MXPA06014024A - Metodos relacionados con un unico polimorfismo nucleotidico del receptor acoplado a la proteina g, gpr40. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere a compuestos de formula (I) (ver formula (I)).

Description

MÉTODOS RELACIONADOS CON UN ÚNICO POLIMORFISMO NUCLEOTÍDICO DEL RECEPTOR ACOPLADO A LA PROTEÍNA G, GPR40 CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos de genotipado, métodos de tratamiento, pruebas de diagnóstico y kits y métodos de caracterización de un agente, relacionado con un único polimorfismo nucleotídico del gen GPR40.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La diabetes es una enfermedad grave y a veces mortal que afecta a más de 17 millones de americanos y a 151 millones de personas en todo el mundo. Gadsby (2002). La diabetes procede de la insuficiencia del cuerpo para producir insulina o responder apropiadamente a la misma. La glucosa es el principal sustrato que regula la secreción de la insulina, pero otros nutrientes tales como los ácidos grasos libres (FFA) y los aminoácidos pueden modificar la secreción de insulina. Haber et al. (2002).

Existen dos tipos principales de diabetes. En la diabetes de tipo I, las células R pancreáticas productoras de insulina son destruidas por el propio sistema inmunitario del cuerpo, lo que conduce a una insuficiencia de insulina. La diabetes de tipo II procede de la pérdida de sensibilidad por las células del cuerpo a la acción de la insulina y de la incapacidad del páncreas para liberar la insulina de manera apropiada. La frecuencia de la diabetes de tipo II está aumentando, y, en los Estados Unidos, ha llegado a ser especialmente frecuente en determinadas poblaciones en situación de riesgo. Gadsby (2002). El síndrome metabólico es un conjunto de condiciones metabólicas que aumenta el riesgo de desarrollar diabetes y enfermedades cardiovasculares. Park et al. (2003). Se han descrito procesos incluyendo la obesidad, resistencia a la insulina, dislipidemia e hipertensión que son componentes clave del síndrome metabólico. Reilly y Rader (2003); Park et al. (2003); Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (2001). La obesidad se ha identificado como un factor central que contribuye al síndrome metabóiico. Se ha propuesto que una reducción del exceso de peso corporal minimizaría los riesgos asociados al síndrome metabólico. Shirai (2004). Los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) son una superfamilia de las proteínas de la membrana caracterizados por la presencia de siete segmentos de la hélice a de la transmembrana (denominados TM1 a TM7) que conectan bucles intracelulares y extracelulares alternos. Gether (2000). Los GPCR median la señalización entre las moléculas con señal, tales como las hormonas, neurotransmisores y mediadores locales, y enzimas intracelulares, canales y transportadores iónicos. Véase Johnson y Dhanasekaran (1989). Sawzdargo ef al. (1997) dan a conocer la identificación del gen del GPCR, GPR40, localizado en el cromosoma 19g13.1 , que codifica una proteína de 300 aminoácidos e identificado con el número de registro AF024687 del GenBank®. Haga et al. (2002) dan a conocer 190.562 variaciones genéticas del genoma humano, incluyendo un único polimorfismo nucleotídico del gen GPR40 en el que el nucleótido 632 de la secuencia de codificación (correspondiente al nucleótido 642 en la secuencia con el número de registro AF024687 del GenBank) puede ser guanina (G) o adenosina (A), de manera que el aminoácido 211 es arginina o histidina. Este único polimorfismo nucleotídico está identificado en la base de datos dbSNP del National Center for Biotechnology Information (NCBl) con el número de registro rs2301151. La publicación de la solicitud de patente internacional n° WO 02/057783 y Briscoe et al. (2003) dan a conocer que GPR40 se expresa de manera específica en las células ß pancreáticas así como en el cerebro humano, del ratón y de la rata. Además, el documento WO 02/057783 y Briscoe et al. identifican ligandos de GPR40 con ácidos grasos saturados e insaturados de cadena media y larga procedentes de experimentos de medición de la concentración del ion calcio. Kotarsky ef al. (2003) dan a conocer que GPR40, no solamente es activado por una gama de ácidos grasos, sino también por fármacos antidiabéticos de tiazolidindiona, medidos con un sistema indicador ligado al receptor GPR40. Itoh et al. (2003) dan a conocer que la fijación y activación de GPR40 por ácidos grasos libres aumenta la secreción de insulina. La publicación de la solicitud de patente internacional n° WO 04/072650 da a conocer secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos de GPR40 humano y su regulación para el tratamiento de enfermedades hematológicas, trastornos del sistema nervioso periférico y central, enfermedades gastrointestinales, enfermedades respiratorias, enfermedades metabólicas, cáncer, enfermedades cardiovasculares y enfermedades urológicas en mamíferos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, en parte, a métodos de genotipado, que comprenden la determinación del aminoácido que es codificado por el gen GPR40 de un paciente humano en el aminoácido número 211. En una realización preferida, se determina el aminoácido codificado en el aminoácido número 211 de ambos alelos del gen GPR40. En otra realización preferida, dichos métodos de genotipado conllevan determinar si dicho aminoácido número 211 es otro distinto de histidina. En otra realización preferida, dichos métodos de genotipado conllevan determinar si dicho aminoácido número 211 es arginina. En una realización preferida adicional, dichos métodos de genotipado conllevan determinar si dicho aminoácido número 211 es histidina. En una realización aún más preferida, dichos métodos de genotipado comprenden, el aislar un ácido nucleico de un paciente humano, ampliando una secuencia contigua de dicho ácido nucleico, en la que dicha secuencia contigua comprende los nucleótidos de GPR40 que codifican el aminoácido número 211 , o sus secuencias complementarias, tratar dicha secuencia contigua con una sonda nucleotídica que permite la determinación del aminoácido codificado en el aminoácido número 211 del gen GPR40 de dicho paciente; y determinar si dicha sonda hibrida dicha secuencia contigua en condiciones de alta severidad. En una realización preferida, dicha sonda consiste en un fragmento contiguo de una secuencia nucleotídica de la SEQ. ID. n°: 9 o de la SEQ. ID. n°: 10 que tiene una longitud de aproximadamente 13 a aproximadamente 35 nucleótidos, unidos a un marcador detectable, e incluyendo los nucleótidos que codifican el aminoácido 211 , o su secuencia nucleotídica complementaria. Un aspecto adicional de la invención proporciona métodos de tratamiento, que comprenden, determinar el aminoácido que es codificado por el gen GPR40 de un paciente humano en el aminoácido número 211 y tratar a dicho paciente con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o un proceso patológico mediado por tener al menos un alelo, y preferentemente ambos alelos, del gen GPR40 en los que el aminoácido codificado número 211 es otro distinto de la histidina, preferentemente arginina. En una realización preferida, dicho agente se selecciona entre insulina, un compuesto de sulfonilurea que estimula la secreción de insulina, un inhibidor de glucógeno fosforilasa, un inhibidor de la producción de biguanida glucosa hepática, un inhibidor de alfa-glucosidasa, un inhibidor de la proteína tírosina fosfatasa-1 B, un inhibidor de dipeptidil peptidasa IV, un inhibidor de glucógeno sintetasa cinasa-3 beta, un agonista del receptor gamma activado por el proliferador de peroxisoma, un antagonista del receptor de glucagón, un inhibidor selectivo de reabsorción de serotonina, un inhibidor de 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa, un agonista del ácido gamma-aminobutírico, un inhibidor de la enzima convertidora en angiotensina, un antagonista receptor de angiotensina-ll, un inhibidor de fosfodiesterasa de tipo 5, un inhibidor de sorbitol deshidrogenasa y un inhibidor de aldosa reductasa, uno de sus profármacos farmacéuticamente aceptables o de sus sales farmacéuticamente aceptables. En otra realización preferida, dicho agente es un agente contra la obesidad, preferentemente seleccionado de un inhibidor de la proteína de transferencia de la secreción de apolipoproteína B/triglícerido de microsomas, un inhibidor de 1 1 ß-hidroxi esteroide deshidrogenasa-1 , un péptido YY3-36, un análogo del péptido YY3-36, un agonista canabinoide, un agonista de MCR-4, un agonista de colecistoquinina-A, un inhibidor de reabsorción de monoamina, un agente simpatomimético, un agonista de receptor adrenérgico ß3, un agonista de dopamina, un análogo del receptor de hormona estimulante de melanocitos, un agonista de 5HT2c, un antagonista de la hormona concentradora de melanina, leptina, un análogo de leptina, un agonista de receptor de leptina, un antagonista de galanina, un inhibidor de lipasa, un agente anorexígeno, un antagonista de receptor de neuropéptido-Y, un agente tiromimético, deshidroepiandrosterona, un análogo de deshidroepiandrosterona, un agonista de receptor glucocorticoide, un antagonista de receptor de orexipa, un agonista de receptor de péptido-1 tipo glucagón, un factor neurótrofo ciliar, una proteína humana relacionada con el agutí, un antagonista de receptor de ghrelin, un antagonista de receptor de histamina 3, un agonista inverso. de receptor de histamina 3 y un agonista de receptor U de neuromedina. Otro aspecto de la invención se refiere a kits, que comprenden una sonda nucleotídica que permite la determinación del aminoácido codificado en el aminoácido número 211 del gen GPR40 de un paciente humano. En una realización preferida, dicha sonda permite la determinación si el aminoácido número 211 de dicho gen GPR40 es histidina. En otra realización, dicha sonda permite la determinación si el aminoácido número 211 de dicho gen GPR40 es otro distinto de histidina, preferiblemente arginina. En una realización preferida adicional, dicha sonda consiste en un fragmento contiguo de una secuencia nucleotídica de la SEQ. ID. n°: 9 o de la SEQ. ID. n°: 10 que tiene una longitud de aproximadamente 13 a aproximadamente 35 nucleótidos, unidos a un marcador detectable, e incluyendo los nucleótidos que codifican el aminoácido 211 , o su secuencia nucleotídica complementaria. En una realización preferida adicional, dichos kits comprenden además: un primer cebador nucleotídico de la reacción en cadena de la polimerasa que es complementario con una secuencia nucleotídica que está aguas abajo de los nucleótidos que codifican el aminoácido 211 de dicho gen GPR40 y un segundo cebador de la reacción en cadena de la polimerasa que es complementario de una secuencia nucleotídica que está aguas arriba de los nucleótidos que codifican dicho aminoácido 211 ; o un primer cebador que es complementario con una secuencia nucleotídica que está aguas arriba de los nucleótidos que codifican el aminoácido 21 1 y un segundo cebador de la reacción en cadena de la polimerasa que es complementario de una secuencia 'nucleotídica que está aguas abajo de los nucleótidos que codifican dicho aminoácido 211. En otra realización preferida, dichos kits comprenden además un recipiente. Un aspecto adicional de la invención se refiere a los métodos de caracterización de un agente, que comprende medir la inhibición competitiva mediante un agente de ensayo de la fijación de un ligando GPR40 a un primer receptor GPR40 humano en el que el aminoácido número 211 es la histidina y medir la inhibición competitiva mediante dicho compuesto de fijación de un ligando de GPR40 a un segundo receptor GPR40 humano en el que el aminoácido número 21 1 es otro distinto de histidina. En una realización preferida, el aminoácido número 211 de dicho segundo receptor es la arginina. En una realización más preferida, los métodos comprenden además comparar la inhibición competitiva de la fijación con dicho compuesto de dicho primer receptor y de dicho segundo receptor. Un aspecto adicional de la invención se refiere a los métodos de caracterización de un agente, que comprenden, medir la activación mediante un de agente de ensayo de un primer receptor GPR40 humano en el que el aminoácido número 211 es la histidina y medir la activación medíante un agente de ensayo de un segundo receptor GPR40 humano en el que el aminoácido número 211 es otro distinto de la histidina. En una realización preferida, el aminoácido número 211 de dicho segundo receptor es la arginina. En una realización más preferida, dichos métodos comprenden además comparar la activación mediante dicho compuesto de dicho primer receptor y de dicho segundo receptor. Otro aspecto de la invención proporciona métodos de caracterización de un agente, que comprende medir la inhibición mediante un agente de ensayo de la activación de un primer receptor GPR40 humano mediante un activador de GPR40, en el que el aminoácido número 211 de dicho primer receptor es la histidina y medir la inhibición mediante un agente de ensayo de la activación de un segundo receptor GPR40 humano por un activador de GPR40, en el que el aminoácido número 211 de dicho segundo receptor es otro distinto de la histidina, preferentemente, la arginina. En una realización más preferida, dichos métodos comprenden además comparar la inhibición de la activación mediante dicho compuesto de dicho primer receptor y de dicho segundo receptor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra la activación de GPR40 por los compuestos de tiazolidindiona medida por liberación del ion calcio intracelular en células HEK 293 que expresan a GPR40 comparadas con células HEK 293 que no expresan a GPR40. La Figura 2 presenta una comparación entre la activación por los compuestos de tiazolidindiona de GPR40 con histidina frente a arginina en el aminoácido 211 medida por liberación del ion calcio intracelular en las células HEK 293 que expresan a GPR40. La Figura 3 presenta las curvas de regresión logística (líneas llenas) con límites de confianza del 95% (líneas de puntos) y los puntos de datos individuales para cada genotipo de GPR40 en una población de 2465 pacientes (1332 masculinos y 857 femeninos) comparando el índice de masa corporal con la probabilidad de padecer diabetes. Los puntos de datos en la parte superior del gráfico indican el índice de masa corporal de pacientes con diabetes. Los puntos de datos en la parte inferior del gráfico indican el índice de masa corporal de pacientes que no padecen diabetes. La Figura 4 presenta una cartografía de restricción del vector de expresión utilizado para preparar las células HEK 293 que expresan a GPR40. La Figura 5 presenta las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos (SEQ. ID. n°:1 y 2 respectivamente) que codifican el GPR40 humano en la que los nucleótidos que codifican el aminoácido número 211 y el aminoácido número 211 como arginina están subrayados. La Figura 6 presenta las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos (SEQ. ID. n°:3 y 4 respectivamente) que codifican el GPR40 humano en la que los nucleótidos que codifican el aminoácido número 211 y el aminoácido número 211 como histidina están subrayados. La Figura 7 presenta las secuencias de cebadores de PCR y de sondas de PCR que pueden utilizarse para ampliar y detectar las secuencias que contienen los alelos de GPR40. La Figura 7 asimismo presenta las secuencias nucleotídicas que codifican el aminoácido número 211 ya sea como histidina (SEQ. ID. n°: 9) o arginina (SEQ. ID. n°: 10). La Figura 8 presenta la secuencia de un montaje del vector de expresión que contiene un alelo de GPR40 que codifica a histidina en el aminoácido número 211.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los términos y expresiones utilizados en la presente memoria tienen su significado habitual en la técnica. Sin embargo, para aclarar aún más la presente invención y por conveniencia, a continuación se proporciona el significado de ciertos términos y frases empleados en la memoria descriptiva, incluyendo los ejemplos y reivindicaciones adjuntas. El/Ios término(s) "agente(s)" significa(n) sustancias, incluyendo péptidos, y compuestos para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o proceso patológico que está mediado por tener al menos un alelo, preferentemente ambos alelos, del gen GPR40 en el que el aminoácido codificado número 21 1 es otro distinto de histidina, preferentemente arginina, tal como se describe con más detalle en la presente memoria descriptiva. La expresión "aminoácido número 211" con respecto al gen GPR40 se refiere a un resto del aminoácido número 211 en la secuencia con número de registro AF024687 de GenBank, también mostrada en las SEQ. ID. n° 2 y n° 4. La expresión "condiciones de alta severidad" significa condiciones de lavado a 68°C en presencia de aproximadamente 0,2 x SSC y aproximadamente 0,1 % de SDS, durante 1 hora. Variaciones útiles de estas condiciones de lavado serán obvias para los expertos en la materia. Generalmente, la severidad de la hibridación se expresa, en parte, con referencia a la temperatura a la que se realiza la etapa de lavado. Generalmente, dichas temperaturas de lavado se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C a 20°C inferiores al punto de fusión térmico (Tm) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. El Tm es la temperatura (a fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente emparejada. Una ecuación para calcular Tm y las condiciones de hibridación del ácido nucleico son bien conocidas y pueden encontrarse en Sambrook (1989), véase el volumen 2, capítulo 9. El término "diabetes" significa diabetes mellitus tal como lo interpretan los expertos en la materia. El término incluye diabetes mellitus de tipo 1 , también conocida como diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), y diabetes mellitus de tipo II, también conocida como diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM). La Organización Mundial de la Salud (O. M.S.) ha sugerido criterios para diagnosticar la diabetes mellitus (O.M.S. 1980/85 Technical Report Series n° 646/727). La diabetes ha sido caracterizada asimismo por el National Diabetes Data Group (véase National Diabetes Data Group: Classification and diagnosis of diabetes mellitus and other categories of glucose intolerance, Diabetes, 28:1039-1044, 1979). Sin embargo, más recientemente, por ejemplo la American Diabetes Association, ha publicado directrices para facilitar el diagnóstico de la diabetes de tipo I y de tipo II (véase, por ejemplo, ADA (2004)). La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente que (i) trata o previene una enfermedad, proceso o trastorno determinado; (ii) atenúa, mejora o elimina uno o más síntomas de una enfermedad, proceso o trastorno determinado; o (iii) evita o retarda el comienzo de uno o más síntomas de una enfermedad, proceso o trastorno determinado. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser determinada por cualquier experto en la materia, basándose en la presente descripción, sobre una base individual y se basará, al menos en parte, en consideraciones de la especie del paciente, el tamaño del paciente, el tipo de sistema de administración utilizado y el tipo de administración con relación a la evolución de la enfermedad. La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" incluye tanto las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables como las sales catiónicas farmacéuticamente aceptables, en cada caso. Las "sales catiónicas farmacéuticamente aceptables" incluyen, pero no se limitan a, sales tales como las sales de metales alcalinos (p. ej., sodio y potasio), sales de metales alcalinotérreos (p. ej., calcio y magnesio), sales de aluminio, sales de amonio y sales con aminas orgánicas tales como: benzatina (N,N'-dibenciletilendiamina), colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (N-metilglucamina), benetamina (N-bencilfenetilamina), dietilamina, piperazina, trometamina (2-amino-2-hidroximetil-1 ,3-propanodiol) y procaína. La expresión "sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables" se desea que defina, pero no se limita a incluir, sales tales como las sales de hidrocloruro, besilato, hidrobromuro, sulfato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, fosfato dibásico, acetato, succinato, citrato, metansulfonato (mesilato) y p-toluensulfonato (tosilato). Una sal particularmente preferida es la sal sódica. Las descripciones de los compuestos que aparecen en la presente memoria que incluyen la frase "sus profármacos o sus sales farmacéuticamente aceptables" o una frase sustancialmente similar significan que incluyen tanto las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos aplicables así como las sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos. La terminología "profármaco" quiere decir un compuesto que se transforma in vivo para producir un compuesto de la presente invención. La transformación puede - tener lugar por varios mecanismos, como por hidrólisis en la sangre. Higuchi y Stella (1987) proporcionan una exposición del uso de profármacos. Por ejemplo, cuando un compuesto de la presente invención contiene un grupo funcional de ácido carboxílico, un profármaco puede comprender un éster formado por la sustitución del átomo de hidrógeno del grupo ácido con un grupo tal como alquilo (C1-C8), alcanoiloximetilo (C2-C12), 1-(alcanoiloxi)etilo que tiene de 4 a 9 átomos de carbono, 1-metil-1- (alcanoiloxi)-etilo que tiene de 5 a 10 átomos de carbono, alcoxicarboniloximetilo que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, 1-(alcoxicarboniloxi)etilo que tiene de 4 a 7 átomos de carbono, 1 -metil-1 -(alcoxicarboniloxi)etilo que tiene de 5 a 8 átomos de carbono, N-(alcoxicarbonil)aminometilo que tiene de 3 a 9 átomos de carbono, 1-(N- (alcoxicarbonil)amino)etilo que tiene de 4 a 10 átomos de carbono, 3-ftalidilo, 4-crotonolactonilo, gamma-butirolacton-4-ilo, di-N, N-alquil (C1-C2)amino-alquilo (C2- C3) (tal como b-dimetilaminoetilo), carbamoil-alquilo (C1-C2), N,N-di-alquilcarbamoil (C1-C2)-alquilo (C1-C2) y piperidino-, pirrolidino- o morfolino-alquilo (C2-C3). Así mismo, cuando un compuesto de la presente invención comprende grupo funcional alcohólico, puede formarse un profármaco mediante la sustitución del átomo de hidrógeno del grupo alcohólico por un grupo tal como: alcanoil (C1-C6)-oximetilo, 1- (alcanoil (C1-C6)oxi)etilo, 1-metil-1-(alcanoil (C1-C6)oxi)etilo, alcoxi (C1- C6)carboniloximetilo, N-alcoxi (C1-C6)carbonilaminometilo, succinoílo, alcanoílo (C1- C6), a-aminoalcanoílo (C1-C4), arilacilo y a-aminoacilo o a-aminoacil-a-aminoacilo, donde cada grupo a-aminoacilo se selecciona independientemente de los L-aminoácidos que se encuentran en la naturaleza, P(O)(OH)2, -P(O)(Oalquilo(C1- C6))2 o glicosilo (radical resultante de la eliminación de un grupo hidroxilo de la forma hemiacetálica de un carbohidrato). Cuando un compuesto de la presente invención comprende un grupo funcional amino, puede formarse un profármaco mediante la sustitución de un átomo de hidrógeno en el grupo amino con un grupo tal como RX-carbonilo, RXO-carbonilo, NRXRX'-carbonilo donde RX y RX' son cada uno independientemente alquilo (C1-C10), cicloalquilo (C3-C7), bencilo o RX-carbonilo es un a-aminoacilo natural o un a-aminoacilo natural a-aminoacilo natural, -C(OH)C(O)OYX en la que YX es H, (alquilo o bencilo (C1-C6)), -C(OYXO) YX1 en la que YXO es alquilo (C1-C4) e YX1 es alquilo (C1-C6), carboxi alquilo (C1-C6), amino alquilo (C1-C4) o mono-N- o di-N,N-(C1-C6)alquilaminoalquilo, -C(YX2) YX3 en la que YX2 es H o metilo e YX3 es mono-N- o di-N,N-(C1-C6)alquilamino, morfolino, piperidin-1-ilo o pirrolidin-1-ilo. "Secuencia nucleotídica" y "polinucleótido" significa ADN o ARN, si está en forma de una sola cadena o de doble cadena. La expresión "secuencia nucleotídíca complementaria" significa una secuencia nucleotídica que se hibrida (se une) con otra secuencia nucleotídica según el emparejamiento de un nucleótido de guanidina (G) con un nucleótido de citidina (C) y un nucleótido de adenosina (A) con un nucleótido de timidina (T), excepto en el ARN en que una T se sustituye con un nucleótido de uridina (U) de manera que U se une con A. Las abreviaturas utilizadas en la presente memoria tienen su significado habitual en la técnica. Sin embargo, para aclarar aún más la presente invención, por conveniencia, a continuación se proporciona el significado de ciertas abreviaturas: "°C" significa grados centígrados; "CO2" significa dióxido de carbono; "DMEM" significa Medio Eagle modificado por Dulbecco; "ADN" significa ácido desoxirribonucleico; "FBS" significa suero bovino fetal; "g" significa gramo; "HEPES" significa ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfónico; "kg" significa kilogramo; "mg" significa miligramo; "ml" significa mililitro; "mM" significa milimolar; "µl" significa microlitro; "µM" significa micromolar; "ng" significa nanogramo; "nm" significa nanómetro; "nM" significa nanomolar; "PCR" significa reacción en cadena de la polimerasa; "Pen/Strep" significa una mezcla que contiene penicilina y estreptomicina; "ARN" significa ácido ribonucleico; "RPM" significa revoluciones por minuto; y "x g" significa número de veces la aceleración de la gravedad. En esta descripción se utilizan las siguientes abreviaturas de aminoácidos: A - Alanina T - Treonina V - Valina C - Cisteína L - Leucina Y - Tirosina I - Isoleucina N - Asparagina P - Prolina Q - Glutamina F - Fenilalanina D - Ácido aspártico W - Triptófano E - Ácido glutámico M - Metionina K - Lisina G - Glicina R - Arginina S - Serina H - Histidina El gen del GPCR, GPR40, identificado con el número de registro AF024687 del GenBank, codifica una proteína de 300 aminoácidos. Sawzdargo ef al. (1997). GPR40, que es muy expresada en las células pancreáticas de los islotes ha estado ligado a la regulación de la secreción de insulina y, por lo tanto, se ha propuesto como diana para el tratamiento de la diabetes. Briscoe et al. (2003); Itoh et al. (2003). Kotarsky et al. (2003) proponen que GPR40 media las respuestas a los fármacos para la diabetes de tipo tiazolidindiona. Como con otros GPCR, GPR40 está implicado en la transmisión de las señales extracelulares en la célula. La activación de GPR40 produce la liberación, a través de la serie de reacciones que implican la proteína Gq, del calcio intracelular. Briscoe et al. (2003). El flujo de calcio resultante es útil para detectar la activación de GRP40 por los métodos conocidos por los expertos en la materia basados en la presente descripción (véanse, por ejemplo: Kotarsky ef al. (2003); Briscoe et al. (2003)). La tiazolidindiona y determinados ácidos grasos son conocidos por activar el GPR40. Kotarsky ef al. (2003) y Briscoe ef al. (2003). Como se ilustra en la Figura 1 , en la presente memoria, los compuestos de tiazolidindiona estimulan la liberación del ion calcio intracelular en las células que expresan a GPR40 en comparación con las células que no expresan a GPR40. Esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que un solo polimorfismo nucleotídico influye en la activación de GPR40, por ejemplo, mediante los fármacos de tipo tiazolidindiona. Este polimorfismo, que tiene lugar en el nucleótido 632 de la secuencia de codificación de GPR40 (correspondiente al nucleótido 642 en la secuencia de número de registro AF024687 del GenBank), implica una sustitución de A por otro nucleótido distinto de G, y preferiblemente éste, resultante de una sustitución del aminoácido en el resto 21 1 desde la histidina hasta otro aminoácido distinto de la histidina, preferentemente arginina. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de GPR40 en las que el aminoácido 211 es arginina aparecen en la SEQ. ID. n° 1 y n° 2 respectivamente. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de GPR40 en las que el aminoácido 211 es histidina aparecen en la SEQ. ID. n° 3 y n° 4 respectivamente. Tal como se ilustra en la Figura 2, las células en las que el nucleótido 632 de GPR40 es G presentan una respuesta mayor a, por ejemplo, la activación de tiazolidindiona, en comparación con las células con el A nucleótido en la posición 632. La Figura 2 presenta los resultados de un ensayo celular que mide el ion calcio intracelular en células con el nucleótido G frente al A en la posición 632. Además, esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que individuos que tienen G en el nucleótido 642, particularmente aquellos que tienen G en ambos alelos, presentan un riesgo mayor de diabetes en comparación con los individuos en los que el nucleótido es A. Tal como se ilustra en la Figura 3, para un índice de masa corporal dado los pacientes que sean heterocigóticos u homocigóticos A en el nucleótido 642 tienen una probabilidad significativamente inferior de padecer diabetes de tipo II que un paciente que sea homocigótico G. La presente invención comprende la caracterización de métodos y los métodos de tratamiento o prevención de enfermedades o procesos patológicos que están relacionados con los que tienen al menos un alelo, preferentemente ambos aleles, de GPR40 en los que el aminoácido codificado número 21 1 es otro distinto de histidina, preferentemente arginina. El genotipado de pacientes por los métodos de la invención puede realizarse por los métodos conocidos por los expertos en la materia basándose en la presente descripción. Ejemplos de métodos se describen, por ejemplo, en el capítulo 2 de Dracopoli ef al. (2004). El genotipado puede realizarse utilizando tejido apropiado de un paciente tal como es conocido por los expertos en la materia basándose en la presente descripción. En una realización preferida, se aisla ADN para genotipado procedente de una muestra de sangre completa por procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia basándose en la presente descripción. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo utilizando una variedad de kits disponibles en el mercado, tales como, el kit Puregene® para aislamiento de ADN (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN), el kit para aislamiento de ADN en la sangre (n° de catálogo 2-032-805, Roche Diagnostics Corporation), el kit GenomicPrep™ para aislamiento del ADN en la sangre (n° de catálogo 27-5236-01 , Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ), el kit PAXgene para ADN en la sangre (n° de catálogo 761133, QIAGEN Inc., Valencia, CA), el kit GNOME® para aislamiento de ADN en la sangre completa (n° de catálogo 2011-600, Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA) y el Kit Wizard® para purificación del ADN genómico (n° de catálogo A1120, Promega U.S., Madison, Wl). La zona de ácido nucleico que contiene el único polimorfismo nucleotídico puede ampliarse, por ejemplo, mediante técnicas de PCR utilizando un cebador transcrito y uno complementario y una sonda de detección. Sin embargo, pueden utilizarse asimismo otros de métodos de ampliación de ácido nucleico, incluyendo la reacción en cadena de la ligasa (véase, por ejemplo, Abravaya, K. ef al. (1995), la ampliación de la señal del ADN ramificado (véase, por ejemplo, Jrdea, M.S. ef al. (1993)), secuencia isotérmica de ácido nucleico basada en la ampliación (NASBA) (véase, por ejemplo, Kievits, T. ef al. (1991)), y otros ensayos independientes de replicación de la secuencia. Los métodos para la preparación de cebadores y sondas de PCR son bien conocidos en la técnica, y están descritos, por ejemplo, en Sambrook ef al. (1989), Ausubel ef al. (1994) e Innis ef al. (1990). Pares cebadores de PCR pueden proceder de secuencias, conocidas por ejemplo, utilizando programas informáticos pensados con esta finalidad tal como Primer (Versión 0.5, 1991 , Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA). Pueden seleccionarse oligonucleótidos para su utilización como cebadores utilizando programas informáticos conocidos en la materia para tales fines. Por ejemplo, la versión 6 del programa informático OLIGO® (Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO, www.oliqo.net) sirve para la selección de pares cebadores PCR de hasta 100 nucleótidos cada uno. Programas similares de selección de cebador han incorporado características adicionales para capacidades ampliadas. Por ejemplo, el programa para la selección de cebador PrimOU (disponible al público en el Genome Center de la Universidad de Texas, South West Medical Center, Dallas TX, ftp://ftp.qenome.ou.edu/pub/proqrams/primou src.tar) es capaz de seleccionar cebadores específicos a partir de secuencias de la megabase y sirve por tanto para diseñar cebadores en un ámbito amplio del genoma. El Primera, versión 0.9 del programa para la selección de cebador (disponible al público en el Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Cambridge MA, http://www-genome.wi.mit.edu/qenome software/other/primer3.html) permite al usuario introducir un "mispriming library" en el que las secuencias impiden que los puntos de unión del cebador sean específicos para el usuario. Primer3 sirve, en particular, para la selección de oligonucleótidos para chips. (El código original para los dos últimos programas de selección de cebador puede obtenerse también a partir de sus respectivas fuentes y modificarse para satisfacer las necesidades específicas del usuario). El programa PrimeGen (disponible al público en el UK Human Genome Mapping Project Resource Centre, Cambridge UK, http://www.hqmp.mrc.ac.uk Reqistered/Option/primeqen.html) diseña cebadores basados en alineaciones de secuencia múltiples, permitiendo de este modo la selección de cebadores que se hibridan con las zonas más conservadas o menos conservadas de las secuencias alineadas de ácido nucleico. Por consiguiente, este programa sirve para la identificación de fragmentos de oligonucleótidos y polinucleótidos tanto únicos como conservados. Otros métodos de selección serán evidentes para los expertos en la materia basándose en la presente memoria descriptiva. Preferentemente, la longitud de la secuencia utilizada para las sondas se minimiza utilizando un aglutinante menor con surco (MGB) unido a la secuencia de la sonda para discriminar entre las dos SNP. Los MGB son conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, tal como se da a conocer en las Patentes U.S. n° 5.801.155; n° 6.084.102; n° 6.426.408; n° 6.312.894; y n° 6.683.173. En una realización preferida, se utiliza la versión 1.5 del programa informático Primer Express® (Applied Biosystems, Foster City, CA) para diseñar cebadores y sondas de PCR para la puesta en práctica de la invención. Ejemplos de cebadores incluyen CTTGGCCATCACAGCCTTCT para el cebador transcrito (SEQ. ID. n°: 5) y CCACGTTGGAGGCGTTGT para el cebador complementario (SEQ. ID. n°: 6). Las sondas pueden ser sondas TagMan® MGB marcadas con colorantes FAM™ y VIC® (Applied Biosystems) que tienen las secuencias 6FAM-CACTGGCCCACTCT y VIC-CACTGGCCCGCTC (SEQ. ID. n° 7 y n° 8 respectivamente). El ADN aislado de un paciente se trata con reactivos de PCR, incluyendo los cebadores y sondas, y se expone a un ciclo térmico repetido para desarrollar la reacción PCR. La detección de la SNP puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando una fluorescencia basada en el sistema de detección de secuencias tal como el ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System (AME Bioscience, Toroed, Noruega). La invención también comprende kits de ensayo de diagnóstico para determinar si un paciente posee otro nucleótido distinto de A, preferentemente G, en el nucleótido 632 de la secuencia de codificación de GPR40. Por ejemplo, el kit puede comprenden un reactivo tal como una sonda de ácido nucleico marcada o que se puede marcar capaz de detectar si un paciente tiene A o G en el nucleótido 632 de la secuencia de codificación de GPR40. Dicha sonda tiene preferentemente menos de 35 nucleótidos de longitud, más preferentemente, menos de 25 nucleótidos y, aún más preferentemente, entre 13 y 25 nucleótidos. El kit puede comprender además reactivos, tales como cebadores de PCR, para ampliar la zona de ácido nucleico que contiene el nucleótido 632. Los reactivos pueden envasarse en un recipiente adecuado. El kit puede comprender además instrucciones para utilizar el kit para detectar si un paciente tiene A o G en el nucleótido 632 de la secuencia de codificación de GPR40. 5 La presente invención proporciona métodos para identificar agentes de ensayo que activan GPR40 comparando la activación mediante un agente de ensayo de un primer receptor de GPR40 humano en el que el aminoácido 211 es otro distinto de histidina, preferentemente arginina, para la activación mediante un agente de ensayo de un segundo receptor humano de GPR40 en el que el aminoácido 211 es la histidina. En la puesta en práctica de esta invención puede utilizarse cualquier método apropiado que mida la activación de GPR40. Tales métodos son conocidos o serán evidentes para los expertos en la materia basándose en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, en una realización preferida, dichos métodos implican la utilización de colorantes sensibles al calcio en un sistema lector de placas de diagnóstico por imagen fluorométrica (Le., FLIPR®) que mide el flujo de calcio tras la activación de los receptores acoplados a la proteína G mediada por la proteína Gq (véase, por ejemplo, Chambers et al. (2003). Otros métodos conocidos en la técnica incluyen la utilización de proteínas de fijación de calcio (Miyawaki ef al. (1997), Kain (1999)) y de luciferasa sensible al calcio (Button y Brownstein (1997), Stables ef al. (1997)). La invención proporciona además métodos para identificar agentes de ensayo que inhiben la activación de GPR40 comparando la inhibición de la activación mediante un agente de ensayo de un primer receptor de GPR40 humano en el que el aminoácido 21 1 es la histidina, con la inhibición de un segundo receptor humano de GPR40 en el que el aminoácido 211 es otro distinto de histidina, preferentemente arginina. Dichos métodos pueden utilizar los ensayos de activación descritos anteriormente que utilizan un activador conocido de GPR40 en combinación con un agente de ensayo. La señal detectable producida se compara con la señal que sería de esperar si se utilizase el activador conocido por sí mismo. Varios activadores de GPR40 son conocidos en la materia y pueden utilizarse para dichos métodos, incluyendo los descritos en Kotarsky ef al. (2003), Briscoe ef al. (2003) y en la publicación de la solicitud de patente internacional n° WO 02/057783. Esta invención también comprende los métodos para identificar los agentes de ensayo que se fijan a GPR40, comparando la inhibición competitiva mediante un agente de ensayo de fijación de un ligando conocido de GPR40 a un primer receptor GPR40 humano en el que el aminoácido número 211 es la histidina con la inhibición competitiva mediante el compuesto de fijación del ligando conocido a un segundo receptor GPR40 humano en el que el aminoácido número 211 es otro distinto de histidina, preferentemente argínina. El ligando puede estar marcado con un marcador detectable como es bien conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, radioisótopos, colorantes fluorescentes y enzimas. Varios ligandos de GPR40 son conocidos en la materia y pueden utilizarse para dichos métodos, incluyendo los descritos en Kotarsky et al. (2003), Briscoe et al. (2003) y en la publicación de la solicitud de patente internacional n° WO 02/057783. Los expertos en la materia apreciarán, basándose en la presente descripción, que la comparación de la activación, inhibición o activación e inhibición de la fijación de los métodos para identificar los agentes de ensayo de esta invención puede realizarse por cualquiera de numerosas formas. Por ejemplo, la medida de la activación y la inhibición de la activación de GPR40 puede realizarse utilizando métodos fluorométricos o colorimétricos que miden el flujo de calcio (p. ej., FLIPR). Por consiguiente, la activación de GPR40 puede cuantificarse exactamente por dichos métodos, por ejemplo, utilizando un instrumento detector de luz que genera un valor numérico. Los valores resultantes de dichas mediciones pueden compararse por medios automáticos o manuales. Por ejemplo, un método práctico, particularmente donde se han generado numerosos valores, implicaría comparar los valores utilizando un sistema informático por los métodos bien conocidos por los expertos en la materia.

