MXPA06013906A

MXPA06013906A - Generacion de plantas con contenido alterado de aceite.

Info

Publication number: MXPA06013906A
Application number: MXPA06013906A
Authority: MX
Inventors: John Davies; Sandra Peters; Hein Tsoeng Medard Ng
Original assignee: Agrinomics Llc
Priority date: 2004-05-28
Filing date: 2005-05-26
Publication date: 2007-03-07
Also published as: CN1989249A; ZA200610792B; US20090162526A1; BRPI0511649A; CA2568017C; WO2005118821A9; AR049131A1; US7745695B2; WO2005118821A2; WO2005118821A3; CA2568017A1

Abstract

La presente invencion se refiere a plantas que despliegan un fenotipo de contenido oleoso alterado debido a la expresion alterada de un acido nucleico de H101002; la invencion se refiere ademas a metodos para generar plantas con un fenotipo de contenido oleoso alterado.

Description

GENERACIÓN DE PLANTAS CON CONTENIDO ALTERADO DE ACEITE SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. No. 60/575,561 , presentada el 28 de mayo de 2004, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La capacidad para manipular la composición de semillas de cultivo, particularmente el contenido y la composición de aceites de semilla, tiene aplicaciones importantes en las industrias agrícolas, relacionadas con aceites de alimentos procesados y aceites para alimento de animal. Las semillas de los cultivos agrícolas contienen una variedad de constituyentes valiosos que incluyen aceite, proteína y almidón. El procesamiento industrial puede separar algunos o todos estos constituyentes para su venta individual en aplicaciones específicas. Por ejemplo, casi 60% del cultivo de soya de los EE. UU. es molido por ia industria procesadora de soya. El procesamiento de la soya produce aceite purificado, que se vende a un alto valor, mientras que el resto se vende principalmente para forraje de ganado de valor más bajo ("Soy Stats", Consejo de la Soya de EE. UU., 2001 ). La semilla de cañóla es molida para producir aceite y harina de cañóla como coproducto (Consejo de Cañóla de Canadá). Casi 20% del cultivo de maíz de EE. UU. de 1999/2000, se refino industrialmente, principalmente para la producción de almidón, etanol y aceite (Com Refiners Association). De esta manera, frecuentemente es deseable maximizar el contenido de aceite de las semillas. Por ejemplo, para las semillas oleaginosas procesadas tales como soya y cañóla, el aumento del contenido absoluto de aceite en la semilla aumentará el valor de dichos granos. Para el maíz procesado puede ser deseable aumentar o disminuir su contenido de aceite, dependiendo de la utilización de otros constituyentes mayores. La reducción de aceite puede mejorar la calidad del almidón aislado reduciendo los sabores indeseables asociados con la oxidación del aceite. Alternativamente, en la producción del etanol, en donde el sabor no es importante, el aumento del contenido de aceite puede aumentar el valor general. En muchos granos de alimento, tales como maíz y trigo, es deseable aumentar el contenido de aceite en semilla, porque el aceite tiene un contenido de energía más alto que otros constituyentes de semilla tales como los carbohidratos. La industria del procesamiento de semillas oleaginosas, como la mayoría de las industrias procesadoras de granos, es un negocio de capital intenso; de esta manera, pequeñas desviaciones en la distribución de productos, de componentes de bajo valor a componentes de aceite de alto valor, pueden tener un impacto económico sustancial en las industrias procesadoras de granos. La manipulación biotecnológica de aceites puede proveer alteración de la composición y mejoramiento del rendimiento del aceite. La alteración composicional incluye aceite de soya y maíz con alto contenido de ácido oleíco (patentes de EE. UU. Nos. 6,229,033 y 6,248,939), y semillas que contienen laurato (patente de EE. UU. No. 5,639,790), entre otras. El trabajo en la alteración de la composición se ha enfocado predominantemente sobre semillas oleaginosas procesadas, pero se ha extendido rápidamente a cultivos de semillas no oleaginosas, incluyendo el maíz. Aunque existe un considerable interés en aumentar el contenido de aceite, la única biotecnología actualmente practicada en esta área es la tecnología de maíz de alto contenido de aceite (HOC) (DuPont, patente de EE. UU. No. 5,704,160). La HOC emplea agentes polinizantes de alto contenido de aceite desarrollados por reproducción de selección clásica junto con hembras híbridas de élite (machos-estériles) en un sistema de producción referido como TopCross. El sistema de alto contenido de aceite TopCross eleva el contenido de aceite del grano cosechado del maíz de aproximadamente 3.5% a aproximadamente 7%, mejorando el contenido de energía del grano. Aunque ha sido provechoso, el sistema de producción HOC tiene limitaciones inherentes. En primer lugar, el sistema que tiene un porcentaje bajo de agentes polinizantes, responsables de todo un campo de siembra, contiene riesgos inherentes, particularmente en los años de sequía. En segundo lugar, el contenido de aceite en los campos de HOC actuales se ha nivelado en aproximadamente 9% de aceite. Finalmente, el maíz de alto contenido de aceite no es fundamentalmente un cambio bioquímico, sino más bien un mutante anatómico (tamaño de embrión aumentado) que tiene el resultado indirecto de aumentar el contenido de aceite. Por estas razones, sería especialmente valiosa una estrategia alternativa para elevar el contenido de aceite, particularmente que derive de un rendimiento bioquímico alterado. Los cultivos objetivo más obvios para el mercado del aceite procesado son la soya y la colza, y una gran cantidad de trabajo comercial (por ejemplo la patente de EE. UU. No. 5,952,544; la solicitud de PCT WO9411516) demuestra que Arabidopsis es un modelo excelente para el metabolismo del aceite en estos cultivos. Los exámenes bioquímicos de la composición de aceite de semilla han identificado genes de Arabidopsis para muchas enzimas biosintéticas críticas, y han conducido a la identificación de ortólogos de gen agronómicamente importantes. Por ejemplo, los exámenes usando poblaciones químicamente mutadas han identificado mutantes de lípido cuyas semillas exhiben composición alterada de ácido graso (Lemieux y otros, 1990; James y Dooner, 1990). Los exámenes de mutagénesis de ADN-T (Feldmann y otros, 1989) que detectaron composición alterada de ácido graso identificaron los genes de omega 3 desaturasa (FAD3) y delta 12 desaturasa (FAD2) (patente de EE. UU. No. 5952544; Yadav y otros, 1993; Okuley y otros, 1994). Un examen enfocado sobre el contenido de aceite en lugar de la calidad de aceite, analizó mutantes inducidos químicamente para semillas arrugadas o densidad de semilla alterada, de los cuales se infirió el contenido de aceite de la semilla alterada (Focks y Benning, 1998). Otro examen, diseñado para identificar enzimas implicadas en la producción de ácidos grasos de cadena muy grande, identificó una mutación en el gen que codifica una diacilglicerol aciltransferasa (DGAT), como responsable de la acumulación reducida de triacilglicerol en semillas (Katavic V y otros, 1995). También se mostró que la sobreexpresión específica del ADNc de DGAT en semilla estuvo asociada con un mayor contenido de aceite en la semilla (Jako y otros, 2001 ). La marcación de activación en las plantas se refiere a un método para generar mutaciones aleatorias por inserción de una construcción de ácido nucleico heterólogo que comprende secuencias reguladoras (por ejemplo un incrementador) en un genoma de una planta. Las secuencias reguladoras pueden actuar para incrementar la transcripción de uno o más genes de planta nativos; por consiguiente, la marcación de activación es un método provechoso para generar ganancia de función, generalmente mutantes dominantes (véase, por ejemplo, Hayashi y otros, 1992, Weigel D y otros, 2000). La construcción insertada provee una marca molecular para la identificación rápida de la planta nativa cuya expresión defectuosa ocasiona el fenotipo mutante. La marcación de activación también puede causar pérdida de la función de fenotipos. La inserción puede dar como resultado la interrupción de un gen de planta nativa, en cuyo caso el fenotipo generalmente es recesivo. La marcación de activación se ha usado en varias especies que incluyen tabaco y Arabidopsis, para identificar muchos tipos diferentes de fenotipos mutantes y los genes asociados con estos fenotipos (Wilson y otros, 1996, Schaffer y otros, 1998, Fridborg y otros, 1999, Kardailsky y otros, 1999; Christensen S y otros, 1998).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención provee una planta transgénica que tiene un fenotipo de alto contenido de aceite. La planta transgénica comprende un vector de transformación que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o es complementaria a, una secuencia que codifica un polipéptido HIO1005. En modalidades preferidas, la planta transgénica se selecciona del grupo que consiste en colza, soya, maíz, girasol, algodón, cacao, alazor, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuate. La invención también provee un método para producir aceite, que comprende cultivar la planta transgénica y recuperar el aceite de dicha planta. La invención también provee una célula de planta transgénica que tiene un fenotipo de alto contenido de aceite. La célula de planta transgénica comprende un vector de transformación que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o es complementaria a, una secuencia que codifica un polipéptido de alto contenido de aceite (en adelante ?IO1005"). En modalidades preferidas, la célula de planta transgénica se selecciona del grupo que consiste en colza, soya, maíz, girasol, algodón, cacao, alazor, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuate. En otras modalidades, la célula de planta es una semilla, polen, propágulo o célula embrional. La invención también provee forraje, harina, grano, alimento o semilla que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido HIO1005. La invención también provee forraje, harina, grano, alimento o semilla que comprende el polipéptido HIO1005, o un ortólogo del mismo. La planta transgénica de la invención es producida por un método que comprende . introducir en células progenitoras de la planta un vector de transformación de planta que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o es complementaria a, una secuencia que codifica un polipéptido HIO1005, y desarrollar las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, en donde la secuencia de polinucleótido HIO1005 se expresa ocasionando el fenotipo de alto contenido de aceite. La presente invención también provee un recipiente de más de aproximadamente 10,000 semillas, de preferencia más de aproximadamente 20,000 semillas, de preferencia más de aproximadamente 40,000 semillas, en donde aproximadamente más del 10%, de preferencia aproximadamente 25%, de preferencia aproximadamente 50%, de preferencia aproximadamente 75%, o de preferencia aproximadamente 90% de las semillas, son semillas derivadas de una planta de la presente invención. La invención también provee células de planta obtenidas de dicha planta transgénica. La presente invención también provee un recipiente de más de aproximadamente 10 kg de semillas, de preferencia aproximadamente 25 kg de semillas, de preferencia aproximadamente 50 kg de semillas, en donde más de aproximadamente 10%, de preferencia más de aproximadamente 25%, de preferencia aproximadamente 50%, de preferencia aproximadamente 75%, o muy de preferencia aproximadamente 90% de las semillas, son semillas derivadas de una planta de la presente invención. Cualquiera de las plantas o partes de las mismas de la presente invención se pueden procesar para producir una preparación de forraje, harina o aceite. Una parte de planta particularmente preferida para este fin es una semilla. En una modalidad preferida, la preparación de forraje, harina o aceite está diseñada para animales rumiantes. Los métodos para producir preparaciones de forraje, harina y aceite son conocidos. Véase por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 4,957,748; 5,100,679; 5,219,596; 5,936,069; 6,005,076; 6,146,669; y 6,156,227. La harina de la presente invención se puede mezclar con otras harinas. En una modalidad preferida, la harina producida de las plantas de la presente invención o generadas por un método de la presente invención, constituye más de aproximadamente 0.5%, aproximadamente 1%, aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 25%, aproximadamente 50%, aproximadamente 75%, o aproximadamente 90% en volumen o peso del componente de harina de cualquier producto. En otra modalidad, la preparación de harina puede mezclarse y puede constituir más de aproximadamente 10%, aproximadamente 25%, aproximadamente 35%, aproximadamente 50% o aproximadamente 75% de la mezcla en volumen.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones A menos que se indique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados que tendrían para el experto en la técnica de la presente invención. Particularmente, véase Sambrook y otros, 1989, y Ausubel FM y otros, 1993, para consultar las definiciones y términos de la técnica. Se entiende que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que éstos pueden variar. Como se usa aquí, ei término "vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para transferencia entre diferentes células hospederas. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogos en una célula ajena. Muchos vectores de expresión procarióticos y eucarióticos están disponibles comercialmente. La selección de vectores de expresión apropiados es del dominio de los expertos en la materia. Una construcción o secuencia de ácido nucleico "heterólogo" tiene una porción de la secuencia que no es nativa para la célula de planta en la que se expresa. Heterólogos, con respecto a una secuencia de control, se refiere a una secuencia de control (es decir, promotor o incrementador) que no funciona en la naturaleza para regular el mismo gen cuya expresión está regulando actualmente. Generalmente, las secuencias de ácido nucleico heterólogo no son endógenas para la célula o parte del genoma en el cual están presentes, y han sido añadidas a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, o similares. Una construcción de ácido nucleico "heterólogo" puede contener una combinación de secuencia de control/secuencia de codificación de ADN, que es la misma o diferente de una combinación de secuencia de control/secuencia de codificación de ADN encontrada en la planta nativa. Como se usa aquí, el término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena de polipéptido, que puede o no incluir regiones precedentes y posteriores a ¡a región codificadora, por ejemplo secuencias 5' no traducidas (5' UTR) o "guías", y 3'UTR o secuencias "traseras", así como también secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificadores individuales (exones) y secuencia reguladora no transcrita. Como se usa aquí, "recombinante" incluye la referencia a una célula o vector que ha sido modificado por la introducción de una secuencia de ácido nucleico heterólogo, o que la célula deriva de una célula así modificada. De esta manera, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en forma idéntica dentro de ia forma nativa de la célula (no recombinante), o expresan genes nativos que son expresados anormalmente de otra manera, subexpresados o no expresados, como resultado de la intervención humana deliberada Como se usa aquí, el término "expresión de gen" se refiere al proceso mediante el cual un polípéptido es producido basándose en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto transcripción como traducción; por consiguiente, "expresión" se puede referir a una secuencia de polinucleótido o polipéptido, o