MXPA06010182A - Proceso para producir polipeptidos - Google Patents

Abstract

Se describe un proceso para producir un polipéptido heterólogo de E. coli en donde células E. coli que comprendenácido nucleico que codifica el polipéptido, se cultivan en un medio de cultivo mientras que se alimenta al medio de cultivo un organofosfato transportable, tal que elácido nucleico se expresa. El polipéptido después serecupera de las células.

Description

PROCESO PARA PRODUCIR POLIPEPTIDOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud provisional de patente de los E.U.A. No. de Serie 60/552,678 presentada en marzo 11, 2004, la cual solicitud provisional de patente de los E.U.A. reclama prioridad esta solicitud de acuerdo con 35 U.S.C. §119, los contenidos de la cual aquí se incorporan por referencia. 1. Campo de la Invención La invención se refiere a un proceso para producir un polipéptido heterólogo de JB. coli . Más particularmente, la invención se dirige a utilizar organofosfato para mejorar el rendimiento de estos polipéptidos . 2. Descripción de la Técnica Relacionada La expresión de proteínas heterólogas por Escherichia coli , ayudado por la bien comprendida biología molecular y facilidad relativa en manipulación genética del microorganismo, ha sido muy productiva tanto en el laboratorio como en la industria. Típicamente, un promotor inducible (por ejemplo, el promotor fosfatasa alcalina, el promotor tac, el promotor arabinosa, etc.) se emplea para regular expresión de proteína heteróloga.

