la formación de imagen del cocazón izquierdo con injecciones intravenosas. Las mic rocápsulas de aJbumina, cuando eon inyectadas en la vena peei ferica, pueden sec capaces de pasar a través de los pyl ones. Fsto da por resultado la opacación ecocardiográf ica de la cavidad del ventrículo izquiecda (LV) así como de tejida del miocardio. Además del escudriñador anteriormente descrito en forma breve, existen otros escudr adores ultrasónicos, ejemplos de los cuales se describen en las Patentes de E.U.A Nos. ^ íS ^ SS y ?+,3Í5,<+35. Básicamente, esas patentes ee refieren a varias técnicas que incluyen ecagcafía dinámica de sección transversal (DCE) para producir imágenes en dos dimensiones secuenciales de rebanadas en sección transversal de ,,« anatomía animal o humana por medio de energía de ultrasonido a un régimen de cuadro suf ic iente para permitir una visualización dinámica de los ócganas en movimiento. Los tipos de aparatos utilizadas en DCE generalmente se denominan escudriñadores de DCE y transmiten y reciben pulsos sónicos cortos en la forma de haces estrechas o líneas. La intensidad de las señales reflejadas es una función del tiempo, que es convertida a una posición usando una velocidad de sonido --^Dmin L, y es desplegada sobre un tubo de rayos catódicos u otros dispositivos adecuados de una manera un poco análoga a los des liegues de radar o sonar. Aunque el DCE se puede usar para producir imágenes de muchos sistemas de órganos que incluyen el hígada, vesícula biliar, páncreas y riñ n, con frecuencia se usa para la visualización de tejido y los vasos sanguíneos principales del corazón. Las microcápsulas se pueden usar para formar imágenes de una amplia variedad de áreas, aun cuando ee inyecten en un sitio venoso periférica. Esas áreas incluyen (sin limitación): (1) el sistema de drenaje venoso al corazón; 2) el tejido de miocardio y características de irrigación (perfusión) durante una prueba de molino de rueda de andar de ejercicio; y 3) tejido de miocardio después de una ingestión oral o inyección intravenosa de fármacos destinados para incrementar el flujo sanguíneo al tejido. Adicionalmente, las miccacápsulas pueden ser útiles para delinear cambios en la irrigación de tejido de miocardio debido a ntervenciones tales como 1) injerto de vena o. arteria coronaria; 2) angioplastia de arteria coronaria (dilatación de balón de una arteria estrechada); el usa de agentes trambolí ticos (tales co a estreptocinasa) para disolver cuágulos en arterias coronarias; o >•+) defectos o cambios de irrigación debido a un ataque cardiaco reciente. Además, en el tiempo de un angiograma coronaria (o un angiogra a de substracción digital) una inyección de las miccocápsulas puede proveer datos con respecto a las "^"iracte íst icas de irrigación de tejida que aumenta ían y complementarían los datos obtenidos del procedimiento de angiograma, que identifica sólo la anatomía de los vasos sanguíneos. A través del uso de las microcápsulas de la presente invención, otros sistemas de órganos cardiacas que incluyen el hígado, vaso y riñon de los cuaJes actualmente ee está obteniendo imagen a técnicas ultrasónicas pueden ser adecuadas [^ra incrementar dichas imágenes actualmente obtenibles y/o la generación de nuevas imágenes que muestren caracte ís icas de irrigación y flujo que previamente na habían sida suceptibles a la imagen usando técnicas de formación de imagen ultrasónicas de la técnica anterior Aspectos preferidos de la presente invención se describirán ahora a manera de ejemplo y con referencia a la figura 1, que es una vista en perspectiva parcialmente cortada de la parte anterior y un lado de aparato de secado por aspersión adecuado para la primera etapa del procesamiento de "...<-- invención.

EJEMPLO 1 Equipo de secado por aspersión Un secador de aspersión adecuada (figura 1) está disponible de A/S Miro Atomizaer, Soeborg, Dinamarca, bajo el nombre cameccial "Mobile Minar". El secador de aspersión """C prende un depósito 1 para la solución de proteína y un dispersor de aire de techo 2 que asegura un control efectivo del patrón de flujo de aire. El aire de remolino es dirigido alrededor del atomizado giratorio o atomizador de boquilla 3 (por ejemplo tipo M-02/B Minor), impulsada por una turbina de aire a una presión de aire de .O barias mínimo y hast 6.0 barias máximo. A 6.0 barias ee al a za una velocidad de rueda del atomizador de aproximadamente 33,000 rpm. Encendiendo y alagando el aire comprimido al atomizador ee hace por medio de una válvula colocada en el panel de instrumento 9. El consumo máximo de aire comprimido al atomizador es de 17 Nma/h a un presión de 6.0 barias. Todas las partes que entran en contacto con el líquida alimentada y el polvo están hechas de acero inoxidable AISI 316, excepto por el tubo de alimentación de la bomba y la rueda del atomizador, que está hecha de acera inoxidable AISI 329, hecho para resistir una fuerza centrifuga alta.

