MXPA06013747A - Secuencias de nucleotidos y polipeptidos codificados los cuales son utiles para modificar las caracteristicas de las plantas. - Google Patents

Abstract

Se describen polinucleotidos aislados y polipeptidos codificados con los cuales, junto con el uso de esos productos se hacen plantas transgenicas con una tolerancia incrementada al pH o incremento en el rendimiento del fosforo.

Description

SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS Y POLIPEPTIDOS CODIFICADOS LOS CUALES SON ÚTILES PARA MODIFICAR LAS CARACTERÍSTICAS DE LAS PLANTAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a polinucleótidos aislados, polipéptidos codificados mediante los cuales, y al uso de esas secuencias para hacer plantas transgénicas con una respuesta modulada al pH y eficacia en el uso de fosfato.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plantas están expuestas constantemente a una variedad de tensiones bióticas (es decir, infecciones de agentes patógenos e insectos herbívoros) y abióticas (por ejemplo, pH alto, baja concentración de fosfato) . Para sobrevivir a estos retos, las plantas han desarrollado mecanismos elaborados para percibir señales externas y tensiones ambientales y para manifestar respuestas adaptivas con cambios fisiológicos y morfológicos apropiados (Bohnert y colaboradores, 1995) . Las plantas expuestas a condiciones de un pH bajo o alto tienen típicamente bajos rendimientos de material vegetal, semillas, fruta y otros productos comestibles. Las condiciones extremas del pH del suelo tienen una influencia mayor sobre la disponibilidad de nutrientes dando por resultado pérdidas agronómicas severas. Las plantas expuestas a condiciones del suelo con un pH bajo desarrollan deficiencias en nutrientes tales como cobre, molibdato, potasio, azufre y nitrógeno. También, las plantas expuestas a condiciones del suelo con un pH alto desarrollan deficiencias en hierro, cobre, manganeso y zinc (Figura 1) . La deficiencia de fosfato es un problema en las condiciones del suelo con un pH tanto alto como bajo. Se requieren nutrientes minerales esenciales en cantidades sustanciales para sostener el crecimiento de las plantas y maximizar el rendimiento de las plantas. Consecuentemente, las entidades agrícolas y hortícolas alteran rutinariamente la rizósfera para maximizar y mantener los rendimientos de los cultivos; esto da por resultado frecuentemente más contaminación y el desequilibrio del balance natural de minerales en el suelo (National Research Council. (1989) Alternative Agricultura.