El requerimiento de un evento de inducción proporciona al investigador la oportunidad por manejar la sincronización de expresión de la proteína diana. Esta habilidad es especialmente importante para aquellas proteínas heterólogas que no son bien toleradas a altas concentraciones por el anfitrión. Al lograr densidad celular deseable antes de la inducción de expresión, el rendimiento volumétrico de la proteína deseada puede llevarse al máximo . Las células dejan de crecer cuando el microorganismo se priva de un nutriente requerido. El componente limitante puede ser carbono, nitrógeno, fosfato, oxígeno o cualquiera de los elementos requeridos por las células. Bajo estas condiciones, las células salen de la fase de crecimiento. Una forma de aliviar el cultivo de las respuestas de tensión provocada por la alimentación de nutrientes, es proporcionar una alimentación del componente faltante. Alimentaciones comunes introducidas en los procesos de fermentación de alimentación por lotes, incluyen glucosa, aminoácidos, oxigeno, etc. En el caso de fósforo (P) celular, el requerimiento por suministro de fosfato no es sorprendente dado que P es el quinto elemento más abundante en una célula después de carbono, oxígeno, nitrógeno, e hidrógeno. Slanier, Adelberg and Ingraham, The Microbial World, 4a ed. (Prentice Hall, NJ 1976), p. 1357. El fósforo es un componente esencial en numerosas macromoléculas tales como ácidos nucleicos, liposacáridos y lípidos de membrana. Además, su papel en los enlaces fosfoanhídrido de alta energía lo hace especialmente importante para el metabolismo de la energía. E. coli es capaz de utilizar fosfato inorgánico (Pi) , organofosfato o fosfonato como la fuente primaria de P . La absorción de Pi del ambiente puede lograrse a través de dos sistemas transportadores, los sistemas Pit y Pst. Para los organofosfatos , la mayoría no son transportables y primero requieren ser hidrolizados enzimáticamente en el periplasma antes que el Pi liberado sea absorbido por el o los sistemas de transporte de Pi . Solo unos cuantos organofosfatos son transportables, y el glicerol-3-fosfato (G3P) es un ejemplo. G3P y glicerofosfato-1-fosfato (G1P) son conocidos como alfa-glicerofosfatos . En respuesta a limitación de Pi-y limitación de carbono, E. coli es capaz de absorber G3P intacto disponible del ambiente externo al compartimiento intracelular, en donde G3P se metaboliza para dar el fosfato o carbono requerido. Wanner, "Phosphorus Assimulation and Control of the Phosphate Regulon", in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, Neidhardt, ed. , (segunda edición) , American Society for Microbiology Press (1996), pp . 1357-1365. Adicionales referencias en G3P son Silhavy et al., J. Bacteriol., 126: 951-958 (1976) en la proteína periplásmica relacionada al sistema de transporte sn-glicerol-3-fosfato de E. coli ; Argast et al., J. Bacteriol., 136: 1070-1083 (1978) en un segundo sistema de transporte para sn-glicerol-3-fosfato en E. coli ; Elvin et al., J. Bacteriol., 161: 1054-1058 (1985) e intercambio Pi mediado por el sistema de transporte G3P dependiente de glpT; Rao et al., J. Bacteriol., 175: 74-79 (1993) en el efecto de mutaciones glpT y glpD en la expresión del gen phoA en ?. coli ; y Elashvili et al., Appl. Environ. Microbiol., 64: 2601-2608 (1998) en genes phnE y glpT que mejora la utilización de organofosfatos en E. coli K-12. Además, Vergeles et al., Eur . . Biochem. , 233: 442-447 (1995) describe la alta eficiencia de glicerol-2-fosfato (G2P) , de otra, forma conocido como beta-glicerofosfato, y G3P como aceptores nucleotidilo en esterificaciones fosfodiesterasa de veneno de víbora. La comprensión actual de los dos sistemas de transporte para la absorción de G3P exógeno en E. coli , los sistemas de transporte Ugp y GlpT ha sido bien resumida en el libro Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology editado por Neidhardt et al., (segunda edición), arriba, pp . 1364 con las referencias 13 y 81. El operón Ugp pertenece al reguión piío. Se induce por limitación de fosfato y se regula positivamente por la proteína phoB . El sistema Ugp es un sistema de transporte de múltiples componentes dependiente de proteína de enlace periplásmico, con ugpB que codifica la proteína de enlace periplásmico, ugpA y U9PC c[ue codifican proteínas de canal de membrana integral, y ugpC que codifica ATPasa. GlpT es parte del sistema glp que medía la absorción y metabolismo de glicerol, G3P, y glicerol fosforil fosfodiésteres (Lin et al., Annu. Rev. Microbiol., 30: 535-578 (1976); Capítulo 20; pg 307-342 Dissimilatory Pathways for sugars, polyols and carboxylates . Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, segunda edición) . Este sistema de transporte es un intercambiador de aniones que se conoce media el flujo de Pi del citoplasma por intercambio con G3P externo. En una cepa de tipo silvestre que crece en G3P, mientras que poco Pi se libera por células que absorben G3P mediante el sistema Ugp, Pi puede liberarse al periplasma cuando G3P se absorbe mediante el sistema GlpT. Si una cantidad represiva de Pi se libera como resultado de flujo mediado por glpT-permeasa, la actividad del reguión pho, el sistema Ugp incluido, se interrumpirá. Bajo ciertas condiciones, GlpT es la única ruta para la salida de Pi de la célula por intercambio con G3P externo. Elvin et al., J. Bacteriol., 161: 1054-1058 (1985); Rosenberg, "Phosphate transport in prokaryotes," p. 205-248. In B. P. Rosen and S. Silver (ed.), Ion Transport in Prokaryotes (Academic Press, Inc., New York, 1987) . Cuando las capacidades de los sistemas Ugp y GlpT se comparan con el G3P de transporte, las máximas velocidades de los dos sistemas son similares. La afinidad aparente para G3P es superior con el sistema Ugp que con el sistema GlpT. Igualmente, ambos sistemas serán capaces de suministrar suficiente G3P para crecimiento celular, de estar disponibles en el medio de crecimiento. Sin embargo, G3P transportado exclusivamente mediante el sistema Ugp puede servir como la única fuente solo de fosfato aunque no de carbono, mientras que G3P transportado por GlpT puede servir como la única fuente para ambos (Schweizer et al., J Bacteriol . , 150 : 1154-1163 (1982)). Los dos genes ugp se codifican el sistema de transporte G3P dependiente del reguión pho se han cartografiado (Schweizer et al., J. Bacteriol . , 150: 1164-1171 (1982)), la región ugp que contiene estos genes se ha caracterizado (Schweizer et al., Mol. and Gen. Genetics, 197: 161-168 (1984)), y la regulación del operón ugp se ha estudiado (Schweizer et al., J. Bacteriol., 163: 392-394 (1985); Kasahara et al., J. Bacteriol., 173: 549-558 (1991); Su et al., Molecular & General Genetics, 230: 28-32 (1991); Brzoska et al., "ugp-dependent transport system for sn-glycerol 3-phosphate of Escherichia coli," p. 170-177 in A. Torriani-Gorini, F. G. Rothman, S. Silver, A. Wright, and E. Yagil (ed.), Phosphate Metabolism and Cellular Regulation in Microorganisms (American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1987); Brzoska et al., J. Bacteriol., 176: 15-20 (1994); and Xavier et al., J. Bacteriol., 177: 699-704 (1995)). En cepas de tipo silvestre, existe un conjunto intracelular estable de G3P y se mantiene a aproximadamente 200 µM . En forma interna, G3P puede sintetizarse por conversión enzimática de glicerol por glicerol cinasa (codifica por glpK) a G3P cuando se desarrollan en glicerol como la única fuente de carbono, o de reducción del intermediario glicolítico, dihidroxiacetona fosfato, por G3P sintasa, el gen producto del gen gpsA, durante crecimiento en fuentes de carbono diferentes al glicerol. Ya que G3P es un intermediario importante que forma el andamio de todas las moléculas de fosfolípido, glicerol fosfatos internos también pueden generarse de la descomposición de fosfolípidos y triacil glicerol. Como un metabolito, G3P interno puede canalizarse en la ruta biosintética de fosfolípido u oxidarse por G3P de hidroxinasa para formar dihidroxiacetona fosfato y alimentarse a la ruta glicolítica. En situaciones en donde el promotor AP se emplea para regular la expresión de proteína heteróloga en E. coli , ya que ocurre inducción solo después de que el medio se agota de Pi, células inducidas para actividad promotor AP, típicamente se agotan de fosfato y en un estado declinante de salud. Puede ser que sea necesario que capten fosfato requerido para funciones celulares. Consecuencias posibles de esta captación de fosfato pueden incluir re-cambio de ribosomas, menores energéticos de células y aumentada expresión de proteasa y proteolisis (St. John and Goldberg, J. Bacteriol . , 143 : 1223-1233 (1980)), llevando potencialmente a células menos sanas con capacidad reducida para acumulación de proteínas . Mejorar el estado metabólico de E. coli puede aumentar en forma concebible la capacidad de la célula en sintetizar proteínas. Si se alimenta lentamente el fosfato, las células pueden solo detectar baja concentración de Pi en el periplasma, de esta manera induciendo al reguión pho sin privarse intracelularmente por el átomo de P (ver patente de los E.U.A. No. ,304,472) . Hay necesidad por proporcionar métodos adicionales para producir polipéptidos heterólogos en E. coli . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En la presente invención, se proporciona un proceso para mejorar la expresión de polipéptidos heterólogos en E. coli . La alimentación de organofosfato transportable tal como un alfa-glicerofosfato a diversos anfitriones de E. coli , incluyendo aquellos con y sin el gen glpT de tipo silvestre y aquellos con y sin el gen phoA de tipo silvestre, tales como por ejemplo ( ugp+ ? glpT phoA-) E. coli , se muestra que mejora la expresión de proteína heteróloga tanto en el matraz de agitación como en ia escala de fermentador de 10-L, y se espera que se desempeñen similarmente a mayor escala tal como 10,000 L. Se observó beneficio en rendimiento de producto a través de sistemas de múltiples modelos que emplean una variedad de promotores, incluyendo promotores inducibles tales como el promotor tac, T7 o AP para una expresión de las proteínas heterólogas. Una ventaja adicional es que el producto puede obtenerse antes en la fase de crecimiento activa, es decir en un tiempo más corto que de otra forma. En ciertas modalidades, puede obtenerse más producto antes en la fase de crecimiento activo para mejorar significativamente la productividad. De acuerdo con esto, la presente invención es como se reivindica. En un aspecto, la presente invención proporciona un proceso para producir un polipéptido heterólogo de E. coli que comprende: (a) cultivar células de E. coli que comprenden ácido nucleico que codifica el polipéptido en un medio de cultivo mientras que se alimenta al medio de cultivo un organofosfato transportable, tal que el ácido nucleico se expresa, y (b) recuperar el polipéptido de las células. En una modalidad preferida, el organofosfato es un glicerofosfato, más preferiblemente un alfa-glicerofosfato y/o un beta-glicerofosfato, y aún más preferible una mezcla de glicerol-2-fosfato y glicerol-3-fosfato o glicerol-3-fosfato solo. En otro aspecto preferido, el cultido se lleva a cabo en un matraz de agitación o fermentador, de preferencia un fermentador. Todavía en otra modalidad preferida, el polipéptido se recupera del citoplasma, periplasma o medio de cultivo de la células . También se prefiere que la expresión del ácido nucleico se regule por un promotor invisible tal como un promotor de fosfatasa alcalina, promotor Tac o promotor T7, y de preferencia en donde la expresión del ácido nucleico empieza mientras que está en la fase de crecimiento activo de la etapa de cultivo . En una modalidad, E. coli es de tipo silvestre. En otra modalidad, E. coli es deficiente en glpT cromosomal y phoA, pero de preferencia no es deficiente en ugp cromosonal . De preferencia, un fosfato inorgánico también está presente durante la etapa de cultivo. Sin estar limitados por ninguna teoría, se considera que en este proceso, los compuestos organofosfatos transportables se alimentan a las células tal que el suministro de fosfato no se detecte por el pstS del sistema Pho pero aún proporciona fosfato ante descomposición en el citoplasma y además la alimentación de organofosfato transportable tal como G3P enriquece potencialmente las células con un intermediario metabólico utilizable que puede alimentarse fácilmente en las rutas metabólicas importantes . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra expresión de un fragmento de anticuerpo llama fragmentado en un anfitrión BL21 de E. coli utilizando el promotor tac en un cultivo de matraz de agitación, utilizando ya sea agua o G3P 200 mM como un suplemento en medio de bajo contenido de fosfato (CRAP) o de alto contenido de fosfato (THCD) . La Figura 2 muestra expresión de un Apo2L citoplásmico en un anfitrión HMS174 de E. coli utilizando el promotor T7 en un cultivo de. matraz de agitación, utilizando ya sea agua o G3P 200 mM como suplemento en medio CRAP. La Figura 3 muestra el efecto de alimentar G3P durante la fermentación en acumulación de IGF-1 secretado con el tiempo. Esto utiliza un anfitrión E. coli de tipo silvestre, el promotor AP y glucosa alimentada continuamente . La Figura 4 muestra el efecto de una mutación lpT y alimentación de G3P durante fermentación en acumulación IGF-1 secretada con el tiempo. Este utiliza un anfitrión ? glpT E. coli , el promotor AP, y una velocidad de alimentación G3P variante. La Figura 5 muestra el diagrama de plásmido para pAPApo2-P2RU. La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc ligando Apo-2 humano (SEQ ID NO:l) y su secuencia de amino ácido derivada (SEQ ID NO: 2) . El "N" en la posición de nucleótido 447 (en SEQ ID NO:l) se emplea para indicar que la base nucleótido puede ser un "T" o "G" . La Figura 7 muestra el efecto de alimentación G3P en acumulación específica de Apo2L en el anfitrión ? glpT E. coli (43F6) , con tres velocidades de alimentación diferentes y un control sin alimentación de G3P. La Figura 8 muestra el beneficio en la acumulación total específica de Apo2L de alimentar glicerofosfato sobre fosfato inorgánico al anfitrión glpT de tipo silvestre (43E7) , en donde la densidad celular aumenta a más de 200 OD550. La Figura 9 muestra el efecto en acumulación total específica de Apo2L de reemplazo de fosfato inorgánico con glicerofosfato en el anfitrión E. coli glpT tipo silvestre (43E7) y anfitrión E. coli ? glpT (43F6) . La Figura 10 muestra el efecto en acumulación total de Apo2L de reemplazo de alfa-glicerofosfato con una mezcla 50:50 de alfa- y beta-glicerofosfato como una alimentación, contra un control sin alimentación, en un anfitrión E. coli ? glpT (61G1) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Definiciones Como se emplea aquí, "polipéptido" se refiere en generala a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez amino ácidos . Polipéptidos "heterólogos" son aquellos polipéptidos ajenos a la célula huésped que se utiliza, tales como proteína humana producida por E. coli . Mientras que el polipéptido puede ser procariótico o eucariótico, de preferencia es eucariótico, más preferiblemente mamífero y más preferiblemente humano. Ejemplos de polipéptidos mamíferos incluyen moléculas tales como por ejemplo, renina; una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humano u hormona de crecimiento bovino; factor de liberación de hormona de crecimiento; hormona paratiroide; hormona de estímulo tiroide; lipoproteínas; 1-antitripsina; cadena de insulina A; cadena de insulina B; proinsulina; trombopoyetina; hormona que estimula los folículos; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, factor de tejido y factor de von Willebrands; factores anti-coagulantes tales como Proteína C; factor naturiético atrial; surfactante pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana o activador de plasminógeno tipo tejido (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis de tumor-alfa y -beta,- anticuerpos a el o los dominios ErbB2 tales como 2C4 (WO 01/00245; hibridoma ATCC HB-12697) , que liga a una región en el dominio extracelular de ErbB2 (por ejemplo cualquiera uno o más residuos en la región de aproximadamente el residuo 22 a aproximadamente el residuo 584 de ErbB2 , inclusive); encefalinasa; substancia inhibidora muleriana; cadena relaxina A; cadena relaxina B; prorelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ; receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofina-3 , -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento de nervios tal como NGF; cardiotrofinas (factor de hipertrofia cardíaca) tales como cardiotrofina-1 (CT-1) ; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ; factor de crecimiento de fibroblastos tales como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF) ; factor de crecimiento de transformación (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF- 1, TGF- 2, TGF-3, TGF- 4, o TGF- 5; factor de crecimiento tipo insulina -I y -II (IGF-I y IGF-II); des (1-3) -IGF-I (IGF-I cerebro) ; proteínas de enlace de factor de crecimiento tipo insulina; proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductivos ; inmunotoxinas ; una proteína morfogenética de huesos (BMP) ; una interferona tal como interferona-alfa, -beta y -gamma; una albúmina de suero, tal como albúmina de suero humano (HSA) o albúmina de suero bovino (BSA) ; factores de estímulo de colonias (CSFs) , por ejemplo M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (ILs) , por ejemplo IL-1 a IL-10; anticuerpo anti-HER-2; ligando Apo2 (Apo2L) ; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana superficial; factor de aceleración de deterioro; antígenos virales tales como por ejemplo una porción del envolvente de SIDA; proteínas de transporte; receptores de asentamiento; adresinas; proteínas regulatorias; anticuerpos y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos anteriormente citados. Los polipéptidos preferidos de interés incluyen polipéptidos tales como HSA, BSA, anti-IgE, anti-CD20, anti-lgG, t-PA, gpl20, anti-CDlla, anti-CD18, 2C4, anti-VEGF, VEGF, TGF-beta, activina, inhibina, anti-HER-2, DNasa, IGF-I, IGF-II, IGF-I de cerebro, hormona de crecimiento, cadenas de relaxina, factor de liberación de hormona de crecimiento, cadenas de insulina o proinsulina, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, NGF, NT-3, BDNF, Apo2L, y urocinasa. El polipéptido más preferible es IGF-I o Apo2L. Los términos "ligando Apo2", "Apo2L" y "TRAIL" se emplean aquí en forma intercambiable para referirse a una secuencia polipéptido que incluye residuos amino ácido 114-281, inclusive, residuos 95-281, inclusive, residuos 92-281, inclusive, residuos 91-281, inclusive, residuos 41-281, inclusive, residuos 15-281, inclusive, o residuos 1-281, inclusive, de la secuencia de amino ácidos mostrada en la Figura 6 (SEQ ID NO: 2), así como fragmentos biológicamente activos, y variantes de eliminación, inserción o substitución de las secuencias anteriores. En una modalidad, la secuencia de polipéptidos comprende residuos 114-281 de la Figura 6 (SEQ ID NO: 2) . Opcionalmente, la secuencia de polipéptidos comprende los residuos 92-281 o residuos 91-281 de la Figura 6 (SEQ ID NO : 2 ) . Los polipéptidos Apo2L pueden codificarse por la secuencia de nucleótidos nativos mostrada en la Figura 6 (SEQ ID N0:1) . Opcionalmente, el codón que codifica el residuo Proll9 (Figura 6; SEQ ID NO:l) puede ser "CCT" o "CCG" . En otra modalidad preferida, los fragmentos o variantes son biológicamente activos y tienen al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de amino ácido, más preferiblemente cuando menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia y aún más preferible al menos 95% , 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, con cualquiera de las secuencias anteriores . La definición abarca variantes de substitución de ligando Apo2 , en donde al menos uno de sus amino ácidos nativos se substituye por un residuo de alanina. La definición también abarca un ligando Apo2 de secuencia nativa aislado de una fuente de ligando Apo2 o preparado por métodos recombinantes o sintéticos . El ligando Apo2 de la invención incluye los polipéptidos referidos como ligando Apo2 o TRAIL descritos en WO 97/01633, WO 97/25428 y WO 01/00832. Los términos "ligando Apo2" y "Apo2L" se emplean para referirse en general a formas del ligando Apo2 que incluyen formas monómero, dímero o trímero del polipéptido. Toda la numeración de los residuos amíno ácido referidos en la secuencia Apo2L utiliza la numeración de acuerdo con la Figura 6 (SEO ID NO: 2) a menos de que se establezca específicamente de otra forma. Por ejemplo, "D203" o "Asp203" se refieren a residuo de ácido aspártico en la posición 203 en la secuencia que se proporciona en la Figura 6 (SEQ ID NO: 2) . El término "dominio extracelular de ligando Apo-2" o "ECD de ligando Apo2" se refiere a una forma de ligando Apo2 que esencialmente está libre de dominios transmembrana y citoplásmico. De manera ordinaria, el ECD tendrá menos de 1% de estos dominios transmembrana y citoplásmico, y de preferencia tendrá menos de 0.5% de estos dominios. "Biológicamente activo" o "actividad biológica", como se refiere a Apo2L, se refiere a (a) tener la capacidad por inducir o estimular apoptosis en cuando menos un tipo de células de cáncer de mamífero o células infectadas viralmente in vivo o ex vivo; (b) capaz de elevar un anticuerpo (es decir inmunogénico) , (c) capaz de ligar y/o estimular un receptor para Apo2L; o (d) retener la actividad de un polipéptido Apo2L nativo o de origen natural . La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operativamente en un organismo anfitrión particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de enlace de ribosoma. Ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando se pone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una pre-secuencia o líder secretorio se enlaza operativamente con ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor se enlaza operativamente con una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosoma se enlaza operativamente con una secuencia de codificación si se ubica para facilitar la traducción. En general, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN enlazadas son contiguas, y en el caso de un líder secretorio, contiguas y en fase de lectura. El enlace se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, los adaptadores oligonucleótidos sintéticos o enlazadores pueden emplearse de acuerdo con la práctica convencional . Como se emplea aquí, las expresiones "células", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean en forma intercambiable y todas estas designaciones incluyen progenia. De esta manera, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y cultivos derivados de estas sin consideración al número de transferencia. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o accidentales . La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como se secreta para las células transformadas originalmente, se incluye. Cuando se pretenden distintas designaciones, será claro del contexto. El término "organofosfato" como se emplea aguí se refiere a un compuesto fosfato que contiene uno o más átomos de carbono, que también pueden contener átomos de haluro. Este compuesto fosfato debe ser tal que pueda alimentarse y utilizarse por un cultivo celular. Estos compuestos a menudo se emplean como pesticidas . Organofosfatos "transportables" pueden transportarse del ambiente externo dentro de la célula sin tener que ser pre-hidrolizados en forma alguna. Si una cepa E. coli no crece bien con un organofosfato, la utilización de este organofosfato puede mejorarse por sobre-expresión en E. coli del producto de gen phnE. Este gen confiere el fenotipo de utilización organofosfato espontáneo a la cepa E. coli ante transformación. Ver Elashvili et al., supra. Ejemplos de organofosfatos convenientes incluyen alquil halofosfatos tales como diisopropil fluorofosfato, alquil fosfatos tales como diisopropil fosfato y 3,4-dihidroxibutil-1-fosfato, así como fosfatos que contienen azúcar o alcanol, tales como hexosa-6-fosfato y glicerol-3-fosfato. Glucosa-1-fosfato, hexosa-6-fosfato y glicerofosfatos tales como glucosa-1-glicerofosfato, fructosa-6-glicerofosfato, alfa-glicerofosfatos tales como glicerol-1-fosfato y glicerol-3-fosf to y beta-glicerofosfato (glicerol-2-fosfato) se prefieren, con los glicerofosfatos que se prefieren más, y aún más se prefieren alfa- y/o beta-glicerofosfatos, y glicerol-2-fosfato y/o glicerol-3-fosfato aún se prefieren más, y una mezcla de glicerol-2- y glicerol-3-fosfato o glicerol-3-fosfato más particularmente se prefieren aquí para uso. Como se emplea aquí, el término "G3P" sin ser una mezcla o "G3P solo" se refiere a una composición que contiene al menos aproximadamente 80% de glicerol-3- fosfato; puede contener hasta aproximadamente 20% de impurezas tales como G2P. Una mezcla de G3P y G2P contendrá menos de aproximadamente 80% de G3P. Un fosfato inorgánico es un compuesto fosfato que no contiene ningún átomo de carbono, con el fosfato que típicamente está asociado con un metal alcalino o alcalino terreo tal como potasio, calcio, magnesio o sodio fosfato. "Fase de crecimiento activa" se refiere a la fase de la etapa de cultivo en donde las células están creciendo en forma activa y células no severamente limitadas en nutriente tales como aquellas que se encuentran en fase estacionaria. Modos para Llevar a Cabo la Invención La presente invención proporciona un método para producir polipéptidos heterólogos a E. coli . En este método, células de E. coli que comprenden ácido nucleico que codifica el polipéptido, se cultivan en un medio mientras que se alimenta al medio de cultivo un organofosfato transportable, tal que el ácido nucleico se exprese. El polipéptido después se recupera de las células. La recuperación puede ser de citoplasma, periplasma o medio de cultivo de las células . El cultivo puede llevarse a cabo en cualquier recipiente conveniente, de preferencia un matraz de agitación o fermentador, más preferibl mente en un fermentador. Parámetros de cultivo se emplean y puede conducirse producción de polipéptido de manera convencional, tal como aquellos procedimientos descritos a continuación. A. Selección de Ácido Nucleico y Sus Modificaciones El ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés de manera conveniente es ARN, ADNc o ADN genómico en cualquier fuente, siempre que codifique el o los polipéptidos de interés . Son bien conocidos métodos para selección del ácido nucleico apropiado para expresión de polipéptidos heterólogos (incluyendo sus variantes) en E. coli . Si se van a producir anticuerpos monoclonales, ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y secuencia utilizando.. procedimientos convencionales (por ejemplo al utilizar sondas oligonucleótido que son capaces de ligar específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de este ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transforman en las células anfitrionas bacterianas presentes para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes. Artículos de revisión en expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluye Skerra et al . , Curr. Opinión in Immunol., 5: 256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs . , 130: 151-188 (1992) . Métodos para humanizar anticuerpos no humanos se han descrito en la técnica. De preferencia, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos amino ácido introducidos en el desde una fuente que no es humana. Estos residuos amino ácido no humanos a menudo se refieren como residuos de "importación", que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332 : 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239 : 1534-1536 (1988)), al substituir regiones de secuencia hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de los E.U.A. No. 4,816,567) en donde substancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha substituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se substituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizarse al producir los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método así denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo roedor se supervisa o monitorea contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humano conocidas . La secuencia humana que es más cercana a la ' del roedor después se acepta como la región marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J.