La máquina tiene escalones 5 para acceso a la parte i?> eriar de la cámara y un interruptor 6 para una válvula de aire para activación de un dispositivo de levantamiento neumático cuando se eleva la tapa de la cámara. La cámara de secado tiene un interior hecho de acero inoxidable AISI 316, y el aislado con Rock ool (Regd TM), y un exterior cubierto con una lámina de acero suave. El techo de la cámara de secado está hecha en su interior de acero inoxidabJe AISI 316 y en su exterior de acero inoxidable ATSI 30'-+. -*"-* Un dispersor de aire 2 hecho de acero inoxidable AIST 304 ee uea para distribución del aire en la cámara de eecado para lograr el mejor efecto de secado posible. Un conducto de aire 4, hecho de acero inoxidable AISI 316, provee transporte lateral del aire de escape y el polvo del ciclón 7, que está hecho de acero inoxidable AISI 316 y diseñado para separar el polvo y aire. Una válvula de cierre de tipo de válvula de mariposa, también hecha de acero inoxidabJe AISI 316 y que tiene un empaque de hule de silicón, se usa para la descarga de polvo baja el ciclón hacia un frasco de vidrio recolector de polvo ß apretadamente colocado bajo el ciclón por medio de un dispositivo de resorte. Un ventilador de escape centrífugo 10 hecho de siluminio, con un motor de caja de ardilla de 3 fases, 0.25 k , y un impulsar de banda de V con protector de banda, jala aire y polvo a través de la cámara de secado y el ciclón. Un apagador 11 controla el flujo de aire. Un calentador de aire 12 calienta el aire de secado por medio de electricidad (consumo total de 7.5 kWh/h, infinitamente variable) y puede dar temperaturas de aire de entrada de hasta apro imadamente 350°C, aunque esto es generalmente demasiado alto para preparar las microcápsulas ríe la invención.

Capacidad de evaporación Equipo para atomización de boquilla de dos fluidos se puede añadir, que esta hecha de acero inoxidable ATSI 316, que consiste de un tubo de entrada con sujetador de boquilla y boquilla, para colocarse en el techo de J a cámara de secado. El equipo incluye un separador aceite/agua, válvula de reducción y calibrador de presión para comprimir aire a la boquilla de dos fluidos. El consumo de aire comprimido es: ß-15 kg/h una presión de 0.5-2.0 barias (0.5-2.0 x 10s Pa). Una bomba de alimentación adec ada para transportar la alimentación de preparación de formación de pared al dispositivo de atomizador es una bomba peristáltica. La bomba esta provista de un motor (1 x 220V, 50 Hz, O.lfi kW) y un engrane continuamente variable para ajuste manual. Un tubo de alimentación hecho de manguera de silicón conduce desde un tanque de alimentación (suministro local) a través de la bomba de alimen ación al dispositivo de atomización. -"" Un filtro de aire absoluto, que consiste de un prefiltro, cuerpo de filtro en acero inoxidable y filtro de aire absoluto, se usa para el tratamiento de aire de secado de entrada para hacerlo completamente limpio.

