MXPA06012889A - Medicamento para el tratamiento contra infecciones fungicas particularmente espergilosis. - Google Patents

Medicamento para el tratamiento contra infecciones fungicas particularmente espergilosis.

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MXPA06012889A
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Giovanni Salvatori
Paolo Carminati
Luigina Romani
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Sigma Tau Ind Farmaceuti
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Abstract

Se describe la combinacion de pentraxina PTX3 con agentes antifungicos para el tratamiento contra infecciones fungicas y particularmente para infecciones causadas por Aspergillus fumigatus.

Description

MEDICAMENTO PARA EL TRATAMIENTO CONTRA INFECCIONES FUNGICAS, PARTICULARMENTE ASPERGILOSIS Campo de la Invención La presente invención se relaciona con un medicamento que comprende una combinación de pentraxina PTX3 y un agente antif?ngico para el tratamiento contra aspergilosis . Antecedentes de la Invención La aspergilosis invasiva (AI) es la principal causa de neumonía nosocomial y de muerte en transplantes alogénicos de médula ósea (MO) con una tasa de infección estimada que abarca de 8% a 15% y una tasa de mortalidad asociada de aproximadamente 90% (3, 16, 30, 36, 47). A pesar del progreso en la terapia y diagnóstico temprano con nuevos agentes antifúngicos (6, 31), la mayoría de los casos de AI permanecen sin diagnosticar y sin tratar (16) . El factor de riesgo más importante para AI que se utilizó históricamente es neutropenia. Sin embargo, los avances hechos en la preparación de pacientes que experimentan quimioterapia y trasplante conlleva a una significativa reducción del período de neutropenia. Numerosos estudios han documentado que la aspergilosis se manifiesta a sí misma después de transplantes de médula ósea concomitantemente con la manifestación de enfermedad de injerto contra hospedero (GvH) (30) . La ocurrencia de AI también en pacientes no neutropénicos (17) REF:176350 confirma la importancia de defectos específicos tanto en mecanismos inmunoefectores innatos y adaptativos en la patogénesis de la enfermedad (13, 20, 22, 32, 39, 43, 44). En particular, se ha evaluado recientemente la función de los linfocitos Th para proporcionar la defensa secundaria esencial contra el hongo (8-10, 12, 14, 23, 26). Ya que AI es extremadamente rara en pacientes inmunocompetentes , la terapia enfocada para potenciar la respuesta inmunitaria del hospedero ofrece un nuevo y prometedor enfoque para el tratamiento contra esta infección. El sistema inmunitario innato ha evolucionado de forma compleja y multifacética para proteger el tejido pulmonar contra infecciones. La protección del tejido pulmonar comprende no solo un control preventivo contra la proliferación microbiana, pero también la ejecución de respuestas inflamatorias balanceadas suficientemente para contener la infección sin inducir grados peligrosos de infiltración y exudación alveolar. Los componentes moleculares de recubrimiento alveolar han sido recientemente el foco de considerable atención como inmunorreguladores primarios en infecciones (28, 29). Las pentraxinas (PTX) son una superfamilia de proteínas que se conservaron durante la evolución de Limulus polyphemus al hombre, generalmente caracterizadas por la estructura pentamérica (21) . PTX3 es un prototipo de la pentraxina de cadena larga que consiste en una porción N-terminal acoplada al dominio C-terminal de pentraxina, esta última es un homólogo de la PTX de cadena corta (7) . PTX3 es secretada por diversos tipos de células, particularmente por fagocitos mononucleares, células endoteliales y células dendríticas (DC) , en respuesta a las citocinas de inflamación primaria in vi tro e in vivo (11, 38 , 18) . El aumento de niveles en circulación de esta proteína se detectó en diversas infecciones y condiciones inflamatorias distintas (37, 19, 34, 41) . PTX3 se une a una variedad de agentes microbianos seleccionados (por ejemplo, conidios de A . fumigatus y P. aeruginosa) y activa diversas vías efectoras del sistema inmunitario para combatir la infectividad del patógeno (20) . El análisis de ratones deficientes en PTX3 ha demostrado que PTX3 es un receptor de reconocimiento de patrón (PRR) que tiene una función no redundante en la resistencia a patógenos seleccionados (20) . La susceptibilidad de ratones deficientes en PTX3 hacia A . fumigatus se ha asociado con la organización no exitosa de respuesta inmunológica adaptativa tipo I, pero puede restaurarse mediante la administración exógena de PTX3 recombinante (20) . Se necesitan avances terapéuticos para combatir la aspergilosis, a pesar de la reciente expansión de armamento antifúngico (45) . Los investigadores han comenzado a explorar las nuevas estrategias con una combinación singular de agentes antifúngicos y citocinas (46) . El tratamiento con Anfotericina B, un fármaco de primera elección, se limita a la nefrotoxicidad relacionada a dosis que precluye la terapia con dosis completa en pacientes que han sido sometidos a transplantes de médula ósea (24) . Se han desarrollado diversas formulaciones de Anfotericina B basadas en lípidos para reducir la toxicidad asociada con D-AmB convencional (25) , así como con L-AmB (2). El perfil farmacocinético de toxicidad con L-AmB es más favorable que el de D-AmB, haciendo posible la terapia con dosis completa. No obstante, la tasa de fallas aún es cuestión de preocupación (1) . Los modelos experimentales en murino de AI publicados, en donde la eficacia de agentes antifúngicos ha sido evaluada, se basan en neutropenia inducida por quimioterapia con o sin corticosteroides, para hacer los ratones menos susceptibles a la infección. Recientemente, hay un aumento en el desarrollo de nuevos agentes antifúngicos para el tratamiento contra AI, con nuevas clase de fármacos caracterizadas por nuevos objetivos terapéuticos (45) , que están produciendo nuevas expectativas para el tratamiento contra AI y que aumentan la cantidad de nuevas terapias combinadas (45) . En base al tratamiento de otras enfermedades infecciosas (4), la terapia combinada aparecería como una opción terapéutica importante .