Immunol . , 151: 2296 (1993); Chothia et al., J . Mol .

Biol . , 196 : 901 (1987) ) . Otro método utiliza una región marco particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas . El mismo marco puede emplearse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol . , 151: 2623 (1993)).

Es además importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables . Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de secuencias padre y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias padre y humanizadas . Modelos de inmunoglobulina tri-dimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos con destreza en la técnica. Están disponibles programas de computadora que ilustran y exhiben estructuras de conformación tri-dimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas selectas . La inspección de estas exhibiciones permite análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidato para ligar su antígeno. De esta manera, residuos FR pueden seleccionarse y combinarse del recipiente y secuencias de importación, de manera tal que la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad incrementada para el o los antígenos diana, se logre. En general, los residuos de región hipervariable están directa y más substancialmente involucrados en influenciar el enlace de antígeno. Diversas formas de anticuerpo humanizado o anticuerpo madurado por afinidad se contemplan. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o anticuerpo madurado por afinidad puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como Fab, que está opcionalmente conjugado con uno o más agentes diana a fin de generar un inmunoconjugado. En forma alterna, el anticuerpo humanizado o anticuerpo madurado de afinidad puede ser un anticuerpo intacto, tal como anticuerpo IgGl intacto . Fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente del cultivo de células huésped recombinante. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para la persona con destreza en la especialidad. En otras modalidades, el anticuerpo de selección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) (WO 93/16185; patentes de los E.U.A. Nos. 5,571,894 y ,587,458) . El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo como se describe en la patente de los E.U.A. No. 5,641,870. Estos fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos . Anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos epítopos diferentes . Anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden ligarse a dos epítopos diferentes de la misma proteína. Anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud íntegra, o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab')2) . Estos pueden ser como fusiones de diversas cadenas de anticuerpo o pueden ser una cadena. Una cadena pesada puede ser competente por sí misma. En un enfoque para producir anticuerpos biespecíficos, una inmunoadhesina biespecífica se prepara al introducir en una célula anfitriona secuencias de ADN que codifican una primera fusión que comprende un primer dominio de enlace fusionado con una secuencia de dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que carece de un sitio de enlace de cadena ligera; una segunda fusión comprende un segundo dominio de enlace fusionado a una secuencia de dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que retiene un sitio de enlace de cadena ligera; y una cadena ligera de inmunoglobulina, respectivamente. Las células anfitrionas después se cultivan para expresar las secuencias de ADN, para producir una mezcla de (i) un heterotrímero que comprende la primera fusión enlazada covalentemente con un segundo par de cadena ligera de inmunoglobulina-fusión; (ii) un heterotetrámero que comprende dos pares de cadenas ligeras de inmunoglobulina-segunda fusión enlazados covalentemente; y (iii) un homodímero que comprende dos moléculas enlazadas covalentemente de la primer fusión. La mezcla de productos se retira del cultivo celular y el heterotrímero se aisla de los otros productos . Este enfoque se describe en WO 94/04690. Para mayores detalles de generar anticuerpos biespecíficos ver por ejemplo Suresh et al., Methods in Enzymology, 121 : 210 (1986) . De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente de los E.U.A. No. 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede someterse a ingeniería para llevar al máximo el por ciento de heterodímeros que se recuperan de cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales amino ácido pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las cadenas laterales grandes, se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar grandes cadenas laterales de amino ácido con más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento de heterodímero sobre otros productos finales indeseados tales como homodímeros . Anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrelazados o "heterocon ugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con avidina, el otro con biotina. Estos anticuerpos por ejemplo se han propuesto para ser blanco o diana en células de sistema inmune a células indeseadas (patente de los E.U.A. No. 4,676,980), y para tratamiento de infección HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Anticuerpos heteroconjugados pueden elaborarse utilizando cualesquiera métodos de entrelazamiento convenientes. Agentes de entrelazamiento convenientes son bien conocidos en la técnica, y se describen por ejemplo en la patente de los E.U.A. No. 4,676,980, junto con una cantidad de técnicas de entrelazamiento. Técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando enlace químico. Brennan et al., Science, 229 : 81 (1985) describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente complej ante ditiol arsenito de sodio, para estabilizar ditioles vecinales y evitar formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab ' generados después se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte entonces en el Fab'-tiol al reducir con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden emplearse como agentes para la inmovilización selectiva de las enzimas . Adicionalmente, fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos (Shalaby et al., J . Exp . Med. , 175: 217-225 (1992)). Diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente del cultivo celular recombinante también se han descrito. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras leucina (Kostelny et al., J.