Además, la presente invención comprende métodos de tratamiento o prevención de enfermedades o procesos patológicos que están relacionados con los que tienen al menos un alelo, preferentemente ambos aleles, de GPR40 en los que el aminoácido codificado número 21 1 es otro distinto de histidina, preferentemente arginina. Los métodos para identificar dichas enfermedades o procesos son bien conocidos por los expertos en la materia o serán evidentes basándose en la presente descripción. Por ejemplo, la Figura 3 ilustra los resultados de un estudio que compara el genotipo de pacientes con diabetes de tipo II con pacientes que no padecen diabetes. Para los expertos en la materia será evidente que pueden emplearse métodos similares a los descritos en la Figura 3 y en el Ejemplo 5 para identificar otras enfermedades o procesos que están relacionados con las que tienen al menos un alelo, preferentemente ambos alelos, de GPR40 en los que el aminoácido codificado número 211 es distinto de histidina, preferentemente arginina. En una realización de la presente invención, una enfermedad o proceso patológico mediado por tener al menos un alelo, preferentemente ambos alelos, de GPR40 en la que el aminoácido codificado número 21 1 es distinto de histidina, preferentemente arginina es la diabetes, preferentemente la diabetes de tipo II. En otra realización, las enfermedades o procesos son complicaciones asociadas a la diabetes.

