MXPA96000206A - Composiciones y metodos para estimular el crecimiento y la diferenciacion de los megacariocitos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a las proteínas novedosas, denominadas como factores de crecimiento y desarrollo de megacariocitos (MGDFs;también en general denominadas como ligandos de Mp1), que tienen actividad biológica de estimulación del crecimiento de megacariocitos y aumento de la diferenciación o maduración de megacariocitos, que al final dan como resultado la producción de plaquetas. Los derivados de MGDF que comprenden moléculas de MGDF unidas a polímeros solubles en agua, tales como polietilenglicol son también descritos, junto con los métodos para su producción. También se describen los procesos para la obtención de los MGDFsen forma homogénea a partir de fuentes naturales, y produciéndolos mediante técnicas recombinantes de ingeniería genética a partir de mamíferos, incluyendo humanos.

Description

"COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA ESTIMULAR EL CRECIMIENTO Y LA DIFERENCIACIÓN DE LOS MEGACARIOCITOS" Inventor (es) : TIMOTHY D. BARTLEY, Norteamericano, domiciliado en 2431 McCrea Road, Thousand Oaks, California 91362, E.U.A.; JAKOB M. BOGENBERGER, Norteamericano, domiciliado en 2242 Barbara Drive, Camarillo, California 93010, E.U.A.; ROBERT A. BOSSELMAN, Norteamericano, domiciliado en 3301 Baccarat Street, Thousand Oaks, California 91362, E.U.A.; PAMELA HUNT, Norteamericano, domiciliado en 2431 McCrea Road, Thousand Oaks, California 91362, E.U.A.; OLAF B. KINSTLER, Norteamericano, domiciliado en 533 North Oaktree Unit A, Thousand Oaks, California 91360, E.U.A. y BABRU B. SAMAL, Norteamericano, domiciliado en 1136 Broadview Drive, Moorpark, California 93021, E.U.A..

Causahabiente : AMGEN INC., corporación del estado de Delaware, E.U.A., domiciliada en Amgen Center, 1840 Dehavilland Drive, Thousand Oaks, California 91320-1789, E.U.A COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA ESTIMULAR EL CT?ECWEENIO Y LA DIFERENCIACIÓN DE LO MEGACARIOC??S - 2 - CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las nuevas proteínas, denominadas en la presente de manera sinónima como ligandos Mpl o MGDFs , que estimulan al crecimiento de megacar ioci tos y aumentan la diferenciación o madura- ración de megacar ioc itos , con el efecto último de incrementar el número de plaquetas. Se proporcionan también los procesos para la obtención de proteínas en forma homogénea a partir de fuentes naturales, y produciéndolas mediante técnicas recombinantes de ingeniería genética. En otro aspecto más, la presente invención se relaciona ampliamente a una novedosa clase de derivados de MGDF, en donde una molécula de MGDF está unida a un polímero soluble en agua, y a los métodos para la preparación de tales moléculas. En otro aspecto más, la presente invención se refiere a los derivados de MGDF en donde una molécula de MGDF está unida a uno o más grupos polietilenglicol ("PEG"), y a los métodos para su prepara- ción.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Al menos dos amplias áreas de investigación están involucradas en la presente invención. La primera 1 se relaciona al desarrollo de los megacar iocitos y a la producción subsecuente de plaquetas, y la segunda se relaciona a un miembro polipeptídico de una familia de receptores del factor de crecimiento, denominada en la presente como el receptor Mpl, y a los ligandos del mismo. Cada una de estas áreas de investigación será ahora descrita a continuación.

A . Producción de Plaquetas a partir de Megacariocitos , 'J Las plaquetas sanguíneas son células circulantes que son cruciales para la prevención del sangrado y para la coagulación de la sangre. Los megacari oc itos son la fuente celular de plaquetas que surgen de una célula 5 precursora común de la médula ósea, la cual da surgimiento a todas las líneas celulares hematopoyéticas . Esta célula precursora común es conocida como la célula totipotencial o PPSC. Ha sido definida una jerarquía de células proge- 20 nitoras de megacariocitos , con base en el tiempo de aparición y en el tamaño de las colonias de megacariocitos (MK) que aparecen en los sistemas de cultivo in vitro, en respuesta a los factores de crecimiento apropiados. El megacari oci to de la unidad formadora de estallido (BFU-MK) es la célula progenitora de megacariocitos más primitiva. Se piensa que los BFU-MK al final producen numerosos megacariocitos de las unidades formadoras de colonias (CFU-MK), las cuales son células progenitoras de MK más diferenciadas. Conforme las células MK sufren diferenciación subsecuente, éstas pierden la habilidad para sufrir mitosis, pero adquieren una habilidad para endorredupli-carse. La endorreduplicación (o endomitosis) es el fenómeno en las células de división nuclear en ausencia de división celular. La endorreduplicación al final da como resultado un MK el cual es poliploide La maduración posterior de MK da como resultado la adquisición de organeles citoplásmicos y • constituyentes membranales que caracterizan a las plaquetas. Las plaquetas son producidas a partir de los MK's maduros mediante un proceso pobremente definido que ha sido sugerido como una consecuencia de la fragmentación física de MK , u otros mecanismos. Las observaciones de estructuras membranosas extensas dentro de los mega-cariocitos ha conducido a un modelo de formación de plaquetas en el cual un sistema de membrana de demarcación perfila las plaquetas nacientes dentro del cuerpo celular. Otro modelo más de formación de plaquetas se ha desarrollado a partir de las observaciones de que los megacarjo-citos formarán procesos citoplásmicos largos, constreñidos en intervalos ajustados al tamaño de las plaquetas, a partir de los cuales las plaquetas presumiblemente se rompen debido a las presiones del flujo sanguíneo en la médula ósea y/o en el pulmón. Estos procesos citoplás-micos fueron denominados proplaquetas por Becker y DeBruyn, para reflejar su papel precursor presunto en la formación de plaquetas. Ver Becker y DeBruyn, Amer. J. Anat 145: 183 (1976). La Figura 1 presenta una vista general de las diversas células precursoras involucradas en el desarrollo de los megacariocitos y de las plaquetas. La célula en en el lado a extrema izquiera de la figura representa una PPSC, y las células adicionales a la derecha de la PPSC en la figura representan el BFU-MK, seguido por CFU-MK. La célula que está sufriendo endorreduplicación, la cual está localizada inmediatamente a la derecha de la PPSC en la figura, es una célula megacariocito madura. Como resultado de la endomitosis, esta célula se ha convertido en poliploide. La siguiente estructura a la dere-cha incluye los procesos citoplásmicos largos que surgen del núcleo poliploide de la célula megacariocito madura. En el lado a extrema derecha de la figura se muestran un número de plaquetas que han sido producidas mediante fragmentación de los procesos citoplásmicos. El siguiente es un resumen de algunas publica-ciones anteriores referentes a la descripción anterior de la maduración de los megacariocitos y de la producción de plaquetas : Williams, N. y Levine, R.F., British Journal of Haematology 52: 173-180 (1982). Levin, J., Molecular Biology and Dif ferentiation of Megakary ocytes , pub. Wiley-Liss, Inc.: 1-10 (1990). Gewirtz, A.M., The Biology of Hematopoiesis , pub.

Wiley-Liss, Inc.: 123-132 (1990). Han, Z.C., y colaboradores, Int. J. Hematol. 54: 3-14 (1991). Nieuwenhuis, H.K. y Sixma, J., New Eng. J. of Med. 327: 1812-1813 (1992). Long, M., Stem Cells 11: 33-40 (1993).

B . Regulación de la Formación de Plaquetas Un cuerpo grande de datos generados en muchos laboratorios indica que la producción de plaquetas es regulada por factores humorales. La complejidad de este proceso biológico no fue originalmente apreciada y actualmente parece que un número de factores de crecimiento humanos posee esta capacidad. 1 La regulación de los megacariocitos ocurre a niveles celulares múltiples. Un número de citocinas aumenta la producción de plaquetas mediante la expansión del combinado de células progenitoras. Un segundo grupo 5 de factores de crecimiento humorales sirve como factores de maduración que actúan sobre las células más diferenciadas para promover la endorreduplicación. Además, parecen existir dos ciclos independientes de biorretroalimen- tación que regulan estos procesos. j d Diversos factores de crecimiento hematopoyéticos no específicos de línea, ejercen efectos importantes sobre la maduración de MK . El factor de estimulación de colonias de g ranulocitos-macrófagos (GM-CSF), la interleucina 3 (IL-3), IL-6 , IL-11, el factor inhibitorio de la leucemia (LIF) , y la eritropoyetina (EPO) promueven cada una individualmente la maduración de los MK humanos in vitro, como es determinado por sus efectos sobre el tamaño, el número o la ploidía de los MK . Los efectos de maduración de los MK de LIF, IL-6, e IL-11 son ya sea parcial (LIF e IL-6) o totalmente (IL-11) aditivos a aquellos de IL-3. Tales datos provenientes de estas publicaciones anteriores sugirieron que las combinaciones de citocinas pueden ser necesarias para promover la maduración de los MK in vivo. 5 El siguiente es un resumen de algunas publica-ciones anteriores relacionadas a la regulación de la producción de megacariocitos y plaquetas: Hoffman, R. y colaboradores, Blood Cells 13: 75- 86 (1987). 8. Murphy, M.J., Hematology/Oncology Clinics of North Americana 3 (3): 465-478 (1988). 9. Hoffman, R., Blood 74 (4): 1196-1212 (1989). 10. Mazur, E.M. y Cohén, J.L., Clin Pharmacol. Ther., 46 (3): 250-256 (1989). 11. Gewirtz, A.M y Calabretta, B.,. Int. J. Cell Cloning 8: 267-276 (1990). 12. Williams, N., Progress in Growth Factor Research 2: 81-95 (1990). 13. Gordon, M.S. y Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992) . 14. Hunt , P. y colaboradores , Exp. Hematol. 21: 372- 281 (1993). 15 Hunt, P. y colaboradores, Exp. Hematol. 21: 1295- 1304 (1993).

Se ha reportado también (ver referencia 16) que el suero aplástico humano contiene una actividad estimuladora de colonias de megacariocitos distinta de la IL-3, el factor de estimulación de colonias de granulo-citos, y los factores presentes en el medio condicionado con linfocitos. Sin embargo, la molécula responsable de esta actividad no fue ni aislada ni caracterizada en la técnica anterior. 16. Mazur, E.M., y colaboradoes , Blood 76: 290-297 (1990).

C. El receptor Mpl El virus de leucemia mieloproliferativa (MPVL) es un retrovirus murino con defecto de replicación que provoca leucemia' aguda en mamíferos infectados. Se ha descubierto que un gen expresado por MPVL consiste de una parte del gen que codifica para la envoltura retroviral (o el recubrimiento proteico externo) del virus, fusionado a una secuencia que está relacionada a la familia de los receptores de citocinas, incluyendo los receptores para GM-CSF, G-CSF, y EPO. La expresión del gen de MPVL descrito anteriormente tiene la propiedad biológica interesante de provocar que las células progenitoras murinas de diversos tipos adquieran inmediatamente la independencia del factor de crecimiento para la proliferación y la maduración terminal. Además, algunos cultivos de células de la médula ósea agudamente transformadas por MPVL contenían megacariocitos, sugiriendo una conexión entre el gen de MPVL y el crecimiento y diferenciación de los megacariocitos . Se reconoce ahora que el gen viral MPVL (denomi- ndo como v-Mpl) tiene un homólogo en las células de mamífero, el cual es denominado con un gen Mpl celular (o c-Mpl). usando sondas derivadas de v-Mpl, fue clonado un ADNc que corresponde al gen c-Mpl humano. Ver solicitud -O PCT publicada NQ WO 92/07074 (publicada el 30 de abril de 1992; discutida más adelante). El análisis secuencial ha mostrado que la proteína codificada por el producto del gen c-Mpl pertenece a la superfamilia de receptores de citocinas, altamante conservada, justo como el producto l1"1 del gen v-Mpl homólogo. Este gen celular, c-Mpl, se piensa que juega un papel funcional en la hematopoyesis, con base en la observación de que su expresión fue encontrada en médula ósea, en bazo, y en hígado fetal proveniente de ratones normales, mediante protección con sonda de ARNasa y experimentos de RT-PCR, pero no en otros tejidos. En particular, c-Mpl es expresado sobre los megacariocitos. Se ha mostrado también que el gen celular humano, c-Mpl humano, es expresado en células positivas a CD34, incluyendo los megacariocitos purificados y las plaquetas. CD34 es una antígeno que es indicador de las células progenitoras hematopoyéticas tempranas. Además, el exponer las células positivas a CD34 a los oligodesoxinucleótidos sintéticos que son anti-sentido al ARNm de c-Mpl o a ARN mensajero, inhibe significativamente la habilidad de formación de colonias de los progenitores de megacariocitos CFU-MK, pero no tiene efecto sobre los progenitores eritroides o de granulomacrófagos . Los datos y observaciones anteriores sugieren que c-Mpl codifica para una molécula de la superficie celular, denominada en la presente como el receptor Mpl, el cual se elaza a un ligando, que activa al receptor, posiblemente conduciendo a la producción y/o al desarrollo de los megacariocitos. La publicación de patente PCT WO 92/07074 está dirigida a la secuencia de la proteína producida por el gen c-Mpl, a partir de fuentes humanas y mur?nas'. Este producto genético, el cual se piensa que es un receptor como se explicó anteriormente, está constituido de al menos tres regiones generales o dominios: un dominio extracelular, un dominio transmembranal, y un dominio intracelular (o citoplásmico ) . Unidos conjuntamente, estos dominios constituyen el receptor Mpl intacto. Esta publicación PCT también se refiere a" una forma soluble del receptor que corresponde substancialmente al dominio } extracelular de la proteína c-Mpl madura. El dominio intracelular contiene una región hidrofóbica que, cuando se une vía la región transmembranal al dominio extracelular de la proteína, hace a la proteína completa sujeta a la agregación y a la insolubilidad. Por otro lado, cuando el dominio extracelular del producto genético c-Mpl es separado del dominio transmembranal y del dominio intracelular, éste se vuelve soluble, de aquí que la forma extracelular de la proteína es denominada como -? forma "soluble" del receptor. El siguiente es un resumen de algunas puhlica- cines anteriores relacionadas a la descripción • anterior de los receptores y los genes v-Mpl y c-Mpl: l1} 17. Wendling, F., y colaboradores, Leukemia 3 (7): 475- 480 (1989). 18. Wendling, F., y colaboradores, Blood 73 (5): 1161-1167 (1989). 19. Souyri, M., y colaboradores, Cell 63: 1137-1147 20 (1990). 20. Vigon, I., y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5640-5644 (1992). 21. Skoda, R.C., y colaboradores, The EMBO Journal 12 (7): 2645-2653 (1993). 25 22. Ogawa, M . , Blood 81 (11): 2844-2853 (1993). 1 23. Methia, N., y colaboradores, Blood 82 (5): 1395- 1401 (1993). 29. Wendling, F, y colaboradores, Blood 80: 246a (1993).

D . La necesidad para un agente capaz de estimular la producción de plaquetas.

Se ha reportado recientemente que las transfusiones de plaquetas están siendo administradas a una proporción x cada vez mayor en los centros médicos en Norteamérica, Europa Occidental y Japón. Ver Gordon, M.S. y Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992). Este incremento parece ser debido en gran medida a los avances en la tecnología médica y al mayor acceso a tales tecnologías como a la cirugía cardiaca y al transplante de médula ósea, de corazón y de hígado. La intensificación de la dosis como un medio de distribución de terapias para los pacientes con cáncer y a la epidemia por HIV-1, han contribuido también a la fuerte demanda del suministro de plaquetas.

El uso de plaquetas trae consigo la posibilidad de transmisión de las muchas enfermedades infecciosas portadas por la sangre, así como a la aloinmunización . Además, la producción de plaquetas purificadas es una tentativa cara y de aquí que el uso cada vez mayor de or tales plaquetas incremente los costos médicos totales.

Como resultado, existe una necesidad imperiosa para métodos nuevos y mejorados para la producción de plaquetas, para usos humanos . Los procedimientos ejemplares previos para aumentar la producción de plaquetas se describen en seguida : La Patente Norteamericana Ne 5,032,396 reporta que la interleucina 7 (IL-7) es capaz de estimular la producción de plaquetas. La interleucina 7 es conocida también como linfopoyetina 1 y es un factor de crecimiento linfopoyético capaz de estimular el crecimiento de los progenitores de células B y T en médula ósea. La solicitud PCT publicada Ns de serie 88/03747, presentada el 19 de octubre de 1988 y la solicitud de patente Europea NB 883099.77.2, presentada el 24 de octubre de 1988 describen los ADN's, los vectores y los procesos relacionados para la producción de proteínas IL-7 de mamífero mediante tecnología de ADN recombinante. Los datos presentados en la patente Norteamericana muestran que la IL-7 puede incrementar las plaquetas circulantes en ratones irradiados normal y subletalmente . La patente Norteamericana N° 5,087,448 describe que los megacariocitos y las plaquetas pueden ser estimulados para proliferar en mamíferos, mediante el tratamiento de éstos con interleucina 6. La interleucina 6 humana recombinante es una glucoproteína de peso molecular 1 de 26,000 con múltiples actividades biológicas. Los datos presentados en esta patente muestran que la IL-6 tiene un efecto de incrementar las colonias de megacariocitos in vitro . 5 Ninguna de las patentes anteriormente citadas menciona nada con respecto a los ligandos Mpl que están involucrados en la presente invención. A pesar de las descripciones anteriores, sigue existiendo una necesidad fuerte para nuevos estimuladores t- & de megacariocitos y/o de plaquetas en mamíferos.

E . Antecedentes relacionados a MGDF Químicamente Modificado. 1 Las proteínas para uso terapéutico son acutual- mente disponibles en formas apropiadas en cantidades adecuadas, principalmente como resultado de los avances en las tecnlogías de ADN recombinante. Los derivados químicos de tales proteínas pueden bloquear de manera efectiva un enzima proteolítica del contacto físico con la estructura o columna vertebral proteica misma, y de este modo prevenir la degradación. Las ventajas adicionales pueden incluir, bajos ciertas circunstancias, el incremento del tiempo de estabilidad y de circulación de la proteína terapéutica y la disminución de la 1 inmunogenicidad. Sin embargo, se debe de notar que el efecto de la modificación de un proteína particular no puede ser predicho. Un artículo de revisión que describe la modificación proteica y las proteínas de fusión -* es Francis, Focus on Growth Fractors 3: 4-10 (Mayo de 1992) (publicado por Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lañe, Londres N20, OLD, Reino Unido). El polietilenglicol ("PEG" o "peg") es una porción química que ha sido usada en la preparación de •* " productos proteicos terapéuticos. Por ejemplo Adagen , una formulación de . adenosina-desaminasa. polietilenglico- lada (pegilada) es aprobada para el tratamiento de enfermedad severa de inmunodeficiencia combinada; la super- óxido-dismutasa polietilenglicolada ha sido usada en ensayos clínicos para el tratamiento de daño a la cabeza; el alfa-interferón polietilglicolado ha sido probado en ensayos clínicos de fase I para el tratamiento de hepatitis; se reporta que la glucocerebrosidasa polietilenglicolada y la hemoglobina polietilenglicolada han sido usadas en pruebas preclínicas. Para algunas proteínas, la unión del polietilenglicol ha mostrado que protege contra la proteólisis, Sada y colaboradores, J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139 (1991), y están disponibles los métodos para la unión de ciertas 25 porciones de polietilenglicol. Ver Patente Norteamericana Ns 4,179,337, Davis y colaboradores, "Polipéptidos no Inmunogénicos", expedida el 18 de diciembre de 1979; y Patente Norteamericana NQ 4,002,531, Royer, ^Modificación de Enzimas con Polietilenglicol y Productos Producidos -* por Estas", expedida el 11 de enero de 1977. Para una revisión, ver Abuchowski y colaboradores, en Enzymes as Drugs. (J.S. Holcerberg y J. Roberts, eds, pp. 367- 383 (1981)). Otros polímeros solubles en agua han sido usados •^ para modificar las proteínas, tales como los copolímeros de etilenglicol/propilenglicol , carboximetilcelulpsa , dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpir.rolidona , poli-1 , 3-dioxolano , poli-1 , 3 , 6-trioxano , copolímero de etileno/anhídrido maleico, y poli-aminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios). Para el polietilenglicol, han sido usados una variedad de medios para unir las moléculas de polietilenglicol a la proteína. En general, las moléculas de polietilenglicol están conectadas a la proteína vía un grupo reactivo encontrado sobre la proteína. Los grupos amino, tales como aquellos sobre los residuos de lisina o en el extremo N, son convenientes para tal unión. Por ejemplo Royer (Patente Norteamericana NQ 4,002,531, anteriormente mencionada) establece que la alquilación reductiva fue usada para la unión de las moléculas de polietilenglicol 1 a una enzima. La Patente Europea Ns EP 0 539 167, publi- cada el 18 de abril de 1993, Wright, "Imidatos de Peg y Derivados Proteicos de los Mismos" establece que los péptidos y los compuestos orgánicos con grupo(s) amino 5 libres son modificados con un derivado de imidato de PEG o polímeros orgánicos solubles en agua, relacionados. La Patente Norteamericana Ns 4,904,584, Shaw, expedida el 27 de febrero de 1990, se refiere a la modificación del número de residuos de lisina en proteínas para la ¡ J unión de moléculas de polietilenglicol vía los grupos amino reactivos. Una proteína terapéutica específica la cual ha sido químicamente modificada, es el factor de estimulación de colonias de granulocitos, "G-CSF". Ver publica- 5 ciones de patente Europea Ns EP 0 401 384, EP 0 473, 268, y EP 0 335 423. Otro ejemplo más es la IL-6 polietilenglicolada, Patente Europea NQ EP 0 442 724, titulada "hIL-6 Modificada", (ver solicitud co-pediente U.S.S.N. 07/632,070) 0 la cual describe las moléculas de polietilenglicol agregadas a la interleucina 6. La patente Europea Na EP 0 154 316, publicada el 11 de septiembre de 1985, reporta la reacción de una linfocina con un aldehido de polietilenglicol. 5 La habilidad para modificar MGDF es desconocida 1 en la técnica, ya que la susceptibilidad de cada proteína individual a la modificación, es determinada por los parámetros estructurales específicos de esa proteína. Además, el efecto de tal modificación sobre las propieda- 5 des biológicas de cada proteína es impredecible a partir de la técnica. Debido a muchas aplicaciones clínicas de MGDF, como se describe en la presente, es deseable un producto MGDF derivatizado, con propiedades alteradas.

Tales moléculas pueden tener vida media y/o actividad -í? incrementada en vivo, así como otras propiedades. La pegilación o polietilenglicolación de las moléculas de proteína dará como resultado en general una mezcla de moléculas de proteína químicamente modificadas. Como una ilustración, las moléculas de proteína con cinco residuos de lisina y un grupo amino libre en el extremo N, que se hicieron reaccionar en los métodos anteriores, pueden dar como resultado una mezcla heterogénea, teniendo algunas seis porciones de polietilenglicol, algunas cinco, algunas cuatro, algunas tres, algunas dos, algunas una y algunas cero. Y, entre las moléculas con varias, las porciones polietilenglicol no pueden ser unidas en el mismo sitio sobre las diferentes moléculas. Será frecuentemente deseable el obtener un producto homogéneo que contenga substancialmente todo o un pequeño 2 número (por ejemplo 2-3) de especies de proteína modifica- ! da que varían en el número y/o sitio de las propiedades químicas, tales como PEG. No obstante, las mezclas de, por ejemplo, especies mono-, di- y/o tri-pegiladas pueden ser deseables o tolerables para una indicación terapéuti- 5 ca dada. La variabildiad de la mezcla de lote a lote podría ser desventajosa cuando se desarrolla y producto proteico pegilado terapéutico. En tal desarrollo es importante la capacidad de predicción de la actividad *<J biológica. Por ejemplo, se ha mostrado que en el caso de la conjugación no selectiva de la superóxido-dismutasa con polietilenglicol, varias fracciones de la enzima modificada fueron completamente inactivas (P. McGoff y colaboradores Chem. Pharm. Bull. 36:3079-3091 (1988)).

Ver también, Rose y colaboradores, Bioconjugate Chemistry 2: 154-159 (1991) el cual reporta la unión selectiva del grupo ligador carbohidrazida al grupo carboxilo C-terminal de un substrato proteico (insulina). No .se puede tener tal capacidad de predicción si la proteína terapéutica difiere en composición de lote a lote. Algunas de las porciones de polietilenglicol no pueden estar unidas tan establemente en algunos sitios como otras, y ésto puede dar como resultado que tales porciones se lleguen a disociar de la proteína. Por supuesto, si tales porciones son aleatoriamente unidas y por lo se llegan a disociar aleatoriamente, la farmacocinética de la proteína terapéutica no puede ser predecible de manera precisa. Es también altamente deseable un producto MGDF derivatizado, donde no exista porción de unión entre la porción polimérica y la porción de MGDF. Un problema con los métodos anteriores es que éstos requieren típicamente una porción de unión entre la proteína y la molécula de polietilenglicol. Estas porciones de unión pueden ser antigénicas, lo cual es también desventajoso cuando se desarrolla una proteína terapéutica. Un método que no involucra el grupo de unión se describe en Francis y colaboradores, En: "Stability of protein pharmaceuticals: in vivo pathways of degrada-tion and strategies for protein stabilization" (Estabilidad de productos farmacéuticos proteicos: vías in vivo de degradación y estrategias para la estabilización de la proteína) (Eds. Ahern., T. y Manning, M.C.) Plenum, Nueva York, 1991). También, Delgado y colaboradores "Coupling of PEG to Protein By Activation with Tresyl Chloride, Applications In Immunoaf finity Cell Preparation", (Acoplamiento de Peg a Proteínas Mediante Activación con Cloruro de Tresilo, Aplicaciones en Preparación de Células por Inmunoafinidad), En: Fisher y colabo-rdores, ed., Separations Using Aqueous Phase Systems, 1 Applications In Cell Biology and Biotechnology, (Separaciones Usando Sistemas en Fase Acuosa, Aplicaciones en oiología y Biotecnología Celular), Plenum Press, Nueva York, Nueva York 1989 pp . 211-213, involucra el 5 uso de cloruro de tresilo, el cual da como resultado ningún grupo de unión entre la porción de polietilenglicol y la porción de proteína. Este método puede ser difícil de usar para producir productos terapéuticos ya que el uso de cloruro de tresilo puede producir i. ú subproductos tóxicos. Chamow y colaboradores, Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) reporta la modificación de la inmuno- adhesina CD4 con el aldehido de mono-metoxi-polietilenglicol ( "MePEG-glicol ") vía la alquilación reductiva. Los auto- 15 res reportan que 50% del CD4-Ig fue modificado por mePEG mediante reacción selectiva del grupo alfa-amino del extremo N. Id. en la página 137. Los autores también reportan que la capacidad de enlace in vitro d e l CD4-Ig modificado (para la proteína gp-120) disminuyó a una proporción correlacionada al grado de MePEGila- ción . Ibid . De este modo, existe una necesidad para derivados de MGDF, y, más particularmente una necesidad para MGDF polietilenglicolado o pegilado. Existe también una necesidad para métodos que lleven a cabo tal deriva-tizacion.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona nuevos polipéptidos que promueven específicamente el crecimiento y/o el desarrollo de megacariocitos ("ligan-dos Mpl" o "MGDFs") los cuales están substancialmente libres de (por ejemplo, aislados de) otras proteínas (por ejemplo, proteínas de mamífero en el caso de un ligando Mpl obtenido de una fuente mamífera). Tales proteínas pueden ser purificadas a partir de fuentes celulares que producen los factores de origen natural o después de la inducción con otros factores. Estos pueden también ser producidos mediante técnicas recombinantes de ingeniería genética. Los ligandos Mpl pueden ser además sintetizados mediante técnicas químicas, o una combinación de las tecnias anteriormente enlistadas . L s ligandos Mpl de esta invención son obtenibles en su forma nativa a partir de fuentes mamíferas. Dos ligandos Mpl ejemplares aislados de plasma aplástico canino se describen en la sección de ejemplos en la presente. Sin embargo, se demuestra en otros ejemplos en la presente que los ligandos Mpl estrechamente 1 relacionados, están presentes en plasma aplástico proveniente de fuentes humanas y porcinas. Notablemente, la actividad de cada uno de los ligandos Mpl humano, porcino y canino, es específicamente inhibible por la 5 forma soluble del receptor Mpl murino, demostrando que todos estos ligandos Mpl (así como aquellos provenientes de otras fuentes mamíferas, incluyendo murinas) están estrechamente relacionados a niveles estructurales y de actividad. /xz) Se espera que los ligandos Mpl humanos, porcinos y de otros mamíferos, puedan ser aislados de fuentes naturales mediante procedimientos substancialmente como se detalla en la presente. Ver Ejemplo 10. En consecuencia, esta invención abarca en general los ligandos Mpl mamíferos, tales como los provenientes de perros, cerdos, humanos, ratones, caballos, ovejas y conejos. Los ligan- dos Mpl particularmente preferidos son aquellos provenientes de perros, cerdos y humanos. Además, los genes que codifican para los ligan- 20 dos Mpl humanos han sido clonados a partir de bibliotecas (genotecas) de riñon y de hígado fetal humano, y secuenciados, como se describe en la sección de Ejemplos más adelante. Se han determinado dos secuencias polipeptídicas humanas que tienen actividad en un ensayo basado en células (ver Ejemplo 4). Estas secuencias difieren en su longitud, pero tienen identidad sobre una gran extensión de sus secuencias de aminoácidos. Las porciones idénticas tienen homología a la eritropoyetina. Los ligandos Mpl son también denominados en la presente como Factores de Crecimiento y Desarrollo de Megacar íocitos (MGDFs); todas las referencias generales a los ligandos Mpl aplicarán para aquellos denominados en la presente como MGDFs y viceversa. Por "polipéptido MGDF" se entiende un polipéptido que tiene una actividad «jj para estimular específicamente o inhibir el crecimiento y/o el desarrollo de megacariocitos. Tales polipéptidos ejemplares se describen en la presente. Se ha encontrado que los ligandos Mpl de la presente invención son específicamente activos en la línea de megacariocitos, aumentado la maduración y/o la proliferación de megacariocitos, como se demuestra en los ensayos de los Ejemplos 2 y 4 más adelante. Por "específicamente" se entiende que los polipéptidos muestran actividad biológica a un grado relativamente superior hacia los megacariocitos, en comparación a muchos 0 de otros tipos celulares. Aquellos que sean estimuladores hacia los megacariocitos se espera que tengan una actividad in vivo de estimulación de la producción de plaquetas, a través de la estimulación de la maduración y diferenciación de los megacariocitos.