National Academic Press, Washington DC) . Por ejemplo, el sobre-encalado excesivo de suelos ácidos ha dado por resultado la inducción en deficiencias en hierro, manganeso, cobre y zinc; deficiencias observadas comúnmente en suelos calcáreos. Por lo tanto, sería de gran interés e importancia poder identificar los genes que confieren características mejoradas de eficacia en el uso de fosfato para hacer posible con lo cual que uno cree plantas transformadas (tales como plantas de cultivo) con características mejoradas de eficacia en el uso de fosfato para mejorar con lo cual la supervivencia en condiciones de un pH bajo y alto. En el campo de la agricultura y silvicultura constantemente se están haciendo esfuerzos para producir plantas con un potencial de crecimiento incrementado a fin de alimentar a la población mundial siempre en crecimiento y garantizar el suministro de materias primas reproducibles. Esto se realiza convencionalmente a través del cultivo de plantas. Sin embargo, el proceso de cultivo es tanto consumidor de tiempo así como también requiere una mano de obra intensiva. Además, se deben efectuar programas de cultivo apropiados para cada especie de planta relevante . Se ha hecho un progreso en parte por medio de la manipulación genética de plantas; es decir al introducir y expresar moléculas de ácido nucleico recombinante en plantas. Estos planteamientos tienen la ventaja de no estar limitados usualmente a una especie de planta, sino que en cambio son transíeribles entre especies de plantas. (Zhang y colaboradores (2004) Plant Physiol . 135:615). Existe la necesidad de procesos generalmente aplicables que mejoren el potencial de crecimiento de plantas forestales o agrícolas. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un proceso para incrementar la tolerancia a tensiones abióticas y consecuentemente el potencial de crecimiento en plantas, caracterizado por la expresión de moléculas de ADN recombinante que están integradas de manera estable en el genoma de la planta.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, la presente invención se refiere a polinucleótidos aislados, a polipéptidos codificados mediante los cuales, y al uso de esas secuencias para hacer plantas transgénicas con una tolerancia modulada al pH o una eficacia en el uso de fosfato. La presente invención también se refiere a procesos para incrementar el potencial de crecimiento en plantas bajo condiciones anormales de pH y fosfato, moléculas de ácido nucleico recombinante y polipéptidos utilizados para esos procesos y sus usos, así como también a las plantas mismas. A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en este documento tienen el mismo significado que aquel entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en el campo al cual pertenece esta invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la relación entre el pH del suelo y la absorción de nutrientes. La Figura 2 muestra la recuperación del pH medida por medio del volumen de semillas recolectadas de una planta que contiene el ADNc 1248777 comparada con controles tratados y no tratados de pH.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. DEFINICIONES Los siguientes términos se utilizan por toda esta solicitud: Promotor Constitutivo: Los promotores referidos en este documento como "promotores constitutivos" promueven activamente la transcripción bajo la mayoría, pero no necesariamente todas, de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen la región de iniciación de la transcripción (CaMV) 35S del virus del mosaico de la coliflor y el promotor 1' o 2' derivado del T-ADN de Agrobacterium turne faciens y otras regiones de iniciación de la transcripción de diversos genes de plantas, tal como el promotor ubiquitina-1 del maíz, conocido por aquellas personas expertas. Dominio: Los dominios son huellas digitales o firmas que se pueden utilizar para caracterizar familias de proteínas y/o partes de proteínas. Estas huellas digitales o firmas pueden comprender la secuencia primaria, conservada (1) , estructura secundaria (2) y/o conformación tridimensional (3) . Generalmente, cada dominio ha sido asociado ya sea con una familia de proteínas o configuraciones. Típicamente, estas familias y/o configuraciones han sido correlacionadas con actividades específicas in vi tro y/o in vivo. Un dominio puede ser de cualquier longitud, inclusive la totalidad de la secuencia de una proteína. Las descripciones detalladas de los dominios, familias y configuraciones asociadas y actividades correlacionadas de los polipéptidos de la presente invención se describen a continuación. Usualmente, los polipéptidos con dominio (s) designado (s) pueden exhibir al menos una actividad que es exhibida por cualquier polipéptido que comprende el (los) mismo (s) dominio (s). Endógeno: El término "endógeno", dentro del contexto de la presente invención, se refiere a cualquier secuencia de polinucleótido, polipéptido o proteína la cual es una parte natural de una célula u organismos regenerados a partir de la célula. Exógeno: "Exógeno", referido aquí, es cualquier secuencia de polinucleótido, polipéptido o proteína, ya sea quimérica o no, que es introducida inicial o subsecuentemente en el genoma de una célula hospedante, individual o el organismo regenerado a partir de la célula hospedante por cualquier medio diferente de un cruzamiento sexual. Los ejemplos de medios por los cuales se puede realizar esto se describen posteriormente e incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (de dicotiledóneas - por ejemplo Salomón y colaboradores EMBO J. 3:141 (1984); Herrera-Estrella y colaboradores EMBO J. 2:987 (1983); de monocotiledóneas, los documentos representativos son aquellos de Escudero y colaboradores, Plant J. 10:355 (1996), Ishida y colaboradores, Nature Biotechnology 14:745 (1996), May y colaboradores, Bio /Technology 13:486 (1995)), métodos biolísticos (Armaleo y colaboradores, Current Genetics 17:97 1990)), electroporación, técnicas in planta y similares. Esta planta que contiene el ácido nucleico exógeno es referida en este documento como T0 para la planta transgénica primaria y Ti para la primera generación. El término "exógeno" utilizado en este documento también se propone para incluir la inserción de un elemento encontrado de manera natural en una ubicación no encontrada de manera natural . Proteínas Funcionalmente Comparables : Esta frase describe aquellas proteínas que tienen al menos una característica en común. Estas características incluyen la similitud de secuencias, actividad bioquímica, similitud de patrones de transcripción y actividad fenotípica. Típicamente, las proteínas funcionalmente comparables comparten alguna similitud de secuencias o al menos una actividad bioquímica y dentro de esta definición, se considera que los homólogos, ortólogos y análogos son funcionalmente comparables. Además, las proteínas funcionalmente comparables comparten generalmente al menos una actividad bioquímica y/o fenotípica. Las proteínas funcionalmente comparables darán origen a la misma característica a un grado similar, pero no necesariamente al mismo grado. Típicamente, las proteínas comparables proporcionan las mismas características donde la medición cuantitativa debido a una de las proteínas comparables es al menos 20% de la otra; más típicamente entre 30 y 40%; aún más típicamente, entre 50-60%; aún más típicamente, 70 a 80%; aún más típicamente entre 90 a 100%. Secuencias heterólogas: Las "secuencias heterólogas" son aquellas que no están unidas operativamente o no son contiguas entre sí de manera natural. Por ejemplo, un promotor del maíz se considera heterólogo a una secuencia de la región de codificación de Arabidopsis . También, un promotor de un gen que codifica un factor de crecimiento del maíz se considera heterólogo a una secuencia que codifica el receptor del maíz para el factor de crecimiento. Las secuencias de elementos reguladores, tales como UTRs o secuencias de terminación del extremo 3' que no se originan en la naturaleza a partir del mismo gen del cual se origina la secuencia de codificación, se consideran heterólogos a la secuencia de codificación. Los elementos unidos operativamente en la naturaleza y contiguos entre sí no son heterólogos entre sí. Por otra parte, estos mismos elementos permanecen unidos operativamente pero se vuelven heterólogos si se coloca otra secuencia rellenadora entre los mismos. De esta manera, el promotor y las secuencias de codificación de un gen del maíz que expresa un transportador de aminoácidos no son heterólogos entre sí, pero el promotor y la secuencia de codificación de un gen del maíz unido operativamente de manera novedosa son heterólogos . pH Alto: El "pH alto" se puede definir como un valor de pH alcalino, no óptimo y terminal cuando una planta dada ya no puede hacer uso de ciertos nutrientes esenciales, tal como fosfato, disponibles en el suelo. Por ejemplo, si una planta crece óptimamente en un pH de 4.0-5.0, el pH alto sería cualquier pH mayor que 5. Si el pH óptimo estuviera en el intervalo de 6-6.5, el pH alto sería un pH mayor que pH 6.5. Como un ejemplo, si un cultivo de maíz bajo condiciones de un pH óptimo produjera 134 hectolitros por 0.4 hectáreas (acre) y todas las otras condiciones se mantuvieran constantes, una variedad tolerante al pH alto produciría rendimientos similares a pH 9 o superior. Promotor Inducible: Un "promotor inducible" en el contexto de la presente invención se refiere a un promotor el cual es regulado bajo ciertas condiciones, tal como luz, concentración química, concentración de proteínas, condiciones en un organismo, célula u organelo, etcétera. Un ejemplo típico de un promotor inducible, el cual se puede utilizar con los polinucleótidos de la presente invención, es PARSK1, el promotor del gen de Arabidopsis que codifica una enzima serina-treonina cinasa y promotor que es inducido por la deshidratación, ácido abscísico y cloruro de sodio (Wang y Goodman, Plant J. 8:37 (1995)). Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción por medio de promotores inducibles incluyen las condiciones anaeróbicas, temperatura elevada o presencia de luz. Baja concentración de Nitrógeno: La "baja concentración de nitrógeno" se puede definir como una cantidad de nitrógeno, ya sea en la forma de amonio o nitrato, la cual es insuficiente para sostener el crecimiento y rendimiento normales para una planta dada. La necesidad de fertilizantes de nitrógeno varía considerablemente entre las plantas. Además, el tipo de suelo y las condiciones en el suelo tienen un impacto significativo sobre la capacidad de una planta para tomar el nitrógeno. Los fertilizantes de nitrógeno complementarios se agregan frecuentemente al suelo o se aplican directamente a las plantas para mejorar su crecimiento o apariencia. Aún con aplicaciones normales de fertilizante, la cantidad de nitrógeno disponible para una planta en cualquier momento dado puede ser muy baja para soportar el crecimiento óptimo. Por lo tanto, la baja concentración de nitrógeno debe definirse en términos de la planta específica y el ambiente en el cual está creciendo la planta. Por ejemplo, si bajo un conjunto dado de condiciones con un híbrido de maíz específico el nivel de nitrógeno óptimo fuera 72.574 kilogramos (160 libras) de fertilizante de nitrógeno por 0.4 hectáreas (acre) y bajo estas condiciones el híbrido fuera capaz de lograr un rendimiento de 134 hectolitros por 0.4 hectáreas (acre), un híbrido tolerante a la baja concentración de nitrógeno crecería óptimamente y produciría el mismo rendimiento con al menos 10% menos o al menos 20% menos o al menos 30% menos o al menos 40% menos o al menos 50% menos nitrógeno. Además, el híbrido con baja concentración de nitrógeno crecería mejor después de que mucho del nitrógeno inicial se hubiera agotado y no requeriría múltiples aplicaciones de nitrógeno. pH Bajo: El "pH bajo" se puede definir como aquel valor de pH ácido, no óptimo y terminal cuando una planta dada ya no puede hacer uso de ciertos nutrientes esenciales, tal como potasio, disponibles en el suelo. Si una planta crece óptimamente en un pH de 4.0 - 5.0, el pH bajo es cualquier pH menor que 4. Si el pH óptimo está en el intervalo de 6-8, un pH bajo sería un pH menor que 6. Por ejemplo, si un cultivo de maíz bajo condiciones de un pH óptimo produjera 134 hectolitros por 0.4 hectáreas (acre) y todas las otras condiciones se mantuvieron constantes, una variedad tolerante al pH bajo produciría rendimientos similares a pH 5 o pH 4. Baja Concentración de Fosfato: La "baja concentración de fosfato" se puede definir como una cantidad de fosfato la cual es insuficiente para sostener el crecimiento y rendimiento normales para una planta dada. El nivel de fosfato requerido para el crecimiento óptimo de las plantas difiere entre las especies de plantas y depende de la condición del suelo y otras condiciones ambientales. Para determinar un nivel de fosfato que sea bajo, son necesarios experimentos comparativos. Por ejemplo, si un híbrido de maíz en un campo particular tratado con 18.144 kilogramos (40 libras) de fosfato por 0.4 hectáreas (acre) produciría 134 hectolitros por 0.4 hectáreas (acre) y todas las otras condiciones se mantuvieran constantes, un híbrido tolerante a la baja concentración de fosfato produciría rendimientos similares en 15.876 kilogramos o menos (35 libras o menos) de fosfato por 0.4 hectáreas (acre) o 13.608 kilogramos o menos (30 libras o menos) de fosfato por 0.4 hectáreas (acre) u 11.340 kilogramos o menos (25 libras o menos) de fosfato por 0.4 hectáreas (acre) o 9.072 kilogramos o menos (20 libras o menos) de fosfato por 0.4 hectáreas (acre) . Depósito Maestro: El término "depósito maestro" descrito en estos experimentos es un depósito de semillas de cinco diferentes plantas transgénicas transformadas con el mismo gen exógeno. Expresión Incorrecta: El término "expresión incorrecta" se refiere a un incremento o una disminución en la transcripción de una región de codificación en una secuencia de ARN complementario en comparación con el de tipo silvestre. Este término también incluye la expresión de un gen o una región de codificación durante un período de tiempo diferente en comparación con el de tipo silvestre y/o de una ubicación no natural dentro del genoma de la planta . Porcentaje de identidad de secuencia: El "porcentaje de identidad de secuencia", como se utiliza en este documento, se determina al comparar dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación, donde el fragmento de la secuencia de polinucleótido o aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (por ejemplo, huecos o salientes) en comparación con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico o residuo de aminoácido idéntico ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación se puede conducir por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman Add. APL . Math . 2:482 (1981), por medio del algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch J. Mol . Biol . 48:443 (1970), por la búsqueda de un método de similitud de Pearson y Lipman Proc . Nati . Acad . Sci . (EUA) 85:2444 (988), por medio de implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA y TFASTA en el Paquete de Equipo Lógico Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wl) o por medio de la inspección. Dado que dos secuencias han sido identificadas por comparación, GAP y BESTFIT se emplean preferiblemente para determinar su alineamiento óptimo. Típicamente, se utilizan los valores por omisión de 5.00 para el peso del hueco y 0.30 para la longitud del peso del hueco. El término "identidad sustancial de secuencias" entre las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos se refiere a un polinucleótido o polipéptido que comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencias, preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90% y mucho más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencias en comparación con una secuencia de referencia utilizando los programas. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos en investigación se buscaron contra las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos objetivo que residen en bases de datos públicas o privadas. Estas búsquedas se realizaron utilizando el programa Washington University Basic Local Alignment Search Tool, Versión 1.83 (WU-Blast2). El programa WU-Blast2 está disponible en la Internet de la Universidad de Washington. Un servicio WU-Blast2 para Arabidopsis también se puede encontrar en la Internet. Típicamente, se utilizaron los siguientes parámetros de WU-Blast2 : las opciones de Filtro se ajustaron a "por omisión", el Formato de Salida se ajustó a "alineamientos con huecos", la Matriz de Comparación se ajustó a "BL0SUM62", el Registro de Corte (valor S) se ajustó a "por omisión", el Esperado (umbral E) se ajustó a "por omisión", el Número de mejores alineamientos por mostrar se ajustó a "100" y la opción de "Salida de clasificación" se ajustó para clasificar la salida mediante el "valor p" . Promotor Vegetal: Un "promotor vegetal" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células vegetales y puede impulsar o facilitar la transcripción de una secuencia de nucloeótidos o un fragmento de la misma de la presente invención. Estos promotores no necesitan ser de origen vegetal. Por ejemplo, los promotores derivados de virus vegetales, tal como el promotor CaMV35S o de Agrobacterium tumefaciens tal como los promotores de T-ADN, pueden ser promotores vegetales. Un ejemplo típico de un promotor vegetal de origen vegetal es el promotor de ubiquitina-1 (ubi-1) del maíz conocido para aquellas personas expertas . Promotor Específico: En el contexto de la presente invención, los "promotores específicos" se refieren a promotores que tienen una alta preferencia por ser activos en un tejido o célula específico y/o en un momento específico durante el desarrollo de un organismo. Por "alta preferencia" se propone al menos 3 veces, preferiblemente 5 veces, más preferiblemente al menos 10 veces, aún más preferiblemente al menos 20 veces, 50 veces o 100 veces el incremento en la transcripción en el tejido deseado sobre la transcripción en cualquier otro tejido. Los ejemplos típicos de promotores específicos para temporales y/o para tejidos de origen vegetal que se pueden utilizar con los polinucleótidos de la presente invención son: SH-EP de Vigna mungo y EP-C1 de Phaseolus vulgaris (Yamauchi y colaboradores (1996) Plant Mol Biol . 30(2) :321-9.); RCc2 y RCc3 , promotores que dirigen la transcripción de genes específicos para la raíz en el arroz (Xu y colaboradores, Plant Mol . Biol . 27:237 (1995) y TobRB27, un promotor específico para la raíz del tabaco (Yamamoto y colaboradores, Plant Cell 3:371 (1991)). Condiciones Restrictivas: Las "condiciones restrictivas" como se utiliza en este documento son una función de la longitud de la sonda, composición de la sonda (contenido de G + C) y concentración de sal, concentración de solventes orgánicos y temperatura de hibridización o condiciones de lavado. Las condiciones restrictivas se comparan típicamente por el parámetro Tm, el cual es la temperatura a la cual 50% de las moléculas complementarias en la hibridización son hibridizadas, en términos de un diferencial de temperatura de Tm. Las condiciones restrictivas altas son aquellas que proporcionan una condición de Tm - 5°C a Tm 10 °C. Las condiciones restrictivas intermedias o moderadas son aquellas que proporcionan Tm - 20°C a Tm - 29°C. Las condiciones restrictivas bajas son aquellas que proporcionan una condición de Tm - 40 °C a Tm - 48 °C. La relación de las condiciones de hibridización con respecto a Tm (en °C) es expresada en la ecuación matemática Tm = 81.5-16.6 (log10[Na+] ) + 0.41 (% de G+C) - (600/N) (1) donde N es la longitud de la sonda. Esta ecuación funciona adecuadamente para sondas de 14 a 70 nucleótidos de longitud que son idénticas a la secuencia objetivo. La ecuación posterior para Tm de híbridos de ADN-ADN es útil para sondas en el intervalo de 50 a más de 500 nucleótidos y para condiciones que incluyen un solvente orgánico (formamida) .

Tm = 81.5+16.6 log { [Na+] / (1+0.7 [Na+] ) } +0.41 (% de G+C) -500/L 0.63 (% de formamida) (2) donde L es la longitud de la sonda en el híbrido. (P.