Immunol . , 148: 1547-1553 (1992)). Los péptidos de cremallera leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazan a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión genes . Los homodímeros de anticuerpo se reducen en la región bisagra para formar monómeros y después re- oxidan para formar los heterodímeros de anticuerpo . Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90 : 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alterno para producir fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios VH y VL de un fragmento se forzan para aparear con los dominio VL y VH complementarios de otro fragmento, de esta manera formando dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos por el uso de dímeros de cadena sencilla Fv (sFv) también se ha reportado (Gruber et al., J. I unol . , 152: 5368 (1994)). Anticuerpos con más de dos valencias se contempla. Por ejemplo, anticuerpos triespecífieos pueden prepararse (Tutt et al., J . Immunol . , 147 : 60 (1991) ) . Moléculas de ácidos nucleicos que codifican variantes de polipéptidos se preparan por una variedad de métodos conocidos en la especialidad. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia amino ácido de origen natural) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida de sitio) , mutagénesis PCR, o mutagénesis de cásete de una versión variante o no variante previamente preparada del polipéptido. Puede ser conveniente el modificar el anticuerpo de la invención con respecto a función efectora, por ejemplo para mejorar el enlace de receptor Fc . Esto puede lograrse al introducir una o más substituciones de amino ácido en una región Fc del anticuerpo. En forma alterna o adicional, pueden introducirse uno o varios residuos cisteína en la región Fc, de esta manera permitiendo formación de enlace disulfuro inter-cadena en esta región. Para aumentar la vida media útil en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de enlace receptor de reciclaje o recuperación en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la patente de los E.U.A. No. 5 ,739 ,277 , por ejemplo. Como se emplea aquí, el término "epítopo de enlace receptor de recuperación" se refiere a un epítopo de la región Fc de la molécula IgG (por ejemplo IgGl , IgG2 , IgG3 , o IgG4) que es responsable por aumentar la vida media en suero in vivo de la molécula IgG. Otras modificaciones del anticuerpo aquí se contemplan. Por ejemplo, el anticuerpo puede enlazarse a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilen glicol, polipropilen glicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilen glicol y polipropilen glicol . B. Inserción de Ácido Nucleico en un Vector Replicable El ácido nucleico heterólogo (por ejemplo ADNc o ADN genómico) se inserta de manera conveniente en un vector replicable para expresión en E. coli bajo el control de un promotor conveniente . Muchos vectores están disponibles para este propósito y la selección del vector apropiado dependerá primordialmente del tamaño del ácido nucleico a insertarse en el vector y la célula anfitriona particular a transformarse con el vector. Cada vector contiene diversos componentes que dependen de la célula anfitriona particular con la cual es compatible. Dependiendo del tipo particular de anfitrión, los componentes de vector generalmente incluyen pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. En general, vectores de plásmido que contienen secuencias de replicón y de control que se derivan de especies compatibles con la célula anfitriona, se utilizan en conexión con los anfitriones E. coli . El vector ordinariamente transporta un sitio de replicación así como secuencias de marcado que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli típicamente se transforma utilizando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (ver, por ejemplo Bolívar et al., Gene, _2:95 (1977)). pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y de esta manera proporciona fáciles medios para identificar células transformadas. El plásmido pBR322, u otra plásmido o fago bacteriano, también en general contiene, o está modificado para contener, promotores que pueden emplearse por el anfitrión E. coli para expresión de los genes marcadores seleccionables. (i) Componente de Secuencia de Señal El ADN que codifica el polipéptido de interés aquí, puede expresarse no solo directamente, sino también como una fusión con otro polipéptido, de preferencia una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión especifico en el extremo N del polipéptido maduro. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN que codifique el polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia de señal heteróloga seleccionada deberá ser aquella que se reconoce y procesa (es decir, se extiende por una peptidasa de señal) por la célula anfitriona. Para células anfitrionas procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal polipéptido nativo o eucariótico, la secuencia de señal se substituye por una secuencia de señal procariótica selecta, por ejemplo, del grupo que consiste de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o líderes de enterotoxina II termo sensibles . (ii) Origen de Componente de Replicación Vectores de expresión . que contienen una secuencia de ácido nucleico que permiten al vector replicar en uno o más células selectas anfitrionas. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias. El origen de replicación del plásmido pbr322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas tales como E. coli . (iii) Componente de Gen de Selección Vectores de expresión en general contiene un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células anfitrionas transformadas que se desarrollan en un medio de cultivo selectivo. Las células anfitrionas no transformadas con el vector que contienen el gen de selección, no sobrevivirán en el medio de cultivo. Este marcador seleccionable se separa de los marcadores genéricos como se utilizan y definen por esta invención. Géneros de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas' diferentes a aquellas provocadas por la presencia del o los marcadores genéticos, o (c) suministrando nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilos . Un ejemplo de un esquema de selección utiliza una droga para frenar el crecimiento de una célula anfitriona. En este caso, aquellas células que se transforman exitosamente con el ácido nucleico de interés producen un polipéptido que confiere resistencia a drogas y de esta manera sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de esta selección dominante de las drogas neomicina (Southern et al., J. Molec . Appl . Genet . , -. 221 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan et al., Science, 209 : 1422 (1980)), o higromicina (Sugden et al., Mol.

Cell. Biol., 5:410-413 (1985)). Los tres ejemplos dados anteriormente emplean genes bacterianos bajo control eucariótico para transportar la resistencia a la droga apropiada G418 o neomicina (geneticina) , xgpt (ácido mícofenólico) o higromicina, respectivamente. (iv) Componente Promotor El vector de expresión para producir el polipéptido de interés contiene un promotor conveniente que se reconoce por E. coli y se enlaza operativamente con el ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés . Promotores convenientes para utilizar con los anfitriones de E. coli incluyen los sistemas de beta-lactamasa y lactosa (Chang et al., Nature, 275 : 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)), el sistema promotor arabinosa (Guzman et al., J. Bacteriol . , 174 : 7716-7728 (1992)), fosfatasa alcalina, el promotor T7, un sistema promotor triptofano (trp) y (Goeddel, ?ucleic Acids Res . , 8:4057 (1980) y EP 36,776) y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. ati. Acad. Sci. USA, J50:21-25 (1983)). Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos . Sus secuencias de nucleótidos se han publicado, de esta manera permitiendo a un trabajador con destreza en ligarlos en forma operativa con ADN que codifica el polipéptido de interés (Siebenlist et al., Cell, 20 : 269 (1980)) utilizando enlazadores o adaptadores para suministrar cualesquiera sitios de restricción requeridos . De preferencia, el promotor empleado aquí es un promotor inducible, es decir, aquel que se activa por un agente de índución o condición (tal como agotamiento de fosfato periplásmico) . Estos promotores inducibles preferidos aquí son el promotor fosfatasa alcalina, el promotor tac, o el promotor T7. Promotores para utilizar en los sistemas bacterianos también en general contienen una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada operativamente con el ADN que codifica el polipéptido de interés . El promotor puede retirarse del ADN fuente bacteriana por digestión con enzima restricción e insertarse en el vector que contiene el ADN deseado. (v) Construcción y Análisis de Vectores La construcción de vectores convenientes que contienen uno o más de los componentes anteriormente citados, emplea técnicas de ligación estándar. Plásmidos aislados o fragmentos de ADN se extienden, ajustan a la medida y re-ligan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos . Para que el análisis confirme secuencias correctas en plásmidos construidos, las mezclas de ligación se emplean para transformar la cepa E. coli K12 294 (ATCC 31, 446) u otras cepas y transformantes exitosos se seleccionan por resistencia a ampicilina o tetraciclina cuando sea apropriado. Plásmidos de los transformantes se preparan, analizan por digestión de endonucleasa de restricción y/o secuención por el método de Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463- 5467 (1977) o Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981), o por el método de Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499 (1980) . C. Selección y Transformación de Células Anfitrionas Anfitriones E . coli adecuados como anfitriones padre para plásmidos de expresión aquí, incluyen E. coli W3110 (ATCC 27,325), E. coli 294 (ATCC 31, 446), E. coli B, y E. coli Xlll 6 (ATCC 31, 537) . Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes, células mutantes de cualquiera de las cepas anteriormente mencionadas también pueden emplearse como los anfitriones de partida que después se mutan adicionalmente para contener cuando menos el genotipo mínimo requerido aquí . La cepa E. coli W3110 es un anfitrión padre preferido debido a que es una cepa anfitriona común para fermentaciones de producto de ADN recombinante. Ejemplos de anfitriones E. coli de partida a utilizarse como anfitriones padre, junto con sus genotipos se incluyen en la siguiente tabla: También son adecuados los intermediarios para producir la cepa 36F8, es decir, 27B4 (Patente de los E.U.A No. 5,304,472) y 35E7 (un aislado de colonia resistente a temperatura espontánea que crece mejor que 27B4) . Una cepa adecuada adicional es la cepa E. coli que tiene la o las proteasas periplasmicas mutantes descritas en la Patente de los E.U.A No. 4,946,783 otorgada en agosto 7, 1990. En una modalidad, la célula anfitriona E. coli empleada es de tipo silvestre respecto a o con referencia al gen glpT, tal como 43E7, o es deficiente en el gen glpT, tal como 43F6 o 61G1. En otra modalidad, la célula anfitriona E. coli empleda es de tipo silvestre respecto a o con referencia al gen phoA. En una modalidad preferida, E. coli es deficiente en phoA cromosomal. En otra modalidad preferida, E. coli es deficiente en glpT cromosomal y en phoA cromosomal . En una modalidad más preferida, E. coli es deficiente en glpT cromosomal y en phoA cromosomal , pero no en ugp cromosomal . El más preferido de estos anfitriones E . coli mutantes 43F6 o 61G1, los genotipos de los cuales se dan en la tabla anterior. Como se emplea aquí, "tipo silvestre respecto a glpT" se refiere a anfitriones de E. coli que son células competentes glpT+ o glpT es decir aquellas que no son deficientes en glpT cromosomal. Similarmente, como se emplea aquí, "tipo silvestre con respecto a phoA" se refiere a anfitriones E. coli que son células competentes phoA+ o phoA es decir, que no son deficientes en phoA cromosomal . Las cepas de la invención pueden producirse por integración cromosomal de la cepa padre u otras técnicas incluyendo aquellas establecidas en los siguientes Ejemplos . El ácido nucleico que codifica el polipéptido se inserta en las células anfitrionas. De preferencia, esto se logra al transformar las células anfitrionas con los vectores de expresión anteriormente descritos y cultivar en el medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir los diversos promotores.

Medios de transformación que introducen ADN en en un organismo tal como el ADN se replican, ya sea como un elemento extracromosomal o por integrante cromosomal . Dependiendo de la célula anfitriona empleada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para estas células . El tratamiento de calicó que emplea cloruro de calcio, como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), en general se emplea para células procarióticas u otras células que contiene barreras de pared celular substancial . Otro método para transformar emplea polietilen glicol/DMSO, como se describe en Chung and Miller, Nucleic Acids Res . , 16: 3580 (1988) . Todavía otro método es el uso de la técnica denominada electroporación. D. Cultivo de las células anfitrionas Células de E. coli empleadas para producir el polipéptido de interés se cultivan en media conveniente se describe en general en Sambrook et al., supra. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y semejantes, son aquellas previamente empleadas con la célula anfitriona seleccionada para expresión y serán aparentes a la persona con destreza ordinaria en la especialidad.

Las células se cultivan mientras que el medio de cultivo se alimenta con un organofosfato transportable tal como un glicerofosfato, por ejemplo alfa-glicerofosfato y/o beta-glicerofosfato, y en especial glicerol-2-fosfato y/o glicerol-3-fosfato . El cultivo puede llevarse a cabo en un matraz de agitación o en un fermentador, de preferencia un fermentador. El polipéptido de preferencia se recupera del citoplasma, periplasma o medio cultivo de las células . En el proceso de esta invención, la expresión del ácido nucleico puede empezar en cualquier fase de la etapa de cultivo. Sin embargo, de preferencia la expresión del ácido nucleico empieza mientras que la densidad celular todavía es creciente. Esto puede elaborarse por la inducción del promotor con el inductor apropiado o la condición de inducción antes de que cese el crecimiento de la célula. La velocidad de alimentación del organofosfato en el medio de cultivo a emplearse para máxima producción del polipéptido, depende de muchos factores, incluyendo el tipo de organsfosfato, la concentración de organofosfato, el tipo de polipéptido producido, el tipo de promotor, la cepa de células anfitrionas empleadas y la densidad celular en el caldo. Si el polipéptido es IGF-I y el organofosfato es glicerol-3-fosfato pretendido para extender la duración de producción, bajo las condiciones de cultivo descritas y utilizando un proceso de 10-L, la velocidad de alimentación del organofosfato de preferencia es de aproximadamente 1 a 7 mmoles/hora para aproximadamente 8-10 litros (ver Figura 4) , más preferible de aproximadamente 1 a 6 mmoles/hora, y aun más preferible de aproximadamente 2 a 6 mmoles/hora, sin embargo más preferible de aproximadamente 2 a 5 mmoles/hora, y más preferible de aproximadamente 3 a 4 mmoles/hora. La velocidad de alimentación óptima dependende del proceso, la densidad celular, la velocidad de respiración, etc. También, en la modalidad preferida, en donde el polipéptido es Apo2L y el organofosfato es glicerol-3-fosfato que pretenden desplazar la expresión de producto para concurrir con la fase de crecimiento activa y utilizando el proceso 10-L, la velocidad de alimentación del organofosfato es de aproximadamente 4 a 17 mmoles/hora por aproximadamente 8-10 litros (ver Figura 7) , más preferiblemente de aproximadamente 6 a 16 mmoles/hora, todavía más preferible de aproximadamente 8 a 15 mmoles/hora, y en particular de aproximadamente 10 a 14 mmoles/hora. La velocidad de alimentación óptima del organofosfato requiere célula determinada para el proceso individual que se emplea para la expresión de la proteína heteróloga especifica. Cualesquiera otros ingredientes de medios necesarios además de fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico pueden ser incluidos en concentraciones apropiadas introducidos solos o como una mezcla con otro ingrediente o medio tal como una fuente de nitrógeno compleja. De preferencia, un fosfato inorgánico también esta presente en el medio cultivo al inicio de la etapa de cultivo. Si este fosfato inorgánico, de preferencia fosfato de sodio y/o potasio está presente, la proporción de fosfato inorgánico a organofosfato depende de factores tales como el tipo de polipéptido expresado y organofosfato empleado. Esta proporción puede ser cualquier proporción, como se determina fácilmente por aquellos con destreza en la técnica, en el intervalo típico de aproximadamente 1:10 (una parte de Pi a 10 partes de organofosfato) a 1:0.25.