ambos. Algunas veces, la expresión de una secuencia de polinucleótido no producirá la traducción a proteína. "Sobreexpresión" se refiere a una expresión incrementada de una secuencia de polinucleótido y/o polipéptido con respecto a su expresión en una planta de tipo silvestre (u otra referencia [por ejemplo, no transgénico]), y se puede relacionar a una secuencia natural o no natural. La "expresión ectópica" se refiere a la expresión en un tiempo, lugar, o grado mayor que no ocurre naturalmente en la planta no alterada o de tipo silvestre. La "subexpresión" se refiere a una disminución de la expresión de una secuencia de polinucleótido y polipéptido, generalmente de un gen endógeno, con respecto a su expresión en una planta de tipo silvestre. Los términos "expresión defectuosa" y "expresión alterada" abarcan sobreexpresión, subexpresión y expresión ectópica. El término "introducido" en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula, significa "transfección", o "transformación", o "transducción", e incluye la incorporación de una secuencia de ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica, en donde la secuencia de ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial), convertirse en un replicón autónomo, o expresarse transitoriamente (por ejemplo ARNm transfectado). Como se usa aquí, una "célula de planta" se refiere a cualquier célula derivada de una planta, que incluye células de tejido no diferenciado (por ejemplo callos), así como también semillas de planta, polen, propágulos y embriones. Como se usan aquí, los términos "nativo" y "tipo silvestre" con respecto a un rasgo o fenotipo de planta dado, se refieren a la forma en la que este rasgo o fenotipo se encuentra en la misma variedad de planta en la naturaleza. Como se usa aquí, el término "modificado" con respecto a un rasgo de una planta, se refiere a un cambio en el fenotipo de una planta transgénica con respecto a la planta no transgénica similar. Un "fenotipo (rasgo) de interés" con respecto a una planta transgénica se refiere a un fenotipo observable o mesurable, mostrado por una planta de generación subsiguiente y/o T1 , que no es exhibida por ia planta no transgénica correspondiente (es decir, una planta fenotípicamente similar que ha sido desarrollada o probada bajo condiciones similares). Un fenotipo de interés puede representar un mejoramiento en la planta o puede proveer un medio para producir mejoramientos en otras plantas. Un "mejoramiento" es una característica que puede aumentar la utilidad de una especie o variedad de planta, suministrando a la planta calidad única y/o novedosa. Un "fenotipo de contenido alterado de aceite" se refiere a un fenotipo mesurable de una planta modificada genéticamente, en donde la planta exhibe un aumento o disminución estadísticamente significativa del contenido total de aceite (es decir, el porcentaje de masa de semilla que es aceite), en comparación con la planta similar pero no modificada. Un fenotipo de alto contenido de aceite se refiere a un aumento en el contenido total de aceite. Como se usa aquí, una secuencia de polinucleótido o gen "mutante" difiere de la secuencia de polinucleótido o gen de tipo silvestre correspondiente en función de secuencia o expresión, en donde la diferencia contribuye a un fenotipo o rasgo de planta modificado. Con respeto a una planta o línea de planta, el término "mutante" se refiere a una planta o línea de planta que tiene un fenotipo o rasgo de planta modificado, en donde el fenotipo o rasgo modificado está asociado con la expresión modificada de una secuencia de polinucleótido o gen de tipo silvestre. Como se usa aquí, el término "T1 " se refiere a la generación de plantas de la semilla de las plantas TO. La generación T1 es la primera serie de plantas transformadas que pueden ser seleccionadas por aplicación de un agente de selección, por ejemplo un antibiótico o herbicida, para el cual la planta transgénica contiene el gen de resistencia correspondiente. El término "T2" se refiere a la generación de plantas por autofertilización de las flores de las plantas T1 , previamente seleccionadas como transgénicas. Las plantas T3 son generadas de las plantas T2, etc. Como se usa aquí, la "progenie directa" de una planta dada deriva de la semilla (o algunas veces de otro tejido) de esa planta, y está en la generación inmediatamente subsiguiente; por ejemplo, para un linaje dado, una planta T2 es la progenie directa de una planta T1. La "progenie indirecta" de una planta dada deriva de la semilla (u otro tejido) de la progenie directa de esa planta, o de la semilla (u otro tejido) de las generaciones subsiguientes en ese linaje; por ejemplo, una planta T3 es la progenie indirecta de una planta T1. Como se usa aquí, el término "parte de planta" incluye cualquier órgano o tejido de la planta, que incluye sin limitación semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, vastagos, gametófitos, esporofitos, polen y microsporas. Las células de planta se pueden obtener de cualquier órgano o tejido de planta y cultivos propagados de los mismos. Las clases de plantas que se pueden usar en los métodos de la presente invención generalmente son tan amplias como la clase de plantas superiores susceptibles a las técnicas de transformación, que incluyen plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Como se usa aquí, la "planta transgénica" incluye una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. El poiinucleótido heterólogo puede ser integrado establemente en el genoma, o puede ser extracromosómico. Preferiblemente, el polinucleótido de la presente invención se integra establemente en el genoma de tal manera que el polinucleótido pasa a las generaciones sucesivas. Una célula, tejido, órgano de planta o planta en el cual se han introducido los polinucleótídos heterólogos, se considera "formado", "transfectado", o "transgénico". La progenie directa o indirecta de las plantas o células de planta transformadas que también contienen el polinucleótido heterólogo también se consideran transgénicos. Varios métodos para la introducción de una secuencia de polinucleótido deseada que codifica la proteína deseada en células de planta son conocidos para el experto en la materia y se tienen disponibles; incluyen, sin limitación: (1 ) métodos físicos tales como microinyección, electroporación y suministro mediado por microproyectil (biolística o tecnología de pistola de gen); (2) métodos de suministro mediados por virus; y (3) métodos de transformación mediados por Agrobacterium. Los métodos usados más comúnmente para la transformación de células de planta son los procesos de transferencia de ADN mediados por Agrobacterium y los procesos mediados por biolística o bombardeo de microproyectiles (esto es, la pistola de gen). Normalmente se desea la transformación nuclear, pero cuando es deseable transformar específicamente los plástidos, tales como cloroplastos o amidoplastos, los plástidos de planta pueden ser transformados utilizando un suministro mediado por microproyectil del polinucleótido deseado. La transformación mediada por Agrobacterium se logra usando una bacteria del suelo construida por ingeniería genética que pertenece al género de Agrobacterium. Para transferir genes a las plantas se pueden usar varias cepas de tipo silvestre y desarmadas de Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes que alojan los plásmidos Ti o Ri. La transferencia de genes se hace por medio de la transferencia de un ADN específico conocido como "ADN-T", que puede ser construido por ingeniería genética para llevar cualquier pieza deseada del ADN en muchas especies de planta. La transformación genética de plantas mediada por Agrobacterium incluye varios pasos. El primer paso, en el cual el Agrobacterium virulento y las células de planta se ponen por primera vez en contacto, generalmente se denomina "inoculación". Después de la inoculación, el Agrobacterium y las células/tejidos de la planta se dejan crecer juntos durante un periodo de varias horas a varios días o más, bajo condiciones adecuadas para el crecimiento y la transferencia del ADN-T. Este paso se denomina "cocultivo". Después del cocultivo y el suministro de ADN-T, las células de planta se tratan con agentes bactericidas o bacteriostáticos para matar el Agrobacterium remanente en contacto con el explante y/o en el recipiente que contiene el explante. Si esto se hace en ausencia de cualquier agente selectivo para promover el crecimiento preferencial de células de planta transgénicas contra no transgénicas, entonces esto es referido normalmente como el paso de "retraso". Si se hace en presencia de presión selectiva que favorece las células de planta transgénicas, entonces es referido como un paso de "selección". Cuando se usa un "retraso", normalmente es seguido por uno o más pasos de "selección". Con respecto al bombardeo de microproyectiles (patente de EE. UU. No. 5,550,318 (Adams y otros); patente de EE. UU. No. 5,538,880 (Lundquist y otros); patente de EE. UU. No. 5,610,042 (Chang y otros); y publicación de PCT WO 95/06128 (Adams y otros); cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad), se recubren partículas con ácidos nucleicos y se suministran a las células mediante una fuerza impulsora. Las partículas ejemplares incluyen las comprendidas de tungsteno, platino y, de preferencia, oro. Una modalidad ilustrativa de un método para suministrar ADN en células de planta por aceleración es el sistema de suministro de partículas biolístico (Biolistics Partióle Delivery System (BioRad, Hercules, California), que se puede usar para impulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de un tamiz, por ejemplo un tamiz de acero inoxidable o tamiz Nytex, sobre una superficie de filtro cubierta con células de planta de monocotiledónea cultivadas en suspensión. Las técnicas de bombardeo de microproyectiles son ampliamente aplicables y se pueden usar para transformar virtualmente cualquier especie de planta. Los ejemplos de especies que han sido transformadas por bombardeo de microproyectiles incluyen especies de monocotiledónea tales como maíz (publicación internacional No. WO 95/06128 {Adams y otros)), cebada, trigo (patente de EE. UU. No. 5,563,055 (Townsend y otros), que se incorpora aquí como referencia en su totalidad), arroz, avena, centeno, remolacha, y sorgo; así como también varias dicotiledóneas que incluyen tabaco, soya (patente de EE. UU. No. 5,322,783 (Tomes y otros), que se incorpora aquí como referencia en su totalidad), girasol, cacahuate, algodón, tomate y legumbres en general (patente de EE. UU. No. 5,563,055 (Townsend y otros), que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Para seleccionar o calificar las células de planta transformadas sin importar la metodología de transformación, el ADN introducido en la célula contiene un gen que funciona en un tejido de planta regenerable para producir un compuesto que confiere al tejido de la planta resistencia a un compuesto, de otra manera tóxico. Los genes de interés para usar como marcador calificable, seleccionable, o examinable, incluirían sin limitación los genes de GUS, proteína fluorescente verde (GFP), luciferasa (LUX), genes de tolerancia a antibiótico o herbicida. Los ejemplos de genes de resistencia a antibiótico incluyen los de las penicilinas, kanamicina (y neomicina, G418, bleomicina); metotrexate (y trimetoprim); cloranfenicol; kanamicina y tetraciclina. Las moléculas de polinucleótido que codifican las proteínas implicadas en la tolerancia a herbicida son conocidas en la técnica e incluyen, sin limitación, una molécula de polinucleótido que codifica 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) descrita en la patente de EE. UU. No. 5,627,061 (Barry y otros), patente de EE. UU. No. 5,633,435 (Barry y otros), y patente de EE. UU. No. 6,040,497 (Spencer y otros) y aroA, descrita en ia patente de EE. UU. No. 5,094,945 (Comai), para tolerancia a glifosato; una molécula de polinucleótido que codifica bromoxinil nitrilasa (Bxn) descrita en la patente de EE. UU. No. 4,810,648 (Duerrschnabel y otros) para tolerancia a bromoxinilo; una molécula de polinucleótido que codifica fitoeno desaturasa (crtl ) descrita por Misawa y otros (1993) Plant J. 4:833-840, y Misawa y otros (1994) Plant J. 6:481-489, para tolerancia al norflurazon; una molécula de polinucleótido que codifica acetoxihidroxiácído sintasa (AHAS, aka ALS) descrita por Sathasirvan y otros (1990) Nucí. Acids. Res. 18:2188-2193, para tolerancia a los herbicidas de sulfonilurea; y el gen bar descrito por DeBlock y otros (1987) EMBO J. 6:2513-2519, para tolerancia al glufosinato y bialafos. La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas de varios explantes transformados está bien documentada en la técnica. Este proceso de regeneración y crecimiento normalmente incluye los pasos de seleccionar células transformadas y cultivar las células individualizadas mediante los pasos usuales de desarrollo embriónico mediante la etapa de plántula enraizada. Los embriones y semillas transgénicas se regeneran similarmente. Los vastagos enraizados transgénicos resultantes se plantan posteriormente en un medio de crecimiento de planta apropiado, tal como suelo. Las células que sobreviven a la exposición al agente selectivo, o las células que han sido calificadas como positivas en una prueba de selección, se pueden cultivar en medios que sostienen la regeneración de plantas. Las plántulas en desarrollo son transferidas a una mezcla de crecimiento de planta sin suelo y se dejan endurecer antes de ser transferidas a un invernadero o una cámara de crecimiento para su maduración. La presente invención se puede usar con cualquier célula o tejido transformable. Como se usa aquí, por transformable se entiende una célula o tejido que es capaz de propagación ulterior para producir una planta. Los expertos en la materia reconocerán que varias células o tejidos de planta son transformables, en los cuales después de la inserción del ADN exógeno y bajo condiciones de cultivo apropiadas, las células o tejidos de planta se pueden transformar en una planta diferenciada. El tejido adecuado para estos fines puede incluir, sin limitación, embriones inmaduros, tejido escutelar, cultivos celulares en suspensión, inflorescencia inmadura, meristema de vastago, explantes nodales, tejido de callo, tejido de hipocotilo, cotiledones, raíces y hojas. Se puede usar cualquier medio de cultivo de planta adecuado. Los ejemplos de medios adecuados incluirían, sin limitación, medio basado en MS (Murashige y Skoog, Physiol, Plant, 15:473-497, 1962), o medio basado en N6 (Chu y otros, Scientia Sínica 18:659,1975), suplementado con reguladores de crecimiento de planta adicionales que incluyen, sin limitación, auxinas, citocininas, ABA, y giberelinas. Los expertos en la materia están familiarizados con la variedad de medios de cultivo de tejido, que cuando se suplementan apropiadamente, sostienen el crecimiento y el desarrollo de tejidos de planta y son adecuados para la transformación y regeneración de la planta. Estos medios de cultivo de tejido se pueden comprar como una preparación comercial, o se pueden preparar y modificar a solicitud. Los expertos en la materia saben que los medios y los suplementos de medios, tales como nutrientes, y los reguladores de crecimiento para la transformación y regeneración, y otras condiciones de cultivo como la intensidad de luz durante la incubación, el pH y la temperatura de incubación, se pueden optimizar para la variedad de interés particular. El experto en la materia apreciará que, después de que un cásete de expresión se incorpora establemente en plantas transgénicas, y se confirma que es operable, se puede introducir en otras plantas por cruzamiento sexual. Se puede usar cualquiera de varias técnicas de reproducción estándares dependiendo de la especie por cruzar.