Dos ligandos Mpl preferidos provenientes de un fuente canina tienen pesos moleculares aparentes de aproximadamente 25 kd y 31 kd , como se determina mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE) bajo condiciones no reducto-ras. Ambas proteínas son purificadas durante el mismo protocolo de purificación, el cual se detalla en la sección de ejemplos más adelante. Los dos ligandos humanos preferidos, MGDF-1 y MGDF-2, son de 332 y 173 aminoácidos de longitud, respectivamente, no incluyendo un péptido de señal putativo de 21 aminoácidos. Estas secuencias, y una tercera molécula relacionada, MGDF-3 se muestran en las Figuras 11 y 12. Un aspecto adicional de la presente invención son los procesos para el aislamiento y purificación de los ligandos Mpl de la presente invención, o fragmentos de los mismos provenientes de fuentes mamíferas, preferentemente sangre completa, suero o plasma. La sangre, el suero o el plasma aplásticos son especialmente preferidos como materiales iniciales. La sangre, el suero o el plasma aplásticos pueden ser obtenidos mediante un proceso que involucra la irradiación de un mamífero con una fuente de radiación tal como cobalto 60 a un nivel de radiación de aproximadamente 400-800 rads, para hacerlos aplásticos. Tal procedimiento es conocido en la técnica, como se ejemplifica en las publicaciones citadas en el Ejemplo 1 más adelante. En el caso de humanos, la sangre, el plasma o el suero irradiados pueden 5 ser obtenidos de un paciente después de la terapia por radiación, por ejemplo, para tratar el cáncer. Después de esto, la sangre, el suero o el plasma aplásticos se sujetan a un proceso de purificación. El proceso de purificación proporcionado por la ¿ presente invención comprende los siguientes procedimientos clave: cromatografía de afinidad con lectina y cromatografía de afinidad del receptor Mpl. Cada uno de estos procedimientos da como resultado una purificación de aproximadamente 300 a 500 veces de las proteínas de 25 y 31 kd provenientes de plasma aplástico canino. Otros procedimientos estándares de purificación de proteínas pueden ser incluidos con los procedimientos anteriores, para purificar adicionalmente los ligandos Mpl de la presente invención, tales como aquellos proce- 20 dimientos detallados más adelante. Otro aspecto más de la presente invención incluye los polinucléotidos que codifican para la expresión de una proteína ligando Mpl de mamífero. Tales secuencias de ADN pueden incluir una secuencia de ADN 5 aislada que codifica para la expresión de las proteínas 1 ligando Mpl de mamífero, como se describe en la presente. Las secuencias de ADN pueden también incluir las secuencias de no-codificación 5' y 3' de mamífero que flanquean la secuencia de codificación del ligando Mpl. Las secuen- 5 cias de ADN ' pueden además codificar para un péptido de señal amino- erminal. Tales secuencias pueden ser preparadas mediante cualquier método conocido, incluyendo la síntesis química completa o parcial. Los codones pueden ser optimizados para la expresión en la célula ¿ J huésped elegida para la expresión (por ejemplo, células de E. coli o CHO) . También proporcionadas por la presente invención están las moléculas de ADN, que comprenden cada una el ADN vector y una secuencia de ADN que codifica 5 para un ligando Mpl de mamífero. Las moléculas de ADN proporcionan el ADN del ligando Mpl en asociación operativa con una secuencia reguladora capaz de dirigir la replicación de la expresión del ligando Mpl en una célula huésped seleccionada. Las células huésped (por ejemplo, células bacterianas, de mamífero, de insecto, le levadura o células vegegales) transformadas con tales moléculas de ADN para el uso en la expresión de una proteína ligando Mpl recombinante, se propocionan también por la presente invención. o Las moléculas de ADN y las células transfor- 1 madas de la invención se emplean en otro aspecto más, un proceso con el otro para la producción de proteína ligando Mpl de mamífero, recombinante, o fragmentos peptídicos de la misma. En este proceso, una línea celular 5 transformada con una secuencia de ADN que codifica para la expresión de la proteína ligando Mpl o un fragmento de la misma (o una molécula de ADN recombinante como se describe anteriormente), en asociación operativa con una secuencia reguladora o de control de expresión apro-? ¡- piada capaz de controlar la expresión de la proteína, se cultiva bajo condiciones apropiadas que permiten la expresión del ADN recombinante. Este proceso reclamado puede emplear un número de células conocidas como células huésped, para la expresión de la proteína. Las líneas celulares actualmente preferidas para la producción del ligando Mpl son líneas celulares de mamífero (por _ ejemplo células CHO) y células bacterianas (por ejemplo, E . coli ) . Para la producción de E. coli del ligando Mpl, se prefiere emplear los residuos de Metionina y lisina en el extremo N de la proteína a ser expresada, ya que el rendimiento del producto de expresión es típicamente superior. Un producto de expresión particularmente preferido es el MGDF humano Met-Lys que tiene un total de 165 aminoácidos (por ejemplo, Met-2-Lys-1 [1-163] MGDF (numerando a partir del primer aminoácido de la proteína madura) después de la purificación del producto expresado en una célula bacteriana tal como E. coli, los residuos terminales Met-Lys pueden ser eliminados mediante tratamiento con una enzima tal como una dipeptidasa (por ejemplo, catepsina C). La proteína ligando Mpl expresada es luego cosechada de la célula huésped, del lisado celular o del medio de cultivo mediante medios convencionales apropiadados . El medio condicionado puede ser procesado a través de los mismos pasos de. purificación s modificaciones de los mismos, como se usan para aislar el ligando Mpl proveniente de plasma aplástico. (Ver Ejemplo 7). En un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan las proteínas del ligando Mpl recombinantes. Estas proteínas están substancialmente libres de otros materiales de mamífero, especialmente proteínas. Las proteínas del ligando Mpl de esta inven-ción están también caracterizadas por contener una o más de las actividades físicas, bioquímicas, farmacológicas o biológicas descritas en la presente. La presente invención también se refiere a un MGDF químicamente modificado, comprendido de una porción de proteína de MGDF conectada al menos a un polímero soluble en agua, y a los métodos para la preparación y el uso de tales composiciones. En particular, la presente invención incluye el MGDF químicamente modificado en donde la especie de MGDF se hace reaccionar con las moléculas reactivas de polietilenglicol para unir el PEG al MGDF. Tal unión puede ser lograda mediante las reacciones de pegilación o polietilenglicolación discutidas en la presente tal como la acilación o alquilación. La acilación o la alquilación con PEG puede I I*-* ser llevada a cabo bajo condiciones mediante las cuales el producto mayor es monopegilado o polipegilado . La polipegilación involucra en general la unión del PEG a los grupos e-amino de los residuos de lisina y puede involucrar adicionalmente la pegilación en el extremo 1 N del polipéptido. La monopegilación involucra preferentemente la unión del PEG al grupo alfa-amino en el extremo N de la proteína. El rendimiento y la homogeneidad de tal reacción de monopegilación puede ser mejorada vía un tipo de alquilación reductiva la cual modifica selectivamente el grupo a1fa- aprijio del residuo N-terminal de una porción de la proteína MGDF, con lo cual se proporciona la unión selectiva de una porción polimérica soluble en agua en el extremo N de la proteína. Esto proporciona una preparación substancialmente homogénea de las moléculas conjugadas de polímero/proteína MGDF, 1 así como (si se usa el polietilenglicol) una preparación de moléculas de proteína MGDF pegiladas, que tienen la porción de polietilenglicol directamente acoplada a la porción proteica. 5 Otro aspecto más de esta invención proporciona las composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva del ligando Mpl recombi- * nante o de origen natural, aislado, el cual puede ser derivatizado con un polímero soluble en agua tal como t d polietilenglicol, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser empleadas en los métodos para el tratamiento de estado de enfermedad o desórdenes caracterizados por una deficiencia de los megacariocitos y/o de las plaquetas, así como una deficiencia in vivo del ligando Mpl. Estas pueden también ser empleadas profilácticamente para mejorar las deficiencias esperadas en megacariocitos o plaquetas (por ejemplo, debidas a la cirugía ) . 20 De este modo, los ligandos Mpl de la presente invención pueden ser empleados en el tratamiento de anemias aplásticas, por ejemplo, para aumentar la producción de plaquetas en pacientes que tienen producción deteriorada de plaquetas (tales como pacientes con SIDA o pacientes que sufren de quimioterapia contra el cáncer.

^ El ligando Mpl puede ser usado para tratar desórdenes sanguíneos tales como trombocitopenia. El ligando Mpl puede ser usando como una terapia adjunta para pacientes con transplantes de médula ósea. Tales pacientes podrían 5 ser humanos u otro mamífero. El ligando Mpl proveniente de una especie se espera también que sea útil en otra especie . Un aspecto adicional de la presente invención, por lo tanto, es un método para el tratamiento de estos f y otros estados patológicos que resultan de una deficiencia de plaquetas, mediante la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica como se describe anteriormente. Estos métodos terapéuticos pueden incluir la administra- 15 ción, simultánea o secuencialmente con el ligando Mpl, de una cantidad efectiva de al menos un factor de estimulación de colonias de megacariocitos, una citocina (por ejemplo, EPO), un receptor de Mpl soluble, hemapoye- tina, interleucina, factor de crecimiento o anticuerpo.

Otro aspecto más de la presente invención proporciona los anticuerpos (por ejemplo, policlonales, monoclonales, humanizados y recombinantes) y fragmentos de anticuerpos, dirigidos contra (por ejemplo reactivos con) un ligando Mpl de mamífero o un fragmento de ligan- 25 do. Como parte de este aspecto, por lo tanto, la inven- i. ción incluye las células capaces de secretar tales anticuerpos (por ejemplo, hibridomas en el caso de anticuerpos monoclonales) y métodos para su producción y uso en procedimientos diagnósticos o terapéuticos. 5 Otro aspecto más de la invención es un ensayo de un fluido corporal para la presencia de un ligando Mpl. Tal ensayo podría emplear anticuerpos que reconocen específicamente un ligando Mpl, en un formato de anticuerpo simple o de "emparedado". Tal ensayo podría l O ser usado para determinar si un paciente necesita la administración externa del ligando Mpl. y/o si tal paciente es probable que experimente una deficiencia de plaquetas o un desorden de las plaquetas. Tales ensayos podrían ser incluidos en un formato de equipo, incluyendo contro- 15 les positivos y negativos, anticuerpo o anticuerpos, y otros componentes estándares del equipo. Otros aspecto y ventajas de la presente invención serán aparentes con la consideración de la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la misma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Numerosas características y ventajas de la 25 presente invención se volverán aparentes a la revisión ,L_ de las figuras, en donde: La Figura 1 describe una revisión del desarrollo y maduración de los megacariocitos y de las plaque- 5 tas .

La Figura 2 demuestra que el receptor Mpl murino, soluble, inhibe substancialmente de manera completa la habilidad del plasma proveniente de perros l u irradiados ("canino aplástico" o "ASPK9"), para inducir el desarrollo de megacariocitos .. El ensayo para el desarrollo de megacariocitos fue .aquel descrito en el Ej emplo 2.

La Figura 3 muestra que una actividad enriquecida de APK9 mediante los procedimientos de cromatografía por afinidad de lectina y por afinidad de receptor Mpl ("ligando Mpl") estimula el crecimiento de las células 1A6.1, y que el receptor Mpl murino, soluble, bloquea ese crecimiento.

La Figura 4 muestra una revisión de los pasos de purificación involucrados en la purificación de las formas de 25 y de 31 kd del receptor Mpl canino prove-25 niente de plasma canino aplástico. ?_ La Figura 5 muestra la purificación del ligando Mpl mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC). La fracción 21 contiene el ligando Mpl de 31 kd altamente purificado; la fracción 22 contiene una mezcla de los ligandos Mpl de 31 kd y de 25 kd; y la fracción 23 contiene el ligando Mpl de 25 kd , altamente purificado.

La Figura 6 muestra una comparación de las * 3 actividades del ligando Mpl en las fracciones de la cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (columna C4 ) que contienen las proteínas ligando Mpl de 25 y/o de 31 kd.

La Figura 7 muestra el número de megacariocitos producidos a partir de los cultivos de las células sanguíneas periféricas seleccionados de CD43, estimuladas con APK9, con el ligando Mpl y con otros diversos factores. 20 La Figura 8 muestra el número de leucocitos totales a partir de cultivos de células de sangre periféricas seleccionadas de DC34, estimuladas con APK9, con el ligando Mpl y con otros diversos factores.

V La Figura 9 muestra los porcentajes de megacariocitos que son producidos en cultivos de células de sangre periférica seleccionadas de CD34, estimuladas con APK9, con el ligando Mpl y con otros diversos fac¬ tores .

La Figura 10 muestra que la IL-3 humana no está involucrada en el desarrollo de megacariocitos, inducido por el ligando Mpl. I O La Figura 11 muestra el ADNc y las secuencias deducidas de aminoácidos del MGDF-1 y MGDF-2 humanos.

La Figura 12 muestra el ADNc y la secuencias 15 deducidas de aminioácidos del MGDF-3 humano.

La Figura 13 muestra una comparación entre MGDF-1 y MGDFs (ligandos Mpl) provenientes de una fuente canina (A) y una fuente murina (B). 20 La Figura 14 muestra un ejemplo de la acilación de MGDF usando los esteres activos de N-hidroxisucci- nimidilo (NHS) del monometoxi-polietilenglicol para dar como resultado un producto polipegilado o polietilen- glicolado .

La Figura 15 muestra un ejemplo de la alquilación reductiva de MGDF no específica, usando los aldehidos de monometoxi-polietilenglicol para dar como resultado un producto polipegilado .

La Figura 16 muestra un ejemplo de la alquilación reductiva de MGDF específica del sitio en el grupo alfa-amino del residuo N-terminal, usando los aldehidos de monometoxi-polietilenglicol, para dar como resultado un producto substancialmente monopegilado .

La Figura 17 muestra el análisis de la cromatografía líquida de alta resolución de exclusión de tamaño (SEC) de los conjugados MePEG-MGDF, preparados usando los derivados activados de MePEG' de peso molecular de 20kDa: A. conjugado poli-MePEG-MGDF preparado mediante la acilación de MGDF con el éster de NHS del MePEG (PEG 11). B. conjugado de poli-MePEG-MGDF preparado mediante alquilación de MGDF con el aldehido de MePEG (PEG 20); C. conjugado de mono-MePEG-MGDF preparado mediante alquilación de MGDF con el aldehido de MePEG (PEG 16).

La Figura 18 muestra las cuentas de plaquetas a partir de ratones tratados con MGDF humano recombinante: diamante abierto = MGDF 22-353 derivado de CHO; circuios abiertos = MGDF 22-184 de E. coli no pegilado (por ejemplo, MGDF 1-163); y circuios cerrados = MGDF 22-184 de E. coli pegilado.

La Figura 19 muestra un diagrama de flujo de la purificación para r-HuMGDF. X) La Figura 20 muestra el efecto de r-HuMGDF (E. coli 1-163) sobre las cuentas de plaquetas en un modelo de carboplatina murina. Los ratones Balb/c fueron inyectados intraperitonealmente con una dosis simple 1 de carboplatina (1.25 mg/ratón) en el Día 0. El grupo solo con excipiente no recibió carboplatina. Después de veinticuatro horas, los animales tratados con carboplatina fueron subcutáneamente inyectados ya sea con excipiente o con 100 ug/kg r-HuMGDF diariamente por el resto del estudio. (n=10 para cada grupo; 5 animales fueron sangrados en cada uno de los otros puntos de tiempo) .

La Figura 21 muestra el efecto de r-HuMGDF 25 (E. coli 1-163) sobre las cuentas de plaquetas en ratones tratados con irraduación. Ratones Balb/c fueron irradiados con una dosis simple de 500 rads de radiación gama (Fuente de cesio) en el Día 0. El grupo solo con excipiente no fue irradiado. Después de veinticuatro horas, los animales irradiados fueron subcutáneamente inyectados ya sea con el excipiente o con 100 ug/kg de r-HuMGDF diariamente por el resto del estudio. (n=8 para cada grupo; fueron sangrados 4 animales en cada uno de los otros puntos de tiempo).

La Figura 22 muestra . el efecto de r-?uMGDF (E. coli 1-163) sobre las cuentas de plaquetas en ratones tratados con una combinación de irradiación y de carboplatina. Ratones Balb/c fueron irradiados con una dosis simple de 500 rads de radiación gama (fuente de cesio) y se les dió carboplatina (1.25 mg/ratón) en el Día 0. Después de veinticuatro horas, los animales comprometidos fueron subcutáneamente inyectados ya sea con excipiente o con 10 ug/kg de r-HuMGDF diariamente por el resto del estudio (n-8 cada grupo). Sin apoyo de r-HuMGDF, la mayoría de los ratones no sobrevivieron a _?jste __estudio. En el grupo control, sobrevivieron 1 de 8 animales. En el grupo tratado, sobrevivieron 8 de 8 animales.

La Figura 23 muestra el efecto de r-HuMGDF (E.coli 1-163) sobre la trombocitopenia inducida por irradiación en monos rhesus. Los monos rhesus fueron sujetados a irradiación (700 cGy Co-80). Se administraron subcutáneamente r-HuMGDF (n=3) o albúmina sérica humana (n=9) (cada uno a 25 ug/kg/día) por 18 días consecutivos comenzando veinticuatro horas después de la irradiación. Los análisis de las células sanguíneas fueron realizados con un analizador electrónico de células sanguíneas. Cada símbolo representa al valor promedio (+/- sem ) .

La Figura 24 muestra los efecto del r-HuMGDF pegilado y glucosilado, sobre las cuentas de plaquetas en ratones tratados con carboplatina e irradiación. Los ratones fueron sujetados a la combinación de carboplatina y de irradiación como se describe para los estudios realizados para la Figura 22. Se administraron inyecciones subcutáneas de la preparación indicada de r-HuMGDF (50 ug/kg/día) diariamente a todo lo largo del estudio comenzado 24 horas después del ataque. Las cuentas de células sanguíneas fueron tomadas en el día indicado usando un contador electrónico de células (Sysmex, Baxter). •i^^»'^ • ^. La Figura 25 muestra la secuencia genética sintética para el MGDF humano recombinante, los aminio- ácidos 1-163, que tienen codones optimizados de E. coli .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los aspectos y ventajas adicionales a la invención serán aparentes para aquellos expertos en la técni- ca, al considerar la siguiente descripción, la cual describe con detalle la práctica de la invención. Los nuevos factores que promueven el desarrollo de megacariocitos de mamífero y/o los factores que producen plaquetas denominados como ligandos Mpl, proporciona- dos por la presente invención son proteínas homogéneas substancialmente libres de asociación con otros materiales proteicos. Preferentemente, las proteínas están aproximadamente 90% libres de otras proteínas, de manera particular, preferentemente, aproximadamente 95% libres de otras proteínas, y más preferentemente aproximadamente mayor o igual al 98% libres de otras proteínas. Estas proteínas pueden ser producidas vía las técnicas recombinantes, para hacer posible la producción en gran cantidad del ligando Mpl activo, puro, útil para aplicaciones terapéuticas. Alternativamente, » tales proteínas pueden ser obtenidas en una forma homogénea a partir de sangre, plasma o suero aplásticos de mamífero, o a partir de una línea celular de mamífero que secreta o que expresa un ligando Mpl. Además, el ligando Mpl o los fragmentos activos del mismo pueden ser químicamente sintetizados. En general, por "ligando Mpl" como se usa en conexión con la presente invención, se entiende los ligandos Mpl descritos en la presente, así como los fragmentos activos y las variantes de los mismos, los cuales se describen con mayor detalle más adelante. Dos ligandos Mpl preferidos provenientes de una fuente canina tienen pesos moleculares aparentes de aproximadamente 25 kd y 31 kd , como es determinado mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida y docecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE) bajo condiciones no reductoras. Ambas proteínas son purificadas durante el mismo protocolo de purificación, el cual se describe con detalle en la sección de ejemplos más adelante. De este modo, por ejemplo, estos dos ligandos Mpl se enlazan a la lectina de germen de trigo y al receptor Mpl inmobilizado . La forma de 25 kd incluye una secuencia de aminoácidos como sigue: Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His-Xaa-Arg-Leu-Xaa-Gln-Xaa-Pro-Asp-Ile-Tyr (SEQ ID NO: 1).

La fórmula de 31 kd incluye una secuencia de aminoácidos como sigue: Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met -Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SEQ. ID NO: 2).

Los aminoácidos "Xaa" mostrados en la SEQ ID NOS: 1 y 2 no son conocidos con certeza, pero se espera que sean cisteina, serina, treonina o (menos probablemente) triptofano . Se puede observar a partir de las secuencias anteriores que el ligando de 31 kd comprende al menos una porción de la forma de 25 kd . En particular, los primeros 21 aminoácidos de la proteína de 31 kd son exactamente los mismos que aquellos de la proteína de 25 kd . Esta evidencia, y especialmente el hecho de que ambas proteínas tengan actividad en los ensayos de actividad de ligando Mpl presentados en la presente, conduce a la conclusión de que ambas proteínas están muy estrechamente relacionadas en términos de estructura y actividad. Es probable que la forma de 31 kd de la proteína difiera de la forma de 25 kd en la secuencia diferencial C-terminal, en la glucosilación diferencial y/o en la división diferencial del gen que codifica para las proteínas. Además de la información de la secuencia anterior, se determinó otra secuencia más durante el secuenciamiento de la banda de 25 kd antes del paso final de purificación (usando la cromatografía líquida de alta resulución de fase inversa). Esta secuencia se encontró asociada con la banda de 25 kd bajo condiciones no reductoras, pero a condiciones no reductoras, implicando que éste es el resultado de la escisión en dos porciones (por ejemplo, mediante una proteasa) de la proteína de 25 kd , cuyas porciones con mantenidas conjuntamente por un enlace disulfuro. Esta secuencia es: Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-Val-Leu-Gly-Ala-Val-Ala-Leu (SEQ ID NO: 3) Aunque la localización precisa de la SEQ ID. NO: 3 en Ia secuencia de la proteína de 25 kd no es clara, la analogía con otras citocinas, tal como la eritropoyetina, apoya la posibilidad de que la secuencia aparece alrededor del aminoácido número 114 en la proteína de 25 kd. Se debe de notar que es probable, aunque no probado, que la SEQ ID NO: 3 también aparece en la proteína de 31 kd, probablemente comenzando nuevamente alrededor del aminoácido número 114. Esta información secuencial es discutida con detalle adicional en el Ejemplo 7. Desde los experimentos iniciales de purificación •* de los ligandos caninos, resumidos anteriormente, ha sido ahora clonado un gen que codifica para un ligando canino. Como resultado, la secuencia de aminoácidos de longitud completa de este ligando canino ha sido determinada como aquella descrita en la Figura 13A.