Dichas complicaciones comprenden la arteriosclerosis, cardiomiopatía diabética, cataratas, úlceras de los pies, macroangiopatía diabética, microangiopatía diabética, nefropatía diabética, retinopatía diabética y neuropatía diabética. En una realización adicional, dichas enfermedades o procesos son alguno de los factores de riesgo asociados al síndrome metabólico, incluyendo la obesidad, hipertensión, resistencia a la insulina, diabetes de tipo II y dislipidemia. La presente invención proporciona métodos de tratamiento relacionados con la administración de un agente para el tratamiento o prevención de una enfermedad o proceso patológico mediada por tener al menos un alelo, preferentemente ambos alelos, del gen GPR40 en el que el aminoácido codificado número 211 es distinto de histidina, preferentemente arginina (definidos anteriormente como "agentes"). Los agentes serán evidentes para los expertos en la materia basándose en esta descripción o pueden ser fácilmente identificados por los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los agentes pueden comprender insulina, compuestos de sulfonilurea que estimulan la secreción de insulina, inhibidores de glucógeno fosforilasa (GPI), inhibidores de producción de glucosa hepática biguanida, compuesto antidiabético tiazolidíndiona, inhibidores de alfa-glucosidasa, inhibidores de la proteína tirosina fosfatasa-1 B (PTP-1 B), inhibidores de dipeptidil peptidasa IV (DPPIV), inhibidores de glucógeno sintetasa cinasa-3 beta (GSK-3ß), agonistas del receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma (PPARy), antagonistas de receptor de glucagón, inhibidores selectivos de reabsorción de serotonina (SSRI), inhibidores de 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (estatinas), agonistas del ácido y-aminobutírico (GABA), inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE), antagonistas del receptor de angiotensina-ll (A-ll) , inhibidores de la fosfodiesterasa de tipo 5 (PDE-5), inhibidores de sorbitol deshidrogenasa (SDI). e inhibidores de aldosa reductasa (ARI). Los agentes pueden incluir cualquier inhibidor de la proteína tirosina fosfatasa-1 B (PTP-1 B). La expresión inhibidor de la proteína tirosina fosfatasa-1 B se refiere a cualquier compuesto que inhiba la enzima proteína tirosina fosfatasa-1 B. PTP-1 B se cree que inhibe la capacidad de la insulina para reducir las concentraciones de azúcar en sangre. Ejemplos de inhibidores de PTP-1 B, análisis para identificar dichos inhibidores y dosis y métodos preferidos de administración se dan a conocer en las siguientes patentes de Estados Unidos, publicaciones de solicitud de patente internacional y otras publicaciones: U.S. n° 6.251.936, n° U.S. 6.221.902, n° U.S. 6.057.316, n° U.S. 6.001.867, n° U.S. 5.753.687, WO 01/46203, WO 01/46204, WO 01146206, WO 01/17516, WO 00/53583, WO 99/58518, WO 99/61435, WO 99/58521 , WO 99/58522, WO 99/58514, WO 99/58520, WO 99/58519, WO 99/58511 , WO 99/61410, WO 99/15529, Malamas et al. (2000A), Bleasdale ef a/. (2001), Wrobel ef al. (1999), Malamas ef al. (2000B), Wang et al. (1998), Andersen ef al. (2000), Iversen et al., (2000), Wrobel et al. (2000) y Kees (1996). Los agentes pueden incluir cualquier antagonista del receptor de glucagón. La expresión antagonistas del receptor de glucagón se refiere a cualquier compuesto que antagonice el receptor de glucagón, inhibiendo así la liberación de la glucosa inducida por la fijación de glucagón al receptor de glucagón. Dicho antagonismo es determinado fácilmente por los expertos en la materia según ensayos conocidos por los expertos en la materia. Ejemplos de antagonistas del receptor de glucagón, análisis para identificar dichos antagonistas y dosis y métodos preferidos de administración se dan a conocer en las siguientes patentes de Estados Unidos, publicaciones de solicitud de patente internacional y otras publicaciones: U.S. n° 6.218.431 , U.S. n° 5.138.090, WO 98/04528, WO 99/01423, WO 00/39088, WO 00/69810, WO 98/21957, WO 98/22109, WO 98/22108, WO 97/16442, Livingston ef al. (1999), Madsen ef al. (1998), de Laszlo ef al. (1999), Chang ef al. (2001). Cascieri et al. (1999), Ling ef al. (2001) y Guillon ef al. (1998). Los agentes pueden incluir cualesquiera de los antagonistas GSK-3ß a título de ejemplo la glucógeno sintetasa cinasa-3 beta (GSK-3ß), los análisis para la identificación de dichos antagonistas y la dosis y métodos preferidos de la administración se dan a conocer en las siguientes patentes de EEUU, las publicaciones de la solicitud de patente internacional y otras publicaciones: patentes U.S. n° 6.057.286, WO 01/56567, WO 01109106, WO 01/49709, WO 01/44246, WO 01/44206, WO 01/42224, WO 00/21927, WO 00/38675, WO 99/65897, WO 98/16528, Coghlan ef al. (200), Smith ef al. (2001), Cross ef al. (2001) y Lochhead ef al. (2001).