Identificación de plantas con fenotipo de contenido alterado de aceite Los presentes autores utilizaron una prueba de marcación de activación de Arabidopsis para identificar la asociación entre el gen que identificaron y designaron como "HIO1005" (At5g02290, Gl#30679585, Gl#30679589), que codifica una proteína cinasa de proteína (Gl#15241749, 30679590), respectivamente, y un fenotipo de contenido alterado de aceite (específicamente, un fenotipo de alto contenido de aceite). Brevemente, y como se describe adicionalmente en los ejemplos, se mutó una gran cantidad de plantas de Arabidopsis con el vector pSKI015, que comprende un ADN-T del plásmido Ti de Agrobacterium tumifaciens, un elemento incrementador viral, y un gen marcador seleccionable (Weigel y otros, 2000). Cuando el ADN-T se inserta en el genoma de plantas transformadas, el elemento incrementador puede ocasionar regulación positiva de los genes en la vecindad, generalmente en la vecindad, generalmente dentro de aproximadamente 10 kilobases (kb) de la inserción. Las plantas T1 se expusieron al agente selectivo para recuperar específicamente las plantas transformadas que expresaron el marcador seleccionable y por lo tanto alojaban las inserciones de ADN-T. Se recolectaron muestras de aproximadamente 15-20 semillas de T2 de las plantas T1 transformadas, y se extrajeron los lípidos de las semillas. Se hizo un análisis de cromatografía de gases (GC) para determinar el contenido y la composición de los ácidos grasos de las muestras de semilla. Se identificó una línea de Arabidopsis que mostró un fenotipo de alto contenido de aceite. La asociación del gen HIO1005 con el fenotipo de alto contenido de aceite se descubrió por análisis de la secuencia de ADN genómico que flanquea la inserción de ADN-T en la línea identificada. Por consiguiente, se pueden emplear genes y/o polipéptidos HIO1005 en el desarrollo de plantas modificadas genéticamente que tienen un fenotipo de contenido modificado de aceite ("un fenotipo HIO1005"). Los genes HIO1005 se pueden usar en la generación de cultivos de semillas oleaginosas, que proveen un rendimiento mejorado de aceite del procesamiento de las semillas oleaginosas, y en la generación de cultivos de granos de forraje que proveen mayor energía para la alimentación animal. Además, los genes HIO1005 se pueden usar para aumentar el contenido de aceite de cultivos de aceite de especialidad, para aumentar el rendimiento de los ácidos grasos inusuales deseados. Las plantas transgénicas que han sido modificadas genéticamente para expresar HIO1005 se pueden usar en la producción de aceite, en donde las plantas transgénicas se desarrollan, y el aceite se obtiene de las partes de las plantas (por ejemplo la semilla) usando los métodos estándares. Ácidos nucleicos y polipéptidos HIO1005 La secuencia del ácido nucleico HIO1005 de Arabidopsis se provee en la SEQ ID NO: 1 y en el registro de Genbank Gl#30679585. La secuencia de proteína correspondiente se provee en la SEQ ID NO:3 y en Gl# 15241749. También se identificó una variante putativa (SEQ ID NO:2) que codifica una proteína (SEQ ID NO:4) que es 100% idéntica a SEQ ID NO:3. En el ejemplo 4 siguiente se describen ácidos nucleicos y/o proteínas que son ortólogos o parálogos de HIO1005 de Arabidopsis. Como se usa aquí, el término "polipéptido HIO1005" se refiere a una proteína HIO1005 de longitud completa, o un fragmento, derivado (variante) u ortólogo de la misma, que es "funcionalmente activo", lo que significa que el fragmento, derivado, u ortólogo de la proteína exhibe una o más de las actividades funcionales asociadas con el polipéptido de SEQ ID NO:2. En una modalidad preferida, un polipéptido HIO1005 funcionalmente activo ocasiona un fenotipo de contenido alterado de aceite cuando se expresa deficientemente en una planta. En una modalidad preferida adicional, ia expresión deficiente del polipéptido HIO1005 ocasiona un fenotipo de alto contenido de aceite en una planta. En otra modalidad, un polipéptido HIO1005 funcionalmente activo es capaz de rescatar la actividad endógena defectuosa (incluyendo deficiente) de HIO1005, cuando se expresa en una planta o en células de planta; el polipéptido de rescate puede ser de la misma especie o de una especie diferente de aquella con la actividad defectuosa. En otra modalidad, un polipéptido HIO1005 de longitud completa o fragmento funcionalmente activo (es decir, un polipéptido natural que tiene la secuencia de SEQ ID NO:2 o un ortólogo natural del mismo), retiene una o más de las propiedades biológicas asociadas con el polipéptido HIO1005 de longitud completa, tales como la actividad de señalización, actividad de unión, actividad catalítica o actividad de localización celular o extracelular. Un fragmento H1O1005 comprende preferiblemente un dominio H1O1005, tal como un dominio C- o N-terminal o catalítico, entre otros, y comprende preferiblemente por lo menos 10 aminoácidos, de preferencia por lo menos 20 aminoácidos, de preferencia por lo menos 25 aminoácidos, y de preferencia por lo menos 50 aminoácidos contiguos de una proteína HIO1005. Se pueden identificar dominios funcionales usando el programa PFAM (Bateman A y otros, 1999 Nucleic Acids Res 27:260-262). Un fragmento HIO1005 preferido comprende uno o más dominios de proteína cinasa. Las variantes funcionalmente activas de los polipéptidos HIO1005 de longitud completa, o los fragmentos de los mismos, incluyen polipéptidos con inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácido que retienen una o más de las propiedades biológicas asociadas con el polipéptido HIO1005 de longitud completa. En algunos casos, se generan variantes que cambian el procesamiento posterior a la traducción de un polipéptido HIO1005. Por ejemplo, las variantes pueden tener características alteradas de transporte de proteína, o localización de proteína o vida media de proteína alterada en comparación con el polipéptido nativo. Como se usa aquí, el término "ácido nucleico HIO1005" abarca ácidos nucleicos con la secuencia provista en, o complementaria a, la secuencia de SEQ ID NO: 1 , así como también fragmentos, derivados u ortólogos funcionalmente activos de la misma. Un ácido nucleico HIO1005 puede ser un ADN, derivado de ADN genómico o ADNc, o ARN. En una modalidad, un ácido nucleico HIO1005 funcionalmente activo codifica, o es complementario a, un ácido nucleico que codifica un polipéptido HIO1005 funcionalmente activo. Incluido dentro de esta definición está el ADN genómico que sirve como molde para un transcrito de ARN primario (esto es, un precursor de ARNm) que requiere procesamiento, tal como empalme, antes de codificar ei polipéptido HIO1005 funcionalmente activo. Un ácido nucleico HIO1005 puede incluir otras secuencias no codificadoras, que pueden o no ser transcritas; dichas secuencias incluyen 5' y 3' UTRs, señales de poliadenilación y secuencias reguladoras que controlan la expresión del gen, entre otras, que son conocidas en la técnica. Algunos polipéptidos requieren eventos de procesamiento, tales como corte proteolítico, modificación covalente, etc., para hacerse completamente activos. Por consiguiente, los ácidos nucleicos funcionalmente activos pueden codificar el polipéptido HIO1005 maduro o preprocesado, o una forma intermedia. También, un polinucleótido HIO1005 puede incluir secuencias codificadoras heterólogas, por ejemplo secuencias que codifican un marcador incluido para facilitar la purificación del polipéptido fusionado, o un marcador de transformación. En otra modalidad, un ácido nucleico HIO1005 funcionalmente activo es susceptible de usarse en la generación de fenotipos con pérdida de función de HIO1005, por ejemplo, mediante supresión de antisentido, cosupresión, etc. En una modalidad preferida, un ácido nucleico HIO1005 usado en los métodos de esta invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica, o es complementaria a, una secuencia que codifica un polipéptido HIO1005, que tiene por lo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o más de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido presentada en la SEQ ID NO:2. En otra modalidad, un polipéptido HIO1005 de la invención comprende una secuencia de polipéptido con por lo menos 50% ó 60% de identidad con la secuencia de polipéptido HIO1005 de la SEQ ID NO:2, y puede tener por lo menos 70%, 80%, 85%, 90% ó 95%, o más de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido HIO1005 de SEQ ID NO:2, tal como uno o más dominios de proteína cinasa. En otra modalidad, un polipéptido HIO1005 comprende una secuencia de polipéptido con al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ó 95%, o más de identidad de secuencia con un fragmento funcionalmente activo del polipéptido presentado en la SEQ ID NO:2. En otra modalidad, un polipéptido HIO1005 comprende una secuencia de polipéptido con al menos 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% de identidad con la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO:2, sobre toda su longitud, y comprende uno o más dominios de proteína cinasa. En otro aspecto, una secuencia de polinucleótido HIO1005 es por lo menos 50% a 60% idéntica sobre toda su longitud a la secuencia de ácido nucleico HIO1005 presentada como SEQ ID NO:1 , o secuencias de ácido nucleico que son complementarias a dicha secuencia de HIO1005, y pueden comprender por lo menos 70%, 80%, 85%, 90% ó 95%, o más de identidad de secuencia con la secuencia HIO1005 presentada como SEQ ID NO:1 , o un fragmento funcionalmente activo del mismo, o secuencias complementarias. Como se usa aquí, "porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia sujeto especificada, o una porción especificada de la misma, se define como el porcentaje de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia derivada candidata idénticos a los nucleótidos o aminoácidos en la secuencia sujeto (o una porción especificada de la misma), después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, como lo genera el programa WU-BLAST-2.Oa19 (Altschul y otros, J. Mol. Biol. (1997) 215:403-410) con parámetros de búsqueda puestos en los valores por omisión. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y son establecidos por el programa mismo dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular contra la cual se busca la secuencia de interés. Un "valor de porcentaje de identidad" es determinado por el número de nucleótidos o aminoácidos coincidentes idénticos dividido entre la longitud de secuencia para la cual se reporta el porcentaje de identidad. El "porcentaje (%) de similitud de secuencia de aminoácido" es determinado haciendo el mismo cálculo que para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos, pero incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos, además de aminoácidos idénticos en el cálculo. Una sustitución conservativa de aminoácido es una en la que un aminoácido es sustituido con otro que tiene propiedades similares, de modo que el pliegue o actividad de la proteína no se ve afectado significativamente. Los aminoácidos aromáticos que pueden ser sustituidos entre sí son fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos hidrofóbicos intercambiables son leucina, isoleucina, metionina y valina; los aminoácidos polares intercambiables son glutamina y asparagina; los aminoácidos básicos intercambiables son arginina, lisina e histidina; los aminoácidos ácidos intercambiables son ácido aspártico y ácido glutámico; y los aminoácidos pequeños intercambiables son alanina, serina, treonina, cisteína y glicina. Las moléculas de ácido nucleico derivadas de las presentes moiécuias de ácido nucleico incluyen las secuencias que hibridan selectivamente con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1. La severidad de hibridación se puede controlar mediante la temperatura, fuerza iónica, pH y la presencia de agentes desnaturalizantes tales como formamida durante la hibridación y lavado. Las condiciones usadas rutinariamente son muy conocidas (véase por ejemplo, "Current Protocol in Molecular Bíology", vol. 1 , cap. 2.10, John Wíley & Sons, Publishers (1994); Sambrook y otros, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor (1989)). En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico de la invención es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 , bajo condiciones de hibridación severas que son: prehibridación de filtros que contienen ácido nucleico durante 8 horas a toda la noche a 65°C en una solución que comprende citrato de una sola concentración 6X (SSC) (1X SSC es 0.15 M de NaCI, 0.015 M de citrato Na; pH 7.0), 5X de solución de Denhardt, 0.5% de pirofosfato de sodio y 100 µg/ml de ADN de esperma de arenque; hibridación durante 18-20 horas a 65°C en una solución que contiene SSC 6X, solución de Denhardt 1X, 100 µg/ml de ARNt de levadura y 0.05% de pirofosfato de sodio; y lavar los filtros a 65°C durante 1 hora en una solución que contiene 0.1 X de SSC y 0.1 % de SDS (dodecilsulfato de sodio). En otras modalidades, se usan condiciones de hibridación moderadamente severas que son: tratamiento de filtros que contienen ácido nucleico durante 6 horas a 40°C en una solución que contiene 35% de formamida, 5X de SSC, 50 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM de EDTA, 0.1 % de PVP, 0.1 % de Ficoll, 1 % de BSA y 500 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado; la hibridación a 18-20 horas a 40°C en una solución que contiene 35% de formamida, 5X de SSC, 50 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM de EDTA, 0.02% de PVP, 0.02% de Ficoll, 0.2% de BSA, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, y 10% de sulfato de dextrano (p/v); seguido por lavado dos veces durante 1 hora a 55°C en una solución que contiene SSC 2X y 0.1 % de SDS. Alternativamente se pueden usar condiciones de baja severidad que comprenden: incubación durante 8 horas a toda la noche a 37°C en una solución que comprende 20% de formamida, SSC 5x, 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), solución de Denhardt 5X, 10% de sulfato de dextrano y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado; hibridación en el mismo amortiguador durante 18 a 20 horas; y lavado de los filtros en SSC 1 x aproximadamente a 37°C durante 1 hora. Como resultado de la degeneración del código genético, se pueden producir varias secuencias de polinucleótido que codifican un polipéptido HIO1005. Por ejemplo, se pueden seleccionar codones para aumentar la velocidad a la que ocurre la expresión del polipéptido en especies hospederas particulares, de acuerdo con el uso de codón óptimo dictado por el organismo hospedero particular (véase, por ejemplo, Nakamura y otros, 1999). Dichas variantes de secuencia se pueden usar en los métodos de esta invención. Los métodos de la invención pueden usar ortólogos del HIO1005 de Arabidopsis. Los métodos para identificar los ortólogos en otras especies de planta son conocidos en la técnica. Normalmente, los ortólogos en diferentes especies retienen las mismas funciones, debido a la presencia de uno o más motivos de proteína y/o estructuras tridimensionales. En la evolución, cuando un evento de duplicación de gen sigue a un proceso de evolución de especie, un solo gen en una especie, tal como Arabidopsis, puede corresponder a múltiples genes (parálogos) en otra. Como se usa aquí, el término "ortólogos" abarca parálogos. Cuando están disponibles datos de secuencia para una especie de planta particular, los ortólogos son identificados generalmente por análisis de homología de secuencia, tal como el análisis BLAST, usualmente utilizando secuencias de proteína de señuelo. Las secuencias son asignadas como un ortólogo potencial si la secuencia de mejor acierto del resultado BLAST delantero recupera la secuencia de consulta original en el BLAST inverso (Huynen MA y Bork P, Proc Nati Acad Sci (1998) 95:5849-5856; Huynen MA y otros, Genome Research (2000) 10:1204-1210). Se pueden usar programas para alineación de secuencias múltiples, tales como CLUSTAL (Thompson JD y otros, 1994, Nucleic Acids Res 22:4673-4680), para destacar las regiones conservadas y/o residuos de proteínas ortólogas, y para generar árboles filogenéticos. En un árbol filogenético que representa secuencias homologas múltiples de diversas especies (por ejemplo recuperadas mediante análisis BLAST), las secuencias ortólogas de dos especies generalmente parecen más cercanas en el árbol con respecto a todas las otras especies de estas dos especies. El enroscamiento estructural u otro análisis de pliegue de proteína (por ejemplo usando el software de ProCeryon, Biosciences, Satzburg, Austria) también puede identificar ortólogos potenciales. Los métodos de hibridación de ácido nucleico también se pueden usar para encontrar genes ortólogos y se prefieren cuando no se tienen disponibles datos de secuencia. La PCR de degeneración y examen de ADNc o colecciones de ADN genómico son métodos comunes para encontrar secuencias de genes relacionadas, y son muy conocidas (véase, por ejemplo, Sambrook, 1989, Dieffenbach y Dveksler, 1995). Por ejemplo, los métodos para generar una colección de ADNc de la especie de planta de interés y sondear la colección con sondas de gen parcialmente homólogo se describen en Sambrook y otros Una porción altamente conservada de la secuencia codificadora Arabidopsis HIO1005 se puede usar como una sonda. Ácidos nucleicos ortólogos HIO1005 se pueden hibridar con el ácido nucleico de SEQ ID NO:1 bajo condiciones de severidad alta, moderada o baja. Después de la amplificación o aislamiento de un segmento de un ortólogo putativo, este segmento se puede clonar y secuenciar mediante técnicas estándares y utilizarse como una sonda para aislar un ADNc completo o clona genómica. Alternativamente, es posible iniciar un proyecto EST para generar una base de datos de información de secuencia para la especie de planta de interés. En otro aspecto, se usan anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos HIO1005 conocidos para aislamiento de ortólogo (véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, 1988, 1999). El análisis de Western blot puede determinar si un ortólogo de HIO1005 (es decir, una proteína ortóloga) está presente en un extracto crudo de una especie de planta particular. Cuando se observa reactividad, la secuencia que codifica el candidato ortólogo se puede aislar mediante examen y selección de colecciones de expresión que representan las especies de planta particulares. Se pueden construir colecciones de expresión en una variedad de vectores disponibles comercialmente, que incluyen lambda gt11 , como lo describen Sambrook y otros, 1989. Una vez identificado el o los ortólogos candidatos mediante cualquiera de estos medios, las secuencias ortólogas candidatas se usan como el señuelo (la "consulta") para el BLAST inverso, contra secuencias de Arabidopsis u otras especies en las cuales se han identificado secuencias de ácido nucleico y/o polipéptido HIO1005. Ácidos nucleicos y polipéptidos HIO1005 se pueden obtener usando cualquier método disponible. Por ejemplo, son bien conocidas las técnicas para aislar ADNc o secuencias de ADN genómico de interés examinando colecciones de ADN o utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) como se describió previamente. Alternativamente se puede sintetizar la secuencia de ácido nucleico. Se puede usar cualquier método conocido, tal como mutagénesis dirigida a sitio (Kunkel TA y otros, 1991 ), para introducir cambios deseados en un ácido nucleico clonado. En general, los métodos de la invención incluyen incorporar la forma deseada del ácido nucleico HIO1005 en un vector de expresión de planta para transformación en células de planta, y el polipéptido HIO1005 se expresa en la planta hospedera. Una molécula de ácido nucleico HIO1005 aislado es diferente a la que está en la naturaleza y es identificada y separada de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está asociada ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico HIO1005. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico HIO1005 aislado incluye moléculas de ácido nucleico HIO1005 contenidas en células que expresan ordinariamente HIO100, en donde por ejemplo la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente a la de las células naturales.