Procedimiento Una solución de 10.0% p/v de rHA estéril sin pirógena en agua sin pirógeno (adecuado para la injecci?n) con etanol al 25.0% v/v se bombeo la boquilla de un atomizador de boquilla de dos fluidos montado en la unidad de secado de aspersión comercial anteriorme te descrito. La velocidad de bomba perist ltica se mantuvo a una velocidad de apro imadamente de 4.0 gcama-.? por minuto de tal manera que una temperatura de aire de entrada de ?20°C la temperatura de aire de salida ee mantuvo a 95°C. El aire comprimido se suministró a las dos boquillas atomizadores de fluido a 2.0-10.0 Bar (2.0-6.0 x 10sPa). En e<sta escala se obtienen miccocápsulas con un tamaño promedio de * 0-3.0 µm . Típicamente un incremento en tamaña de partícula promedio (por presión de atomización reducida conduce a un incremento en la cantidad de miccocápsulas sabre 10 µ de tamaño (véaee cuadro 1) CUADRO 1 EFECTOS DE PRESIÓN DE ATOMIZACIÓN SOBRE LA FRECUENCIA DE LAS MICROCAPSULAS DE MAS DE 10 uM DE DIÁMETRO Presión de ata-dzacion % de f recae-ncia sobare 10 µ. m (x 105 Pa) 6.0 0.8 5.0 3.0 3.5 6.6 2.5 8.6 2.0 13.1 Una presión de 5.0 ? 10* se usó para generar las microcápsulas en este ejemplo específico. En el segundo paso del procedimiento, 5 g de miccocápsulas se calentaron en un vaso de precipitado de vidrio usando un horno con ventilador de Saller.kamp . Una temperatura 26 de 175°C durante una hora fue suficiente para producir can 100% de fijación como se determina poc CLAR. Fl efecto de esta fijación de calor fue incrementar la vida media ecogénica in vitco de unos cuantos segundas a un exceso de 30 minutas. Alterando la temperatura y duración de la incubación es posible variar el grado de fijación entre alrededor de 5% y 100%. Después de la fijación con calor, las microcápsulas ee desaglomeraron y se dispersaron en agua en una de dos "^ormas. El método 1 implicó primero mezclar las esferas fijadas con c or con un peso igual de lactosa finamente molida (diámetro promedio de 5 µm) . L.a mezcla después ee hizo pasar a través de un molino centrífuga de Frisch con un tamiz de 0.5 mi y un rotor de 12 dientes. Las esferas molidas se recogieron y se hicieron pasar a través del molino una segunda vez para asegurar que hubie-ra ocurrido el mezclado completo. El polvo molido des?ué'3 se ;.plvió a suspender en agua que contenía 1 g.ml-1- Pluranic F6A (Regd TM) . Tipica ente 10 gramos de mi rocápsulas de lactosa ee añadieron a 100 mi de agua y Pluronic F6&. El método 2 para desaglo erac i n implica añadir 5 gramos de las microcápsulas fijadas con calor a 100 mi de agua que contenía 100 mg de Pluronic F6ß. L s mi rocápeu as ee dispersaron usando un homogeneizador de Silverson (modela L4R con una zonda homogenei zadara tubular de 2.54 cm y un tamiz de esfuecza cortante alto) y homogeneizando durante 60 segundos.

L s esferas reeuspendidas se separaron en esferas .?actas (que contenían gas) y rotas usando una técnica de flotación. Las esferas que contenían gas se vieron flotar a la superficie durante un periodo de una hora y después se decantaron desde la fracción de su idero que na contenía el gas requerido. El procedimiento de separación se puede acelerar por centrifugación. Una centri fLigación de 30 segundos a 5000 x g es suficiente para separar las dos fracciones. "*' Después de la separación las microcápsulas intactas se secaron por congelamiento en presencia de lactosa y Pluronic F6&. Las condiciones óptimas para secado por congelamiento implicaron volver a suspender 30 mg de microcápsulas en 5 mi de agua que contenían 50 mg de lactosa y 5 g de Pluranic F66. Las icracápsulas secadas por congelamiento se pueden volver a dispersar en un líquido (v.gr., agua, solución salida) para dar una distribución de monadisnersió ) .

EJEMPLO 2 Se prepararon micracápsulas co o el ejemplo 1 pero bajo las condiciones que se detallan más adelante. Una solución de 100 + 10 mg/ml de albúmina humana derivada del suero estéril sin pirógenos en agua sin pirógenos (adecuada para inyección) can etanol al 25% p/p se usó coma el material de abastecimiento de secado por aspersión.

LJsando una bomba peristáltica, el material de de albúmina se volvió a una velocidad de 5 0 + 2% de tal manera que, con una temperatura de entrada de 6.0 + 0.5 barg., se mantuvo una temperatura de salida de 9 +, 2 mmHß0. Las condiciones de secado por aspersión adicionales fueron las siguientes: flujo de aire 50 + 2% presión de atomización 6.0 + 0.5 barias g; flujo de aire de secado 9 + 2 Las micracápsulas producidas se fijaron con calor a "''". temperatura de 176 + 2°C durante 55 + 5 min en alícuotas de + 1 g en bazos de precipitado de acero inoxidable de 250 mi. Después de la fijación con calor, las microcápsulas ee desaglomeraron. La glucosa ee añadió a las mi rocápeulaß a una relación de 2:1 se mezclaron y se molieron con un molino de chorro de impacto de aire de Glen Crestón. Se llenaron frascos de vidrio n las microcápsulas desaglameradas, y los frascos se pulgaran con nitrógeno, se ¡?J.Jaron y se taparon. Fl producto se esterilizó terminantemente y radiando a una dosis de entre 25-35 kGy.