Tijessen, "Hybridization with Nucleic Acid Probes" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, P.C. vand der Vliet, ed., c. 1993 by Elsevier, Amsterdam) . La Tm de la ecuación (2) es afectada por el carácter del híbrido; para los híbridos de ADN-ARN la Tm es 10-15°C más alta que aquella calculada, para los híbridos de ARN-ARN la Tm es 20-25°C más alta. Debido a que la Tm disminuye aproximadamente 1°C para cada 1% de disminución en la homología cuando se utiliza una sonda larga (Bonner y colaboradores, J. Mol . Biol . 81:123(1973)), las condiciones restrictivas se pueden ajustar para favorecer la detección de genes idénticos o miembros de la familia relacionados. La ecuación (2) se deduce asumiendo un equilibrio y por lo tanto, las hibridizaciones de acuerdo con la presente invención se realizan más preferiblemente bajo condiciones de exceso de sonda y durante un tiempo suficiente para lograr el equilibrio. El tiempo requerido para alcanzar el equilibrio puede acortarse por medio de la inclusión de un acelerador de la hibridización tal como sulfato de dextrano u otro polímero de alto volumen en el amortiguador de hibridización. Las condiciones restrictivas se pueden controlar durante la reacción de hibridización o después de que ha ocurrido la hibridización al alterar las condiciones de sal y temperatura de las soluciones de lavado utilizadas. Las fórmulas mostradas anteriormente son igualmente válidas cuando se utilizan para calcular las condiciones restrictivas de una solución de lavado. Las condiciones restrictivas preferidas de las soluciones de lavado se encuentran dentro de los intervalos establecidos anteriormente; las condiciones restrictivas altas son 5-8 °C abajo de la Tm, las condiciones restrictivas intermedias o moderadas son 26-29°C abajo de la Tm y las condiciones restrictivas bajas son 45-48°C abajo de la Tm. Superdepósito : Como se utiliza en el contexto de la presente invención, un "superdepósito" se refiere a una mezcla de semillas de 100 "depósitos maestros" diferentes. De esta manera, el superdepósito contiene una cantidad igual de semillas de 500 eventos diferentes, pero solo representa 100 plantas transgénicas con una diferente secuencia de nucleótidos exógena que es transformada en las mismas, debido a que los depósitos maestros son de 5 eventos diferentes con la misma secuencia de nucleótidos exógena que es transformada en las mismas. T0: Como se utiliza en la presente solicitud, el término "T0" se refiere a la planta completa, explante o tejido calloso inoculado con el medio de transformación. Tx: Como se utiliza en la presente solicitud, el término Tx se refiere ya sea a la progenie de la planta T0, en el caso de la transformación de la planta completa, o la plántula regenerada en el caso de la transformación de explante o tejido calloso. T2 : Como se utiliza en la presente solicitud, el término T2 se refiere a la progenie de la planta Ti. La progenie T2 es el resultado de la autofertilización o polinización cruzada de una planta Ti . T3 : Como se utiliza en la presente solicitud, el término T3 se refiere a la progenie de la segunda generación de la planta que es el resultado directo de un experimento de trasformación. La progenie T3 es el resultado de la autofertilización o polinización cruzada de una planta T2. Concentración de Nitrógeno Cero: El nitrógeno no está presente en ninguna cantidad. Concentración de Fósforo Cero: El fósforo no está presente en ninguna cantidad. 2. CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES DE LOS POLINUCLEÓTIDOS Y POLIPÉPTIDOS DE LA INVENCIÓN Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención son benéficos debido a que cuando son expresados incorrectamente (es decir, cuando son expresados en una ubicación no natural o en una cantidad incrementada o disminuida) producen plantas con una tolerancia al pH modificado y una eficacia en el uso de fosfato. La "eficacia en el uso de fosfato" es un término que incluye varias respuestas a condiciones ambientales que afectan la cantidad de fosfato disponible para la planta. Por ejemplo, bajo condiciones de un pH tanto bajo como alto, el fosfato está enlazado dentro del suelo, dando por resultado una disminución del fosfato disponible para mantener o iniciar los procesos fisiológicos. Como se utiliza en este documento, se propone que la modulación de la eficacia en el uso de fosfato incluya todas estas situaciones así como también otras situaciones ambientales que afectan la capacidad de la planta para utilizar y/o mantener el fosfato de manera efectiva (por ejemplo, tensión osmótica, etcétera) . Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, como se describe posteriormente y como es evidenciado por los resultados de varios experimentos, son útiles para modular la tolerancia al pH o la eficacia en el uso de fosfato. Estas características pueden utilizarse para explotar o maximizar los productos de las plantas para propósitos agrícolas, ornamentales o forestales en diferentes condiciones ambientales de suministro de agua. La modulación de la expresión de los nucleótidos y polipéptidos de la presente invención conduce a plantas transgénicas que serán menos sensibles a variaciones en el pH y que requerirán menos fosfato, dando por resultado mejores rendimientos bajo estos tipos de condiciones adversas. Ambas categorías de plantas transgénicas conducen a costos reducidos para el agricultor y un mejor rendimiento en sus condiciones ambientales respectivas. 3. LOS POLINUCLEÓTIDOS Y POLIPÉPTIDOS DE LA INVENCIÓN Los polinucleótidos de la invención, y las proteínas expresadas mediante los cuales, se exponen en las secuencias presentes en el Listado de Secuencias. Algunas de estas secuencias son proteínas funcionalmente comparables . Las proteínas funcionalmente comparables son aquellas proteínas que tienen al menos una característica en común. Estas características pueden incluir similitud de secuencias, actividad bioquímica y actividad fenotípica. Típicamente, las proteínas funcionalmente comparables comparten alguna similitud de secuencias y comparten generalmente al menos una actividad bioquímica y/o fenotípica. Por ejemplo, las proteínas bioquímicas, funcionalmente comparables son proteínas que actúan sobre el mismo reactivo para proporcionar el mismo producto. Otra clase de proteínas funcionalmente comparables son las proteínas fenotípicas, funcionalmente comparables. Los miembros de esta clase regulan la misma característica física, tal como una tolerancia incrementada a la sequía. Las proteínas pueden considerarse proteínas fenotípicas funcionalmente comparables aún si las proteínas dan origen a la misma característica física, pero a un grado diferente.

Los polipéptidos de la invención también incluyen aquellos que comprenden las secuencias consensúales descritas en las Tablas 1-5, 2-6 y 3-5. Una secuencia consensual define los aminoácidos y/o dominios conservados, importantes dentro de un polipéptido. De esta manera, todas aquellas secuencias que conforman la secuencia consensual son adecuadas para el mismo propósito. Los polipéptidos comprendidos de una secuencia dentro y definida por una de las secuencias consensúales pueden utilizarse para los propósitos de la invención específicamente para hacer plantas transgénicas con una tolerancia mejorada al calor o condiciones de cantidades de agua altas o bajas. 4. USO DE LOS POLINUCLEOTIDOS Y POLIPEPTIDOS PARA HACER PLANTAS TRANSGÉNICAS Para utilizar las secuencias de la presente invención o una combinación de las mismas o partes y/o mutantes y/o fusiones y/o variantes de las mismas, se preparan construcciones de ADN recombinante las cuales comprenden las secuencias de polinucleótidos de la invención insertadas en un vector y las cuales son adecuadas para la transformación de células vegetales. La construcción se puede hacer utilizando técnicas estándar de ADN recombinante (Sambrook y colaboradores, 1989) y se puede introducir a las especies de interés por medio de la transformación mediada por Agrobacterium o por otros medios de transformación referidos posteriormente. La estructura principal del vector puede ser cualquiera de aquellas típicas en el campo tales como plásmidos, virus, cromosomas artificiales, BACs, YACs y PACs y vectores de la clasificación descrita por (a) BAC: Shizuya y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:8794-8797 (1992); (b) YAC: Burke y colaboradores, Science 236:806-812 (1987) ; (c) PAC: Sternberg N. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci EAU. Jan; 87(1) : 103-7 (1990); (d) Bacteria-Yeast Shuttle Vectors: Bradshaw y colaboradores, Nucí Acids Res 23:4850-4856(1995); (e) Lambda Phage Vectors: Replacement Vector, por ejemplo Frischauf y colaboradores, J. Mol Biol 170:827-842 (1983); o Insertion vector por ejemplo, Huynh y colaboradores, In: Glover NM (ed)DNA Cloning: A practical Approach, Vol. 1 Oxford: IRL Press (1985); T-DNA gene fusión vectors: Walden y colaboradores, Mol Cell Biol 1: 175-194 (1990); y (f) Plasmid vectors: Sambrook y colaboradores, infra. Típicamente, la construcción comprende un vector que contiene una secuencia de la presente invención con cualquier secuencia reguladora de la transcripción y/o traducción deseada, tales como promotores, UTRs y secuencias de terminación del extremo 3'. Los vectores también pueden incluir orígenes de replicación, regiones de unión de andamiaje (SARs, por sus siglas en inglés), marcadores, secuencias homologas, intrones, etcétera. El vector también puede comprender un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable en las células vegetales. El marcador codifica típicamente la resistencia a biocidas, particularmente la resistencia a antibióticos, tal como la resistencia a canamicina, bleomicina, higromicina o la resistencia a herbicidas, tal como la resistencia a glifosato, clorosulfuron o fosfinotricina . Se utiliza un promotor vegetal que dirige la transcripción del gen en todos los tejidos de una planta regenerada y puede ser un promotor constitutivo, tal como p326 o CaMV35S. Alternativamente, el promotor vegetal dirige la transcripción de una secuencia de la invención de una manera específica para el tejido (promotor específico para el tejido) o de otra manera está bajo un control ambiental más preciso (promotor inducible) . Varios promotores vegetales, inclusive constitutivos, específicos para el tejido e inducibles, son conocidos para aquellas personas expertas en el campo y se pueden utilizar en la presente invención. Típicamente, los promotores preferidos para el uso en la presente invención son aquellos que son inducidos por el calor o condiciones de baja cantidad de agua, tal como el promotor RD29a (Kasuga y colaboradores, Plant Cell Physiol . 45:346 (2004) y Yamaguchi -Shinozaki y Shinozaki, Mol Gen Genet . 236:331 (1993)) y otros promotores que contienen DRE (elementos sensibles a la deshidratación) (Liu y colaboradores, Cell 10:1391 (1998)). Otra modalidad preferida de la presente invención es el uso de promotores específicos para la raíz tales como aquellos presentes en los genes AtXTH17, AtXTHld, AtXTH19 y AtXTH20 de Arabidopsis (Vissenberg y colaboradores, (2005) Plant Cell Physiol 46:192) o promotores específicos para las células oclusivas tales como TGG1 o KST1 (Husebye y colaboradores, (2002) Plant Physiol 128:1180; Plesch y colaboradores (2001) Plant J 28:455). Alternativamente, la expresión incorrecta se puede realizar utilizando un sistema de dos componentes, con lo cual el primer componente comprende una planta transgénica que comprende un activador transcripcional unido de manera operativa a un promotor y el segundo componente comprende una planta transgénica que comprende una secuencia de la invención unida de manera operativa a la secuencia/región de unión al objetivo del activador transcripcional . Las dos plantas transgénicas son cruzadas y la secuencia de la invención es expresada en su progenie. En otra alternativa, la expresión incorrecta puede realizarse al transformar las secuencias del sistema de dos componentes en una línea de plantas transgénicas. Cualquier promotor que funcione en las plantas se puede utilizar en el primer componente, tales como aquellos descritos anteriormente. Los polipéptidos activadores de la transcripción adecuados incluyen, pero no están limitados a, aquellos que codifican HAP1 y GAL4. La secuencia de enlace reconocida y fijada como objetivo por la proteína activadora de la transcripción seleccionada (por ejemplo un elemento UAS) se utiliza en el segundo componente.