Para ir ligando Apo2 , de preferencia este en el intervalo de aproximadamente 1:4 a 1:0.25, y más preferible de aproximadamente 1:3 a 1:0.5, y todavía más preferible de aproximadamente 1:3 a 1:1, y aun más preferible aproximadamente 1:2 a 1:1, y en particular de preferencia aproximadamente 1:1. Estas proporciones permiten una inducción previa de expresión de proteína y en algunos casos permiten que se produzca antes más producto . El pH del medio puede ser cualquier pH de aproximadamente 5-9 dependiendo primordialmente del organismo anfitrión. Si el promotor es un promotor inducible, para que ocurra la inducción, típicamente las células se cultivan hasta que se logran a cierta densidad óptica, por ejemplo, una AS50 de aproximadamente 200 para un proceso de alta densidad celular, en este punto se inicia la inducción (por ejemplo, por adición de un inductor, por agotamiento de un componente medio, etc.), para inducir expresión del gen que codifica el polipéptido de interés . Cuando se emplea el promotor de fosfatasa alcalina, células de E. coli empleadas para producir el polipéptido de interés de esta invención se cultivan en medio conveniente en sonde el promotor fosfatasa alcalina puede inducirse como se describo en general, por ejemplo, en Sambrook et al., supra . Al inicio, el medio puede contener fosfato inorgánico para el crecimiento de las bacterias en una cantidad suficientemente grande para suportar significante crecimiento celular y evitar la inducción de la síntesis de polipéptido heterólogo objetivo o diana bajo el control del promotor. Conforme las células crecen y utilizan fosfato, disminuye el nivel de fosfato inorgánico en el medio, de esta manera provocando inducción de síntesis del polipéptido cuando el fosfato inorgánico se agota. Al agregar por ejemplo, una alimentación que constituye una mezcla de G2P y G3P o una alimentación G3P, mayor crecimiento a una superior densidad celular, tal como hasta 200 OD550 o superior, se lleva a cabo en la ausencia de fosfato inorgánico o a niveles de agotamiento del fosfato inorgánico en el periplasma y soportar el cultivo, resultando en una aumento o en una extensión de acumulación de producto. E. Detección de Expresión Expresión de genes puede ser medida en una muestra directamente por ejemplo, por técnicas northern convencionales, para cuantificar la transcripción de mRNA (Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 5201 5205 (1980)), transferencia punto (análisis de ARN) o hibridización in si tu, utilizando una sonda apropidamente etiquetada, con base en la secuencia que codifica en el polipéptido. Diversas etiquetas pueden emplearse, más comúnmente radioisótopos, particularmente 32P. Sin embargo, otras técnicas también pueden emplearse, tales como utilizar nucleótidos modificados con biotina para introducción en un polinucleótido. La biotina sirve entonces como el sitio para enlace con avidina o anticuerpos, que pueden etiquetarse con un amplia variedad de etiquetas tales como radionúclidos, agentes de fluorescencia, enzimas o semejantes. En forma Alterna, pueden emplearse ensayos o geles para detección de proteína. Para secreción de un producto de gen expresado, las células anfitrionas se cultivan bajo condiciones suficientes para secreción del producto de gen. Estas condiciones incluyen, por ejemplo condiciones de temperatura, nutriente, y densidad celular que permite secreción por células. Aún más, estas condiciones son aquellas en las cuales ' la célula puede realizar las funciones celulares básicas de transcripción, traducción y paso de proteínas de un compartimiento celular a otro, como se conoce por aquellos con destreza en la técnica. F. Purificación de Polipéptidos Los siguientes procedimientos, individualmente o en combinación, son ejemplares de procedimientos de purificación convenientes con el o los métodos específicos empleados dependientes del tipo de polipéptidos : fraccionación en columnas de inmunoafinidad o intercambio de iones; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía en silice; cromatografía en una resina de intercambio de iones tal como S-SEPHAROSEMR y DEAE; cromatoenfoque ; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; y filtración de gel utilizando por ejemplo medio SEPHADEXMR G-75. Los anticuerpos monoclonales pueden separarse convenientemente del medio de cultivo por procedimientos de purificación de anticuerpo convencionales tales como por ejemplo medio de proteína A-SEPHAROSEMR, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. La invención se comprenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo no habrán de considerarse como limitantes del alcance de la invención. Todas las citas de literatura y patentes aquí se incorporan por referencia. EJEMPLO 1 Alimentación de G3P a Cultivo de Matraz de Agitación para la producción de fragmento de anticuerpo de llama (cadena pesada) y Apo2L Antecedentes : La inclusión de G3P 200 mM (concentración final) ya sea en medio de cultivo de bajo contenido de fosfato (CRAP) o alto contenido de fosfato (THCD) , se comparó con la adición de control respectivo (agua) para la expresión de una proteína heteróloga en cultivo de matraz de agitación. En la primera fase de este ejemplo, la proteína heteróloga diana es un monocuerpo camélido anti-HCG de llama 13kD. Los anticuerpos camélidos se han conocido previamente que tienen dos especies, una molécula IgG clásica que consiste de dos cadenas pesadas más dos ligeras y una molécula IgG de cadena pesada que carece de una cadena ligera referida como monocuerpos . El monocuerpo camélido se expresa por BL21, una cepa E. coli B, utilizando el promotor tac ya sea en medio de bajo contenido de fosfato (CRAP)- o alto contenido de fosfato (THCD) . La secuencia de señal de proteína para enlace malE que precede a la secuencia de codificación de fragmento de anticuerpo dirigido por la secreción de la proteína de expresión en el periplasma del anfitrión. En la segunda parte de este ejemplo, un promotor T7 se emplea para regular la expresión del ligando Apo2 en HMS174, una cepa E. coli K12 , en medio CRAP suplementado con G3P y no suplementado. La producción de proteína heteróloga en ambos experimentos se induce con la adición de IPTG al alcanzar la densidad celular de deseada. Materiales y Métodos : Construcción de plásmidos pCB36624 86.RIG: pCB36624_86.RIG se construye el modificar el vector pL1602 (Sidhu et al., J. Mol. Biol., 296:487-495 (2000)) . El vector pS1602, que tiene secuencia promotora pTac y secuencia de señal de secreción malE, contiene una secuencia de hormona de crecimiento humana fusionada al dominio C terminal de la proteína de revestimiento menor gen-3 (p3) del fago mu. La secuencia que codifica hGH se retira y la secuencia de vector resultante sirven como la estructura principal de vector para la inserción de un fragmento de ADN sintético que codifica el anticuerpo anti-HCG de llama (Spinelli et al., Nat . Struct . Biol . 3_(9) = 752-757 (1996)). El fagémido resultante (pCB36624) codifica el producto de fusión bajo el control del promotor Ptac inducido por IPTG (Ammán and Brosius, Gene, 40 : 183-190 (1985)). El polipéptido expresado incluye el péptido de señal de proteína para enlace de maltosa, seguido por la región de codificación anti-HCG, seguido por una etiqueta epítopo FLAG, seguido por un péptido enlazador rico en Gly/Ser-que contiene un codón de parada suprimible seguido por P3C (el dominio C-terminal de la proteína de revestimiento fago) . Bibliotecas de exhibición fago se consideran utilizando el método de Sidhu et al., J. Mol . Biol . , 296 : 487-495 (2000) con fagénidos de "plantilla de parada" apropiadamente designados. Para la biblioteca NNS17, un derivado de pCB36624 que contiene los codones de parada TAA en lugar de los codones 93, 94, 100 y 101, se emplea como la plantilla para el método de mutagénesis Kunkel (Kunkel et al., Methods Enzymol . , 154: 367-382 (1987)), con el oligonucleótido mutagénico NNS17 designado para reparar simultáneamente los codones de parada e introducir codones degenerados 17 NNK entre los codones que codifican Gly95 y Trpl03. NNS 17 : GCC GTC TAT ACT TGT GGT GCT GGT NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS TGG GGT CAG GGT (SEQ ID NO : 3 ) Como todos los monocuerpos, el anti-HCG llama es un miembro de familia Vh.3 y como tal se reconoce por la proteína A. La interacción de enlace de proteína A se emplea como un sustituto para la estabilidad mediada por CDR3. Las bibliotecas fago resultantes se clasificaron por múltiples rondas contra la proteína A como lectura de estabilidad de andamio y expresión. Las bibliotecas clasificadas se analizaron por derivación de selección en la distribución de aminoácidos en la biblioteca NNS. RIG de andamio, como se nombra por la secuencia en las posiciones 96, 97 y 98, resultó ser el clon más dominante con base en los residuos secuenciados. La secuencia CDR3 de 17 aminoácidos de largo para el RIG de andamio se determina por RIG SVFNLRRESWVTW (SEQ ID NO: 4) . El fagénido con RIG de andamio se renombra pCB36624_86.RIG, con la secuencia de ADN: 5 ' -GATGTTCAGT TGCAGGAATC AGGCGGTGGC TTGGTACAGG CCGGAGGTTC GTTGCGTTTG TCCTGTGCTG CCTCGGGTGC TACTGGTTCT ACTTATGATA TGGGCTGGTT TCGTCAGGCT CCGGGTAAAG AACGTGAATC GGTTGCCGCC ATTAACTGGG GGTCGGCTGG GACTTACTAT GCTTCGTCCG TCCGTGGTCG TTTTACTATT TCACGTGATA ATGCCAAAAA AACTGTCTAT TTGCAGATGA ATTCATTGAA ACCAGAAGAT ACTGCCGTCT ATACTTGTGG TGCTGGTAGG ATCGGCCGGT CGGTCTTCAA CTTGAGGAGG GAGAGCTGGG TCACGTGGTG GGGTCAGGGT ACCCAGGTCA CTGTCTCCTC TGCCGGTGGT ATGGATTATA AAGATGATGA TGATAAA-3 ' (SEQ ID NO: 5) Construcción de plásmido petl9b.nohis Utilizando técnicas de biología molecular estándar, codones Apo2L 114-281 se amplificaron por reacción de cadena polimerasa a partir de un clon Apo2L de longitud íntegra aislado de ADNc de placenta humana. Adicionales nucleótidos que contienen sitios de retención para facilitar la clonación se agregan en la secuencia 5' y 3', respectivamente. El cebador 5' oligonucleótido tiene la secuencia: 5' GCTTGCTACATATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGA 3' (SEQ ID NO: 6) que contiene el sitio de restricción Nde I subrayado. El cebador 3' oligonucleótido tiene, la secuencia: 5 ' CTTG?ATAGGATCCCTATTAGCCAACTAAAA?GGCCCCAAAA AACTGGC 3' (SEQ ID NO: 7) que contiene el sitio de restricción BamH I . El fragmento resultante se subclonó utilizando los sitios de restricción Nde I a BamH I en un vector de expresión baculovirus modificado pVL1392 (Pharmingen) en cuadro y corriente debajo de una secuencia que contiene una etiqueta HislO y un sitio de escisión enterocinasa (Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1997)). pVL13 2-Apo2L se digiere con Nde I y BamH I y el fragmento Nde 1-to-BamH I generado se subclonó en pET-19b (Novagen) , también digerido con Nde I y BamH I . El plásmido resultante se nombró petl9b.nohis . Cepas Bacterianas : Células competentes de BL21 (Stratagene) y HMS174 (Merck) se transformaron con pCB36624_86.RIG y petl9b.nohis, respectivamente utilizando procedimientos estándar. Se seleccionaron transformantes después de crecimiento en una placa LB que contiene 50 µg/mL de carbenicilina (carbenicilina LB+CARB50MR) , purificados por rayado y desarrrollaron en caldo LB con 50 µg/mL de carbenicilina CARB50MR en un incubador a 30 grados C. pCB36624_86. RIG confirió resistencia a carbenicilina al anfitrión de producción BL21/ pCB36624_86.RIG y petl9b.nohis a HMS174/petl9b .nohis, permitiendo que los anfitriones transformados crecieran en la presencia del antibiótico. Medio de Fermentación: Tanto medio de cultivo de bajo contenido de fosfato (CRAP) como medio de cultivo de alto contenido de fosfato (THCD) se emplearon para la evaluación de producción de fragmento de anticuerpo llama y ligando Apo2. La composición de medio (con las cantidades de cada componente utilizadas por litro de medio inicial) se cita a continuación: Ingrediente Medio de bajo-P04 Medio de alto-P04 Cantidad/ L cantidad/L Glucosa 5.5 g 5.5 g Sulfato de amonio 3.57 g 3.57 g Na2HP04 1.86 g Na2HP04-H20 0.93 g Citrato de sodio, 0.71 g 0.71 g Dihidrato Cloruro de 1.07 g 1.07 g Potasio Sulfato de 7 ml 7 ml Magnesio 1M Hycase SF 5.36 g Extracto de 5.36 g 5.36 g levadura Casamino ácidos 5.36 g MOPS 1M, pH 7.3 110 ml 110 ml KOH para ajuste según se requiera según se requiera de pH a pH 7.3 Para preparar 200 mM de medio suplementado con G3P, 5 ml de DL-alfa-gliceropfosfato 1 M (G3P) (Sigma Chem. Co . ) se agregan a 20 ml de medio bajo-P04 con 50 µg/ml de carbenicilina (medio de bajo-P04 + carbenicilina CARB50MR) o medio de alto-P04 con 50 µg/ml de carbencilina (medio de alto-P04 + carbenicilina CARBSO"11) antes de inoculación. Para el medio no suplementado (control) , 5 ml de agua se emplean en lugar de G3P. Fermentación en Matraz de Agitación: Fermentación en matraz de agitación se conduce en un matraz con deflector de 125-ml que contiene 25 ml de control y medio suplementado con G3P. Un cultivo durante la noche de BL2l/pCB36624_86.RIG o HMS174/petl9b .nohis desarrollado en LB + carbenicilina CARB50MR se contra-diluyó a aproximadamente 1:100 para inoculación en el control o medio suplementado con GSP. Se incubaron cultivos a 30 grados C en un agitador a 250 RPM y la expresión del producto se induce por la adición de 1 mM de IPTG cuando la densidad celular alcanzó aproximadamente 50-60% del crecimiento de células potencial soportado por el medio . Precipitados celulares de 1 ml de caldo de cultivo, tomados justo antes de la adición del inductor y aproximadamente 24 horas posterior a la inoculación, se prepararon y almacenaron a -20 grados C . Acumulación de fragmento de anticuerpo llama analizado por PAGE y Densitometría: Precipitado celular congelado (-20 grados C) preparado a partir de 1 ml de muestra de cultivo, se descongeló y resuspendió en cantidad suficiente de TRIS lOmM, pH 7.6 + EDTA 1 mM, pH 8.0 (TE) para llevar a la suspensión celular a concentración en 1 0D/25 µl . 25 µl de la suspensión de células SE TE mezclan con 25 µl de amortiguador de muestra 2X que contiene beta-mercaptoetanol . La mezcla se calentó a >95 grados C por 5 minutos antes de que se carguen 10 µl (equivalente a 0.2 OD) por pozo en gel Bis-Tris 10% premoldeado NU-PAGEMR (Novex) . Se realizó electroforésis en amortiguador MES ácido (2- (N-morfolino) etansulfónico en agua desionizada ajustado al pH apropiado tal como NaOH 1 N) . El gel resuelto se tiñe con COOMASSIE BLUE R250MR y después destiñe . La intensidad de banda del fragmento de anticuerpo 13-kD se determina utilizando soporte lógico de imagen Kodak DIGITAL SCIENCE 1DMR después de explorar el gel húmedo con el sistema de formación de imagen Kodak . Acumulación de ligando Apo2 por HPLC de fase inversa: Precipitado celular congelado (-20 grados C) preparado a partir de 1 ml de muestra de cultivo se resuspende en cantidad suficiente de amortiguador TE para llevar la suspensión celular a concentración 1 OD/25 µl, 20 µl de la suspensión celular se mezclan en 480 µl de guanidina HCl 6 M, pH 9.0 + ditiotreitol (DTT) lOOmM, y se deja que incube a temperatura ambiente por una hora antes de centrifugar a 13,000 rpm por 15 minutos para recuperar el sobrenadante/extracto. El extracto se filtra a través de un filtro de centrifugado MILLIPOREMR antes de secar-20 µl en una columna HPLC (medio PerSeptive Biosystems POROS® Rl/10) para cromatografía de fase inversa. La separación HPLC se realiza a 80 grados C con las fases móviles que fluyen a 1.0 ml/min y empleó un gradiente de 28% a 35% de acetonitrilo con TFA 0.1% sobre 20 minutos para la resolución de Apo2L lejos de las proteínas contaminantes . La detección de pico fue a longitud de onda de 280 nm. La cantidad de monómero presente en muestras se calcula utilizando un factor de respuesta promedio (mAU/µg) derivado del área bajo el pico asociada con 5-20 µg de normas purificadas analizadas por el mismo método. Resultados : La Figura 1 muestra que el anticuerpo se expresa a niveles superiores tanto en medio de alto-P04 (THCD) como bajo-P04 (CRAP) suplementado con G3P 200 mM contra el control . La Figura 2 muestra la proteína Apo2L que se expresa niveles superiores en medio de bajo-P04 (CRAP) suplementado con G3P 200 mM contra el control.