J^ Con base en los cálculos de peso molecular, se predice que los ligandos caninos de 25 kd y 31 kd son formas procesadas C-terminales del ligando de longitud completa mostrado en la Figura 13A. Además, ha sido obtenido un ligando Mpl murino que tiene la secuencia descrita 5 en la Figura 13B. Tales ligandos purificados pueden también ser caracterizados por actividad específica en el ensayo de megacariocitos humanos del Ejemplo 2, de al menos 9 aproximadamente 5.7 x 10 unidades de megacariocitos/mg . 0 Una unidad de megacariocito es definida como aquella cantidad de material que da como resultado la producción de tantos megacariocitos como un microlitro de control estándar APK9, usando el ensayo descrito en el Ejemplo 2. 5 Tales ligandos purificados están también carac- i~ terizados por una actividad específica en el ensayo de crecimiento de células dependiente de Mpl del Ejemplo 9 4, de al menos aproximadamente 6.9 x 10 unidades de crecimiento de células/mg. Una "unidad de crecimiento de células" es definida como la cantidad de ligando requerida para dar como resultado el crecimiento de 200 células 1A6.1 en el ensayo del Ejemplo 4. La Tabla 1 siguiente muestra los cálculos adicionales específicos de la actividad para los ligandos ?? Mpl caninos, purificados, efectivos, preparados de acuerdo con esta invención: Tabla 1 Ligando Ensayo de 1A6.1 Ensayo de Meg Humano Mpl (unidades/mg) (unidades/mg) 31 kd 6.52 x 109 5.7 x 109 25 kd 10.5 x 109 14 x 199 Resumiendo la información anterior, algunos ligandos Mpl ejemplares de la presente invención están caracterizados por una o más de las siguientes propiedades bioquímicas y biológicas: (a) tales ligandos Mpl son aislados de plasma aplástico canino; (b) tales ligandos Mpl tienen pesos moleculares aparentes de aproximadamente 25 kd ó 31 kd , como se determina mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil-sulfato de sodio al 12-14% (SDS-PAGE) bajo condiciones no reductoras; (c) los ligandos Mpl comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ. ID NO: 1, en el caso de la proteína de 25 kd; o SEQ ID NO: 2, en el caso de la proteína de 31 kd; (d) los ligandos Mpl comprenden adicionalmente la secuencia de aminoácidos SEQ. ID NO: 3 (particularmente de manera preferida en la proteína de 25 kd); (e) los ligandos Mpl se enlazan a la lectina de germen de trigo; (f) los ligandos Mpl se enlazan al receptor Mpl murino, soluble, inmobilizado ; (g) la actividad de ligando Mpl puede ser inhibida in vitro por el receptor Mpl soluble; y (h) los ligandos Mpl se enlazan a una columna Las actividades biológicas de los ligandos Mpl preferidos de la presente invención, son demostradas 1*_ .por su habilidad para estimular de manera específica el crecimiento y el desarrollo de los megacariocitos en el ensayo de promoción del crecimiento de megacariocitos del Ejemplo 2. En este ensayo, el ligando MPL estimu- la la diferenciación de las células CD34 sanguíneas periféricas, humanas (por ejemplo, las cédulas CD-34 seleccionadas mediante inmunoadsorción ) durante un periodo de cultivo de 8 días. Los megacariocitos son __, identificados mediante la tinción con anticuerpos anti- -.^ antígeno de plaqueta, específicos, y contados microscópicamente. El ligando Mpl estimula también el crecimiento de la línea celular dependiente del factor, 1A6.1. En ausencia del ligando Mpl, las células morirán. El número de células 1A6.1 es valorado después de 2 días en el cultivo con el ligando Mpl. Los ligandos Mpl descritos anteriormente tienen actividades específicas como se describe en la Tabla 1 anterior . Se ha determinado que las fuentes de los ligandos Mpl son sangre, plasma o suero de mamífero, aplásticos. No obstante, la fuente de tales ligandos no se espera que esté limitada a tales fuentes conocidas y pueden incluir otros fluidos corporales de mamífero, células obtenidas a partir de los mismos, etc. 25 La purificación de los ligandos Mpl nativos provenientes de fuentes de mamífero, está basada en dos pasos claves de purificación: (a) cromatografía de afinidad de lectina, usando preferentemente la aglutinina de germen de trigo; y (b) cromatografía de afinidad del receptor Mpl inmobilizado . Los pasos adicionales pueden ser incluidos para purificar adicionalmente la proteína, tal como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de filtración en gel y la cromatografía en fase inversa. Las. técnicas de purificación empleadas actualmente en la obtención del ligando. Mpl a partir de plasma aplástico canino, comprenden los siguientes pasos (ver, Ej emplo 7 ) : (a) cromatografía de afinidad de lectina (la cromatografía de aglutinina de germen de trigo es especialmente preferida); (b) cromatografía de afinidad del receptor Mpl soluble (Mpl-X) (preferentemente, usando Mpl-X muri-no inmobilizado); (c) cromatografía de intercambio iónico (aniónico o catiónico) (preferentemente, cromatografía de intercambio aniónico; preferentemente de manera particular usando una columna Mono Q); (d) cromatrografía de filtración en gel bajo condiciones disociativas (preferentemente, usando Superdex 200 más SDS) ; y (e) cromatografía de fase inversa (preferentemente, usando una columna C-4). El ligando Mpl de mamífero, homogéneo, icluyen-do el ligando humano, puede ser obtenida mediante la aplicación de los procedimientos de purificación anteriores a sangre, suero o plasma aplásticos, o a otras fuentes de ligando Mpl de mamífero, por ejemplo, fuentes celulares o tisulares. No se requiere que los pasos estén en .una secuencia particular, pero la secuencia enlistada es la preferida. Los procedimientos paira el cultivo de una fuente celular (o de tejido) los cuales se puede encontrar que producen el ligando Mpl, son conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden ser usados, por ejemplo, para expandir el suministro de material inicial. El ligando Mpl o uno o más fragmentos peptídicos, pueden también ser producidos vía las técnicas recombinantes. Para obtener la secuencia de ADN para un ligando Mpl particular, el material de ligando Mpl purificado es reducido y opcionalmente digerido con una proteasa tal como tripsina. Los fragmentos enzimáticos son aislados y secuenciados mediante técnicas conven-cionales. Alternativamente, como se ejemplifica en los i ejemplos de la presente, la proteína purificada intacta puede ser secuenciada directamente al grado posible, con base en la cantidad de proteína disponible, y luego la región secuenciada puede ser usada análogamente 5 a los fragmentos trípticos secuenciados en el siguiente procedimiento. Las sondas oligonucleotídicas son sintetizadas usando el código genético, para predecir todas las secuencias posibles que codifican para las secuencias de aminoácidos del fragmento o fragmentos secuenciados. -'0 Preferentemente, varias secuencias degeneradas son generadas como sondas. El gen del ligando Mpl. es identificado mediante el uso de estas sondas para seleccionar una biblioteca genómica de mamífero, u otra fuente. Alternativamente, el ARNm proveniente de una fuente celular del ligando Mpl, puede ser usado para elaborar una biblioteca de ADNc la cual puede ser seleccionada con las sondas, para identificar el ADNc que codifica para el polipéptido del ligando Mpl. Además, la técnica de PCR puede ser usada para extender la secuencia de ADNc, usando los cebadores apropiados Usando estas sondas para seleccionar una biblioteca genómica, se obtiene el clon de ADN. Para obtener un clon de longitud completa, las sondas basadas en la secuencia obtenida de ADN pueden ser empleadas 5 para volver a seleccionar la biblioteca e hibridarse *"*- a la secuencia de ADN del ligando Mpl, de longitud completa. El ADNc humano para el ligando Mpl puede también ser obtenido mediante la subclonación del clon genómico humano de longitud completa, dentro de un vector de expresión, transfectándolo dentro de células COS, preparando una biblioteca de ADNc a partir de estas células COS transfectadas y seleccionando mediante hibridación para el ADNc del ligando Mpl. Una vez que se o identifica el ADNc completo, éste o cualquier porción del mismo que codifica para un fragmento activo del ligando Mpl, puede ser introducido dentro de cualquiera de una variedad de vectores de expresión, para elaborar un sistema de expresión para el ligando Mpl o uno o ' más fragmentos del mismo. Mediante tal uso de técnicas recombinantes, se obtienen las secuencias preferidas de ADN que codifican para el polipéptido del ligando Mpl. La presente invención también abarca estas secuencias de ADN, libres 0 de asociación con secuencias de ADN que codifican para otras proteínas (por ejemplo, aisladas), y que codifican para la expresión de los polipéptidos del ligando Mpl con una actividad de ligando Mpl (por ejemplo, el crecimiento y/o desarrollo de megacariocitos). Estas secuen- 25 cias de ADN incluyen aquellas secuencias que codifican para todo o un fragmento de ligando Mpl, y aquellas secuencias que se hibridan, preferentemente bajo condiciones de hibridación severas, a las secuencias de ADNc [Ver, T. Maniatis y colaborados, Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 287 a la 389]. Las condiciones ejemplares de hibridación severas son la hibridación en 4 X SSC a 62-67°C, seguido por el lavado en 0.1 x SSC a 62-67°C, por apro-ximadamente una hora. Alternativamente, las condiciones de hibridación severas, ejemplares, son la hibridación en formamida al 45-55%, 4 X SSC a 40-45°C. Las secuencias de ADN que se hibridan a las secuencias para el ligando Mpl bajo condiciones de hibri-dación relajadas, y las cuales codifican para los péptidos del ligando Mpl que tienen las propiedades biológicas del ligando Mpl, también codifican para los nuevos polipéptidos del ligando Mpl de esta invención. Los ejemplos de tales condiciones de hibridación severas, relajadas, son 4 X SSC a 45-55°C, o hibridación con forpamida al 30-40% a 40-45°C. Por ejemplo, una secuencia de ADN que comparte las regiones de homología significativa, por ejemplo, los sitios de glucosilación o enlaces disulfuro, con las secuencias de ligando Mpl y que codi-fica para una .proteína que tiene una o más propiedades -^~ biológicas del ligando Mpl, codifica claramente para un polipéptido del ligando Mpl, aún si tal secuencia de ADN pudiera no hibridarse de manera estricta o severa a la secuencia o secuencias del ligando Mpl. 5 Las variaciones alélicas (cambios de bases de origen natural en la población de la especie, las cuales pueden o no dar como resultado un cambio de aminoácidos) de las secuencias de ADN que codifican para las secuencias peptídicas del ligando Mpl, están también incluidas en la presente invención, así como los análogos y derivados de las mismas. De manera similar, están también abarcadas dentro de la presente invención las secuencias de ADN que codifican para los polipéptidos de ligando Mpl, pero los cuales difieren en el uso del 1 codón debido a las degeneraciones del código genético o a las variaciones en la secuencia de ADN del ligando Mpl, las cuales son provocadas por mutaciones puntuales o mediante modificaciones inducidas para aumentar la actividad, la vida media o la producción de los polipép- 20 tidos codificados por éstas. Se siguió un procedimiento de clonación como se describe en el Ejemplo 11 más adelante y dió como resultado las secuencias de aminoácidos y de ADNc de las proteínas MGDF-1, MGDF-2, y MGDF-3 humanas, descri- 25 tas en la presente. MGDF-1 es mostrado como los aminoáci-dos 22-353 en la Figura 11, y contiene 332 aminoácidos. MGDF-2 es una porción truncada de MGDF-1 , y se muestra como los aminoácidos 22-195 en la Figura 11. MGDF-2 contiene por lo tanto 174 aminoácidos. MGDF-3 se muestra como los aminoácidos 22-289 en la Figura 12, y contiene 268 aminoácidos. En cada MGDF descrito en la presente, la molécula que incluye el péptido de señal, mostrado como los aminoácidos 1-21 en las Figuras 11 y 12, es también parte de los polipéptidos de la presente invención, pero ésta es preferentemente eliminada para que sea mostrada la actividad de crecimiento y desarrollo de megacariocitos. En resumen, los MGDFs 1-3 son definidos como sigue: MGDF-1 aminoácidos 22-353 Figura 11 MGDF-2 aminoácidos 22-195 Figura 11 MGDF-3 aminoácidos 22-289 Figura 12 En los ensayos presentados en la presente, MGDF-1 y MGDF-2 fueron activos mientras que MGDF-3 no lo fue. Con base en los datos de actividad presentados en la presente, se hace la hipótesis de que el MGDF humano es expresado in vivo como un polipéptido precursor substancialmente inactivo o menos activo que contiene aminoácidos C-terminales variables. A la escisión de los aminoácidos C-terminales (así como el péptido de señal), la forma o formas procesadas de la molécula conservan la actividad o se vuelven más activas. En vista de la hipótesis anterior, se cree que MGDF-1 puede requerir el procesamiento (por ejemplo escisión con una proteasa) con el fin de mostrar su actividad. El hecho de que una forma truncada MGDF-1 (por ejemplo, MGDF-2) sea activa, apoya esta hipótesis. El medio condicionado proveniente de células 293 de riñon humano (Invitrogen) transfectadas con el gen de MGDF-1 sí demuestra la actividad en el ensayo de células del Ejemplo 4 siguiente. Por otro lado, en otras líneas celulares, por ejemplo, las células 32D no fue observada actividad para esta molécula. Se hace la hipótesis de que esto puede significar que las células 293 son capaces de procesar la molécula MGDF-1 , presumiblemente mediante truncamiento, de modo que la molécula responsable principalmente para la actividad, es una forma truncada, mientras que las células 32D no son capaces de procesar la molécula. En vista de la hipótesis anterior, pueden resultar diversos moléculas activas a partir de las escisiones o truncamiento de la secuencia descrita como MGDF-1 (Figura 11). Las características estructurales c conservadas entre la familia de citocinas, tal como eritropeyetina (EPO), incluyen cuatro racimos o grupos alfa-helicoidales y cuatro cisteinas. Con referencia a la secuencia de MGDF-1 , la Cys en la posición 172 es el elemento más C-terminal de estas estructuras evolu-tivamente conservadas y funcionalemente esenciales. Por lo tanto, las variantes de truncamiento preferidas de MGDF-1 son cualesquiera de aquellas que tengan truncamientos C-terminales del aminoácido 173 al 353 (junto con la escisión del péptido de señal. Preferentemente, la secuencia de MGDF-1 será eliminada de ésta desde los aminoácidos 50 al 185 desde el extremo C, particularmente de manera preferida, desde los aminoácidos 90 al 172 desde el extremo C. Como se describe en la presente, se piensa que el péptido de señal es de 21 aminoácidos de longitud; sin embargo, el péptido de señal puede tener 23 aminoácidos, con base en la secuen-ciua de MGDF-1. En consecuencia, los polipéptidos que corresponden a aquellos presentados en la presente, pero los cuales se inician en la posición 24 de las Figuras 11 ó 12, están también específicamente contemplados . Las siguientes son algunas variantes específicas, preferidas, del MGDF-1 que pueden mostrar actividad (por ejemplo, la habilidad para promover el crecimiento de megacariocitos y/o de plaquetas; o la actividad ' '" inhibitoria /estimuladora hacia el receptor natural): MGDF-4 aminoácidos 22-172 Figura 11 MGDF-5 aminoácidos 22-177 Figura 11 5 MGDF-6 aminoácidos 22-191 Figura 11 MGDF-7 aminoácidos 22-198 Figura 11 MGDF-8 aminoácidos 22-265 Figura 11 MGDF-11 aminoácidos 22-184 Figura 11 En algunos clones, los aminoácidos 133-136 en la secuencia de MGDF-1 estuvieron ausentes, de modo que pueden también ser activas las secuencias que corresponden a aquellas descritas anteriormente, pero en las cuales estos aminoácidos están faltando (y el número de aminoácidos C-terminal ajustado por debajo de cuatro). En un clon, el cual tuvo un codón de terminación en la posición 192, se encontró un residuo de alalina en vez de un residuo de " treonina, como se muestra en la posición 191 en la Figura 11. Por lo tanto, la inven- 20 ción incluye las variantes de las moléculas de MGDF en las cuales la posición 191 es alanina en vez de treonina . El MGDF-3 resulta de la eliminación de una secuencia denominada en la presente como IVS-5 (Secuencia de Intervención 5) ya que esta secuencia está empalmada • dentro del quinto exón en la secuencia. Ya que el extremo 5' de IVS-5 aparece dentro de un codón, su eliminación da como resultado un desplazamiento estructural en la secuencia remanente de MGDF, lo cual se puede observar que ocurra comenzando en la posición 160 de MGDF-3 hacia el final de la molécula. No ha sido todavía mostrada ninguna actividad para MGDF-3 mismo con la trasfección dentro de células 293, y probando el medio condicionado resultante para la actividad en el ensayo basado en células del Ejemplo 4. .Aparentemente.* de manera contraria a MGDF-1 las células 293 son capaces de procesar MGDF-3 a una forma activa. No obstante, con base en la hipótesis del truncamiento descrita anteriormente en conexión con MGDF-1, el truncamiento de los aminoácidos C-terminales provenientes de MGDF-3, puede también dar como resultado la actividad. Por ejemplo, el truncamiento C-terminal de MGDF-3 desde el aminoácido 40 hasta el 102, puede dar como resultado la actividad. Preferentemente, son eliminados los aminoácidos desde el 50 hasta el 90. Dos variantes específicas preferidas de MGDF-2 son: MGDF-9 22-179 Figura 12 NGDF-10 22-190 Figura 12 J , En todos los ligandos Mpl descritos en la presente, incluyendo los MGDFs ejemplares descritos anteriormente, puede estar presente un residuo de metio- nilo en el extremo N, especialmente cuando tales polipép- 5 tidos son expresados en células huésped bacterianas. Los polipéptidos del ligando Mpl pueden también ser producidos mediante síntesis química convencional, conocida. Los métodos para la construcción de los polipéptidos de la presente invención por medios sintéticos Son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las secuencias polipeptídicas del ligando Mpl, construidas sintéticamente, en virtud de la compartición de las características estructurales y conformacionales primarias, secundarias o terciarias con los polipéptidos del ligando Mpl, pueden poseer propiedades biológicas del ligando Mpl en común con éstas. De este modo, estas pueden ser empleadas como substitutos biológicamente activos o inmunológicos para polipéptidos del ligando Mpl, purificados, naturales, en procesos terapéuticos e inmunológicos. Las modificaciones en los péptidos o en las secuencias de ADN que codifican para el ligando Mpl pueden ser realizadas por alguien de experiencia en la técnica usando técnicas conocidas. Las modificaciones de interés en las secuencias del ligando Mpl, pueden ' _ incluir el reemplazo, la inserción o la supresión de un residuo de aminiácido seleccionado en las secuencias de codificación. Las técnicas de mutagénesis para tal reemplazo, inserción o supresión son bien conocidas 5 por alguien de experiencia en la técnica. [Ver, por ejemplo, Patente Norteamericana Ns 4,518,584]. Se prefieren los cambios conservadores en los aminoácidos del 1 al 20. Los péptidos preferidos pueden ser generados mediante enzimas proteolít icas , o mediante síntesis 0 química directa. Tales variantes están incluidas dentro del significado de los polipéptidos del ligando Mpl y los polinucléotidos de la presente invención. Las mutaciones específicas de las secuencias del polipéptido del ligando Mpl, pueden involucrar modi- 5 ficaciones de un sitio de glucosilación (por ejemplo, serina, treonina, o asparagina). La ausencia de glucosilacidn o únicamente de glucosilacidn parcial, resulta de la sustitución o supresión de aminoácidos en cualquier sitio de reconocimiento de la glucosilacidn ligado a 0 la asparagina, o en cualquier sitio de la molécula que sea modificado por la adición del carbohidrato enlazado al oxigeno. Un sitio de reconocimiento de glucosilacidn, ligado a la asparagina, comprende una secuencia tripeptídica que es específicamente reconocida por las enzimas de glucosilación celular, apropiadas. Estas secuencias tripeptídicas son ya sea Asn-Xaa-Thr o Asn-Xaa-Ser, donde Xaa puede ser cualquier aminoácido diferente de prolina. Una variedad de sustituciones o supresiones de aminoácidos en una o ambas de la primera o tercera posiciones de aminoácido de un sitio de reconocimiento de glucosilación (y/o supresión de aminoácidos en la segunda posición) da como resultado la no glucosilación en la secuencia tripéptica modificada). La expresión de tales secuencias alteradas de nucléotidos produce variantes que son no glucosiladas en ese sitio.

Análogos/Derivados Adicionales de -MGDF Otros análogos y derivados de las secuencias de MGDF (ligandos Mpl), los cuales pueden conservar la actividad de MGDF (ligando Mpl) total o parcialmente, pueden también ser preparados por alguien de experiencia en la técnica, dadas las descripciones en la presente. Tales modificaciones están también abarcadas por esta invención. Más particularmente, la presente invención también incluye ampliamente las composiciones de MGDF químicamente modificado, y los métodos para la elaboración y uso de los mismos. La presente descripción revela que es posible modificar MGDF y mejorar sus propiedades.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un producto de MGDF que comprende una proteína de MGDF ligada al menos a una porción polimérica soluble en auga. En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un producto MGDF en donde dicha proteína de MGDF está ligada al menos a una molécula de polietilenglicol . En otro aspecto mas, la presente invención se refiere a las moléculas de MGDF unidas al menos a una molécula de • polietilenglicsl vía un enlace acilo o alquilo . La pegilación o polietilenglicolacidn de MGDF puede ser llevada a cabo mediante cualesquiera reacciones de pegilacidn conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo: Focus on Growth Factors 3 (2): 4-10 (1992); Patente Europea N° EP 0 154 316; Patente Europea Nd EP 0 401 384; y las otras publicaciones citadas en la presente que se refieren a la pegilacidn o polietilengli-colación. Preferentemente, la pegilacidn es llevada a cabo vía una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo, análogo). Estos medios preferidos para la derivatizacidn con polietilenglicol, serán ahora discutidos con mayor detalle Acilación La pegilación mediante acilación involucra en general la reacción de un derivado de éster activo de polietilenglicol (PEG) con una proteína de MGDF. Cualquier molécula de PEG reactiva, conocida o subsecuentemente descubierta puede ser usada para llevar a cabo la pegilacidn de MGDF. Un éster de PEG preferido, activado,, es el PEG esterificado a l . N-hidroxisuccinimida ("NHS"). Como se usa en la presente, "acilación" se contempla que incluya sin limitación los siguientes tipos de enlace entre MGDF y un polímero soluble en agua tal como PEG: amida, carbamato, uretano y similares. Ver Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994). Las condiciones de reacción pueden ser seleccionadas de cualquiera de aquellas conocidas en la técnica de la pegilación, o aquellas subsecuentemente desarrolladas, pero deben de evitar las condiciones tales como temperatura, solvente, y pH que pudieran inactivar a las especies de MGDF a ser modificadas. Las condiciones de reacción que aplican en general a la pegilación de los MGDFs serán descritas más adelante. Una reacción ejemplar con un éster de NHS de monometoxi-PEG , se describe en la Figura 14. 1 La pegilación mediante acilación dará como resultado en general un producto MGDF poli-pegilado , en donde los grupos e-amina de lisina son pegilados vía un grupo de enlace de acilo. Preferentemente, el 5 enlace de conexión será una amida. También, preferentemente, el producto resultante será substancialmente solo (por ejemplo, mayor o igual a 95%) mono, di- o t r i-pegilado . Sin embargo, algunas especies con grados mayores de pegilación (hasta el número máximo de grupos l ? e-aminoácido de lisina de MGDF más un grupo alfa-amino en el extremo amino de MGDF) serán normalmente formadas en cantidades que dependen de las condiciones de reacción específicas, usadas. Si se desea, pueden ser separadas más especies pegiladas, purificadas, a partir de la mezcla, particularmente las especies sin reaccionar, mediante técnicas de purificación estándares, incluyendo entre otras, la diálisis, desalación, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatrografía de filtración en gel y electroforesis.

Alquilación La pegilación mediante alquilación involucra en general la reacción de un derivado de aldehido termi- nal de PEG, con una proteína tal como MGDF en presencia de un agente reductor. Como con la acilación discutida anteriormente, las condiciones de reacción se describen más adelante. La pegilación mediante alquilación puede también dar como resultado el MGDF poli-pegilado . Una reacción ejemplar de alquilación reductiva con MGDF para producir un producto polipegilado, se muestra en la Figura 15. Además, se pueden manipular las condiciones de reacción como se describe en la presente, para favore0 cer la pegilación substancialmente solo en el grupo alfa-amino del extremo N de la especie de MGDF (por ejemplo, una especie mono-pegilada ) . Una reacción de alquilación reductora, ejemplar, con MGDF para producir un producto monopegilado se muestra en la Figura 16. *• r' En cualquier caso de la monopegilacidn o polipegilación , los grupos PEG están preferentemente unidos a la proteína vía un grupo -CH2-NH-. Con referencia particular al grupo -CH^-, este tipo de enlace es denominado en la presente como un enlace "alquilo". 20 La derivatizacidn vía la alquilación reductora para producir un producto monopegilado, explota la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina versus el extremo N) disponibles para la derivatización en MGDF. La reacción es realizada a un pH (ver más adelante) el cual permite el tomar ventaja de las diferencias de pKa entre los grupos e- amino de los residuos de lisina, y aquel del grupo alfa- amino del residuo N-terminal de la proteína. Mediante tal derivatización selectiva, es controlada la unión de un polímero soluble en agua que contiene un grupo reactivo tal como un aldehido, a una proteína: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el extremo N de la proteína, y no ocurre modificación significante de otro grupo reactivo, tales como los I d grupos amino de la cadena lateral de lisina. En un aspecto importante, la presente invención proporciona una preparación substancialmente homogénea de moléculas conjugadas de polímero/proteína MGDF (lo que significa que la proteína MGDF a la cual una molécula polimérica 1 ha sido unida substancialmente sola (por ejemplo, mayor o igual a 95%) en un sitio simple. Más específicamente, si se usa polietilenglicol, la presente invención también proporciona la proteína MGDF pegilada que carece posiblemente de los grupos de enlace antigénicos, y que tiene la molécula de polietilenglicol directamente acoplada a la proteína MGDF. De este modo, en un aspecto preferido, la presente invención se refiere al MGDF pegilado, en donde el grupo o grupos PEG esta(n) unidos vía los grupos acilo o alquilo. Como se discutió anteriormente, tales productos pueden ser monopegilados o pegilados (por ejemplo, que contienen de 2 a 6, preferentemente de de 2 a 5, grupos PEG). los grupos PEG están en general unidos a la proteína en los grupos alfa- o epsilon-amino de los aminoácidos, pero se contempla también que los grupos PEG puedieran están unidos a cualquier grupo amino unido a la proteína, el cual sea suficientemente reactivo para llegar a unirse a un grupo PEG bajo condiciones de reacción apropiadas. Las moléculas poliméricas usadas en los procedimientos de acilación y alquilación . pueden . ser seleccionados de entre los polímeros solubles en agua o una mezcla de los mismos. El polímero seleccionado debe de ser soluble en agua, de modo que la proteína a la cual éste se une no se precipitará en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. El polímero seleccionado debe de ser modificado para tener un grupo reactivo simple, tal como un éster activo para la acilación, o un aldehido para la alquilación, preferentemente, de modo que el grado de polimerización puede ser controlado como se proporciona en los métodos presentes. Un aldehido de PEG reactivo, preferido, es el propionaldehí-do de polietilenglicol, el cual es estable en agua, o los derivados mono-alcoxi o -ariloxi de 1 a 10 átomos de carbono, del mismo (ver, Patente Norteamericana Na 5,252,714). El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Preferentemente, para uso terapéutico de la preparación del producto, el polímero será farmacéuticamente aceptable. El polímero soluble en agua puede ser seleccionado del grupo que consiste de, por ejemplo, polietilenglicol, monometoxi-polietilenglicol, dextrano, ?oli-(N-vinil - pirrolidon ) -polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un co-polímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por L U ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico. Para las reacciones de acilación, el polímero o polímeros seleccionados deben de tener un grupo éster reactivo, simple. Para la alquilación reductora presente, el polímero o polímeros seleccionados deben de tener un grupo 15 aldehido reactivo, simple. En general, el polímero soluble en agua no será seleccionado de los residuos gluco- silo de origen natural, ya que éstos son usualmente elaborados más convenientemente mediante sistemas de expresión recombinante de mamífero. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado . Un polímero soluble en agua particulamente preferido para el uso en la presente, es el polietilenglicol, abreviado PEG. Como se usa en la presente, se entiende que el polietilenglicol abarca cualquiera de las formas de PEG que han sido usadas para derivatizar otras proteínas, tales como el mono-(alcoxi o ariloxi de 1 a 10 átomos de carbono )-polietilenglicol . Como se emplea en la presente, se define que MGDF incluye cualquiera de las diversas formas descritas de MGDF en la presente. Por ejemplo, las formas glucosi-ladas o no glucosiladas de longitud completa o truncadas del MGDF, están todas incluidas. Las siguientes son moléculas de MGDF preferidas para ser der ivatizadas (en cada caso la numeración de refiere a los aminoácidos numerados de acuerdo con la Figura 11): MGDF-1 aminoácidos 22t353 Figura 1 MGDF-2 aminoácidos 22-195 Figura 1 MGDF-4 aminoácidos 22-172 Figura 1 MGDF-11 aminoácidos 22-184 Figura 1 MGDF-12 aminoácidos 27-353 Figura 1 MGDF-13 aminoácidos 27-195 Figura 1 MGDF-14 aminoácidos 27-172 Figura 1 MGDF-15 aminoácidos 27-184 Figura 1 Las especies anteriores, preferidas, pueden ser glucosiladas, no glucosiladas, o desglucosiladas , preferentemente no glucosiladas, Estas pueden ser elaboradas recombinantemente ya sea en células bacterianas (por ejemplo, E. coli) o de mamífero (por ejemplo CHO). Los siguientes son subgrupos particularmente preferidos de moléculas químicamente der ivatizadas de esta invención (en cada caso, éstas son porciones mono-o poli-, por ejemplo 2-4 de PEG, unidas vía un grupo alquilo o alquilo): MGDF-11 pegilado MGDF-4 pegilado MGDF-2 pegilado En general, la derivat-ización química puede ser realizada bajo cualesquiera condiciones apropiadas usadas para hacer reaccionar una substancia biológicamen-te activa con una molécula polímerica activada. Los métodos para la preparación de MGDF pegilado comprenderán en general los pasos de (a) hacer reaccionar un polipéptido de MGDF con polietilenglicol (tal como un éster reactivo o derivado de aldehido de PEG) bajo condi-ciones mediante las cuales el MGDF se llega a unir a uno o más grupos PEG. y (b) la obtención del producto o productos de reacción. En general, las condiciones óptimas de reacción para las reacciones de acilación serán determinadas caso por caso, con base en los pará-metros conocidos y en el resultado deseado. Por ejemplo, ,£ entre mayor sea la proporción de PEG : proteína , mayor es el porcentaje de producto poli-pegilado . La alquilación reductora para producir una población substancialmente homogénea de la molécula 5 conjugada de mono-polímero/proteína MGDF comprenderá en general los pasos de: (a) la reacción de una molécula de MGDF con una molécula PEG reactiva bajo condiciones de alquilación reductora, a un pH apropiado para permitir la modificación seleccionable del grupo alfa-amino en O el extremo amino de dicha proteína de MGDF; y (b) la obtención del producto a productos de re&cción. Para una población substancialmente homogénea de las moléculas conjugadas de mono-polímero/proteína MGDF, las condiciones de reacción de alquilación reducto- 5 ra son aquellas que permiten la unión selectiva de la porción polimérica soluble en agua al extremo N de MGDF. Tales condiciones de reacción proporcionan en general diferencias de pKa entre los grupos amino de la lisina y los grupos alfa-amino en el extremo N (siendo 0 el pKa el pH al cual el 50% de los grupos amino están protonados y el 50% no lo están). El pH afecta también la proporción del polímero a la proteína a ser usada- En general, si el pH es menor, será deseado un mayor exceso de polímero a proteína (por ejemplo, entre menos reactivo sea el grupo alfa-amino N-terminal, se •"* necesita más polímero para lograr las condiciones óptimas). Si el pH es mayor, la proporción polímero : proteína no necesita ser tan grande (por ejemplo, son disponibles más grupos reactivos, de modo que se necesitan 5 menos moléculas de polímero). Para fines de la presente invención, el pH caerá en general dentro del intervalo de 3-9, preferentemente 3-6. Otra consideración importante es el peso molecular del polímero. En general, entre mayor sea ^0 e? peso molecular del polímero, menor es el número de moléculas de polímero que pueden ser unidas a la proteína. De manera similar, la ramificación del polímero debe de ser tomada en cuenta cuando se optimizan estos parámetros. En general, entre mayor sea el peso molecular (o entre más sean las ramificaciones) mayor es la proporción polímer o: proteína . En general, para las reacciones de pegilación contempladas en la presente, el peso molecular promedio preferido es de aproximadamente 2kDa a aproximadamente lOOkDa (el término "aproximada- 20 mente" indica ± lkDa). El peso molecular promedio preferido es de aproximadamente 5kDa a aproximadamente 50kDa , particularmente de manera preferida aproximadamente 12kDa a aproximadamente 25 kDa. La proporción del polímero soluble en agua a la proteína MGDF estará en general en el intervalo de 1:1 a 100:1, preferentemente (para la pegilación) 1:1 a 20:1 y (para la monopegilacidn ) 1:1 a 5:1. Usando las condiciones indicadas anteriormente, la alquilación reductora proporcionará la unión selectiva 5 del polímero a cualquier proteína MGDF que tenga un grupo alfa-amino en el extremo amino, y proporcionará una preparación substancialmente homogénea del conjugado monopolímero/proteína MGDF. El término "conjugado de polímero/proteína MGDF" se usa en la presente para dar l O a entender una composición comprendida de una molécula polimérica simple unida a una molécula de proteín-a MGDF. El conjugado de monopolímero/proteína MGDF tendrá preferentemente una molécula polimérica localizada en el extremo N, pero no sobre los grupos laterales amino de la lisina. La preparación será preferentemente mayor de 90% de conjugado de monopolímero/protei?a MGDF, y más preferentemente mayor de 95% del conjugado monopolímero/proteína MGDF, con el resto de las moléculas observables que están sin reaccionar (por ejemplo, la proteína Q e carece de la porción polimérica). Los ejemplos siguientes proporcionan una preparación que es al menos aproximadamente 90% de conjugado monopolímero/proteína , y aproximadamente 10% de proteína sin reaccionar. El conjugado monopolímero/proteína tiene actividad bioló- 25 gica .