Generación de plantas modificadas genéticamente con un fenotipo de contenido alterado de aceite Se pueden usar ácidos nucleicos y polipéptidos HIO1005 para generar plantas modificadas genéticamente que tienen un fenotipo de contenido modificado de aceite. Como se usa aquí, un "fenotipo de contenido modificado de aceite" se puede referir al contenido modificado de aceite en cualquier parte de la planta; el contenido modificado de aceite frecuentemente se observa en semillas. En una modalidad preferida, se usa la expresión alterada del gen HIO1005 en una planta para generar plantas con un fenotipo de alto contenido de aceite. Los métodos descritos en la presente son aplicables generalmente a todas las plantas. Aunque se efectúa marcación de activación e identificación de gen en Arabidopsis, el gen HIO1005 (o un ortólogo, variante o fragmento del mismo) se puede expresar en cualquier tipo de planta. En una modalidad preferida, la invención está dirigida a plantas productoras de aceite que producen y almacenan triacilglicerol en órganos específicos, principalmente en las semillas. Dichas especies incluyen soya {Glycine max), colza y cañóla (que incluye Brassica napus, B. campestris), girasol {Helianthus annus), algodón {Gossypium hirsutum), maíz {Zea mays), cacao {Theobroma cacao), cártamo {Carthamus tinctorius), palma de aceite {Elaeis guineensis), palma de coco {Cocos nucífera), lino {Linun usitatissimum), ricino {Ricinus communis) y cacahuate {Arachis hypogaea). La invención también puede estar dirigida a plantas de frutos y verduras, plantas productoras de grano, plantas productoras de nuez, especies de Brassica de ciclos rápidos, alfalfa {Medicago sativa), tabaco (Nicotiana), césped (familia Poaceae), otros cultivos de forraje, y especies silvestres que pueden ser una fuente de ácidos grasos únicos. El experto en la materia reconocerá que existe una amplia variedad de técnicas de transformación, y continuamente se ponen disponibles nuevas técnicas. Cualquier técnica que sea adecuada para la planta hospedera objetivo se puede emplear dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, las construcciones se pueden introducir en una variedad de formas que incluyen, sin limitación, una cadena de ADN, en un plásmido, o en un cromosoma artificial. La introducción de las construcciones en las células de planta objetivo se puede realizar mediante una variedad de técnicas que incluyen, sin limitación, transformación mediada por Agrobacterium, electroporación, microinyección, bombardeo de microproyectiles, coprecipitación de ADN con fosfato de calcio o transformación mediada por liposoma de un ácido nucleico heterólogo. La transformación de la planta preferiblemente es permanente, esto es, por la integración de las construcciones de expresión introducidas en el genoma de la planta hospedera, de tal manera que las construcciones introducidas se transfieren a generaciones de plantas sucesivas. Dependiendo del uso, una construcción de ácido nucleico heterólogo que comprende un polinucleótido HIO1005 puede codificar toda la proteína o una porción biológicamente activa de la misma.

