MXPA06009361A - Enzimas desaturasa - Google Patents

Abstract

Se describen células transgénicas transformadas con moléculas deácido nucleico que codifican enzimas con actividad de desaturasa y el uso de estas células y enzimas en la biocatálisis.

Description

ENZIMAS DESATURASA MEMORIA DESCRIPTIVA La invención se refiere a células transgénicas transformadas con moléculas de ácido nucleico que codifican para enzimas con actividad desaturasa y el uso de estas células y enzimas en biocatálisis. Las desaturasas son enzimas implicadas en la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA, por sus siglas en inglés). Los PUFA son ácidos grasos (FA) que son esenciales para el funcionamiento normal de una célula y sus propiedades nutricionales son bien conocidas. Un ejemplo de un PUFA es ácido docosahexanoico (DHA). El DHA es un ácido graso n-3 que puede obtenerse directamente de la dieta o derivarse del metabolismo de ácido linoleico y a-linolénico alimenticio. Los ácidos grasos n-3 se relacionan con las propiedades promotoras de la salud. Por ejemplo, los ácidos grasos n-3 han sido descritos como anti-inflamatorios, antitrombóticos, antiarrítmicos, hipolipidémicos y vasodilatadores. Como tal, el papel de DHA en la prevención y/o tratamiento de enfermedades tal como enfermedad coronaria del corazón, hipertensión, diabetes tipo II, enfermedades oculares, artritis, fibrosis cística y esquizofrenia han sido el foco de mucha de la investigación médica. La producción de PUFA implica una serie consecutiva de desaturaciones y alargamientos de la cadena acilo graso para generar ácido araquidónico (20:4?5,8,11 ,14) y ácido decosahexaenoico (22:6?4,7,10,13,16,19). Varias desaturasas implicadas en este procedimiento metabólico han sido aisladas de microalgas marinas, incluyendo Phaeodactylum tricornutum [5], Euglena gracilis [6] y Pavlova lutherí [7]. Estas desaturasas unidas a membrana son específicas con respecto a la longitud de cadena del substrato y las posiciones de doble enlace en el ácido graso. Estas pertenecen a la clase conocida como desaturasas de ácido graso front-end debido al hecho de que introducen dobles enlaces entre el grupo carboxi y los enlaces preexistentes del ácido graso [1]. Estas desaturasas contienen un dominio de citocromo bd en su N-terminal y tres motivos de histidina que son importantes para actividad catalítica [10]. Las enzimas desaturasa y los genes que las codifican son conocidos en la técnica. Por ejemplo, WO03/064596 describe, entre otras cosas, células transgénicas transformadas con moléculas de ácido nucleico omega 3 y delta 12 desaturasa y el uso de estas células en la producción de ácidos grasos. En particular el uso de la omega 3 desaturasa en la conversión de ácido araquidónico a ácido eicosapentaenoico y el uso de la delta 12 desaturasa en la conversión de ácido oleico a ácido linoleico. WO03/099216 también describe desaturasas de hongos y en particular plantas transgénicas modificadas para expresar enzimas delta 15 desaturasa de hongos. Además, US2003/0157144 y US2003/0167525 describe genes delta 5 y delta 6 desaturasa en la conversión de ácido dihomoilinolénico a ácido araquidónico o ácido linoleico a ácido ?-linolénico respectivamente.