E3EMPL0 3: Prueba de albúmina monomérica libre en microcápsulas Un volumen de 1 mi de etanol se añadió a 100 mg de microcápsulas en una botella de vidrio de 20 mi y ße sanificó durante 30 segundos. A esta suspensión se añadieron 19 mi de Ha.0. La mezcla se centrifugó en una miccoceptcí fuga de banco (Gilson) durante 20 segundos y la fracción clara ee probó. La prueba se realizó cargando 50 mi de la fracción automáticamente en un CLAR Shi adzu LC6A y cromatograf ianda sobre una columna de penetración de gel de TSK a una veJocidad de flujo de 1 mi minuto menos 1 usando un regulador de pH de fosfato de sodio (pH 7.0). Las alturas de los picos que representan los ' ™?nomeros HA se registraron y se usaron para determinar la concentración de monómero usando una curva estándar entre 1 y 10 mgml-1 de HA anam r ico. El HA manamérico libre en % se calculó midiendo la concentración de monómero en Jas mi rocápsulas fijadas y representando estas cifras como un porcentaje de la concen ración de monómero de las microcápsulas no fijadas. Calentando las miccac psulas secadas por aspersión en ¿n horno (como ee describe en el ejemplo 1) ee obtiene una disminución en la cantidad de monómero que se puede detectar. Esta disminución en HA monamécico detectable se debe a la desnaturalización y entrelazamiento de HA mono érico en polímeros insolubles que na pueden ser probados por el étada de CLAR antes mencionado. Usando el método de CLAR para evaluar niveles de monitoreo de HA, es obvio que después de 15 minutos de incubación no hay HA monomérico libre presente en las microcápsulas de HA. Sin embargo, es posible entrelazar ajicionalmente las microcápsulas de HA calentando durante periodos prolongados. El calentamiento prolongado da co o resultado un nivel incrementado de e relazamiento de microcápsulas que a su vez producen mi rocápsulas de resistencia cada vez mayor que son carrepondientemente más resistentes a la presión. tediante el control cuidadoso de temperatura y tiempo de incubación, es posible producir micracápsulas can una escala ^ fc-?n rolada de entrelazamiento (y por lo tanto resist ibi lidad a la presión ) .

EJEMPLO 4: Clasificación de microcápsulas Una ventaja del procedimiento de la invención es que ermite controlar el tamaño mediano y distribución de tamaño de las microcápsulas. Sin embarga, se pueden seleccionar tamaños deseados si se desea, por ejemplo por flotación. En una dispersión homogénea de mi rocápsulas, las partículas más grandes se elevaran a la superficie más rápido que las partículas más pequeñas debido a l a densidad más baja (más aire epcapsulada) de las partículas más grandes. Por lo tanto, dejando reposar la dispersión, la distribución de tamaña de partículas cambiará a cualquier nivel de la eoJución con respecto al tiempo. Las mic ocápsulas se dispersaron en 2000 mi de saJución acuosa que contenía cloruro de sodio al 6% p/v y Pluronic F66 al 0.1% p/v (R gd TM) en una botella de vidrio dando una columna de líquido de aproximadame e 175 mm. Un tubo de muestreo ee colocó a 165 mi por abajo de la superficie del líquido superior para permitir la remoción de muestras de intervalos de tiempo regulados. Alterando el tiempo de reposo y la concentración de 'Moruro de sodio, fue posible producir una variedad de distribución de tamaño de partícula y clasificar las microcápsulas hasta 2 mieras. Otras técnicas húmedas para la clasificación incluyen cromatografía hidrodinámica y frace icjnamiento de flujo de campo. Las técnicas "en seca" usando los principios de elut.riación y separación de flujo cruzado están comercialmente disponibles en forma de clasificadores de Miccosplit (British R*,m) . Zig-zag (AJpine) y Turbo ( issuin).