Transformación Las secuencias de nucleótidos de la invención son introducidas en el genoma o la célula de la planta hospedante apropiada por medio de una variedad de técnicas. Estas técnicas para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas y están descritas en la bibliografía técnica y científica. Véase, por ejemplo Weising y colaboradores, Ann . Rev. Genet . 22_:421 (1988); y Christun, Euphytica, v. 85, n. 1-3:13-27, (1995) . Los procesos para la transformación y regeneración de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas son conocidos para aquellas personas expertas en el campo. Para la introducción de ADN en una célula hospedante vegetal está disponible una variedad de técnicas. Estas técnicas incluyen la transformación de células vegetales por medio de la inyección (por ejemplo Newell, 2000), microinyección (por ejemplo Griesbach (1987) Plant Sci . 50 69-77) , electroporación de ADN (por ejemplo Fromm y colaboradores (1985) Proc . Nati Acad . Sci . EUA 82:5824 y Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48), PEG (por ejemplo Paszkowski y colaboradores (1984) EMBO J". 3_:2717), uso de biolísticos (por ejemplo Klein y colaboradores (1987) Nature 327:773), fusión de células o protoplastos (Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi -Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds., Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim- ?ueva York-Basel -Cambridge) , por fía de T-AD? utilizando Agrobacterium tumefaciens (por ejemplo Fraley y colaboradores (Crit. Rev. Plant. Sci. 4, 1-46 y Fromm y colaboradores, Biotechnology 8 (1990) , 833-844) o Agrobacterium rhizogenes (por ejemplo Cho y colaboradores (2000) Planta 210:195-204) u otros hospedantes bacterianos (por ejemplo Brootghaerts y colaboradores (2005) ?ature 433:629-633), así como también posibilidades adicionales. Además, una variedad de métodos de transformación no estable que es bien conocida para aquellas personas expertas en el campo puede ser deseable para la presente invención. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, la expresión transitoria (por ejemplo, Lincoln y colaboradores, (1998) Plant Mol . Biol . Rep . 16:1-4) y la transfección viral (por ejemplo Lacomme y colaboradores, (2001) In "Genetically Engineered Viruses" (C.J.A. Ring y E.D. Blair, Eds) . Páginas 59-99, BIOS Scientific Publishers, Ltd. Oxford, UK) . Las semillas se obtienen a partir de plantas transformadas y se utilizan para someter a prueba la estabilidad y la herencia. Generalmente, se cultivan dos o más generaciones para asegurar que la característica fenotípica se mantenga y trasmita de manera estable. Una persona experta reconocerá que después de que el cásete de expresión es incorporado de manera estable en plantas transgénicas y se confirma que es operable, puede introducirse en otras plantas por medio del cruzamiento sexual. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de técnicas de cultivo estándar, dependiendo de las especies a ser cruzadas . Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar para conferir la característica de tolerancia incrementada al calor y/o condiciones de baja cantidad de agua, sin la reducción de fertilidad, esencialmente en cualquier planta. Las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención codifican proteínas apropiadas de cualquier organismo, en particular de plantas, hongos, bacterias o animales . El proceso de acuerdo con la invención se puede aplicar a cualquier planta, preferiblemente plantas superiores, que pertenecen a las clases de Angiospermae y Gymnospermae . Las plantas de las subclases de Dicotylodenae y Monocotyledonea son particularmente adecuadas. Las plantas dicotiledóneas pertenecen a los órdenes de Magniolales, iniciales, Laurales, Piperales Aristochiales , Nymphaeales, Ranunculales, Papeverales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Lei tneriales, Myricales, Fágales, Casuarinales, Caryophyllales , Bátales, Polygonales, Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Málvales, Urticales, Lecythidales, Viólales, Salicales, Capparales, Ericales, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales , Haloragales, My r tales , Cornales, Proteales, Santales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Rhamnales, Sapindales, Jug 1 ándales , Geraniales , Polygalales, Umbellales, Gentianales , Polemoniales, Lamíales, Plantaginales, Scrophulariales, Campanulales, Rubiales, Dipsacales y Asterales . Las plantas monocotiledóneas pertenecen a los órdenes de Alismatales, Hydrochari tales , Na j adales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales , Restionales, Poales, Juncales, Cyperales, Typhales, Bromeliales, Zingiberales, Arecales, Cyclanthales, Pandanales, Árales, Lilliales y Orchidales . Las plantas que pertenecen a la clase de Gymnospermae son Piñales, Ginkgoales, Cycadales y Gnetales . El método de la invención se utiliza preferiblemente con plantas que son de interés para la agricultura, horticultura, biomasa para la bioconversión y/o silvicultura. Los ejemplos son tabaco, colza de semilla oleaginosa, betabel, papa, jitomate, pepino, pimiento, fríjol, chícharo, frutas cítricas, manzana, pera, bayas, ciruela, melón, berenjena, algodón, semilla de soya, girasol, rosa, nochebuena, petunia, guayule, col, espinaca, alfalfa, alcachofa, maíz, trigo, centeno, cebada, céspedes tales como césped de varilla o hierba de césped, mijo, cáñamo, plátano, chopo, árboles de eucalipto, coniferas.

Homólogos Incluidos por la Invención Los agentes de la invención incluyen proteínas que comprenden al menos una región de aproximadamente 10 aminoácidos contiguos que comprende preferiblemente al menos una región de aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, aún más preferiblemente que comprende al menos una región de aproximadamente 25, 35, 50, 75 o 100 aminoácidos contiguos de una proteína de la presente invención. En otra modalidad preferida, las proteínas de la presente invención incluyen una región de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, más preferiblemente una región de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 50 aminoácidos contiguos y aún más preferiblemente una región de entre aproximadamente 40 y aproximadamente 80 aminoácidos contiguos . Debido a la degeneración del código genético, se pueden utilizar diferentes codones de nucleótidos para codificar un aminoácido particular. Una célula hospedante exhibe frecuentemente un patrón preferido del uso de codones. Las secuencias de ácido nucleico son construidas preferiblemente para utilizar el patrón de uso de codones de la célula hospedante particular. Esto mejora generalmente la expresión de la secuencia de ácido nucleico en una célula hospedante transformada. Cualquiera de las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos descritas anteriormente puede modificarse para reflejar el uso de codones preferido de una célula u organismo hospedante en el cual están contenidas. La modificación de una secuencia de ácido nucleico para el uso óptimo de condones en plantas es descrita en la Patente Norteamericana No. 5,689,052. Las variaciones adicionales en las secuencias de ácido nucleico pueden codificar proteínas que tienen características equivalentes o superiores en comparación con las proteínas a partir de las cuales son diseñadas.

Se entiende que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína o péptido (y la secuencia de ácido nucleico que la codifica) sin un cambio o pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. Los cambios de aminoácidos pueden lograrse al cambiar los codones de la secuencia de ácido nucleico. Es bien sabido en el campo que uno o más aminoácidos en una secuencia nativa pueden ser sustituidos por otros aminoácidos, la carga y polaridad de los cuales son similares a aquellas del aminoácido nativo, es decir una sustitución conservadora de aminoácido, dando por resultado un cambio taciturno. Los substitutos conservadores para un aminoácido dentro de la secuencia de polipéptido nativa se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido (véase posteriormente) . Los aminoácidos se pueden dividir en los siguientes cuatro grupos: (1) aminoácidos ácidos (con carga negativa) tales como ácido aspártico y ácido glutámico; (2) aminoácidos básicos (con carga positiva) , tales como arginina, histidina y lisina; (3) aminoácidos polares neutros, tales como glicina, serina, treonina, cisteína, cistina, tirosina, asparagina y glutamina; y (4) aminoácidos no polares neutros (hidrófobos) tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triftófano y metionina. En un aspecto adicional de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden comprender secuencias que difieren de aquellas que codifican una proteína o fragmento de la misma seleccionada del grupo que consiste de aquellas secuencias presentes en el Listado de Secuencias debido al hecho que la secuencia de ácido nucleico diferente codifica una proteína que tiene uno o más cambios conservadores de aminoácidos . En otro aspecto, los equivalentes biológicamente funcionales de las proteínas o fragmentos de las mismas de la presente invención pueden tener aproximadamente 10 o menos cambios conservadores de aminoácidos, de manera más preferible aproximadamente 7 o menos cambios conservadores de aminoácidos y de manera mucho más preferible aproximadamente 5 o menos cambios conservadores de aminoácidos. En una modalidad preferida, la proteína tiene entre aproximadamente 5 y aproximadamente 500 cambios conservadores, más preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 300 cambios conservadores, aún más preferiblemente entre aproximadamente 25 y aproximadamente 150 cambios conservadores y mucho más preferiblemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 25 cambios conservadores o entre 1 y aproximadamente 5 cambios conservadores.