EJEMPLO 2 Alimentación de G3P a Cultivo Fermentador de 10-L de Tipo Silvestre o ( ? glpT phoA- ugp+) Anfitrión para Producción de IGF-I Regulado por Promotor de Fosfatasa Alcalina Materiales y Métodos : Plásmido pBKIGF-2B para Expresión de IGF-I: El plásmido pBKIGF-2, empleado para la expresión de IGF-I aquí, se construye como se detalla en la patente de los E.U.A. No. 5,342,763. Este plásmido se construyó a partir de una estructura principal básica de pBR322. Las secuencias de transcripción y traducción requeridas para la expresión del gen IGF-I en E. coli , se proporcionan por el promotor de fosfatasa alcalina y las secuencias trp Shine-Dalgarno. El terminador transcripcional lambda t0 se sitúa adyacente al codón de terminación IGF-I. La secreción de la proteína del citoplasma se dirige por la secuencia de señal lamB. La mayoría de rhIGF-I se encuentra en el espacio periplásmico celular. El plásmido pBKIGF-2B confiere resistencia a tetraciclina sobre el anfitrión transformado . Cepas Bacterianas y Condiciones de Crecimiento: El anfitrión empleado en la fermentación IGF-I son derivados de E. coli W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp . 1190-1219). Experimentos referentes a un anfitrión con glpT de tipo silvestre se llevaron a cabo con la cepa 43E7 (E. coli W3110 fhuA(tonA) ? (argF-lac) ptr3 degP41 ? ompT? (nmpc-fepE) ilvG+ phoA) , y experimentos referentes a un anfitrión con una mutación ? glpT se llevaron a cabo con la cepa 43F6 (E. coli W3110 fhuA(tonA) ? (argF-lac) ptr3 degP41 ? ompT? (nmpc-fepE) ilvG+ phoA ? glpT) . Células competentes de 43E7 o 43F6 se transformaron con pBKIGF-2B utilizando procedimientos estándar. Se recolectaron transformantes después de crecimiento en una placa LB que contiene 20 µg/mL de tetraciclina (LB + tetraciclina TET20MR) , purificada por rayado, y desarrollaron en caldo LB con 20 µg/mL de tetraciclina TET20MR en un agitador/incubador a 37 grados C antes de probar en el fermentador. pBKIGF-2B confiere resistencia a tetraciclina al anfitrión de producción y permite que el anfitrión transformado crezca en la presencia del antibiótico. Proceso de Fermentación de 10-L: La composición de medio de fermentación y protocolo de operación empleados para la expresión de IGF-1 fueron algo similares a aquellas empleadas en el proceso IGF-I descrito en la patente de los E.U.A. No. 5,342,763. Brevemente, un cultivo de siembra en matraz de agitación de 43E7/pBKIGF-2 o 43F6/pBKIGF-2 se empleó para inocular el medio rico de producción. La composición del medio (con las cantidades de cada componente utilizadas por litro de medio inicial) se describe a continuación: Ingrediente Cantidad/L Glucosa* 200-500 g Sulfato de amonio 2-10 g Fosfato de Sodio, Dihidrato Monobásico 1-5 g Fosfato de Potasio, Dibásico 1-5 g Citrato de Sodio, Díhidrato 0.5-5 g Cloruro de Potasio 0.5-5 g Sulfato de Magnesio, Heptahidrato 0.5-5 g PLURONICMR Polyol, L61 0.1-5 mL Cloruro Férrico, Heptahidrato 10-100 mg Sulfato de Zinc, Heptahidrato 0.1-10 mg Cloruro de Cobalto, Hexahidrato 0.1-10 mg Molibdato de Sodio, Dihidrato 0.1-10 mg Sulfato Cúprico, Pentahidrato 0.1-10 mg Ácido Bórico 0.1-10 mg Sulfato de Manganeso, Monohidrato 0.1-10 mg Ácido Clorhídrico 10-100 mg Tetraciclina 4-30 mg Extracto de Levadura* 5-25 g NZ Amine AS* 5-25 g Metionina* 0-5 g Hidróxido de Amonio según se requiera para controlar el pH Ácido Sulfúrico según se requiera para controlar el pH *Una porción de la glucosa, extracto de levadura, metionina y NZ Amine AS, se agrega al medio inicialmente con el resto que se alimenta a través de la fermentación . La fermentación de 10-litros fue un proceso de alimentación por lotes con parámetros de fermentación establecidos como sigue: Agitación: 1000 RPM Aeración: 10.0 slpm Control de pH: 7.3 Temp. : 37 grados C Contra presión: 0.3 bar Alimentación de glucosa: controlada por computadora utilizando un algoritmo para mantener la concentración de oxígeno disuelto (D02) a 30% de saturación de aire después de que D02 baja a 30%. Alimentación de nitrógeno complejo: alimentación a velocidad constante de 0.2 mL/min empezando cuando OD550 alcanza 40 y manteniendo el resto del tiempo la operación Duración de la Operación: 40 a 50 horas En experimentos que involucran alimentación de glicerol-3-fosfato (G3P) , la cantidad apropiada de solución de material G3P 1M se adicionó en la alimentación de nitrógeno complejo y la velocidad de alimentación suplementada subsecuente aumentó para suministrar la cantidad deseada de nitrógeno complejo más G3P al cultivo. El impacto de la mutación ? glpT con o sin la alimentación G3P se estimó por la diferencia en la acumulación de IGF-I. La cantidad total de IGF-I en una muestra solubilizada en guanidina 6M + DTT 100 mM, se midió por un método HPLC de fase inversa como se describe en la patente de los E.U.A. No. 6,559,122. Resultados : La Figura 3 muestra que con el anfitrión de tipo Silvestre (43E7) y promotor AP y glucosa continuamente alimentada, la cantidad de IGF-I secretado fue distintivamente superior cuando G3P se alimenta al medio que cuando G3P no se agrega.