En una modalidad, se pueden usar sistemas de vector binarios basados en Ti para transferir los polinucleótidos. Los vectores binarios de Agrobacterium estándares son conocidos para los expertos en la materia y muchos están disponibles comercialmente (por ejemplo, pBI121 Clontech Laboratories, Palo Alto, California). Una construcción o vector puede incluir un promotor de planta para expresar la molécula de ácido nucleico de elección. En una modalidad preferida, el promotor es un promotor de planta. El procedimiento óptimo para la transformación de plantas con vectores de Agrobacterium variará con el tipo de planta transformada. Métodos ejemplares para la transformación mediada por Agrobacterium incluyen la transformación de explantes de hipocotilo, punta de vastago, tallo o tejido de hoja, derivado de plántulas estériles y/o retoños. Dichas plantas transformadas se pueden reproducir sexualmente, o mediante cultivo de célula o tejido. La transformación por Agrobacterium se ha descrito previamente para una gran cantidad de tipos de plantas diferentes y los métodos para dicha transformación se pueden encontrar en la literatura científica. Son de particular relevancia los métodos para transformar cultivos comercialmente importantes, tales como colza (De Block y otros, 1989), girasol (Everett y otros, 1987), y soya (Christou y otros, 1989; Kline y otros, 1987). La expresión (que incluye transcripción y traducción) de HIO1005, se puede regular con respecto al grado de expresión, los tipos de tejido en donde ocurre la expresión y/o la etapa de desarrollo de la expresión.

Están disponibles varias secuencias reguladoras heterólogas (por ejemplo promotores e incrementadores) para controlar la expresión de un ácido nucleico HIO105. Estos incluyen promotores constitutivos, inducibles y regulables, así como también promotores e incrementadores que controlan la expresión de una manera específica de tejido o específica de tiempo. Los promotores constitutivos ejemplares incluyen el promotor E4 de frambuesa (patentes de EE. UU. Nos. 5,783,393 y 5,783,394), el promotor de nopalina sintasa (NOS) (Ebert y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (EE. UU.) 84:5745-5749, 1987), el promotor de octopina sintasa (OCS) (que es llevado en plásmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), los promotores de caulinovirus tales como el promotor 19S del virus de mosaico de coliflor (CaMV) (Lawton y otros, Plant Mol. Biol. 9:315-324, 1987) y el promotor CaMV 35S (Odell y otros, Nature 313:810-812, 1985 y Jones JD y otros, 1992), el promotor de actina de melón (solicitud de PCT publicada WO0056863), el promotor 35S del virus del mosaico de escrofularia (patente de EE. UU. No. 5,378,619), el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de ribulosa-1 ,5-bís-fosfato carboxilasa (ssRUBISCO), el promotor Adh (Walker y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (EE. UU.) 84:6624-6628, 1987), el promotor de sacarosa sintasa (Yang y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (EE. UU.) 87:4144-4148, 1990), el promotor del complejo de gen R (Chandier y otros, The Plant Cell /:1175-1183, 1989), el promotor del gen de proteína de unión de clorofila a/b, el promotor CsVMV ((Verdaguer B y otros, 1998), estos promotores se han usado para crear construcciones de ADN que han sido expresadas en plantas, por ejemplo en la publicación de PCT WO 84/02913. Los promotores específicos de tejido ejemplares incluyen los promotores E4 y E8 de tomate (patente de EE. UU. No. 5,859,330), y el promotor del gen 2AII de tomate (Van Haaren MJJ y otros, 1993). En una modalidad preferida, la expresión de HIO1005 está bajo el control de secuencias reguladoras de genes cuya expresión está asociada con el desarrollo temprano de semilla y/o embrión. En realidad, en una modalidad preferida, el promotor usado es un promotor incrementado en semilla. Ejemplos de dichos promotores incluyen las regiones 5' reguladoras de dichos genes, tales como napina (Kridl y otros, Seed Sci Res. 1 :209:219, 1991 ), globulina (Belanger y Kriz, Genet., 129: 863-872, 1991 , No. de registro GenBank L22295), gamma zeina Z 27 (Lopes y otros Mol Gen Genet, 247:603-613, 1995), promotor de oleosina L3 (patente de EE. UU. 6,433,252), faseolina (Bustos y otros, Plant Cell, 1(9):839-853, 1989), arcelind (US 2003/0046727), un promotor 7S de soya, un promotor 7Sa de soya (US 2003/0093828), el promotor de beta conglicinina 7Sa' de soya, un promotor 7Sa' (Beachy y otros, EMBO J., 4:3047, 1985; Schuler y otros, Nucleic Acid Res., 10(24):8225-8244, 1982), inhibidor de tripsina de soya (Riggs y otros, Plant Cell 1 (6):609-621 , 1989), ACP (Baerson y otros, Plant Mol. Biol. 22(2):255-267, 1993), estearoil-ACP desaturasa (Slocombe y otros, Plant Physiol. 104(4):167-176, 1994), subunidad a' de ß-congiicinina de soya (Chen y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. 83:8560-8564, 1986), Vicia faba USP (P-Vf.Usp, SEQ ID NO: 1 , 2 y 3 en (US 2003/229918) y promotor de oleosina L3 de Zea Mays (Hong y otros, Plant Mol. Biol. 34(3):549-555, 1997). También se incluyen las zeínas, que son un grupo de proteínas de almacenamiento encontradas en el endosperma de maíz. Se han aislado clonas genómicas para los genes de zeína (Pedersen y otros, Cell 29:1015-1026, 1982; y Russell y otros, Transgenic Res. 6(2): 157-168); también se pueden utilizar los promotores de estas clonas, que incluyen los de 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD y los genes. Otros promotores que se sabe que funcionan, por ejemplo en maíz, incluyen los promotores para los siguientes genes: waxy, Brittle, Shrunken 2, enzimas de ramificación i y II, sintasas de almidón, enzimas de desramificación, oleosinas, glutelinas y sacarosas sintasas. Los genes de legumbres cuyos promotores están asociados con el desarrollo temprano de semilla y embrión incluyen V. Faba legumin (Baumlein y otros, 1991 , Mol Gen Genet 225:121-8; Baumlein y otros, 1992, Plant J 2:233-9), V. Faba usp (Fiedler y otros, 1993, Plant Mol Biol. 22:669-79), convicilina de chícharo (Bown y otros, 1988, Biochem J 251 :717-26), lectina de chícharo (dePater y otros, 1993, Plant Cell 5:877-86), faseolína de P. vulgaris beta (Bustos y otros, 1991 , EMBO J 10:1469-79), DLEC2 y PHS [beta] de P. vulgaris (Bobb y otros, 1997, Nucleic Acids Res 25:641-7), y proteína de almacenamiento 7S de beta-conglicinina de soya (Charuberland y otros, 1992, Plant Mol Biol. 19:937-49). Los genes de cereal cuyos promotores están asociados con el desarrollo temprano de semilla y embrión incluyen glutelina de arroz ("GluA-3", Yoshihara y Takaiwa, 1996, Plant Cell Physiol 37:107-11 ; "GluB-1", Takaiwa y otros, 1996, Plant Mol Biol. 30:1207-21 ; Washida y otros, 1999, Plant Mol.

Biol. 40:1-12, "Gt3", Leisy y otros, 1990, Plant Mol Biol. 14:41-50), prolamina de arroz (Zhou y Fan, 1993, Transgenic Res 2:141-6), prolamina de trigo (Hammond-Kosack y otros, 1993, EMBO J 12:545-54), zeína de maíz (Z4, Matzke y otros, 1990, Plant Mol Biol. 14:323-32), y B-hordeíns de cebada (Entwistle y otros, 1991 , Plant Mol Biol. 17:1217-3)). Otros genes cuyos promotores están asociados con el desarrollo temprano de semilla y embrión incluyen GLO7A de palma de aceite (7S globulina, Morcillo y otros, 2001 , Physiol Plant 112:233-243), Brassica napus napin, proteína de almacenamiento 2S, y gen napA (Josefsson y otros, 1987, J Biol. Chem 262:12196-201 ; Stalberg y otros, 1993, Plant Mol Biol 1993 23:671-83, Ellerstrom y otros, 1996, Plant Mol Biol 32:1019-27), oleosina de Brassica napus (Keddie y otros, 1994, Plant Mol Biol 24:327-40), oleosina de Arabidopsis (Plant y otros, 1994, Plant Mol Biol 25:193-205), FAE1 de Arabidopsis (Rossak y otros, 2001 , Plant Mol Biol 46:717-25), conA de Canavalia gladiata (Yamamoto y otros, 1995, Plant Mol Bioi. 27:729-41 ), y estrictosidina sintasa de Catharanthus roseus (Str, Ouwerkerk y Memelink, 1999, Mol Gen Genet 261 :635-43). En otra modalidad preferida, se usan secuencias reguladoras de genes expresados durante la biosíntesis de aceite (véase por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 5,952,544). Los promotores alternativos son de genes de proteína de almacenamiento de planta (Bevan y otros, 1993, Philos Trans R Soc Lond B Biol. Sci 342:209-15). Promotores adicionales que se pueden utilizar se describen por ejemplo en las patentes de EE. UU. 5,378,619; 5,391 ,725, 5,428,147; 5,447,858; 5,608,144; 5,608,144; 5,614,399; 5,633,441 ; 5,633,435; y 4,633,436. En otro aspecto, en algunos casos puede ser deseable inhibir la expresión de HIO1005 endógeno en una célula hospedera. Los métodos ejemplares para practicar este aspecto de la invención incluyen, sin limitación, supresión de antisentido (Smith y otros, 1988; van der Krol y otros, 1988); cosupresión (Napoli y otros, 1990); ribozimas (publicación de PCT WO 97/10328); y combinaciones de sentido y antisentido (Waterhouse y otros, 1998). Los métodos para la supresión de secuencias endógenas en una célula hospedera normalmente emplean la transcripción o transcripción y traducción de por lo menos una porción de la secuencia por suprimir. Dichas secuencias pueden ser homologas a regiones codificadoras y no codificadoras de la secuencia endógena. La inhibición de antisentido puede usar toda la secuencia de ADNc (Sheehy y otros, 1988), una secuencia parcial de ADNc que incluye fragmentos de la secuencia codificadora 5' (Cannon y otros, 1990), o secuencias 3' no codificadoras (Ch'ng y otros, 1989). Las técnicas de cosupresi?n pueden usar toda ia secuencia de ADNc (Napoli y otros, 1990; van der Krol y otros, 1990), o una secuencia parcial de ADNc (Smith y otros, 1990). Se pueden realizar pruebas moleculares y genéticas estándares para analizar más la asociación entre un gen y un fenotipo observado. A continuación se describen técnicas ejemplares. 1. Síntesis de ADN/ARN Los patrones de expresión de gen, específicos de etapa y de tejido en líneas mutantes contra tipo silvestre se pueden determinar por ejemplo mediante hibridación in situ. Se puede realizar análisis del estado de metilación del gen, especialmente las regiones reguladoras flanqueadoras. Otras técnicas adecuadas incluyen sobreexpresión, expresión ectópica, expresión en otras especies de planta y knock-out (genética inversa, knock-out dirigido, silenciamiento de gen inducida por virus [VIGS, véase Baulcombe D, 1999]). En una aplicación preferida se usa perfil de expresión de aplicación, generalmente mediante análisis de microarreglo, para medir simultáneamente diferencias o cambios inducidos en ia expresión de muchos genes diferentes. Las técnicas para análisis de microarreglo son muy conocidas (Schena M y otros, Science (1995) 270:467-470; Baldwin D y otros, 1999; Dangond F, Physiol Genomics (2000) 2:53-58; van Hal NL y otros, J Biotechnol (2000) 78:271-280; Richmond T y Somerville S, Curr Opin Plant Biol. (2000) 3:108-116). Se puede realizar el perfil de expresión de líneas marcadas individuales. Dicho análisis puede identificar otros genes que son regulados coordinadamente como consecuencia de la sobreexpresión del gen de interés, lo que puede ayudar a colocar un gen desconocido en una ruta particular. 2. Análisis de producto de gen El análisis de los productos de gen puede incluir la expresión de proteína recombinante, producción de antisuero, inmunolocalización, pruebas bioquímicas para actividad catalítica u otra actividad, análisis del estado de fosforilación, y análisis de la interacción con otras proteínas por medio de pruebas de levadura de dos híbridos. 3. Análisis de la ruta El análisis de la ruta puede incluir colocar un gen o producto de gen dentro de una ruta bioquímica, metabólica o de señalización particular basándose en su fenotipo de expresión deficiente, o mediante homología de secuencia con genes relacionados. Alternativamente, el análisis puede comprender cruzas genéticas con líneas de tipo silvestre y otras líneas mutantes (que crean mutantes dobles) para ordenar el gen en una ruta, o determinar el efecto de una mutación sobre la expresión de genes "reporteros" en dirección 3' en una ruta.