. EXPERIMENTOS QUE CONFIRMAN LA UTILIDAD DE LOS POLINUCLEÓTIDOS Y POLIPÉPTIDOS DE LA INVENCIÓN .1 Procedimientos Las secuencias de nucleótidos de la invención se identificaron por medio del uso de una variedad de muéstreos para condiciones de pH y/o baja concentración de fosfato y/o baja concentración de nitrógeno. Aquellas personas expertas en el campo reconocen que estos muéstreos son predictivos de las secuencias de nucleótidos que proporcionan plantas con una tolerancia mejorada a condiciones de pH y/o baja concentración de fosfato y/o baja concentración de nitrógeno debido a que emulan las diferentes condiciones ambientales que pueden resultar de condiciones de un pH incrementado y/o baja concentración de fosfato y/o baja concentración de nitrógeno. Estos muéstreos se encuentran generalmente dentro de dos categorías (1) muéstreos en suelo y (2) muéstreos in vi tro . Los muéstreos en suelo tienen la ventaja de someter a ensayo la respuesta de la planta completa a condiciones particulares, tales como pH alto o baja concentración de fósforo. Por otra parte, los muéstreos in vi tro tienen la ventaja de depender de medios definidos y de esta manera permitir una manipulación más definida de las condiciones de crecimiento. Cada uno de los muéstreos utilizados se describe con mayor detalle posteriormente. En general, los muéstreos utilizados para identificar los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se condujeron utilizando superdepósitos de plantas transformadas T2 de Arabidopsis . Las plantas Ti se transformaron con un plásmido Ti que contenía una SEQ ID NO particular en la orientación con sentido con relación a un promotor constitutivo y que albergaba el gen marcador seleccionable por la planta fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) , el cual confiere resistencia a herbicidas en las plantas transformadas. Para los muéstreos in vi tro, las semillas de múltiples superdepósitos (1,200 semillas de T2 de cada superdepósito) se sometieron a prueba usualmente. Las semillas T3 se recolectaron de las plantas resistentes y se sometieron a prueba nuevamente en uno o más muéstreos in vi tro . Los resultados de los muéstreos conducidos para cada SEQ ID NO se pueden encontrar en los Ejemplos posteriores. 1. pH Alto Los muéstreos para la resistencia a un pH alto identifican plántulas más capaces de prosperar bajo deficiencias nutricionales (por ejemplo, Fosfato, Manganeso, Hierro, Boro) impuestas por condiciones alcalinas . Las semillas son esterilizadas en blanqueador casero al 50% durante 5 minutos y luego se lavan tres veces con agua desionizada, doblemente destilada. Las semillas esterilizadas se almacenan en la oscuridad a 4°C durante un mínimo de 3 días antes del uso. Los medios de un pH alto se preparan al mezclar 0.5 g/l de hidrato de MES con MS IX + sacarosa al 0.5%. Antes del tratamiento en autoclave, el pH se ajusta con KNH 10 N a los siguientes valores: pH 5.7 (control), pH 7.03, pH 8.02, pH 9.01 y pH 10.18. El pH de los medios se somete a prueba nuevamente puesto que los valores de pH caen después del tratamiento en autoclave como sigue: pH 5.7 — > pH 5.66; pH 7.03 ? pH 6.50; pH 8.02 ? pH 7.50; pH 9.01 ? pH 8.91; pH 10.18 ? pH 9.91. Hablando en general, el pH 9.01 (pH 8.91) permite la germinación pero no el crecimiento más allá de 2 a 5 mm y sin crecimiento de raíz. La germinación no ocurre a un pH más alto (por ejemplo pH 10.81) . Aproximadamente 1,200 semillas son separadas equitativamente por placa de MS-sacarosa antes de la incubación en posición vertical a 22 °C durante 14 días. Bajo estas condiciones, las placas son expuestas a 12,030 LUX desde la parte superior y 3,190 LUX desde la parte inferior. Las plántulas son evaluadas para el crecimiento de la raíz y brotes después de 7 y 14 días. Las plántulas tolerantes putativas son transferidas a MS pH 5.7 para la recuperación durante 14 días antes del transplante al suelo. La pulverización de FinaleM se realiza después de que las plantas son transferidas al suelo para retirar los elementos no transgénicos de la población. El ADN es aislado de cada planta T2 y se utiliza en reacciones de PCR utilizando las siguientes condiciones de los ciclos: 95°C durante 5 minutos, 35 ciclos de (94°C durante 30 segundos, luego 59 °C durante 30 segundos, luego 72°C durante 1 minuto), 72°C durante 8 minutos y mantener a 4°C. Las alícuotas del producto de reacción son analizadas en un gel de agarosa al 1.0% teñido con bromuro de etidio. Los productos de ADN son secuenciados para determinar qué secuencias de inserto estaban en cada candidato de superdepósito seleccionado en el muestreo. Las semillas T3 de aquellas plantas que contenían los productos de la PCR secuenciados se recolectan y se someten a prueba nuevamente en medios de un pH alto. Además, las plantas son sometidas a prueba en medios de MS que carecen de fosfato y que tienen un pH de 5.7. 2. Concentración de Fosfato Cero Los muéstreos para la tolerancia a una concentración de fosfato cero identifican las plántulas más capaces de prosperar bajo una deficiencia nutricional de fosfato. Las semillas son esterilizadas en blanqueador casero al 50% durante 5 minutos y luego son lavadas tres veces con agua desionizada, doblemente destilada. Las semillas esterilizadas se almacenan en la oscuridad a 4°C durante un mínimo de 3 días antes del uso. Los medios con una concentración de fosfato cero se preparan utilizando medios de MS comercialmente disponibles que carecen de fosfato, pH 5.7. Aproximadamente 1,200 semillas son separadas equitativamente por placa de MS-P antes de la incubación en posición vertical a 22 °C durante 14 días. Bajo estas condiciones, las placas son expuestas a 12,030 LUX desde la parte superior y 3,190 LUX desde la parte inferior. Las plántulas son evaluadas para el crecimiento de la raíz y los brotes después de 7 y 14 días. Las plántulas tolerantes putativas son transferidas a MS pH 5.7 para la recuperación durante 14 días antes del transplante al suelo. La pulverización de FinaleMR se realiza después de que las plantas son transferidas al suelo para retirar los elementos no transgénicos de la población. El ADN es aislado de cada planta T2 y se utiliza en reacciones de PCR utilizando las siguientes condiciones de los ciclos: 95°C durante 5 minutos, 35 ciclos de (94°C durante 30 segundos, luego 59 °C durante 30 segundos, luego 72°C durante 1 minuto), 72°C durante 8 minutos y mantener a 4°C. Las alícuotas del producto de reacción son analizadas en un gel de agarosa al 1.0% teñido con bromuro de etidio. Los productos de ADN son secuenciados para determinar qué secuencias de inserto estaban en cada candidato de superdepósito seleccionado en el muestreo. Las semillas T3 de aquellas plantas que contenían los productos de la PCR secuenciados se recolectan y se someten a prueba nuevamente . 3. Concentración de Fosfato Cero, Concentración de Nitrógeno Cero Los muéstreos para la tolerancia a una concentración de fosfato cero, concentración de nitrógeno cero identifican las plántulas más capaces de prosperar bajo una deficiencia nutricional de fosfato. Las semillas son esterilizadas en blanqueador casero al 50% durante 5 minutos y luego son lavadas tres con agua desionizada, doblemente destilada. Las semillas esterilizadas se almacenan en la oscuridad a 4°C durante un mínimo de 3 días antes del uso. Los medios con una concentración de fosfato cero, concentración de nitrógeno cero se preparan utilizando medios de MS comercialmente disponibles que carecen de fosfato, pH 5.7.

Aproximadamente 1,200 semillas son separadas equitativamente por placa de MS-P-N antes de la incubación en posición vertical a 22 °C durante 14 días. Bajo esas condiciones, las placas son expuestas a 12,030 LUX desde la parte superior y 3,190 LUX desde la parte inferior. El crecimiento y verdosidad total se someten a ensayo 10 días después del tratamiento. La recuperación de las plántulas es evaluada al agregar una capa delgada (8.3 ml) de medios completos de MS+P+N, pH 5.7, suavizados por la adición de agar al 0.02%. Los medios se agregan al borde de la placa y se hacen girar lentamente hasta que una película delgada de medios de +PN está presente sobre la parte superior de los medios de -PN solidificados. Las plántulas tolerantes, putativas son más verdes y tienen un crecimiento incrementado en comparación con los controles. La pulverización de FinaleMR se realiza después de que las plantas son transferidas al suelo para retirar los elementos no transgénicos de la población. El ADN es aislado de cada planta T2 y utilizado en reacciones de PCR utilizando las siguientes condiciones de los ciclos: 95°C durante 5 minutos, 35 ciclos de (94°C durante 30 segundos, luego 59 °C durante 30 segundos, luego 72 °C durante 1 minuto) , 72 °C durante 8 minutos y mantener a 4°C. Las alícuotas del producto de reacción son analizadas en un gel de agarosa al 1.0% teñido con bromuro de etidio.

Los productos de ADN son secuenciados para determinar qué secuencias de inserto estaban en cada candidato de superdepósito seleccionado en el muestreo. Las semillas T3 de aquellas plantas que contienen los productos de la PCR secuenciados se recolectan y se someten a prueba nuevamente. .2 RESULTADOS A continuación se exponen los resultados de los experimentos anteriores en donde cada ejemplo individual se refiere a todos los resultados experimentales para un polinucleótido/polipéptido particular de la invención.

Ejemplo 1 - ADNc Ceres 12335629 El clon 40781, ADNc Ceres 12335629 codifica una proteína de longitud completa que tiene homología con una ferredoxina tiorredoxina reductasa de Arabidopsis thaliana . La expresión ectópica del ADNc Ceres 12335629 bajo control del promotor CaMV35S induce los siguientes fenotipos: o Mejor crecimiento y recuperación después de la exposición a condiciones de un pH alto y o El crecimiento continuo bajo un pH alto indujo deficiencias de fosfato y hierro.

Generación y evaluación fenotípica de líneas Tx que contenían 35S::ADNc 12335629. Las plantas Wassilewskija (WS) de Arabidopsis de tipo silvestre se transformaron con un plásmido Ti que contenía el ADNc 12335629 en la orientación con sentido con relación al promotor constitutivo 35S. El vector del plásmido Ti utilizado para esta construcción, CRS338, contiene PAT y confiere resistencia a herbicidas en las plantas transformadas. Se seleccionaron diez eventos transformados independientemente y se evaluaron por su fenotipo cualitativo en la generación Ti. No se observaron fenotipos positivos o negativos en las plantas T .

Muéstreos de superdepósitos en medios con un pH alto para la tolerancia al pH. Las semillas de los superdepósitos de las líneas de sobreexpresión de 35S se evaluaron por la verdosidad y tamaño en medios de un pH alto como se describió anteriormente. Una vez que el ADNc 12335629 se identificó en las plantas tolerantes, los cinco eventos T2 individuales que contenían este ADNc (ME03527) se sometieron al muestreo en medios de un pH alto en esencia como se describió anteriormente, pero donde el pH de los medios es 8.5, para identificar los eventos con el fenotipo tolerante.

RESULTADOS : Análisis cualitativo del superdepósito que contenía las plantas de 35S::clon 40781 en un pH alto El muestreo dio por resultado una disminución en la germinación y/o crecimiento para las plantas tanto de tipo silvestre como los superdepósitos en comparación con las semillas en medios de control. Solo una línea sobrevivió al transplante al suelo. El candidato fue más verde que los controles pero el tamaño total fue comparable a aquel de las plantas de tipo silvestre. No hubo retardo en el tiempo de florecimiento o disminución en la producción de semillas en comparación con las plantas de tipo silvestre no tratadas pero un tiempo de florecimiento más rápido y una mayor producción de semillas fueron aparentes en comparación con una planta de tipo silvestre tratada con pH, recuperada (datos no mostrados) . Estos resultados son consistentes con aquellos de la generación Ti la cual exhibió tiempo de florecimiento y fertilidad normales .

Análisis cualitativo y cuantitativo de T3 - ADNc 12335629 en un pH alto Las plantas se trataron con FinaleMR para eliminar cualquier positivo falso o cualquier línea donde fue suprimido el marcador FinaleMR. Todos los candidatos resistentes a FinaleMR florecieron y produjeron semillas. La segregación de FinaleMR se evaluó para identificar los eventos que contenían una segregación de inserto individual en una relación 3:1 (R:S) calculada por medio de la prueba chi cuadrado . Todos los eventos segregaron un inserto funcional, individual (Tabla 1-1). Las plantas transgénicas fueron más verdes y ligeramente más grandes que las plantas de control bajo tensión de un pH alto.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la progenie de ADNc 12335629 en medios que carecen de fosfato Antes de someter a prueba los eventos T2 independientes, las plantas que contenían el ADNc 12335629 se sometieron a ensayo nuevamente por la tolerancia a la inanición de fosfato por medio del crecimiento en medios que no contenían fosfato como se describió anteriormente. Después de siete días se observa una tolerancia solo ligeramente mayor en comparación con los controles, pero las plántulas con el ADNc 12335629 son un poco más grandes y ligeramente más verdes que aquellas del control. Debido a que el ligero incremento en el tamaño fue particularmente difícil de evaluar, cualquier planta más baja o igual al promedio de tipo silvestre de 0.42 cm se valoró que era sensible y cualquier planta más alta se valoró como tolerante. Veinticuatro plántulas resistentes y doce plántulas sensibles a la inanición de fosfato se compararon con las frecuencias de FinaleMR y se encontró que tenían una probabilidad de la prueba Chi-cuadrado de 0.49, sugiriendo un ajuste positivo (Tabla 1-2).

Análisis cualitativo y cuantitativo de los eventos T2 individuales del ADNc 12335629 en un ensayo de placas con un pH alto Cinco eventos individuales del ADNc 12335629 (ME03527) se analizaron por un fenotipo positivo bajo condiciones de un pH alto. Los cinco eventos T2 tuvieron frecuencias de germinación de tipo silvestre en placas de MS a pH 5.7 (datos no mostrados) . Todas las líneas T2 y las líneas T3 recuperadas mostraron evidencia de un inserto individual como se determinó por medio del análisis Chi-cuadrado (Tabla 1-3). Las semillas de cada uno de los cinco eventos T2 independientes se colocaron en placas a pH 8.5 y se permitió que germinaran y crecieran durante 14 días. Cuatro de los cinco eventos T2 de ME03527 (-02, -03, -04 y -05) tuvieron un fenotipo positivo de tolerancia a un pH alto que fue definido por el crecimiento y la verdosidad. El fenotipo de ME03527-01 fue muy débil para valorarse como positivo en comparación con los controles (Tabla 1-4) . La resistencia del fenotipo varió entre los cuatro eventos independientes positivos, pero todos mostraron un crecimiento mejor que los controles. Las relaciones de segregación, determinadas por medio de una prueba Chi-cuadrado, muestran que la segregación del transgen es la misma que aquella observada para FinaleMR (Tabla 1-4) . ME03527-02, -03, -04 y -05 tuvieron los fenotipos de tolerancia al pH más fuertes y más consistentes .