Para la presente alquilación reductora, el agente reductor debe de ser estable en solución acuosa, y preferentemente debe de ser capaz de reducir únicamente la base de Schiff formada en el proceso inicial de la alquilación reductora. Los agentes reductores preferidos pueden ser seleccionados del grupo que consiste de borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, di etil-amino-borano , trimetilamino-borano y piridin-borano . Un agente reductor particularmente preferido es el cianoborohidruro de sodio. Otros parámetros de reacción, tales como el solvente, los tiempos de reacción, las temperaturas, etc., y los medios de purificación en los productos, pueden ser determinados caso por caso con base en la información publicada referente a la derivatización de proteínas con polímeros solubles en agua (ver las publicaciones citadas en la presente). Los detalles ejemplares se muestran en la sección de Ejemplos siguente . Alguien puede elegir preparar una mezcla de las moléculas conjugadas de polímero/proteína mediante métodos de acilacidn y/o alquilación, y la ventaja proporcionada en la presente es que se puede seleccionar la proporción del conjugado monopolímero/proteína para incluirse en la mezcla. De este modo si se desea, se - puede preparar una mezcla de diversas proteínas con diversos números de moléculas poliméricas unidas (por ejemplo di-, tri-, tetra- etc.) y combinarse con el material conjugado de monopolímero/proteína preparado 5 usando los métodos presentes, y tener una mezcla con una proporción predeterminada de conjugado monopolímer o/ proteína . Los ejemplos de trabajo siguientes demuestran la preparación del MGDF químicamente modificado y la l O preparación del MGDF pegilado vía la acilación y la alquilación. De este modo, otros spectos de la presente invención se refieren a estas preparaciones. En general, las condiciones que pueden ser aligeradas o muduladas mediante la administración del 15 presente polímero/MGDF, incluyen aquellas descritas anteriormente para las moléculas de MGDF en general. Sin embargo, las moléculas de polímero/MGDF descritas en la presente pueden tener actividades adicionales, actividades aumentadas o reducidas, u otras caracterís-20 ticas, en comparación a las moléculas no derivatizadas . En otro aspecto más de la presente invención, se proporcionan las composiciones farmacé.uticas de las moléculas de MGDF químicamente modificadas, mencionadas. Tales composiciones farmacéuticas pueden contener 25 cualquiera de los ingredientes especificados en la pre-senté para las moléculas de MGDF no derivatizadas . Conforme se conduzcan los estudios posteriores, surgirá la información respecto a los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de diversas condiciones en diversos pacientes, y el trabajador experto ordinario, considerando el contexto terapéutico, la edad y la salud general del recipiente, será capaz de evaluar la dosificación apropiada. En general, la dosis estará entre 0.01 µg/kg de peso corporal (calculando la masa de la proteína sola, sin modificación química) y 300 ug/kg (basado en los mismos) . La dosis preferida será en general de 5 ig/kg de peso corporal a 100 ug/kg de peso corporal, de manera particular preferentemente de 10 ug/kg de peso corporal hasta 75 µg /kg de peso corporal . La presente invención también proporciona un método para la producción de polipéptidos de MGDF (por ejemplo, el ligando Mpl) o fragmentos activos de los mismos. Un método de la presente invención involucra la introduccidn del ADNc que codifica para un polipéptido del ligando Mpl en un vector de expresión, para elaborar un sistema de expresión para el ligando Mpl. Una célula huésped seleccionada es transfectada con el vector, y cultivada. El método de la presente invención compren-de por lo tanto el cultivo de una célula o línea celular adecuada, la cual ha sido transfectada con una secuencia de ADN que codifica para la expresión de un polipéptido del ligando Mpl, bajo el control de secuencias reguladoras conocidas. Las secuencias reguladores incluyen los fragmentos promotores, los fragmentos terminadores y otras secuencias adecuadas las cuales dirigen/controlan la expresión de la proteína en una célula huésped apropiada. El factor expresado es luego recuperado, aislado y purificado del medio de cultivo (o de la célula, si se expresa intracelularmente ) mediante medios apropiados, .conocidos por alguien de experiencia en la técnica. Además, los métodos descritos en la Patente Norteamericana NQ 5,272,071 están también contemplados como aplicables para los polinucléotidos/polipéptidos de la invención . Las células apropiadas o las líneas celulares apropiadas pueden ser células de mamífero, tales como las células de ovario de hámster Chino (CHO) o las células 3T3. La selección de las células huésped de mamífero apropiadas y los métodos para la transformación, cultivo, amplificación, selección y produccidn y purificación del producto, son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Gething y Sambrook, Nature 293: 620-625 (1981), o alternativamente, Kaufman y colaboradores, Mol. Cell. Biol., 5 (7): 1750-1759 (1985) o Howley y colaboradores, Patente Norteamericana NQ 4,419,446.

Otras líneas de células de mamífero apropiadas, son las líneas celulares de mono C0S-1 y C0S-7, y la línea de células CV-1. Las células huésped de mamífero ejemplares, adicionales, incluyen líneas celulares de primate y líneas celulares de roedores, incluyendo las líneas celulares transformadas. Son también apropiadas células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, así como explantes prima-rios. Las células candidato pueden ser genotípicamente deficientes en. el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúa dominantemente. Otras líneas celulares de mamífero apropiadas, incluyen pero no están limitadas a, las líneas de células HeLa, las células L-929 de ratón, las líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, las líneas de células de hámster BHK o HaK. De manera similar, como células huésped útiles, apropiadas para la presente invención, son las células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, DH5alfa, DH10, y MC1061) son bien conocidas como células huésped en el campo de la biotecnología. Pueden también ser empleadas en este método diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otros Bacillus spp., Streptomyces spp., y similares.

Muchas cepas de células de levadura conocidas por aquellos expertos en la técnica son también disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Además, cuando se desee, puedan ser utilizadas las células de insecto como células huésped en el método de la presente invención. Ver por ejemplo Miller y colaboradores, Genetic Engineering 8: 277-298 (1986) y las referencias citas en ésta. La presente invención también proporciona las moléculas recombinantes o los vectores para el uso en el método de expresión de los nuevos polipéptidos del ligando Mpl. Estos vectores contienen las secuencias de ADN del ligando Mpl, y las cuales solas o en combina-ción con otras secuencias, codifican para los polipéptidos del ligando Mpl (con o sin los péptidos de señal) de la invención o los fragmentos activos de los mismos. Alternativamente, los vectores que incorporan las secuencias modificadas como se describe anteriormente, son también modalidades de la presente invención, y son útiles en la producción de los polipéptidos del ligando Mpl. El vector empleado en el método contiene también las secuencias reguladoras seleccionadas, en asociación operativa con el ADN que codifica para las secuencias de la invención, y capaz de dirigir la replicacidn y la expresión de éstas en las células huésped seleccionadas. Un vector es el pXM, el cual es particularemen-te deseable para la expresión en células COS [Y.C. Yang y colaboradores, Cell 47: 3-10 (1986)]. Otro vector más, el cual es deseable para la expresión en células de mamífero, por ejemplo, células CHO, es pEMC2Bl . Los vectores de expresión de células de mamífero descritos en la preente, pueden ser sintetizados mediante técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Los componentes de los vectores, por ejemplo los replicones, los genes de selección, los aumentadores, los promotores y similares, pueden ser obtenidos de fuentes naturales o sintetizados por procedimientos conocidos. Ver, Kaufman y colaboradores, J. Mol. Biol. 159: 511-521 (1982); y Kaufman, Proc. Nati. Acad, Sci. USA 82: 689-693 (1985). Alternativamente, el ADN vector puede incluir todo o parte del genoma del virus del papiloma bovino [Lusky y colaboradores, Cell 36: 391-401 (1984)] y ser replicado en las líneas celulares tales como las células de ratón C127, como un elemento episómico estable. La transfección de estos vectores en células huésped apropiadas puede dar como resultado la expresión de los polipéptidos del ligando Mpl. Pueden también ser usados para este propósito "-' otros vectores de expresión apropiados, de los cuales numerosos tipos son conocidos en la técnica para la expresión en mamíferos, insectos, levaduras, hongos y bacterias. Las condiciones a ser tratadas por los 5 métodos y composiciones de la presente invención, son en general aquellas que involucran una deficiencia existente en megacariocitos/plaquetas o una deficiencia esperada en megacariocitos/plaquetas en el futuro (por ejemplo, debido a la cirugía planeada). Tales condiciones serán usualmente el resultado de una deficiencia (temporal o permanente) del ligando Mpl activo in vivo. El término genérico para la deficiencia de plaquetas es la trombocitopenia, y de aquí que los métodos y composiciones de la presente invención estén en general dispo- 15 nibles para el tratamiento de la trombocitopenia. La trombocitopenia (deficiencias de plaquetas) puede estar presente por diversas razones, incluyendo la quimioterapia y otra terapia con una variedad de fármacos, terapia por radiación, cirugía, pérdida acci- 20 dental de sangre, y otras condiciones de enfermedad específicas. Las condiciones de enfermedad específicas, ejemplares, que involucran la trombocitopenia y puedan ser tratadas de acuerdo con esta invención son: anemia aplástica, trombocitopenia idiopática, tumores metastási- 2 eos que dan como resultado trombocitopenia, lupus erite-matoso sistémico, esplenomegalia, síndrome de Fanconi, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de ácido fólico, anomalía de May-Hegglin, síndrome de Wiskott-Aldrich , y hemoglobinuria paroxística nocturna. También, ciertos tratamientos para el SIDA dan como resultado la trombocitopenia (por ejemplo, el AZT). Ciertos trastornos del sanado de la heridas pueden también tomar beneficio de un incremento en los números de plaquetas. Con respecto a las deficiencias de plaquetas anticipadas, por ejemplo debido a la cirugia futura, un ligando ' Mpl de la presente invención podría ser administrado varios días a diversas horas antes de la necesidad para plaquetas. Con respecto a las situaciones agudas, por ejemplo, pérdida accidental y masiva de sangre, se podría administrar el ligando Mpl junto con sangre o plaquetas purificadas. Los ligandos Mpl de esta invención pueden también ser útiles en la estimulación de ciertos tipos de células diferentes de los megacariocitos, si se en-cuentra que tales células expresan el receptor Mpl. Las condiciones asociadas con tales células que expresan el receptor Mpl, las cuales son responsables de la estimulación por parte del ligando Mpl, están también dentro del alcance de esta invención. Las moléculas de MGDF que no son por sí mismas activas en los ensayos de actividad presentados en la presente, pueden ser útiles como moduladores (por ejemplo, inhibidores y es imuladores) de los receptores Mpl in vitro o in vivo. Los polipéptidos de la presente invención pueden también ser empleados solos, o en combinación con otras citocinas, con el receptor Mpl soluble, con factores hematopoyéticos , con interleucinas, con factores de crecimiento o anticuerpos, en el tratamiento de las condiciones anteriormente identificadas. Por lo tanto, como otro aspecto más de la presente invención, están las composiciones terapéuticas para el tratamiento de las condiciones referidas anteriormente. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de ligando Mpl o un fragmento terapéuticamente efectivo del mismo, en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. El material portador puede ser agua para inyección, preferentemente suplementada con otros materiales comunes en soluciones para la administración a mamíferos. Típicamente, un agente terapéutico de ligando Mpl será ad-minstrado en la forma de una composición que comprende la proteína purificada en conjunto con uno o más portadores, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. La solución salina amortiguada neutra, o la solu-ción salina mezclada con albúmina sérica, son portadores apropiados ejemplares. Preferentemente, el producto es formulado con un liofilizado usando los excipientes apropiados (por ejemplo, sucrosa). Pueden ser incluidos si se desea otros portadores, diluyentes, y excipientes estándares. Otras composiciones ejemplares son el amortiguador Tris, pH 8.0 y el amortiguador de acetato pH 5.0, los cuales, en cada caso, pueden incluir además sorbitol. Las presentes composiciones pueden ser administradas sistémicamente de manera parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden ser administradas intravenosamente o subcutáneamente. Cuando se administran sistémicamente, las composiciones terapéuticas para el uso en esta invención pueden estar en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, y libre de pirógenos. La preparación de tales soluciones de proteína, farmacéuticamente aceptables, con respecto al pH, la isotonicidad , estabilidad y similares, está dentro de la experiencia de la técnica. El régimen de dosificación involucrado en un método para el tratamiento de las condiciones anteriormente descritas será determinado por el médico que atiende, considerando los diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo la edad, la condi-ción, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, tiempo de administración u otros factores clínicos. En general, el régimen diario debe estar en el intervalo de 0.1-1000 microgra-mos de proteína del ligando Mpl o fragmento de la misma por kilogramo de peso corporal. Los métodos terapéuticos, composiciones y polipéptidos de la presente invención pueden también ser empleados, solos o en combinación con otras citoci-ñas, con el receptor Mpl soluble, con factores hemato-poyéticos, con interleucinas, con factores de crecimiento o con anticuerpos, en el tratamiento de los estados de enfermedad caracterizados por otros síntomas, así como las deficiencias de plaquetas. Se anticipa que una molécula de ligando Mpl probará ser útil en el tratamiento de algunas formas de trombocitopenia en combinación con estimuladores generales de la hematopoyesis, tales como IL-3 o GM-CSF. Otros factores estimuladores megacariocíticos , por ejemplo, meg-CSF, el factor de células totipotenciales (SCF), el factor inhibitorio de la leucemia (LIF) , la oncostatina M (0SM), u otras moléculas con actividad estimulante de megacariocitos, pueden también ser empleadas con el ligando Mpl. Las citocinas ejemplares adicionales o los factores hematopo-yéticos para tal co-administración incluyen IL-1 alfa, * IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 , IL-11, factor 1 de estimulación de colonias (CSF-1), GM-CSF, factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF), EPO, interferón-alfa (IFN-alfa), IFN-beta, o IFN-gama. 5 Puede además ser útil el administrar, ya sea simultánea o secuencialmente, una cantidad efectiva de un receptor Mpl mamífero, soluble, el cual parece tener un efecto de provocar que los megacariocitos se fragmenten en plaquetas una vez que los megacariocitos han alcanzado i la forma madura. De este modo, la administración del ligando Mpl ( para aumentar el número de megacariocitos maduros) seguido por la administración del receptor Mpl soluble (para inactivar el ligando y permitir que los megacariocitos maduros produzcan plaquetas) se espera que sea un medio particularmente efectivo de estimulación de la producción de plaquetas. La dosis anteriormente mencionada podría ser ajustada para compensar tales componentes adicionales en la composición terapéutica. El progreso del paciente tratado puede ser verificado periódicamente mediante métodos convencionales. Otros usos para estos polipéptidos novedosos son en el desarrollo de anticuerpos generados mediante métodos estándares. De este modo, los anticuerpos que reaccionan con los ligandos Mpl de la presente inven- 25 cidn, así como ''lo»"-fragmentos- reactivos de tales anti-cuerpos están también contemplados. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, recombinantes, quiméricos, de cadena simple y/o biespecí fieos , etc. Los fragmentos de anticuerpos pueden ser cualquier frag-mentó que sea reactivo con el ligando Mpl de la presente invención, tales como Fab, Fab ' , etc. También proporcionados por esta invención están los hibridomas generados mediante la presentación del ligando Mpl o un fragmento de los mismos como un antígeno a un mamífero selec-cionado, seguido por la fusión de células (por ejemplo células de bazo) del animal con ciertas células cancerosas, para crear líneas celulares inmortalizadas mediante técnicas conocidas. Los métodos empleados para generar tales líneas celulares y los anticuerpos dirigidos contra todo o porciones de un polipéptido del ligando Mpl humano de la presente invención, están también abarcados por esta invención. Los anticuerpos pueden ser usados terapéuticamente, tal como para inhibir el enlace del ligando Mpl y su receptor. Los anticuerpos pueden además ser usados para fines diagnósticos in vivo e in vitro, tal como en la forma marcada' para detectar la presencia del ligando Mpl en un fluido corporal. i í5- Los siguientes ejemplos son incluidos para ilustrar más completamente la presente invención. Además, estos ejemplos proporcionan las modalidades preferidas de la invención, pero no quiere decir que limiten el alcance de la misma, a no ser como se indique. Los métodos estándares para muchos de los procedimientos descritos en los siguientes ejemplos, o los procedimientos alternativos adecuados, se proporcionan en manuales ampliamente reconocidos de biología molecular tales como, por ejem-* ® pío, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (198.7). y en Ausubel y colaboradores (Eds), Current Protocols in Molecular Biology, Greene associates/Willey Inters- cience, New York (1990). 15 EJEMPLO 1 Plasma Canino Aplástico Plasma canino aplástico heparinizado (2APK9") o plasma canino normal ("NK9") se produjo como se describe en las siguientes publicaciones, excepto que fueron distribuidos 450 rads de radiación corporal total a los recipientes: . 25 1. Mazur, E. y South, K. Exp. Hematol. 13:1164-1172 (1985). 2. Amaga, M., South, K., Cohén, J.L., y Mazur, E.M. Blood 69: 486-492 (1987). 3. Mazur, E., Basilico, D., Newton, J.L., Cohén, J.L., Charland, C, Sohl, P.A., y Narendran, A. Blood 76:1771-1782 (1990).

EJEMPLO 2 Ensayo de Megacariocitos Humanos Se ensayaron el APK9 y el APK9 fraccionado, para la habilidad de estimular el desarrollo de megaca-riocitos humanos a partir de células progenitoras CD34 Las células seleccionadas de CD34 fueron obtenidas de células de sangre periférica como se describe (Hokom, M.H., Choi, E., Nichol., J.L., Hornkohl, A., Arakawa, T., y Hunt, P. Molecular Biology of Haematopoiesis 3:15-31,1994) y se incubaron en el siguiente medio de cultivo: medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM; GIBCO, Grand Island, NY) suplementado con 1% de Glutamine Pen-strep (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) y 10% de plasma AB humano, pobre en plaquetas, heparinizado # Tam-bien se incluyeron 2-mercaptoetanol( 10 M) , ácido pirúvi-xo (110 ug/ml), colesterol (7.8 ig/ml), adenosina, guanina, citidina, uridina, timidina, 2-desoxicitosina , 2-desoxiadenosina , 2-desoxiguanosina (10 ug/ml cada uno, Sigma); insulina recombinante humana (10 ug/ml), trans-ferrina humana (300 ug/ml), lípidos de frijol de soya (1%, Boehringer Mannheim, Indianapolis , IN); factor de crecimiento de fibroblastos, básico, recombinante, humano (2 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA); factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (15 ng/ml), factor de crecimiento derivado de plaquetas (10 ng/ml, Amgen, Inc., Thousand O.aks , CA) .. Las células seleccio-madas de CD34 se colocaron en placa a 2x10 /mi de medio de cultivo, 15 ul de volumen final, en pozos de placas de microtitulación estilo Terasaki (Vanguard, Inc., Neptune, NJ) . Las células de incubaron a 37°C por 8 días en cajas humidificadas en 5% de C0~ en aire, fijadas directamente a los pozos de cultivo con 1% de glutaraldehído, y se incubaron con un coctel de anticuerpos monoclonales (anti-GPIb, anti-GPIIb, (Biodesign) y anti-GPIb (Dako, Carpintería, CA). La reacción inmune se desarrolló con un sistema de detección de estreptavi-dina-beta-galactosidasa (HistoMark, Kirkegaard y Perry). Los megacariocitos, identificados por un color azul, fueron contados con un microscopio de fase invertida a una amplificación de 100X. Los resultados se presentaron como el número promedio de megacariocitos por pozo +/-el error estándar de la media (SEM). En algunos casos, los datos se presentaron en términos de "unidades de megacar iocitos/ml ", donde el grado al cual una muestra dada indujo el desarrollo de los megacariocitos, fue normalizado al control APK9 positivo para ese experimento. Una unidad es definida como la cantidad que da como resultado el mismo número de megacariocitos que 1 ul de APK9 estándar. La actividad fue aceptada como debido a que el ligando de MPL si éste pudo ser bloqueado con 5-10 ug/ml de MPL-X (receptor Mpl soluble). Se ha demostrado que APK9 contiene el factor o factores que estimulan el desarrollo de- megacariocitos humanos en este sistema. Las células seleccionadas de CD34 incubadas con 10% de NK9 por 8 días, muestran un número despreciable de megacariocitos teñidos de azul, mientras que las células seleccionadas de CD34 incubadas con 10% de APK9 por 8 días, muestran un número mucho mayor de megacariocitos teñidos de azul. L Figura 2 muestra que concentraciones cada vez mayores de Mpl-X agregado al sistema de cultivo de megacariocitos humanos, bloquean cada vez más el desarrollo de los megacariocitos. A concentraciones de Mpl-X mayores de 5 ug/ml, la inhibicidn es completa. En este experimento, las células seleccionadas de CD34 se esti-~- mularon con 5% de APK9. Esto demuestra que una actividad que interactúa con Mpl-X (ligando Mpl presunto) es nece- ria para el desarrollo de megacariocitos humanos, e implica que el ligando Mpl está presente en APK9 mismo. 5 Se he demostrado adicionalmente en la presente, que la actividad del ligando Mpl, necesaria para el desarrollo de megacariocitos humanos, está presente en APK9. Se diluyó APK9 (135 mi) a 6 veces en medio de Iscove y se aplicó a una columna de afinidad de Mpl-X. El material -ÍO no enlazado (flujo al través) fue recolectado y concentrado hasta el volumen original antes del ensayo. El material enlazado se eluyd en 10 mi de cloruro de sodio 1 M, y 20% del combinado se diafiltró y se concentró a 4 veces para el ensayo. Las células seleccionadas de CD34 incuba- 15 das en medio solo, no se desarrollaron en megacariocitos. Las células incubadas en un 5% de APK9 (mismo combinado que el aplicado a la columna) se desarrollaron en 40 +/- 8 megacariocitos por pozo. Las células incubadas en 10% del material no enlazado no se desarrollaron en megacariocitos. Las células incubadas en 10% del combinado de elución se desarrollon en 120 +/- 44 megacariocitos por pozo. Las actividades de la carga de la columna y del combinado de elución fueron substancialmente inhibidas completamente con 5 ug/ml de Mpl-X en el ensayo. 25 EJEMPLO 3 Transfección del receptor Mpl murino o humano en una línea de células murinas A . Receptor Mpl Murino El ADNc del receptor Mpl murino, de longitud completa, se subclonó dentro de un vector de expresión qUe contiene un promotor transcripcional derivado del LTR del virus de Sarcoma Murino de Moloney , 5 ug de esta construcción y 1 ug del plásmido marcador selecciona-ble pWLNeo (Stratagene ) se sometieron conjuntamente a electroporesis en una línea de células murinas dependien-tes de interleucina 3 (32D, clon 23; Greenberger y colaboradores, PNAS 80:2931-2936 (1983)). Las células se cultivaron por 5 días para recuperarse del procedimiento, luego se incubaron en el medio de selección que incluía 800 ug/ml de Geneticina (G418, Sigma) y 1 ng/ml de IL-3 murina. Las células sobrevivientes fueron luego divididas en combinados de 2x10 células, y se cultivaron hasta que se desarrolló una población que pudo ser analizada posteriormente. Se probaron seis poblaciones para la expresión superficial del receptor Mpl mediante análi-sis FACS usando un suero antipéptido de conejo, policio- -í nal. Se eligió una población para la clasificación por FACS usando el mismo suero antipeptídico que el que se mencionó anteriormente. Los clones de células simples de la línea celular progenitora se seleccionaron mediante 5 crecimiento en 10% de APK9 y Geneticina. Después de la selección en APK9 por 35 días, las células se mantuvieron en 1 ng/ml de interleucina 3 murina. Uno de los subclones, 1A6.1, se usó para este cuerpo de trabajo. í 0 B . Receptor Mpl Humano La secuencia del receptor Mpl humano de longitud completa ( Vigori, I., y colaboradores, PNAS 89:5640-5644 (1992)) se subclond dentro de un vector de expresión 15 que contenía el promotor tanscrípcional del virus del Sarcoma Murino de Moloney (el mismo vector que con el receptor murino). Seis ug de esta construcción y 6 ug de una construcción de empaquetamiento retroviral anfotrdfica (Landau, N.R., Littman, D.R., J. Virology 66: 5110-5113 (1992)) se transfectaron dentro de 3 x 10 células 293 usando un equipo de transfeccidn de mamífero de CaPO^ (Stratagene). Las mismas células se retrans- fectaron después de 2 días y nuevamente después de 4 días. El día después de la última transfección, las célu- 25 las 293 se co-cultivaron con la línea de células murinas J._ dependientes de IL-3 (32D, clon 23; Greenberger y colaboradores, PNAS 80: 2931-2936 (1983). Después de 24 horas, las células 32D fueron rescatadas y separadas en bandas en un gradiente de BSA (Path-o-cyte; Miles Inc.). Las células se expandieron en 1 ng/ml de IL-3 murina y luego se seleccionaron para el crecimiento en 20% de APK9. Las células se clasificaron para la expresión en la superficie celular del receptor mediante FACs , usando un suero antipeptídico de conejo, policlonal. Estas célu- ¿? las se usaron subsecuentemente en los ensayos.

EJEMPLO 4 Ensayo de 1A6.1 para el ligando Mpl 1 Se lavaron células 1A6.1 libres de IL-3 de cultivo y se volvieron a colocar en placa (1000 células/15 ul de volumen total/pozo) en placas de microtitulación estilo Terasaki en MEM alfa (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal de ternera (FCS), Geneticina (800 ug/ml) y 1% de pen/strep (Gibco) en diluciones 1:1 en serie de las muestras de prueba. Después de 48 horas, el número de células viables por pozo se determinó microscópicamente. Una unidad de actividad se definió como aquella cantidad de actividad que did como resultado 200 células viables por pozo. La actividad se definió como debida al ligando Mpl, si éste puso ser completamente bloqueado mediante la inclusión de 5-10 ug/ml de Mpl-X en el ensayo. La actividad del ligando Mpl en APK9 promedió 4400 +/- 539 unidades/ml de plasma aplástico. A no ser que se indique de otro modo, las unidades de la actividad de ligando Mpl' son definidas en el ensayo 1A6.1. Los ensayos con células transfectadas con el gen del receptor Mpl humano (Ejemplo 3B) fueron llevados a cabo esencialmente de la misma -manera :que con las células 1A6.1.