Generación de plantas mutadas con un fenotipo de contenido alterado de aceite La invención provee además un método para identificar plantas que tienen mutaciones en ei HIO1005 endógeno que confiere contenido alterado de aceite, y generar progenie de estas plantas con contenido alterado de aceite que no están modificadas genéticamente. En un método, denominado "TILLING" (de 'lesiones locales inducidas por dirección en genomas'), son inducidas mutaciones en la semilla de una planta de interés, por ejemplo usando un tratamiento EMS. Las plantas resultantes se desarrollan y autofertilizan, y la progenie se utiliza para preparar muestras de ADN. Se usa PCR específica de HIO1005 para identificar si una planta mutada tiene una mutación HIO1005. Las plantas que tienen mutaciones HIO1005 se pueden probar entonces para determinar su contenido alterado de aceite, o alternativamente las plantas se pueden probar para determinar su contenido alterado de aceite, y después se usa PCR específica de HIO1005 para determinar si una planta que tiene contenido alterado de aceite tiene un gen HIO1005 mutado. La TILLING puede identificar mutaciones que pueden alterar la expresión de genes específicos o la actividad de proteínas codificadas por estos genes (véase Coibert y otros (2001 ) Plant Physiol 126:480-484; McCallum y otros (2000) Nature Biotechnology 18:455-457). En otro método, se puede usar un enfoque de gen candidato /Locus de Rasgo Cuantitativo (QTLs) en un programa de reproducción asistida por marcador para identificar los alelos o las mutaciones en el gen HIO1005 u ortólogos de HIO1005 que pueden conferir contenido alterado de aceite (véase Bert y otros, Theor Appl Genet 2003 Jun 107(1 ):181-9; y Lionneton y otros, Genome, 2002 Dic; 45(6):1203-15). De esta manera, en un aspecto adicional de la invención, se usa un ácido nucleico HIO1005 para identificar si una planta que tiene contenido alterado de aceite tiene una mutación en HIO1005 endógeno, o si tiene un alelo particular que ocasiona contenido alterado de aceite. Aunque la invención se ha descrito con referencia a métodos y modalidades específicas, se apreciará que se pueden hacer varios cambios y modificaciones sin apartarse de la invención. Todas las publicaciones aquí citadas se incorporan expresamente como referencia con la finalidad de describir las composiciones y metodologías que se podrían usar con respecto a la invención. Todas las patentes, solicitudes de patente e información de secuencia citadas en los sitios web referidos y bases de datos públicas también se incorporan como referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Generación de plantas con fenotipo HIO1005 por transformación con una construcción de marcación de activación Se generaron mutantes usando el vector de marcación de activación "ACTTAG" pSK1015 (G1 #6537289; Weigel D y otros, 2000). Se usaron los métodos estándares para generar plantas transgénicas de Arabidopsis, y fueron esencialmente como se describe en la solicitud publicada de PCT WO0183697. Brevemente, plantas de Arabidopsis TO (Col-0) se transformaron con Agrobacterium que lleva el vector pSK1015, que comprende ADN-T derivado del plásmido Ti de Agrobacterium, un gen marcador seleccionable de resistencia a herbicida, y el elemento incrementador 35S de 4X CaMV. Las plantas transgénicas se seleccionaron en la generación T1 basándose en la resistencia de herbicida. La semilla T3 se analizó mediante espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR) en el momento de la cosecha. Los espectros de infrarrojo NIR se capturaron usando un Bruker 22 N/F. Se usó software Braker para estimar el contenido de aceite total por semilla y el contenido de proteína total de semilla usando datos del análisis NIR y métodos de referencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los contenidos de aceite previstos por la calibración de los presentes autores (ren oil 1473 Id+sime q2, Predicts Hexane Extracted Oil), que siguieron el método general de AOCS AMI-92, "Oficial Methods and Recommended Practices" de la American Oil Chemists Society, 5a ed., AOCS, Champaign, Illinois, se compararon para 38,090 líneas individuales ACTTAG. Subsiguientemente al análisis de composición de semilla, se determinó la posición del elemento ACTTAG en el genoma de cada línea mediante PCR inversa y secuenciación. Se consideraron en este análisis 38,090 líneas con secuencias de flanqueo recuperadas. Puesto que las 38,090 líneas se plantaron y desarrollaron durante un periodo de 12 meses, los valores de contenido de aceite de semilla se normalizaron para minimizar el efecto de las diferencias ambientales que pueden alterar el contenido de aceite de semilla. Se calculó el contenido promedio de aceite de semilla y su desviación estándar cada día que se plantó una línea. El contenido de aceite de semilla se expresó como una "distancia de desviación estándar relativa" (distancia SD), que se calculó restando el contenido promedio de aceite de semilla el día de la plantación, del contenido de aceite de semilla de cada línea, y dividiendo la diferencia entre la desviación estándar para ese día. Esa normalización permite comparar el contenido de aceite de semilla en las semillas de plantas desarrolladas durante todo el año. Los genes que ocasionan un fenotipo de alto contenido de aceite en la semilla cuando se sobreexpresan se identificaron evaluando todos los genes afectados por los elementos ACTTAG en las 38,090 líneas. Esto se realizó mediante el siguiente procedimiento: en primer lugar se identificaron los genes probablemente activados por el elemento ACTTAG en cada línea, y se asignó a estos genes el contenido de aceite de semilla de la línea; en segundo lugar, se determinó el contenido de aceite de semilla cuando un gen particular se sobreexpresa promediando los valores individuales de aceite de semilla para cada gen. Puesto que se evaluaron 38,090 líneas y cada elemento afecta un promedio de 2.5 genes, cada gen tendrá un promedio de 4 valores de aceite de semilla. Se determinó que los genes con la distancia SD promedio más alta eran aquellos que causaban un fenotipo de alto contenido de aceite en semilla cuando se sobreexpresan. Las plantas que sobreexpresan At5g02290, HIO1005 tienen un contenido de aceite de 117% del promedio diario de la plantación. El contenido de aceite y la "distancia de desviación estándar relativa" de las plantas que sobreexpresan At5g02290, HIO1005, se muestran en el siguiente cuadro 1.

CUADRO 1 EJEMPLO 2 Caracterización de la inserción de ADN-T en plantas que exhiben el fenotipo alterado de contenido de aceite Los presentes autores realizaron análisis moleculares estándares, esencialmente como se describe en la solicitud de patente PCT WO 0183697, para determinar el sitio de la inserción de ADN-T asociado con el fenotipo de contenido alterado de aceite. Brevemente, ADN genómico se extrajo de plantas que exhiben el fenotipo de contenido alterado de aceite. Una PCR, usando iniciadores específicos para el vector pSK1015, confirmó la presencia del incrementador 35S en plantas de la línea de aceite HIO1005, y un análisis de Southern blot verificó la integración genómica del ADN-T ACTTAG, y mostró la presencia de las inserciones de ADN-T en cada una de las líneas transgénicas. Se usó PCR inversa para recuperar el ADN genómico que flanquea la inserción de ADN-T, que después se sometió a análisis de secuencia usando una búsqueda básica de BLASTN y/o una búsqueda de la base de datos de Recursos de Información de Arabidopsis (TAIR) (disponible en el sitio web arabidopsis.org).

EJEMPLO 3 Recapitulación del fenotipo HIO1005 Para probar si la sobreexpresión de Atg02290 ocasiona un fenotipo de alto contenido de aceite en semilla, se comparó ei contenido de aceite en semillas de plantas transgénicas que sobreexpresan este gen, con el contenido de aceite en semillas de plantas de control no transgénicas. Para hacer esto, At5g02290 se clonó en un vector de transformación de planta detrás del promotor CsVMV específico de semilla, y se transformó en plantas de Arabidopsis usando el método de inmersión floral. El vector de transformación de planta contiene el gen nptll manejado por el promotor RE4, para proveer resistencia a la kanamicina y servir como un marcador seleccíonable. La semilla de las plantas transformadas se sembró en medio de agar que contenía kanamicina. Después de 7 días, las plantas transgénicas se identificaron como plantas verdes sanas y se transplantaron al suelo. Las plantas de control no transgénicas se germinaron en medio de agar, se dejaron crecer 7 días y después se transplantaron al suelo. Veintidós plántulas transgénicas y diez plantas de control no transgénicas se transpiantaron en posiciones aleatorias en el mismo semillero de 32 células.

Las plantas se desarrollaron hasta maduración, se dejaron autofertilizar y echar semilla. La semilla se cosechó de cada planta y se estimó su contenido de aceite por medio de espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR) usando los métodos previamente descritos. El porcentaje de aceite en la semilla cosechada de cada planta determinado por espectroscopia NIR se presenta en el cuadro 3. El valor de aceite relativo se determina dividiendo el valor de aceite predicho entre el valor promedio de aceite en la semilla de control (es decir, la semilla de plantas sin el transgen). El efecto de la sobreexpresión de At5g02290 sobre el aceite de semilla se probó en dos experimentos. En ambos experimentos, las plantas que sobreexpresan At5g02290 tuvieron un contenido de aceite en semilla más alto que las plantas de control desarrolladas en el mismo semillero. Entre los experimentos, el contenido de aceite en semilla promedio de las plantas que sobreexpresan Atg02290 fue 3.9% mayor que el de los controles no transformados. El contenido de aceite en semilla de las plantas que sobreexpresan Atg502290 fue significativamente mayor que las plantas de control no transgénicas (ANOVA bidireccional; P=0.0297).