La Tabla 1-5 proporciona los resultados del análisis de secuencias consensúales basado en el ADNc Ceres 13487605.

Tabla 1-5 /tmp/Lead-clone40781 oln CeresClone 295783 48 g?|50898984 42 CeresClope 470939 40 gil 14275859 44 g?|505189 44 Lead clone40781 42 CeresClone 1127455 39 Consensual M A-TTS- ASP — -SPR RC VVRAK -EPS-DKSVE 50 CeresClone 295783 RRS F C]A|D" KIGIVTAVVI KG LADHRDTLGA ^LCPCRHYDD 98 g?|50898984 RRS|N]1 FFC|S)E KgJVTAVVl KG LADHKDgJLGA =LCPCRHYDD 92 CeresClone 470939 RKSGT YFCVD KGVTS VI KG LADHKDTLGA =>LCPCRHYDD 90 g?|14275859 RRStjrYFCMD KGVTSVVI KG LAEHKDTLGA 3LCPCRHYDD 94 g?|505189 RKSGTYFCVD KGVTSVVI KG LAEHKDSLGA PLCPCRYYDD 94 Lead clone40781 RRSGTYFCVD KGVTSVVI KG LAEHKDSfPlGA PLCPCRHYDD 92 CeresClone 1127455 RRSGTYFCVD KGVp<]SVVI KG AEHKDS^ A PLCPCRHYDD 89 Consensual I MRKFSEQYA RRSGTYFCVD KGVTSVVI KG LADHKD-LGA PLCPCRHYDD 100 Ul CeresClone 295783 KAAEVÍV3G FW MCPCV PMRER KECHCMLFLT PDND FAGKDQ ~S[FJEETKE 148 g?]50898984 KAAEVµv G FW NICPCVPMRER KECHCMLFLT PDNDFAG0DQ TLEEI KD|A 142 CeresClone 470939 <AA EV?QG FW CPCVPMRER KECHCMLFLT PDND FAG EQ TLDEI KES] 140 g?|14275859 AAE1 QQGFW NCPCVPMRER KECHCMLFLT PDND FAGEEQ SMEEI KEJJ 144 g?]505189 KAAE^ OGFW NCPCVPMRER KECHCMLFLT PENDFAGKDQ [GlLDEl RE|V 144 Lead clone40781 KAAEV QGFW NCPCVPMRER KECHCMLFLT PDNDFAGKDQ TSlDEl KET1 142 CeresClone 1127455 KAAE QGFW NCPCVPMRER KECHCMLFLT PDNDFAGKDQ TSDEI KET 139 Consensual KAAEV-QGFW NCPCVPMRER KECHCMLFLT PDNDFAGKDQ TI TLDEI KE- 150 CeresClone 295783 g?|50898984 CeresClone 470939 g?|l4275859 g?|505189 Lead clone40781 CeresClone 1127455 Consensual TANM 154 24/05/05 ?lur=3.500000 —colusión —box — noboxcol colbyconsensus Ejemplo 2 - ADNc Ceres 12330185 El clon 34035, ADNc Ceres 12330185, codifica una proteína de 128 aminoácidos de función desconocida (DUF423) de Arabidopsis thaliana . La expresión ectópica del ADNc Ceres 12330185 bajo control del promotor 32449 induce los siguientes fenotipos : o Tamaño incrementado y verdosidad en deficiencias de nutrientes incurridas por condiciones de un pH alto, o Mejor recuperación del suelo después de la exposición a la tensión de un pH alto, y o Mejor recuperación después de la exposición a condiciones carentes tanto de fosfato como de nitrógeno.

Generación y evaluación fenotípica de las líneas Ti gue contenían p32449::ADNc 12330185 Las plantas assilewskija (WS) de Arabidopsis de tipo silvestre se transformaron con un plásmido Ti que contenía el ADNc 12330185 en la orientación con sentido con relación al promotor constitutivo 32449. El promotor 32449 tiene una amplia expresión a través de Arabidopsis, aunque a un nivel de expresión mucho más bajo que CaMV35S. El vector del plásmido Ti utilizado para esta construcción, CRS311, contiene PAT y confiere resistencia a herbicidas en plantas transformadas. Nueve eventos transformados independientemente se seleccionaron y se evaluaron por su fenotipo cualitativo en la generación de Ti. No se observaron fenotipos positivos o negativos en las plantas Tx.

Muéstreos de superdepósitos en medios con un pH alto para la tolerancia al pH Las semillas de superdepósitos de líneas de sobreexpresión de 32449 se evaluaron por la verdosidad y tamaño en medios con un pH alto como se describió anteriormente. Una vez que el ADNc 12330185 se identificó en plantas tolerantes, nueve eventos T2 individuales que contenían este ADNc (ME00077) se sometieron al muestreo en medios con un pH alto en esencia como se describió anteriormente, pero donde el pH de los medios es 8.5, para identificar los eventos con el fenotipo tolerante.

RESULTADOS : Análisis cualitativo del superdepósito que contenía 34449: :ADNc 12330185 en un pH alto La línea del ADNc 12330185 exhibió un tiempo de florecimiento retardado de ~ 8 días y una producción de semillas disminuida en comparación con las plantas de tipo silvestre sin tratamiento. Sin embargo, el ADNc 12330185 exhibió un tiempo de florecimiento más rápido (~15 días) y una producción de semillas mayor en comparación con la planta de tipo silvestre que creció a un pH alto.

Análisis cualitativo y cuantitativo de las semillas T3 que contenían 32449 ::ADNc 12330185 en un pH alto La línea del ADNc 12330185 se sometió a prueba por la resistencia a FinaleMR y se sometió a ensayo nuevamente por la tolerancia continua al pH. La relación de segregación de las semillas T3 del ADNc 12330185 es sugerente de un inserto individual, como es calculado por una prueba Chi-cuadrado (Tabla 2-1) . La línea del ADNc 12330185 se sometió a prueba nuevamente en medios a pH 9.0 como se describió y se encontró que era tolerante al pH alto en comparación con los controles.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la inanición de fosfato y nitrato de plantas T3 (ADNc 12330185) . Para descubrir si el fenotipo tolerante al pH está relacionado con una mejor supervivencia bajo la inanición de nutrientes, las semillas T3 se sometieron a ensayo en medios de MS que carecían tanto de fosfato (-P) como de nitrato (-N) (pH 5.7) como se describió anteriormente. La línea del ADNc 12330185 fue más verde y de un tamaño igual en comparación con los controles de tipo silvestre. Diez días después de la adición de una película de medio +NP, las plántulas del ADNc 12330185 se recuperaron más rápidamente que las plántulas de tipo silvestre. Veinticinco de las 36 plántulas de SP9pHl tuvieron un mayor crecimiento en comparación con las plántulas de tipo silvestre. Esta frecuencia de crecimiento incrementada es sugerente de un inserto individual como es determinado por el análisis Chi-cuadrado (Tabla 2-2) .

Análisis cualitativo y cuantitativo de eventos T2 individuales del ADNc 12330185 en un pH alto. Las semillas de las líneas T2 que representaban nueve eventos individuales y que contenían el ADNc 12330185 (ME0077-01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09) se colocaron en placas en medios de pH, pH 8.5 como se describió anteriormente. Las placas se evaluaron en 7 y 12 días después de la colocación en placas (Tabla 2-3) . Los nueve eventos T2 tuvieron frecuencias de germinación de tipo silvestre excepto por ME00077-04 (Tabla 2-4) . Sin embargo, este problema de germinación no se observó cuando las plántulas se colocaron en placas a un pH alto. Seis de los nueve eventos mostraron tolerancia a un pH alto como se define por el crecimiento y la verdosidad. Los fenotipos de tolerancia más fuertes estuvieron en ME00077-03 y ME00077-05. ME00077-03 y ME00077-05 tuvieron ambos insertos individuales como se determina por medio del análisis Chi-cuadrado (Tabla 2-3). El fenotipo tolerante al pH fue más fuerte en la línea T3 del ADNc 12330185 recuperada del muestreo de superdepósito. No se realizó una cartografía genética de este inserto de la línea para determinar que evento representaba. Este fenotipo de la línea fue muy fuerte de manera que permitió que cuadrantes de tipo silvestre adyacentes dentro de la misma placa crecieran normalmente después de 14 días. Esto es más probable debido a la acidificación de los medios circundantes por la línea tolerante al pH. Las plantas T2 de ME00077-03, -05 también mostraron una recuperación incrementada durante los ensayos de inanición de fosfato y nitrógeno (datos no mostrados) . Sin embargo, la línea T3 del ADNc 12330185 recuperada del fenotipo del superdepósito fue más fuerte que aquella observada para las líneas ME00077-03 y -05 bajo recuperación de la inanición de -NP (como se observa anteriormente) .

La Tabla 2-6 proporciona los resultados del análisis de secuencias consensúales basados en el ADNc Ceres 12330185.

- C?resClone 566573 33 CeresClone 588155 33 CeresClone 289088 37 g?|50918749 42 g?|7963694 30 CeresClone 678257 37 g?|7963702 37 CeresClone 972918 50 Lead clone34035 50 CeresClone 872428 33 Consensual -MDP RLWHKVAAVS GVAALGLGTY GAH-F-PQNP 50 CeresClone 566573 -AFSGTCYTV 83 CeresClone 588155 .AFSGTCYTV 83 CeresClone 289088 /LFSGTCYTV 87 g?]50918749 /LFSGTCYTV 92 g?|7963694 /LFSGTCYTV 80 CeresClone 678257 /LFSGTCYTV 87 g?j7963702 /LFSGTCYTV 87 CeresClone 972918 /AFSGTbr— 96 O Lead clone34035 AFSGTCY 100 o CeresClone 872428 AFSGTCY 83 Consensual AYKEVWQTAS LYHLVHTAAL — APMTK-PN I FGGLLTAGI V-FSGTCYTV 100 Consensual AYLEDRKFST -AP-GGFAFI AAWASLLF 128 24/05/05 plur=5000000 —colusión —box — noboxrol colbycons?nsue Ejemplo 3 - ADNc Ceres 12482777 El clon 126592, ADNc Ceres 12482777, codifica una proteína de longitud completa que tiene homología con una hierro/manganeso superóxido dismutasa de Arabidopsis thaliana . La expresión ectópica del ADNc Ceres 12482777 bajo control del promotor CaMV35S induce los siguientes fenotipos : o Crecimiento incrementado bajo tensión inducida por un pH alto o Mejor recuperación después de la exposición a la tensión por pH o Altura reducida sin una reducción en el índice de cosecha.

Generación y evaluación fenotípica de las líneas Ti que contenían 35S::ADNc 12482777 Las plantas assilewskija (WS) de Arabidopsis de tipo silvestre se transformaron con un plásmido Ti que contenía el ADNc 12482777 en la orientación con sentido con relación al promotor constitutivo 35S. El vector del plásmido Ti utilizado para esta construcción, CRS338, contiene PAT y confiere resistencia a herbicidas en las plantas transformadas. Siete eventos transformados independientemente se seleccionaron y se evaluaron por su fenotipo cualitativo en la generación Ti. No se observaron fenotipos negativos en las plantas Ti, aunque se observó un incremento en el número de ramificaciones en uno de los eventos.