Breve Descripción de la Invención Se ha descubierto que la pentraxina PTX3 ejerce un efecto sinérgico sorprendente cuando se combina con otros agentes antifúngicos, permitiendo así la preparación de un fármaco caracterizado por dosis subóptimas del agente antif?ngico. Esta característica prueba ser ventajosa en términos de una mayor capacidad del manejo del medicamento, en que es capaz de limitar sustancialmente los efectos secundarios característicos de sus ingredientes activos individuales. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es la combinación de pentraxina PTX3 y un agente antifúngico, así como una composición farmacéutica que lo contiene y el uso de esta combinación para la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico contra infecciones fúngicas, particularmente aspergilosis. Descripción Detallada de la Invención En diversas solicitudes de patente presentadas con el nombre del solicitante actual se describe la pentraxina PTX3 y sus diversos usos terapéuticos . La solicitud de patente internacional WO 99/32516 describe la secuencia de la proteína y su uso en enfermedades infecciosas, inflamatorias o tumorales. Otros usos de pentraxina PTX3 de cadena larga se describen en los documentos WO 02/38169, WO 02/36151, WO 03/011326 y WO 03/084561. En una modalidad preferida de la invención, el agente antifúngico es Anfotericina B, con mayor preferencia en forma de deoxicolato que se conoce comercialmente con la marca Fungizona (Bristol-Myers Squibb) o en formulación liposomal conocida en el mercado comercialmente como AmBisome (GILEAD) . Con respecto a los aspectos relacionados con la aplicación industrial de la presente invención, la pentraxina PTX3 de cadena larga y el agente antifúngico estarán en forma de una composición farmacéutica en donde los ingredientes activos estén solubilizados y/o transportados por diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de composiciones farmacéuticas que pueden utilizarse para pentraxina de cadena larga PTX3 ' son también aquellos descritos en el documento WO 99/32516. La combinación según la presente invención puede administrarse mediante rutas entérales o parenterales. La dosis diaria dependerá, según el juicio del médico de cabecera, del peso, edad y estado general del paciente. Se debe señalar que la preparación de estas composiciones farmacéuticas, incluyendo las de liberación lenta, pueden lograrse utilizando técnicas e instrumentos comunes conocidos por los farmacéuticos y los expertos en tecnología farmacéutica . En una modalidad particular de la invención, la infección fúngica es aspergilosis invasiva (AI) . La combinación según la invención ha sido evaluada en un modelo experimental en murino de trasplante de médula ósea que replica la inmunodeficiencia observada en las mismas condiciones en el hombre. Los ratones se someten a diferentes programas de tratamiento y se evalúa para determinar la resistencia a AI y los parámetros de inmunidad innata y adaptativa. Los resultados han mostrado que PTX3 induce una resistencia total a la infección y reinfección, que activa las respuestas protectoras tipo I y que aumenta considerablemente la eficacia terapéutica de agentes antifúngicos cuando se administran combinados. La presente invención se ilustrará detalladamente también por medio de ejemplos y figuras, en donde: La Figuras 1 ilustra el efecto de la administración de PTX3, AmBisome (L-AmB) o Fungizona (D-AmB) en ratones con aspergilosis invasiva. Los ratones C3H/HeJ letalmente irradiados fueron infundidos con células de médula ósea desprovistas de células T de ratones BALB/c (2 x 106) una semana antes de la infección intranasal con 2 x 107 conidios de Aspergilus . Los ratones fueron tratados con PTX3 o con los polienos a dosis y por las vías de rutas indicadas, cinco días antes (Pre-) o después (Post-) o simultáneamente (Con.), en cada caso repitiéndose la administración durante los siguientes cinco días. La resistencia a la infección se evaluó como el porcentaje de supervivencia. La carga fúngica en los pulmones, cerebros y riñones de ratones infectados se cuantifico mediante la siembra seriada en placas sobre el medio de dextrosa Sabouraud de lavados de diversos órganos y los resultados se expresaron como unidades formadoras de colonias (UFC) (promedio ± SE) en muestras obtenidas a partir de órganos indicados y llevados a cabo al momento de la muerte de ratones que murieron antes de la infección o también a los 6 días después de la infección. Los grupos comprenden 6 animales . * Indica P < 0.05 (ratones tratados contra no tratados) . La Figura 2 ilustra el efecto de la administración de PTX3 sobre la resistencia a la reinfección por Aspergillus . Los ratones trasplantados con médula ósea, que se generan como se describe previamente en la leyenda para la Figura 1, se infectaron intranasalmente con 2 x 107 de conidios de Aspergillus una semana después del trasplante de la médula ósea trataron simultáneamente con PTX3 a las dosis y vías de administración indicadas, comenzando en el día de la infección y continuando durante los siguientes cinco días . Dos semanas después de la infección, los ratones sobrevivientes fueron reinfectados intravenosamente con 5 x 105 conidios de Aepergillus . El crecimiento fúngico (UFC) en los riñones se evaluó tres días después de la reinfección. *Indica P < 0.05 (ratones tratados contra no tratados) . Las Figuras 3A-3B muestra que PTX3 reduce la enfermedad pulmonar en ratones con aspergilosis invasiva. Las secciones de base periódica de Schiff se preparan a partir de pulmones de ratones trasplantados con médula ósea infectados con conidios de Aspergillus ya sea sin tratamiento (Fig. 3A) o con tratamiento (Fig. 3B) con 1 mg/Kg de PTX3 intraperitonealmente desde el día de la infección continuando durante los siguientes 5 días. Numerosas hifas de Aspergillus (flechas) se infiltraron en el parénquima pulmonar, con una destrucción extensa del parénquima y marcados signos de daño de la pared bronquial y necrosis y un bajo reclutamiento celular que se observa en los pulmones de ratones sin tratamiento (3 días después de la infección) . Los ratones tratados con PTX3 presentan un tejido pulmonar caracterizado por infiltrados curativos de células inflamatorias sin evidencia de destrucción parenquimal o crecimiento fúngico (6 días después de la infección) . Amplificación , x 100 en los paneles A y B; x 400 en los insertos. Las Figuras 4A-4B muestran que PTX3 acelera la recuperación celular en ratones con aspergilosis invasiva. Los ratones trasplantados con médula ósea, que se generan como se describe detalladamente en la leyenda para la Figura 1, se infectan intranasalmente con 2 x 107 conidios de Aspergillus y se someten a tratamiento (+) o sin tratamiento (-) con 1 mg/Kg PTX3 intraperitonealmente desde el día de la infección y continuando durante cinco días adicionales. Los números se refieren a los porcentajes de células positivas, indicado por un análisis FACS en los pulmones (Fig. 4A) y en el bazo (Fig. 4B) , 3 0 6 días después de la infección. Las figuras 5A-5C muestran que PTX3 induce la recuperación funcional de células Thl . Los ratones trasplantados con médula ósea, generados como se describe previamente en detalle con la leyenda de la Figura 1, se infectan intranasalmente con 2 x 107 conidios de Aspergillus y se someten a tratamiento con 1 mg/kg PTX3 intraperitonealmente tanto antes de la infección (línea a rayas oblicua) desde el día de la infección continuando durante 3 días adicionales (barras punteadas) . A los tres días después de la infección, se determinaron los niveles de IL-12 p70 e IL-10 mediante análisis específicos de ELISA en fluidos de lavados bronquioalveolares (Fig. 5A) , la cantidad de células CD4+ T del bazo que producen citocinas se enumeraron mediante análisis ELISPOT (Fig. 5B) y la expresión génica de citocinas sobre células de bazo CD4+ se pudo determinar mediante PCR en tiempo real. Las barras indican los errores estándar. *P < 0.05, ratones infectados contra no infectados; **P < 0.05, ratones tratados con PTX3 contra ratones sin tratamiento. Ratones no infectados (barras blancas) ; ratones infectados (barras negras) . La Figura 6 muestra que PTX3 aumenta la eficacia terapéutica de AmBisome (L-AmB) y Fungizona (D-AmB) . En ratones trasplantados con médula ósea, generados como se describe detalladamente en la leyenda para la Figura 1, se infectaron intranasalmente con 2 x 107 conidios de Aspergillus y se sometieron a tratamiento intraperitonealmente con cada agente individual solo o combinado, antes (Pre-) o después (Post-) de