La Figura 4 muestra que con el anfitrión ? glpT (43F6) y el promotor AP, la cantidad de IGF-I secretada fue distintivamente superior cuando G3P se alimenta al cultivo a 1.18 o 3.28 mmoles/hora, por aproximadamente 8 litros, que cuando G3P no se agregó, pero no fue superior cuando se alimentan 8.22 mmoles/hora, por aproximadamente 8 litros de G3P. La velocidad de alimentación óptima se determine fácilmente por una persona con destreza en la técnica con base en el producto, tipo de organofosfato, etc. Bajo las condiciones del proceso de fermentación descrito, cultivando en un fermentador de 10-litros para producir IGF-I, hay una velocidad de alimentación G3P óptima, por aproximadamente 8-10 litros, en el intervalo preferido de aproximadamente 1-7 mmoles/hora, más preferible aproximadamente 1-6 mmoles/hora, todavía más preferible aproximadamente 2-6 mmoles/hora, aún más preferible aproximadamente 2-5 mmoles/hora, y en especial de preferencia aproximadamente 3-4 mmoles/hora. No solo este intervalo de velocidades de alimentación aumenta la cantidad de producto sobre el control, sino también extiende la duración de producción relativa al control . EJEMPLO 3 Alimentación de Glicero-3-fosfato para Mejorar Acumulación de Ligando Apo2 en el Proceso de 10-L Antecedentes en Ligando Apo2 Ligando que induce apoptosis 2 (Apo2L) (Pitti et al., J. Biol. Chem., 271: 12687-12690 (1996)), también conocido como ligando que induce apoptosis relacionada al factor de necrosis de tumor (TRAIL) (Wiley et al . , Immunity, 3_: 673-682 (1995) ) , es una proteína de membrana tipo II y un miembro de la familia TNF de ligandos. Apo2L/TRAIL dispara la apoptosis en una amplia variedad de células de cáncer, pero no en la mayoría de las células normales, a través de enlace a sus receptores de muerte cognnato (WO 99/00423; Ashkenazi, FASEB J. , 13 : (7) A1336 (April 23, 1999); Ashkenazi, Nature Reviews - Cáncer, 2 : 420-430 (2002)). Un fragmento soluble del dominio extracelular de ligando Apo2 , correspondiente a residuos amino ácido 114-281 (de aquí en adelante referido como Apo2L/TRAIL) , actualmente está bajo investigación por estudios clínicos potenciales y se ha expresado exitosamente en E. coli . Descripción General del Proceso de Fermentación: El vector de expresión codifica para el uso del promotor de fosfatasa alcalina (?P) para regular la producción del polipéptido de aproximadamente 19.5-kDa. Los polipéptidos nacientes expresados, ante liberación de los ribosomas, se pliegan en monómeros en el citoplasma y además se asocian para volverse el homotrímero biológicamente activo. Durante fermentación, los parámetros de proceso se establecen de manera tal que las actividades celulares se conducen a máximas velocidades de absorción de oxígeno de aproximadamente 3.0 mmoles/L-min. Después de recolectar el caldo, la proteína heteróloga atrapada citoplásmicamente se libera por ruptura mecánica de las células en el lisado celular del cual pueden recuperarse . Materiales y Métodos : Construcción de Plásmido pAPApo2-P2RU: pAPApo2-P2RU se describe en WO 01/00832 publicada en enero 4, 2001. Brevemente, este plásmido del cual la construcción se ilustra en la Figura 5, codifica la co-expresión de Apo-2L (residuos amino ácido 114-281) y los tRNA's de codón raro codificado por pro2 y argU, esta co-expresión se regula por el promotor de fosfatasa alcalina. El plásmido basado en pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . , 43 : 77-90 (1978)) pAPApo2-P2RU se utiliza para producir Apo-2L en E. coli . Las secuencias de transcripción y traducción requeridas para la expresión de Apo-2L, se proporcionan por el promotor de fosfatasa alcalina y la secuencia trp Shine-Dalgarno, como se describe para el plásmido phGHl (Chang et al., Gene, 55:189-196 (1987)). La secuencia de codificación para Apo-2L (de 114-281) se ubica corriente abajo del promotor y secuencias Shine-Dalgarno y se precede por una metionina de inicio. La secuencia de codificación incluye nucleótidos (mostrada en la Figura 6) que codifica los residuos 114-281 de Apo-2L (Figura 6 - SEO ID NOS : 1 y 2, respectivamente, para secuencias de nucleótidos y amino ácido) excepto porque el residuo que codifica el codón Proll9 se cambia a "CCG" en lugar de "CCT" a fin de eliminar estructura secundaria potencial. La secuencia que codifica el terminador de transcripción lambda t0 (Scholtissek et al., Nucleic Acids Res . , 15: 3185 (1987)) sigue la secuencia de codificación Apo-2L. Adicionalmente, este plásmido también incluye secuencias para la expresión de tRNA' s pro2 (Komine et al., J. Mol. Biol., 212:579-598 (1990)) y argU/dnaY (García et al., Cell, ^5:453-459 (1986)). Estos genes se clonaron por PCR de E. coli de W3110 y colocaron corriente debajo de la secuencia de terminador de transcripción lambda t0. Este plásmido confiere tanto resistencia a tetraciclina como ampicilina ante el anfitrión de producción. Cepas Bacterianas y Condiciones de Crecimiento: La cepa 43E7 (E. coli W3110 fimA (tonA) phoA ? (argF-lac) ptr3 degP ompT ilvG+) ) se emplea como el anfitrión de producción de tipo Silvestre para comparación con 43F6, el anfitrión mutado glpT para la expresión de ligando Apo2 y los tRNA' s de codón raro.

Células competentes de 43E7 o 43F6 se prepararon y transformaron con pAPApo2-P2RU utilizando procedimientos estándar. Se seleccionaron transformantes de placas LB que contienen 20 µg/ml de tetraciclina (LB+Tet20) , purificaron por rayado y desarrollaron en caldo LB con 20 µg/ml de tetraciclina en un agitador/incubador a 30 grados C antes de almacenarse en DMSO a -80 grados C. Proceso de Fermentación para Producción de Apo2L: Un inoculo de matraz de agitación se prepara al inocular el medio LB estéril que contiene fosfato de sodio 4-6 mM con una ampolleta de cultivo de material recientemente descongelada. Se incluyeron antibióticos apropiados en el medio para proporcionar presión selectiva para asegurar retención del plásmido. Se incubaron cultivos de matraz con agitación a aproximadamente 30 grados C (28 grados C - 32 grados C) por 14-18 horas. Este cultivo después se empleó para inocular el recipiente de fermentación de producción. El volumen de inoculación fue entre 0.1% y 10% del volumen inicial del medio. Producción de Apo2L se llevó a cabo en el medio de producción dado en la Tabla 1 para lograr un volumen de cultivo final de aproximadamente 10 litros. El proceso de fermentación se realiza a aproximadamente 30 grados C (28-32 grados C) y controla el pH a aproximadamente 7.0 (6.5-7.5) . La velocidad de aeración y la velocidad de agitación se establecen para proporcionar adecuada transferencia de oxígeno al cultivo. Justo antes de agotar el fosfato en lote (a aproximadamente 75-85 OD) , una alimentación de DL-alfa-glicerofosfato (especificación de producto de distribuidor muestra pureza de producto a 80-90%, con beta-glicerofosfato citado como la impureza principal) se inició y alimentó al gasto de alimentación deseado. A través del proceso de fermentación, el cultivo celular se le alimenta glucosa como la fuente de carbono primaria con base en un algoritmo de computadora mientras que se aseguran condiciones aeróbicas . Dos adiciones por lote de aproximadamente 50-150 µM (concentración final) de ZnS04 se realizaron durante el proceso de fermentación, una justo antes de la inducción de la expresión de producto, la otra a aproximadamente el punto medio del periodo de producción para armado o ensamblado del homotrímero mejorado. En este ejemplo, las adiciones ocurrieron a una densidad óptica de cultivo de aproximadamente 80-120 OD5S0 y a aproximadamente 28 horas posteriores a inoculación. La fermentación se dejó que procediera por aproximadamente 34-45 horas antes de ser recolectada. Tabla 1 Composición de Medio de Producción para Sistema de Expresión de Promotor AP Ingrediente Cantidad/Litro Tetraciclina 4-20 mg Glucosa3 10-250 g Sulfato de Amonioa 2-8 g Fosfato de Sodio, monobásico, dihidratoa 1-5 g Fosfato de Potasio, dibásico 1-5 g Fosfato de Potasio, monobásico3 0-5 g Citrato de Sodio, dihidrato 0.5-5 g Cloruro de Potasio 0-5 g Sulfato de Magnesio, heptahidrato3 1.0-10 g Antiespumante 0-5 ml Cloruro Férrico, hexahidrato3 20-200 mg Sulfato de Zinc, heptahidrato3 0.2-20 mg Cloruro de Cobalto, hexahidrato3 0.2-20 mg Molibdato de Sodio, dihidrato3 0.2-20 mg Sulfato Cúprico, pentahidrato3 0.2-20 mg Ácido Bórico3 0.2-20 mg Sulfato de Manganeso, monohidrato3 0.2-20 mg Hidrolizado de Caseína3 5-25 g Extracto de Levadura3 5-25 g 3 Una porción de estos ingredientes, se alimenta al cultivo durante la fermentación. Se agrega hidróxido de amonio como se requiere para controlar el pH.

