MXPA96002770A

MXPA96002770A - Metodo y reactivo para inhibir la replicacion delvirus de la hepatitis c

Info

Publication number: MXPA96002770A
Application number: MXPA/A/1996/002770A
Authority: MX
Inventors: G Draper Kenneth
Original assignee: Ribozyme Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-01-13
Filing date: 1995-01-12
Publication date: 1998-10-30

Abstract

La presente invención se refiere a una molécula enzimática de ARN que segmenta específicamente arn de un virus de hepatitis C.

Description

MÉTODO Y REACTIVO PARA INHIBIR LA REPLICACION DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta solicitud es una continuación en parte de Draper, intitulada "Método y Reactivo para Inhibir la Replicación del Virus de la Hepatitis C", presentada el 14 de mayo de 1992, No. de Serie de los Estados Unidos cedido 07/882,888, el total de la cual se incorpora en la presente para referencia. Esta invención se relaciona con reactivos útiles como inhibidores de la replicación del virus de la hepatitis C (HCV) y expresión del gen. La siguiente es una discusión de la técnica importante, nada de la cual es admitida que sea la técnica anterior para las reivindicaciones pendientes. El grupo del virus de la Hepatitis C es responsable para la mayoría de los casos de la hepatitis no A, no B. Aunque la hepatitis no A, no B, puede ser provocada por muchos virus diferentes, la causa principal es el HCV. La infección es transmitida por medio de transfusiones sanguíneas (25-50% de los hemofílicos tienen hepatitis crónica) , infusión percutánea del uso ilícito de drogas (25-50% de todos los usuarios de drogas tienen hepatitis no A, hepatitis no B) , transplante de órgano renal (donde más tarde la mortalidad se debe a la hepatitis no A, no B) , y la transferencia maternal -neonatal . Hasta el 20% de los brotes esporádicos de hepatitis son provocados por el HCV. La asociación del virus de la hepatitis C en la hepatitis post-transfusión (>95% de los casos) y la observación subsiguiente de que la infección con este virus, más que con el virus de la hepatitis B, se correlaciona fuertemente con el desarrollo de carcinoma hepatocelular y la cirrosis hepática, han llevado a un estudio intenso de la biología molecular de los genes virales. El virus de la hepatitis C (HCV) es un virus envuelto, de cadenas positivas, el cual está evolucionalmente relacionado con flavivirus y pestivirus. El genoma HCV consiste de una región 5' sin traducir (51 UTR), un marco de lectura abierto largo de entre 9030 y 9099 nucleótidos y un 3' UTR. El extremo 3' del genoma ha sido reportado que contiene un alargamiento corto de poli (A) en las cadenas de tipo I, pero esto no ha sido confirmado en el tipo de cadenas II, III o IV. Se ha reportado que las secuencias en 5' UTR presentan control de la traducción negativa en la expresión del gen viral, pero la regulación principal de la expresión del gen de HCV viene de las divisiones o desdoblamientos proteolíticos de la poliproteína. Varios desdoblamientos proteolíticos de la poliproteína son esenciales para la expresión eficiente de la replicación asociada con las proteínas virales después de la traducción. Las proteínas replicasa resultantes interactúan con una región de entre 27 y 45 nucleótidos en 3' UTR, la cual funciona como una cola estructural para la iniciación de la replicación genómica viral . La división o desdoblamiento de la poliproteína de HCV utiliza ambas de las proteasas codificadas celular y viralmente, y genera por lo menos nueve proteínas. Una décima proteína viral (una segunda proteasa) ha sido reportada que es generada por el desdoblamiento o división alternativa de la poliproteína, pero no ha sido confirmado. Las proteínas codificadas viralmente, confirmadas, pueden ser clasificadas como proteínas estructurales o no estructurales. Las proteínas estructurales de los virus son la proteína C (22kD) , glicoproteína E (35 kD) y la glicoproteína E2/NS1 (58 kD) . Las proteínas no estructurales incluyen NS2 (53 kD) , NS3 (70 kD) , NS4a (8 kD) , NS4b (27 kD) , NS5a (58 kD) y NS5b (68 kD) . La proteína C es una proteína hidrofóbica, la cual constituye el componente estructural del núcleo de la partícula viral y puede jugar un papel en localizar la partícula viral a la membrana celular. También hay evidencia de ensayos pasajeros, que la proteína del núcleo puede funcionar como un transactivador de la expresión del gen.

Esta proteír.a es esencial para la replicación viral y parece estar altamente conservada a nivel del nucleótido de homología entre los tipos conocidos de HCV. Las proteínas de la envoltura son necesarias para la replicación viral, pero sus secuencias de nucleótidos (y de aminoácidos) difieren significativamente entre los tipos de HCV. La proteína NS3 funciona como la proteasa viral principal y las mutaciones en esta proteína llevan a la inactivación de la replicación viral, inhibiendo el procesamiento de la poliproteína. La secuencia de nucleótidos de la región NS3 es altamente conservada entre los aislados virales . El nivel de diferencia presentado por la ARN replicasa del HCV se ha cuantificado indirectamente, por la evaluación de la apariencia secuencial de las sustituciones de nucleótidos en el genoma de las muestras HCV obtenidos del mismo paciente. Estos estudios sugirieron que la diferencia de nucleótidos fue mínima, pero puede haber sido una subevaluación de la diferencia real de la replicasa, debido a que las muestras fueron preseleccionadas realmente por crecimiento en el paciente. Las sustituciones inaceptables podrían haberse perdido durante el crecimiento del virus. La replicación del HCV en los hepatocitos está integralmente entrelazada con la replicación de otros virus de la hepatitis. Aunque el virus de la hepatitis delta (HDV) es muy distinto del HCV, los ciclos de vida de los dos virus pueden ser interdependientes . Normalmente, HDV depende de la replicación del Virus de la Hepatitis B (HBV) para suministrar proteínas de la capside y otras funciones necesarias para el ensamble de las partículas de HDV infeccioso. Debido a que el HCV inhibe al HBV y el crecimiento del virus de la Hepatitis A (HAV) en células coinfectadas, la replicación del HCV también puede inhibir la maduración de HDV. El uso de HDV como un vector del gen para el tratamiento de las infecciones por HCV no podrían estar influenciadas por esta interferencia, debido a que la expresión del gen del genoma de HDV está aparentemente sin inhibir por HCV.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención caracteriza moléculas de ARN enzimáticas, nuevas o ribozimas, y métodos para su uso para inhibir la replicación de HCV. Tales ribozimas pueden ser utilizados en un método para el tratamiento de enfermedades provocadas por estos virus relacionados en el hombre y otros animales, incluyendo otros primates. Las ribozimas son moléculas de ARN que tienen una actividad enzimática, la cual es capaz de desdoblar repetidamente otras moléculas de ARN separadas en una forma específica de la secuencia de bases nucleotídicas. Tales moléculas de ARN enzimáticas, pueden ser el objetivo para virtualmente cualquier fragmento transcripto de ARN y se logra desdoblamiento eficiente in vitro. Kim et al., 84 Proc . 5 Nat. Acad. of Sci. USA 8788, 1987, Hazeloff, et al., 234 Nature 585, 1988, Cech, 260 JAMA 3030, 1988, y Jefferies et al., 17 Nucleic Acid Research 1371, 1989. Las ribozimas actúan uniéndose primero a un ARN "'* objetivo. Tal unión ocurre por medio de la porción de unión del ARN objetivo de una ribozima, la cual es mantenida en proximidad cercana a una porción enzimática del ARN, el cual actúa para desdoblar el ARN objetivo. De esta forma, la ribozima primero reconoce y luego se une a un ARN objetivo por medio de un apareamiento de bases complementario y una vez unido en el sitio correcto, actúa enzimáticamente para cortar el ARN objetivo. El desdoblamiento estratégico de tal ARN objetivo, destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada. Después de que una ribozima ha unido y desdoblado su ARN objetivo es liberado de ese ARN para buscar otro objetivo y puede unirse y desdoblar repetidamente nuevos objetivos. La naturaleza enzimática de una ribozima es ventajosa sobre otras tecnologías, tales como la tecnología antisentido (donde una molécula de ácido nucleico simplemente se une a un ácido nucleico objetivo, para bloquear su traducción) ya que la concentración efectiva de ribozima necesaria para efectuar un tratamiento terapéutico es menor que aquella de un oligonucleótido antisentido. Esta ventaja refleja la capacidad de la ribozima para actuar 5 enzimáticamente. De esta forma, una molécula de ribozima individual es capaz de desdoblar muchas moléculas de ARN objetivo. Además, la ribozima es un inhibidor altamente específico, con la especificidad de inhibición, dependiendo -"""" no solamente en el mecanismo de apareamiento de base de unión, sino también el mecanismo por el cual la molécula inhibe la expresión del AR? al cual se une. Es decir, la inhibición es provocada por el desdoblamiento del AR? objetivo y de esta forma la especificidad está definida como la relación de la velocidad de desdoblamiento del AR? objetivo sobre la velocidad de desdoblamiento de AR? no objetivo. Este mecanismo de desdoblamiento es dependiente de factores adicionales a aquellos implicados en el apareamiento de bases. De esta forma, se cree que la especificidad de acción de una ribozima, es mayor que aquella del enlace del oligonucleótido antisentido al mismo sitio de AR?. Esta clase de desdobladores o divisores químicos exhibirán un alto grado de especificidad solamente para el AR?m viral en células infectadas. Una molécula de ribozima que tiene como objetivo una región de la secuencia altamente conservada, permitirá el tratamiento de muchas cepas de HCV humano con un solo compuesto. No existe tratamiento el cual ataque específicamente la expresión del gen o genes virales del HCV. Los protocolos de tratamiento actuales (interferon y ribavirina) consisten del tratamiento de los síntomas de la enfermedad, no de la replicación viral. Al cesar los protocolos de tratamiento actuales, se asegura un rebote de la enfermedad debido a que el tratamiento no hace impacto en la latencia del virus o replicación viral real. El desdoblamiento del ARN viral ofrece un tratamiento nuevo, el cual reducirá la replicación del virus y establecimiento de la latencia en células recién infectadas. Los métodos de esta invención pueden ser utilizados para tratar infecciones del virus de la hepatitis C humana, la cual incluye ambas de la infección del virus aguda y crónica y la transformación de hepatocitos inducidos por HCV. La utilidad puede extenderse a otras especies de HCV, las cuales infectan a animales no humanos, donde tales infecciones son de importancia veterinaria. Además, la utilidad puede ser extendida a otros miembros de las familias pestivirus y flavivirus. El tratamiento ocurrirá . en el momento de la infección viral activa y reducirá las cargas de virus en las células infectadas y también deshabilita la replicación viral. El tratamiento con ribozima también puede ser utilizado como un medio para crear genomas defectuosos los cuales pueden ser utilizados en vacunas. De esta forma, en el primer aspecto, la invención caracteriza una molécula de ARN enzimática (o ribozima) la cual desdobla específicamente el ARN de HCV. Los sitios de desdoblamiento preferidos están dentro de las regiones requeridas para la replicación viral, por ejemplo, síntesis de proteína, tales como la región 51 sin traducir del genoma de HCV. Esta región se cree que controla la traducción de las proteínas virales en una forma la cual es reminiscente del control de la traducción independiente de la capside de picornavirus . La interrupción de esta región en el ARN resulta en la síntesis de proteína deficiente, así como también la síntesis de ADN incompleto (inhibición de la transcripción de los genomas defectuosos) . Las regiones alternativas fuera de la región 5' sin traducir también hacen objetivos adecuados de la inhibición mediada por la ribozima de la replicación de HCV. Tales objetivos incluyen regiones genómicas [ARNm] , las cuales codifican para la proteína estructural viral, E2/NS1, y las regiones que codifican para las proteínas no estructurales, especialmente la proteasa NS3 y las proteasas híbridas NS2/NS3. La selección de regiones objetivo particulares, dependerán de la estructura secundaria del genoma. Para evitar el potencial de escape viral de la terapia de ribozima, por cambios de bases aleatorios en el ARN genómico, se anticipa la formación del objetivo de regiones múltiples dentro de 5 ' UTR o los genes C y NS3. La formación de objetivos múltiples también reducirá al mínimo la capacidad 5 del virus para utilizar mutaciones por punto para escapar de la sobrevivencia inmune. La variación de fase, la cual acompaña las sustituciones de aminoácidos en las proteínas de superficie (y resulta desde las mutaciones por punto en el genoma de HCV) se ha propuesto para tomar en cuenta la per istencia viral, la cual es típica de las infecciones por HCV. De esta forma, dos o más ribozimas diferentes pueden ser utilizadas en esta invención para el tratamiento terapéutico. Por "gen" se entiende que se refiere ya sea a las regiones que codifican para la proteína o un ARNm semejante, o cualquiera de las regiones reguladoras en el ARN, las cuales regulan la síntesis de la proteína o estabilidad del ARNm. /* - Por "molécula de ARN enzimática" se entiende una molécula de ARN, la cual tiene complementariedad en la región de unión al sustrato para un objetivo de gen especificado y también tiene una actividad enzimática, la cual es activa para desdoblar específicamente el ARN en ese objetivo. Es decir, la molécula de ARN enzimática es capaz de desdoblar intermolecularmente el ARN y por lo tanto, inactivar una molécula de ARN objetivo. Esta complementariedad funciona para permitir la hibridación eficiente de la molécula de ARN enzimática al ARN objetivo para permitir que ocurra el desdoblamiento. Se prefiere el 100% de complementariedad, pero la complementariedad tan baja como de 50-75% también puede ser útil en esta invención. Por ARN "equivalente" para HCV se entiende incluir aquellas moléculas de ARN que se presentan en forma natural, asociadas con las enfermedades virales causadas en varios animales, incluyendo humanos y otros primates. Estos ARN virales tienen estructuras similares y genes equivalentes entre sí. En las modalidades preferidas, la molécula de ARN enzimática se forma en un motivo de cabeza de martillo, pero también puede formarse en el motivo de una horquilla, el virus de la hepatitis delta, intrón del grupo I o ARNasaP ARN (en asociación con una secuencia guía del AR?) . Los ejemplos de tales motivos de cabeza de martillo son descritos por Rossi et al., 8 AIDS RESEARCH A?D HUMAN RETROVIRUSES 183, 1992, los motivos de horquilla por Hampel et al., RNA CATALYST FOR CLEAVING SPECIFIC RNA SEQUENCES, presentada el 20 de septiembre de 1989, la cual es una continuación en parte de la Solicitud de los Estados Unidos No. de Serie 07/247,100, presentada el 20 de septiembre de 1988, Hampel and Tritz, 28 Biochemistrv 4929, 1989 y Hampel et al., 18 Nucleic Acids Research 299, 1990, y un ejemplo del motivo del virus delta de la hepatitis es descrito por Perrotta and Been, 31 Biochemistry 16, 1992, del motivo ARNasaP por Guerrier-Takada et al., 35 Cell 849, 1983, y del intrón del grupo I por Cech et al., Patente de los Estados Unidos 4,987,071. Estos motivos específicos no son limitantes en la invención y aquellos con habilidad en la técnica, reconocerán que todo lo que es importante en una molécula de ARN enzimática de esta invención, es que tiene un sitio de unión del sustrato específico, el cual es complementario a una o más de las regiones del AR? del gen objetivo y que tiene secuencias de nucleótidos dentro de, o que rodean este sitio de unión del sustrato, el cual imparte una actividad de desdoblamiento del AR? a la molécula. En las modalidades particularmente preferidas, el AR? el cual es desdoblado por la ribozima, está en 5' UTR del AR? genómica HCV o en la proteína C o los ORF de ?S3. Los números de nucleótido en el genoma de HCV se dan para delinear los extremos 5' de las regiones objetivo. Los datos de la secuencia principal se toman de Tanaka et al, 23 Virus Res . 39, 1992. Para comparación, se utilizan los datos de la secuencia de HCV de Choo et al 88 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2451 1991.