Además, US2003/134400 describe genes delta 4 desaturasa que están implicados en la conversión de ácido adrénico a ácido ?6-docosapentaenoico y en la conversión de ácido ?3-docosapentaenoico a ácido docosahexaenoico. Estos ácidos grasos raros se utilizan en composiciones farmacéuticas y cosméticas y pueden ser ácidos grasos nutricionales esenciales. Además, de los FA 16:0, 16:1?9, 18:0 y 18:1?9 comunes encontrados en la mayoría de los organismos vivos, cantidades traza de ácidos grasos más inusuales pueden encontrarse en una amplia gama de especies. Por ejemplo, la presencia de 16:1?11 se ha reportado en varias especies de Pavlova, en Eustigmatophyte Nannochloropsis oculata, y en las diatomeas Phaeodactylum tricornutum y Thalassiosira pseudonana [11 , 12, 13]. Este FA representa una muy pequeña porción de los FA totales en estas microalgas, y su papel específico en las células de algas es desconocido. Sin embargo, este FA es un precursor muy importante en la síntesis de feromonas sexuales en insectos. Las feromonas sexuales son mezclas específicas de especies de derivados de ácidos grasaos insaturados (UFA) que difieren en el grupo funcional terminal y en el número, posición y configuración (Z o E) del doble enlace, que se producen por varias acil-CoA desaturasas [14,15]. Simples UFA ?11 de monoene son los precursores más prevalentes en la formación de componentes de feromona sexual principal en Lepidoptera moderna [16,17]. Por ejemplo, en gusano del maíz Helicoverpa zea, que produce una mezcla de feromona de Z11-16:Ald y Z9-16:Ald en una relación :1 , el trascrito codificador de desaturasa más abundante es HzeaLPAQ (también llamado HzPGDsl) que codifica para una ?11 -desaturasa que no posee una extensión del citocromo 65, y por lo tanto requiere un citocromo 65 libre para actividad. Muchas acil-CoA ?11 -desaturasas con diferentes especificidades se han aislado de insectos [14,15], pero ninguna de otras especies. Se ha descrito la primera caracterización de un citocromo 65 desaturasa, que presenta actividad ?11 -desaturasa. De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una célula transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico cuya molécula de ácido nucleico consiste en secuencias como se representa en las figuras 5A, 5B, 6Aa, 6C, 7A, 8A, 8B, 9A, 10A, 11 A, 11 B, 11 D o moléculas de ácido nucleico que hibridan estas secuencias, en donde dichas moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido que tiene actividad desaturasa. En una modalidad preferida de la invención estas condiciones de hibridación son condiciones de hibridación estrictas. En una modalidad preferida de la invención dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos una homología al 30% con la secuencia de ácido nucleico representada en las figuras 5A, 5B, 6A, 6C, 7A, 8A, 8B, 9A, 10A, 11 A, 11 B, 11 D. Preferiblemente dicha homología tiene al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o al menos 99% de identidad con la secuencia de ácido nucleico representada en las figuras 5A, 5B, 6A, 7A, 8A, 8B, 9A, 10A, 11 A, 11 B y que codifica para un polipéptido que tiene actividad desaturasa. Las secuencias de ácidos nucleicos desaturasa pueden modificarse para producir enzimas variadas con expresión mejorada en células. Por ejemplo, la adición de un codón que codifica para un aminoácido de alanina puede facilitar la expresión recombinante en sistemas microbianos por ejemplo, levadura. Estas modificaciones pueden no requerirse en todos los sistemas de expresión pero algunas veces son deseables. En una modalidad preferida de la invención dicha molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico como se representa en las figuras 5A, 5B, 6A, 6C, 7A, 8A, 8B, 9A, 10A, 11 A, 11 B, 11 D. Preferiblemente, dicha molécula de ácido nucleico consiste en la secuencia de ácido nucleico como se representa en las figuras 5a, 5b, 6a, 7a, 8a, 8b, 9a, 10a, 11a, 11b. En una modalidad preferida adicional de la invención dicha célula sobre-expresa dicha desaturasa codificada por dicha molécula de ácido nucleico. En una modalidad preferida de la invención dicha sobre-expresión es al menos 2 veces superior cuando se compara con una célula de referencia no transformada de la misma especie. Preferiblemente dicha sobre-expresión es: al menos 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces o al menos 10-veces cuando se compara con una célula de referencia no transformada de la misma especie. En una modalidad preferida de la invención dicha molécula de ácido nucleico es ADNc. En incluso una modalidad preferida adicional de la invención dicha molécula de ácido nucleico es un ADN genómico. En una modalidad preferida de la invención dicha célula transgénica se transfecta con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico como se representa por la figura 10A y que codifica para un polipéptido desaturasa en donde dicho polipéptido tiene una actividad ?11 -desaturasa, o una molécula de ácido nucleico que se híbrida a la molécula de ácido nucleico en la figura 10A y codifica para un polipéptido con actividad ?11 -desaturasa. En una modalidad alternativa preferida de la ¡nvención dicha célula transgénica se transfecta con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico como se representa por la figura 8A y que codifica para un polipéptido desaturasa en donde dicho polipéptido tiene una actividad ?6-desaturasa, o una molécula de ácido nucleico que se híbrida a la molécula de ácido nucleico en la figura 8A y que codifica para un polipéptido con actividad ?6-desaturasa. En una modalidad preferida de la invención dicha célula transgénica es una célula eucariótica.