EJEMPLO 5 Demostración de que el ligando Mpl está presente en plasmas o sueros aplásticos de ratón, perro, cerdo y humano El ligando Mpl está presente en el plasma o en el suero aplástico de fuentes murinas, caninas, porcinas y humanas (Tabla 2). El plasma se recolectó a partir de la pre-irradiacidn de ratones BDFl y 12 días después de la irradiación (500 rads)* El plasma se tratd en un ensayo 1A6.1, donde éste demostró una actividad de 2000 unidades/ml, que fue substancialmente completamente inhi- bible con Mpl-X (10 ug/ml) • El plasma de ratón irradiado fue también positivo en el ensayo de megacariocitos humanos, donde éste mostró una actividad de 1833 unidades/ml. El plasma se recolectó de perros antes de la irradiación y 10 días después de la irradiación (450 rads). El plasma se probó en el ensayo 1A6.1 y en los ensayos de megacariocitos humanos. La actividad se detectó y fue completamente inhibida por Mpl-X (10 ug/ml) en ambos ensayos. o Se recolectó plasma de cerdos antes de la irradiación y 10 días después de la irradiación (650 rads). El plasma se probó en el ensayo 1A6.1 y en los ensayos de megacariocitos humanos. En ambos ensayos éste mostró actividad del ligando Mpl (inhibible por 10 ug/ml de Mpl-X) comparable a aque-i 1 lia encontrada en el plasma canino aplástico. Se obtuvieron sueros provenientes de humanos aplásticos. Este material se recolectó de pacientes con transplante de médula ósea. Los sueros provenientes de 6 pacientes fueron ensayados en el ensayo 1A6.1, donde mostraron una actividad de 903 unidades/ml, 88% de la cual fue debida al ligan- 20 do Mpl (inhibible con 10 ug/ml de Mpl-X). Los sueros provenientes de 14 pacientes aplásticos has sido también probados en el ensayo de megacariocitos humanos. Como un grupo, éstos mostraron actividad substancial, 941 unidades meg/ml, la cual fue completamene inhibible con 10 ug/ml de Mpl-X. Los datos de la IL-3 murina se incluyen para demostrar la especificidad del ensayo 1A6.1. Aunque esta citocina recombinante induce el crecimiento de la línea celular, ésta no es bloqueada por 10 ug/ml de Mpl-X.

Tab l a 2 Es pec i e Ensayo de Células 1A6.1 Ensayo de Meg Humano (unidades/ml ) (unidades de Meg/ml ) medio + Mpl-X medio +Mpl-X Ratón normal 0+/-0 0+/-0 0+/-0 0+/-0 Ratón aplástico 2000 0 1833 no realizado Canino normal 0+/-0 0+/-0 0+/-0 0+/-0 Canino aplástico 4400+/--539 0+/-0 792+/-128 0+/-0 Porcino normal 0+/-0 0+/-0 0+/-0 0+/-1 Porcino aplástico 3866+/-1136 0+/-0 1284+/-182 10+/-10 Humano normal 0+/-0 0+/-0 0+/-0 0+/-0 Humano aplástico 903+/-64 114+/-33 941+/-178 0+/-0 murIL3 6000+/-565 6000+/-565 no realizado no realizado EJEMPLO 6 El ligando Mpl estimula el crecimiento de las células 1A6.1 y el desarrollo de los megacariocitos humanos El ligando Mpl (enriquecido al menos aproximada-mente 100,000 veces después de los procedimientos de cromatografía con lectina y de afinidad; ver Ejemplo 7) estimula el crecimiento de la línea de células 1A6.1 y el desarrollo de megacariocitos humanos a partir de células de sangre periférica seleccionada de CD34, de una manera dependiente de la dosis. La actividad responsable es debida al ligando Mpl como se muestra en las Figuras 2 y 3, ya que las actividades en ambos ensayos pueden ser completamente bloqueadas con Mpl-X. Ha sido también mostrado por los inventores que las células CD34 de sangre periférica, purificadas con FACS, cuando se incuban en ligando Mpl (100 unidades/ml por 9 días en este caso), se desarrollan en megacarioci-tos maduros, fenotípicamente normales. Esto establece que el ligando Mpl purificado tiene el mismo efecto sobre los megacariocitos que el APK9 crudo. Además, este experimen- + + to usó células CD34 purificadas (100% de CD34 ) en oposición a las células seleccionadas por CD34 , las cuales en general son solamente 30 - 50% de CD34 .

EJEMPLO 7 Purificación del Ligando Mpl Canino Resumen Se purificaron las proteínas (de 25 kd y de 31 kd) que muestran las actividades predichas para un ligando para el receptor Mpl. Las proteínas fueron purificadas a partir de plasma de perros irradiados, mediante un esquema que emplea cromatografía de afinidad con aglutinina de germen de trigo (WGA), cromatografía de afinidad del receptor Mpl, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de filtración en gel, y cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa de C4. Ver, Figura 4 para una revisión de este esquema de purificación. Los ligandos Mpl de 25 kd y de 31 kd han sido altamente purificados hasta homogeneidad aparente, y se 1 ha determinado que contienen las secuencias de aminoácidos descritas en la presente.

II Métodos Clarificación de Plasma Plasma congelado (un total de 20 litros) de perros irradiados (ver Ejemplo 1) fue descongelado toda <** la noche a 4°C; el descongelamiento de las botellas mayores se inició a temperatura ambiente por varias horas antes de la colocación en el cuarto frío. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación por 6 horas a 11,000 xg. El plasma se diluyó con solución salina amortiguada de fosfato, pH 7.3, que contenía 0.01% de azida de sodio (PBS/azida) y se filtró a través de un filtro de 1.2 mieras. El procedimiento de clarificación dió como resultado típicamente una dilución aproximada de dos veces del material inicial.

B . Cromatografía de Afinidad con Aglutinina de Germen de Trigo Todas las operaciones se llevaron a cabo a 4°C. El plasma clarificado (en dos lotes) se aplicó a una columna de aglutinina de germen de trigo inmovilizada (1 litro, 10 x 12 cm, E Y Laboratories), equilibrada en PBS/azida. Después de la aplicación de la muestra, el material no enlazado se lavó de la columna con PBS/azida, seguido por un lavado con cloruro de sodio 0.5 M en Tris/HCl 20 mM , pH 8. La actividad del ligando Mpl, enlazado por la columna WGA, se eluyó con N-acetilgluco-samina 0.35 M (GlcNAc), cloruro de sodio 0.5 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8. La actividad del ligando Mpl no pudo ser detectada en el flujo al través o en las fracciones del lavado .

Cromatografía de Afinidad del Receptor Mpl-X El receptor Mpl murino soluble (Mpl-X) que 5 se usó, correspondió al dominio extracelular completo del receptor Mpl menos Trp en la posición 483 (ver Vigon y colaboradores, 8: 2607-2615 (1993)). Con el fin de optimizar el enlace del ligando Mpl a la columna de afinidad del receptor Mpl-X, el combinado de elución de WGA se l ? concentró usando un ultrafiltro membranal (corte de peso molecular de 10,000, YM-I0, Amicon) y cloruro de sodio ajustado a 0.2 M mediante dilución subsecuente . El combinado de WGA concentrado se aplicó a una columna de sefarosa activada con 20 mi de m-Mpl-X (receptor soluble Mpl murino)/CNBr (2.6 x 4.2 cm, 1.5 mg de m-Mpl-X por mi de resina) a una velocidad de flujo de 0.9 ml/min. La columna se lavd con 40 mi de PBS/azida a 1.5 ml/min, seguido por un lavado con alta concentración de sal (405 mi) con Tris-HCl 10 mM , cloruro de sodio 1 M, CHAPS 1 mM , pH 8.0. La columna fue luego eluida con CAPS 20 mM , cloruro de sodio 1 M, CHAPS 5 mM , pH 10.5. Las fracciones apropiadas se recolectaron. El Tris se agregó a cada fracción para neutralizar el pH. El SDS-PAGE y la absorbancia a 280 nm del oc perfil de elución de una columna de afinidad del receptor - - Mpl-X, revelan un pico temprano de proteína en las fracciones 1-4, mientras que la mayor parte de la actividad del ligando Mpl eluyó después de la fracción 5.

D . Columna de Intercambio Anidnico de Mono-Q Las fracciones de más alta pureza provenientes de varias columnas de afinidad del receptor Mpl-X se combinaron, se concentraron, y se diafiltraron contra Tris-HCl 20 mM , CHAPS 5 mM, pH 8.7 hasta un volumen final de 58.5 mi. La concentración de proteína del combinado se estimó mediante absorbancia a 280 nm como de 0.12 mg/ml (aproximadamente 7 mg de proteína total). El combinado se cargó a 0.5 ml/min sobre una columna Mono Q HR 5/5 (Pharmacia) equilibrada en Tris-HCl 20 mM , CHAPS mM , pH 8.7. La columna se eluyó con un gradiente lineal hasta NaCl 0.36 M en el mismo amortiguador por 27 minutos. La columna fue luego lavada con un gradiente de 6 minutos hasta NaCl 0.54 M, y finalmente con un lavado de un solo paso a NaCl 0.9 M. Se recolectaron fracciones de 1 mi. El perfil de elución de la columna Mono Q muestra que ningún ligando Mpl, y la proteína despreciable, pudieron ser detectados en el flujo al través y en las fracciones del lavado. Mucha de la actividad del ligando Mpl eluye en las fracciones 5-7, durante las etapas iniciales del gradiente con NaCl. Un "hombro" de actividad es observado en las fracciones 8-10, seguido por un segundo pico mayor que comprende las fracciones 11-15. Se observa una banda distinta de 25 kd mediante SDS-PAGE (no reductor) en las fracciones activas. La intensidad de la banda corresponde directamente con la actividad del ligando Mpl en las fracciones. La banda estuvo ausente en las fracciones 3 y 4 (no actividad). Esta fue prominente en las fracciones 5 y 6 (pico de actividad de 1A6.1) y una banda similar, teñida intensamente, estuvo presente en las fracciones 11-14 (pico de actividad de 1A6.1). La banda es tenue en el combinado de las fracciones 15 y 16, que corresponde con la actividad significativamente menor en la fracción 16.

E . Experimentos de Elución en Gel Los experimentos de elución en gel fueron realizados usando alícuotas de las fracciones 5 y 6 de Mono Q y las fracciones 13 y 14 de Mono Q. Para estos experimentos, los combinados de las fracciones 5 y 6 (de 6 microlitros cada una) o de 13 y 14 (de 7.5 microlitros cada una) fueron realizadas, mezcladas con amortiguador de muestra de SDS-PAGE (no reductor), y aplicados a - - geles de SDS al 12%. A la terminación de la electroforesis, las bandas de interés fueron extirpadas (1 mm) y las rebanadas fueron cortadas en piezas menores con navajas de rasurar. Las piezas se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1.5 mi que contenían 0.5 mi de PBS/CHAPS 5 mM, y se agitaron suavemente toda la noche a 4°C. Al siguiente día los tubos fueron centrifugados brevemente, se retiró una alícuota, y la muestra se diafiltró contra medio de Iscove suplementado con BSA como una proteína portadora. Las muestras diafiltradas fueron sometidas para el ensayo. Los resultados revelan que pueden ser observados dos picos de la actividad del ligando Mpl. Un pico corresponde a la región de 25 kd del gel, mientras que un segundo pico de la actividad del ligando Mpl se observa en la región de 31 d.

Filtración en Gel Superdex 200.

Las fracciones 13-16 provenientes de la columna de intercambio aniónico Mono Q, así como dos fracciones equivalentes provenientes de un segundo fraccionamiento con Mono Q, se combinaron y se concentraron usando un ultrafiltro de membrana (Centricon-10 , Amicon). Se agregó SDS hasta una concentración final de 0.1%, y la muestra se inyectó sobre una columna Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia). La columna se equilibró en Tris-HCl 50 mM , SDS al 0.1%, pH 7.5, a una velocidad de flujo de 0.3 ml/min, y se operó a temperatura ambiente. Se recolectaron las fracciones de un minuto. Los resultados fueron que la mayor parte de la proteína en la muestra eluye en las fracciones 32-40, mientras que la actividad del ligando Mpl es detectada en las fracciones 42-46. El análisis de las fracciones SDS-PAGE mostró una banda distinta de 25 kd en las fracciones activas.

G . Cromatografía Líquida de Alta Resolución de Fase Inversa de C4 Las fracciones 43-46 de Superdex 200 combinadas o la fracción 42 sola, fueron concentradas usando un ultrafiltro de membrana (Microcon-10 , Amicon). Los combinados concentrados fueron separadamente aplicados a una columna de microperforación de fase inversa C4 de 1 x 100 mm (SynChropak RP-4). La columna se equilibró en TFA al 0.04% en agua (amortiguador A); el amortiguador B fue TFA al 0.035% en acetonitrilo al 80%. Después de la inyección de la muestra, se realizó un gradiente lineal hasta 45% de B en 4 minutos, seguido por un gra-diente lineal hasta 75% de B en 40 minutos. La velocidad de flujo fue de 75 microlitros/min . Los resultados de la purificación de la fracción 42 se presentan en la Figura 5. Los picos de actividad del ligando Mpl, distintivos, fueron observados en las fracciones 21-23. Estas fracciones fueron analizadas en un gel de poliacrilamida al 14%, bajo condiciones reductoras y no reductoras. La fracción 21 estuvo compuesta de una banda simple de 31 kd; la fracción 23 estuvo compuesta de una banda simple, ancha de 25 kd; y la fracción 22 contenía bandas en la región de 25 kd y de 31 kd. No fueron visibles otras bandas significativas. Nótese que los primeros experimentos de elución en gel habían asignado la actividad del ligando Mpl a estas dos regiones. Una banda simple de alto peso molecular, menor, se observó en todas las fracciones del gel no reductor, pero no pudo ser observada en el gel reductor .

H . Análisis de la Secuencia N-terminal de los ligandos Mpl de 25 kd y de 31 kd.

El análisis de la secuencia N-terminal se llevó a cabo sobre fracciones de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa C4 que contenían la actividad. Las secuencias determinadas para estas proteínas se reportan anteriormente. Además de la secuencia mayor que corresponde a la banda de 25 kd (al menos 90% del total de la muestra aplicada), el secuenciamiento detectó dos secuencias menores (las cuales estuvieron asociadas con la banda contaminante menor, descrita en la parte G ante-rior). Las comparaciones con secuencias conocidas revelaron que las secuencias menores fueron la cadena kappa y la cadena pesada de la Ig canina. Si se desea, estas impurezas menores pudieron ser además reducidas en cantidad mediante la aplicación de otro paso más de purificación, tal como preferentemente otro paso de filtración en gel.

I . Comparación de las actividades del ligando Mpl en las fracciones purificadas con C4 La Figura 6 muestra los datos que demuestran que las actividades presentes en las fracciones 22 y 23 provenientes del paso de cromatografía de HPLC de fase inversa de C4 son substancialmente equivalentes. La fracción 22 contenía una mezcla de las bandas de 25 kd y de 31 kd, mientras que la fracción 23 contenía únicamente la banda de 25 kd. Las alícuotas de cada fracción fueron diluidas a 1:45000. Las fracciones diluidas estimularon substancialmente igual el crecimiento de las células 1A6.1, (fracción 22, 5400 células por pozo; frac-cidn 23, 6000 células por pozo). Las fracciones diluidas se incubaron con concentraciones crecientes de Mpl-X. Las fracciones fueron igualmente sensibles a la inhibición por parte de Mpl-X, siendo ambas completamente bloqueadas con 7 - 1.4 icrogramos/ml . Esto indica que la proteína o proteínas activas en cada fracción son la especie del ligando Mpl con actividad biológica equivalente .

EJEMPLO 8 Comparación del ligando Mpl a otros factores sobre el desarrollo de megacariocitos Se ha reportado que un número de factores recombinantes o compuestos orgánicos tales como el acetato forbol-mirístico (PMA) impactan el crecimiento o el desarrollo de los megacariocitos. En consecuencia, los efectos de estos factores sobre las células de sangre periférica seleccionadas con CD34 fueron investigados. La interleucina 3 recombinante humana (IL-3, 1-2 ng/ml), el factor de células totipotenciales (SCF, 50 ng/ml), interleucina 6 (IL-6, 25 ng/ml), eritropoyetina (EPO, 1 unidad/ml), factor inhibitorio de la leucemia (LIF, 10 ng/ml), y el factor de estimulación de colonias granulo-citos-macrófagos (GM-CSF, 25 ng/ml, Amgen, Inc.); inter-leucina 11 (IL-11, 25 ng/ml, R+D Systems, Minneapolis, MN); acetato forbol-mirístico (PMA, 10 M, Sigma) se agregaron a los cultivos como se indicó. El ligando Mpl se usó a 275 unidades por mi, el APK9 se usó al 5% (equivalente a 220 unidades/ml). Los factores probados en la combinación fueron a la misma concentración que cuando se probaron individualmente. Después de 8 días en el cultivo, las células fueron fijadas directamente en los pozos, y teñidas para los megacariocitos (n=6 pozos por condición) o se contaron para el número de células totales (n=*3 pozos por condición). Los datos se presentaron como la media +/- SEM. La Figura 7 muestra que APK9 y el ligando Mpl dieron como resultado el mayor número de megacarioci-tos por pozo. La IL-3 también dió como resultado el desarrollo de megacariocitos, especialmente en combinación con SCF. IL-6, IL-11, o EPO tuvieron poco efecto sobre el número de megacariocitos, ya sea solos o en combinación con IL-3. PMA, LIF y GM-CSF tuvieron poco efecto. En la Figura 8 están los datos del mismo experimento, que muestran el número total de células encontradas por pozo ( "celularidad") . APK9 y el ligando Mpl tuvieron poco efecto sobre la celularidad, mientras que IL-3 y SCF tuvieron efectos modestos. SCF e IL-3 en combínacidn tuvieron los mayores efectos. Los datos mostrados en las Figuras 7 y 8 fueron usados para calcular los porcentajes de megacariocitos por pozo, como se muestra en la Figura 9. Claramente, el factor que da como resultado el mayor porcentaje de megacariocitos por pozo de cultivo es el ligando Mpl, el ingrediente activo en APK9. Esto es indicativo de la especificidad del ligando Mpl hacia los megacariocitos.

EJEMPLO 9 La actividad promotora de megacariocitos del ligando Mpl no es dependiente de la IL-3 humana El ligando Mpl estimula el desarrollo de ega-cariocitos humanos, cuando se usa como un suplemento al medio de cultivo descrito en el Ejemplo 2. Aunque IL-3 no es un ingrediente del medio, éste pudo estar presente en niveles indetectablemente bajos en el plasma humano normal presente en el medio. Sin embargo, aún si está presente, la IL-3 no está involucrada en la megacariopo-yesis inducida por el ligando Mpl. Esto se muestra en la Figura 10. IL-3 a 2 ng/ml contiene una actividad en el ensayo meg humano de 14,900 unidades meg/ml. Esta actividad es inhibida al 97% con anti-IL-3 (3.3 microgra-mo/ml; Genzyme, Cambridge, MA). El ligando Mpl a 8203 unidades meg/ml no fue inhibido con anti-IL-3.

EJEMPLO 10 Análisis del ligando Mpl porcino Resumen Las proteínas provenientes de plasma de cerdo irradiado, con actividad del ligando Mpl, se caracterizaron con cromatografía de afinidad WGA, cromatografía de afinidad al receptor Mpl, cromatografía de intercambio ióico y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa C4. La actividad fue también caracterizada mediante la elución a partir de las rebanadas provenientes de los geles de SDS-poliacrilamida .

Cromatografía Comentarios Columna de afinidad WGA 4.4 x 10 unidades aplicadas, 3.4 x 10 unidades recuperadas Columna del receptor Mpl 2.7 x 10 unidades aplicadas, 2.4 x 10 unidades recuperadas - - Cromatografía Comentarios ( Continuación ) Intercambio iónico Mono S 2.4 x 10 unidades aplicadas pH 6.0 4.4 x 10 unidades recuperadas HPLC de fase inversa C4 Actividad recuperada de las fracciones 23-25 Experimentos de elución Dos actividades claramente distinguien gel das, una aproximadamente de 18. kd, y la otra aproximadamente 28 kd.

EJEMPLO 11 Clonacidn del ligando Mpl Humano, MGDF Humano Se describen dos procedimientos en seguida: * • Primer Experimento de Clonación Ejemplar A. Generación de la sonda MGDF humana Un número de cebadores PCR degenerados se designaron con base en la secuencia amino-terminal de la proteína canina. Se usaron diferentes pares cebadores para amplificar el gen MGDF a partir del ADN genómico humano. Después de 40 ciclos de amplificación, usando los cebadores en sentido 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SEQ ID NO: 4), que codifica para los primeros cinco aminoácidos de la proteína canina (SEQ ID NO: 1) y el cebador antisentido: 5' GCA RTG YAA CAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO: 5), que codifica para los aminoácidos 16 al 21 de la SEQ ID NO: 1, el producto de PCR se corrió sobre un gel de agarosa al 2.0% en amortiguador TBE. La banda de 63 pares de bases fue cortada del gel de agarosa y reamplif icada usando el mismo grupo de cebadores. El producto de PCR se clonó en el vector PCR II (Invitrogen, San Diego). Se seleccionaron un número de colonias mediante secuenciamiento de ADN. El ADN plasmídico que codifica para un péptido similar a la proteína MGDF canina, se usó como la fuente para generar una sonda radioactiva, para seleccionar las bibliotecas de ADNc. La secuencia de aminoácidos codificada por el fragmento genético es como sigue: Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SEQ ID NO: 6) La banda de agarosa que contenía el MGDF humano se usó para generar la sonda mediante PCR caliente. Una - - reacción de PCR típica de 100 microlitros contuvo los siguientes ingredientes: ADN plantilla 2-3 µl cebador 5' (SEQ ID N0:4) 1 µ l , 20 pmoles cebador 3' (SEQ ID N0:5) 1 µ l , 20 pmoles amortiguador 10 X 10 µ l dATP (0.1 mM) 2 ni dTTP (10 mM) 2 µ l dGTP (10 mM) 2 µ l dCTP (0.1 mM) 2 p dCTP, p32 (10 µC/µl) 5 µl dATP, p32 (10 µC/µl) 5 µl ADN-polimerasa Taq 0.5 µl, 2.5 unidades agua 77 µ l volumen total 100 µl Las condiciones de amplificación fueron como sigue calentamiento inicial 94°C, 2 min recocido 53°C, 30 seg extensión 72°C, 30 seg desnaturalización 94°C, 30 seg se llevaron a cabo 40 ciclos de amplificación en un Sistema 9600 de Perkin Elmer GeneAmp. El producto- se purifió mediante el paso de éste a través de una columna de empuje (Stratagene, San Diego). 1 µl de la sonda se contó en un contador de cintilación. Las sondas que contenían de 1 a 3 millones de cuentas por mi, se agregaron a la mezcla de hibridación .

Construcción de la biblioteca de hígado fetal El ARN poliA de hígado fetal humano se adquirió de Clontech Laboratories. Se usaron aproximadamente 4 microgramos de ARN para la síntesis del ADNc, en el cual el cebado se llevó a cabo usando un hexámero aleatorio, 5' GTA CGC GTT CTA GAN NNN NNT 3', (SEQ ID NO: 7) unido a un oligo que contenía un sitio Xba I. Se usó el protocolo Gibco-BRL para generar el ADNc de doble hebra. El adaptador Eco R I-Bst X I (Invitrogen, San Diego) se ligó al ADNc de doble hebra, seguido por la digestión con la enzima de restricción, Xba I. La selección del tamaño del ADNc se llevó a cabo en una columna de Sephacryl S500 (Life Technologies, Inc.). Los ADNcs mayores de 400 pares de bases se ligaron al vector de expresión de mamífero vl9.8 (Martin, F., Cell 63: 203-211 (1990)) el cual fue ya digerido con Eco Rl y Xba I. Células competentes de E. coli DH10 se transformaron y la biblioteca de ADNc resultante se dividió en 7 combinados de 100,000 ADNc cada uno.

C. Selección de la biblioteca lambda Una biblioteca de riñdn fetal humano en lambda gtll se compró de Clontech con un título de 650 millones de pfu/ml. Se seleccionaron aproximadamente 2 millones de placas con una sonda generada mediante PCR (ver arriba). La hibridación se realizó en 6 X SSC, 5 X Denhardt, SDS al 0.1%, 100 ug/ml de ADN de esperma de salmón de una sola hebra, por 15 horas a 56°C. Se llevaron a cabo rondas múltiples de selección. El ADN se amplificó a partir de las placas simples y se hibridó con el cebador interno 5' AGT TTA CTG AGG ACT CGG AGG 3' (SEQ ID NO: 8) que codifica para los aminoácidos 7 al 13 en la SEQ ID NO: 6, para identificar los positivos reales.

D . Amplificación Rápida del cebador 3 de los Extremos de ADNc (RACE) El ARN poliadenilado proveniente de riñon fetal humano y de hígado fetal se compraron a Clontech.

Un microgramo de ARN se transcribió inversamente usando el oligo 5' TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT. TTT TTT TTT 3' (SEQ ID NO: 9) como el cebador. El equipo de síntesis de ADNc de Gibco-BRL (Life Technologies, Inc., Cat. #18267-013) se usó para generar la primera hebra de ADNc. El volumen final fue de 30 microlitros. La reacción se detuvo mediante la adición de EDTA 500 mM hasta una concentración final de mM , y se mantuvo a -20°C. Para la PCR inicial, se usaron 0.5 microlitros de ADNc como la plantilla por reacción. El cebador SEQ ID NO: 9 y el oligo competidor 5' TTC GGC CGG ATA GGC ctt ttt t?t ttt tt_p 3, (SEQ ID N0; 1Q) ge usaron como los cebadores antisentido, mientras que el oligonucleóti-do 5' TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3' (SEQ ID NO: 11) que codifica para los aminoácidos 5 al 11 de la SEQ ID NO: 6, se usd como el cebador en sentido. Se llevaron a cabo cuarenta ciclos de amplificación usando el siguiente protocolo: 94°C, 30 segundos; 65°C, 30 segundos; 72°C, 30 segundos, después de una incubación inicial de 2 minutos a 94°C. Se usó un Sistema 9600 de Perkin Elmer GeneAmp para la amplificación. El empaquetamiento se llevó a cabo usando el cebador en sentido 5' GAG TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3' (SEQ ID NO: 12) que codifica para los aminoácidos 8 al 14 de la SEQ ID NO: 6, mientras que la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10 sirvieron como los cebadores antisentido. Se llevaron a cabo cuarenta ciclos de amplificación con el recocido a 65°C. Los productos de PCR se corrieron sobre un gel de agarosa al 0.8% y luego se fotografiaron bajo luz ultravioleta. Fueron visibles las bandas alrededor de 0.8 a 1.2 kb . Los productos de PCR fueron luego clonados en el vector PCR II (Invitrogen). Las colonias individuales se recogieron y los plásmidos se aislaron usando los equipos de Qiagen cat # 12143 y 12145. El secuenciamiento cebado con colorante, de doble hebra, se realizó usando los cebadores de vector. Las secuencias se analizaron mediante diversos tipos de dotación lógica informática (software) de GCG.

Extensidn del cebador 5' y 3' Con el fin de aislar la secuencia del gen MGDF de longitud completa, se llevaron a cabo extensiones del cebador 3' y 5', usando diferentes combinados de la biblioteca de hígado fetal, como la plantilla. Para la amplificación del cebador 5 del ADNc, se usaron aproximadamente 20 ng de ADNc de cada combinado, como la planti-lia. Se usaron un cebador antisentido específico de MGDF 5' GGA GTC ACG AAG CAG TTT AC 3' (SEQ ID NO: 13) que codifica para los aminoácidos 12 al 17 de la SEQ ID NO: 6 y el cebador en sentido vl9.8 del vector 5', 5' CCT TTA CTT CTA GGC CTG 3' (SEQ ID NO: 14). La ampli-ficación se llevó a cabo por 30 ciclos con recocido a 53°C. El empaquetamiento se realizó para 30 ciclos con los cebadores antisentido 5' GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3' (SEQ ID NO: 15) que codifica para los aminoácidos 1 al 6 de la SEQ ID NO: 6, y el cebador de vector de la SEQ ID NO: 14. Para la extensión con cebador de los extremos 3' de los ADNcs de MGDF, se usaron el cebador de vector antisentido 5' GGC ATA GTC CGG GAC GTC G 3» (SEQ ID NO: 16) y el cebador específico de MGDF 5T TCC TCC TGC TTG TGA CCT C 3' (SEQ ID NO: 17) que codifica para los aminoácidos 1 al 6 de la SEQ ID NO: 6. La amplificación se llevó a cabo por 30 ciclos con recocido a 58°C. La amplificación de empaquetamiento por 30 ciclos se realizó usando el cebador de MGDF SEQ ID NO: 12 y cebador de vector SEQ ID NO: 16. Las bandas especí- - - 1. ficas aparecieron en los números de combinado 1, 7 y 8, los cuales fueron clonados en el vector PCR II. El ADN plasmídico purificado proveniente de colonias simples se purificó y se secuenció. 5 F . Aislamiento de los clones de longitud completa de MGDF humano Muchos de los clones iniciales carecieron de t O parte del extremo amino de MGDF, ya que parte de la secuencia de MGDF se usó para el cebado, y el empaquetamiento. El cebador 5' CCA GGA AGG. ATT CAG GGG A 3' (SEQ ID NO: 18), cuya secuencia se obtuvo a partir de los experimentos de extensión con cebador 5, como se describe 15 anteriormente, se usó como el cebador en sentido. El cebador vector SEQ ID NO: 16 sirvió como el cebador antisentido. Se llevaron a cabo 35 ciclos de amplificación con recocido a 58°C. El cebador específico de MGDF 5" CAÁ CAÁ GTC GAC CGC CAG CCA GAC ACC CCG 3' (SEQ ID 20 NO: 19) con un sitio Sal I y el cebador vector (SEQ ID NO: 15), se usaron para el empaquetamiento por 35 ciclos. El producto de PCR se clonó en el vector PCR II y se secuenció.