la infección. Las dosis fueron: 0.04 y 0.2 mg/kg PTX3 antes o después de la infección, respectivamente; 1 mg/kg AmBisome y 2 mg/kg Fungizona. Se evaluó la resistencia de infección como porcentaje de supervivencia y como UFC a partir de los pulmones, se llevó a cabo al momento de la muestra para aquellos ratones que murieron antes, o de otra forma a los 6 días después de la infección. *P < 0.05, ratones tratados contra no tratados; **P < 0.001, tratamiento combinado con PTX3 + L-AmB contra solamente cada tratamiento individual. ***P < 0.05, tratamiento combinado con PTX3 + D-AmB contra solamente D-AmB. Las Figuras 7A-7B muestran que PTX reduce la producción de TNF-a y aumenta la proporción de citocinas de Thl:Th2 en ratones tratados con polienos. En ratones trasplantados con médula ósea, que se genera como se describe previamente en detalle en la leyenda de la Figura 1, se infectaron intranasalmente con 2 x 107 conidios de Aspergillus y se sometieron a tratamiento intraperitonealmente solamente con cada agente individual o combinados después de la infección. Las dosis fueron como se describe detalladamente para la leyenda para la Figura 6. Se determinaron los niveles TNF-? (pg/ml) en fluidos de lavados bronquioalveolares tres días después de la infección (A) y los niveles de IFN-? e IL-4 (pg/ml en los sobrenadantes de cultivo de células de bazo activadas con antígeno (B) que se lleva a cabo al momento de la muerte de aquellos ratones que murieron antes, o de otra forma a los 6 días después de la infección. Las barras indican los errores estándar. (-, ratones sin tratamiento). *P < 0.05 ratones tratados contra no tratados; **P < 0.05, tratamiento combinado con PTX3 + Fungizona (D-AmB) contra solamente D-AmB; ***p < 0.05, tratamiento combinado con PTX3 + AmBisome (L-AmB) contra cada tratamiento individual por sí solos . Materiales y Métodos Animales . Ratones hembra BALB/c y C3H/HeJ con edad de 8-10 semanas fueron suministrados por Charles River Breeding Laboratorios (Calco, Italia) . Los ratones fueron criados bajo condiciones axémicas específicas. Los ratones trasplantados con médula ósea fueron alojados en pequeñas jaulas estériles (5 animales por jaula) y alimentados con agua y alimento estéril. Todos los procedimientos concernientes a los animales y su cuidado fueron llevados a cabo de conformidad con las normas y leyes nacionales e internacionales . Todos los estudios in vivo fueron llevados a cabos de conformidad con los lineamientos nacionales y con aquellos del Comité para el Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Perugia. Modelo de trasplante de médula ósea. Se prepararon células de médula ósea (MO) de ratones donantes BALB/c mediante una aglutinación diferencial con aglutinina de soya. Se inyectaron intravenosamente (i.v.) células desprovistas de linfocitos T (menos de 1% de células T contaminantes como se cuantifica mediante el análisis FACS) a una concentración de > 4 x 106/ml en ratones C3H/HeJ receptores expuestos a una dosis letal de 9 Gy (33). Sin el trasplante de médula ósea, los ratones morían en 14 días. Según los estudios previos (33), más del 95% de los ratones sobrevivieron, lo que demuestra un quimerismo hematopoyético del donador estable que se detecta por la expresión del Complejo de Histocompatibilidad Tipo I del tipo donador, en células del bazo. Microorganismo, condiciones del cultivo e infección. La cepa de A . fumigatus fue suministrada de un caso fatal de aspergilosis pulmonar en el Instituto de Enfermedades infecciones de la Universidad de Perugia (13). Para la infección, los ratones se anestesiaron ligeramente por medio de inhalación de éter etílico antes de la instilación de una suspensión 2 x 107 conidios/20 µl solución salina, que se administró lentamente a través de las fosas nasales utilizando una micropipeta con una punta desechable estéril . Este procedimiento se repitió durante 3 días consecutivos. Para la reinfección, los ratones que sobrevivieron a la infección intranasal primaria (i.n.) se inocularon con 5 x 105 conidios de Aspergillus intravenoso. La carga fúngica en los pulmones, cerebro y ríñones de ratones infectados se cuantificó mediante sembrado serial en placas sobre un medio de dextrosa Sabouraud y los resultados (promedio ± SE) se expresan como unidades formadoras