Los agentes para la invención pueden incluir los inhibidores de alfa-glucosidasa. Cualquier inhibidor de alfa-glucosidasa puede utilizarse como agente en la invención. A título de ejemplo los inhibidores de alfa-glucosidasa incluyen acarbosa (conocida también como Precose®) y miglitol (conocida también como Glyset®) y análogos, derivados, profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de estos inhibidores de alfa-glucosidasa.

Los agentes pueden incluir los compuestos de sulfonilurea que estimulan la secreción de insulina. Cualquier compuesto de sulfonilurea que estimule la secreción de insulina puede utilizarse como agente para la invención. A título de ejemplo los compuestos de sulfonilurea que estimulan la secreción de insulina comprenden glipizida, también conocida como Glucotrol® y Glucotrol XL®, glimepirida (también conocida como Amaryl®), gliburida y clorpropamida (también conocida como Diabinese®); y análogos, derivados, profármacos y sus sales farmacéuticamente aceptables. Un compuesto de sulfonilurea que estimula la secreción de insulina es la glipizida. Los agentes pueden incluir inhibidores de la producción de biguanida glucosa hepática. Cualquier inhibidor de la producción de biguanida glucosa hepática puede utilizarse como agente en la puesta en práctica de la invención. Un ejemplo de biguanida es la metformina, también conocida como Glucophage®. Los agentes pueden incluir agonistas de PPARy, que incluyen compuestos de tiazolidíndiona y no de tiazolidindiona. Los agonistas de PPARy aumentan la sensibilidad de la insulina en tejidos, importante para la acción de la insulina tales como el tejido adiposo, el músculo esquelético y el hígado. Cualquier agonista de PPARy puede utilizarse como agente en la puesta en práctica de la invención. A título de ejemplo los agonistas de PPARy comprenden los descritos en las siguientes patentes de EEUU: U.S. n° 4.340.605; U.S. n° 4.342.771 ; U.S. n° 4.367.234; U.S. n° 4.617.312; U.S. n° 4.687.777 y U.S. n° 4.703.052; y análogos, derivados, profármacos y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los agonistas de PPARy preferidos comprenden darglitazona, ciglitazona, englitazona, pioglitazona, conocida también como Actos®, y rosiglitazona, conocida también como Avandia® y BRL-49653. Los agonistas de PPARy se administran preferentemente en cantidades que varían desde aproximadamente 0,1 mg/día a aproximadamente 100 mg/día en dosis individuales o divididas, con preferencia aproximadamente de 0,1 mg/día a aproximadamente 50 mg/día para un paciente medio, dependiendo del compuesto antidiabético tiazolidindiona y de la vía de administración. Sin embargo, será necesaria alguna variación en la dosis dependiendo del estado del sujeto que ha de ser tratado. El responsable de la dosificación determinará, en todo caso, la dosis apropiada para cada paciente. Los agentes pueden incluir cualquiera de los inhibidores de dipeptidil peptidasa IV (DPP IV). La expresión inhibidor de DPP IV se refiera a cualquier compuesto que inhiba la enzima dipeptidil peptidasa. Los expertos en la materia determinan fácilmente dicha inhibición según los ensayos tales comoD los descritos en la publicación de la solicitud de patente internacional número WO 98/19998. A título de ejemplo los inhibidores de DPP IV incluyen los dados a conocer en las patentes U.S. números U.S. 6.124.305, U.S. 6.110.949 y U.S. 6.124.305, en las publicaciones de solicitudes de patente internacional n° WO 01/34594, n° WO 99/61431 , n° WO 98/19998, n° WO 97/40832 y n° WO 95/15309 y en Augustyns et al. (1997); y análogos, derivados, profármacos y sus sales farmacéuticamente aceptables. La dosis y los métodos de administración preferidos son según los proporcionados en los documentos WO 01/34594 y WO 98/19998. Alguna variación en la dosis puede tener lugar necesariamente dependiendo del estado del paciente que se está tratando. El responsable de la dosificación determinará, en todo caso, la dosis apropiada para el cada paciente. Los agentes pueden también comprender cualquier inhibidor selectivo de reabsorción de serotonina (SSRI). La expresión inhibidor selectivo de reabsorción de serotonina se refiere a un compuesto que inhibe la reabsorción de serotonina por neuronas aferentes. Los expertos en la materia determinan fácilmente dicha inhibición según ensayos normalizados tales comoD los descritos en la patente U.S. n° 4.536.518 y otras patentes de EEUU citadas en el párrafo siguiente. Los SSRI preferidos que pueden utilizarse de acuerdo con esta invención incluyen femoxetina, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 3.912.743; la fluoxetina, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 4.314.081 ; la fluvoxamina, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 4.085.225; la indalpina, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 4.064.255; la indeloxazina, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 4.109.088; el milnaciprano, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 4.478.836; la paroxetina, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 3.912.743 o la patente U.S. n° 4.007.196; la sertralina, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 4.536.518; la sibutramina, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 4.929.629; y la zimeldina, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 3.928.369. La fluoxetina es conocida también como Prozac®. El hidrocloruro de sertralina, también conocido como Zoloft®, puede prepararse como se publica en la patente U.S. n° 4.536.518. La sibutramina es conocida también como Meridia®. Los SSRI que pueden utilizarse como agentes incluyen análogos, derivados, profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los SSRI descritos anteriormente. Los SSRI se administran preferentemente en cantidades que varían desde aproximadamente 0,01 mg/kg/día 0 a aproximadamente 500 mg/kg/día en dosis individuales o divididas, con preferencia aproximadamente de 10 mg a aproximadamente 300 mg al día para un paciente medio, dependiendo del SSRI y de la vía 0 de administración. Sin embargo, será necesaria alguna variación en la dosis dependiendo del estado del paciente que debe ser tratado. El responsable de la dosificación determinará, en todo caso, la dosis apropiada para el cada paciente. Los agentes pueden comprender además cualquier inhibidor de 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa (estatina). La expresión inhibidor de 3-hidroxi-3-metilglutaril 5 coenzima A (HMG-CoA) reductasa se refiere a un compuesto farmacéutico que inhibe la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reductasa. Esta enzima está implicada en la conversión de HMG-CoA a mevalonato, que es una de las etapas en la biosíntesis del colesterol. Dicha inhibición se determina fácilmente según los ensayos normalizados bien conocidos por los expertos en la materia. Las estatinas preferidas que pueden utilizarse de acuerdo con esta invención comprenden la atorvastatina, dada a conocer en la patente U.S. n° 4.681.893, atorvastatina de calcio, dada a conocer en la patente U.S. n° 5.273.995, cerivastatina, dada a conocer en la patente U.S. n° 5.502.199, dalvastatina, dada a conocer en la publicación de la solicitud de patente europea n° 738.510 A2, fluindostatina, dada a conocer en la publicación de la solicitud de patente europea n° 363.934 A1 , fluvastatina, dada a conocer en la patente U.S. n° 4.739.073, lovastatina, dada a conocer en la patente U.S. n° 4.231.938, mevastatina, dada a conocer en la patente U.S. n° 3.983.140, pravastatina, dada a conocer en la patente U.S. n° 4.346.227, simvastatina, dada a conocer en la patente U.S. n° 4.444.784 y velostatina, dada a conocer en la patente U.S. n° 4.448.784 y en la patente U.S. n° 4.450.171. Los inhibidores de 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa especialmente preferidos comprenden atorvastatina, atorvastatina de calcio, también conocida como Lipitor®, lovastatina, también conocida como Mevacor, pravastatina, también conocida como Pravachol®, y simvastatina, también conocida como Zocor®; y análogos, derivados, profármacos y sus sales farmacéuticamente aceptables. Las estatinas se administran preferentemente en cantidades que varían desde aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg/día en dosis individuales o divididas, con preferencia aproximadamente de 1 mg/kg/día a aproximadamente 200 mg/kg/día para un paciente medio, dependiendo de la estatina y de la vía de administración. Sin embargo, será necesaria alguna variación en la dosis dependiendo del estado del paciente que debe ser tratado. El responsable de la dosificación determinará, en todo caso, la dosis apropiada para cada paciente. Los agentes pueden incluir cualquier inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE). La expresión inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina se refiere a un compuesto farmacéutico que inhibe la actividad de la enzima convertidora de la angiotensina . ACE está implicado en la conversión de la angiotensina 1 en el vasoconstrictor, angiotensina II. La actividad de los inhibidores de ACE puede determinarse fácilmente por métodos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo cualquiera de los ensayos normalizados descritos en las patentes citadas a continuación. Los inhibidores preferidos de ACE comprenden: alacepril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.248.883; benazepril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.410.520; captopril, dado a conocer en la patentes U.S. n° 4.046.889 y n° 4.105.776; ceronapril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.452.790; delapril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.385.051 ; enalapril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.374.829; fosinopril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.337.201 ; imadapril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.508.727; lisinopril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.555.502; moexipril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.344.949; moveltopril, dado a conocer en la patente belga n° 893.553; perindopril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.508.729; quinapril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.344.949; ramipril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.587.258; espirapril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.470.972; temocapril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.699.905; y trandolapril, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.933.361; y análogos, derivados, profármacos y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los inhibidores de ACE se administran preferentemente en cantidades que varían desde aproximadamente 0,01 mg/kg/día hasta aproximadamente 500 mg/kg/día en dosis individuales o divididas, con preferencia aproximadamente de 10 mg a aproximadamente 300 mg al día para un paciente medio, dependiendo del inhibidor de ACE y de la vía de administración. Sin embargo, será necesaria alguna variación en la dosis dependiendo del estado del sujeto que debe ser tratado. El responsable de la dosificación determinará, en todo caso, la dosis apropiada para cada paciente.