CUADRO 2 CUADRO 2 (CONTINUACIÓN) EJEMPLO 4 Análisis de la secuencia H1O1005 de Arabidopsis Se realizaron análisis de secuencia con BLAST (Altschui y otros, 1990, J. Mol. Bioi. 215:403-410), PFAM (Bateman y otros, 1999, Nucleic Acids Res 27:260-262), PSORT (Nakai K y Horton P, 1999, Trends Biochem Sci 24:34-6) y/o CLUSTAL (Thompson JD y otros, 1994, Nucleic Acids Res 22:4673-4680).

TBLASTN contra ESTs: El gen At5g02290 candidato es soportado por el ADN de longitud completa gi|42458510, gi|42458347, gi|42458159, gi|42457560, gi|42457287. Nótese que las 2 entradas de la secuencia de proteína para At5g02290 (>gi|15241749 y >gi|30679590) son 100% idénticas, y por lo tanto dan exactamente los mismos resultados de análisis computacional que se describen abajo. Hay muchas ESTs de diversas especies de planta que muestran similitud con At5g02290. Cuando sea posible se hacen ESTs contiguas de cada especie. Más abajo se da el acierto más alto de cada una de las siguientes especies, y se incluyen en el cuadro 2 de ortólogo: Triticum aestivum, Glycine max, Mentha x piperita, Populus trémula, Oryza sativa, Lycopersicon esculentum, Solanum tuberosum, y Beta vulgaris. 1. ESTs de remolacha con los siguientes IDs de GenBank: gi|34892113 2. ESTs de papa con las siguientes IDS de GenBank: gi|9249744 gi| 10446230 gi| 12588854 gi| 14642480 gi| 17070644 gi|17070774 gi|17070788 gi|17075314 gi|19821257 gi|21922218 gi|21375853 3. ESTs de tomate con las siguientes IDS de GenBank: gi|4381266 g¡|5602522 gi|5897320 gi|4381266 gi|5602522 g¡|5897320 gi|5897320 gi| 14688536 gi| 14688536 4. ESTs de arroz con las siguientes IDS de GenBank: gi|2317369 gi|2317406 gi|5443728 5. ESTs de álamo con las siguientes IDS de GenBank: gi|23985034 gi|24060873 gi|28609471 gi|27421455 6. ESTs de menta con las siguientes IDS de GenBank: gi|7244808 7. ESTs de soya con las siguientes IDS de GenBank: gi|7478486 7638957 7925466 13790463 15812567 15815577 16344047 16344695 19270028 22525920 10 22525985 27446266 ESTs de maíz con las siguientes IDS de GenBank: 5915602 6194459 15 6826956 6828040 21210829 18173600 18650074 20 22472730 22473455 22545925 23199478 gi|26558828 gi|26558898 9. ESTs de algodón con las siguientes IDS de GenBank: gi|5050902 gi|5050715 gi|5046977 10. ESTs de trigo con las siguientes IDS de GenBank: |l 1543439 120102206 120106492 120113019 117145892 121483048 |22212150 I22302945 I32556607 BLASTP contra aminoácidos: La proteína At5g02290 tiene homología con proteína cinasas de plantas, hongos y animales. Un análisis de secuencia detallado de proteína cínasas de planta mostraron que At5g02290 es un miembro de la familia 1.2.2 de proteína cinasas de planta (serina/treonina cinasa citoplásmica de tipo receptor Vil), de la cual hay 51 miembros (familia PPC 1.2.2). Probablemente estas proteínas realizan funciones similares en las plantas. Los 10 mejores resultados de BLAST para At5g02290 se indican más abajo y se incluyen en el cuadro 2 de ortólogo. 1. At5g02290 misma proteína cinasa >gi|15241749|ref|NP_195849.11, putativa [Arabidopsis thaliana] proteína cinasa >gi|30679590|ref|NP_850755.11 , putativa [Arabidopsis thaliana] >gi|21431784|sp|P43293|NAK_ARATH Probable serina/treonina cinasa de proteína NAK >gi|l 1376624|pir|jT48250 proteína cinasa NAK específica de serina/treonina (EC 2.7.1.-) - Arabidopsis thaliana >gi|7406425|emb|CAB85534.1 | proteína cinasa NAK específica de serina/treonina [Arabidopsis thaliana] >gi|21555255|gb|AAM63816.1 | proteína cinasa NAK específica de serina/treonina [Arabidopsis thaliana] longitud = 389 Puntuación = 2017 (715.1 bits), esperado = 9.9e-208, P = 9.9e-208 Identidades = 389/389 (100%), Positivos = 389/389 (100%) La siguiente secuencia es otra entrada redundante de At5g02290. Sin embargo, difiere de la secuencia arriba indicada en algunos nucleótidos. Probablemente este es el resultado de errores de secuenciación o de polimorfismos de un solo nucleótído con poco o ningún efecto sobre la actividad. proteína cinasa >gi|166809|gb|AAAI 8853.11 Longitud = 389 Puntuación = 2008 (711.9 bits), esperado= 8.9e-207, P = 8.9e-207 Identidades = 388/389 (99%), Positivos = 388/389 (99%) 2. Proteína cinasa putativa específica de serina/treonina de arroz Proteína cinasa >gi|34906046|ref|NP_914370.11 putativa específica de serina/treonina [Oryza sativa (grupo-cultivar japónica)] proteína cinasa >gi|15290002|dbj|BAB63697.1 | putativa específica de serina/treonina [Oryza sativa (grupo-cultivar japónica)] proteína cinasa >gi|20160935|dbj|BAB89871.1 | putativa específica de serina/treonina [Oryza sativa (cultivar-grupo japónica)] Longitud = 467 Puntuación = 1331 (473.6 bits), Esperado = 4.9e-135, P = 4.9e- 135 Identidades = 252/375 (67%), Positivos = 307/375 (81 %) 30 3. Atlg07570 de Arabidopsis >gi|15222437|ref|NP_172237.11 proteína cinasa (APKIa) [Arabidopsis thaliana] >gi|42571375|reflNP_973778.1 | proteína cínasa (APKIa) [Arabidopsis thaiiana] >gi|l 168470|sp|Q06548|APKA_ARATH Proteína cinasa APKIA >gi|282877|pir||S28615 proteína cinasa APKI específica de serina/treonina/tirosina (EC 2.7.1.-) [validada] - Arabidopsis thaliana >gi|217829|dbj|BAA02092.1 | proteína cinasa tirosina-serina-treonina [Arabidopsis thaliana] >gi|28393320|gb|AAO42086.1 | proteína cinasa putativa APKIA [Arabidopsis thaliana] >gi|28827602|gb|AAO50645.1 | proteína cinasa putativa APKIA [Arabídopsis thaliana] Longitud = 410 Puntuación = 1330 (473.2 bits), Esperado = 6.3e-135, P = 6.3e-135 Identidades = 253/359 {70%), Positivos = 303/359 (84%) La siguiente secuencia es otra entrada redundante de Atlg07570.

Sin embargo, difiere de la secuencia indicada arriba por algunos nucleótidos.

Probablemente este es el resultado de errores de secuenciación o polimorfismos de un solo nucleótido con poco o ningún efecto sobre la actividad. >gi|8778537|gb|AAF79545.1 | F22G5.5 [Arabidopsis thaliana] Longitud = 464 Puntuación = 993 (354.6 bits), Esperado = 1.9e-133, Suma P(2) = 1.9e-133 Identidades = 192/277 (69%), Positivos = 229/277 (82%) 4. At2g28930 de Arabidopsis >gi|42569425|ref|NPJ 80459.2| proteína cinasa (APKIb) [Arabidopsis thaliana] Longitud = 423 Puntuación = 1314 (467.6 bits), Esperado = 3.1e-133, P = 3.1 e- 133 Identidades = 252/373 (67%), Positivos = 301/373 (80%) Las siguientes secuencias son otras entradas redundantes de At2g28930. Sin embargo, difiere de la secuencia indicada arriba por algunos nucleótidos. Probablemente este es el resultado de errores de secuenciación o polimorfismos de un solo nucleótido con poco o ningún efecto sobre la actividad. >gi|12644274|sp|P46573|APKB_ARATH Proteína cinasa APKIB >gi|7434286|pir||T02725 probable proteína cinasa específica de serina/treonina/tirosina (EC 2.7.1.-) T9I4.1 - Arabidopsis thaliana >gi|3461835|gb|AAC33221.11 proteína cinasa putativa [Arabidopsis thalíana] >gi|20197437|gb| AAM 15075.11 proteína cinasa putativa [Arabidopsis thaliana] Longitud = 412 Puntuación = 1327 (472.2 bits), Esperado = 1.3e-134, P = 1.3e-134 Identidades = 258/388 (66%), Positivos = 309/388 (79%) 5. Proteína cinasa putativa de arroz >gi|14719339|gb|AAK73157.1 | proteína cinasa putativa [Oryza sativa] Longitud = 395 Puntuación = 1310 (466.2 bits), Esperado = 8.2e-133, P = 8.2e- 133 Identidades = 249/370 (67%), Positivos = 302/370 (81 %) 6. Proteína cinasa putativa de arroz >gi|34897424|ref|NP_910058.11 proteína cinasa putativa [Oryza sativa (grupo-cultivar japónica)] >gi|27545044|gb|AAOI 8450.11 proteína cinasa putativa [Oryza sativa (grupo-cultivar japónica)] Longitud = 416 Puntuación = 1284 (457.0 bits), Esperado = 4.7e-130, P = 4.7e-130 Identidades = 254/402 (63%), Positivos = 321/402 (79%) 7. At2g39660 de Arabidopsis >gi|15225520|ref]NP_l 81496.11 proteína cinasa, putativa [Arabidopsis thaliana] >gi 17434287 |pír | |T00574 probable proteína cinasa [importada] - Arabidopsis thaliana >gi|2795805|gb|AAB97121.1 | proteína cinasa putativa [Arabidopsis thaiiana] >gi|13272431 |gb|AAK17154.11 proteína cinasa putativa [Arabidopsis thaliana] >gi|17064834|gb|AAL32571.1 | proteína cinasa putativa [Arabidopsis thaliana] >gi|18086424|gb|AAL57667.1 | At2g39660/F12L6.32 [Arabidopsis thaliana] >gi|20197111 |gb|AAM 14921.11 proteína cinasa putativa [Arabidopsis thaliana] >gi|20259860|gb|AAM 13277.11 proteína cinasa putativa [Arabidopsis thaliana] >gi|20334794|gb|AAM16258.11 At2g39660/F12L6.32 [Arabidopsis thaliana] Longitud = 395 Puntuación = 1272 (452.8 bits), Esperado = 8.8e-129, P = 8.8e-129 Identidades = 241 /368 (65%), Positivos = 300/368 (81 %) 8. Proteína cinasa de cañóla (Brassica) >gi|45259527|dbj IBADI 2263.1 ] proteína cinasa [Brassica rapa] Longitud = 404 Puntuación = 1252 (445.8 bits), Esperado = 1.2e-126, P = 1.2e-126 Identidades = 244/398 (61 %), Positivos = 301/398 (75%) 9. At3g55450 de Arabidopsis >gi|30694253|ref|NP_191105.2| proteína cinasa, putativa [Arabidopsis thaliana] >gi|23306362|gb|AAN 17408.11 clase de proteína cínasa específica de serina/treonina [Arabidopsís thaliana] Longitud = 389 Puntuación = 1179 (420.1 bits), Esperado = 6.3e-i 19, P = 6.3e- 119 Identidades = 226/354 (63%), Positivos = 283/354 (79%) 10. Proteína cínasa putativa de tirosina-serina-treonina de arroz >gi|19071648|gb|AAL84315.1| proteína cinasa putativa de tirosina-serina-treonina [Oryza sativa (cultivar-grupo japónica)] Longitud = 422 Puntuación = 1178 (419.7 bits), Esperado = ß.Oe-119, P = 8.0e- 119 Identidades = 235/394 (59%), Positivos = 301/394 (76%) CUADRO 3 CUADRO 3 (CONTINUACIÓN) CUADRO 3 (CONTINUACIÓN) HOMÓLOGOS MAS CERCANOS: CONTINUACIÓN At5g02290 puede ser una proteína cloroplástica (predicho por TargetP). Consistentemente con este resultado, At5g02290 carece de péptido señal y carece de dominio de transmembrana como fue predicho con SignalP y TMHMM, respectivamente. Un análisis de Pfam mostró que At5g02290 es un miembro de la familia de proteína cinasas de serina/treonina (COG0515, SM00220, PF00069).