Muéstreos de los superdepósitos en medios con un pH alto para la tolerancia al pH Las semillas de los superdepósitos de las líneas de sobreexpresión de 35S se evaluaron por la verdosidad y tamaño en medios con un pH alto como se describió anteriormente. Las semillas T3 también se sometieron a ensayo por el rendimiento total de semillas, peso en seco total del tejido e índice de cosecha como se describió anteriormente .

RESULTADOS: Análisis cualitativo del superdepósito que contenía las plantas de 35S::ADNc 12482777 en un pH alto El muestreo identificó un evento individual que fue más verde y el tamaño total fue comparable con los controles . No hubo un retardo en el tiempo de florecimiento o una disminución en la producción de semillas en comparación con una planta de tipo silvestre sin tratamiento. Después de la recuperación, la planta que contenía el ADNc 12482777 tuvo un rendimiento de semillas significativamente mejor, determinado por el volumen de las semillas, que los controles (Figura 2) .

Análisis cualitativo y cuantitativo de T3 - ADNc 12482777 en un pH alto Las plantas se trataron con FinaleMR para eliminar cualquier positivo falso o cualquier línea donde el marcador FinaleMR estuviera suprimido. Todos los candidatos resistentes a FinaleMR florecieron y produjeron semillas. La segregación de la resistencia a FinaleMR en la línea T3 sugirió una relación de segregación de 1:1 (R:S) calculada por medio de la prueba chi-cuadrado (Tabla 3-1) . Las plantas fueron más verdes que el control tratado previamente con pH. No hubo un efecto tolerante encontrado bajo condiciones de una baja concentración de fosfato (datos mostrados) , lo que sugiere que la respuesta tolerante no es hacia las deficiencias de nutrientes impuestas por el pH alto sino preferiblemente hacia la tensión oxidativa inducida por la alcalinidad.

Análisis cualitativo y cuantitativo del índice de cosecha, rendimiento de semillas y altura de la planta de la progenie T3 de 35S::ADNc 12482777. Una población segregante de 17 plantas que contenían el ADNc 12482777 se analizó por el índice de cosecha y rendimiento de semillas en comparación con poblaciones de tipo silvestre. Basándose en mediciones de la altura del tallo, la población transgénica de 35S::ADNc 12482777 (10 plantas) fue significativamente más pequeña que las poblaciones de tipo silvestre/de control tanto internas (6 plantas) como externas. Las plantas internas de tipo silvestre/de control fueron aquellas plantas que se segregaban de la población T3 de la línea de 35S::ADNc 12482777 la cual no contenía el inserto (elementos no transgénicos, segregantes) . Las plantas de tipo silvestre externas no fueron plantas transgénicas de una fuente exterior que no compartía linaje con la línea que se sometía a prueba. Las plantas de tipo silvestre externas se agregaron al experimento como un control del proceso para asegurar la calidad de las condiciones de crecimiento. La altura promedio de las plantas transgénicas del ADNc 12482777 fue 33.44 cm ± 0.78 contra 44.65 cm ± 0.70 para los controles internos de tipo silvestre. A pesar de esta disminución en la altura de las plantas, el índice de cosecha, medido por medio del peso de las semillas/peso total de la planta permaneció sin ser afectado, es decir esas plantas transgénicas aún produjeron la misma relación de peso total de semillas :peso total de la planta (biomasa) como los controles no transgénicos. Este resultado significa que aunque el rendimiento total de semillas es disminuido en las líneas del ADNc 12482777, aún tiene las mismas semillas proporcionalmente como los controles. Las plantas del ADNc 12482777 tuvieron un índice de cosecha de 56.96 ± 2.99 en comparación con el índice de cosecha de la población de tipo silvestre de 44.92 ± 2.67 (Tabla 3-2A). Este incremento en el índice de cosecha fue significativo a un valor P de .009 (Tabla 3-3A) . Es importante observar que el peso de las semillas de las plantas del ADNc 12482777 con un índice de cosecha más grande fue 0.30977 g ± 0.025 mientras que la población de tipo silvestre tuvo un peso de semillas promedio de 0.37155 g ± 0.027 (Tabla 3-3B) . El ADNc 12482777 tiene un peso de semillas ligeramente más pequeño que la población de tipo silvestre pero no es diferente estadísticamente a un valor P de 0.12 (Tabla 3-3B) , sugiriendo que el índice de cosecha de 35S::ADNc 12482777 es comparable con, si no es mayor que, las plantas de tipo silvestre. Este incremento en el índice de cosecha no es debido a un incremento en el número de ramificaciones (datos no mostrados) como se observa en la generación Ti . En cambio, la longitud internodos entre silicuas es reducida en comparación con el control interno de tipo silvestre, lo que sugiere que las plantas del ADNc 12482777 tienen más silicuas por longitud de tallo.

Tabla 3-2A. Comparación estadística, descriptiva del índice de Cosecha entre las poblaciones T segregantes que contienen el ADNc 12482777. índice de Cosecha: ADNc Población índice de Cosecha: del Población Interna 12482777 estatura pequeña Transgénica ADNc 12482777 estatura de tipo silvestre de tipo silvestre Promedio 56.9582619 Promedio 44.91972222 Error Estándar 2.990040579 Error Estándar 2.667294901 Mediana 56.68809524 Mediana 45.56319444 Desviación Estándar 9.455338527 Desviación Estándar 6.533511501 Varianza de la Muestra 89.40342666 Varianza de la Muestra 42.68677253 Mínimo 43.41666667 Mínimo 33.9375 Máximo 70.11666667 Máximo 54.36666667 Suma 569.582619 Suma 269.5183333 Cuenta 10 Cuenta 6 Nivel de Confianza Nivel de Confianza (95.0%) 6.763946869 (95.0%) 6.856488619 Tabla 3-2B. Comparación estadística, descriptiva < jel peso total de las semillas (g) al momento de la cosecha entre las poblaciones T4 segregantes que contienen el ADNc 12482777. Peso Total de las Semillas Población Peso Total de las Semillas Población Interna (g) del: ADNc 12482777: Transgénica (g) del: ADNc 12482777: de tipo silvestre Estatura Pequeña Estatura de tipo silvestre Promedio 0.30977 Promedio 0.37155 Error Estándar 0.024799382 Error Estándar 0.027304014 Mediana 0.3017 Mediana 0.3796 Desviación Estándar 0.078422531 Desviación Estándar 0.066880902 Varianza de la Muestra 0.006150093 Varianza de la Muestra 0.004473055 Mínimo 0.1956 Mínimo 0.2715 Máximo 0.4207 Máximo 0.4621 Suma 3.0977 Suma 2.2293 Cuenta 10 Cuenta 6 Nivel de Confianza Nivel de Confianza (95.0%) 0.056100142 (95.0%) 0.070187087 Tabla 3-4A. Comparación estadística del índice de cosecha entre las poblaciones transgénicas del clon 126592 y las poblaciones internas de tipo silvestre utilizando una prueba t en dos muestras asumiendo varianzas desiguales. ADNc 12482777 estatura de Wt (población interna de tipo silvestre) y ADNc 12482777 estatura pequeña (población transgénica). índice de Cosecha: ADNc índice de Cosecha: ADNc 12482777 estatura de Wt 12482777 estatura pequeña Promedio 44.91972222 56.9582619 Varianza 42.68677253 89.40342666 Observaciones 6 10 Diferencia Promedio Hipotética 0 df 14 t Stat -3.004493678 P(T<=t) una vía 0.004733406 t Crítica una vía 1.76130925 P(T<=t) dos vías 0.009466812 t Crítica dos vías 2.144788596 Tabla 3-4B. Comparación estadística del peso de las semillas entre la población transgénica del clon 126592 y las poblaciones internas de tipo silvestre utilizando una prueba t en dos muestras asumiendo varianzas desiguales. ADNc 12482777 estatura de Wt (población interna de tipo silvestre) y ADNc 12482777 estatura pequeña (población transgénica). Peso de las Semillas 12482777: Peso de las Semillas estatura de Wt 12482777: Estatura Pequeña Promedio 0.37155 0.30977 Varianza 0.004473055 0.006150093 Observaciones 6 10 Diferencia Promedio Hipotética 0 Df 12 t Stat 1.674926201 P(T<=t) una vía 0.059894848 t Crítica una vía 1.782286745 P(T<=t) dos vías 0.119789696 t Crítica dos vías 2.178812792 La Tabla 3-5 proporciona los resultados del análisis de las secuencias consensúales basados en el ADNc Ceres 12482777.

Tabla 3-5 CeresClone:278210 VKJSIRJSPI PED' NHG|RLVI jSJKT PNAl vwte 141 Leadclonel 26592 ANAVNPL KlE lEDKKLVI VKT PNAV 3LVWDl 239 CeresClone:970125 158 CeresClone:624535 Ef AVNPLpBD1 [DKKLVVVKT >NAVNPLVWN Y 7|H|PLLTI DV EHAYFI DFQ 244 gi |16974682 GNAVNPL MTE IDKKLVVLKS 'NAVNPLVWN HHHIHPLLTI DV ??/' EHAYYLDYQ 246 Consensual -NAVNPL-S- EDKKLV-VKT PNAVNPLVWN PLLTI DV WEHAYYLD- 250 CeresClone:278210 D R RK DYV SM Leadclonel 26592 NNR Rk EYI N ra CeresClone:970125 CeresClone:624535 OR DYI S, gi |16974682 RRIP EYI S ? Consensual NRR — Yl S-F -KLVSWE-V SSRLEKA-A ERE-E — R K — REE-E — 300 CeresClone:278210 AlÑJGl RARSR ARQGRQGE )E VARSRPVEA 220 o Leadclonel 26592 PIDD-EV^E] |7?lPlS|5t | /S EVD 305 CeresClone:970125 158 CeresClone:624535 TÜSÍ 1 — Al PE] prTSt 3p lDlLD AE- 313 gi |16974682 TTGI D PAPE I Fkfc JG|DJ- 313 Consensual E PE VY-D-D-D — 329 Ejemplo 4 - ADNc Ceres 12333678 El clon 26006, ADNc Ceres 12333678, codifica una glicosil hidrolasa de longitud completa. La expresión ectópica del ADNc Ceres 12333678 bajo control del promotor CaMV35S induce los siguientes fenotipos: o Germinación en altas concentraciones de polietilenglicol (PEG) , manitol y ácido abscísico (ABA) . o Crecimiento continuo en una alta concentración de PEG, manitol y ABA.

Generación y evaluación fenotípica de líneas Ti que contenían 35S::ADNc 12333678.

Las plantas Wassilewskija (WS) de Arabidopsis de tipo silvestre se transformaron con un plásmido Ti que contenía el ADNc 12333678 en la orientación con sentido con relación al promotor constitutivo CaMV35S. El vector del plásmido Ti utilizado para esta construcción, CRS338, contiene PAT y confiere resistencia a herbicidas en las plantas transformadas. Se seleccionaron diez eventos transformados independientemente y se evaluaron por su fenotipo cualitativo en la generación T . No se observaron fenotipos positivos o negativos en las plantas Tx .