EJEMPLO 5: Caracterización de microcápsula de albúmina de suero humano Se ha encontrada que las microcápsulas huecas producidas por el método de la invención son tales que la cantidad del material formacior de pared usado en la producción es considerablemente mayor que el usado en los métodos de producción anteriores debido a un tamaño promedio más pequeña y mejoras en las características de la coraza. Sin embargo, a pesar de esto, la ecogenicidad de laß micracápsulas es superior a la producida anteriorme e. Esta caracte ís ica novedosa se mide y ee expresa en decibeles (dB) de ecogenicidad por microgra a/ml de albúmina. La ecogenicidad se puede definir como la capacidad de un material para reflejar o "retroescudr iña " ondas de ultrasonido. La intensidad del stroescudriñamienta se cuantifica por análisis de imagen en términos tíe decibeJes. Mientras mayor sea Ja intensidad de la señal, más ecagénica será la muestra» Toda el agua usada para la prueba no contenía piraxena y se recogió das días antes de usarse, permitiendo desgasificarla mediante exposición al aire. A un bazo de precipitado de prueba de polipropileno de 400 mi (Fisons Scientific Equip ent, RU), se añadieron 350 trJ.. de agua y cualesquiera burbujas de aire se dejaron flotar a la superficie en vez de usarse. Una máquina de ultrasonido Sonos 1000 de Hewlett Packard ee usó y Jos controles ee fijaron de la siguiente manera: TGC (control de ganancia total «1, «2, «3, tt4 , #5, «6, »7, todos = 26, Compresión = i 26 dB; y Transmisión = 60 cIB. Un transductor de 3.5 MHz se usó a un a fijación de profundidad de 6 cm. El transductar se introdujo al agua a una profundidad de 1.5 cm y el seguidor magnético se fijó a 75 rotaciones por m.iputo. Un registro de antecedentes de l a intensidad del retroescudr iñadar se hizo inicialmep te. Un analizador de imagen RU) ee uso para registrar el esrudr i ñamiento de ultrasonido durante 1.2 segundas y después se dividió el registra en 10 cuadros de tiempo individuales. Cada cuadro se analizó para densidad de retroescudr iña ienta y se calcularon los res ltado-? estadíst icos. Un volumen homogéneo de microcápsulas suspendidas se "ñ dió cuidadosamente evitando la introducción de burbujas de aire. El volumen añadido fue tal que después de la administración, la conce ración de micracápsulas dentro de la celda de prueba de ultrasonido fue de 1 x 10A/ml. Las microcápeulas ee dejaron dispersar uniformemente en toda el agua antes de que se "capturara" un escudriñamiento de ultrasonido de tiempo real usando el analizador de imagen y que se midiera la intensidad del retroescud iñamiento. Fl instrumento de ultrasonido ee calibró por referencia a un reflector de acero inoxidable y una serie de bloques de hule de silicón imitadores de tejida ecarref lectores suministrados por ATS Laboratories Inc. Bridgeport, CT 06606, E.U.A. Una curva de calibración se trazó y las mediciones subsecuentes de unidades de despliegue de video, determinadas más adelante, se convirtieron de nuevo a DV de la curva de calibración producida. La prueba se repitió tres veces y se calculó la medición de intensidad promedio.

Fl contenido de proteína de s mic rocápsulas de « -búmina de suero humano se determinaron usando la prueba de KjeJdahl modificada. La prueba determina el contenido de nitrógeno de una muestra de miccocápsulas que des ués se calcula en términos de la concentración de proteína total, de este resultado l a proteína en un número f o de microc psul s y particularmente el contenida de proteínas de la muestra añadida a la prueba tíe e ogeneicidad ee pueden calcular. Las microcápsulas se digirieron usando un sistema de diges ión de Tecatar 12 con un carbohidrato presente en la muestra siendo oxidado por peróxido de hidrógeno. Cualquier proteípa, y por lo tanto el nitrógeno presante, es convertido durante la digestión a sulfato de amonio. Fsto a su vez es convertido a amoniaco por destilación de vapor bajo condiciones alalinas. El amoniaco liberada es condensado, absorbida en ácido bórico y l a cantidad absorbida es determinada por titilación con ácido clorhídrico. Este procedimiento ee automatizó usando un analizador Kjeltec Auto 1030. Usando valores normales apropiados se puede calcular la cantida de proteína presente en la muestra. A partir del análisis de proteína total, ee determinó la cantidad de proteína añadida a la celda de prueba de e ogeneicidad. Fl número de microcápsulas administrada ee calculó coma un pesa de proteína añadida y por lo tanto la ecogenicidad por microgramo/ml de microcápsulas se determinó.