Los agentes pueden incluir cualquier antagonista del receptor de angiotensina-II (A-ll). La expresión antagonista del receptor de angiotensina-ll se refiere a un compuesto farmacéutico que bloquea los efectos vasoconstrictores de angiotensina II bloqueando la fijación de angiotensina II al AT, receptor encontrado en muchos tejidos, (p. ej., músculo liso vascular, glándula suprarrenal). La actividad de un antagonista de A-ll puede determinarse fácilmente por métodos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo cualquiera de los ensayos normalizados descritos en las patentes citadas a continuación. Los antagonistas de A-ll preferidos incluyen: candesartán, que se puede preparar como se describe en la patente U.S. n° 5.196.444; eprosartán, que se puede preparar como se describe en la patente U.S. n° 5,185,351 ; irbesartán, que se puede preparar como se describe en la patente U.S. n° 5,270,317; losartán, que se puede preparar como se describe en la patente U.S. n° 5,138,069; y valsarían, que se puede preparar como se describe en la patente U.S. n° 5,399,578; y análogos, derivados, profármacos y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los antagonistas de receptor de angiotensina-ll más preferidos son losartán, irbesartán y valsarían. . Los antagonistas de A-ll se administran preferentemente en cantidades que varían desde aproximadamente 0,01 mg/kg/día hasta aproximadamente 500 mg/kg/día en dosis individuales °o divididas, con preferencia aproximadamente de 10 mg a aproximadamente 300 mg al día para un paciente medio, dependiendo del antagonista de A-ll y de la vía de administración. Sin embargo, será necesaria alguna variación en la dosis dependiendo del estado del paciente que debe ser tratado. El responsable de la dosificación determinará, en todo caso, la dosis apropiada para cada paciente. Los agentes pueden incluir cualquier agonista del ácido ?-aminobutírico (GABA). La expresión agonista del ácido ?-aminobutírico se refiere a un compuesto farmacéutico que se fija a los receptores GABA en el sistema nervioso central del mamífero. GABA es el principal neurotransmisor inhibidor en el sistema nervioso central del mamífero. La actividad de un agonista de GABA puede determinarse fácilmente por métodos conocidos por los expertos en la materia, que incluyendo los procedimientos dados a conocer en Janssens de Verebeke, P. ef al., Biochem. Pharmacol.. 31 , 2257-2261 (1982), Loscher, W., Biochem. Pharmacol.. 31 , 837-842, (1982) y/o Phillips, N. et al.. Biochem. Pharmacol.. 31. 2257-2261. Los agonistas de GABA preferidos incluyen: muscimol, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 3.242.190; progabida, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 4.094.992; riluzol, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 4.370.338; baclofén, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 3.471.548; gabapentín (Neurontin®), que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 4.024.175; vigabatrín, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 3.960.927; tiagabina (Gabitril®), que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 5.010.090; lamotrigina (Lamictal®), que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 4.602.017; pregabalín, que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 6.028.214; fepitoína (Lamictal®), que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 2.409.754; carmamazepina (Tegrotol®), que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 2.948.718; y topiramato (Topamax®), que puede prepararse como se describe en la patente U.S. n° 4,513,006; y análogos, derivados, profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de estos agonistas de GABA. En general, de acuerdo con esta invención, el agonista de GABA utilizado como agente se administrará en una dosis de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente en tratamiento al día hasta aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal del paciente en tratamiento al día, en dosis individuales o divididas. Sin embargo, se darán necesariamente algunas variaciones en la dosificación dependiendo de la enfermedad del paciente en tratamiento. El responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para cada paciente. En particular, cuando se utilice como agonista de GABA en esta invención, el pregabalín se dosificará desde aproximadamente 300 mg hasta aproximadamente 1200 mg al día; el gabapentín se dosificará desde aproximadamente 600 mg hasta aproximadamente 3.600 mg al día. Los agentes pueden incluir cualquier inhibidor de glucógeno fosforilasa (GPI). La expresión inhibidor de glucógeno fosforilasa se refiere a cualquier sustancia . o compuesto o a cualquier combinación de sustancias y/o compuestos que reduzca, retarde o elimine la acción enzimática de la glucógeno fosforilasa. Dichas acciones son determinadas fácilmente por los expertos en la materia según los ensayos .normalizados descritos en la patente U.S. n° 5.988.463. La patente U.S. n° 5.988.463, la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 96/39384 y la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 96/39385 ejemplifican los GPI que pueden ser agentes. Los GPI se administran preferentemente en cantidades que varían desde aproximadamente 0,005 mg/kg/día hasta aproximadamente 50 mg/kg/día en dosis individuales o divididas, con preferencia aproximadamente de 0.1 mg/kg/día a aproximadamente 15 mg/kg/día para un paciente medio, dependiendo del GPI y de la vía de administración. Sin embargo, será necesaria alguna variación en la dosis dependiendo del estado del paciente en tratamiento. El responsable de la dosificación determinará, en todo caso, la dosis apropiada para cada paciente. Los agentes pueden incluir cualquier inhibidor de sorbitol deshidrogenasa (SDI). La expresión inhibidor de sorbitol fosforilasa se refiere a cualquier sustancia o compuesto o a cualquier combinación de sustancias y/o compuestos que reduzca, retarde o elimine la acción enzimática de la sorbitol fosforilasa. La sorbitol deshidrogenasa cataliza la oxidación de sorbitol a fructosa. A título de ejemplo los SDI incluyen los dados a conocer en la patente U.S. n° 5.728.704, patente U.S. n° 5.866.578 y la publicación de la solicitud de patente internacional n° WO 00/59510 normalmente asignadas; y en los análogos, derivados, profármacos y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los SDI se administran preferentemente en cantidades que varían desde aproximadamente 0,001 mg/kg/día hasta aproximadamente 100 mg/kg/día en dosis individuales o divididas, con preferencia aproximadamente de 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg al día para un paciente medio, dependiendo del SDI y de la vía de administración. Sin embargo, será necesaria alguna variación en la dosis dependiendo del estado del paciente en tratamiento. El responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para cada paciente.