de colonia (UFC) en muestras obtenidas a partir de los órganos indicados. Para los experimentos seleccionados, también se evaluó el crecimiento fúngico mediante un análisis de quitina (10) . Para el análisis histológico, se retiró el pulmón y se fijó indirectamente en formalina. Las secciones (3 a 4 µm)de tejidos sometidos en parafina se tiñeron mediante el procedimiento de base periódica de ácido Schiff (13, 20) . Tratamientos . Se purificó PTX3 (SIGMA-Tau, Pomeiza, Roma, Italia) mediante una cromatografía de inmunoafinidad a partir del sobrenadante de cultivo de células CHO transfectadas con PTX3 y se monitorizó para determinar la ausencia de endotoxinas (20). Se diluyó PTX3 , Anfotericina B deoxicolato (D-AmB, Fungizona, Bristol-Myers Squibb, Sermoneta, Italia) y Anfotericina B liposonal (L-AmB, AmBisome, GILEAD, Milán, Italia) hasta obtener las concentraciones deseadas en solución salina estéril (PTX3) o en una solución de 5% glucosa-agua. Los tratamientos se llevaron a cabo según el siguiente programa: se administraron intraperitonealmente (i.p.) o intranasalmente (i.n.) (PTX3 solamente) diferentes dosis de PTX3 , Anfotericina B o AmBisome, solos o combinados, durante 5 días antes de infectarse con Aspergillus (tratamiento profiláctico) , concomítantemente con la infección y durante 5 días después de la infección o durante 5 días después de la última inyección de conidios (tratamiento terapéutico) . En el caso de administración intranasal, se administraron separadamente PTX3 y los conidios. Los animales testigo recibieron solamente el diluyente o la solución salina estéril . Citometría de flujo. Se evaluó el fenotipo de los diversos tipos celulares utilizando anticuerpos de murino contra antígenos indicados con anticuerpos anti-ratón de rata conjugados con FITC de PharMingen (San Diego, Ca) . Antes de la identificación inmunoquímica, se saturó FcR mediante la incubación de células con 5% suero normal. Se utilizaron como testigos los anticuerpos de histotipo. Los análisis se llevaron a cabo por medio de FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, Ca) . Los datos obtenidos fueron evaluados como el porcentaje de células positivas. Los histogramas son representativos de uno de cuatro experimentos independientes. Cuantificación de transcriptos de citocinas mediante RT-PCR en tiempo real. Se retrotranscribió el ARN total (5 µg, extraído a partir de células de bazo CD4+ T utilizado el estuche de reactivos RNeasy Mini Kit (QIAGEN S.p.A., Milán, Italia)) con transcriptasa inversa Sensiscript (QIAGEN) según las indicaciones del fabricante . Los cebadores para PCR se obtuvieron de Applied Biosystems (Foster City, Ca) . Las muestras se sometieron a 40 ciclos de amplificación a 95°C durante 15 segundos y luego a 60°C durante un minuto utilizando ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) . La amplificación por PCR del gen limpiador eucariota ARNr 18S se llevó a cabo a fin de permitir la normalización de las muestras según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems) . Los controles con agua fueron incluidos a fin de asegurar la especificidad. Todos los datos se examinaron para determinar su integridad mediante análisis del gráfico de amplificación. Los datos normalizados con ARN 18S fueron expresados como ARNm relativos de las citocinas examinadas (??Ct) y se compararon con aquellos de ratones sin infección previa (10) . Análisis de citocinas y análisis (ELISPOT) "análisis inmunosorbente en mancha ligado a enzima" . Se determinaron los niveles de citocinas en fluidos de lavado broncoalveolar en el sobrenadante de cultivo de células del bazo estimulados con Aspergillus (9, 10), térmicamente activadas utilizando el Estuche ELISA (R y D Systems, Inc. Space Import-Export srl, Milán, Italia) . Los límites de detección de los análisis (pg/ml) fueron < 16 para IL-12 p70, < 32 para TNF-a, < 10 para IFN-? y < 3 para IL-4 e IL-10. Para la numeración de las células CD4+ T que producen citocinas, se utilizó el análisis ELISPOT en células de bazo CD4+ T purificadas (9, 10) . Los resultados se expresaron como la cantidad de células promedio que producen citocinas (± SE) por 105 células, calculado usando réplicas de diluciones celulares en serie. Análisis estadístico. Se utilizó la prueba de rango-log para el