CUADRO 2 Ecooenicidad v.s. peso de microcápsulas EJEMPLO 6 Optimización de condiciones de secado por aspersión para aumentar al máximo el numero de partículas de contacto con gas intacto Anteriormente ße describió la producción de icropartículas suaves, esféricas y huecas para usarse en la formación de imagen de ecocontraste. Es conveniente reducir al 36 mínimo el número de partículas mayor de 6 mieras y aumentar al máximo el número de partículas huecas que contienen gas. Se realizaron una serie de alimentos bajo las condiciones; descritas en el ejemplo 1 para examinar la influencia de velocidad de alimentación de líquido sobre el rendimiento de partículas esféricas intactas. Se encontró que el incremento de la velocidad de alimentación de líquido redujo el número de mi ropart ículas intactas formadas durante el secado por aspersión inicial (cuadro 4) El tamaño de partícula promedio y O estabilidad de presión global, es decir, espesor de la coraza, no cambia pero l a ecogenicidad total si lo hace, a medida que la velocidad de flujo de líquido se incrementa de 4 a 16 ml./min. Se encuentra que las velocidades más lentas de evaporación (a velocidades de flujo de líquidos mayores conducen a que se formen menos partículas que contienen gas intacto.

CUADRO 4

Claims (7)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un procedimiento para formar microcáps laß que comprende (i) proveer una solución de un material solvente acuoso y (ii) rociar la solución en un gas de tal manera que el solvente acuoeo ee evapore, f r ando así microcápeulas huecas, caracterizado porque la solución acuosa contiene un líquido de '"'ayor volatilidad que el agua.

2.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el líquido volátil tienen un punto de ebullición qu<t¡ está entre 20°C y 100°C a presión atmosférica.

3.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación i, caracterizado además porque el líquido volátil es etanal a metanol.

4.- Un procedimiento de conformidad con cualquiera de j.as reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el. líquido volátil constituye 0.1-60.0% v/v de la solución acuosa. 5.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracte izada deman porque el líquida volátil constituye

5.0-30.0% v/v de la solución acuosa.

6.- Un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracte izado además porque el material es una proteína.

7.- Un procedimiento de conformidad con la i /ivindicación 6, caracterizado además porque la proteína es albúmina, colágena o gelatina. 6.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la prateína es albúmina. 9.- Un procedimien o de conformidad con cualquiera de las re vindicaciones anteriores, caracterizado además porque Ja concentración de material en la solución es de 1.0-25.0% p/v. ••""-- 10.- Un procedimiento de conformidad can la reivindicación 9, caracterizado además porque l a concentración de material en la solución es de 5.0-15.0% p/v. 11.- Un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la solución comprende adicianal ente un agente de contraste de rayos-x o un agente de contraste de formación de imagen de resonancia magnética. 12.- Un procedimie o de conformidad con cualquiera ae las reivindicaciones ant riores, caracterizado además porque las microcápsulas san procesadas además antes de usarse, por ejeoiplo por tratamiento con calor para insolubilizar adié ional ente las microcápsulas, o radiación para esterilizar las microcápsulas. 13.- Un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el procedi iento ee lleva a cabo para producir un producto intravenosamente inyectable estéril. 14.- Microcápsulas preparadas por un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reiv ndica iones anteriores. 15.- Microcápsulas obtenibles por un procedimien o de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14. 16.- Un agente de contraste de ultrasonido que comprende microcápsulas huecas caracte izado porque las microcápsulas, cuando ee suspenden en agua desgaei f icada a 20°C para dar una concent ación de micracápsulas homogénea de 13.0 -'" ml, tienen una ref lect ivid a 3.5 MHz de ultrasonido de por Jo menos -1.0 dB. 17.- Una composición farmacéutica que comprenda mic rocápsulas secas estériles de conformidad con Jas reivindicaciones 14, 15 o 16 en un frasco sellado. 1.6.- Una composición farmacéutica que comprende microcápsulas estériles de conformidad con Jas reiv dicaciones 14, 15 o 16 suspendida en un medio intravenosame e inyectable estéril . 19.- Un método para proveer una imagen de una parte de un paciente humano o un animal, que comprende (i) introducir microcápsuj as de conformidad con la reivindicación 14, 15 o 16 en el paciente, (ii) hacer pasar radiación al paciente y (iii) crear una imagen basada en Ja reflect ividad , capacidad de transmisión o resonancia de las micracápsulas en dicha parte del paciente.