TABLA 1. Secuencia objetivo del ARNm de HCV.

No. de Nucleótido Secuencia Objetivo3 SEC. DE IDENT. NO. 27 CGACACU C CACCAUA SEC.DEIDENT.NO. 001 114 GCAGCCU C CAGGACC SEC.DEIDENT.NO. 002 128 CCCCCCÜ C CCGGGAG SEC.DEIDENT.NO. 003 148 UAGUGGU C UGCGGAA SEC.DEIDENT.NO. 004 165 GGUGAGU A CACCGGA SEC.DEIDENT.NO. 005 175 CCGGAAU U GCCAGGA SEC.DEIDENT.NO. 006 199 CCUUÜCÜ ü GGAUCAA SEC.DEIDENT.NO.007 213 ACCCGCÜ C AAUGCCÜ SEC. DEIDENT.NO.008 252 GACUGCU A GCCGAGU SEC. DEIDENT.NO.009 260 GCCG?GU A GUGUUGG SEC. DEIDENT.NO.010 265 GUAGUGU U GGGUCGC SEC. DE IDENT.NO.011 270 GUUGGGU C GCGAAAG SEC. DEIDENT. NO.012 288 UUGUGGU A CUGCCUG SEC. DEIDENT.NO.013 298 GCCUGAU A GGGUGCU SEC. DEIDENT. NO.014 306 GGGUGCU U GCGAGUG SEC. DEIDENT. NO.015 325 GGGAGGU C UCGUAGA Seq. ID. NO. 016 327 GAGGUCU C GUAGACC Seq. ID. NO. 017 330 GUCUCGU A GACCGUG Seq. ID. NO. 018 407 AGGACGU C AAGUUCC Seq. ID. NO. 019 412 GUCAAGU U CCCGGGC SEC.DEIDENT.NO. 020 413 UCAAGUU C CCGGGCG SEC.DEIDENT.NO. 021 426 CGGUGGU C AGAUCGU SEC.DEIDENT.NO. 022 472 CCCACGU U GGGUGUG SEC.DEIDENT.NO. 023 489 CGCGACU A GGAAGAC SEC.DEIDENT.NO. 024 498 GAAGACU U CCGAACG SEC.DEIDENT.NO. 025 499 AAGACUU C CGAACGG SEC.DEIDENT.NO. 026 508 GAACGGU C GCAACCU SEC.DEIDENT.NO. 027 534 ACAACCU A UCCCCAA SEC.DEIDENT.NO. 028 536 AACCUAU C CCCAAGG SEC.DEIDENT.NO. 029 546 CAAGGCU C GCCGACC SEC.DEIDENT.NO. 030 561 CGAGGGU A GGGCCUG SEC.DEIDENT.NO. 031 573 CUGGGCU C AGCCÜGG SEC.DEIDENT.NO. 032 583 CCUGGGU A CCCUUGG SEC.DEIDENT.NO. 033 588 GÜACCCÜ U GGCCCCU SEC.DEIDENT.NO. 034 596 GGCCCCÜ C UAUGGCA SEC.DEIDENT.NO. 035 598 CCCCUCU A UGGCAAU SEC.DEIDENT.NO. 036 632 GAUGGCU C CUGUCAC SEC.DEIDENT.NO. 037 637 CUCCUGU C ACCCCGC SEC.DEIDENT.NO. 038 649 CGCGGCU C CCGGCCU SEC.DEIDENT.NO. 039 657 CCGGCCU A GUÜGGGG SEC.DEIDENT.NO. 040 660 GCCUAGU U GGGGCCC SEC.DEIDENT.NO. 041 696 GCGCAAU C UGGGUAA SEC.DEIDENT.NO. 042 707 GUAAGGU C AUCGAUA SEC.DEIDENT.NO. 043 710 AGGUCAU C GAUACCC SEC. DE IDENT. NO. 044 714 CAUCGAU A CCCUCAC SEC. DE IDENT. NO. 045 UGCGGCU U CGCCGAC SEC. DE IDENT. NO. 046 730 731 GCGGCUU C GCCGACC SEC. DE IDENT. NO. 047 AUGGGGU A CAUUCCG SEC. DE IDENT. NO. 048 748 752 GGUACAU U CCGCÜCG SEC.DEIDENT.NO. 049 753 GUACAUU C CGCUCGU SEC.DEIDENT.NO. 050 758 UÜCCGCU C GUCGGCG SEC. DE IDENT. NO. Q51 CGCÜCGU C GGCGCCC SEC. DE IDENT. NO. 052 761 CCCCCCU A GGGGGCG SEC. DE IDENT. NO. Q53 773 AUGGUGU C CGGGUUC SEC. DE IDENT. NO. 054 806 812 ÜCCGGGU U CUGGAGG SEC. DE IDENT. NO. Q55 CCGGGUU C UGGAGGA SEC. DE IDENT. NO. 056 813 832 GUGAACU A CGCAACA SEC. DE IDENT. NO. 057 847 GGGAACU U GCCCGGU SEC.DEIDENT.NO. 058 855 GCCCGGU U GCUCUUU SEC. DE IDENT. NO. 059 UUCUCU SEC. DE IDENT. NO. 060 859 GGUÜGCÜ C U AUUGUGU A UGAGGCA SEC. DE IDENT. NO. 061 932 GCAUGAU C AUGCAUA SEC. DE IDENT. NO. 062 1001 GGUGCGU A cccuscs SEC. DE IDENT. NO. 063 1022 1031 CCUGCGU U CGGGAGA SEC. DE IDENT. NO. 064 1032 CUGCGUU C GGGAGAA SEC. DE IDENT. NO. 065 1048 AACGCCU C CCGÜUGU SEC. DE IDENT. NO. 066 1053 CUCCCGU U GUUGGG SEC.DEIDENT.NO. 067 1056 CCGUUGU U GGGUAGC SEC.DEIDENT.NO. 068 1061 GUUGGGU A GCGCUCA SEC.DEIDENT.NO. 069 1127 GCCACGU C GACUUGC SEC.DEIDENT.NO. 070 1132 GUCGACU U GCUCGUU SEC.DEIDENT.NO. 071 1136 ACUUGCU C GUUGGGG SEC.DEIDENT.NO. 072 1139 UGCUCGU U GGGGCGG SEC.DEIDENT.NO. 073 1153 GCCGCUU U CUGUUCC SEC. DE IDENT. NO. 074 1154 CCGCUUU C UGUUCCG SEC.DEIDENT.NO. 075 1158 UUUCUGU U CCGCCAU SEC.DEIDENT.NO. 076 1159 UUCUGUU C CGCCAUG SEC.DEIDENT.NO. 077 1168 GCCAUGU A CGUGGGG SEC.DEIDENT.NO. 078 1189 UGCGGAU C CGUÜUUC SEC. DE IDENT. NO. 079 1193 GAUCCGU U UUCCUCG SEC.DEIDENT.NO. 080 1194 AUCCGUU U UCCUCGU SEC.DEIDENT.NO. 081 1195 uccsuuu U CCUCGUC SEC.DEIDENT.NO. 082 1196 CCGUUÜÜ C CUCGUCU SEC.DEIDENT.NO. 083 1280 GCCAUGU A UCAGGUC SEC.DEIDENT.NO. 084 1282 CAUGUAU C AGGUCAC SEC.DEIDENT.NO. 085 1287 AUCAGGU C ACCGCAU SEC.DE1DENT.NO. 086 1373 AAGCUGU C GUGGAUA SEC.DEIDENT.NO. 087 1380 CGUGGAU A UGGUGGC SEC.DEIDENT.NO. 088 1406 GGGGAGU C CUAGCGG SEC.DEIDENT.NO.089 1409 GAGUCCU A GCGGGCC SEC.DEIDENT.NO.090 1418 CGGGCCU U GCCUACU SEC.DEIDENT.NO. 091 1423 COUGCCU A CUAUUCC SEC.DEIDENT.NO. 092 1426 GCCUACU A UUCCAUG SEC.DEIDENT.NO. 093 1428 CUACUAU U CCAUGGU SEC.DEIDENT.NO. 094 1429 UACUAUU C CAUGGUG SEC.DEIDENT.NO. 095 1727 GCUCCAU C GACAAGU SEC.DEIDENT.NO. 096 1735 GACAAGU U CGCUCAG SEC.DEIDENT.NO. 097 1736 ACAAGUU C GCUCAGG SEC.DEIDENT.NO. 098 1740 GUUCGCU C AGGGAUG SEC.DEIDENT.NO. 099 1757 GCCCCAU C ACCUAUA SEC.DEIDENT.NO. 100 1762 AUCACCU A UACCGAG SEC.DEIDENT.NO. 101 1795 AGGCCUU A CUGCUGG SEC.DEIDENT.NO. 102 1806 CUGGCAU U ACGCACC SEC.DEIDENT.NO. 103 1807 UGGCAUU A CGCACCU SEC. DE IDENT. NO. 104 1815 CGCACCU C GGCAGUG SEC.DEIDENT.NO. 105 1827 GUGUGGU A UCGUACC SEC.DEIDENT.NO. 106 1829 GUGGUAU C GUACCUG SEC.DEIDENT.NO. 107 1832 GUAUCGU A CCUGCGU SEC.DEIDENT.NO. 108 1840 CCUGCGU C GCAGGUG SEC.DEIDENT.NO. 109 1854 GUGUGGU C CAGUGUA SEC.DEIDENT.NO. no 1883 GCCCÜGU U GUAGUGG SEC.DEIDENT.NO. 111 1886 CUGUUsU A GUGGGGA SEC.DEIDENT.NO. 112 1902 GACCGAU C GGUCCGG SEC.DEIDENT.NO. 113 1906 GAUCGGU C CGGUGCC SEC. DE IDENT. NO. 114 1917 UGCCCCU A CGUAUAA SEC. DE IDENT. NO. l 5 1921 CCUACGU A UAACUGG SEC.DEIDENT.NO.116 1923 UACGUAU A ACUGGGG SEC. DE IDENT. NO.117 1990 AACUGGU U UGGCUGU SEC. DEIDENT.NO.118 1991 ACUGGUU u GGCUGUA SEC. DEIDENT.NO.119 1998 UGGCUGU A CAUGGAU SEC.DEIDENT.NO.120 2043 GGGCCCU C CGUGCAA SEC.DEIDENT.NO.121 2054 GCAACAU C GGGGGGG SEC.DEIDENT.NO. 122 2063 GGGGGGU C GGCAACC SEC.DEIDENT.NO. 123 2072 GCAACCU C ACCUUGA SEC.DEIDENT.NO. 124 2077 CUCACCU U GACCUGC SEC.DEIDENT.NO. 125 2121 GGCCACU U ACACAAA SEC.DEIDENT.NO. 126 2122 sccACüu A CACAAAA SEC.DEIDENT.NO. 127 2137 UGUGGCU C GGGGCCA SEC.DEIDENT.NO. 128 2149 CCAUGGU U AACACCU SEC.DEIDENT.NO. 129 2150 CAUGGUU A ACACCUA SEC.DEIDENT.NO. 130 2219 UUACCAU C UUUAAGG SEC.DEIDENT.NO. 131 2221 ACCAUCU U UAAGGUU SEC.DEIDENT.NO. 132 2261 ACAGGCU U AGUGCUG SEC.DEIDENT.NO. 133 2262 CAGGCUU A GUGCUGC SEC.DEIDENT.NO. 134 2295 AGAGCGU U GCGACCU SEC.DEIDENT.NO. 135 2320 GACAGAU C GGAGCUC SEC.DEIDENT.NO. 136 2327 CGGAGCU C AGCCCGC SEC.DEIDENT.NO. 137 2344 CÜGCUGU C CACGACA SEC.DEIDENT.NO. 138 2417 UCCACCU C CAUCAGA SEC.DEIDENT.NO. 139 2421 CCUCCAU C AGAACAU SEC.DEIDENT.NO. 140 2429 AGAACAU C GUGGACG SEC.DEIDENT.NO. 141 2534 CGCGCGU C UGUGCCU SEC.DEIDENT.NO. 145 2585 CCGCCCU A GAGAACC SEC.DEIDENT.NO. 143 2600 UGGUGGU C CUCAACG SEC. DE IDENT. NO. 144 2603 ÜGGUCCU C AACGCGG SEC. DE IDENT. NO. 145 2671 GCCUGGU A CAUCAAG SEC. DE IDENT. NO.146 2675 GGUACAU C AAGGGCA SEC. DE IDENT. NO.147 2690 GGCUGGU C CCUGGGG SEC. DE IDENT. NO.148 2704 GCGGCAU A UGCUCUG SEC.DEIDENT.NO.149 2709 AUAUGCU C UGUACGG SEC. DE IDENT. NO.150 2713 GCUCUGU A CGGCGUG SEC. DE IDENT. NO. 151 2738 UCCUGCU C CUGCUGG SEC.DEIDENT.NO.152 2763 ACGGGCÜ U ACGCCAU SEC. DE IDENT. NO.153 2764 CGGGCUU A CGCCAUG SEC. DE IDENT. NO.154 2878 UGGUGGU U ACAAUAC SEC.DEIDENT.NO.155 2879 GGUGGUÜ A CAAUACU SEC. DE IDENT. NO.156 2884 UUACAAU A CUUUAUC SEC. DE IDENT. NO.157 2887 CAAUACU U UAUCACC SEC. DE IDENT. NO.158 2888 AAUACUU U AUCACCA SEC. DE IDENT. NO.159 2910 GGCGCAU U UGUGCGU SEC.DEIDENT.NO.160 2911 GCGCAUU U GUGCGUG SEC.DEIDENT.NO.161 2924 UGUGGGU C CCCCCUC SEC. DE IDENT. NO.162 2931 CCCCCCU C UCAAUGU SEC. DE IDENT. NO.163 2933 CCCCUCÜ C AAUGUCC SEC. DE IDENT. NO.164 2939 UCAAUGU C CGGGGGG SEC. DE IDENT. NO.165 2958 CGAUGCU A UCAUCCU SEC. DE IDENT. NO.166 2960 AUGCUAU C AUCCUCC SEC. DE IDENT. NO.167 2963 CUAUCAU C CÜCCÜCA SEC. DE IDENT. NO.168 2966 UCAUCCU C CUCACAU SEC. DE IDENT. NO.169 2969 UCCUCCÜ C ACAUGUG SEC.DEIDENT.NO.170 3059 CUGCCAU A ACUGCGA SEC. DE IDENT. NO.171 3138 AGGCCAU U ACGUCCA SEC.DEIDENT.NO. 172 3139 GGCCAUU A CGUCCAA SEC.DEIDENT.NO. 173 3143 AUUACGU C CAAAUGG SEC.DEIDENT.NO. 174 3154 AUGGCCU U CAUGAAG SEC.DEIDENT.NO. 175 3155 UGGCCUU C AUGAAGC SEC.DEIDENT.NO. 176 3209 CCCCGCU A CAGGAUU SEC.DEIDENT.NO. 177 3216 ACAGGAU U GGGCCCA SEC.DEIDENT.NO. 178 3233 CGGGCCU A CGAGACC SEC.DEIDENT.NO. 179 3242 GAGACCU U GCGGUGG SEC.DEIDENT.NO. 180 3263 AGCCCGU C GUCUUCU SEC.DEIDENT.NO. 181 3266 CCGUCGU C UUCUCUG SEC.DEIDENT.NO. 182 3268 GUCGUCU U CUCUGAC SEC.DEIDENT.NO. 183 3290 CCAAGAU C AUCACCU SEC.DEIDENT.NO. 184 3293 AGAUCAU C ACCUGGG SEC.DEIDENT.NO.185 3329 GGGACAU C AUCUUGG SEC.DEIDENT.NO. 186 3332 ACAUCAU C UUGGGAC SEC.DEIDENT.NO. 187 3334 AUCAUCU U GGGACUG SEC.DEIDENT.NO. 188 3347 UGCCCGU C UCCGCCC SEC.DEIDENT.NO. 189 3349 CCCGUCU C CGCCCGA SEC.DEIDENT.NO. 190 3371 GGGAGAU A CUUCUGG SEC.DEIDENT.NO. 191 3416 GGCGACU C CUUGCCC SEC.DEIDENT.NO. 192 3419 GACUCCU U GCCCCCA SEC.DEIDENT.NO. 193 3428 CCCCCAU C ACGGCCU SEC.DEIDENT.NO. 194 3482 CUAGCCÜ C ACAGGCC SEC.DEIDENT.NO. 195 3518 GGGAGGU U CAAGUGG SEC.DEIDENT.NO. 196 3519 GGAGGUU C AAGUGGU SEC.DEIDENT.NO. 197 3527 AAGUGGU u UCCACCG SEC.DEIDENT.NO. 198 3528 AGUGGUU U CCACCGC SEC.DEIDENT.NO. 199 3529 GUGGUUU C CACCGCA SEC.DEIDENT.NO. 200 3576 UGUGUGU U GGACCGU SEC.DEIDENT.NO. 201 3601 GCCGGCU C AAAGACC SEC.DEIDENT.NO. 202 3611 AGACCCU A GCCGGCC SEC.DEIDENT.NO. 203 3684 UGCGCCU C CCGGGGC SEC.DEIDENT.NO. 204 3696 GGCGCGU U CCCUUAC SEC.DEIDENT.NO. 205 3697 GCGCGUU C CCUUACA SEC.DEIDENT.NO.206 3701 GUUCCCU U ACACCAU SEC.DEIDENT.NO.207 3702 UUCCCUÜ A CACCAUG SEC.DEIDENT.NO. 208 3724 GGUAGCU C GGACCUC SEC.DEIDENT.NO.209 3731 CGGACCÜ C UAUCÜGG SEC.DEIDENT.NO.210 3733 GACCUCU A UCUGGUC SEC.DEIDENT.NO.211 3735 CCUCUAU C UGGUCAC SEC.DEIDENT.NO.212 3740 AUCUGGU C ACGAGAC SEC.DEIDENT.NO.213 3761 ACGUCAU U CCGGUGC SEC.DEIDENT.NO.214 3762 CGUCAUU C CGGUGCG SEC.DEIDENT.NO.215 3786 UGACGGU C GGGGGAG SEC.DEIDENT.NO.216 3797 GGAGCCU A CUGUCCC SEC.DEIDENT.NO.217 3802 CUACUGU C CCCCAGA SEC.DEIDENT.NO.218 3835 GGCUCUU C GGGUGGC SEC. DE IDENT. NO.219 3851 CACUGCU c uscccuu SEC.DEIDENT.NO.220 3858 CUGCCCU U CGGGGC SEC.DEIDENT.NO.221 3859 UGCCCUU C GGGGCAC SEC. DE IDENT. NO.222 3872 ACGCUGU A GGCAUCU SEC. DE IDENT. NO.223 3878 UAGGCAU C UUCCGGG SEC. DE IDENT. NO. 224 3880 GGCAUCU U CCGGGCU SEC. DE IDENT. NO.225 3881 GCAUCUU C CGGGCUG SEC. DE IDENT. NO. 226 3908 GGGGGGU U GCGAAGG SEC. DE IDENT. NO. 227 4056 GAGCACU A AAGUGCC SEC. DE IDENT. NO. 228 4072 GCUGCGU A CGCAGCC SEC. DE IDENT. NO. 229 4087 CAAGGGU A CAAGGUA SEC. DE IDENT. NO. 230 4115 CAUCUGU U GCCGCCA SEC. DE IDENT. NO.231 4175 CCAACAU C AGAACUG SEC. DE IDENT. NO.232 4187 CUGGGGU A AGGACCA SEC. DE IDENT. NO.233 4228 ÜCCACCU A UGGUAAG SEC. DE IDENT. NO. 234 4233 CUAUGGU A AGUUCCU SEC. DE IDENT. NO.235 4237 GGUAAGU U CCUUGCC SEC. DE IDENT. NO.236 4238 GUAAGUÜ C CUUGCCG SEC. DE IDENT. NO.237 4241 AGUUCCU U GCCGACG SEC. DE IDENT. NO.238 4280 AUAUCAU A AUAUGUG SEC. DE IDENT. NO.239 4283 UCAUAAU A UGUGAUG SEC. DE IDENT. NO.240 4337 GCACAGU C CUGGACC SEC. DE IDENT. NO.241 4370 CGCGGCU C GUCGUGC SEC. DE IDENT. NO.242 4373 GGCUCGU C GUGCUCG SEC. DE IDENT. NO.243 4379 UCGUGCU C GCCACCG SEC. DE IDENT. NO.244 4425 CCCAAAU A UUGAGGA SEC. DE IDENT. NO.245 4444 GCUCUGU C CAACACU SEC. DE IDENT. NO.246 4460 GAGAGAU C CCCUUCU SEC. DE IDENT. NO.243 4481 AGGCCAU C CCCCUCG SEC. DE IDENT. NO.248 4487 UCCCCCÜ C GAGGCCA SEC. DE IDENT. NO.249 4496 AGGCCAU C AAGGGGG SEC.DEIDENT.NO. 250 4528 UGCCACU C CAAGAAG SEC.DEIDENT.NO. 251 4577 UCGGAAU C AAUGCCG SEC.DEIDENT.NO. 252 4586 AUGCCGU A GCGUAUU SEC.DEIDENT.NO. 253 4591 GUAGCGU A UUACCGG SEC.DEIDENT.NO. 254 4593 AGCGUAU U ACCGGGG SEC.DEIDENT.NO. 255 4594 sCGUAÜÜ A CCGGGGU SEC.DEIDENT.NO. 256 4616 UGUCCGU C AUACCGA SEC.DEIDENT.NO. 257 4619 CCGUCAU A CCGACUA SEC.DEIDENT.NO. 258 4626 ACCGACU A GCGGAGA SEC.DEIDENT.NO. 259 4672 ACGGGCU A CACCGGU SEC.DEIDENT.NO. 260 4697 CGGUGAU C GACUGCA SEC.DEIDENT.NO. 261 4789 GCGGUGU C GCGCUCA SEC.DEIDENT.NO. 162 4795 UCGCGCU C ACAACGG SEC.DEIDENT.NO. 263 4920 CÜGUGCU U GGUAUGA SEC.DEIDENT.NO. 264 4924 GCUUGGU A UGAGCUC SEC.DEIDENT.NO. 265 4931 AUGAGCU C ACGCCCG SEC.DEIDENT.NO. 266 4947 UGAGACU A CAGUCAG SEC.DEIDENT.NO. 267 4952 CUACAGU C AGGUÜGC SEC.DEIDENT.NO. 268 4957 GUCAGGU U GCGGGCU SEC.DEIDENT.NO. 269 4965 GCGGGCU U ACCUGAA SEC.DEIDENT.NO. 270 4966 CGGGCUU A CCUGAAU SEC.DEIDENT.NO. 271 4974 CCUGAAU A CACCAGG SEC. DE IDENT. NO. 272 4984 CCAGGGU U GCCCGUC SEC.DEIDENT.NO. 273 4991 UGCCCGU C UGCCAGG SEC. DE IDENT. NO. 274 5004 GGACCAU C UGGAGUU SEC.DEIDENT.NO. 275 5102 ACCUGGU A GCAUACC SEC.DEIDENT.NO. 276 5107 GUAGCAU A CCAAGCC SEC.DEIDENT.NO.277 5133 CAGGGCU C AGGCUCC SEC.DEIDENT.NO. 278 5218 CUGCUGU A UAGGCUA SEC.DEIDENT.NO. 279 5220 GCUGUAU A GGCUAGG SEC.DEIDENT.NO. 280 5306 UGGAGGU C GUCACUA SEC.DEIDENT.NO. 281 5309 AGGUCGU C ACUAGCA SEC.DEIDENT.NO. 282 5313 CGUCACU A GCACCUG SEC.DEIDENT.NO. 283 5330 UGCUGGU A GGCGGAG SEC.DEIDENT.NO. 284 5339 GCGGAGU C CUUGCAG SEC.DEIDENT.NO. 285 5342 GAGUCCU U GCAGCUC SEC.DEIDENT.NO. 286 5359 GCCGCAU A UUGCCUG SEC.DEIDENT.NO. 287 5361 CGCAUAÜ U GCCUGAC SEC.DEIDENT.NO. 288 5376 AACCGGU A GUGUGGU SEC.DEIDENT.NO. 289 5399 GUAGGAU C AUUUUGU SEC.DEIDENT.NO. 290 5423 CGGCUGU U GUUCCCG SEC.DEIDENT.NO. 291 5426 CUGUUGU U CCCGACA SEC.DEIDENT.NO. 292 5427 UGUUGUU C CCGACAG SEC.DEIDENT.NO. 293 5524 GAGCAGU U CAAGCAG SEC.DEIDENT.NO. 294 5525 AGCAGUU C AAGCAGA SEC.DEIDENT.NO. 295 5583 CGCÜGCU C CCGUGGU SEC.DEIDENT.NO. 296 5596 GUGGAGU C CAGGUGG SEC.DEIDENT.NO. 297 5612 GGGCCCU U GAGGCCU SEC.DEIDENT.NO. 298 5620 GAGGCCU U CUGGGCA SEC.DEIDENT.NO. 299 5621 AGGCCUU C UGGGCAA SEC.DEIDENT.NO. 300 5674 GCAGGCU U AUCCACU SEC.DEIDENT.NO. 301 SEC.DEIDENT.NO. 302 5675 CAGGCUU A UCCACUC SEC.DEIDENT.NO. 303 57£7 CUCCUGU U CAACAUC SEC.DEIDENT.NO. 304 5768 UCCUGUU C AACAUCU GCUCCUC SEC.DEIDENT.NO. 305 5801 CUCAACU C SEC.DEIDENT.NO. 306 5805 ACUCGCU C CUCCCAG SEC.DEIDENT.NO. 307 5821 GCUGCUU C GGCCUUC SEC.DEIDENT.NO. 308 5827 UCGGCCU U CGUGGGC SEC.DEIDENT.NO. 309 5828 CGGCCUU C GUGGGCG SEC.DEIDENT.NO. 310 5843 CCGGCAU U GCCGGUG CGGCCAU U GGCAGCA SEC.DE1DENT.NO. 311 5858 GCAGCAU A GGCCÜUG SEC.DEIDENT.NO. 312 5867 UAGGCCU U GGGAAGG SEC.DE1DENT.NO. 313 5873 GCGGGCU A UGGAGCG SEC.DEIDENT.NO. 314 5905 GUGCACU C GUGGCUU SEC.DEIDENT.NO. 315 5930 CGU SEC.DEIDENT.NO. 316 5937 GGCU U UUAAGGU SEC.DEIDENT.NO. 317 5938 GUGGCUU U UAAGGUC SEC.DEIDENT.NO. 318 5939 UGGCÜUU U AAGGUCA GGCÜUUU A AGGUCAU SEC.DEIDENT.NO. 319 5940 SEC.DEIDENT.NO. 320 5945 UUAAGGU C AUGAGCG SEC.DEIDENT.NO. 321 5965 GCGCCCU C CGCCGAG SEC.DEIDENT.NO. 322 5981 ACCÜGGU U AACUÜGC SEC.DEIDENT.NO. 323 5982 CCUGGUU A ACÜUGCU SEC.DEIDENT.NO. 324 5990 ACUUGCU C CCUGCCA SEC.DEIDENT.NO. 325 6004 AUCCUCU C CCCCGGC 6020 CCCUGGU C GUCGGGG SEC.DEIDENT.NO. 326 6023 UGGUCGU C GGGGUCG SEC.DEIDENT.NO. 327 6029 UCGGGGU C GUGUGUG SEC.DEIDENT.NO.328 6044 CAGCAAU C CÜGCGUC SEC.DEIDENT.NO.329 6051 CCÜGCGU C GGCACGU SEC.DEIDENT.NO.340 6106 AUAGCGU U CGCUUCG SEC.DEIDENT.NO.341 6107 UAGCGUU C GCUUCGC SEC.DEIDENT.NO.342 6111 GUUCGCU U CGCGGGG SEC.DE1DENT.NO.343 6413 ACGGCAU C AUGCAAA SEC.DEIDENT.NO.344 6574 CCGAACU A UUCCAGG SEC.DEIDENT.NO.345 6576 GAACUAU U CCAGGGC SEC.DE1DENT.NO.346 6577 AACUAUÜ C CAGGGCG SEC.DEIDENT.NO.347 6637 GGGGACU U CCACUAC SEC.DEIDENT.NO.348 6638 GGGACUU C CACUACG SEC.DEIDENT.NO.349 6643 UUCCACU A CGUGACG SEC.DEIDENT.NO.350 6671 ACAACGU A AAAUGCC SEC. DEIDENT.NO.351 