• Los agentes pueden incluir cualquier inhibidor de fosfodiesterasa de tipo 5 (PDE-5). La expresión inhibidor de fosfodiesterasa de tipo 5 se refiere a cualquier sustancia o compuesto o a cualquier combinación de sustancias y/o compuestos que reduzcan, retarden o eliminen la acción enzimática de PDE-5 específico del monofosfato cíclico de guanosina (c-GMP). Dichas acciones son determinadas fácilmente por los expertos en la materia según los ensayos descritos en la publicación de la solicitud de patente internacional WO 00/24745. Las siguientes publicaciones de patente ejemplifican los inhibidores de fosfodiesterasa de tipo 5 que pueden utilizarse como agentes de esta invención, y se refieren a métodos de preparación de estos inhibidores de fosfodiesterasa de tipo 5 (PDE-5): publicación de solicitud de patente internacional n° WO 00/24745; publicación de solicitud de patente internacional n° WO 94/28902; publicación de solicitud de patente europea n° 0463756A1 ; publicación de solicitud de patente europea n° 0526004A1 y publicación de solicitud de patente europea n° 0201188A2. Los inhibidores de fosfodiesterasa de tipo 5 preferidos son sildenafilo (preferentemente citrato de sildenafilo, también conocido como Viagra®) que puede prepararse como se publica en las patentes U.S. n° 5.250.534 y n° 5.955.611 , tadalafilo (también conocido como Cialis®) que puede prepararse como se publica en la patente U.S. n° 5.859.006 y vardinafilo (también conocido como Levitra®) que puede prepararse como se publica en la patente U.S. n° 6.362.178. A título de ejemplo los inhibidores de PDE-5 también incluyen análogos, derivados, profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los inhibidores de PDE-5 citados anteriormente. Los inhibidores de PDE-5 se administran preferentemente en cantidades que varían desde aproximadamente 5 mg/día hasta aproximadamente 500 mg/día en dosis individuales o divididas, con preferencia aproximadamente de 10 mg a aproximadamente 250 mg/día, para un paciente medio, dependiendo del inhibidor de PDE-5 y de la vía de administración. Sin embargo, será necesaria alguna variación en la dosis dependiendo del estado del paciente en tratamiento. El responsable de la dosificación determinará, en todo caso, la dosis apropiada para cada paciente. Los agentes pueden incluir cualquier inhibidor de aldosa reductasa. La expresión "inhibidor de la aldosa reductasa" se refiere a compuestos que inhiben la bioconvesión de glucosa en sorbitol, catalizada por la enzima aldosa reductasa. A título de ejemplo los inhibidores de aldosa reductasa comprenden ponalrestat, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.251.528, tolrestat, dado a conocer en la patente U.S. n° 4.600.724, epalrestat, dado a conocer en las patentes U.S. n° 4.464.382, n° 4.791.126 y n° 4.831.045, zenarestat, dado a conocer en las patentes U.S. n° 4.734.419 y n° 4.883.800, zopolrestat dado a conocer en la patente U.S. n° 4.939.140 y los inhibidores preferidos de aldosa reductasa dados a conocer en la patente U.S. n° 6.579.879. A título de ejemplo los inhibidores de aldosa reductasa también incluyen análogos, derivados, profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los inhibidores de aldosa reductasa citados anteriormente. La cantidad de inhibidor de aldosa reductasa que se administra por dosis y el intervalo entre dosis dependerá del inhibidor de aldosa reductasa que se esté utilizando, del tipo de composiciones farmacéuticas que se estén utilizando, de las características del paciente que está siendo tratado y de la gravedad de los procesos, si los hay, que están siendo tratados. Los inhibidores de aldosa reductasa se administran preferentemente en cantidades que varían desde aproximadamente 0,001 mg/kg/día hasta aproximadamente 1000 mg/kg/día en dosis individuales o divididas, con preferencia aproximadamente de 0,01 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg al día para un paciente medio, dependiendo del inhibidor de aldosa reductasa y de la vía de administración. Sin embargo, será necesaria alguna variación en la dosis dependiendo del estado del paciente en tratamiento. El responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para cada paciente. Un inhibidor de aldosa reductasa preferido es zopolrestat que se administra preferentemente a una dosis de entre 250 mg y 500 mg al día. Los agentes pueden también incluir agentes contra la obesidad tales como los inhibidores de la secreción ' de apolipoproteína-B/proteína microsómica de transferencia de triglicérido (apo-B/MTP), inhibidores de 11 ß-hidroxi esteroide deshidrogenasa-1 (11ß-HSD de tipo 1), péptido YY3-36 o sus análogos, antagonistas de canabinoides (p. ej., antagonistas de CB-1 , tales como rimonabant y compuestos de purina descritos en la publicación de patente U.S. n° 2004/0092520), agonistas de MCR-4, agonistas de colecistoquinina-A (CCK-A), inhibidores de reabsorción de monoamina (tal comoD sibutramina), agentes simpat?miméticos, agonistas del receptor ß3 adrenérgíco, agonistas de dopamina (tal como bromocriptina), análogos del receptor de la hormona estimulante de melanocitos, agonistas de 5HT2c, antagonistas de la hormona concentradora de melanina, leptina (proteína OB), análogos de leptina, agonistas receptores de leptina, antagonistas de galanina, inhibidores de lipasa (tal comoG tetrahidrolipstatina, es decir orlistat), agentes anoréxicos (tal como un agonista de bombesina), antagonistas de receptor de neuropéptido-Y (p. ej., antagonistas de receptor NPY Y5, tales como los compuestos espiro descritos en las patentes U.S. n° 6.566.367, n° 6.649.624, n° 6.638.942, n° 6.605.720, n° 6.495.559, n° 6.462.053, n° 6.388.077, n° 6.335.345 y n° 6.326.375, las publicaciones de las patentes U.S. n° 2002/0151456 y n° 2003/036652, y las publicaciones PCT n° WO 03/010175, n° WO 03/082190 y n° WO 02/048152), agentes tiromiméticos, deshidroepiandrosterona o su análogo, agonistas o antagonistas del receptor glucocorticoide, antagonistas del receptor de orexina, agonistas del receptor del péptido-1 similar a glucagón, factores neurótrofos ciliares (tal comoD Axokine™ disponible en Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY y en Procter & Gamble Company, Cincinnati, OH), proteínas humanas relacionadas con el agutí (AGRP), antagonistas del receptor de ghrelin, antagonistas de receptor de histamina 3 o agonistas inversos, agonistas del receptor de neuromedina U y similares. Otros agentes contra la obesidad, son bien conocidos, o serán evidentes a la luz de la presente publicación, para cualquier experto en la materia. Los agentes contra la obesidad especialmente preferidos se seleccionan del grupo consistente en orlistat (preparados como se describe en las patentes U.S. n° 5.274.143, n° 5.420.305 y n° 5.540.917), sibutramina (preparado como se describe en la patente U.S. n° 4.929.629), bromocriptina (patentes U.S. n° 3.752.814 y n° 3.752.888), efedrina, leptina, pseudoefedrina; rimonabant (preparado como se describe en la patente U.S. n° 5.624.941), péptido YY3-36 o uno de sus análogos (preparado como se describe en la publicación de la patente U.S. n° 2002/0141985 y la publicación PCT n° WO 03/027637); y el antagonista de receptor de NPY Y5, 2-oxo-N-(5-fenilpirazinil)espiro-[isobenzofuran-1 (3H),4'-piperidina}1 '-carboxamida. Otros antagonistas de receptor NPY Y5 son los descritos en la Publicación PCT n° WO 03/082190, incluyendo la 3-oxo-N-(5-fenil-2-pirazinil)-espiro[isobenzofuran-1 (3H), 4'-piperidina]-1 '-carboxamida; la 3-oxo-N-(7-trifluorometilpirido[3,2-b]pirid¡n-2-il)-espiro-[isobenzofuran-1 (3H), 4'-piperidina]-1 '-carboxamida; la N-[5-(3-fluorofenil)-2-pirimidinil]-3-oxospiro-[isobenzofuran-1 (3H), [4'-piperidina]-1 '-carboxamida; la trans-3'-oxo-N-(5-fenil-2-pirimidinil)] espiro[ciclohexano-1 , 1 '(3?)-isobenzofuran]-4-carboxamida; la trans-3'-oxo-N-[1 -(3-quinolil)-4-imidazolil]espiro[ciclohexano-1 , 1 '(3'H)-isobenzofuran]-4-carboxamida; la trans-3-oxo-N-(5-fenil-2-pirazinil)espiro[4-azaiso-benzofuran-1 (3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; la trans-N-[5-(3-fluorofenil)-2-pir¡m¡dinil]-3-oxospiro[5-azaisobenzofuran-1 (3H), 1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; la trans-N-[5-(2-fluorofenil)2-pirimidinil]-3-oxospiro[5-aza¡sobenzofuran-1 (3H), 1 '-ciclohexano]-4'-carboxamida; la trans-N-[1-(3,5-difluorofenil)-4-im¡dazolil]-3-oxospiro[7-azaisobenzofuran-1 (3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; la frans-3-oxo-N-(1-fenil-4-pirazolil)espiro[4-azaisobenzofuran-1 (3H), 1 '-ciclohexano]-4'-carboxamida; la trans-N-[1 -(2-fluorofenil)-3-pirazolil]-3-oxospiro[6-azaisobenzofuran-1 (3H), 1 '-ciclohexano]-4'-carboxamida; la trans-3-oxo-N-(l-fenil-3-pirazolil)espiro[6-azaisobenzofuran-1 (3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; la trans-3-oxo-N-(2-fenil-1 ,2,3-triazol-4-il)esp¡ro[6-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida y las sales farmacéuticamente aceptables y sus profármacos. Preferiblemente, los compuestos de la presente invención en las terapias de combinación se administran junto con ejercicio y una dieta sensible. Los agentes se emplean en los métodos de esta invención bien solos o en combinación con uno o otros agentes más. Los agentes pueden administrarse solos o con uno o más excipientes, diluyente o cargas farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas que contienen los agentes pueden administrarse fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como comprimidos, polvos, pastillas, jarabes, soluciones inyectables y así sucesivamente. Si se desea, estas composiciones farmacéuticas pueden contener ingredientes adicionales como aromatizantes, aglutinantes, excipientes y similares. Para los propósitos de administración oral, pueden utilizarse los comprimidos que contienen varios excipientes como citrato de sodio, carbonato de calcio y difosfato calcico junto con varios disgregradores como almidón, metilcelulosa, ácido algínico y determinados silicatos complejos, junto con agentes aglutinantes como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y acacia. Además, a menudo son útiles para la compresión agentes lubrificantes tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco. Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden emplearse como cargas en cápsulas de gelatina rellenas, blandas y duras. Materiales preferidos para esta utilización incluyen lactosa o azúcar de leche y polietilenglicoles de peso molecular elevado. Cuando se desean suspensiones acuosas o elixires para administración bucal, el agente en las mismas puede combinarse con diversos agentes edulcorantes o aromatizantes, materia colorante o colorantes y si se desea, agentes emulsionantes o de suspensión junto con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y/o combinaciones de los mismos. Para administración parenteral, pueden emplearse soluciones de los agentes útiles en esta invención, en aceite de sésamo o aceite de cacahuete, propilenglícol acuoso o en soluciones acuosas estériles. Dichas soluciones acuosas deben estar adecuadamente tamponadas si fuera necesario y el diluyente líquido en primer lugar puesto en forma isotónica con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En relación con esto, los medios acuosos estériles empleados están todos disponibles fácilmente por técnicas clásicas conocidas por los expertos en la materia. Los métodos de preparación de diversas composiciones farmacéuticas con una determinada cantidad de ingrediente activo son conocidos o serán obvios a la luz de esta descripción, para los expertos en la materia. Por ejemplo, los métodos de preparación de composiciones farmacéuticas se describen en Gennaro (2003). Las descripciones de todas las patentes, solicitudes, publicaciones y documentos, incluyendo los folletos y boletines técnicos, citados en la presente memoria, se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Se- considera que un experto en la materia, basándose en la presente descripción, que incluye los ejemplos, dibujos y reivindicaciones adjuntas, puede utilizar la presente invención en todo su alcance.

Se cree que un experto en la materia, utilizando la presente descripción, que incluye los ejemplos, listados de secuencias y reivindicaciones adjuntas, puede utilizar la presente invención en todo su alcance. Los siguientes ejemplos deben considerarse sólo ilustrativos de la práctica de la invención, y no limitativos del resto de la descripción de ninguna manera.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Células 293 que expresan a GPR40 Se prepararon montajes del vector de expresión que contiene los alelos del gen GPR40 basándose en el vector, pIRESpuro, (n° de catálogo 6031-1 , BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Dicho montaje del vector de expresión presenta la secuencia de SEQ. ID. n°: 11 y la cartografía de restricción mostrada en la Figura 4. Células 293 embrionarias de riñon humanas (HEK) que han sido transformadas con adenovirus 5 (disponibles en la ATCC, n° de catálogo CRL-1573) se cultivaron en medio que contiene DMEM (n° de catálogo 11995-065, Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% de FBS (n° de catálogo 16140-071 , Invitrogen) y 100 unidades Pen/Strep (n° de catálogo 15140-122, Invitrogen). Cuando las células alcanzaron el 80% de confluencia, se transfectaron con los vectores de expresión que contienen GPR40 utilizando reactivo Fugene-6 (Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, IN). Después de 48 hora de incubación, se aspiró el medio y se añadió medio nuevo que contiene DMEM, FBS al 10%, 100 unidades de Pen/Strep y 1 µg/ml de puromicina. A las cuatro semanas, se utilizaron probetas de clonación (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) para seleccionar clones estables con resistencia a la puromicina transportados por el vector pIRESpuro. Estas colonias se dejaron ampliar durante cuatro semanas más y se seleccionaron colonias de crecimiento rápido que producen células HEK 293/GPR40 para su utilización en el ensayo FLIPR del Ejemplo 2.