Muéstreos de superdepósitos en alta concentración de PEG, manitol y ABA como muéstreos substitutos para la tolerancia a la seguía Las semillas de 13 superdepósitos (1,200 semillas T2 de cada superdepósito) de las líneas de sobreexpresión de CaMV35S o 32449 se sometieron a prueba en medios con un pH alto como se describió anteriormente. Las semillas T3 se recolectaron de plantas tolerantes y se analizaron por la tolerancia en todos los muéstreos adicionales con un pH alto. Una vez que se identificó el ADNc 12333678 en plantas tolerantes, los eventos T2 individuales que contenían este ADNc ( E01334) se sometieron al muestreo en una alta concentración de PEG, manitol y ABA para identificar eventos con el fenotipo de resistencia. Los superdepósitos (SP) son referidos como SPI, SP2 y así sucesivamente. La letra después del guión se refiere al muestreo (P = PEG, M = manitol y A = ABA) y el número después de la letra se refiere al número asignado a cada planta obtenido de ese muestreo en ese superdepósito. Por ejemplo, SP1-M18 es la 18a planta aislada de un muestreo con manitol del superdepósito 1.

RESULTADOS : Evaluación cualitativa de ME01334 en un pH alto El superdepósito 1 se sujetó al muestro en medios con un pH alto como se describió anteriormente. Los análisis de la PCR identificaron a ME01334 como una de las líneas ME que muestran resistencia a un pH alto. La prueba de la segunda generación confirmó la herencia de la resistencia al pH (datos no mostrados) . Las plantas ME01334 que se recuperaron después de un pH alto produjeron un número excepcionalmente grande de semillas en comparación con los controles de tipo silvestre. Una prueba adicional confirmó que estas plantas producen estadísticamente 30-80% más semillas que las plantas de control ya sea de tipo silvestre o transgénicas que se recuperaron de este muestreo o se transfirieron de medio de MS regulares. La Tabla 4-1 proporciona los resultados del análisis de secuencias consensúales basados en el ADNc Ceres 12333678.

Tabla 4-1 /tmp/Lead-clone26006.aln Consensual KKHFVLVHGA CHGAWCWYK- KPLLEA-GHR VTALDLAASG 50 23/05/05 plur=9.500000 -colusión —box — noboxcol colbyconsensus Tabla 4-1 15866583 SHjKVI LVGHS ? GG|GJSV{GDJ : 98 2780225 GEKVI LVGpHS CGGLNI Al A|A 90 50513520 GEKVI LVGE5 CGGLNI Al A 90 6435646 GEKVI LVG¡EJS CGGLNI Al A 90 57899620 GERLI LVGHS FGGLSI ALAM 95 CeresClone:936068 GERLVLVGHS LGGLNI ALAM 94 gi 34907176 GERLVLVGHS HGGLSVALAM 96 gi 56393011 NEKI I LVGHA LGGL0 S§AM 97 gi 41814856 LERVVLVGHS MGGI NI SLAM 93 gi 56392765 QERVVLVGHS M|GGI NI SLAK/ 93 CeresClone:644331 GEKVVLVGHS LGGVNVALA 97 g¡|53830670 NEKVI LVGHS GGGMJTA]AV_ 91 Leadclone26006 DEKVVLVGHS FGGLSLALAM 95 CeresClone:1010900 DEKVVLVGHS FGGLNLAI AM 95 20196998 DEKVVLVGHS FGGLNLAI AM 95 27754457 DEKVVLVGHS FGGLNLAI AM 95 6651393 DEKVVLLGHS FGGMSLgLAM 97 14279437 EEKVI LVGHS LGGV[F]LALA|G 96 40549303 DEKVI LVGHS L|GGMNL|G]LA g 91 Consensual —PRQI -El —FE-YSEPL MELM-SLP- -EKVVLVGHS -GGLNI ALAM 100 Tabla 4-1 15866583 144 2780225 136 50513520 136 6435646 136 57899620 141 CeresClone:936068 142 gi 34907176 145 gi 56393011 143 gi 41814856 139 gi 56392765 139 CeresClone:644331 144 g¡|53830670 139 Leadclone26006 143 CeresClone:1010900 143 20196998 143 27754457 143 6651393 145 14279437 146 si 40549303 139 Consensual EKFPEKI SVA VFL-A-MPDT EH-PS-VLEK P-E WMDTEF- 150 Tabla 4-1 Consensual TS Ml -GP-FL- -LYQLSP-ED L-LA-MLVRP GSLFI -D-LS 200 Tabla 4-1 Consensual K F — E- YGSVKRVYI V — ED — I -EE -FQRWMI ENY P — EV-E1 EG 250 Tabla 4-1 oo Consensual -DHM-M-SKP QELS — LL-I A-KY — 276 Siendo descrita de esta manera la invención, será aparente para una persona de experiencia ordinaria en el campo que se pueden hacer varias modificaciones de los materiales y métodos para practicar la invención. Estas modificaciones deben considerarse dentro del alcance de la invención definida por las siguientes reivindicaciones. Cada una de las referencias de patente y bibliografía periódica citadas en este documento es incorporada expresamente por este acto en su totalidad por esta mención.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico aislado, caracterizada porque comprende: a) un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos la cual codifica una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85% de identidad de secuencias con cualquiera de aquellas secuencias presentes en el Listado de Secuencias; b) un ácido nucleico el cual es un complemento de una secuencia de nucleótidos de acuerdo con el párrafo (a) ; c) un ácido nucleico el cual es inverso de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el subpárrafo (a) , de tal manera que la secuencia de nucleótidos inversa tiene un orden de secuencia el cual es inverso al orden de secuencia de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el subpárrafo (a) ; o d) un ácido nucleico capaz de hibridizarse a un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de los párrafos (a) (c) , bajo condiciones que permiten la formación de un duplo de ácido nucleico a una temperatura de aproximadamente 40 °C y 48 °C abajo de la temperatura de fusión del duplo de ácido nucleico.
2. 2. La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene la secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de aquellas secuencias presentes en el Listado de Secuencias.
3. 3. La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las secuencias consensúales expuestas en las Tablas 1-5, 2-6, 3-5 o 4-1.
4. 4. La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos tiene una secuencia de acuerdo con cualquiera de aquellas secuencias presentes en el Listado de Secuencias.
5. 5. Una construcción de vector, caracterizada porque comprende: a) un primer ácido nucleico que tiene una secuencia reguladora capaz de causar la transcripción y/o traducción en una planta; y b) un segundo ácido nucleico que tiene la secuencia de la molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4; en donde el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico son unidos de manera operable y en donde el segundo ácido nucleico es heterólogo a cualquier elemento en la construcción del vector.
6. 6. La construcción del vector de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el primer ácido nucleico es nativo respecto al segundo ácido nucleico.
7. 7. La construcción del vector de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el primer ácido nucleico es heterólogo para el segundo ácido nucleico.
8. 8. Una célula hospedante, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en donde la molécula de ácido nucleico está flanqueada por una secuencia exógena.
9. 9. Una célula hospedante, caracterizada porque comprende una construcción del vector de conformidad con la reivindicación 5.
10. 10. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85% de identidad de secuencias con cualquiera de aquellas secuencias presentes en el Listado de Secuencias.
11. 11. Un método para introducir un ácido nucleico aislado en una célula hospedante, caracterizado porque comprende: a) proporcionar una molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1; y b) poner en contacto el ácido nucleico aislado con la célula hospedante bajo condiciones que permiten la inserción del ácido nucleico en la célula hospedante.
12. 12. Un método para transformar una célula hospedante, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula hospedante con una construcción del vector de conformidad con la reivindicación 5.
13. 13. Un método para detectar un ácido nucleico en una muestra, caracterizado porque comprende: a) proporcionar una molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4; b) poner en contacto la molécula de ácido nucleico aislado con una muestra bajo condiciones que permiten una comparación de la secuencia de la molécula de ácido nucleico aislado con la secuencia de TDN en la muestra; y c) analizar el resultado de la comparación.
14. 14. Una planta, célula vegetal, material vegetal o semilla de una planta, caracterizados porque comprenden una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 la cual es exógena o heteróloga para la planta o célula vegetal.
15. 15. Una planta, célula vegetal, material vegetal o semilla de una planta, caracterizados porque comprenden una construcción del vector de conformidad con la reivindicación 5.
16. 16. Una planta, caracterizada porque ha sido regenerada a partir de una célula vegetal o semilla de conformidad con la reivindicación 14.
17. 17. Una planta, célula vegetal, material vegetal o semilla de una planta, caracterizados porque comprenden una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, en donde la planta tiene características mejoradas de tolerancia al pH y eficacia en el uso de fosfato en comparación con una planta de tipo silvestre cultivada bajo las mismas condiciones.
18. 18. Un método para incrementar la tolerancia al pH o la eficacia en el uso de fosfato en una planta, caracterizado porque comprende transformar una planta con una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.
19. 19. Una planta transgénica, caracterizada porque tiene una construcción de gen que comprende un ácido nucleico que codifica un componente de tolerancia al pH o eficacia en el uso de fosfato unido de manera operable a un promotor vegetal de manera que el componente de tolerancia al pH o eficacia en el uso de fosfato es sobreexpresado ectópicamente en la planta transgénica y la planta transgénica exhibe: i) una velocidad de crecimiento más rápida, ii) mayor peso en fresco o en seco con la maduración, iii) mayor rendimiento de frutos o semillas, iv) tolerancia más alta al pH, v) tolerancia más alta a una baja concentración de fosfato, o vi) tolerancia más alta a una baja concentración de nitrógeno que una planta progenitora la cual no contiene la construcción del polinucleótido, cuando la planta transgénica y la planta progenitora son cultivadas bajo condiciones ambientales idénticas, en donde el componente de tolerancia al pH o eficacia en el uso de fosfato es cualquiera de los polipéptidos expuestos en el Listado de Secuencias o cualquiera de las secuencias consensúales de la reivindicación 3.
20. 20. Un método para la tolerancia al pH o eficacia en el uso de fosfato en una planta, caracterizado porque comprende transformar una planta con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende al menos uno de los siguientes; a) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos en las posiciones 29-154 de la secuencia consensual de la Tabla 1-5, b) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos en las posiciones 18-128 de la secuencia consensual de la Tabla 2-6, c) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos en las posiciones 57-230 de la secuencia consensual de la Tabla 3-5, d) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos en las posiciones 234-248 de la secuencia consensual de la Tabla 3-5, y e) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos en las posiciones 10-276 de la secuencia consensual de la Tabla 4-1.
21. 21. Una planta, célula vegetal, material vegetal de una planta con características mejoradas de tolerancia al pH o eficacia en el uso de fosfato en comparación con una planta de tipo silvestre cultivada bajo las mismas condiciones, caracterizados porque comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende al menos uno de los siguientes: a) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos en las posiciones 29-154 de la secuencia consensual de la Tabla 1-5, b) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos en las posiciones 18-128 de la secuencia consensual de la Tabla 2-6, c) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos en las posiciones 57-230 de la secuencia consensual de la Tabla 3-5, d) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos en las posiciones 234-248 de la secuencia consensual de la Tabla 3-5, y e) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos en las posiciones 10-276 de la secuencia consensual de la Tabla 4-1.