6703 CCCGAAU U CUUCACC SEC. DEIDENT.NO.352 6704 CCGAAUU C UUCACCG SEC.DEIDENT.NO.353 6706 GAAUUCU U CACCGAA SEC.DEIDENT.NO.354 6707 AAUUCUU C ACCGAAU SEC.DEIDENT.NO.355 6715 ACCGAAU U GGACGGG SEC.DEIDENT.NO.356 6730 GUGCGGU U GCACAGG SEC.DEIDENT.NO.357 6739 CACAGGU A CGCUCCG SEC. DEIDENT.NO.358 6744 GUACGCU C CGGCGUG SEC. DEIDENT.NO.359 6759 CAGACCU C UCCUACG SEC.DEIDENT.NO.360 6761 GACCUCU C CUACGGG SEC.DEIDENT.NO.361 6764 CÜCUCCU A CGGGAGG SEC.DEIDENT.NO.362 6776 AGGAUGU C ACAUUCC SEC.DEIDENT.NO.363 6782 UCACAUU C CAGGUCG SEC.DEIDENT.NO.364 6788 UCCAGGU C GGGCUCA SEC.DEIDENT.NO.365 6794 UCGGGCU C AACCAAU SEC.DEIDENT.NO. 366 6802 AACCAAU A CCUGGUU SEC.DEIDENT.NO. 367 6809 ACCUGGU U GGGUCAC SEC.DEIDENT.NO. 368 6814 GUUGGGU C ACAGCUC SEC.DEIDENT.NO. 369 6821 CACAGCU C CCAUGCG SEC.DEIDENT.NO. 370 6906 UAAACGU A GGCUGGC SEC.DEIDENT.NO. 371 6922 AGGGGGU C UCCCCCC SEC.DEIDENT.NO. 372 6924 GGGGUCU C CCCCCUC SEC.DEIDENT.NO.373 6931 CCCCCCU C CUUGGCC SEC.DEIDENT.NO. 374 6934 CCCUCCU U GGCCAGC SEC.DEIDENT.NO. 375 6943 GCCAGCU C UUCAGCU SEC.DEIDENT.NO.376 6958 AGCCAAU U GUCUGCG SEC.DEIDENT.NO.377 6961 CAAUUGU C UGCGCCU SEC.DEIDENT.NO.378 7034 CCAACCU C CUGUGGC SEC.DEIDENT.NO. 379 7118 ACCCGCU U CGAGCGG SEC.DEIDENT.NO. 380 7119 CCCGCUU C GAGCGGA SEC.DEIDENT.NO. 381 7145 GGGAAGU A UCCGUUG SEC.DEIDENT.NO. 382 7195 CCCGCGU U GCCCAUA SEC.DEIDENT.NO. 383 7202 UGCCCAU A UGGGCAC SEC.DEIDENT.NO.384 7218 CCCGGAU U ACAACCC SEC.DEIDENT.NO.385 7219 CCGGAUU A CAACCCU SEC.DEIDENT.NO. 386 7234 CCACUGU U AGAGUCC SEC.DEIDENT.NO. 387 7235 CACUGUU A GAGUCCU SEC.DEIDENT.NO. 388 7251 GAAAAGU C CGGACUA SEC.DEIDENT.NO. 389 7258 CCGGACU A CGUCCCU SEC. DE IDENT. NO. 390 7262 ACUACGU C CCUCCGG SEC. DE IDENT. NO. 391 7266 CGUCCCU C CGGCGGU SEC. DE IDENT. NO. 392 7288 UGCCCAU U GCCGCCU SEC.DEIDENT.NO. 393 7296 GCCGCCU A CCACGGG SEC. DE IDENT. NO. 394 7354 ACAGAGU C CACCGUG SEC. DE IDENT. NO. 395 7386 GCUGGCU A CÜAAGAC SEC. DE IDENT. NO. 396 7389 GGCUACU A AGACUUU SEC. DE IDENT. NO. 397 7395 UAAGACU U UCGGCAG SEC. DE IDENT. NO. 398 7396 AAGACUU U CGGCAGC SEC. DE IDENT. NO. 399 7397 AGACUUU C GGCAGCU SEC. DE IDENT. NO. 400 7411 UCCGGAU C GUCGGCC SEC. DE IDENT. NO. 410 7414 GGAUCGU C GGCCGUU SEC. DE IDENT. NO. 402 7421 CGGCCGU U GACAGCG SEC. DE IDENT. NO. 403 7498 UCGUACU C CUCCAUG SEC.DEIDENT.NO. 404 7501 UACUCCU C CAUGCCC SEC. DE IDENT. NO. 405 7514 CCCCCCU U GAGGGGG SEC. DE IDENT. NO. 406 7539 CCCÜGAU C UCAGCGA SEC. DE IDENT. NO. 407 7541 CUGAUCU C AGCGACG SEC. DE IDENT. NO. 408 7552 GACGGGU C UUGGUCU SEC. DE IDENT. NO. 409 7554 CGGGUCU U GGUCUAC SEC. DE IDENT. NO. 410 7558 UCUUGGU C UACCGUG SEC. DE IDENT. NO. 411 7560 UUGGUCU A CCGUGAG SEC. DE IDENT. NO. 412 7589 ACGACAU C GUCUGCU SEC. DE IDENT. NO. 413 7592 ACAUCGU C UGCUGCU SEC.DEIDENT.NO. 414 7600 UGCUGCU C AAUGUCC SEC.DEIDENT.NO. 415 7606 UCAAUGU C CUACACA SEC.DEIDENT.NO.416 7667 UGCCCAU C AACGCGU SEC.DEIDENT.NO.417 7723 ACAACAU C CCGCAGU SEC.DEIDENT.NO. 418 7775 UGCAAGU C CUGGACG SEC.DEIDENT.NO.419 7789 GACCACU A CCGGGAC SEC.DEIDENT.NO. 420 7839 UAAGGCU A AACUUCU SEC.DEIDENT.NO. 421 7847 AACUUCU A UCCGUAG SEC.DEIDENT.NO.422 7849 CUUCUAU C CGUAGAA SEC.DEIDENT.NO.423 7853 UAUCCGU A GAAGAAG SEC.DEIDENT.NO.424 7894 GCCAAAU C UAAAUUÜ SEC.DEIDENT.NO.425 7896 CAAAUCU A AAUUUGG SEC.DEIDENT.NO.426 7900 UCUAAAU U UGGCUAU SEC.DEIDENT.NO.427 7901 CUAAAUU U GGCUAUG SEC.DEIDENT.NO.428 7906 UUUGGCU A UGGGGCA SEC.DEIDENT.NO.429 7955 ACCACAU C CGCUCCG SEC.DEIDENT.NO.430 7960 Auccscu C CGUGUGG SEC.DEIDENT.NO.431 8075 CUCGCCU U AUCGUAU SEC.DEIDENT.NO. 432 8076 UCGCCUU A UCGUAUU SEC.DEIDENT.NO.433 8078 GCCUUAU C GUAUUCC SEC.DEIDENT.NO.434 8170 uccucsu A CGGAUUC SEC.DEIDENT.NO.435 8176 UACGGAU U CCAGUAC SEC.DEIDENT.NO.436 8182 UÜCCAGU A CÜCUCCU SEC. DE IDENT. NO.437 8187 GUACUCU C CUGGGCA SEC.DEIDENT.NO.438 8201 AGCGGGU U GAGUÜCC SEC.DEIDENT.NO.439 8206 GUUGAGU U CCÜGGUG SEC.DEIDENT.NO.440 8207 UUGAGUU C CUGGUGA SEC.DEIDENT.NO.441 8227 UGGAAAU C AAAGAAA SEC.DEIDENT.NO. 442 8357 AGGCCAU A AAGUCGC SEC.DEIDENT.NO. 443 8362 AUAAAGU C GCUCACG SEC.DEIDENT.NO. 444 8366 AGUCGCU C ACGGAGC SEC.DEIDENT.NO. 445 8378 AGCGGCU C UACAUCG SEC.DEIDENT.NO. 446 8380 CGGCUCU A CAUCGGG SEC.DEIDENT.NO. 447 8384 UCUACAU C GGGGGCC SEC.DEIDENT.NO. 448 8424 CUGCGGU U AUCGCCG SEC.DEIDENT.NO. 449 8425 UGCGGUU A UCGCCGG SEC.DEIDENT.NO. 450 8427 CGGUUAU C GCCGGUG SEC.DEIDENT.NO. 451 8460 GACGACU A GCUGCGG SEC.DEIDENT.NO. 452 8508 GGCCÜGU C GAGCUGC SEC.DEIDENT.NO. 453 8522 CAAAGCU C CAGGACU SEC.DEIDENT.NO. 454 8540 CGAUGCU C GUGAACG SEC.DEIDENT.NO. 454 8558 ACGACCU U GUCGUUA SEC.DEIDENT.NO. 455 8561 ACCUUGU C GUUAUCU SEC.DEIDENT.NO. 456 8564 UUGUCGU U AUCUGUG SEC.DEIDENT.NO. 457 8638 AGGUACU C UGCCCCC SEC.DEIDENT.NO. 458 8671 CCAGAAU A CGACUUG SEC.DEIDENT.NO. 459 8698 UCAUGCU C CUCCAAC SEC.DEIDENT.NO. 460 8701 UGCUCCU C CAACGUG SEC.DEIDENT.NO. 461 8728 GACGCAU C CGGCAAA SEC.DEIDENT.NO. 462 8774 CCCCCCÜ U GCACGGG SEC.DEIDENT.NO. 463 8842 AUCAUGU A UGCGCCC SEC.DEIDENT.NO. 464 8854 CCCACCU U AUGGGCA SEC.DEIDENT.NO. 465 8855 CCACCUÜ A UGGGCAA SEC.DEIDENT.NO. 466 8871 GAUGAUU U UGAUGAC SEC.DEIDENT.NO. 467 8880 GAUGACU C ACUUCUU SEC.DEIDENT.NO. 468 8931 CCÜGGAU U GUCAGAU SEC.DEIDENT.NO. 469 8934 GGAUUGU C AGAUCUA SEC.DEIDENT.NO. 470 8939 GUCAGAU C UACGGGG SEC.DEIDENT.NO. 471 8941 CAGAUCU A CGGGGCC SEC.DEIDENT.NO. 472 9065 CAUGCCU C AGGAAAC SEC.DEIDENT.NO. 473 9074 GGAAACU U GGGGUAC SEC.DEIDENT.NO. 474 9080 UUGGGGU A ccscccu SEC.DEIDENT.NO. 475 9088 CCGCCCU U GCGAGUC SEC.DEIDENT.NO. 476 9095 UGCGAGU C UGGAGAC SEC.DEIDENT.NO. 477 9119 GAAGUGU C CGCGCUA SEC.DEIDENT.NO. 478 9126 CCGCGCU A GGCUACU SEC.DEIDENT.NO. 479 9131 CUAGGCU A CUGUCCC SEC.DEIDENT.NO. 480 9136 CUACUGU C CCAAGGG SEC.DEIDENT.NO. 481 9226 GCCGCGU C CCAGCUG SEC.DEIDENT.NO. 482 9238 CUGGACU U GUCCAGC SEC.DEIDENT.NO. 483 9241 GACÜUGU C CAGCUGG SEC.DEIDENT.NO. 484 9250 AGCUGGU U CGUUGCU SEC.DEIDENT.NO. 485 9251 GCUGGUU C GUUGCUG SEC.DEIDENT.NO. 486 9254 GGUUCGU U sCUGGUU SEC.DEIDENT.NO. 487 9278 GAGACAU A UAUCACA SEC.DEIDENT.NO. 488 9280 GACAUAU A UCACAGC SEC.DEIDENT.NO. 489 9282 CAUAUAU C ACAGCCU SEC.DEIDENT.NO. 490 9292 AGCCUGU C UCGUGCC SEC.DEIDENT.NO. 491 9326 GGUGCCU A CÜCCUAC SEC.DEIDENT.NO. 492 9329 GCCUACU C CUACUUU SEC. DE iDENT. NO. 493 9332 UACUCCU A CUUUCCG SEC. DE IDENT. NO. 494 9335 UCCUACU U UCCGUAG SEC. DE IDENT. NO. 495 9336 CCUACUU U CCGUAGG SEC.DEIDENT.NO.496 9337 CUACUUU C CGUAGGG SEC. DE IDENT. NO. 497 9341 UUUCCGU A GGGGUAG SEC. DE IDENT. NO. 498 9347 UAGGGGU A GGCAUCU SEC. DE IDENT. NO.499 9353 UAGGCAU C UACCUGC SEC. DE IDENT. NO. 500 9355 GGCAUCU A CCUGCUC SEC. DE IDENT. NO.501 9362 ACCUGCU C CCCAACC SEC. DE IDENT. NO.502 9385 GGGAGCU A AUCACUC SEC. DE IDENT. NO. 503 9388 AGCUAAU C ACUCCAG SEC. DE IDENT. NO.504 9392 AAUCA U C CAGGCCA SEC. DE IDENT. NO.505 9402 GGCCAAU A GGCCAUC SEC. DE IDENT. NO.506 a Las secuencias que presentan homología perfecta entre los dos genomas están subrayadas en tipo de superficie resaltada. Los métodos para la preparación de ribozimas útiles en esta invención, generalmente son descritos por Draper, intitulada "Método y Reactivo para el Tratamiento de Condiciones Artríticas", presentada el 12 de noviembre de 1993, y asignado el No. de Serie de los Estados Unidos 08/152,487, el total de la cual se incorpora en la presente para referencia. En un segundo aspecto relacionado, la invención caracteriza una célula de mamífero, la cual incluye una molécula de ARN enzimática como se describió en lo anterior.