análisis de los datos pareados de las curvas de supervivencia Kaplan-Meier. Se utilizó la prueba t de Student o los análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de Bonferroni para determinar la significancia estadística de las diferencias en la eliminación orgánica y los análisis in vi tro, como se indica en las leyendas de las Figuras. La significancia se define como P < 0.05. Los grupos in vivo comprenden 4-6 animales. Los datos registrados se agrupan de 3-5 experimentos, a menos que se especifique otra cosa. Resultados . Como se demostró previamente, la administración exógena de PTX3 restauró la resistencia antifúngica en ratones deficientes de PTX3 con y a 20. Para evaluar si PTX3 puede tener un efecto benéfico en ratones susceptibles, utilizamos ratones trasplantados con médula ósea cuya susceptibilidad sustancial a AI esté bien documentada (15) . Los ratones fueron sometidos a tratamiento con diferentes dosis de PTX3 administradas intranasalmente o intraperitonealmente, antes, concomítantemente con o después de la infección. Las dosis fueron seleccionadas en base a experimentos preliminares que muestran que los niveles de PTX3 (a la dosis de 0.5mg/kg/intranasal) eran elevados en los fluidos de lavados broncoalveolares durante al menos 24 horas (de 70 a 25 ng/ml, de 2 a 24 horas) y que eran más elevados que aquellos observados en ratones con AI un día después de la infección (de 2 a 15 mg/ml) (20 y datos no publicados) . Los parámetros de supervivencia y la carga fúngica en el pulmón y cerebro se registraron y analizaron en comparación con aquellos obtenidos en ratones tratados con diferentes dosis de AmBisome o Fungizona. Los resultados mostraron que PTX3 administrado profilácticamente (Figura ÍA) indujo una total resistencia a AI con cualquiera de las dosis evaluadas, como se pudo revelar por el aumento de supervivencia (> 60 días) de la mayoría (de 85 a 95%) de los ratones tratados y por la carga fúngica significativamente reducida en los pulmones y cerebro, particularmente en ratones que recibieron la dosis más elevada (1 mg/kg) . Se obtuvieron resultados similares en ratones que recibieron PTX3 concomítantemente con la infección (Figura IB) . Se detectó un efecto dependiente de dosis para este período de administración, en que la eficacia protectora de PTX3 se perdió a una dosis de 0.04 mg/kg. El PTX3 administrado después de la infección aumentó la supervivencia de ratones solo con la dosis más elevada, aunque en ambas dosis se redujo significativamente la carga fúngica en el pulmón y en la dosis más alta se redujo significativamente la carga fúngica en el cerebro (Figura 1C) . No se observó ninguna diferencia entre ambas rutas de administración. Se observaron resultados similares en ratones tratados con 5 mg/kg de AmBisome, en que todos los ratones sobrevivieron a la infección cuando se trataron antes o después de la infección (Figura ID) . La Fungizona no proporcionó el mismo nivel de protección y se observó un aumento en la supervivencia así como una disminución de la carga fúngica solo con la dosis tolerada más elevada (4 mg/kg) que se administró después de la infección (Figura 1E) . Además, evaluamos la susceptibilidad de ratones curados, después del tratamiento con PTX3 para la reinfección con Aspergillus y descubrimos que el tratamiento con PTX3 también aumentó significativamente la resistencia a la reinfección, como se pudo revelar por un menor crecimiento fúngico en los riñones de ratones reinfectados (Figura 2) . El PTX3 también mejoró la patología pulmonar. Las secciones pulmonares de ratones infectados mostraron la presencia de numerosas hifas de Aspergillus que se infiltraron en el parénquima pulmonar, con signos de daño severo a la pared bronquial y necrosis y un bajo reclutamiento de células inflamatorias (Figura 3A) . Estas características no se observaron en ratones tratados con PTX3 , de los cuales sus pulmones fueron caracterizados por infiltrados cicatrizantes de células inflamatorias poli y mononucleares sin evidencia de crecimiento fúngico ni destrucción de la pared bronquial (Figura 3B) . Estos datos proporcionan evidencia de la eficacia terapéutica de PTX3 en la condición de trasplantes de médula ósea donde los agentes antifúngicos normalmente muestran una actividad reducida (16, 31) .