II . Segundo Procedimiento de Clonación Ejemplar A. Clonación del ADNc del Extremo N de MGDF Canino Los cebadores oligonuc leotídicos degenerados se designaron con base en la secuencia de aminoácidos N-terminal de MGDF canino, descrita en la sección previa, y se usaron como cebadores en las reacciones en cadena de polimerasa (PCRs) para amplificar las secuencias de ADNc que codifican para MGDF* El ARN total se preparó a partir de muestras de riñon canino mediante el método de isocianato de guanidinio de Chomzynski y Sacchi (Biochem. 162: 156-159 (1987)). La primera hebra de ADNc se preparó con un adaptador de cebador aleatorio 5' GGC CGG ATA GGC CAC TCN NNN NNT 3' ( SEQ ID NO: 20) usando la transcriptasa inversa MoMULV y se usó como plantilla en las PCRs subsecuentes. La PCR se realizó sobre 0.5 microlitros, apro-ximadamente 50 ng del ADNc, usando el cebador 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SEQ ID NO: 4), un cebador de hebra en sentido que codifica para los aminoácidos 1-6 de la SEQ ID NO: 1 , y ya sea el cebador B 5* GCA RTG NAG NAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO: 5) o el cebador C 5' GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO: 21), los - - 1 cuales son cebadores de hebra antisentido que codifican para los aminoácidos 16-21 de la SEQ ID NO: 1 con tres nucleótidos extra en los extremos 5', para incrementar la estabilidad del recocido. La PCR con la polimerasa 5 Taq se realizó por 35 a 45 ciclos, hasta que las bandas del producto fueron aparentes en el análisis de electroforesis en gel de agarosa. Para los primeros dos ciclos de PCR, el paso de recocido se realizó a 37°C por 2 minutos; para el remanente de los ciclos el recocido l O fue a 50°C por 1 minuto. Se observaron múltiples bandas de producto en cada reacción. Las porciones del gel que contenía las bandas de aproximadamente el tamaño esperado (66 pares de bases) se recolectaron con la punta de una pipeta Pasteur y se reamplificaron con el mismo par cebador. Los productos de ADN se clonaron dentro del vector PCR II (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se secuenciaron tres clones y se encontró que codificaban, en un esquema de lectura, para la secuencia de MGDF canina esperada, los residuos 1-21.

De esta manera, la secuencia única de ADNc de MGDF canino se obtuvo abarcando la región desde el tercer nucledtido del coddn 6 hasta el tercer nucleótido del codón 15. Uno de estos clones sirvió como la plantilla para la preparación de una sonda de ADNc de MGDF canino, marcado.

B . Construcción de la biblioteca de ADNc a partir de hígado fetal humano El ARN ha sido aislado de hígado fetal humano (Instituto Internacional para el Avance de la Medicina, Exton, PA) mediante lisis de tejido en tiocianato de guanidinio 5.5 M y purificación vía la centrifugación con CsTFA (Pharmacia). El ARN poliadenilado se seleccionó usando dinaesferas del oligo (dt)25 (Dynal, de acuerdo a la instrucción del fabricante). El ADNc de doble hebra se produjo a partir de este ARN usando el sistema del plásmido Superscript para la síntesis de ADNc (Life Technologies, Inc.) excepto que se usó un diferente adaptador ligador: 5' TTG GTG TGC ACT TGT G 3' (SEQ ID NO: 22) y 5' CAC AAG TGC ACA CCA ACC CC 3' (SEQ ID NO: 23). Después de la selección por tamaño, este ADNc se insertó direccionalmente dentro de los sitios Bst XI y Not I del vector de expresión de mamífero pBCB (pBCB es derivado del plásmido Rc/CMV, Invitrogen, que comp*t de la columna vertebral pucl9, el promotor CMV y el sitio de poliadenilación BGH). El ADN ligado se sometió a electroporesis en la cepa bacteriana electro-competente 10B (Life Technologies, Inc.).

- - C . Selección de la biblioteca de ADNc de hígado fetal humano para MGDF Réplicas de filtro de la biblioteca de hígado fetal humano se hibridaron al producto de PCR de ADNc de extremo N de MGDF canino, radioactivamente marcado (5x SSPE, 2x de Denhardt, pirofosfato de sodio al 0.05%, SDS al 0.5%, 100 microgramos/ml de lisado de ARNt de levadura y 100 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón, desnaturalizado) a 64°C por 18 horas. Los filtros se lavaron a 64°C en 5x de SSPE, 0.5 de SDS y se expusieron toda la noche. Dos diferentes clones que se hibridan a esta sonda se aislaron y se analizaron.

D . Expresión de los clones de ADNc de MGDF humano El ADN purificado de los clones de ADNc de MGDF se transfectó dentro de células 293 EBNA (Invitro-gen). 1.5 microgramos de ADN se mezcló con 7.5 microlitros de Lipofectamina (Life Technologies, Inc.) en 100 micro-litros de DMEM libre de suero. Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente la mezcla de ADN-Lipofectamina se agregd a 5 x 10 células/pozo (una placa Greiner cuadrada de 24 pozos) en 400 microlitros de DMEM, 1% de suero (Fetal Clone II) y se incubó por 6 horas a 37°C. Se agregó a las células 500 microlitros de DMEM, 20% de suero (Fetal Clone II). 16 horas después el medio se aspiró y se agregaron 500 microlitros de DMEM, 1% de suero (Fetal Clone II). 72 horas después los medios condicionados se recolectaron y se centrifugaron a través de un filtro de giro de 0.22 mieras. Los medios condicionados se ensayaron para la actividad biológica de MGDF.

III . Descripción y Actividad de los Clones de MGDF Humanos Con base en las estrategias de clonación ante-riormente descritas, se obtuvieron los clones de ADNc humanos mostrados en la Figura 11 (MGDF-1 y MGDF-2; SEQ ID NOS: 24, 25 y 26, 27) y la Figura 12 (MGDF-3; SEQ ID NOS: 28, 29). Cada una de estas secuencias en las Figuras contiene una secuencia de señal putativa de los aminoáci-dos 1-21, de modo que las proteínas maduras comienzan en el aminoácido 22 en cada caso. Los resultados de los ensayos de actividad usando el ensayo basado en células descrito en el Ejemplo 4A anterior con los MGDFs 1-3, se presentan en las Tablas 3 y 4 siguientes. En la Tabla 3, los medios condicionados - - provenientes de células 293 EBNA transfectadas con cada construcción, fueron recolectadas después de 2 días de cultivo, luego se probaron sobre células 1A6.1 (32D/ mur-MPL+) +/- 10 microgramos/ml mur-MPL-X. En la Tabla 4, los medios condicionados a partir de las células 293 EBNA transfectadas con cada construcción, se recolectaron después de 4 días de cultivo, luego se probaron sobre las células 32D/mur-MPL+ (Ejemplo 3A) y las células 32D/hu-MPL+ (Ejemplo 3B). Como se puede observar, el MGDF-1 y el MGDF-2 humanos, pero no el MGDF-3, se encontró que estaban activos' en las líneas celulares que expresan las formas murina y humana de Mpl. La línea celular que expresa el receptor MPL humano responde más al MGDF-1 y el MGDF-2 humanos que la línea celular que expresa el receptor Mpl murino.

Tabla 3 Clon (- mur-MPL-X) ( + mur-MPLX) Medio 0 0 PBCO (plásmido control) 0 0 MGDF-1 1 2 , 800 800 MGDF-1 (repetición) 1 2 , 800 566 MGDF-2 4 , 525 400 Tabla 3 (cont i n u a c on ) U/ml U/ml Clon (- mur-MPL- •X) (+ mur-MPLX) MGDF-2 (repetición) 12,800 1,131 MGDF-3 0 0 MGDF-3 (repetición) 0 0 APK9 control 4400+/-400 0 Tabla 4 U/ml U/ml Clon 32D/mur-MPL+ 32D/hu-MPL+ MGDF-1 1,600 25,600 MGDF-2 6,400 50,000 MGDF-2 (repetición) 6,400 50,000-100,000 La Tabla 5 siguiente muestra que las actividades de MGDF-1 y MGDF-2 humanos sobre células 32D/hu-MPL+ (Ejemplo 3B) son de manera substancial completamente inhibidas por el receptor mpl humano, soluble (hu-MPL-X). El hu-MPL-X estuvo presente como medios condicionados recolectados de células CHO que producen la proteína. Los medios condicionados hu-MPL-X de CHO se concentraron 120 veces, y luego se agregaron a los cultivos al 6.6%.

Los medios condicionados provenientes de los cultivos de CHO control no tuvieron efecto sobre el ensayo. El ensayo se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 4B, excepto que las células viables fueron valoradas después de 3 días .

Tabla 5 U/ral U/ml Clon (-Hu-MPL-X) (+Hu-MPL-X) MGDF-1 530 0 MGDF-2 270 0 Ensayo de Megacariocitos Humanos MGDF-1 y MGDF-2 pero no MGDF-3 indujeron la formación de megacariocitos a partir de células seleccionadas de CD34 de sangre periférica. El experimento descrito en la Tabla 6 fue realizado esencialmente como se describe en el Ejemplo 2, excepto que las células de sangre periférica fueron seleccionadas por CD34 sin elutriacidn, y el cultivo se cosechó después de 7 días. Los medios condicionados provenientes de cada construcción 293 EBNA MGDF fueron usados a un volumen final de 20% +/- 30 microgramo/ml de mur-MPL-X. Se usó el control APK9 a un volumen final de 6% Tabla 6 Megacariocitos Megacariocitos por Pozo por Pozo Clon (-mur-MPL-X) (+mur-MPL-X) vector control 0 0 APK9 control 100 +/- 3 0 MGDF-1 142 +/- 48 17 +/- 2 l O MGDF-2 100 +/- 3 6 +/- 2 MGDF-2 repetición 86 +/- 10 0 MGDF-3 2 +/- 2 0 EJEMPLO 12 1 El siguiente ejemplo describe la síntesis de 12 diferentes moléculas pegiladas de MGDF, PEG 9 - PEG 12 y PEG 14 - PEG 21. En cada caso, la molécula de MGDF que fue pegilada con MGDF-11 derivada de E. coli (aminoácidos 22-184, numerando desde el comienzo del péptido de señal o de los aminoácidos 1-163, numerando a partir del comienzo de la proteína madura). Los detalles concernientes a todas estas especies pegiladas se resumen en las Tablas 7 - 10 siguientes. 25 - - 12.1 Preparación de conjugados poli-MePEG-MGDF mediante acilación de MGDF con derivados MePEG activados Preparación del conjugado poli-MePEG (20 kDa)-MGDF (PEG 11).

Una solución enfriada (4°C) de MGDF (2.5 mg/ml) en amortiguador BICINE 0.1 M, pH 8, se agregó a un exceso molar de 10 veces de succinimidil-propionato de MePEG sólido (peso molecular 20 kDa) (Shearwater Polymers, Inc.). El polímero se disolvió con agitación suave y la reacción se condujo posteriormente a temperatura ambiente . El grado de la modificación de la proteína durante el curso de la reacción fue verificado periódicamente mediante cromatografía líquida de alta resolución de exclusión de tamaño (SEC) usando la columna Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech) eluida con amortiguador de acetado de sodio 0.1 M, pH 6.9 a 0.7 ml/min. El análisis de cromatografía líquida de alta resolución de exclusión de tamaño de la mezcla de reacción al punto de tiempo de 30 minutos indicó que no fue dejada ninguna proteina libre en la mezcla de reacción. A este punto la concentración de la proteína en la mezcla de reacción fue reducida a 1 mg/ml mediante la - - }? adición de agua estéril, y el pH de la mezcla se ajustó a 4 con varias gotas de ácido acético 0.5 M. El conjugado MePEG-MGDF se separó del exceso de MePEG y de otros subproductos de reacción mediante 5 cromatografía de intercambio iónico usando la resina de intercambio iónico SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech). La mezcla de reacción se cargó (2.5 mg/ml de resina) sobre la columna y el MePEG sin reaccionar se eluyó con 3 volúmenes de columna del amortiguador A ini-í0 cial (fosfato de sodio 20 mM, pH 7.2, 15% de glicerol). Después de eso, el conjugado MePEG-MGDF se eluyó usando un gradiente lineal de 0% a 30% en 10 volúmenes de columna del amortiguador B final (cloruro de sodio 1 M en amortiguador A). El eluyente se verificó periódicamente a 280 nm. Las fracciones que contienen el conjugado poli-MePEG-MGDF se combinaron, se concentraron y se filtraron de manera estéril. El conjugado poli-MePEG-MGDF purificado se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución de exclusión de tamaño usando las columnas de filtración en gel TSK-GEL G4000SWXL y G2000SWXL, acopladas en serie. Las proteínas se detectaron mediante absorbancia de UV a 280 nm. Los estándares de filtración en gel BIO-RAD sirvieron como marcadores de peso molecular de la proteí- 25 na globular.

Como se puede observar en la Figura 17A, la cromatografía líquida de alta resolución de exclusión de tamaño revela dos componentes mayores en la preparación (en aproximadamente una proporción de 1 a 2) las posiciones de elución de la cual corresponden a aquellas de las proteínas globulares de 370.9 kDa y 155.0 kDa respectivamente. Ver también Tabla 8 siguiente. Los conjugados PEG 9, PEG 10 y PEG 12 preparados mediante acilacidn de MGDF con esteres de succinimi-dilo de los MePEGs de peso molecular = 6 - 50 kDa, se condujeron de manera similar. Los parámetros mayores de reacción usados en estas preparaciones se resumen en la Tabla 7. Los resultados de los análisis de cromatografía líquida de alta resolución de exclusión de tamaño de estos conjugados, se muestran en la Tabla 8. 12.2 Preparación de conjugados poli-MePEG-MGDF mediante alquilación reductora de MGDF con aldehidos de MePEG.

Preparación del conjugado poli-MePEG (20 kDa)-MGDF (PEG 20).

A una solución enfriada (4°C), con agitación, de MGDF (2 mi, 2.5 mg/ml) en fosfato de sodio 100 mM, pH 5, que contenía NaCNBH- 20 mM , se agregó un exceso molar de 10 veces del aldehido de monometoxi-polietilenglicol (MePEG) (peso molecular promedio de 20 kDa) y la agitación de la mezcla de reacción se continuó a la misma temperatura. El grado de la modificación de la proteína durante el curso de la reacción se verificó periódicamente mediante cromatografía líquida de alta resolución de exclusión de tamaño usando la columna Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech) eluida con amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M, pH 6.9 a 0.7 ml/min. Después de 16 horas el análisis de cromatografía líquida de alta resolución de exclusión de tamaño indicó que más del 90% de la cantidad inicial de la proteína había sido modificada. A este tiempo la concentración de la proteína en la mezcla de reacción se llevó a 1 mg/ml mediante dilución de la mezcla de reacción con agua estéril, y el pH se ajustd a 4 (ácido acético 0.5 M). El conjugado MePEG-MGDF se separó del exceso de MePEG y de otros subproductos de reacción, mediante cromatografía de intercambio iónico usando la resina de intercambio iónico SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech). La mezcla de reacción se cargó (2.5 mg/ml de resina) sobre la columna y el MePEG sin reaccionar se eluyó con 3 volúmenes de columna del amortiguador A inicial (fosfato de sodio 20 mM, pH 7.2, 15% de glicerol). Después de eso, el conjugado MePEG-MGDF se eluyó usando un gradiente lineal desde 0% hasta 30% en 10 volúmenes de columna del amortiguador B final (cloruro de sodio 1 M en amortiguador A). El eluyente se verificó periódicamente a 280 nm. Las fracciones que contienen el conjugado poli-MePEG-MGDF se combinaron, se concentraron y se filtraron de manera estéril. El conjugado poli-MePEG-MGDF purificado se analizó mediante HPLC de exclusión de tamaño usando las columnas de filtración en gel TSK-GEL G4000SWXL y G2000SWLX, acopladas en serie. Las proteínas se detectaron mediante absorbancia de UV a 280 nm. Los estándares de filtración en gel BIO-RAD sirvieron como los marcadores de peso molecular de la proteína globular. Como se puede observar en la Figura 17B, la HPLC de exclusión de tamaño revela dos componentes mayo-res (que constituyen el 52% y el 47% de la cantidad total) en la preparación, las posiciones de elución de las cuales corresponden a aquellas de las proteínas globulares de 359.4 kDa y de 159.3 kDa, respectivamente. Ver también Tabla 8. Los conjugados de PEG 18, PEG 19 y PEG 21 pre-parados mediante alquilación reductora de MGDF con los aldehidos de MePEG de peso molecular = 6 - 25 kDa, se condujeron de manera similar. Los dos parámetros mayores de reacción usados en estas preparaciones se resumen en la Tabla 7. Los resultados de los análisis de cromatografía líquida de alta resolución de exclusión de tamaño de estos conjugados se muestran en la Tabla 8. 12.3 Preparación de conjugados de monometoxi-polietilen-glicol-MGDF con el sitio de unidn en el residuo alfa-amino N-terminal.

Preparación del conjugado mono-MePEG (20 kDa)-MGDF (PEG 16).

A una solución enfriada (4°C), con agitación, de MGDF (2 mi, 2.5 mg/ml) en fosfato de sodio 100 mM, pH 5, que contenía NaCNBH- 20 mM, se agregó un exceso molar de 5 veces de aldehido de metoxipolietilen-glicol (MePEG) (peso molecular promedio de 20 kDa) y la agitación de la mezcla de reacción se continuó a la misma temperatura . El grado de modificación de la proteína durante el curso de la reacción se verificó periódicamente median-te HPLC de exclusión de tamaño usando la columna Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech), eluida con amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M, pH 6.9, a 0.7 ml/min. Después de 16 horas el análisis de HPLC de exclusión de tamaño indicó que aproximadamente 90% de la cantidad inicial de la proteína había sido modificada. A este tiempo la concentración de la proteína en la mezcla de reacción se redujo a 1 mg/ml mediante dilución con agua estéril y el pH de la mezcla de reacción se ajustó a 4 (ácido acético 0.5 M). El conjugado mono-MePEG (20 kDa)-MGDF se separó del exceso de MePEG y de otros subproductos de reacción mediante cromatografía de intercambio iónico usando una resina de intercambio iónico SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech). La mezcla de reacción se cargó (2.5 mg/ml de resina) sobre la columna, y el MePEG sin reaccionar se eluyó con 3 volúmenes de columna del amortiguador inicial A (fosfato de sodio 20 mM , pH 7.2, 15% de glice-rol). Después de eso, el conjugado MePEG-MGDF se eluyó usando un gradiente lineal desde 0% hasta 25% del amortiguador final B (cloruro de sodio 1 M en amortiguador A) en 20 volúmenes de columna. El eluyente se verificó periódicamente a 280 nm . Las fracciones que contenían el conjugado poli-MePEG-MGDF se combinaron, se concentra-ron y se filtraron de manera estéril. La homogeneidad de los conjugados mono-MePEG-MGDF se determinó mediante Electroforesis en Gel de Poliacrilamida y Dodecil-sulfato de sodio, usando geles en gradiente prevaciados del 4 al 20% (NOVEX). Se reveló una banda mayor que corresponde a la posición de una proteína de 46.9 kDa. El conjugado poli-MePEG-MGDF purificado se analizó mediante HPLC de exclusión de tamaño, usando columnas de filtración en gel TSK-GEL G4000SWXL y G2000SWXL acopladas en serie. Las proteínas se detectaron mediante absorbancia de UV a 280 nm. Los estándares de filtración en gel de BIO-RAD sirvieron como marcadores de peso molecular de la proteína globular. Como se puede observar en la Figura 17C, la HPLC de exclusión de tamaño revela un componente mayor en la preparación, las posiciones de elución de las cuales corresponde a aquella de la proteína globular de 181.1 kDa. Ver también Tabla 9. Los conjugados mono-MePEG-MGDF, PEG 14, PEG 15 y PEG 17 preparados mediante alquilación reductora de MGDF con aldehidos de MePEG de peso molecular = 6 - 25 kDa, se condujeron de manera similar. Los parámetros mayores de reacción usados en estas preparaciones se resumen en la Tabla 7.

/-*-. Los resultados de los análisis de cromatografía líquida de alta resolución de exclusión de tamaño de estos conjugados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 7 Resumen de lo s parámetros de reacción de mod i f icac ión de MGDF 0 Código Reactivo _ MePEG _. , ,__Cond¿ciongs. dg^Reacción Tipo PM Concen- pH . Tempe- Tiempo , Pr.opor- ración . ratura , hr ción de MGDF °C Molar mg/ml " MePEG/MGDF PEG 9 éster 6kDa 2.5 8 t .a. 0.5 15 5 de NHS PEG 10 éster 6kDa 2.5 8 t.a. 0.5 10 de NHS PEG 11 éster 20kDa 2.5 8 t.a. 0.5 10 de NHS 0 PEG 12 éster 50kDa 2.5 8 t.a. 0.5 5 de NHS PEG 14 ALDEHIDO 6kDa 2.5 5 4°C 16 5 PEG 15 ALDEHIDO 12kDa 2.5 5 4°C 16 5 Tabla 7 (continuación) Código Reactivo MePEG £ondiciones_de_Reaccidn_ Tipo PM ConcenpH TempeTiempo, Proportración ratura, hr ción de MGDF °C Molar mg/ml MePEG/MGDF PEG 16 ALDEHIDO 20kDa 2.5 5 4°C 16 PEG 17 ALDEHIDO 25kDa 2.5 5 4°C 16 10 PEG 18 ALDEHIDO 6kDa 4°C 16 10 PEG 19 ALDEHIDO 12kDa 4°C 16 10 PEG 20 ALDEHIDO 20kDa 5 4°C 16 10 PEG 21 ALDEHIDO 25kDa 4°C 16 10 A. Tabla 8 Resumen de características del poli-MePEG-MGDF mediante cromatografía líquida de alta resolución de exclusión de tamaño Código Reactivo MePEG PM aparente mediante Cantidad Exclusión de Tamaño, del kDa componente, íO PEG 9 éster de 6kDa 87.9 75 NHS 52.7 25 (hombro) PEG 10 éster de 6kDa 69.2 14 (hombro) NHS 42.9 86 1 PEG 11 éster de 20kDa 370.9 68 NHS 155.0 32 PEG 12 éster de 50kDa 865.6 53 NHS 368.0 47 PEG 18 ALDEHIDO 6kDa 84.6 60 41.5 40 PEG 19 ALDEHIDO 12kDa 218.4 59 106.7 41 PEG 20 ALDEHIDO 20kDa 359.4 52 159.3 47 ¿ z> PEG 21 ALDEHIDO 25kDa 450.5 54 218.4 46 - Tabla 9 Pesos moleculares aparentes de los conjugados = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = MQM = Z Z = = = = = = = = = = = = = =! = = = = S:S: = Código Reactivo MePEG PM aparente mediante PM aparente mediante Exclusión de Tamaño, SDS-PAGE, kDa kDa Tipo PM PEG 14 ALDEHIDO 6 kDa 44.5 27.7 PEG 15 ALDEHIDO 12 kDa 104.7 38.3 L O PEG 16 ALDEHIDO 20 kDa 181.1 46.9 PEG 17 ALDEHIDO 25 kDa 226.4 55.5 12.4 Preparación de los conjugados DiMePEG( 12kDa)-MGDF mediante alquilación reductora de MGDF con aldehido de metoxi-poli (etilen-glicol ) (PEG 22).

El siguiente procedimiento dió como resultado una molécula purificada denominada en la presente como PEG 22. 20 Un exceso de 5 veces de aldehido de metoxi- polietilen-glicol (MePEG; por ejemplo, 0HC-(CH2)20-(CH2-CH20)n-CH3; donde n = una repetición tal que el peso molecular es «á*'.',a,proximadamerite<'' 12 kDa) (Shearwater Polymers), se agregó "a una solución 2.5 mg/ml de MGDF (derivado de E. coli, ^5 1 - 163) en acetato de sodio 100 mM, pH 5.0 mantenido a 45 grados Celsius. Después de mezclado por 10 minutos, se agregó suficiente cianoborohidruro de sodio (Aldrich) para alcanzar una concentración de 20 mM en la mezcla de reacción . Esta mezcla se agitó por 16 horas aproximadamente a 5°C. Al final de este tiempo, se agregó suficiente agua purificada USP para llevar la concentración del MGDF hasta 1 mg/ml. Este fue filtrado a través de un filtro a vacío de 0.2 mieras. Se prepararon 90 mg del producto de reacción de esta manera. Se agregaron pequeñas porciones de soluciones de fosfato monobásico 1.0 M de hidróxido de sodio 1 N a la mezcla del producto de reacción, para lograr una solución de fosfato 10 mM, pH 6.8. El conjugado se purificó sobre una columna de intercambio catiónico. La columna de Alta Resolución SP-Sepharose de 40 mi se preparó con una altura de lecho de 7.5 cm. La columna se equilibró con amortiguador de equilibrio (fosfato 10 mM, pH 6.8, con 15% de glicerol). La columna se cargó en 2.2 mg/ml de resina a 0.15 volúmenes de columna (VC) por minuto. Esto fue seguido por un lavado con un amortiguador de equilibrio hasta que se alcanzó la línea base. La columna se eluyó con un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna a partir del Amortiguador A (fosfato 20 mM, pH 7.2 con 15% de glice-*t1" rol) al Amortiguador B (Amortiguador A mas cloruro de sodio 0.3 M) . La velocidad de flujo fue mantenida a todo lo largo a 0.15 VC por minuto. El eluyente se verificó periódicamente a 280 nm . 5 Los geles de SDS-PAGE fueron corridos de las fracciones, y aquellas que contenían el conjugado DiPEG se combinaron y se filtraron a través de una unidad de 0.2 mieras .

EJEMPLO 13 Actividad Biológica de las Moléculas de MGPF Pegiladas A. PEG-9 - PEG-12 y PEG-14 - PEG-21 Se midieron las cuentas de plaquetas provenientes de ratones tratados con MGPF humano recombinante, y los resultados se presentan en la Figura 18. MGPF 22- 253 derivadas de CHO (diamantes abiertos), de E. coli 0 22-184 no pegilado (círculos abiertos) y de E. coli 22- 184 pegilado (círculos cerrados), a las concentraciones indicadas en la descripción de las figuras anteriores, se inyectaron subcutáneamente en ratones normales Balb/c una vez al día por 5 días. Los sangrados de prueba a par- 25 tir de un pequeño corte lateral en una vena de la cola se recolectaron 24 horas después de la última inyección. Los análisis de las células sanguíneas se realizaron con un analizador de células sanguíneas electrónico Sysmex (Baxter Piagnostics, Inc. Irvine, CA). Los datos se presentan como la media de las determinaciones de 4 animales, +/- el error estándar de la media. Otros parámetros de las células sanguíneas tales como las cuentas totales de células sanguíneas rojas o las cuentas totales de células sanguíneas blancas no fueron afectados por este tratamiento . Las formas adicionales del MGPF humano recombinante se trataron como se describe anteriormente. Las cuentas de plaquetas provenientes de ratones tratados ya sea con 50 microgramos/kg/día o 10 microgramos/kg/día de la forma indicada de r-HuMGDF, se muestran en la Tabla 10 siguiente. Los datos son la media de 4 animales y los errores estándares están con negritas.

Tabla 10 50 ig/kg/día Forma Media (n: =4) sen Media (n=4) sen CHO 22-353 4343 309 2571 80 E. coli 22-184 2021 29 1439 18 PEG 9 2728 56 2369 34 PEG 10 2431 291 1556 126 Tabla 10 (continuación) 50 ug/kg/día 10 ug/kg/día Forma Media (n= *) sem Media (n =4) sem PEG 11 3778 59 1861 73 PEG 12 3885 156 1740 88 PEG 14 3567 80 2020 63 PEG 15 4402 57 2834 99 PEG 16 4511 239 3215 11 PEG 17 4140 188 3113 261 PEG 18 4586 59 2931 129 PEG 19 3980 330 4189 80 PEG 20 3942 285 3054 339 PEG 21 4195 145 4002 91 Línea base 939 25 Clave para la Tabla 10 En cada uno de los siguientes, la molécul-á' de MGDF que fue pegilada fue MGDF-11 derivada de E. coli (aminoácidos 22-184, numerando desde el comienzo del péptido de señal o los aminoácidos 1-163, numerando desde el comienzo de la proteína madura), como se describe en el Ejemplo 12 anterior : > Nombre Pegilación PM promedio Molécula PEG reactiva de PEG para la síntesis PEG 9 polipegilado 6 kDa Ester de NHS de MePEG PEG 10 polipegilado 6 kPa Ester de NHS de MePEG PEG 11 polipegilado 20 kPa Ester de NHS de MePEG PEG 12 polipegilado 50 kPa Ester de NHS de MePEG PEG 14 monopegilado 6 kPa Aldehido de MePEG PEG 15 monopegilado 12 kPa Aldehido de MePEG PEG 16 monopegilado 20 kPa Aldehido de MePEG PEG 17 monopegilado 25 kDa Aldehido de MePEG PEG 18 polipegilado 6 kDa Aldehido de MePEG PEG 19 polipegilado 12 kDa Aldehido de MePEG PEG 20 polipegilado 20 kDa Aldehido de MePEG - PEG 21 polipegilado 25 kDa Aldehido de MePEG « í?: .- * Las cuentas de línea base son en animales nnoorrmmaales sin la administración de ningún material. Es claro que la pegilación del MGDF humano recombinante no afecta de *?ffat?era adversa la habilidad de la molécula para incrementar las cuentas de plaquetas en animales recipientes, y puede de hecho incrementar la actividad del producto 22-184 de E. coli, para ser tan }j grande o más grande que aquel observado con la molécula 22-353 derivada de CHO.