En una modalidad preferida alternativa de la ¡nvención dicha célula es una célula procariótica. En una modalidad preferida adicional de la invención dicha célula eucariótica es una célula vegetal. Las plantas que incluyen una célula vegetal de conformidad con la invención también se proporcionan como semillas producidas por dichas plantas. En una modalidad preferida de la ¡nvención dicha planta se selecciona de: maíz (Zea mays), cañóla (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), lino (Linum usitatissimum), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cerale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annus), trigo (Tritium aestivum), soya (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), cacahuate (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), papa dulce (lopmoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucífera), pina (Anana comosus), naranjo (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia senensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Fícus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangífer indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), nuez de macadamla (Macadamia intergrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha de azúcar (Beta vulgaris), avena, cebada, verduras y ornamentales.

Preferiblemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, cereales y alubias, maíz, trigo, papa, tapioca, arroz, sorgo, mijo, mandioca, cebada, guisante), y otras raíces, tubérculos o cultivo que se destina a la cosecha. Los cultivos que se destianan a la cosecha importantes son colza, remolacha de azúcar, maíz, girasol, soya, sorgo, y lino (linaza). Las plantas horticulturales a las cuales la presente invención puede aplicarse pueden incluir lechuga, endivia, y brassicas vegetales incluyendo col, brócoli y coliflor. La presente ¡nvención puede aplicarse a tabaco, cucúrbita, zanahoria, fresa, girasol, tomate pimienta. Las plantas de grano que proporcionan semillas de interés ¡ncluyen plantas oleaginosas y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de grano tal como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas oleaginosas ¡ncluyen algodón, soya, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen habas y guisantes. Las habas ¡ncluyen guar, algarrobilla, fenogreco, soya, fríjol, caupi, frijol mungo, haba de lima, frijo fava, lentejas, garbanzo, etc. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona una semilla que comprende una célula vegetal de conformidad con la ¡nvención. Preferiblemente dicha semilla es de una planta oleaginosa. De acuerdo con aún un aspecto adicional de la invención se proporciona un recipiente de reacción que comprende por lo menos un polipéptido de conformidad con la invención, substratos de ácido graso y co- factores en donde dicho recipiente se adapta para desaturación de dichos substratos de ácido graso. En una modalidad preferida de la invención dicho polipéptido se expresa por una célula de conformidad con la invención. Preferiblemente dicha célula es una célula eucariótica, por ejemplo una célula de levadura. En una modalidad preferida alternativa de la ¡nvención dicha célula es una célula procariótica. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para desaturar un substrato de ácido graso que comprende los pasos de: i) proporcionar un recipiente de reacción de conformidad con la invención; y ¡i) hacer crecer dichas células contenidas en dicho recipiente de reacción bajo condiciones que permitan la desaturación de por lo menos un substrato de ácido graso. Una modalidad de la invención ahora se describirá por ejemplo únicamente y con referencia a los siguientes cuadros y figuras: El cuadro 1 ilustra la composición de ácidos grasos principales en T. pseudonana; CUADRO 1 Ácido Graso % molar de ácidos grasos totales 14:0 11.50 16:0 17.95 16:1?9 19.81 16:1?11 0.19 16:2?9,12 2.47 16:3?6,9,12 6.68 18:0 0.47 18:1?7 0.26 18:1?9 1.50 18:1?11 1.52 18:2?9,12 2.37 18:3?6,9,12 0.98 18:3?9,12,15 0.32 18:4?6,9,12,15 5.72 20:0 0.44 20:3?8,11 ,14 0.26 20:4?5,8,11 ,14 2.46 20:5?5,8,11 , 14,17 17.51 20:6?4,7,10,13,16,19 6.64 24:0 0.49 El cuadro 2 ¡lustra los ácidos grasos principales de los transformantes de levadura pYES y pYDESN con y sin adición de ácidos grasos saturados exógenos.