En ratones con AI, la resistencia a infección se correlaciona con la activación de células Thl que producen IFN-? (12, 13). Para evaluar si PTX3 activa la reactividad de células Thl en ratones trasplantados con médula ósea infectados con AI, evaluamos la recuperación celular mediante análisis FACS, la producción local de citocinas y la actividad antifúngica de los fagocitos efectores. La evaluación cuantitativa de leucocitos sanguíneos indicó que la cantidad absoluta de neutrófilos circulantes aumentó significativamente después del tratamiento con PTX3 (no se muestran datos) . No obstante, ya que los niveles de neutrófilos en la sangre no permiten predecir la susceptibilidad a Aspergilosis (5) , se llevaron a cabo análisis citofluorométricos llevados a cabo sobre células pulmonares y del bazo. La cantidad de células CD4+, células CD8+ y neutrófilos CR-1+ aumentaron significativamente en los pulmones de ratones tratados con PTX3 (Figura 4A) . La recuperación de neutrófilos y parcialmente de células CD4+ T también se observó en el bazo. No se observó ninguna diferencia en la cantidad de células F4-80+ de pulmones o bazo con o sin tratamiento con PTX3 (Figura 4B) . Las células y linfocitos que se recuperaron probaron ser funcionalmente activas, como se indica por la producción dé citocinas proinflamatorias (IL-12) y antiinflamatorias (IL-10) en los homogenizados pulmonares y por la frecuencia de CD4+ Thl (IFN-?) y Th2 (IL-4) . La Figura 5A muestra que el tratamiento con PTX3 aumenta sustancialmente la producción de IL-12 (en aproximadamente 4 veces) ; sin embargo, la producción de IL-10 solo aumentó en la mitad (en comparación con el testigo sin tratamiento) , este es un resultado que sugiere que el PTX3 ejerce un sutil control sobre los procesos inflamatorios en el sitio de infección. Más aún, el tratamiento con PTX3 aumentó la frecuencia de células CD4+ Thl en el bazo y redujo el de las células que producen IL-4 (Figura 5B) , un descubrimiento confirmado por la evaluación de los niveles de expresión de ARNm de citocinas por medio de PCR cuantitativo. La Figura 5C muestra que tanto el tratamiento profiláctico como terapéutico con PTX3 aumenta significativamente la expresión de IFN-? y reduce el de IL-4. Al evaluar el nivel de actividad antifúngica en los fagocitos efectores, se descubrió que la actividad eliminadora de conidios de los fagocitos efectores fue mayor en los ratones tratados con PTX3 que en los ratones sin tratamiento (no se muestran datos) . Ya que los estudios in vi tro han descartado cualquier actividad directamente eliminadora de.PTX3 sobre el hongo (no se muestran datos) , estos datos califican al PTX3 como un novedoso agente con una sustancial actividad inmunorreguladora tanto en la inmunidad antifúngica innata como adaptativa. Todos los descubrimientos anteriormente mencionados nos impulsaron a evaluar si la actividad inmunorreguladora de PTX3 puede explotarse para aumentar la eficacia terapéutica de AmBisome o Fungizona, debido a que estos agentes se conocen por operar sinérgicamente con los fagocitos efectores antifúngicos (40) . Para este propósito, los ratones trasplantados con médula ósea recibieron PTX3 solo o junto con los polienos a dosis subóptimas en las que ninguno de los agentes había logrado el máximo efecto terapéutico. Los tratamientos individuales o combinados se administraron ya sea antes o después de la infección. Se monitorizó a los ratones para determinar la supervivencia, crecimiento fúngico y producción de citocinas. Se descubrió que mientras que cada agente individual administrado solo, redujo significativamente el crecimiento fúngico pulmonar, no modificó significativamente la supervivencia de los ratones, con excepción de PTX3 administrado solo antes de la infección. Sin embargo, la terapia combinada con PTX3 y AmBisome, ya sea antes o después de la infección, curó a los ratones de infección como puede juzgarse mediante el aumento de supervivencia (> 60 días) y el menor crecimiento fúngico. La administración combinada de PTX3 y Fungizona aumentó significativamente la resistencia a la infección f?ngica en comparación a Fungizona por sí sola cuando se administró después de la infección (Figura 6) . Los análisis de citocinas en los homogeneizados pulmonares y en el sobrenadante de células de bazo cultivadas y estimuladas con antígeno demostró que el PTX3 redujo en gran medida la producción de TNF-a en los pulmones de ratones que recibieron Fungizona, en comparación a los niveles observados en ratones tratados con solamente el fármaco; el nivel de producción de TNF-a como reacción al AmBisome fue menor en comparación al inducido por el tratamiento con Fungizona y no se modificó mediante el tratamiento en combinación con PTX3 (Figura 7A) . La producción de IFN-? por células del bazo aumentó significativamente en comparación a ratones sin tratamiento después de cada tratamiento individual y aumentó más en ratones tratados con PTX3 y AmBisome; a diferencia, se redujo en gran medida la producción de IL-4 tanto con el tratamiento con PTX3 y/o AmBisome como por el tratamiento combinado con PTX3 y Fungizona, aunque en menor grado (Figura 7B) . Por lo tanto, parece ser que PTX3 opera sinérgicamente con AmBisome, más que con Fungizona para reducir la respuesta inflamatoria pulmonar y promover la reactividad antifúngica de Thl. PTX3 según la presente invención indujo una respuesta curativa en ratones con AI con mínima enfermedad. Tener en cuenta que PTX3 es efectivo cuando se administra profilácticamente y que muestra una actividad no directa