Ejemplo 2 Ensayo FLIPR con GPR40 El primer día, células HEK 293/GPR40 preparadas según el Ejemplo 1 y células HEK 293 de referencia se colocaron en placas negras con fondo transparente de 384 pocilios recubiertas con poli-D-lisina (n° de catálogo 354663, BD Biosciences) a razón de 10.000 células por pocilio (30 µl por pocilio de 3,3 x 105 células/ml de solución) en medio de cultivo que contenía DMEM, 10% de FBS y Penn/Strep (100 µg/ml), con adición de 1 µg/ml de puromicina para las células HEK 293/GPR40 únicamente, y se incubaron a 37°C en 5% de CO2. El segundo día, se eliminó el medio de cada pocilio y se sustituyó por 30 µl de medio exento de suero (DMEM y Pen/Strep solamente, y sin FBS), con adición de 1 µg/ml de puromicina para las células HEK 293/GPR40 solamente. El tercer día, viales con colorante del kit de ensayo FLIPR® Calcium 3 (n° de catálogo R8091 , Molecular Devices, Sunnyvale CA) se reconstituyeron con 11 ml de solución salina tamponada de Hanks (componente del kit de ensayo FLIPR® ) y 225 µl de solución madre de probenecid 250 mM recién preparada que contenía NaOH 5N (1 ml), probenecid (0,74 g) (n° de catálogo P8761 , Sigma-Aldrich Co.) y tampón 1x FLIPR (9 ml) (preparado a partir de tampón 10x FLIPR que contiene, por litro, NaCI (84,68 g), D(+) glucosa anhidra (18,02 g), MgSO4-7H20 (1 ,2 g), KCI (3,73 g), HEPES (23,8 g) y CaCI2 (1 ,11 g), a pH 7,4). Los ácidos grasos y otros compuestos de ensayo del ligando GPR40 se diluyeron hasta concentraciones de entre 0,05 µM y 100 µM en FLIPPJDMSO (tampón 1x FLIPR que contiene 0,25% de DMSO). Se añadieron 30 microlitros de colorante a cada pocilio de la placa y se incubaron las placas a 37°C y 5% de C02 durante una hora. Se midió el flujo de calcio utilizando un lector de placas FLIPR (Molecular Devices). Se inyectaron soluciones del compuesto de ensayo en cada pocilio (15 µl por pocilio) a un ritmo de 10 µl por segundo. Se hicieron exposiciones cada dos segundos para 0,4 segundos por exposición para 90 exposiciones.

Ejemplo 3 Aislamiento y purificación del ADN Se aisla y purifica ADN de una muestra de sangre completa utilizando el kit Puregene® de aislamiento de ADN (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN) según las instrucciones del fabricante. Alternativamente, los glóbulos rojos procedentes de muestras congeladas de sangre completa pueden usarse mezclando sangre completa descongelada (1 ml) con solución de lisis RBC (Gentra Systems, Inc.), por ejemplo, en una proporción 3:1 (es decir, 3 ml de solución de lisis RBC para 1 ml de sangre completa) y se mezclan. La solución se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, la solución se centrifuga a 1.800 x g durante 10 minutos. El sobrenadante del tubo se vierte y el sedimento resultante se vuelve a poner en suspensión en el sobrenadante residual. Se añade a continuación Solución de lisis celular (1 ml) (Gentra Systems, Inc.), por ejemplo, hasta un volumen equivalente al del volumen de sangre completa inicial. Se añade Solución A de RNasa (5 µl) (Gentra Systems, Inc.) al lisado celular y el tubo se incuba a 37°C durante 15 minutos. La muestra se enfría a continuación a temperatura ambiente, se añade Solución para precipitación de proteínas (333 µl) (Gentra Systems, Inc.) al lisado celular y la mezcla se combina agitando a alta velocidad durante al menos 20 segundos. La mezcla se centrifuga a continuación a 1.800 x g durante 10 minutos produciendo un sedimento proteico compacto. El sobrenadante resultante que contiene ADN se vierte en un tubo de centrifugadora limpio de 15 ml que contiene 10 ml de isopropanol al 100% (2-propanol). La muestra se mezcla suavemente invirtiendo el tubo (aproximadamente 40 a 60 veces) hasta que precipite el ADN. Si no aparece el ADN, se añaden siete µl de glucógeno (20 µg/ml) por ml de sangre completa (materia prima original) y se incuban a temperatura ambiente durante 15 minutos. La muestra se centrifuga a continuación a 1.800 x g durante tres minutos produciendo un pequeño sedimento blanco de ADN. Se añaden 10 ml de etanol al 70% y el tubo se invierte varias veces para lavar el sedimento de ADN. La muestra se centrifuga durante un minuto a 1.800 x g. El sobrenadante se vierte a continuación, y el tubo se invierte y se seca con aire.

Ejemplo 4 Discriminación alélica Se diseñaron cebadores y sondas Tagman® MGB (Applied Biosystems) utilizando el programa informático Primer Express versión 1.5 (Applied Biosystems). La reacción PCR se llevó a cabo en un volumen de 5 µl consistente en: 2,5 µl de 2x TagMan® Universal PCR Master Mix (sin AmpErase), 200 nM de cada sonda, 900 nM de los cebadores transcritos y complementarios y agua hasta 5 µl. Alternativamente, se obtuvieron cebadores y sondas como TaqMan Assays-on Demand™ (Applied Biosystems) y se llevó a cabo la reacción PCR en 5 µl consistente en: 2,5 µl de 2x TagMan® Universal PCR Master Mix (sin AmpErase), 2,25 µl de agua y 0,25 µl de 20 x Assay Mix. Los 5 µl de mezcla de reacción se añadieron a aproximadamente 10 ng de ADN anhidro en el pocilio de una placa de 96 pocilios. Las placas se colocaron en un agitador de placas de valoración y se agitaron intensamente durante 10 minutos y a continuación se centrifugaron brevemente a 1.000 RPM. El ciclo térmico se realizó en un GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosytems) con un módulo del bloque de la muestra doble de 384 pocilios utilizando las condiciones siguientes de ciclo térmico: 950°C durante 10 minutos, 40 ciclos de 92°C durante 15 segundos y 60°C durante un minuto. La señal fluorescente se detectó utilizando un detector de secuencia ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems) según las instrucciones del fabricante. Los datos se analizaron con el programa informático Sequence Detection System (SDS) versión 2.1 (Applied Biosytems).

Ejemplo 5 Investigación de variantes de GPR40 en pacientes diabéticos de tipo II De los 2.465 pacientes analizados, 1.332 eran varones y 857 eran hembras.

Las frecuencias alélicas se estimaron haciendo el recuento de las apariciones del alelo completo de GRP40, y a continuación dividiendo por dos el número de individuos a considerar para los dos alelos a los que contribuye cada paciente. Se estimaron las frecuencias en el genotipo haciendo el recuento de las apariciones de un determinado genotipo y a continuación dividiendo por el número de individuos.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método de genotipado, que comprende determinar el aminoácido que está codificado por el gen GPR40 de un paciente humano en el aminoácido número 211.

2. Un método de la reivindicación 1 que comprende además determinar el aminoácido que está codificado en el aminoácido número 21 1 por ambos alelos del gen GPR40 de dicho paciente.

3. Un método de genotipado de la reivindicación 1 que comprende además determinar si el gen GPR40 de dicho paciente codifica el aminoácido número 21 1 que es distinto de histidina.

4. Un método de genotipado de la reivindicación 1 que comprende además determinar si el gen GPR40 de dicho paciente codifica el aminoácido número 211 que es la arginina.

5. Un método de genotipado de la reivindicación 1 que comprende además determinar si el gen GPR40 de dicho paciente codifica e^aminoácido número 21 1 que es la histidina.

6. Un método de genotipado de la reivindicación 1 , que comprende además: aislar el ácido nucleico procedente de un paciente humano; ampliar una secuencia contigua de dicho ácido nucleico, en el que dicha secuencia contigua comprende los nucleótidos de GPR40 que codifican el aminoácido número 211 , o su secuencia complementaria; tratar dicha secuencia contigua con una sonda nucleotídica que permite la determinación del aminoácido codifica en el aminoácido número 21 1 del gen GPR40 de dicho paciente; y determinar si dicha sonda hibrida dicha secuencia contigua en condiciones de alta severidad.

7. Un método de la reivindicación 6, en el que dicha sonda permite la determinación si el aminoácido número 21 1 de dicho gen GPR40 es la histidina.

8. Un método de la reivindicación 6, en el que dicha sonda permite la determinación si el aminoácido número 211 de dicho gen GPR40 es la arginina.

9. Un método de la reivindicación 6, en el que dicha sonda consiste en un fragmento contiguo de una secuencia nucleotídica de la SEQ. ID. n°: 9 que tiene una longitud de aproximadamente 13 a aproximadamente 35 nucleótidos, unidos a un marcador detectable, y que incluye los nucleótidos que codifican el aminoácido 21 1 , o su secuencia nucleotídica complementaria.

10. Un método de la reivindicación 6, en el que dicha sonda consiste en un fragmento contiguo de una secuencia nucleotídica de la SEQ. ID. n°: 10 que tiene una longitud de aproximadamente 13 a aproximadamente 35 nucleótidos, unidos a un marcador detectable, e incluyendo los nucleótidos que codifican el aminoácido 21 1 , o su secuencia nucleotídica complementaria.

11. Un método de tratamiento, que comprende: determinar el aminoácido que está codificado por el gen GPR40 de un paciente humano en el aminoácido número 211 ; y tratar a dicho paciente con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o proceso patológico mediado por que tiene al menos un alelo del gen GPR40 en el que el aminoácido codificado número 211 es otro distinto de la histidina.

12. Un método de la reivindicación 1 1 , en el que dicho agente es un de compuesto antidiabético de tiazolidindiona, uno de sus profármacos farmacéuticamente aceptables o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

13. Un método de la reivindicación 11 , en el que dicho agente es un inhibidor de dipeptidil peptidasa IV, uno de sus profármacos farmacéuticamente aceptables o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

14. Un kit, que comprende una sonda nucleotídica que permite la determinación del aminoácido codificado en el aminoácido número 211 del gen GPR40 de dicho paciente humano.

15. Un método de caracterización de un agente, que comprende: medir la inhibición competitiva mediante un agente de ensayo de fijación de un ligando de GPR40 a un primer receptor humano de GPR40 en el que el aminoácido número 211 es la histidina; y medir la inhibición competitiva mediante dicho compuesto de fijación de un ligando de GPR40 a un segundo receptor humano de GPR40 en el que el aminoácido número 211 es distinto de la histidina.