CUADRO 2 Acido % Molar de esteres de metilo de ácido graso total graso - substrato + 14:0 +16:0 +18:0 pYES2 pYDESN pYES2 pYDESN pYES2 pYDESN pYES2 pYDESN 14:0 0.78 0.52 1.12 0.96 0.76 0.58 0.76 0.70 14:1?9 0.22 0.13 1.20 1.29 0.23 0.14 0.23 0.20 16:0 18.40 15.04 18.37 14.62 28.35 22.09 17.22 15.09 16: 1?9 39.73 35.55 43.39 36.24 42.24 37.03 36.24 31.67 16: 1?1 0.23 3.27 2.36 5.84 0.22 5.57 0.25 5.84 1 18:0 7.37 7.34 6.61 7.23 6.36 6.60 16.72 17.47 18: 1?9 30.19 34.32 24.44 30.24 23.89 25.19 26.07 26.58 181?1 1.20 1.21 1.35 1.30 1.19 1.12 1.08 0.96 1 26:0 1.89 2.63 1.16 2.29 1.26 1.70 1.43 1.50 El cuadro 3 ilustra la actividad ?6 desaturasa de TpDESI en comparación con una Phaeodactylum tricornutum desaturasa homologa.

CUADRO 3 6: 1?9 = 16:1 n-7 16: 2?6.9 = 16:2n-7 18:1?9 = 18:1 n-9 18: 2?6.9 = 18:2n-9 8: 2?9.12 = 18:2n-6 18:3?6.9.12=18:3n-6 18:3?9.12.15 = 18:3n-3 8:4?6.9.12.15 = 18:4n-3 Las figuras 1A a 1 C ilustran la secuencias de proteína predichas con homología a desaturasas front-end derivadas del borrador de genoma T. psudonana. Las alineaciones de secuencia de 12 T. psudonana desaturasas; putativas con otras enzimas desaturasa front-end funcionalmente caracterizadas identificaron tres bloques principales de homología que representan los dominios funcionales de la acil desaturasas front-end (A). El recuadro con sombra más oscura destaca el dominio de unión a hemo del citocromo 65 y el recuadro sombreado indica tres cajas de histidina. Véase Material and Methods para número de acceso Genbank y especies fuente de las enzimas funcionalmente caracterizadas. Un árbol filogenético de nueve 7". pseudonana desaturasas con otras enzimas se construyó (B). Al remover las regiones que contienen espacios (región de alineación ambigua), se creó un conjunto de datos a partir de una alineación originalmente hecha con clustalX. El árbol se construyó a partir del conjunto de datos utilizando un paquete de software Phylip3.5c y los análisis de remuestreo se llevaron a cabo con 1000 replicas. Únicamente nodos bien soportados (sobre 70%) se indicaron con valores remuestreados. Todas las ramificaciones se trazan a escala como se indica por la barra de escala (=0.1 sustituciones/sitio). La secuencia TpDESN es 477 aminoácidos de largo (C). El dominio de unión a hemo del citrocromo 65 se encuentra en un fondo sombreado y se estructuran los tres recuadros de histidina. Las figuras 2A y 2B ilustran el análisis de expresión RT-PCR de TpdesN. Las células se cosechan en diferentes etapas de crecimiento para una extracción total de ARN y síntesis de ADNc (A). Se realizó un PCR en ADNc derivado de ARN transcrito inverso utilizando pares de iniciadores específicos de ARNr 18s y TpdesN (B).Se llevó a cabo un PCR en diluciones en serie no diluidas (campo 1 ) y de cinco veces (campo 2-4) de cada ADNc. El gen ARNr 18S se utilizó como un control de síntesis de ADNc. EE: fase exponencial temprana, LE: fase exponencial tardía, ES: fase estacionaria temprana; Las figuras 3A y 3B ¡lustran un análisis de GC de FAME de levadura transformada con el plásmido pYES2 vacío o el plásmido que contiene TpDESN. La cepa de levadura Invsd transformada con pYES2 (A) o pYDESN (B) se indujeron durante 3 días a 20°C sin suplementación antes de tomar muestras para los análisis de ácido graso. I. S. estándar interno I. S. (17:0). El experimento se repitió tres veces y se muestran los resultados de un experimento representativo; Las figuras 4A y 4B ilustran espectros de masa de aductos DMDS FAME de levadura transformada de pYDESN. El espectro de masa del aducto DMDS de 161?9 FAME, presente en todas las muestras de levadura (A). El espectro de masa del aducto DMDS de 16:1?11 FAME, que únicamente se encontró en levadura transformada con pYDESN (B). Esteres picolinílicos con espectros característicos de 16:1?11 también se identificaron en estas muestras (ios datos no se muestran); y La figura 5A es la secuencia de ácido nucleico geonómico de la desaturasa A de T. pseudonana; La figura 5B es la secuencia de ADNc desaturasa A; figura 5C secuencia de aminoácido; La figura 6A es la secuencia de ácido nucleico geonómico de desaturasa B de Thalassiosira pseudonana; la figura 6B es la secuencia de aminoácido parcial; la figura 6C és la secuencia de ADNc de desaturasa B; y la figura 6D es la secuencia de aminoácido de dicha secuencia de ADNc. La figura 7A es la secuencia de ácido nucleico de desaturasa E de Thalassiosira pseudonana; la figura 7B es la secuencia de aminoácido; La figura 8A es la secuencia de ácido nucleico de desaturasa I de Thalassiosira pseudonana; la figura 8B es la secuencia de ADNc y la figura 8C es a secuencia de aminoácido La figura 9A es la secuencia de ácido nucleico de desaturasa K de Thalassiosira pseudonana; la figura 9B es la secuencia de aminoácido; La figura 10A es la secuencia de ácido nucleico de desaturasa N de Thalassiosira pseudonana; La figura 11A es la secuencia de ácido nucleico de desaturasa O de Thalassiosira pseudonana; la figura 11B es la secuencia de ADNc; la figura 11 C es la secuencia de aminoácido; la figura 11 D es la secuencia de ácido nucleico de la secuencia variante de desaturasa O de Thalassiosira pseudonana; y la figura 11 E es la secuencia de aminoácido de dicha desaturasa O variante; La figura 12A y 12B es un análisis de GC de FAME de la levadura que expresa TpDESI con substratos exógenos 18:2?9,12 (A) y 18:3?9,12, 15 (B). Nuevos FA producidos de substratos endógenos y exógenos se recalcan; la figura 12C es un análisis de GC de FAME de levadura transformada con un control de solamente vector en comparación con la levadura transformada con TpDESI; La figura 13 es una ilustración de trayectorias de síntesis de ácido graso y La figura 14 es un análisis de GC de FAME de una levadura que expresa TpDESO.