Modelo Dominio Seq-f* Seq-t Hmm-f Hmm-t Puntuación Valor E COG0 515 1/1 68 388 .. 1 536 [ ] 88 3 3.1e-23 SM00220 1/1 68 348 .. 1 231 [ ] 140 .7 5.2e-39 PF00069 1/1 68 350 .. 1 278 [ ] 182.0 2e-51 *seq-f se refiere a "secuencia de" y seq-t se refiere a "secuencia a", Los dos puntos después del número seq-t indican que la región coincidente está dentro de la secuencia y no se extiende a ningún extremo. Los dos corchetes indican que la coincidencia abarca toda la longitud de HMM de perfil; hmm-f y hmm-t se refieren al comienzo y la terminación de coordenadas desde la porción coincidente del HMM de perfil.

Las proteína cinasas eucarióticas son unas enzimas que pertenecen a una familia muy extensa de proteínas que comparten un núcleo catalítico conservado con serina/treonina y tirosina cinasas. Hay un número de regiones conservadas en el dominio catalítico de las proteína cinasas. En el extremo N del dominio catalítico hay un tramo rico en residuos de glicina en la vecindad de un residuo de lisina, que se ha visto implicado en la unión de ATP. En la parte central del dominio catalítico hay un residuo conservado de ácido aspártico que es importante para la actividad catalítica de la enzima. Aunque la signatura SMART, SM00220, identifica el dominio catalítico, la signatura PROSITE, PS00108, identifica el sitio activo. El análisis de secuencia detallado de proteína cinasas de planta mostraron que At5g02290 es un miembro de la familia 1.2.2 de proteína cínasas de planta (serina/treonina cínasa citoplásmica de tipo receptor Vil), de la cual hay 51 miembros (familia PPC 1.2.2). Nótese que la clasificación de proteína cínasa por plantsP se basa en comparación de secuencias usando BLAST. El sistema de clasificación no toma en cuenta la localización celular de las proteínas. Por lo tanto, aunque la familia 1.2.2 de proteína cinasa de planta se denomina "cinasa citoplásmica de tipo receptor Vil" no se hace implicación respecto a la localización celular de sus miembros (por ejemplo citoplásmica, nuclear, transmembrana). En conclusión, la proteína cinasa cioroplástica At5g02290 puede regular la actividad de otras proteínas que pueden tener un impacto sobre la síntesis de ácidos grasos.

EJEMPLO 5 Se obtienen explantes transformados de colza, soya, maíz, girasol, algodón, cacao, alazor, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuate, mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens o bombardeo de micropartículas. Las plantas se regeneran del tejido transformado. Las plantas desarrolladas en invernadero se analizan después para determinar el grado de expresión del gen de interés y las concentraciones de aceite.

EJEMPLO 6 Este ejemplo provee procedimientos analíticos para determinar el contenido de aceite y proteína, diferencias de masa, composición de aminoácidos, concentraciones de aminoácido libre y contenido de micronutrientes, de plantas de maíz transgénico. Las concentraciones de aceite en granos de maíz simples de primera generación y germen y endosperma disecado (en una base de masa y como un porcentaje en peso de tejido), se determinan mediante resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H de baja resolución (Tiwari y otros, JAOCS, 51 :104-109 (1974); o Rubel, JAOCS, 71 :1057-1062 (1994)), con lo cual se miden tiempos de relajación de RMN de muestras de granos simples, y se calculan las concentraciones de aceite basándose en análisis de regresión usando una curva patrón generada del análisis de granos de maíz con cantidades variables de aceite, determinadas gravimétricamente después de extracción acelerada con disolvente. Se hace análisis simple de varianza y la prueba t de Student (JMP, versión 4.04, SAS Instítute Inc., Cary, Carolina del Norte, EE. UU.), para identificar diferencias significativas entre granos transgénicos y no transgénícos determinadas por PCR específica de transgen. Las concentraciones de aceite y las concentraciones de proteína en semillas de segunda generación se determinan por espectroscopias NIT, en donde se miden los espectros NIT de muestras de semillas reunidas cosechadas de plantas individuales, y las concentraciones de aceite y proteína se calculan basándose en un análisis de regresión usando una curva patrón, generada del análisis de granos de maíz con cantidades variables de aceite o proteína, determinadas gravimétricamente después de extracción acelerada con disolvente o análisis elemental (% N), respectivamente. Se hace análisis de varianza simple y la prueba T de Student para identificar diferencias significativas en el aceite (% en peso del grano) y proteína (% en peso del grano) entre semillas de plantas con marcador positivo y marcador negativo. Se determinan las concentraciones de los aminoácidos libres de cada evento transgénico usando el siguiente procedimiento. Semillas de cada planta transgénica se muelen individualmente hasta quedar un polvo fino, y aproximadamente 50 mg del polvo resultante se transfieren a un tubo de centrífuga previamente pesado. Se registra el peso exacto de la muestra y se agrega a cada tubo de muestra 1.0 ml de ácido trifluoroacético al 5%. Las muestras se mezclan a temperatura ambiente con vórtice y después se centrifugan 15 minutos a 14,000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf (modelo 5415C, Brinkmann Instrument, Westbury, Nueva York). Se retira una alícuota del sobrenadante y se analiza por HPLC (Agílent 1100) usando el procedimiento indicado en la publicación técnica de Agilent "Amino Acíd Analysis Using the Zorbax Eclipse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC", 17 de marzo de 2000. El total de aminoácidos de maíz se determina cuantitativamente por medio del siguiente método. Se muelen granos y aproximadamente 60 mg de la harina resultante se hídrolizan en ácido usando HCl 6N a reflujo, a 100 °C durante 24 horas. Las muestras se secan y se reconstituyen en HCl 0.1 N, seguido por derivación de precolumna con a-ftalaldehído (OPA0 para análisis de HPLC). Los aminoácidos se separan mediante una columna de HPLC Zorbax Eclipse XDB-C 18 de fase inversa en un 1100 HPLC de Agilent (Agilent, Palo Alto, California). Los aminoácidos se detectan por fluorescencia. En este examen de aminoácidos no son incluidos cisteína, prolina, asparagina, glutamina y triptófano (Henderson y otros, "Rapid, Accurate, Sensitive and Reproducible HPLC Analysis of Amino Acids, Amino Acid Analysis Using Zorbax Eclípse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC", Agilent Publication (2000); véase también "Measurement of Acid-Stable Amino Acids" Método AACC 07-01 (Métodos Aprobados por la American Associatíon of Cereal Chemists, 9a edición (LCCC# 95-75308)). El total de triptófano se mide en los granos de maíz usando un método de hidrólisis alcalina como se describe (Métodos Aprobados por la American Association of Cereal Chemists 10a edición, AACC ed, (2000), 07-20: Medición de triptófano- Hidrólisis alcalina).

Las concentraciones de tocoferol y tocotrienol en las semillas se miden mediante los métodos conocidos. Brevemente, 10 mg de tejido de semilla se agregan a 1 g de microesferas (Biospec Product Inc, Barlesville, Oklahoma) en un tubo de microcentrífuga estéril, al que se han agregado 500 µl de pirogalol al 1 % (Sigma Chemical Co., San Luís Misuri) /etanol. La mezcla se agita durante 3 minutos en un mini Beadbeater (Biospec) en la velocidad "rápido"; después se filtra a través de un filtro de 0.2 µm en un tubo automuestreador. Los extractos filtrados se analizan por HPLC usando una columna de HPLC Zorbax de sílice (4.6 mm x 250 mm) con una detección fluorescente, excitación a 290 nm, emisión a 336 nm, y paso de banda y ranuras. La composición de disolvente y las condiciones de operación se muestran abajo, siendo el disolvente A hexano y el disolvente B éter metil-t-butílico. El volumen de inyección es de 20 µl, la velocidad de flujo es de 1.5 ml/minuto y el tiempo de operación es de 12 minutos a 40 °C. El gradiente de disolvente es 90% de disolvente A, 10% de disolvente B durante 10 minutos; 25% de disolvente A, 75% de disolvente B durante 11 minutos; y 90% de disolvente A, 10% de disolvente B durante 12 minutos. Se corren estándares de tocoferol en 1 % de pirogalol/etanol para comparación (a-tocoferol, v-tocoferol, ß-tocoferol, d-tocoferol, y tocoferol (tocol)). Se hacen curvas patrón para alfa, beta, delta, y gamma tocoferol usando software Chemstation (Hewlett Packard). Se corren estándares de tocotrienol en 1 % de pirogalol/etanol para comparación (a-tocotrienol, ?-tocotrienol, ß-tocotrienol, d-tocotrienol). Se hacen curvas patrón para a-, ß-, d-, y ?-tocotrienol usando software Chemstation (Hewlett Packard). Las concentraciones de carotenoide en los granos de maíz transgénico se determinan mediante un protocolo estándar (Craft, Meth. Enzymol., 213:185-205 (1992)). Los plastiquínoles y filoquínonas se determinan mediante protocolos estándares (Threlfall y otros, Methods in Enzymology, XVIII, parte C, 369-396 (1971 ); y Ramadan y otros, Eur. Food Res. Technol, 214(6):521-527 (2002)).

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una planta transgénica que comprende un vector de transformación de planta, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o es complementaria a, un polipéptido HIO1005 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o 4, o un ortólogo de la misma, con lo cual la planta transgéníca tiene un fenotipo de aceite alterado con respecto a plantas de control.

2.- La planta transgénica de conformidad con ia reivindicación 1 , caracterizado además porque se selecciona del grupo que consiste en colza, soya, maíz, girasol, algodón, cacao, alazor, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuate.

3.- Una parte de planta obtenida de la planta que se reclama en la reivindicación 1.

4.- La parte de planta de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque es una semilla.

5.- Harina, forraje o alimento producido de la semilla que se reclama en la reivindicación 4.

6.- Un método para producir aceite que comprende desarrollar una planta transgénica como la que se reclama en la reivindicación 1 , y recuperar el aceite de dicha planta.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho aceite se recupera de la semilla de la planta.

8.- Un método para producir un fenotipo de alto contenido de aceite en una planta, que comprende: a) introducir en células progenitoras de la planta un vector de transformación de planta que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o es complementaria, a una secuencia que codifica un polipéptido HIO1005, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o 4, o un ortólogo de la misma, y b) desarrollar las células progenítoras transformadas para producir una planta transgénica en donde se expresa dicha secuencia de polinucleótido, y dicha planta transgénica exhibe un fenotipo de contenido alterado de aceite con respecto a plantas de control.

9.- Una planta obtenida de acuerdo con el método que se reclama en la reivindicación 8.

10.- La planta de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque se selecciona del grupo que consiste en colza, soya, maíz, girasol, algodón, cacao, alazor, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuate.

11.- Un método para generar una planta que tiene un fenotipo de alto contenido de aceite, que comprende identificar una planta que tiene un alelo en su gen HIO1005 que resulta en un incremento del contenido de aceite en comparación con plantas que carecen del alelo, y generar progenie de dicha planta identificada, en donde la progenie generada hereda el alelo y tiene el fenotipo de alto contenido de aceite.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque emplea metodología de gen candídato/QTL.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque emplea metodología TILLING.

14.- Un forraje, harina, grano, alimento o semilla que comprende un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEQ ID NO: 1 o 2.

15.- Un forraje, harina, grano, alimento o semilla que comprende una secuencia de aminoácidos como la que se indica en la SEQ ID NO: 3 o 4, o un ortólogo de la misma.