De preferencia, la célula de mamífero es una célula humana o una célula de otro primate. En un tercer aspecto relacionado, la invención caracteriza un vector de expresión, el cual incluye el ácido nucleico que codifica para las moléculas de ARN enzimáticas descritas en lo anterior, ubicado en el vector, por ejemplo, en una forma la cual permite la expresión de esa molécula de ARN enzimática dentro de una célula de mamífero. En un cuarto aspecto relacionado, la invención caracteriza un método para el tratamiento de una enfermedad provocada por HCV, administrando a un paciente una molécula de ARN enzimática, la cual desdobla el ARN de HCV en las regiones discutidas en lo anterior. La invención proporciona una clase de agentes de desdoblamiento químico, los cuales presentan un alto grado de especificidad por el ARN viral de las células infectadas del tipo HCV. La molécula de ribozima es de preferencia formada para el objetivo de una región de la secuencia altamente conservada de HCV de tal manera que todos los tipos y cepas de este virus, pueden ser tratados con una sola ribozima.

Tales moléculas de ARN enzimáticas, pueden ser suministradas exógenamente a las células infectadas. En el motivo de cabeza de martillo preferido, el tamaño pequeño (menos de 40 nucleótidos, de preferencia entre 32 y 36 nucleótidos de longitud) de la molécula, permite que el costo del tratamiento sea reducido comparado con otros motivos de ribozima . La síntesis de ribozimas mayores de 100 nucleótidos de longitud, es muy difícil utilizando métodos automatizados y el costo terapéutico de tales moléculas es prohibitivo. El suministro de ribozimas por vectores de expresión es principalmente factible utilizando solo tratamientos ex vivo. Esto limita la utilidad de este enfoque. En esta invención, motivos de ribozima pequeños (por ejemplo, de la estructura de cabeza de martillo, mostrada generalmente en la Figura 1) se utilizan para el suministro exógeno. La estructura sencilla de estas moléculas también aumenta la capacidad de la ribozima para invadir las regiones objetivo de la estructura del ARNm. De esta forma, a diferencia de la situación, cuando la estructura de cabeza de martillo está incluida dentro de fragmentos transcritos más largos, no hay secuencias de flanqueo de la ribozima para interferir con el pliegue correcto de la estructura de la ribozima o con el enlace complementario de la ribozima a la región objetivo del ARNm .

Las moléculas de ARN enzimáticas de esta invención, pueden ser utilizadas para tratar infecciones por el virus HCV. Los animales infectados pueden ser tratados en el momento de la infección productiva. Esta sincronización del tratamiento reducirá las cargas virales en células infectadas y deshabilitará la replicación viral en cualquier ronda subsiguiente de infección. Esto es posible, debido a que las ribozimas preferidas, deshabilitan esas estructuras requeridas para la iniciación exitosa de la síntesis de la proteína viral. Para el tratamiento de hepatocitos transformados, los métodos ¿e esta invención, permiten la inhibición de la expresión de los genes virales, aunque provocan transformación celular. Los objetivos preferidos de la presente invención, son ventajosos sobre otros objetivos, ya que no actúan solamente en el momento de la absorción viral o replicación genómica durante la infección. Además, las partículas virales, las cuales son liberadas durante una primera ronda de infección en presencia de tales ribozimas, aún será inmunogénica en virtud de que tiene sus capsides intactas. De esta forma, un método de esta invención, permite la creación de partículas virales defectuosas, pero inmunogénicas, y de esta forma, una posibilidad continuada de iniciación de una respuesta inmune en un animal tratado.

Ad?más, las moléculas de ARN enzimáticas de esta invención, pueden ser utilizadas in vitro en un cultivo celular infectado con los virus HCV, para producir partículas virales las cuales tienen capsides intactas y ARN genómico defectuoso. Estas partículas pueden ser utilizadas para iniciar las respuestas inmunes en una forma profiláctica o como un tratamiento de animales infectados . Otras características y ventajas de la invención, serán aparentes de la siguiente descripción de las modalidades preferidas y de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS El dibujo se describirá primero brevemente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación diagramática de una ribozima con motivo de cabeza de martillo que muestra los tallos I, II y III (marcados (I), (II) y (III), respectivamente) , que interactúan con una región objetivo del HCV. Se muestran los extremos 5' y 3' de ambas de la ribozima y el objetivo. Las líneas indican los nucleótidos apareados en las bases .

Sitios Objetivo El genoma de HCV puede ser sometido a un esbozo genético rápido en virtud de su contenido de ARN y la naturaleza de errores en la replicación genómica. Esas regiones (genes) del genoma, las cuales son esenciales para la replicación del virus, sin embargo, se espera que mantengan una secuencia constante (es decir, son conservadas) sobre periodos extensos de tiempo. Estas regiones son los sitios objetivos preferidos en esta invención, ya que más probablemente sean conservados entre tipos o cepas diferentes de los virus HCV y de esta forma, solamente una ribozima es necesaria para destruir todos de tales virus. De esta forma, una ribozima puede ser utilizada para el objetivo de todos los virus HCV. Se han seleccionado varias de tales regiones en los genomas de estos virus y examinado sus secuencias de nucleótidos para la presencia de regiones, las cuales pueden ser desdobladas por las ribozimas que tienen como objetivo esas regiones. Una región analizada en detalle es la región 5' sin traducir; otras regiones (tales como los ORF de la proteína C o NS1) pueden ser analizadas en una forma similar a aquella descrita en lo siguiente. La ribozimas tienen como objetivo regiones seleccionadas del genoma HCV, se eligen de preferencia para desdoblar el ARN objetivo en una forma la cual inhibe la traducción del ARN. Los genes se seleccionan de tal manera que tal replicación viral es inhibida, por ejemplo, inhibiendo la síntesis de proteína. La selección del sitios objetivo efectivos dentro de estas regiones críticas del ARN viral trata de probar la accesibilidad del ARN objetivo para la hibridación con varias sondas oligonucleótido. Estos estudios pueden ser realizados utilizando sondas de ARN y ensayando la accesibilidad por desdoblamiento de la molécula híbrida con ARNasaH (véase lo siguiente) . Alternativamente, tal estudio puede utilizar sondas de ribozima, diseñadas a partir de predicciones de estructura secundaria de los ARN y ensayando los productos del desdoblamiento por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) , para detectar la presencia de moléculas desdobladas y sin desdoblar. El siguiente es sólo un ejemplo de un método por el cual los sitios objetivo adecuados, pueden ser identificados y no está limitando esta invención. Generalmente, el método implica identificar sitios de desdoblamiento potenciales para una ribozima cabeza de martillo, y luego probar cada uno de estos sitios para determinar su adecuabilidad como objetivos, asegurando que la formación de la estructura secundaria es mínima . Las secuencias del ARNm del virus son desdobladas utilizando el análisis de computadora ARNfold. Las regiones del ARNm, en este caso los nucleótidos 5* del genoma de HCV, los cuales se predicen que tienen nucleótidos débiles o sin apareamiento de bases son investigados para los motivos de reconocimiento de la ribozima supuesta. Estos sitios representan los sitios preferidos para desdoblar la cabeza de martillo u otro desdoblamiento de la ribozima dentro de estos ARN objetivo. Los sustratos de ARN cortos que corresponden a cada uno de los sitios del gen están designados. Cada sustrato está compuesto de dos a tres nucleótidos en los extremos 5' y 3 ' que no formarán pares de bases con una región de reconocimiento de ribozima correspondiente. Las regiones sin aparear flanquean una región central de los nucleótidos 12-14 a los cuales los brazos complementarios en la ribozima están diseñados . La estructura de cada secuencia sustrato es predicha utilizando un programa de computadora PC fold. Las secuencias, las cuales dan una energía libre positiva de unión son aceptadas. Las secuencias, las cuales dan una energía libre negativa son modificadas por recorte de una o dos bases de cada uno de los extremos. Si las secuencias modificadas se predicen aún para tener una estructura secundaria fuerte, se rechazan. Después de que se eligen los sustratos, las ribozimas están diseñadas para cada uno de los sustratos ARN. La ribozima plegada también es analizada utilizando PC fold.

Se buscan moléculas de ribozima las cuales forman regiones de tallo II de motivo de cabeza de martillo (véase la Figura 1) y que contengan los brazos de flanqueo, los cuales están desprovistos de apareamiento de bases intramolecular. Con frecuencia, las ribozimas son modificadas por recorte de una base desde los extremos de la ribozima, o por la introducción de pares de bases adicionales en el tallo II para lograr el pliegue deseado. Las ribozimas con el pliegue incorrecto son rechazadas. Después de que se encuentran los pares sustrato/ribozima para que contengan las estructuras intramoleculares correctas, las moléculas son plegadas juntas para predecir las interacciones intermoleculares. Una representación esquemática de una ribozima con su par de bases coordinado a su secuencia objetivo conocida, se muestra en la Figura 1. Utilizando tales análisis, se obtuvieron las siguientes predicciones de los sitios objetivo efectivos en el ARN genómico de HCV, basado en un análisis de la estructura del ARN generado por computadora (véase la Tabla 1) . El nucleótido objetivo está listado con el número de nucleótido genómico (en el genoma de HCV) dado a la izquierda de la secuencia. Los nucleótidos de flanqueo se dan para referencia. Esos objetivos, aunque son útiles como objetivos de la ribozima, pueden ser probados para determinar la accesibilidad a las sondas de ácido nucleico en un ensayo de ribonucleasa H (véase lo siguiente) . Este ensayo proporciona una prueba rápida del uso del sitio objetivo sin que requiera la síntesis de una ribozima. Puede ser utilizado para tamizar los sitios más adecuados para el ataque de la ribozima.

Síntesis de las Ribozimas Las ribozimas útiles en esta invención, pueden ser producidas por la transcripción del gen como se describe por Cech, supra, o por síntesis química. La síntesis química del ARN es similar a aquella para la síntesis del ADN. El grupo 2 ' -OH adicional en el ARN, sin embargo, requiere una estrategia de grupo de protección diferente para tratar con la formación del enlace internucleótido 3 '-5' selectivo y con la susceptibilidad del ARN a la degradación en la presencia de bases. El método recientemente desarrollado de la síntesis de ARN utilizando el grupo t-butildimetilsililo para la protección del 2' hidroxilo es el método más confiable para la síntesis de ribozimas. El método reproducible produce el ARN con los enlaces internucleótido 3 '-5', con los rendimientos de acoplamiento promedio en exceso de 99%, y requiere solamente una desprotección de dos etapas del polímero .

Un método basado en la química de H- fosfonato da una eficiencia de copulación relativamente inferior que un método basado en la química fosforamidita. Esto también es un problema para la síntesis del ADN. Un enfoque prometedor para aumentar la síntesis de oligonucleótidos automática, se ha descrito recientemente para los H- fosfonatos . Una combinación de un tiempo de copulación adecuado y coronación adicional de las secuencias de "omisión" dan altos rendimientos en las síntesis de oligodesoxinucleótidos en escalas en el rango de 14 micromoles con tan poco como 2 equivalentes de un monómomero en la etapa de copulación. Otro enfoque alternativo es el uso de soportes poliméricos solubles (por ejemplo, polietilenglicoles) , en lugar de los soportes sólidos convencionales. Este método puede producir oligonucleótidos cortos en cantidades de cien miligramos por lote utilizando aproximadamente 3 equivalentes de un monómero en una etapa de copulación. Varias modificaciones a la estructura de la ribozima pueden hacerse para aumentar la utilidad de las ribozimas. Tales modificaciones aumentarán la duración en almacenamiento, la vida media in vitro. estabilidad y facilidad de introducción de tales ribozimas al sitio objetivo, por ejemplo, para aumentar la penetración de membranas celulares y conferir la capacidad para reconocer y unir a las células objetivo.