Evaluación de Acumulación de Producto Soluble Durante Proceso de Fermentación por Método de Cromatografía HPLC de Intercambio de Iones : Muestras de caldo se tomaron durante el curso de tiempo del proceso de fermentación. Células de 1 mililitro de muestras de caldo diluidas a una densidad celular de 20 OD550 se recolectaron por centrifugación y los precipitados celulares resultantes se almacenaron a -20 grados C hasta análisis. Los precipitados celulares se descongelaron y resuspendieron en 0.5 ml de amortiguador de extracción (HEPES 50 M, pH 8.0, EDTA 50 mM y 0.2 mg/ml de lisozima de clara de huevo gallina) y rompieron mecánicamente para liberar el producto del citoplasma. Los sólidos se retiraron de los lisados celulares por centrifugación antes que los lisados clarificados se cargaran en una columna HPLC (medio DIONEX PROPACMR IEX) para- cuantificación de trímero. El método de ensayo HPLC resuelve el producto de las proteínas E. coli contaminante por el uso de un gradiente 5%-22% de NaCl 1M en amortiguador fosfato 25-mM (pH 7.5) durante 25 minutos a un gasto de flujo de 0.5 ml/min. Evaluación de Expresión Apo2L Monomérico Total Durante el Proceso de Fermentación por Cromatografía HPLC de Fase Inversa: Caldo de cultivo fresco o muestras previamente congeladas y después descongeladas se emplearon para cuantificación de la producción de monómero total. 20 µl de muestra se mezclan en 480 µl de HCl guanidina 6M, pH 9.0 con DTT 100 mM y se deja que incuben a temperatura ambiente por una hora antes de centrifugarse a 13,000 rpm por 15 minutos para recuperar el extracto. El extracto se filtra a través de un filtro con centrifugado antes de cargarse 20 µl en una columna HPLC (medio PerSeptive Biosystems POROSMR Rl/10) para cromatografía de fase inversa. La separación de HPLC se realiza a 80 grados C con las fases móviles que fluyen a 1.0 ml/min y emplean un gradiente de 28% a 35% de acetonitrilo con TFA 0.1% durante 20 minutos para la resolución del Apo2L de las proteínas contaminantes . Detección pico fue a una longitud de 280-nm. La cantidad de monómero presente en muestras se calcula utilizando un factor de respuesta promedio (mAU/µg) derivado del área bajo el pico asociado con 5-20 µg de estándares purificados analizados por el mismo método. Resultados : La Figura 7 muestra un título de producto específico mejorado (referido como título específico en µg/OD-ml en la gráfica) con una velocidad de alimentación de G3P óptima al anfitrión ? glpT (43F6) . Todas las corridas alimentadas con G3P se desempeñaron mejor que el control sin alimentación. En este ejemplo, como la velocidad de alimentación para un cultivo de 8 litros aproximado aumentó de 6 a 12 mmoles/hora, el título de producto específico mejoró, pero conforme la velocidad aumentó sobre 12 mmoles/hora a 18 mmoles/hora, el título específico fue menor. La velocidad de alimentación óptima de G3P se determinará fácilmente por una persona con destreza en la técnica con base en el producto, tipo de organofosfato, etc. Bajo estas condiciones particulares, el cultivo de células en fermentador de 10-litros para producir este producto específico Apo2L, la velocidad de alimentación preferida de G3P, por aproximadamente 8-10 litros, de preferencia está en el intervalo de aproximadamente 4 a 17 mmoles/hora, más preferible aproximadamente 6 a 16 mmoles/hora, todavía más preferible aproximadamente 8 a 15 mmoles/hora, y más preferible aproximadamente 10 a 14 mmoles/hora. La Figura 8 muestra un título de producto específico mejorado (referido como acumulación total específica en µg/OD-ml en la gráfica) alimentando G3P sobre alimentación de fosfato inorgánico al anfitrión glpT de tipo silvestre (43E7) . Mientras que la alimentación de glicerofosfato aumenta la acumulación total específica de Apo2L, alimentar fosfato inorgánico impactó negativamente la acumulación total específica en comparación con el control sin alimentación. Tendencias similares se esperarían utilizando una alimentación menor de glicerofosfato que la que se empleó. Los resultados aquí se pretende que muestren que un alto nivel de expresión puede tenerse alimentando glicerofosfato a un anfitrión glpT de tipo silvestre. Además, en este experimento particular, similar al caso de alimentación de fosfato inorgánico, la densidad de células de cultivo aumentó a más de 200 ODS50 cuando se alimentó el glicerofosfato, pero no para la situación sin alimentación . EJEMPLO 4 Expresión de Producto Apo2L Expresado por Promotor AP Durante Fase de Crecimiento Activo La misma construcción de plásmido, cepa de anfitrión de producción, composición de medio, proceso de fermentación y métodos de ensayo de producto se emplearon como se describe en el Ejemplo 3 excepto por los lotes de fosfato y la adición de G3P. Una porción de fosfato inorgánico típicamente incluido en el lote de sal en un proceso de control se reemplazó con una cantidad equivalente de moles de G3P, ya sea agregados inmediatamente después de inoculación o unas cuantas horas antes del agotamiento de fosfato inorgánico en el lote. En estos ejemplos, el G3P agregado se espera que sea la fuente de fosfato para una fracción significante del crecimiento celular subsecuente a la adición. Proceso de Fermentación para Producción de Apo2L Durante Fase de Crecimiento Activo: El protocolo de preparación de inoculo fue el mismo que el descrito en el Ejemplo 3. La producción de Apo2L se lleva a cabo en el medio de producción dado en la Tabla 1 excepto porque cualquiera de 75% o 50% de las sales fosfato se eliminan del lote inicial y reemplazan con un número equivalente de moles de G3P agregado de nuevo como una post-inoculación de adición de lote. La fermentación se realiza a aproximadamente 30 grados C (28-32 grados C) y el pH se controla a aproximadamente 7.0 (6.5-7.5) de acuerdo con protocolo estándar. La velocidad de aeración y la velocidad de agitación fueron como se describe en el Ejemplo 3. Para el caso en donde 50% del fosfato inorgánico se reemplaza con G3P, el fosfato inorgánico se formó en lotes antes de esterilización al medio mientras que el reemplazo de glicerol-3-fosfato se realiza aproximadamente 1-2 horas antes del fosfato de lotes se esperaba que se agotara (a aproximadamente 30-40 ODS50) . Para el caso en donde 75% del fosfato inorgánico se reemplaza con G3P, tanto el fosfato inorgánico como G3P se agregaron inmediatamente después de la inoculación del fermentador. A través del proceso de fermentación, al cultivo celular se alimenta a glucosa como la fuente de carbono primaria con base en un algoritmo de computadora mientras que asegura condiciones aeróbicas . Adiciones de Zn se realizaron durante el proceso de fermentación como se describe en la sección previa. La fermentación se dejó que procediera por aproximadamente 34-45 horas. Resultados : La Figura 9 muestra la inducción de expresión de proteína heteróloga que ocurre significativamente con anterioridad en la fase de crecimiento activo cuando 50% - 75% de lotes de P04 se reemplazan con la adición G3P tanto para los anfitriones de tipo silvestre como mutados con glpT, desplazando la curva de acumulación total específica a la izquierda para el caso de control duplicado que se realiza con el anfitrión de tipo silvestre sin substitución de G3P. Esto indica la ventaja de esta invención en que el producto puede obtenerse previo durante el proceso de fermentación. Mientras que todas las proporciones de Pi a G3P probadas aquí lograron esta ventaja independientemente del tipo de anfitrión, la Tabla 2 muestra que utilizando una proporción 1:1 o 1:3 de Pi a G3P para el anfitrión mutado con glpT 43F6, produce la velocidad de productividad de Apo2L volumétrica más alta (un promedio de aproximadamente 0.34 contra un promedio de aproximadamente 0.24 mg/ml-hr para el anfitrión de control) . Además, utilizando ya sea la proporción y el anfitrión de tipo silvestre o mutado se logra la acumulación específica pico (en µg/OD-ml) previamente (22 a 26 horas contra 28 a 30 horas) . Esto muestra que en ciertas modalidades preferidas, la invención puede lograr cantidades similares si no superiores de Apo2L monomérico en aproximadamente 10% a 25% menos de tiempo de fermentación que de otra forma para mejorar significativamente la productividad del proceso. Tabla 2 Efecto de Reemplazar Lotes Iniciales de Fosfato Inorgánicos con Adición de Glicerofosfato Durante las Primeras 30 Horas de Fermentación Experimento Velocidad Tiempo para Rendimiento de alcanzar pico de Apo2L total producción de pico Monomérica acumulación (g (mg/ml -hr) (µg/OD-ml) /L) Control 0.27 28 2.9 (43E7) Experimento Velocidad Tiempo para Rendimiento de alcanzar pico de Apo2L total producción de pico Monomérica acumulación (g (mg/ml -hr) (µg/OD-ml ) /L) Control 0.21 30 2.8 (43E7) P1/G3P @ 0.34 22.5 3.3 1:1 (43F6) (50% de reemplazo) P1/G3P @ 0.25 22 2.0 1:1 (43E7) (50% de reemplazo) P1/G3P @ 0.34 26.0 3.0 1:3 (43F6) (75% de reemplazo) EJEMPLO 5 Expresión de Producto Apo2L Desplazado por Promotor AP Utilizando una Mezcla 50/50 de Alfa- y Beta- Glicerofosfato Un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 3 se siguió excepto por un grado más barato de mezcla aproximadamente 50:50 de alfa- y beta-glicerofosfato se empleó en lugar de G3P como la alimentación utilizando la cepa 61G1 (anfitrión mutante glpT) . Resultados La Figura 10 muestra que mejora en rendimiento similar frente a un control sin alimentación se obtiene utilizando la mezcla de material G3P de grado superior. El uso de la mezcla alfa/beta reducirá el costo de materia prima, sin comprometer los resultados de producción.

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES 1. Proceso para producir un polipéptido heterólogo de E. coli , comprende (a) cultivar células de E. coli que comprende ácido nucleico que codifica el polipéptido en un medio de cultivo mientras que se alimenta al medio de cultivo un organofosfato transportable, tal que se exprese el ácido nucleico, y (b) recuperar el polipéptido de las células.
2. 2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el organofosfato es un glicerofosfato .
3. 3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el glicerofosfato es una alfa-glicerofosfato o beta-glicerofosfato, o una mezcla de los mismos .
4. 4. El proceso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el glicerofosfato es una mezcla de glicerol-2-fosfato y glicerol-3-fosfato o es glicerol-3-fosfato .
5. 5. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el cultivo se lleva a cabo en un matraz de agitación o fermentador.
6. 6. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el polipéptido se recupera del citoplasma, periplasma o medio de cultivo de las células.
7. 7. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la expresión del ácido nucleico se regula por un promotor inducible .
8. 8. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el promotor inducible es el promotor fosfatasa alcalina,
9. 9. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el promotor inducible es el promotor tac.
10. 10. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el promotor inducible es el promotor T7.
11. 11. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-10, caracterizado porque la expresión del ácido nucleico empieza mientras que está en la fase de crecimiento activo de la etapa de cultivo.
12. 12. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque E. coli es deficiente en phoA cromosomal .
13. 13. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque E. coli es tipo silvestre respecto a glpT cromosomal .
14. 14. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque E. coli es deficiente en glpT cromosomal .
15. 15. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque E. coli es deficiente en phoA cromosomal y glpT.
16. 16 . El proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque E. coli no es deficiente en ugp cromosomal.
17. 17. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque el polipéptido es polipéptido eucariótico.
18. 18. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido de mamífero.
19. 19. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque el polipéptido es un factor de crecimiento tipo insulina-1.
20. 20. El proceso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la velocidad de alimentación del organofosfato es de aproximadamente 1 a 7 mmoles/hora por aproximadamente 8-10 litros y el cultivo se lleva a cabo en un fermentador de 10-litros.
21. 21. El proceso de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la velocidad de alimentación del organofosfato es de aproximadamente 2 a 6 mmoles/hora por aproximadamente 8-10 litros.
22. 22. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la velocidad de alimentación del organofosfato es de aproximadamente 3 a 4 mmoles/hora por aproximadamente 8-10 litros.
23. 23. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque el polipéptido es Apo2L.
24. 24. El proceso de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la velocidad de alimentación del organofosfato es de aproximadamente 4 a 17 mmoles/hora por aproximadamente 8-10 litros y el cultivo se lleva a cabo en un fermentador de 10-litros.
25. 25. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el gasto de alimentación es de aproximadamente 6 a 16 mmoles/hora por aproximadamente 8-10 litros.
26. 26. El proceso de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el gasto de alimentación es de aproximadamente 8 a 15 mmoles/hora por aproximadamente 8-10 litros.
27. 27. El proceso de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el gasto de alimentación es de aproximadamente 10 a 14 mmoles/hora por aproximadamente 8-10 litros.
28. 28. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27, caracterizado porque también está presente un fosfato inorgánico durante la etapa de cultivo.
29. 29. El proceso de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la proporción de fosfato inorgánico a organofosfato está en el intervalo de aproximadamente 1:10 a 1:0.25. *
30. 30. El proceso de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el polipéptido es Apo2L y la proporción es de aproximadamente 1:3 a 1:0.5.
31. 31. El proceso de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la proporción es aproximadamente 1:1.