en células fúngicas, parece ser que el efecto benéfico depende de su habilidad para activar la resistencia protectora dependiente de Thl. El PTX3 activa al menos dos vías efectoras contra la infectividad patogénica, es decir, la vía clásica de activación del complemento en la unión de Clq (35) y la promoción de fagocitosis mediante la interacción con uno o más receptores celulares aún no identificados (20) . Es probable que la internalización de los conidios por las células mononucleares residentes pueda servir para limitar la infectividad fúngica y permitir la recuperación de las células mieloides y linfoides en el pulmón. Sin embargo, el PTX3 también activa la DC mediante la producción de IL-12 y expresión de moléculas coestimulantes en respuesta a conidios de Aspergillus (20) . Por lo tanto, la rápida manifestación de la producción de PTX3 en las DC a través de los miembros de la familia de receptores similares a Toll (TLR por sus siglas en inglés) (18) implica una función directa de PTX3 en la amplificación de la resistencia innata y en la orientación de la inmunidad adaptativa. La producción de IL-12 aumento y la de IL-10 se redujo en los pulmones de ratones infectados tratados con PTX3 como resultado que indica una respuesta inflamatoria. No obstante, la producción de TNF-a no aumentó con el tratamiento de PTX3 , lo que sugiere que PTX3 , al igual que una variedad de colectinas, puede actuar como un fino regulador del equilibrio entre el estímulo pro y antiinflamatorio (42, 48) . Según la presente invención, la eficacia terapéutica de AmBisome y Fungizona se evaluó en un modelo de infección con trasplante de médula ósea que tiene paralelismo con una profunda inmunopatología atestiguada en los receptores de trasplantes de médula ósea, donde la susceptibilidad a infecciones fúngicas invasivas está causalmente relacionada con el desarrollo de respuestas Th protectoras (15, 33) . Descubrimos que AmBisome mostró una superior actividad en comparación con Fungizona en ratones con AI después del trasplante de médula ósea. Tanto los tratamientos terapéuticos y profilácticos diarios con 5 mg/kg AmBisome curaron ratones de infección y redujeron la carga fúngica pulmonar. Con D-AmB, observamos solo una resistencia levemente mayor a la infección con la dosis tolerada más alta (por ejemplo, 4 mg/kg) que se administró después de la infección. Se ha postulado que la toxicidad de D-AmB incluyendo fiebre y temblores, es el resultado de la producción de citocinas proinflamatorias por las células inmunitarias innatas, mediante un mecanismo dependiente de TLR (43). Los macrófagos de murino y las líneas celulares humanas que expresan para TLR2 , CD14 y la proteína adaptadora MyD88 respondieron a D-AmB con la liberación de citocinas proinflamatorias, incluyendo TNF-a. Aquí hemos descubierto que la producción de TNF-a fue mayor en ratones tratados con D-AmB que en aquellos tratados con L-AmB. Sin embargo, el tratamiento combinado con PTX3 redujo en gran medida la producción de TNF-a inducida por el tratamiento con Fungizona, mientras que aumentó concomítantemente la eficacia terapéutica del fármaco como se muestra con una mayor sobreviencia y menor carga fúngica en ratones tratados con la combinación de PTX3 y D-AmB después de la infección. La terapia combinada con PTX3 también aumentó la eficacia de la dosis subóptima de AmBisome sin afectar los niveles de producción de TNF-a, en comparación con aquellos observados en el tratamiento individual. Por lo tanto, la actividad de PTX3 en la administración simultánea con agentes antifúngicos puede depender de un efecto que va más allá de la disminución de la producción de TNF-a. Con respecto a esto, se sabe que la eficacia de la quimioterapia antifúngica depende de la reactividad inmunitaria del hospedero (32) y que las diferentes formulaciones de Anfotericina B ejercen una actividad antifúngica adicional en combinación con la fagocitosis efectora contra A . fumigatus (40) . También se ha mencionado que PTX3 aumenta la fagocitosis y la actividad eliminadora de los fagocitos efectores contra conidios de Aspergillus (20) . Referencias 1. Adler-Moore, J. y R. T. Profitt. 1993. Development, characterization, efficacy, and mode of action of AmBisome, a unilamellar formulation of amphotericin B. J. Liposome Res. 3:429-450. 2. Adle-Moore, J. y R. T. Proffitt. 2002. AmBisome: liposomal formulation, structure, .mechanism of action and preclinical experience. J Antimicrob. Chemother. 49:21-30. 3. Babbin, B. A., J. N. Greene, R. Vega, S. Iravani, N. N. Ku y R. L. Sandin. 2000. 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Claims (8)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. La combinación de pentraxina PTX3 y un agente antifúngico .
2. La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente antifúngico es una Anfotericina B.
3. La combinación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque Anfotericina B está en forma de deoxicolato o en una formulación liposomal .
4. La composición farmacéutica caracterizada porque comprende la combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque contiene dosis subóptimas de agente antifúngico.
6. El uso de la combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico contra infecciones fúngicas.
7. El uso de conformidad con la reivindicación 6, donde el medicamento contiene dosis subóptimas del agente antifúngico .
8. El uso de conformidad con las reivindicaciones 6 y 7, donde la infección fúngica es aspergilosis pulmonar.
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