B. PEG-22 5 Los resultados con PEG-22 se presentan en la Figura 24. Notablemente, la normalización de las cuentas de plaquetas con PEG-22 ocurrió varios días más pronto que con el MGDF derivado de CHO, de longitud -'0 completa, PEG-16, o PEG-17.

EJEMPLO 14 Expresión de MGDF humano recombinante (1-163) en E. coli Para expresar r-HuMGDF en E. coli, la secuencia que codifica para los primeros 163 aminoácidos de la proteína madura, fue químicamente sintetizada utilizando codones de E. coli óptimos. Además, las secuencias de ADN que codifican para los aminoácidos Metionina y Lisina fueron agregados al extremo 5' del gen. Por lo tanto, la proteína r-HuMGDF codificada por esta secuencia es de 165 aminoácidos de longitud comenzando con Met-Lys. La secuencia de este gen se describe en la Figura 25.

La síntesis del gen de r-HuMGDF (1-163) se lie-- '*"' vó a cabo en varios pasos. Primeramente, los oligonucleótidos complementarios (de 60 a 70 pares de bases de longitud) que representan los fragmentos adjuntos del gen, fueron químicamente sintetizados utilizando codones 5 de E. coli óptimos. Durante esta síntesis, los codones para los aminoácidos Metionina y Lisina se colocaron en el extremo 5' del gen maduro, y se colocó un gen de detención en el extremo 3' del gen. Además, los sitios de corte para las enzimas de restricción Xbal y HindIII ÍO se colocaron en los extremos 5' y 31 del gen, respectivamente, y se colocó un sitio de enlace al ribosoma, sintético, una distancia apropiada con dirección hacia arriba de la Metionina de iniciación. En segunda instancia, los oligonucleótidos complementarios para cada fragmento genético fueron recocidos. Tercero, estos fragmentos genéticos sintéticos, individuales, fueron amplificados usando la Reacción en Cadena de Polimerasa. Cuarto, los fragmentos amplificados fueron luego subclonados dentro de un vector apropiado. Quinto, se verificaron las secuen- 20 cias de los fragmentos subclonados. Sexto, los fragmentos individuales se ligaron conjuntamente y se subclonaron dentro de un vector apropiado, reconstruyendo el gen r- HuMGPF (1-163) de longitud completa. Finalmente, se verificó la secuencia del gen reconstruido. 25 El fragmento del gen r-HuMGDF sintético, flan-"•'"" queado por los sitios de restricción Xbal y HindIII en los extremos 5' y 3' respectivamente, contiene un sitio de enlace al ribosoma, el codón de inicio ATG, la secuencia que codifica para la proteína madura Met-Lys r-HuMGDF, 5 y el codón de detención. El fragmento anterior fue clonado dentro de los sitios Xbal y HindIII del vector de expresión pAMGll inducible por lactosa. El vector pAMGll es un plásmido de bajo número de copias con un origen de replicación lO derivado de pRIOO. El plásmido de expresión pAMGll puede ser derivado del plásmido pCFM1656 (ATCC :# 69576, depositado el 24 de Febrero de 1994) mediante, la realización de una serie de cambios de base dirigidos al sitio mediante oligo-mutagénesis de traslape por PCR. Comenzando con el sitio BglII (plásmido pb # 180) inmediatamente 5' al promotor Pcop„o de replicación de prlásmido y J p frocediendo hacia los genes de replicación plasmldicos, los cambios en los pares de bases son como sigue: pAMGll pb # pb en pCFM1656 pb cambiado a un pAMGll # 204 T/A C/G # 428 A/T G/C # 509 G/C A/T # 617 - - insertar dos pb G/C 25 # 679 G/C T/A pAMGll pb # pb en pCFM1656 pb cambiado a un pAMGll # 980 T/A C/G # 994 G/C A/T # 1004 A/T C/G # 1007 C/G T/A # 1028 A/T T/A # 1047 C/G T/A # 1178 G/C T/A # 1466 G/C T/A i O # 2028 G/C supresión de pb # 2187 C/G T/A # 2480 A/T T/A # 2499--2502 AGTG GTCA 1 5 TCAC CAGT # 2642 TCCGAGC supresión de pb AGGCTCG #3435 G/C A/T # 3446 G/C A/T # 3643 A/T T/A # 4489--4512 - - insertar pbs GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC ( SEQ I D NOS : 30 , 31 ) y mediante la substitución de la secuencia de ADN entre los sitios de restricción únicos AatlI y Clal con el siguiente oligonucleótido: ' CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT-3 ' TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA- -GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3 ' -CTAATTATAAGAGTTA?CACTCGCGAGTGTTAAATAGC 5 ' Clal (#4438) (SEQ ID NOS: 32, 33) La expresión de r-HuMGDF, clonado en pAMGll, es impulsada por un promotor sintético inducible por lactosa, tal como Ps4, el cual tiene la siguiente secuencia: ' GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA- -ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3' .

(SEQ ID NO: 34) El promotor Ps4 está representado por el represor de lactosa (Lacl), el producto del gen lacl de E. coli . El plásmido pAMGll-r-HuMGDF fue subsecuentemente transformado dentro de una cepa de E. coli K-12 que contenía el alelo lacl . El alelo lacl es una mutación dentro del promotor lacl, la cual incrementa la expresión de Lacl, y da como resultado un control más estricto de la expresión de la proteína a partir del promotor Ps4. Por lo tanto, en esta cepa, en ausencia de la lactosa, la expresión de r-HuMGDF es reprimida por Lacl. A la adición de la lactosa, se reduce el enlace de la proteína Lacl al sitio operador sobre el promotor Ps4, y se inicia la transcripción de r-HuMGDF a partir de Ps4. La célula huésped de E. coli empleada en este ejemplo está depositada bajo el número ATCC #69717, el 30 de Noviembre de 1994. El huésped E. coli ATCC # 69717 fue transforma-do con el plásmido pAMGl 1-r-HuMGDF y se desarrolló de acuerdo a la siguiente descripción de fermentación. La cepa de E. coli se inocula en caldo Luria y luego se incuba a 30°C por aproximadamente 12 horas. Las células son luego asépticamente transferidas a un fermentador que contiene el medio lote (20 g/L de extracto de levadura; 3.4 g/L de ácido cítrico; 15 g/L de fosfato ácido de potasio; 15 mi de Dow P2000; 5 g/L de glucosa; 1 g/L de sulfato de magnesio heptahidratado ; 5.5 ml/L de metales en trazas; 5.5 ml/L de vitaminas). La fase en lote del proceso continúa hasta que el cultivo alcanza una densidad óptica de 5.0 ± 1.0 a 600 nm. La fase en lote alimentado es luego comenzada con la iniciación del primer medio de alimentación (700 g/L de glucosa; 6.75 g/L de sulfato de magnesio heptahidratado) . La proporción de alimentación es ajustada cada 2 horas por un esquema establecido. La iniciación del segundo medio de alimentación (129 g/L de peptona tripticasa; 258 g/L de extracto de levadura) comienza cuando el cultivo alcanza una densidad óptica de 20-25 a 600 nm. El segundo medio de alimentación es mantenido a una velocidad de flujo constante, mientras que primer medio de alimentación continúa siendo ajustado. La temperatura durante la fermentación completa es mantenida a aproximadamente 30°C. El cultivo es mantenido aproximadamente a pH 7 con la adi-ción de ácido y base, como sea necesario. El nivel de oxígeno disuelto, deseado, es mantenido al ajustar la agitación y las velocidades de entrada de aire y de entrada de oxígeno en el fermentador. Cuando la densidad óptica del cultivo alcanza 57-63 a 600 nm, se inicia Ia adición del tercer medio de alimentación. El tercer medio de alimentación (300 g/L de lactosa) es introducido al fermentador a una velocidad de flujo constante; la adición del primer medio de alimentación es descontinuada, y se cambia la velocidad de flujo del segundo medio de alimentación a una nueva Velocidad constante. La fermen- •A- tación dura aproximadamente diez horas después de la iniciación del tercer medio de alimentación. Al final de la fermentación, el cultivo es enfriado a 15 ± 5°C. Las células son cosechadas mediante centrifugación. La pasta 5 resultante es empacada y almacenada a menos de -60°C. La purificación del MGDF recombinante, producido en E. coli como se describe anteriormente, se llevó a cabo como sigue. Mil ochocientos gramos de pasta celular se suspendieron en aproximadamente 18 litros de EDTA 10 0 mM , y se pasaron a través de un homogeneizador a alta presión a 1,054.6 kg/cm2 (15,000 psi). La suspensión de células rotas' se centrifugó y el botón se resuspendió en 10 litros de EDTA 10 mM. La suspensión se centrifugó y se solubilizaron 200 g del botón en 2 litros de Tris 5 10 mM, clorhidrato de guanidina 8 M, DTT 10 mM, EDTA 5 mM, pH 8.7. Esta solución se diluyó lentamente en 200 litros de CAPS 10 mM, urea 3 M, 30% de glicerol, cista- mina 3 mM, cisteína 1 mM, pH 10.5. La solución diluida se agitó lentamente por 16 0 horas a temperatura ambiente, y el pH se ajustó a 6.8. La solución con pH ajustado se clarificó y se aplicó a una columna de Sefarosa CM de 2 litros, equilibrada con fosfato de sodio 10 mM, urea 1.5 M, 15% de glicerol, pH 6.8. Después de la carga, la columna se lavó con fosfato 5 de sodio 10 mM, 15% de glicerol, pH 7.2. El MGDF se eluyó con un gradiente de cloruro de sodio de 0 a 0.5 M, fosfato de sodio 10 mM, pH 7.2. El eluido de CM se concentró y se intercambió el amortiguador con fosfato de sodio 10 mM, pH 6.5, con una membrana de corte de peso molecular de 10,000. La solución concentrada, a aproximadamente 2 mg por mi, se trató con catepsina C (proporción molar de 500 a 1) por 90 minutos a temperatura ambiente. La solución se cargó luego a una columna de Sefarosa de Alta Resolución SP de 1.2 litros, equilibrada con . fosfato de sodio 10 mM; 15% de glicerol, pH.7.2.-Después de la carga, el MGDF se eluyó con un gradiente de 0.1 a 0.25 M de cloruro de sodio, fosfato de sodio 10 mM, pH 7.2. Se agregó sulfato de amonio a 0.6 M al eluido de la columna de alta resolución de SP. El eluido se cargó a una columna Phenyl Toyopearl de 1.6 litros, equilibrada con fosfato de sodio 10 mM, sulfato de amonio 0.6 M, pH 7.2. El pico de MGPF se eluyó con un gra-diente de sulfato de amonio de 0.6 a 0 M, fosfato de sodio 10 mM, pH 7.2. El eluido del Phenyl Toyopearl se concentró y se intercambió con amortiguador con una membrana de corte de peso molecular de 10,000, en Tris 10 mM, 5% de sorbitol, pH 7.5.

EJEMPLO 15 Propiedades biológicas in vivo de r-HuMGPF (E. coli 1-163) El r-HuMGPF (E. coli 1-163), preparado como se describe en el Ejemplo 14 anterior, se evaluó en roedores para la eficacia biológica. Ratones Balb/c hembra, normales, se inyectaron subcutáneamente por 5 días consecutivos a dosis cada vez mayores de r-HuMGPF. Las dosis estuvieron en el intervalo de 15 ug./kg/día a 1,500 ug/kg/día. Veinticuatro horas después de la última inyección, se midieron las cuentas de células sanguíneas usando un contador electrónico de células (Sysmex, Baxter). Se observó un incremento lineal en las cuentas de plaquetas con concentraciones logarítmicamente en incremento de la citocina. Las cuentas de plaquetas se incrementaron a 300% de los valores de línea base con 1,500 ug/kg/ día en este sistema. No se vieron afectados otros paráme-tros de las células sanguíneas con este tratamiento, tal como las cuentas de células sanguíneas blancas o rojas, o el hematocrito. Las plaquetas se cosecharon de ratas inyectadas subcutáneamente con 300 ug/kg/día de r-HuMGPF (E. coli 1-163) por 6 días, y se evaluaron para la habilidad de /1 agregarse en respuesta a APP. Los datos indican que las plaquetas provenientes de animales tratados son virtualmente indistinguibles de las plaquetas de los animales control, ya que ambas poblaciones son equivalente- 5 mente sensibles al agonista de las plaquetas, el APP. Se evaluó también el r-HuMGDF para la habilidad de abrogar la trombocitopenia asociada con quimioterapia y/o irradiación. La carboplatina, un agente quimioterapéutico que provoca trombocitopenia profunda en ?0 humanos, se usó en estos estudios. Ratones Balb/c se inyectaron subcutáneamente con 1.25 g de carboplatina al inicio del estudio. Después de 24 horas, los ratones se inyectaron diariamente con 100 ug/kg/día de r-HuMGDF (E. coli 1-163), o excipiente, para el resto del estu- 1 dio. Por el Día 9, las cuentas de plaquetas disminuyeron hasta aproximadamente 15% de lo normal en los ratones tratados con excipiente, pero permanecieron a los niveles de linea base en los ratones tratados con r-HuMGDF (ver Figura 20). Para los estudios de irradiación, los ratones se sujetaron a una dosis simple de 500 rads de radiación gamma (fuente de Cesio). Esta es una dosis subletal que da como resultado una reducción de 90% de las cuentas de plaquetas por el Día 11. Las cuentas de plaquetas no regresan a los valores normales sino hasta el Día 21. 0 Cuando se administró r-HuMGDF (E. coli 1-163) una vez al día (100 ug/kg/día) a los ratones irradiados del Día 1 al Día 20, la caída en las cuentas de plaquetas fue menos severa y el regreso a los niveles de línea base fue más rápido que en los ratones tratados con excipiente (Figura 21). Con el fin de probar el r-HuMGDF en un modelo de trombocitopenia extrema y prolongada, se aplicaron en combinación la carboplatina y la radiación (Figura 22). En esta circunstancia, las cuentas de plaquetas disminuyeron a niveles extremadamente bajos (3-5% de lo normal), y la mayoría de los animales (7/8) no sobrevivieron a este tratamiento. No obstante, cuando estos animales fueron tratados diariamente con inyecciones subcutáneas de r-HuMGDF a 100 ug/kg/día por toda la duración del estudio, la trombocitopenia fue significativamente abrogada, el regreso a las cuentas de línea base fue más rápido, y todos los animales tratados con r-HuMGDF (8/8) sobrevivieron . El r-HuMGDF fue también evaluado en monos rhesus. Los monos rhesus normales fueron subcutáneamente inyectados ya sea con 2.5 ó 25 ug/kg/día por 10 días (Día 0-9). En el grupo de menor dosis, las cuentas de plaquetas se incrementaron en 400% en el Día 12, y en los grupos de dosis mayor éstas se incrementaron hasta 700%, también en el Día 12. Después de que se detuvieron las inyecciones, las cuentas de plaquetas regresaron a lo normal por el Día 25-30. Las cuentas de células sanguíneas blancas y las cuentas de células san uíneas rojas no se vieron afectadas por este tratamiento. r-HuMGDF (E. coli 1-163) fue también probado en un modelo de primate de trombocitopenia severa (Figura 23). Los animales se sujetaron a radiación (700 rads, de fuente de Cobalto), lo cual dió como resultado una reducción de las cuentas plaquetarias a 1-2% de lo normal por el Día 15. Por el Día 35-40, las cuentas de plaque-tas regresaron a lo normal. En contraste, las cuentas de plaquetas en animales irradiados tratados diariamente con r-HuMGDF (25 ug/kd/día) disminuyeron únicamente al 10% de lo normal y en promedio no fueron más abajo de 20,000/ul, el punto de partida para las transfusiones de plaquetas en humanos trombocitopénicos . El regreso a las cuentas de línea base fue también más rápido en los animales tratados con r-HuMGDF, ocurriendo por el Día 20. Estos datos in vivo a partir de estudios en roedores y en primates apoyan completamente el concepto de que r-HuMGDG (E. coli 1-163) es un potente agente terapéutico con la capacidad de afectar significativamente las trombocitopenias clínicamente relevantes.

•• EJEMPLO 16 Método para la Producción de Cultivos de Células CHO de r-HuMGDF 1-332 El r-HuMGDF 1-332 glucosilado, se produce a partir de células transfectadas de Ovario de Hámster Chino, que expresan un ADNc para MGDF 1-332 bajo un promotor apropiado, y ligado a un gen que codifica para 0 el marcador de selección amplificable, DHFR. Un promotor apropiado para 1.a expresión de MGDF n células CHO, es SR . Ver Mol. Cell. Biol. 8: 466-472 (1988) y Patente Mundial WO 91/13160 (1991). Un vector apropiado para la expresión de MGDF en células CHO es pDSRs2. Ver Patente 5 Mundial WO 90/14363 (1990). Las líneas de células CHO ejemplares, pueden producir MGDF secretado, en el intervalo de 10-20 mg/L en medios de cultivo celular estándares, pero pueden ser incrementadas a 25 hasta ¿ 100 mg/L. Para producir MGDF con una línea celular típica, un 0 cultivo puede ser expandido mediante el paso de éste en suspensión o en recipientes de cultivo tisular en el modo de crecimiento adherente, usando el medio comprendido de proporciones iguales de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (PMEM) y medio F12 de Ham (PMEM/F12, Gibco) 5 suplementado con 5 a 10% de Suero Fetal Bovino (FBS) o suero fetal bovino, dializado, y metotrexato (MTX) (si es necesario; la concentración típica de MTX es 200-600 nM) para mantener la presión de selección. Este medio debe de ser suplementado con aminoácidos no esenciales extra (NEAA's) y glutamina. Los cultivos en suspensión pueden propagarse rápidamente entre las densidades de inoculación (división) de 1-4 x 10 células/mL y densida-des máximas de aproximadamente 1 x 10 células/mL, punto en el cual los cultivos son expandidos mediante dilución en volúmenes mayores, con densidades celulares iniciales a las densidades de división especificadas. Para producir MGPF en botellas giratorias, se debe de generar un volumen apropiado y la densidad celular apropiada del cultivo en suspensión, usando ya sea recipientes giratorios magnéticamente agitados, colocados en un ambiente de temperatura controlada (37 ± 1°C), o un sistema biorreactor, controlado por instrumentos, de tanque giratorio. Las botellas giratorias (tales como botellas giratorias Falcon de 850 cm3) deben de ser sembra-das a densidades iniciales de 1.5 a 3 x 10 células por botella, y suplementadas con el medio de crecimiento adicional (PMEM/F12 con 5-10% de FBS, IX de NEAA y IX de L-glutamina) en una cantidad apropiada para generar una monocapa confluente en 3-4 días (150-300 mL por botella). El medio de crecimiento debe de ser adecuadamente amorti-guado con bicarbonato de sodio a un pH de 6.9 a 7.2 en equilibrio con dióxido de carbono, a una presión parcial de 60 a 90 mm Hg. Las botellas deben de ser gasificadas con 10% de C02/aire, e incubadas sobre estantes girato-rios (aproximadamente 1 rpm) a 37 ± 1°C por 3-4 días. A la confluencia, las botellas giratorias deben de ser desplazadas al medio de producción libre de suero, vaciando o aspirando el medio de crecimiento; el lavado de las botellas con un amortiguador isotónico tal como la Solu-ción Salina Amortiguada con Fosfato de Pulbecco (P-PBS), 50-100 mL por botella; luego agregando un volumen apropiado de PMEM/F12 libre de suero, amortiguado con bicarbonato (1:1) (200 - 300 mi por botella) suplementado con NEAA's y L-glutamina, y con sulfato de cobre para minimi-zar la agregación covalente (1-20 uM) . Las botellas deben de ser gasificadas con 10% de C02/aire e incubadas por 6 ± 1 días a 37 ± 1°C sobre estantes giratorios (aproximadamente 1 rpm), o hasta que la actividad metabólica haya impulsado el nivel de glucosa por debajo de 0.5 g/L y/o el nivel de pH por debajo de 6.6. El medio condicionado debe de ser cosechado vaciándolo o aspirándolo de las botellas, y reemplazado con medio de producción libre de suero, fresco, como se describió anteriormente, para las cosechas adicionales. Esto puede proceder hasta que las células ya no puedan sustentar más la producción libre de suero y se desprendan de las botellas giratorias. El medio condicionado cosechado puede ser procesado para la purificación mediante microfiltración de extremo muerto, a través de filtros de 0.45 mieras y/o de 0.2 mieras (Sartorius Sartobran pH o Pall). El medio condicionado filtrado debe de ser enfriado a 4°C, luego debe de ser ya sea almacenado temporalmente a 4°C o inmediatamente concentrado y dializado para disminuir la fuerza iónica, usando un sistema de ultrafiltración de flujo cruzado (por ejemplo Filtron YM-50). La ultra-filtración y la diafiltración deben de ocurrir a 4°C para minimizar la degradación de la proteína. El medio condicionado debe de ser dializado con una solución acuosa amortiguada (por ejemplo, fosfato de potasio 10 mM, pH 6.8) antes de los pasos de purificación cromato-gráfica . La calidad del producto en el medio condicionado puede ser verificada periódicamente mejor, usando los manchados de Western de SPS-PAGE no reductores, los cuales pueden revelar las cantidades relativas de el MGPF agregado, monomérico, y proteolí ticamente degradado en las muestras. Otro método más para la producción de MGPF a partir de células CHO, podría ser el adaptar una línea celular que expresa MGPF a un medio libre de suero tal como Gibco S-SFM II. Las células pueden ser adaptadas mediante el paso en serie en el medio que contiene suplementos séricos mínimos o ningún suplemento sérico. Si se encuentra que una línea celular se desarrolla substancial-mente en tal medio, al tiempo que produce cantidades adecuadas de MGPF secretado, la producción puede proceder mediante el retiro de un cultivo inoculo vía el paso en serie en volúmenes de cultivo cada vez mayores, luego inoculando un recipiente de producción apropiado (un biorreactor controlado por instrumentos, de tanque giratorio) y p.ermitiendo que el cultivo prolifere a su densidad máxima viable bajo condiciones de crecimiento óptimas (pH, nutrientes, temperatura, oxígeno, agitación). En el punto de producción óptimo (como se determina experimen-talmente al medir la cantidad y la calidad del producto) el cultivo puede ser cosechado a partir del biorreactor, y las células pueden ser retiradas del medio condicionado mediante filtración profunda a microescala o microfiltración de flujo cruzado de submicras. Si se usa la filtra-ción profunda el medio debe de ser además clarificado mediante la filtración de extremo muerto de submicras, antes de la concentración y la diálisis, como se describió anteriormente.

Mientras que la presente invención ha sido des-crita anteriormente en general y en términos de las modalidades preferidas, se entiende que ocurrirán variaciones y modificaciones para aquellos expertos en la técnica, a la luz de la descripción anterior. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones anexas cubran todas las variaciones tales que estén dentro del alcance de la invención como se reclama. Además, las publicaciones y otros materiales citados para iluminar los antecedentes de la invención, y en particular los casos para proporcionar detalles adicionales concernientes a su práctica, se. incorporan, por referencia en la presente.