El suministro exógeno de ribozimas se beneficia de la modificación química del esqueleto, por ejemplo, por la carga negativa total de la molécula de ribozima que es reducida para facilitar la difusión a través de la membrana celular. Las presentes estrategias para reducir la carga del oligonucleótido incluyen: modificación de los enlaces internucleótido por fosfonatos de etilo, uso de fosforamiditas, enlace de los oligonucleótidos a moléculas cargadas positivamente, y crear paquetes complejos compuestos de oligonucleótidos, lípidos y receptores específicos o efectores para las células objetivo. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen ribozimas que contienen azufre, que contienen fosforotioatos y fosforoditioatos como enlaces internucleótido en el ARN. Las síntesis de tales ribozimas modificadas con azufre se logra por el uso de un reactivo de transferencia de azufre, 1,1-dioxido de la 3H-1,2-bencenoditiol-3-ona. Las ribozimas también pueden contener ribonucleótidos modificados con ribosa. Los análogos de pirimidina son preparados a partir de uridina, utilizando un procedimiento que emplea trifluoruro de dietilamino azufre (DAST) como un reactivo inicial. Las ribozimas también pueden ser ya sea unidas electrostática o covalentemente a los cationes poliméricos con el propósito de reducir la carga. El polímero puede ser unido a la ribozima convirtiendo simplemente el extremo 3' a un dialdehído ribonucleósido, el cual es obtenido por un desdoblamiento peryodato de la terminal del sistema 2', 3' -cis diol. Dependiendo de los requisitos específicos para los sistemas de suministro, otras posibles modificaciones pueden incluir diferentes brazos enlazadores que contienen funcionalidades carboxilo, amino o tiol. Aún otros ejemplos incluyen el uso de fosfonatos de metilo y 2 ' -o-metilribosa y 5' o 3' coronando o bloqueando con m7GpppG o m3 ' 2 > 7GpppG. Por ejemplo, una ribozima con cinasa se pone en contacto con trifosfato de guanosina y guaniltransferasa para agregar una corona m3G a la ribozima. Después de tales síntesis, la ribozima puede ser purificada en gel utilizando el procedimiento estándar. Para asegurar que la ribozima tiene la actividad deseada, puede ser probada con y sin la corona 5' utilizando procedimientos estándar para ensayar ambas de su actividad enzimática y su estabilidad. Las ribozimas sintéticas, incluyendo aquellas que contienen varios modificadores, pueden ser purificadas por cromatografía líquida de alta presión (CLAP) . Otras técnicas de cromatografía líquida, empleando columnas de fase inversa e intercambiadores aniónicos en soportes de sílice y poliméricos, también pueden ser utilizadas. Sigue un ejemplo de la síntesis de una ribozima. Se emplea una química de fosforamidita en fase sólida. Los monómeros utilizados son 2 ' -ter-butil-dimetilsilil-cianoetil-fosforamiditas de uridina, N-benzoilcitosina, N-fenoxiacetiladenosina y guanosina (Glen Research, Sterling, VA) . La síntesis en fases sólida se lleva a cabo ya sea en un sintetizador ABI 394 o sintetizador de ADN/ARN 380B utilizando el protocolo estándar, proporcionado con cada máquina. La única excepción es que la etapa de copulación está aumentada de 10 a 12 minutos. La concentración de fosforamidita es de 0.1M. La síntesis se hace en una escala de 1 µmol utilizando una columna de reacción de ARN de 1 µmol (Glen Research) . Las eficiencias de copulación promedio están entre 97% y 98% para el modelo 394 y entre 97% y 99% para el modelo 380B, como se determinó por una medición calorimétrica del catión tritilo liberado. Las ribozimas bloqueadas se desdoblan del soporte sólido (por ejemplo, CPG) , y las bases y la porción difosfoéster desprotegida en un frasco estéril por amoníaco etanólico seco (2 ml) a 55°C durante 16 horas. La mezcla de reacción se enfría en hielo seco. Después, el líquido frío es transferido a un frasco con una tapa de tornillo estéril y se liofiliza. Para eliminar los grupos 2 ' -ter-butilo-dimetilsililo de la ribozima, el residuo es suspendido en fluoruro de tetra-n-butilamonio 1 M en THF seco (TBAF) , utilizando un exceso de 20 veces el reactivo por cada grupo sililo, durante 16 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 15-25°C) . La reacción se detiene agregando un volumen igual de acetato de trietilamina 1 M estéril pH 6.5. La muestra se enfría y se concentra en un SpeedVac a la mitad del volumen inicial. Las ribozimas se purifican en dos etapas por CLAP en una columna C4 de 300 µ, 5 mm DeltaPak en un gradiente de acetonitrilo. La primera etapa o etapa de "en tritilo" es una separación de la ribozima o ribozimas 5 ' -DMT-protegidas de las secuencias defectuosas que carecen de un grupo 5' -DMT. Los solventes utilizados para esta etapa son A (acetato de trietilamonio 0.1 M, pH 6.8) y B (acetonitrilo) . El perfil de elución es: 20% de B durante 10 minutos, seguido por un gradiente lineal de 20% a 50% de B durante 50 minutos, 50% de B durante 10 minutos, un gradiente lineal de 50% de B a 100% de B durante 10 minutos, y un gradiente lineal de 100% de B a 0% de B durante 10 minutos. La segunda etapa es una purificación de una ribozima desbloqueada completamente por tratamiento de ácido trifluoroacético al 2% en una columna C4 de 300 µ, 5 mm DeltaPak en un gradiente de acetonitrilo. Los solventes utilizados para esta segunda etapa son: A (acetato de trietilamonio 0.1 M, pH 6.8) y B (80% de acetonitrilo, acetato de trietilamonio 0.1 M, pH 6.8). El perfil de elución es: 5% de B durante 5 minutos, un gradiente lineal de 5% de B a 15% de B durante 60 minutos, 15% de B durante 10 minutos y un gradiente lineal de 15% de B a 0% de B durante 10 minutos. La ribozima que contiene la fracción se enfría y liofiliza en un SpeedVac. El residuo sólido se disuelve en una cantidad mínima de etanol y perclorato de sodio en acetona. La ribozima es recolectada por centrifugación, se lava tres veces con acetona, y liofiliza.

Vector de Expresión Aunque se prefieren las ribozimas sintéticas en esta invención, también pueden utilizarse aquellas producidas por los vectores de expresión. Al diseñar un vector de expresión de ribozima adecuado, deben de considerarse importantes los siguientes factores. La ribozima final debe de mantenerse tan pequeña como sea posible para reducir al mínimo la estructura secundaria indeseable dentro de la ribozima. Un promotor (por ejemplo, el citomegalovirus humano inmediato al promotor temprano) , debe de elegirse para que sea un promotor relativamente fuerte y expresable in vitro e in vivo. Tal promotor debe expresar la ribozima a un nivel adecuado para efectuar la producción de suficiente ribozima para destruir un ARN objetivo, pero no a un nivel demasiado elevado para evitar que ocurran otras actividades celulares (a menos de que se desee la muerte de las células) .

Ura horquilla en el extremo 5' de la ribozima es útil para proteger la ribozima de las 5' -3' exonucleasas . Una horquilla seleccionada en el extremo 3 ' de la ribozima es útil, ya que actúa como una protección de la 3' -5' exonucleasas . Tales horquillas pueden ser insertadas dentro de las secuencias del vector para permitir que las ribozimas estándar sean colocadas en una orientación apropiada y expresadas con tales secuencias unidas.

Las colas poli (A) también útiles para proteger el extremo 3' de la ribozima. Estas pueden ser proporcionadas ya sea incluyendo un sitio de señal poli (A) en el vector de expresión (para imitar una célula que agregue la cola poli (A) in vivo) o introduciendo una secuencia poli (A) directamente en el vector de expresión. En el primer enfoque, la señal debe de ser ubicada para evitar la formación de una estructura secundaria indeseable con otras partes de la ribozima. En el segundo enfoque, el alargamiento poli (A) puede reducirse en tamaño con el tiempo, cuando se expresa in vivo, y de esta forma el vector puede necesitar ser verificado con el tiempo. Debe tenerse cuidado en la adición de una cola poli (A) la cual une las proteínas de enlace poli (A) , lo cual evita que la ribozima actúe sobre sus secuencias objetivo.

Prueba de Ribozima Una vez que las ribozimas deseadas son seleccionadas, sintetizadas y purificadas, se prueban en experimentos y cinéticos y otros experimentos para determinar su utilidad. Un ejemplo de tal procedimiento se proporciona en lo siguiente.

Preparación de la Ribozima La ribozima sintética sin purificar (típicamente 350 µg a la vez) se purifica por separación en un gel de poliacrilamida de desnaturalización al 15% ' (0.75 mm de grueso, 40 cm de largo y se visualiza por efecto de UV. Una vez cortado, los cortes del gel que contienen la ribozima de longitud completa se remojan en 5 ml de amortiguador de elución de gel (NH4OAc 0.5 M, EDTA 1 mM) durante la noche con agitación a 4°C. El eluyente es desalado en una matriz C-18 (cartuchos Sep-Pak, Millipore, Milford, MA) y se seca al vacío. El ARN seco se resuspende en 50-100 µl de TE (TRIS 10 mM, EDTA lmM, pH 7.2). Una alícuota de esta solución se diluye 100 veces en 1 ml de TE, la mitad del cual se utiliza para cuantificar espectofotométricamente la solución de ribozima. La concentración de este material de depósito diluido es típicamente de 150-800 nM. La pureza de la ribozima se confirma por la presencia de una sola banda en un gel de poliacrilamida de desnaturalización. Ventajosamente, una ribozima puede ser sintetizada en dos o más porciones. Cada porción de una ribozima generalmente tendrá solamente actividad enzimática limitada, o no tendrá actividad enzimática y la actividad aumentará sustancialmente (por al menos 5-10 veces) cuando todas las porciones están ligadas juntas (o yuxtapuestas en cualquier otra forma) . Un ejemplo específico de la síntesis de la ribczima de cabeza de martillo se proporciona en lo siguiente . El método implica la síntesis de dos (o más) ribozimas "medias" más cortas y la ligazón de ellas juntas, utilizando la T4 ARN ligasa. Por ejemplo, para hacer una ribozima de 34 unidades, se sintetizan dos fragmentos de 17 unidades, uno está fosforilado y ambos se purifican en gel. Estas 17 unidades purificadas, entonces se recocen a una plantilla de ADN de cadena complementaria para los dos fragmentos de 17 unidades. Esta plantilla de ADN tiene una secuencia diseñada para ubicar las dos porciones de 17 unidades con un extremo de cada uno adyacente al ' otro . Las moléculas de ARN yuxtapuestas se tratan entonces con la T4 ARN ligasa en presencia de ATP. El ARN de 34 unidades así formado entonces se purifica por CLAP.

Preparación de los Sustratos Aproximadamente 10-30 pmoles del sustrato sin purificar se marcan en el extremo 5 ' radioactivamente con la T4 polinucleótido cinasa utilizando 25 pmoles de ATP [Documento propuesto al cliente para la reacción de " -32P] .

La mezcla marcada completa se separa en un gel de poliacrilamida de desnaturalización al 20% y se visualiza por autorradiografía. La banda de longitud completa se corta y se remoja durante la noche a 4°C en 100 µl de TE (Tris-HCl mM, pH de 7.6, EDTA 0.1 mM) .

Reacciones Cinéticas Para las reacciones utilizando sustratos cortos (entre 8 y 16 bases) se hace una solución de sustrato IX en amortiguador de ensayo (Tris-HCl 75 mM, pH 7.6; EDTA 0.1 mM, MgCl2 10 mM) de tal manera que la concentración del sustrato es menor que 1 nM. Una solución de ribozima (típicamente 20 nM) se hace IX en amortiguador de ensayo y se hacen cuatro diluciones utilizando IX de amortiguador de ensayo. Quince µl de cada dilución de ribozima (es decir, 20, 16, 12, 8 y 4 nM) se colocan en un tubo separado. Estos tubos y el tubo de sustrato se pre-incuban a 37°C durante por lo menos cinco minutos.

La reacción se inicia mezclando 15 µl del sustrato en cada tubo de ribozima por pipeteo rápido (obsérvese que las concentraciones de ribozima finales son 10, 8, 6, 4, 2 nM) . Alícuotas de 5 µl se retiran a intervalos de 15 ó 30 segundos y se detienen con 5 µl de solución de detención (95% de formamida, EDTA 20 mM, colorantes de xileno cianol y azul de bromofenol) . Después del punto de tiempo, la ribozima final, una alícuota del sustrato restante es retirada como un control de ribozima cero. Las muestras se separan ya sea en geles de poliacrilamida al 15% o 20%. Cada gel se visualiza y se cuantifica con un explorador beta Ambis (Ambis Systems, San Diego, CA) . Para la mayoría de las ribozimas activas, los análisis cinéticos se realizan en exceso de sustrato para determinar los valores K-j-. y Kcat . Para las reacciones cinéticas con los datos de ARN largos (mayores de 15 bases de longitud) los sustratos se preparan por transcripción utilizando la T7 ARN polimerasa y plantillas definidas que contienen un promotor T7 y ADN que codifica para los nucleótidos apropiados del ARN viral. La solución de sustrato se hace IX en amortiguador de ensayo (Tris-HCl 75 mM, pH 7.6; EDTA 0.1 mM; MgCl2 10 mM) y contiene una concentración de 58 nanomolar de las moléculas de AR? largas. La reacción se inicia por la adición de las ribozimas purificadas en gel a una concentración de 1 µM. Las alícuotas se retiran a 20, 40, 60, 80 y 100 minutos, luego se detienen por la adición de una solución de paro de 5 µl . Los productos desdoblados se separan utilizando PAGE de desnaturalización. Las bandas se visualizan y cuantifican con un explorador beta Ambis .