LISTAPO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Bartley, Timothy P. Bogenberger, Jakob M. Bosselman, Robert A. Hunt, Pamela Kinstler, Olaf B. Samal, Babru B. (ii) TITULO PE LA INVENCIÓN: Composiciones y Métodos para la Estimulación del Crecimiento y Piferen- ciacidn de los Megacariocitos (iii) NUMERO PE SECUENCIAS: 34 (iv) P0MICILI0 PARA CORRESPONPENCIA : (A) PESTINATARIO: Amgen Inc. (B) CALLE: 1840 Dehavilland Drive (c) CIUDAD: Thousand Oaks (D) ESTADO: California (E) PAÍS: Estados Unidos de América (F) CÓDIGO POSTAL: 91320-1789 - i (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTAPORA: (A) TIPO PE MEPIO: Pisco flexible (B) COMPUTAPORA: Compatible con computadora personal IBM 5 (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-POS/MS-POS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: 10 (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE: 15 (A) NOMBRE: Cook, Robert R. (C) NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: A-290-C (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 aminoácidos (8) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal 25 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) PESCRIPCION PE LA SECUENCIA: SEQ IP NO: 1: Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 1 5 10 15 Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gln Xaa Pro Asp He Tyr 20 25 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ IP NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS PE LA SECUENCIA: (A) LONGITUP: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO PE CAPENA: sencilla (P) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO PE MOLÉCULA: proteína (xi) PESCRIPCION PE LA SECUENCIA: SEQ IP NO: 2: Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 1 5 10 15 Ser His Val Leu His 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ IP NO: 3 (i) CARACTERÍSTICAS PE LA SECUENCIA: (A) LONGITUP: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) PESCRIPCION PE LA SECUENCIA: SEQ IP NO: 3: Thr Glp Lys Glu Gln Thr Lys Ala Gln Asp Val Leu Gly Ala Val Ala 1 5 10 15 - Leu (2) INFORMACIÓN PARA SEQ IP NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: GCNCCNCCNG CNTGYCA 17 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: GCARTGYAAC ACRTGNGART C 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS PE LA SECUENCIA: (A) LONGITUP: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO PE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína ( x i ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 6 : Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp 10 15 Ser His Val Leu His 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN • DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: GTACGCGTTC TAGANNNNNN T 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CAPENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: AGTTTACTGA GGACTCGGAG G 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CAPENA: sencilla (P) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO PE MOLÉCULA: APNc (xi) PESCRIPCION PE LA SECUENCIA: SEQ IP NO: 9: TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT tttttttttt 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ IP NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTT?"pTT 2g (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN PE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: TGCGACCTCC GAGTCCTCAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CAPENA: sencilla (P) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: GGAGTCACGA AGCAGTTTAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: CCTTTACTTC TAGGCCTG 18 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: GAGGTCACAA GCAGGAGGA 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: GGCATAGTCC GGGACGTCG 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: TCCTCCTGCT TGTGACCTC 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (P) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) PESCRIPCION PE LA SECUENCIA: SEQ IP NO: 18: CCAGGAAGGA TTCAGGGGA 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ IP NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS PE LA SECUENCIA: (A) LONGITUP: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO PE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO PE MOLÉCULA: APNc ' (xi) PESCRIPCION PE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ IP NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS PE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: GGCCGGATAG GCCACTCNNN NNNT 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DÉ LA SECUENCIA: SEQ' ID NO: 21: GCARTGYAAN ACRTGNGART C 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CAPENA: sencilla (P) TOPOLOGÍA: lineal '(ii) TIPO PE MOLÉCULA: APNc (xi) PESCRIPCION PE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22: TTGGTGTGCA CTTGTG 16 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23: CACAAGTGCA CACCAACCCC 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1342 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 99..1094 (xi) DESCRIPCIÓN PE LA SECUENCIA: SEQ IP NO: 24 CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG 60 TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT 113 Ser Pro Al* Pro Pro 1 5 GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 161 Ala 'Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg ?sp Ser His Val 10 15 20 CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209 Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr 25 30 35 CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 257 Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr 40 45 50 CAG ATG GAG GAG ACC AAG GC? CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305 Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp lie Leu Gly Ala Val Thr Leu 55 60 65 CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAÁ CTG GGA CCC ACT TGC 353 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys 70 75 80 85 CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val ?rg Leu Leu Leu 90 95 100 GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CC? CAG GGC AGG 449 Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg 105 110 115 ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTß ?GC TTC CA? CAC 97 Thr Thr Ala Kis Lys ?sp Pro Asn Ala lie Phe Leu Ser Phe Gln His 120 125 130 CTG CTC CGA GGA A?G GTG CGT TTC CTG ?TG CTT GT? GO? GGG TCC ?CC 545 Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr 135 140 145 CTC TGC GTC AGG CGG GCC CC? CCC ?CC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC 593 Leu Cys Val ?rg ?rg ?la Pro Pro Thr Thr ?la Val Pro Ser ?rg Thr 150 155 160 165 TCT CTA GTC CTC ?C? CTG AAC G?ß CTC CC? ??C ?8 ?CT TCT GG? TTG 641 Ser Leu Val Leu Thr Leu ?sn Glu Leu Pro ?sn ?rg Thr Ser Gly Leu 170 175 180 TTG G?G ACA A?C TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGß CTT 689 Leu Glu Thr Asn Phß Thr Ala Ser ?la Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu 185 X90 195 CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC A?G ?TT CCT GGT CTG CTG ??C 737 Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phß Arg Ala Lys lie Pro Gly Leu Leu Asn 200 205 210 CAÁ ACC TCC AGG TCC CTG GAC C?? ?TC CCC GG? T?C CTG ??C ?GG ?T? 785 Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln He Pro Gly Tyr Leu Asn Arg He 215 220 225 CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC 833 His'Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser ?rg 230 235 240 245 AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA AC? TC? G?C ?C? GGC 881 Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp He Ser Ser Gly Thr Ser ?sp Thr Gly 250 255 260 TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CC? ?CC C?T 929 Ser Leu Pro Pro ?sn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His 265 270 275 CCT CCT ACT GGA C?G T?T ?CG CTC TTC CCT CTT CC? CCC ?CC TTG CCC 977 Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro 280 285 290 ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA 1025 Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser ?la Pro 295 300 305 ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC AC? TCC TAC ACC CAC TCC 1073 Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu ?sn Thr Ser Tyr Thr Hiß Ser 310 315 320 325 CAG AAT CTG TCT C?G GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC G?C?TC?GC? 1124 Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly 330 TTGTCTCGTG TAC?GCTCCC TTCCCTGC?G GGCGCCCCTG GG?G?C??CT GG?C??G?TT 1184 TCCTACTTTC TCCTG???CC C???GCCCTß GT????GGG? T?C?C?GG?C TG????GGG? 1244 ?TC?TTTTTC ACTGTAC?TT ?T???CCTTC ?GAAGCT?TT TTTTT??GCT ?TC?GC??T? 1304 CTCATC?G?G C?GCT?GCTC TTTGGTCTAT TTTCTGC? 1342 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS PE LA SECUENCIA: (A) LONGITUP: 332 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (P) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO PE MOLÉCULA: proteína (xi) PESCRIPCION PE LA SECUENCIA: SEQ IP NO: 25 Ser Pro ?la Pro Pro ?la Cys ?sp Leu ?rg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1 5 10 15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cyß Pro Glu Vßl 20 25 30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val ?sp Phe Ser Leu 35 40 45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys ?la Gln ?sp He Leu ' 50 55 60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met ?la ?la ?rg Gly Gln 65 70 75 80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln 85 90 95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu 100 105 110 Pro Pro Gln Gly ?rg Thr Thr ?la His Lyß ?ßp Pro ?ßn ?la Zle Phß 115 120 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu ?rg Gly Lys Val ?rg Phe Leu Met Leu 130 135 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val ?rg ?rg ?la Pro Pro Thr Thr ?la 145 150 155 160 Val Pro Ser ?rg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu ?an Glu Leu Pro ?sn 165 170 175 ?rg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr ?lß Ser ?lß ?rg Thr 180 185 190 Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe ?rg ?lß Lys He 195 200 205 Pro Gly Leu Leu ?sn Gln Thr Ser ?rg Ser Leu ?sp G n He Pro Gly 210 215 220 Tyr Leu Asn Arg He His Glu Leu Leu ?sn Gly Thr ?rg Gly Leu Phe 225 230 235 240 Pro Gly Pro Ser ?rg ?rg Thr Leu Gly ?lß Pro ?sp ?le Ser Ser Gly 245 250 255 Thr Ser ?sp Thr Gly Ser Leu Pro Pro ?ßn Leu G n Pro Gly Tyr »t 260 265 270 Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu 275 ' 280 285 Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro 290 295 300 ?sp Pro Ser ?la Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu ?sn Thr 305 310 315 320 Ser Tyr Thr His Ser Gln ?sn Leu Ser Gln Glu Gly 325 330 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUP: 1342 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO PE CAPENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 99.621 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26 CAGGGAGCC? CGCC?GCC?? G?C?CCCCGG CC?G??TGG? GCTG?CTG?? TTGCTCCTCG 60 TGGTCATGCT TCTCCTA?CT GC??GGCT?? CGCTGTCC ?GC CCG GCT CCT CCT 113 Ser Pro ?lß Pro Pro GCT TGT G?C CTC CG? GTC CTC ?GT ??? CTG CTT CGT G?C TCC C?T GTC 161 Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu ?rg ?sp Ser His Vßl 10 15 20 CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CC? G?G GTT C?C CCT TTG CCT ?C? 209 Leu His Ser ?rg Leu Ser Gln Cys Pto Glu Val His Pro Leu Pro Thr 25 30 35 CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG G?C TTT ?GC TTG GG? G?? TGG ??? ?CC 257 Pro Val Leu Leu Pro ?la Val ?sp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr 40 45 50 CAG ATG GAG G?G ?CC AAG GC? C?G G?C ?TT CTG GG? GC? GTG ?CC CTT 305 G n Met Glu Glu Thr Lys ?la Gln ?sp He Leu Gly ?lß Vßl Thr Leu 55 60 65 CTG CTG G?G GG? GTG ?TG GC? GC? CGG GG? C?? CTG GG? CCC ?CT TGC 353 Leu Leu Glu Gly Val Met ?la ?la ?rg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys 70 75 80 85 CTC TC? TCC CTC CTG GGG C?G CTT TCT GG? C?G GTC CGT CTC CTC CTT 401 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Vßl ?rg Leu Leu Leu 90 95 100 GGG GCC CTG C?G ?GC CTC CTT GG? ?CC C?G CTT CCT CC? C?G GGC ?GG 449 Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly ?rg 105 110 115 ACC ACA GCT CAC ??G G?T CCC ??T GCC ?TC TTC CTG ?GC TTC C?? C?C 497 Thr Thr Ala His Lys ?sp Pro ?sn ?la He Phe Leu Ser Phe Gln His 120 125 130 TG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GT? GG? GGG TCC ?CC 545 Leu Leu Arg Gly Lys Val ?rg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr 135 140 145 CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC AC? GCT GTC CCC AGC AGA ACC 593 Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr ?la Val Pro Ser ?rg Thr 150 155 160 165 TCT CTA GTC CTC ACA CTG A?C G?G CTC C C???C?GG?C TTCTGG?TTG 641 Ser Leu Val Leu Thr Leu ?sn Glu Leu 170 TTGGAGACAA ACTTCACTGC CTC?GCC?G? ?CT?CTGGCT CTGGGCTTCT G??GTGGC?G 701 CAGGGATTCA GAGCC??G?T TCCTGGTCTG CTG??CC??? CCTCC?GGTC CCTGG?CC?? 761 ATCCCCGGAT ACCTGAAC?G G?T?CACGA? CTCTTG??TG G??CTCGTGG ?CTCTTTCCT 821 GGACCCTCAC GCAGG?CCCT ?GG?GCCCCG G?C?TTTCCT C?GG??C?TC ?G?C?C?GGC 881 TCCCTGCCAC CC??CCTCC? GCCTGG?T?T TCTCCTTCCC C??CCC?TCC TCCT?CTGG? 941 C?GTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCC?CC TTGCCC?CCC CTGTGGTCC? GCTCC?CCCC 1001 CTGCTTCCTG ACCCTTCTGC TCCA?CGCCC ?CCCCT?CC? GCCCTCTTCT ???C?C?TCC 1061 T?C?CCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGG?? GGGTAAGGTT CTC?G?C?CT GCCG?C?TC? 1121 GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG C?GGGCGCCC CTGGG?G?C? ?CTGGAC??G 1181 ATTTCCTACT TTCTCCTG?? ACCC???GCC CTGGTA???G GG?TAC?CAG G?CTG????G 1241 GGAATCATTT TTCACTGT?C ?TT?T???CC TTC?G??GCT ?TTTTTTT?? GCT?TC?GC? 1301 ATACTCATC? GAGCAGCT?G CTCTTTGGTC T?TTTTCTGC ? 1342 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 174 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27 Ser Pro Ala Pro Pro ?lß Cys ?sp Leu ?rg Vßl Leu Ser Lyß Leu Leu 1 5 10 15 ?rg ?sp Ser His Val Leu His Ser ?rg Leu Ser Gln Cyß Pro Glu Vßl 20 25 30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro ?lß Vßl ?sp Phe Ser Leu 35 40 45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys ?lß Gln ?sp ?le Leu , 50 55 60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met ?la ?la ?rg Gly Gln 65 70 75 80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln 85 90 95 Val ?rg Leu Leu Leu Gly ?la Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu 100 105 110 Pro Pro Gln Gly ?rg Thr Thr ?la His Lys ?sp Pro ?sn ?lß Zle Phe 115 120 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu ?rg Gly Lys Vßl ?rg Phe Leu Met Leu 130 135 140 val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Vßl ?rg ?rg ?lß Pro Pro Thr Thr ?lß 145 150 155 160 Val Pro Ser ?rg Thr Ser Leu Vßl Leu Thr Leu ?sn Glu Leu 165 170 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ IP NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1164 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 97..894 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28: AGGGAGCCAC GCC?GCC?G? C?CCCCGGCC ?G??TGG?GC TG?CTG??TT GCTCCTCGTG 60 GTCATGCTTC TCCTA?CTGC ??GGCTAACG CTGTCC ?GC CCG GCT CCT CCT GCT 114 1 5 TGT GAC CTC CG? GTC CTC ?GT ??? CTG CTT CGT G?C TCC C?T GTC CTT 162 Cys Asp Leu ?rg Val Leu Ser Lys Leu Leu ?rg ?sp Ser Hiß Val Leu 10 15 20 CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA G?G GTT C?C CCT TTG CCT ?C? CCT 210 His Ser ?rg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val Hiß Pro Leu Pro Thr Pro 25 30 35 GTC CTG CTG CCT GCT GTG G?C TTT ?GC TTG GG? G?? TGG ??? ?CC C?G 258 Val ' eu Leu Pro ?la Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln 40 45 50 ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG 306 Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp He Leu Gly ?la Val Thr Leu Leu 55 60 65 70 CTG G?G GGA GTG ATG GC? GCA CGG GGA C?? CTG GG? CCC ?CT TGC CTC 354 Leu Glu Gly Val Met ?la Ala ?rg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu 75 80 85 TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GG? C?G GTC CGT CTC CTC CTT GGG 402 Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Vßl ?rg Leu Leu Leu Gly 90 95 100 GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA C?G GGC ?GG ?CC 450 ?la Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly ?rg Thr 105 110 115 ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC C?? C?C CTG 498 Thr ?la His Lys ?sp Pro ?sn ?la ?le Phe Leu Ser Phe Gln His Leu 120 125 130 CTC CGA GGA AAG G?C TTC TGG ATT GTT GG? G?C ??? CTT C?C TGC CTC 546 Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp He Val Gly ?sp Lys Leu His Cys Leu 135 140 145 150 AGC CAG AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT G?? GTG GC? GC? GGG ATT C?G 594 Ser Gln Asn Tyr Trp Leu Trp ?la Ser Glu Vßl ?lß ?lß Gly He Gln 155 160 165 AGC CAÁ GAT TCC TGG TCT GCT G?? CC? ??C CTC C?G GTC CCT GG? CC? 642 Ser Gln Asp Ser Trp Ser ?la Glu Pro ?sn Leu Gln Vßl Pro Gly Pro 170 175 180 AAT CCC CGG ATA CCT G?? C?G G?T ?C? CG? ?CT CTT G?? TGG ??C TCG 690 Asn Pro Arg He Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Leu Glu Trp ?sn Ser 185 190 195 TGG ACT CTT TCC TGG ACC CTC ACG CAG G?C CCT ?GG ?GC CCC GG? C?T 738 Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln ?sp Pro ?rg Ser Pro Gly His 200 205 210 TTC CTC AGG A?C ?TC ?G? C?C AGG CTC CCT GCC ?CC C?? CCT CC? GCC 786 Phe Leu Arg Asn He Arg His Arg Leu Pro Ala Thr Gln Pro Pro ?la 215 220 225 230 TGG ATA TTC TCC TTC CCC AAC CCA TCC TCC TAC TGG AC? GT? T?C GCT 834 Trp He Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser Tyr Trp Thr Val Tyr Ala 235 240 245 CTT CCC TCT TCC ACC CAC CTT GCC CAC CCC TGT GGT CC? GCT CC? CCC 882 Leu Pro Ser Ser Thr His Leu ?la His Pro Cys Gly Pro ?la Pro Pro 250 255 260 CCT GCT TCC TG?CCCTTCT GCTCC??CGC CC?CCCCT?C CAGCCCTCTT 931 Pro 'Ala Ser j 265 CTAAACACAT CCT?C?CCC? CTCCC?G??T CTGTCTC?GG ??GGGT??GG TTCTC?G?C? 991 CTGCCG?C?T C?GC?TTGTC TCGTGT?C?G CTCCCTTCCC TGC?GGGCGC CCCTGGG?G? 1051 C?ACTGGAC? AGATTTCCT? CTTTCTCCTG ???CCC???G CCCTGGT??? AGGGAT?C?C 1111 AGGACTGA?? AGGGAATCAT TTTTCACTGT ACATTAT??? CCTTC?G??G CT? 1164 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 265 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29: i Ser Pro ?la Pro Pro ?la Cys ?sp Leu ?rg Vßl Leu Ser Lyß Leu Leu 1 5 10 15 Arg Asp Ser His Vßl Leu His Ser ?rg Leu Ser Gln Cyß Pro Glu Vßl 20 25 30 His Pro Leu Pro Thr Pro Vßl Leu Leu Pro ?lß Vßl ?sp Phe Ser Leu 35 40 45 ,. Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lyß ?lß Gn ?sp Z e Leu 50 55 60 Gly ?la Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Vßl Met ?lß ?lß ?rg Gly Gln 65 70 75 80 Leu Gly Pro Thr Cyß Leu Ser Ser Leu Leu ßly Gln Leu Ser Gly ßln 85 90 95 Val ?rg Leu Leu Leu Gly ?lß Leu Gln Ser Leu Leu Oly Thr Gln Leu 100 " OS 110 Pro Pro Gln Gly ?rg Thr Thr ?lß Hiß Lys ?sp Pro ?sn ?lß He Phe H5 120 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu ?rg Gly Lyß ?sp Phe Trp Zle Vßl Gly 130 135 140 Asp Lys Leu His Cys Leu Ser Gln ?sn,Tyr Trp Leu Trp ?lß Ser Glu 145 150 155 160 Val ?la ?la Gly He Gln Ser Gln ?sp Ser Trp Ser ?lß Glu Pro ?sn 165 170 175 Leu Gln Val Pro Gly Pro ?sn Pro ?rg He Pro Glu Gln ?sp Thr ?rg 180 185 190 Thr Leu Glu Trp ?sn Ser Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln ?sp 195 200 205 Pro ?rg Ser Pro Gly His Phe Leu ?rg ?sn He ?rg His ?rg Leu Pro 210 215 220 Ala Thr Gln Pro Pro ?la Trp He Phe Ser Phe Pro ?sn Pro Ser Ser 225 230 235 240 Tyr Trp Thr Val Tyr ?la Leu Pro Ser Ser Thr His Leu ?la His Pro 245 250 255 Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro ?la Ser 260 265 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CAPENA: sencilla (P) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30: GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31: CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 80 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: APNc (xi) PESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32: CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT TCTTGATTAA TATTCTCAAT 60 TGTGAGCGCT CACAATTTAT 80 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 86 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33: CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA 60 TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT 86 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS PE LA SECUENCIA: (A) LONGITUP: 89 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO PE CAPENA: sencilla (P) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO PE MOLÉCULA: APNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34: GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC 60 TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT 89 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido de las siguientes:

Claims (83)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido MGDF humano, caracterizado porque promueve específicamente el crecimiento y el desarrollo de magacariocitos humanos, substancialmente libres de otras proteínas humanas.

2. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polipéptido comprende los aminoácidos 22-172 de la Figura 11.

3. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicho polipéptido comprende los aminoácidos 22-195 de la Figura 11.

4. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos del MGDF-2.

5. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polipéptido comprende los aminoácidos 22-353 de la Figura 11.

6. Un polipéptido de conformidad con la rei-vindicación 5, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos del MGDF-1.

7. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos de un miembro seleccionado del grupo que consiste de MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7, y MGDF-8.

8. Un polipéptido de conformidad con la rei-vindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende los aminoácidos 22-184 de la Figura 11.

9. Un' polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido com-prende además la secuencia Met-Lys en el extremo N del mismo .

10. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el polipéptido comprende los aminoácidos 22-184 de la Figura 11, y comprende además la secuencia Met-Lys en el extremo N del mismo.

11. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, carac erizado porque el polipéptido comprende los aminoácidos 22-353 de la Figura 11, y comprende además la secuencia Met-Lys en el extremo N del mismo.

12. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende los aminoácidos 1-21 de la Figura 11.

13. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica para un polipéptido MGDF humano.

14. Un polinucleótido -aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque codifica para un polipéptido MGDF humano de conformidad con cual-quiera de las reivindicaciones 1 a la 12.

15. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque es una secuencia de ADN.

16. Una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque es una secuencia de ADNc .

17. Una secuencia de ADNc de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque tiene una secuencia como se muestra en la Figura 11 ó 12.

18. Un vector de ADN caracterizado porque comprende una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 15.

19. El vector de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la secuencia de ADN está operativamente unida a una secuencia de ADN para el control, de la expresión.

20. Una célula huésped, caracterizada porque es establemente transformada o transfectada con una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 15.

21. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque expresa el polipéptido MGDF codificado por dicha secuencia de ADN.

22. Un método para la producción de un polipéptido MGDF humano, caracterizado el método porque comprende el crecimiento de una célula huésped de conformi-dad con la reivindicación 21, en un medio nutritivo apropiado, y se aisla el polipéptido MGDF a partir de dicha célula o del medio nutritivo.

23. Un método para la producción de un poli-péptido MGDF humano de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la célula huésped es una célula de E . coli .

24. Un método para la producción de un poli-péptido MGDF humano de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la célula huésped es una célula CHO.

25. Un anticuerpo, caracterizado porque reac-ciona con un polipéptido MGDF humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

26. Un anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 25.

27. Un anticuerpo recombinante de conformidad con la reivindicación 25.

28. Una composición farmacéutica caracteriza-da porque comprende un polipéptido MGDF humano de confor-midad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12 en 'asociación con un diluyente, adyuvante, o portador farmacéuticamente aceptable.

29. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque está en solución acuosa.

30. Una composición farmacéutica de conformi-dad con la reivindicación 28, caracterizada porque está e.n forma liofilizada. .

31. Un método para el tratamiento de un paciente que tiene una deficiencia de un polipéptido MGPF humano, caracterizado el método porque comprende la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido MGPF humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12, a dicho paciente.

32. Un método para el tratamiento de un paciente que tiene una condición trombocitopénica, caracterizado el método porque comprende la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido MGDF humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12, a dicho paciente.

33. Un método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque dicha condición se selecciona del grupo que consiste de anemia aplástica, trombocitopenia idiopática, y trombocitopenia resultante de tratamiento con fármacos o radiación.

34. Un método para el incremento del número de megacariocitos maduros en un paciente en necesidad del mismo, caracterizado el método porque comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un polipéptido MGDF humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12.

35. Un método para el incremento del número de plaquetas en un paciente en necesidad del mismo, caracterizado el método porque comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un polipéptido MGDF humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12.

36. Un derivado de MGDF, caracterizado porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12, conectado al menos a un polímero soluble en agua.

37. Un derivado de MGDF de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el polipéptido de MGDF se selecciona del grupo que consiste de MGDF- 1, MGDF-2, MGPF-4, MGDF-11, MGPF-12, MGPF-13, MGPF-14, y MGPF-15.

38. Un derivado de MGPF de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el polipéptido de MGPF es recombinantemente producido en una célula bacteriana.

39. Un derivado de MGPF de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el polímero soluble en agua es farmacéuticamente aceptable.

40. Un derivado de MGPF de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste de dextrano, poli (N-vinil-pirrolidona ) , polietilen-glicoles, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de óxido de propileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados , alcoholes polivinílicos y mezclas de los mismos.

41. Un derivado de MGDF de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el polímero soluble en agua es un polietilen-glicol.

42. Un derivado de MGDF de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el polietilenglicol es un monometoxi-polietilen-glicol .

43. Un derivado de MGDF de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el polietilenglicol está unido al polipéptido de MGDF mediante un enlace acilo o un alquilo.

44. El polipéptido de MGDF pegilado, caracte-rizado porque tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12.

45. Un polipéptido de MGDF pegilado, de con-formidad con la reivindicación 44, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 22-184 de la Figura 11.

46. Un polipéptido de MGDF pegilado, de con-formidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el grupo polietilen-glicol está unido al extremo N del mismo .

47. Un polipéptido de MGDF pegilado, de con-formidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el grupo polietilen-glicol tiene un peso molecular promedio de 10 a 50 kilodaltons.

48. Un polipéptido de MGDF pegilado, de con-formidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el polipéptido MGPF es producido en E. coli.

49. Un polipéptido de MGPF monopegilado, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12.

50. Un derivado de MGPF, caracterizado porque comprende un polipéptido de MGPF de conformidad con cual-quiera de las reivindicaciones 1 a la 12, covalentemente unido a dos moléculas poliméricas solubles en agua.

51. Un derivado de MGPF de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque las moléculas poliméricas solubles en agua son ambas polietilen-glico-les

52. Un derivado de MGDF de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el polipéptido de MGDF comprende los aminoácidos 22 al 184 de la Figura 11, y los poliet ilen-glicoles tienen un peso molecular promedio de 5 a 25 kilodaltons.

53. Un método para el enlace o unión de un polipéptido soluble en agua a un polipéptido de MGDF de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12, en donde el polímero soluble en agua tiene un grupo aldehido reactivo simple, el método está caracterizado porque comprende: (a) el poner en contacto el polipéptido de MGDF con un polímero soluble en agua, bajo condiciones de alquilación reductora, a un pH suficientemente ácido para permitir que el grupo alfa-amino en el extremo amino del polipéptido MGDF sea reactivo; y (b) el aislamiento del polipéptido de MGDF unido al menos a un polímero soluble en agua.

54. Un método para el enlace o unión de un polímero soluble en agua a un polipéptido de MGDF de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12, en donde el polímero soluble en agua tiene un grupo éster reactivo simple, el método está caracterizado porque comprende: (a) el poner en contacto el polipéptido de MGDF con un polímero soluble en agua, bajo condiciones de modo que el polipéptido de MGDF se llegue a unir al polímero soluble en agua a través de un enlace acilo; y (b) el aislamiento de un polipéptido de MGDF unido al menos a un polímero soluble en agua.

55. Un método de conformidad con la reivindicación 53 ó 54', caracterizado porque el polímero es farmacéuticamente aceptable.

56. Un método de conformidad con la reivindicación 53 ó 54, caracterizado porque el polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste de dextrano, poli (N-vinil-pirrolidona) , polietilenglicoles, homopolí-meros de polipropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcoholes polivinílicos.

57. Un método de conformidad con la reivindi-cación 53 ó 54, caracterizado porque el polímero soluble en agua es polietilen-glicol.

58. Un método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el pH está entre aproxi-madamente 3 y aproximadamente 9.

59. Un método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque las condiciones de alquilación reductora involucran el uso de cianoborohidruro de sodio como un agente reductor.

60. Un método para el enlace o unión de una molécula de polietilen-glicol a un polipéptido de MGDF de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12, en donde la molécula de polietilen-glicol tiene un grupo aldehido reactivo simple, el método está caracterizado porque comprende: (a) el poner en contacto el polipéptido de MGDF con la molécula de polietilen-glicol bajo condicio-nes de alquilacion reductora, a un pH suficientemente ácido para permitir que el grupo alfa-amino en el extremo amino del polipéptido de MGPF sea reactivo; y (b) la obtención de un polipéptido de MGDF pegilado .

61. Un método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la molécula de polietilen-glicol tiene un peso molecular de 2 a 100 kilodaltons . i

62. Un producto polipeptídico de MGPF pegilado, caracterizado porque se produce mediante el proceso de conformidad con la reivindicación 60.

63. Una preparación substancialmente homogénea de un polipéptido de MGDF de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones a a la 12, caracterizado porque es monopegilado en el grupo alfa-amino en el extremo N del polipéptido de MGDF.

64. Una preparación de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque el polipéptido de MGPF es monopegilado con un polietilen-glicol que tiene un peso molecular promedio de 5 a 50 kilodaltons.

65. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido de MGPF pegilado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a la 49, 51 ó 52, y un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. --A.

66. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende: (a) una preparación substancialmente homogénea del polipéptido de MGPF monopegilado de conformidad 5 con la reivindicación 63, dicho polipéptido de MGPF monopegilado consiste de un polietilen-glicol que tiene un peso molecular de 5 a 50 kilodaltons conectado a un polipéptido de MGPF solamente en el extremo N del mismo, vía un enlace alquilo; y 10 (b) un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. . . . . . . .

67. Un polipéptido de MGPF monopegilado, caracterizado porque comprende los aminoácidos 22-184 de la Figura 11.

68. Un polipéptido de MGPF monopegilado de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el grupo polietilen-glicol está unido al extremo 20 N del polipéptido.

69. Un polipéptido de MGPF monopegilado de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el grupo polietilen-glicol tiene un peso molecu- 25 lar promedio de 2 a 100 kilodaltons. ,-J

70. Un polipéptido de MGDF monopegilado de conformidad con la reivindicación 67, 68 ó 69, caracterizado porque el polípéptido de MGDF ha sido producido en E . coli . 5

71. Un método para la unión de polietilenglicol soluble en agua a un polipéptido de MGDF, que comprende los aminoácidos 22-184 de la Figura 11, el método está caracterizado porque comprende el poner 10 en contacto el polipéptido de MGDF con el polietilenglicol, bajo condiciones de modo que el polipéptido de MGDF se llegue a unir al polietilen-glicol para obtener un polipéptido de MGDF monopegilado. 15

72, Un método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el polietilen-glicol está unido al polipéptido de MGDF bajo condiciones de alquilación reductora, a un pH suficientemente ácido para permitir que el grupo alfa-amino en el extremo N del polipéptido de MGDF sea 20 reactivo.

73. Un método de conformidad con la reivindicación 71 ó 72, caracterizado porque el polipéptido de MGDF es monopegilado con un polietilen-glicol que 25 tiene un peso molecular promedio de 2 a 100 kilodaltons.

74. Un método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el polipéptido de MGDF es elaborado mediante la escisión de Met -2-Lys-1 a partir de un polipéptido obtenido mediante la expresión en una célula de E. coli de un ADN que codifica para un polipéptido que comprende los aminoácidos 22-184 de la Figura 11, y la secuencia de Met-Lys en el extremo N del mismo.

75. Un método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el polipéptido de MGDF es elaborado mediante: a. la' expresión en una célula de E. coli de un ADN que codifica para un polipéptido que comprende los aminoácidos 22-184 de la Figura 11 y la secuencia de Met-Lys en el extremo N del mismo, b. el aislamiento del polipéptido expresado, -2 -1 la escisión de Met -Lys del polipéptido aislado

76. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el polipéptido de MGDF monopegilado de conformidad con la reivindicación 69, y un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. ~-J

77. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 71 , caracterizada porque está en solución acuosa. 5

78. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 76, caracterizada porque está en forma liofilizada.

79. Un método para el tratamiento de un pa-10 cíente que tiene una deficiencia de un polipéptido de MGDF humano, el método está caracterizado porque comprende la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de MGDF monopegilado de conformidad con la reivindicación 69 a dicho paciente. 15

80. Un método para el tratamiento de un paciente que tiene una condición trombocitopénica, el método está caracterizado porque comprende la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido de MGDF 20 monopegilado de conformidad con la reivindicación 69 a dicho paciente.

81. Un método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque dicha condición se 25 selecciona del grupo que consiste de anemia aplástica, trombocitopenia idiopática, y trombocitopenia que resulta de tratamiento con fármacos o radiación.

82. Un método para el incremento del número de megacariocitos maduros en un paciente en necesidad del mismo, el método está caracterizado porque comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un polipéptido de MGDF monopegilado de conformidad con la reivindicación 69.

83. Un método para el increplento del número de' plaquetas en un paciente en necesidad del mismo, el método está caracterizado porque comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un polipéptido de MGDF monopegilado de conformidad con la reivindicación 69. En testimonio de lo cual firmo la presente en esta Ciudad de México, D.F., el 11 de enero de 1996. Apoderado