Análisis cinético Un mecanismo de reacción sencillo para el desdoblamiento mediado por la ribozima es: k? donde R = ribozima, S = sustrato, y P = productos. La etapa en el cuadro es importante solamente en el exceso de sustrato. Debido a que la concentración de ribozima está en exceso sobre la concentración del sustrato, la concentración del complejo ribozima-sustrato ([R:S]) es constante durante el tiempo, excepto durante un tiempo muy breve, cuando el complejo se está formando inicialmente, es decir: d.R:Sl = O dt donde t = tiempo, y de esta forma: (R) (S) k = (RS) (k2 + k?) La velocidad de la reacción es la velocidad de desaparición del sustrato con el tiempo: Velocidad = -d(S) = k9 (RS) dt Sustituyendo estas expresiones (R) (s.k-L = i/k2 -d(s) (k2 + k?) dt O: -d(s) = ^1-^2 <R) d S (k2~+ ) Integrando esta expresión con respecto a los rendimientos con el tiempo: -ln S = ---1----2 (R) t S0 (k2"+ ft-_) donde SQ = sustrato inicial. Por lo tanto, una gráfica del logaritmo negativo de la fracción de sustrato sin cortar contra el tiempo (en minutos) produce una línea recta con la pendiente: pendiente = k-^ k2 (R) = 0j-.s (k2 T k^) donde ^-Q yS = constante de velocidad observada. Una gráfica de la pendiente (k0ks) contra la concentración de ribozima produce una línea recta, una pendiente la cual es: pendiente = k-__k2 la cual es kcat (k2 + k-_) km Utilizando estas ecuaciones, los datos obtenidos de los experimentos cinéticos proporcionan la información necesaria para determinar cual ribozima probada es más útil, o activa. Tales ribozimas pueden ser seleccionadas y probadas en sistemas in vivo o ex vivo .

Preparación de Liposomas Las moléculas de lípido se disuelven en un solvente orgánico volátil (CHC13, metanol, éter dietílico, etanol, etc.) . El solvente orgánico es eliminado por evaporación. El lípido es hidratado en suspensión con solución salina amortiguada con fosfato 0. IX (PBS), luego se congela-descongela 3x utilizando nitrógeno líquido e incubación a la temperatura ambiente. La suspensión se extruye secuencialmente a través de filtros de policarbonato de 0.4 µm, 0.2 µm y 0.1 µm a la presión máxima de 5,516 kPa (800 psi) . La ribozima es mezclada con la suspensión de liposoma extruído y se liofiliza hasta sequedad. El polvo de lípido/ribozima se rehidrata con agua a un décimo del volumen original. La suspensión se diluye al volumen mínimo requerido para la extrusión (0.4 ml para un barril de 1.5 ml y 1.5 ml para un barril de 10 ml) con lxPBS y se re-extruye a través de filtro de policarbonato de 0.4 µm, 0.2 µm, 0.1 µm. La ribozima atrapada por el liposoma se separa de la ribozima sin atrapar por cromatografía en filtración en gel (SEPHAROSE CL-4B, BIOGEL A5M) . Las extracciones de liposomas se reúnen y esterilizan por filtración a través de un filtro de 0.2 µm. La ribozima libre se re ne y se recupera por precipitación con etanol. La concentración de liposoma se determina por incorporación de un lípido radiactivo. La concentración de ribozima se determina marcando con 32P. Rossi et al., 1992 supra (y las referencias citadas ahí) describe otros métodos adecuados para la preparación de liposomas.

Ensavo In Vivo La eficacia de la acción de una ribozima elegida puede ser probada in vivo por el uso de cultivos celulares sensibles a HCV utilizando procedimientos estándar. Por ejemplo, los cultivos de monocapa de células HepG2 sensibles a HCV se hacen crecer en placas de cultivo de tejido de 6 ó 96 pozos. Antes de la transducción con plásmidos de expresión HCV, los cultivos se tratan durante tres a 24 horas con liposomas que contienen la ribozima o complejos de lípido/ribozima catiónicos. Entonces las células se enjuagan con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y se transducen o transfectan con plásmidos de expresión HCV. Las células se tratan durante tres a cinco días con preparaciones de ribozima apropiadas en cambios de medio recién preparado. El ARN celular total es cosechado por la técnica de isotiocianato de guanidina y la cantidad de ARNm de HCV se cuantifica y evalúa para el desdoblamiento mediado por ribozima utilizando el ensayo de protección de ribonucleasa. Alternativamente, los lisados celulares pueden ser preparados y las partículas de núcleo de HCV pueden ser inmunoprecipitadas utilizando antisuero antinucleopoliclonal adsorbido a Sepharosa proteína A de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los núcleos precipitados se tratan con ribonucleasa para digerir cualquiera de los ARN sin capside y la proteína del núcleo se digiere con proteinasa K/extracción con fenol. Usualmente, una mitad del ARN total y una mitad del ARN extraído es analizada utilizando el ensayo de protección de ribonucleasa.

Ensavo de Protección de Ribonucleasa La acumulación del ARNm objetivo en las células o el desdoblamiento del ARN por ribozimas o ARNasaH (in vitro o in vivo) puede ser cuantificado utilizando un ensayo de protección de ARNasa. En este método, las ribosondas antisentido se transcriben del ADN plantilla utilizando la T7 ARN polimerasa (U.S. Biochemicals) en reacciones de 20 µl que contienen IX de amortiguador de transcripción (suministrado por el fabricante), ATP GTP y UTP 0.2 mM, 1 U/µl desde el inhibidor ARNasa pancreática (Boehringer Mannheim Biochemicals) y 200 µCi de CTP marcado con 32P (800 Ci/mmol, New England Nuclear) durante 1 h a 37°C. El ADN plantilla se digirió con 1 U ARNasa libre de la ADNasa I (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH) a 37°C durante 15 minutos y los nucleótidos sin incorporar eliminados por cromatografía giratoria en SEPHADEX G-50. En una forma similar a la transcripción de la sonda antisentido, el ARN objetivo puede ser transcrito in vitro utilizando una plantilla de ARN adecuada. El fragmento transcrito es purificado por métodos estándar y digerido con ribozima a 37°C de acuerdo con los métodos descritos posteriormente . Alternativamente, las células infectadas con el virus se cosechan en 1 ml de PBS, se transfieren a un tubo de 1.5 ml EPPENDORF, se empastillan durante 30 segundos a baja velocidad en una microcentrífuga y se lisan en 70 µl de amortiguador de hibridación (isotiocianato de guanidina 4 M, 0.1% de sarcosilo, citrato de sodio 25 mM, pH 7.5) . El lisado de células (45 µl) o cantidades definidas del fragmento transcrito in vitro (también en amortiguador de hibridación) entonces se combinan con 5 µl de amortiguador de hibridación que contiene 5 x 105 cpm de cada ribosonda antisentido en tubos de 0.5 ml EPPENDORF, se cubre con 25 µl de aceite mineral y la hibridación se realiza por calentamiento durante la noche a 55°C. Las reacciones de hibridación se diluyen en solución de ARNasa 0.5 ml (20 U/ml de ARNasa A, 2 U/ml de ARNasa TI, 10 U/ml de ARNasa libre de ADNasa, I en NaCl 0.4 M) , calentada durante 30 minutos a 37°C y se agregan 10 µl de 20% de SDS y 10 µl de Proteinasa K (10 mg/ml), seguida por una ecuación adicional de 30 minutos a 37°C. Los híbridos se purifican parcialmente por extracción con 0.5 ml de una mezcla 1:1 de fenol/cloroformo; las fases acuosas se combinan con 0.5 ml de isopropanol y los híbridos resistentes a la ARNa-?a se empastillan durante 10 minutos a la temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) en una microcentrífuga. Las pastillas se disuelven en 10 µl de amortiguador de carga (95% de formamida, IX de TBE, 0.1% de azul de bromofenol, 0.1% de xileno cilanol) , se calienta a 95% durante cinco minutos, se enfría en hielo y se analiza en 4% de geles de poliacrilamida/urea 7 M bajo condiciones de desnaturalización .

Estabilidad de la Ribozima La ribozima elegida puede ser probada para determinar su estabilidad y de esta forma su utilidad potencial. Tal prueba también puede ser utilizada para determinar el efecto de varias modificaciones químicas (por ejemplo, adición de una cola poli (A) , sobre la estabilidad de la ribozima y de esta forma ayudar a la selección de una ribozima más estable. Por ejemplo, una mezcla de reacción que contiene de 1 a 5 pmoles de ribozima marcada en 5' (con cinasa) y/o 3', 15 µg de extracto citosólico y MgCl 2.5 mM, en un volumen total de 100 µl . La reacción se incuba a 37°C. Se toman alícuotas de 8 µl a intervalos de tiempo y se mezclan con 8 µl de una mezcla de paro (EDTA 20 mM, formamida al 95%) . Las muestras se separan en un gel de secuenciación de acrilamida al 15%, se expone a una película y se explora con un Ambis. La ribozima marcada en 3' puede formarse por incorporación de cordicepina marcada con 32P en 3 ' OH utilizando la poli (A) polimerasa. Por ejemplo, la reacción con poli (A) polimerasa contiene tris 40 mM, pH 8, MgCl2 10 mM, NaCl 250 mM, MnCl2 2.5 mM; 3 µl de cordicepina-P32 , 500 Ci/mM; y 6 unidades de la poli (A) polimerasa en un volumen total de 50 µl . La mezcla de reacción se incuba durante 30 minutos a 37°C.

Efecto de la sustitución de base sobre la Actividad de la Ribozima Para determinar cuales características estructurales principales podrían cambiar el desdoblamiento de la ribozima del sustrato, pueden hacerse cambios de base menores en la región de desdoblamiento del sustrato reconocido por una ribozima específica. Por ejemplo, las secuencias del sustrato pueden ser cambiadas en el nucleótido "C" central, cambiando el sitio de desdoblamiento de un motivo GUC a un motivo GUA. Los valores kcat/km para el desdoblamiento utilizando cada sustrato, se analizan entonces para determinar si tal cambio aumenta las velocidades de desdoblamiento de la ribozima. Experimentos similares pueden ser realizados para dirigir los efectos de cambiar las bases complementarias a los brazos de unión de la ribozima. Los cambios predichos para mantener el enlace fuerte al sustrato complementario son preferidos. Cambios menores en el contenido de nucleótidos pueden alterar las alteraciones ribozima/sustrato en formas las cuales son impredecibles, basadas en el enlace fuerte solo. Las estructuras en la región de núcleo catalítica de la ribozima reconoce cambios triviales ya sea en la estructura del sustrato o la estructura de tres dimensiones del complejo ribozima/sustrato . Para comenzar la optimización del diseño de la ribozima, las velocidades de desdoblamiento de las ribozimas contienen longitudes de brazo variadas, pero con el objetivo para la misma longitud del sustrato de ARN corto pueden ser probadas. Las longitudes del brazo mínimas se requieren y el desdoblamiento efectivo varía con las combinaciones de ribozima/sustrato . La actividad de desdoblamiento de las ribozimas seleccionadas, puede ser evaluado utilizando sustratos homólogos HCV o ARN genómico de HCV. Los ensayos se realizan en un exceso de ribozima y los valores obtenidos aproximados de La comparación de los valores obtenidos con sustratos cortos y largos, indica la utilidad in vivo de una ribozima.

Estabilidad Intracelular de las ribozimas suministradas en liposomas Para probar la estabilidad de una ribozima elegida in vivo es útil la siguiente prueba. Las ribozimas son marcadas en el extremo con 32P, atrapadas en liposomas y suministradas a células sensibles a HCV durante tres horas. Las células se fraccionan y purifican por extracción con fenol/cloroformo. Las células (lxlO7, matraz T-175) se raspan de la superficie del matraz y se lavan dos veces con PBS frío. Las células se homogenizan por remojo de 35 veces en 4 ml de TSE (Tris 10 mM, pH 7.4, Sacarosa 0.25 M, EDTA mM) . Los núcleos se empastillan a 100 xg durante 10 minutos. Los organelos subcelulares (la fracción de la membrana) se empastillan a 200,000 xg durante dos horas, utilizando un rotor SW60. La pastilla se resuspende en 1 ml de amortiguador H (Sacarosa 0.25 M, HEPES 50 mM, pH 7.4). El sobrenadante contiene la fracción citoplasmática (en aproximadamente 3.7 ml) . La pastilla nuclear se resuspende en 1 ml de sacarosa al 65% en TM (Tris 50 mM, pH 74., MgCl2 2.5 mM) y se bandea en un gradiente en etapas de sacarosa (1 ml de núcleos en 65% de sacarosa TM, 1 ml de sacarosa al 60% TM, 1 ml de sacarosa al 55% de TM, sacarosa al 50% de TM, 300 ul de sacarosa al 25% TM) durante una hora a 37,000xg con un rotor SW60. La banda nuclear se cosecha y se diluye a 10% de sacarosa cor. amortiguador TM. Los núcleos se empastillan a 37,000xg utilizando un rotor SW60 durante 15 minutos y la pastilla se resuspende en 1 ml de amortiguador TM. Las alícuotas se fraccionan por tamaño en gel de poliacrilamida de desnaturización y se determina la ubicación intracelular. Por comparación de la velocidad de migración de la ribozima recién sintetizada, pueden determinarse varias fracciones que contienen la ribozima intacta. Para investigar las modificaciones, las cuales deben alargar la vida media de las moléculas de ribozima intracelularmente, las células pueden ser fraccionadas como en lo anterior y la pureza de cada fracción ensayando la actividad de la enzima conocida para existir en esa fracción. Las diversas fracciones celulares se congelan a -70°C y se utilizan para determinar las resistencias a nucleasa relativas de las moléculas de ribozima modificadas. Las moléculas de ribozima pueden ser sintetizadas con modificaciones 5-fosforotioato (ps) , o 2'-0-metilo (2 '-OMe) en cada extremo de la molécula. Estas moléculas y una versión de fosfodiéster de la ribozima se marcan en el extremo con 32P y ATP utilizando T4 polinucleótido cinasa. Se agrega en concentraciones iguales a los extractos citoplasmáticos celulares y alícuotas de cada uno se toman a intervalos de 10 minutos. Las muestras se fraccionan por tamaño por PAGE de desnaturalización y velocidades relativas de resistencia a la nucleasa analizadas por exploración del gel con un explorador Ambis. El resultado muestra si las ribozimas fueron digeridas por el extracto citoplasmático y cuáles versiones son relativamente más resistentes a la nucleasa. Las ribozimas modificadas generalmente mantienen 80-90% de la actividad catalítica de la ribozima nativa cuando se emplean sustratos de ARN cortos . Las ribozimas sin marcar, marcadas en el extremo 5' o marcadas en el extremo 3 ' , pueden ser utilizadas en los ensayos. Estos experimentos también pueden realizarse con extractos de células humanas para verificar las observaciones .

Administración de la Ribozima Las ribozimas seleccionadas pueden ser administradas profilácticamente, o a pacientes infectados con el virus, por ejemplo, por suministro exógeno de la ribozima a un tejido infectado por medio de un vehículo de suministro apropiado, por ejemplo, un liposoma, un vehículo de liberación controlada, por el uso de iontoforesis, electroporación o moléculas apareadas por iones, o aductos unidos covalentemente, y otros métodos de suministro aprobados farmacológicamente. Las vías de administración incluyen la intramuscular, aerosol, oral, (forma de tableta o pildora) , tópica, sistémica, ocular, intraperitoneal y/o intratecal . Los vectores de expresión para la inmunización con ribozimas y/o suministro de ribozimas también son adecuados. Véase Draper, Solicitud de los Estados Unidos No. de Serie 08/152,487, presentada el 12 de noviembre de 1993, el total de la cual incluyendo los dibujos se incorpora en la presente para referencia. Véase también, Sullivan, Solicitud de los Estados Unidos No. de Serie 08/155,474, el total de la cual incluyendo los dibujos se incorpora en la presente para referencia. La vía de suministro específica de cualquier ribozima seleccionada, dependerá del uso de la ribozima. Generalmente, un programa de suministro específico para cada ribozima se enfocará en la incorporación de la ribozima desnuda con respecto a la ubicación intracelular, seguida por la demostración de la eficacia. Alternativamente, el suministro para estas mismas células en un órgano o tejido de un animal, puede ser practicada. Los estudios de incorporación incluirán ensayo de incorporación para evaluar la incorporación de la ribozima celular, sin considerar el vehículo o estrategia de suministro. Tales ensayos también determinarán la ubicación intracelular de la ribozima después de la incorporación, estableciendo por último los requisitos para el mantenimiento de las concentraciones en estado estable dentro del compartimiento celular que contiene la secuencia objetivo (núcleo y/o citoplasma) . Entonces, pueden probarse la eficacia y la citotoxicidad. La toxicidad no solamente incluirá la viabilidad de las células sino también la función de las células. Algunos métodos de suministro que pueden ser utilizados incluyen: a. encapsulación en liposomas, b. transducción por vectores retrovirales, c. conjugación con colesterol, d. ubicación en el compartimiento nuclear utilizando el sitio de enlace del antígeno encontrado en la mayoría de los snARJST, e. neutralización de la carga de la ribozima por la utilización de derivados nucleotídicos, y f. Uso de células progenitoras sanguíneo para distribuir las ribozimas en todo el cuerpo. Por lo menos tres tipos de estrategias de suministro son útiles en la presente invención, incluyendo: modificaciones de la ribozima, vehículos de suministro del fármaco portador de la partícula y vectores de expresión viral. Las ribozimas sin modificar y los oligonucleótidos antisentido, como la mayoría de las moléculas pequeñas, son incorporadas por las células, aunque lentamente. Para aumentar la incorporación celular, la ribozima puede ser modificada esencialmente al azar, en formas las cuales reducen su carga, pero mantienen los grupos funcionales específicos. Esto resulta en una molécula la cual es capaz de difundirse a través de la membrana celular, eliminando así la barrera de permeabilidad. La modificación de ribozimas para reducir la carga es sólo un enfoque para aumentar la incorporación celular de estas moléculas más grandes. El enfoque aleatorio, sin embargo, no es contemplable, ya que las ribozimas son estructural y funcionalmente más complejas que las moléculas de fármaco pequeñas. Los requisitos estructurales necesarios para mantener la actividad catalítica de la ribozima son bien entendidos por aquellos con habilidad en la técnica. Estos requisitos se toman en consideración cuando se diseñan las modificaciones para aumentar el suministro celular. Las modificaciones también se diseñan para reducir la susceptibilidad a la degradación a las nucleasas. Ambas de estas características deben mejorar en gran medida la eficacia de la ribozima. La incorporación celular puede ser aumentada por varios órdenes de magnitud, sin tener que alterar los enlaces fosfodiéster necesarios para la actividad de desdoblamiento de la ribozima. Las modificaciones químicas del esqueleto fosfato reducirán la carga negativa permitiendo la difusión libre a través de la membrana. Este principio ha sido demostrado exitosamente para la tecnología de ADN antisentido. Las similitudes en la composición química entre el ADN y el ARN hace este enfoque factible. En el cuerpo, el mantenimiento de una concentración externa será necesario para activar la difusión de la ribozima modificada dentro de las células del tejido. Las vías de administración, las cuales permitirán que el tejido enfermo sea expuesto a una concentración elevada, pasajera del fármaco, el cual se disipa lentamente por adsorción sistémica son las preferidas. La administración intravenosa con un portador del fármaco diseñado para aumentar la vida media en circulación de la ribozima puede ser utilizada. El tamaño y composición del portador del fármaco restringe la depuración rápida de la corriente sanguínea. El portador, hecho para acumularse en el sitio de la infección, puede proteger a la ribozima de los procesos degradativos . Los vehículos de suministro del fármaco son efectivos para ambas de las administraciones sistémica y tópica. Pueden diseñarse para servir como un depósito de liberación lenta, o para suministrar sus contenidos directamente a la célula objetivo. Una ventaja de utilizar los vehículos de fármaco de suministro directo, es que moléculas múltiples son suministradas por la incorporación. Tales vehículos han mostrado aumentar la vida media en circulación de los fármacos, los cuales en cualquier otra forma podrían ser eliminados rápidamente de la corriente sanguínea. Algunos ejemplos de tales vehículos de suministro de fármaco especializados, los cuales fallan en esta categoría, son los liposomas, hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables, y microesferas bioadhesivas . De esta categoría de sistemas de suministro, los liposomas son los preferidos. Los liposomas aumentan la estabilidad intracelular, aumentan la eficiencia de incorporación y mejoran la actividad biológica. Los liposomas son vesículas esféricas, huecas, compuestas de lípidos dispuestos en una forma similar a aquellos lípidos los cuales forman la membrana celular. Tienen un espacio acuoso interno para atrapar compuestos solubles en agua y en el rango de tamaño de 0.05 a varias mieras de diámetro. Varios estudios han mostrado que los liposomas pueden suministrar ARN a las- células y que el ARN permanece biológicamente activo. Por ejemplo, un vehículo de suministro de liposoma diseñado originalmente como una herramienta de investigación, la lipofectina, ha mostrado suministrar moléculas de ARNm intactas a las células, con un rendimiento de la producción de la proteína correspondiente. Los liposomas ofrecen varias ventajas: No son tóxicos y biodegradables en la composición; presentan vidas medias en la circulación prolongada; y las moléculas de reconocimiento pueden ser unidas fácilmente a su superficie para formar el objetivo de los tejidos. Finalmente, la fabricación de costo efectivo de agentes farmacéuticos a base de liposomas, ya sea en suspensión líquida o un producto liofilizado, ha demostrado la viabilidad de esta tecnología como un sistema de suministro de fármaco aceptable. Otros sistemas de suministro de fármaco de liberación controlada, tal como las nanopartículas y los hidrogeles, pueden ser vehículos de suministro potenciales para una ribozima. Estos portadores han sido desarrollados para agentes quimioterapéuticos y agentes f rmacéuticos a base de proteína, y por consiguiente, pueden ser adaptados para el suministro de la ribozima. La administración tópica de las ribozimas es ventajosa, ya que permite la concentración localizada en el sitio de la administración con adsorción sistémica mínima. Esto simplifica la estrategia de suministro de la ribozima al sitio enfermo y reduce la extensión de la caracterización toxicológica. Además, la cantidad de material que va a ser aplicada es menor que aquella requerida para otras vías de administración. El suministro efectivo requiere que la ribozima se difunda dentro de las células infectadas. La modificación química de la ribozima para neutralizar la carga negativa, puede ser todo lo que se requiera para la penetración. Sin embargo, en el caso de que la neutralización de la carga sea insuficiente, la ribozima modificada puede ser co-formulada con aumentadores de la permeabilidad, tales como Azone o ácido oleico, y en un liposoma. Los liposomas pueden representar ya sea un vehículo de presentación de liberación lenta en el cual la ribozima modificada y el mejorador de la permeabilidad se transfieren desde el liposoma dentro de la célula infectada, o los fosfolípidos de liposoma pueden participar directamente con la ribozima modificada y el aumentador de la permeabilidad en facilitar el suministro celular. En algunos casos, ambos de la ribozima y el aumentador de la permeabilidad, pueden ser formulados en una formulación de supositorio para la liberación lenta. Las ribozimas también pueden ser administradas sistémicamente . La absorción sistémica se refiere a la acumulación de fármacos en la corriente sanguínea, seguida por distribución en todo el cuerpo. Las vías de administración, las cuales llevan a la absorción sistémica incluyen: intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, intratecal y oftálmica. Cada una de estas vías de administración exponen a la ribozima a un tejido enfermo accesible. La administración subcutánea se drena en un nodulo linfático localizado, lo cual procede a través de la red linfática en la circulación. La velocidad de entrada en la circulación ha mostrado ser una función del peso molecular o el tamaño. El uso de un liposoma u otro portador del fármaco localiza a la ribozima en el nodulo linfático. La ribozima puede ser modificada para difundirse dentro de la célula, o el liposoma puede participar directamente en el suministro ya sea de la ribozima sin modificar o modificada a la célula. La administración intraperitoneal también lleva a la entrada en la circulación, una vez más, el peso molecular o el tamaño que controlan la velocidad de entrada. Los liposomas inyectados intravenosamente, muestran acumulación en el hígado, pulmón y bazo. La composición y tamaño puede ajustarse de tal manera que esta acumulación represente del 30% al 40% de la dosis inyectada. El resto se deja circular en la corriente sanguínea durante 24 horas. El método de elección del suministro debe resultar en la acumulación citoplásmica y las moléculas deben tener alguna resistencia a la nucleasa para la dosis óptima. El suministro nuclear puede ser útil, pero es menos preferible.

Los métodos de suministro más preferidos incluyen liposomas (10-400 nm) , hidrogeles, polímeros de liberación controlada, microinyección o electroporación (para los tratamientos ex vivo) y otros vehículos farmacéuticamente aplicables. La dosis dependerá de la indicación de la enfermedad y la vía de administración, pero debe estar entre 100-200 mg/kg de peso corporal/día. La duración del tratamiento, se extenderá a través del curso de los síntomas de la enfermedad, usualmente por lo menos 14-16 días y posiblemente en forma continua. Las dosis diarias múltiples se anticipan para aplicaciones tópicas, aplicaciones oculares y aplicaciones vaginales. El número de dosis dependerá del vehículo de suministro de la enfermedad y los datos de eficacia de las pruebas clínicas. El establecimiento de los niveles terapéuticos de la ribozima dentro de la célula, es dependiente de la velocidad de incorporación y degradación. Disminuyendo el grado de degradación se prolongará la vida media intracelular de la ribozima. De esta forma, las ribozimas modificadas químicamente, por ejemplo, con modificación del esqueleto fosfato o coronando los extremos 5 ' y 3 ' de la ribozima con análogos de nucleótidos, pueden requerir dosificación diferente. Las descripciones de sistemas útiles son proporcionadas en la técnica citada en lo anterior, todo de la cual se incorpora en la presente para referencia. Las ribozimas reivindicadas también son útiles como herramientas de diagnóstico para detectar específica o no específicamente la presencia de un ARN objetivo en una muestra. Es decir, el ARN objetivo, si está presente en la muestra, será desdoblado específicamente por la ribozima y de esta forma puede ser fácil y específicamente detectado como la especie de ARN más pequeño. La presencia de tales especies de ARN más pequeños es indicadora de la presencia del ARN objetivo en la muestra. Otras modalidades están dentro de las siguientes reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ARN enzimática, caracterizada porque es activa para desdoblar específicamente el ARN de HCV.

2. La molécula de ARN enzimática de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque desdobla el ARN de HCV en la región 5' sin traducir, el ARN que codifica para la región del núcleo (c) o las proteasas NS3 o NS2/NS3.

3. La molécula de ARN enzimática de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ARN está en un motivo de cabeza de martillo.

4. La molécula de ARN enzimática de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ARN está en un motivo de horquilla, intrón del grupo 1, virus de la hepatitis delta, o el motivo de ARN de la ARNasaP.

5. La molécula de ARN enzimática de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque desdobla la secuencia mostrada como cualquiera de las secuencias de identificaciones Nos. 1-8.

6. Una célula de mamífero que incluye una molécula de ARN enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. La célula de conformidad con la reivindicación 6, en la que la célula es una célula humana.

8. Un vector de expresión incluyendo el ácido nucleico que codifica para la molécula de ARN enzimática de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en una forma la cual permite la expresión de esa molécula de ARN enzimática dentro de una célula de mamífero.

9. Un método para el tratamiento de una enfermedad provocada por un HCV o la expresión de un gen de HCV o la porción de un gen de HCV por la administración a un paciente de una molécula de ARN enzimática de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el paciente es un humano o un primate no humano .

11. Un método para proporcionar partículas virales defectuosas, caracterizado porque comprende la etapa de poner en contacto una célula infectada con un HCV con una molécula de ARN enzimática, activa para desdoblar un gen requerido para la replicación viral.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la molécula es activa para desdoblar un ácido nucleico requerido para la síntesis de proteína viral.

13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el ácido nucleico está en la región 5' sin traducir del HCV.

14. Las partículas virales defectuosas producidas por el contacto con una célula infectada con un HCV con una molécula de ARN enzimática activa para desdoblar un gen requerido para la replicación viral.

15. Un método para inducir una respuesta inmune o para inducir la producción de inmunoglobulina anti-HCV en un humano, caracterizado porque comprende la etapa de administrar una partícula viral defectuosa producida por el contacto de una célula infectada con un HCV con una molécula de ARN enzimática, activa para desdoblar un gen requerido para la replicación viral.