Materiales y métodos Identificación de secuencias de codificación de desaturasa de Thalassiosira pseudonana putativa y análisis fiiogenético con otras desaturasas funcionalmente caracterizadas El genoma borrador de la diatomea T. pseudonana se ha secuenciado aproximadamente nueve veces mediante todo el método dirigido de genoma. Los datos de secuencia se produjeron por el US Department of Energy Joint Genome Institute (http://www.igi.doe.gov/) y los datos de secuencia brutos se descargaron e instalaron en un servidor local. Las investigaciones de tbiastn en lote se llevaron a cabo utilizando secuencias de proteína de las siguientes 13 desaturasas conocidas como consulta, incluyendo PIDESI (AY332747, Pavlova lutherí), TFAD4 (AF489589, Thraustochytrium sp. ATCC 21685), TFAD5 (AF489588, Thraustochytrium sp. ATCC 21685), PtDELd (AY082392, Phaeodactylum tricornutum), PtDEL6 (AY082393, Phaeodactylum tricornutum), EgDEL8 (AF139720, Euglena gracilis), EgDEL4 (AY278558, Euglena gracilis), ZfDEL5 (AF309556, Danio rerio), B0DEL6 (U79010, Borago officinalis), HsDELd (AF084558, Homo sapiens), HsDEL6 (AF084559, Homo sapiens), CeDEL6 (AF031477, Caenorhabditis elegans) y CeDEL5 (AF078796, Caenorhabditis elegans). Todas las secuencias no redundantes con un valor E menor a 0.001 se recuperaron y ensamblaron en contigs utilizando el programa de ensamble de secuencia CAP3 [18]. Los contigs se tradujeron en secuencias amino en tres estructuras en la orientación indicada por el resultado tbiastn. Los modelos del gen desaturasa putativa se construyeron manualmente con base en homología de secuencia y en estructura se identificaron los límites de intrón GT-AG. Las secuencias de aminoácido deducidas de las 12 secuencias desaturasas putativas de T.pseudonana se alinearon con las 13 desaturasas funcionalmente caracterizadas de otras especies, utilizando la versión 1.8 de ClustalX [19]. La alineación entonces se reconcilió y además se ajustó. Únicamente nueve secuencias de Thalassiosira casi de longitud total se mantuvieron para análisis adicional. Un conjunto de datos de 250 posiciones de residuo conservadas se utilizó para construcción del árbol filogenético. El análisis de distancia utilizó el programa protdist del paquete Phylip 3.5c con una matriz de sustitución PAM250 y entonces se construyó un árbol de la matriz utilizando fitch (Fitch-Margoliash method). Los análisis de muestreo se llevaron a cabo con 1000 replicas utilizando el algoritmo de unión adjunto.

Cultivo de T.pseudonana T. pseudonana (CCAP 1085/12) se obtuvo de la Colección de Cultivo de Algas y Protozoarios (Dunstaffnage Marine Lab., Oban, PA34 4AD, Scotland, U.K.). El medio de crecimiento utilizado se enriqueció con un medio de agua marina artificial (EASW), conformado en lotes de 20 litros como se describió previamente [4]. Los cultivos se hicieron crecer en un matraz de un litro a 15°C con iluminación constante de 50 µE m"2s"1, y se proporcionó ventilación al agitar el matraz a 150 rpm. La densidad celular se monitoreo al contar las células con un hemocitómetro. La concentración de nitrato se determinó periódicamente durante el tiempo de cultivo al medir el cambio de la absorbancia del medio a 220 nm [20].

Extracción de ARN, síntesis de ADNc y análisis de RT-PCR El ARN total se extrajo de células congeladas cosechadas en diferentes etapas de crecimiento con un mini equipo de planta RNeasy (Qiagen). La primera cadena de ADNc se sintetizó a partir de tres µg de ARN tratado con ADNsa utilizando un equipo RT-PCR Prostar First-strand (Stratagene). PCR se realizó utilizando diluciones no diluidas y de cinco veces de ADNc de la siguiente manera: las reacciones se calentaron a 95°C durante 5 minutos seguido por 35 ciclos a 95°C durante 30 segundos, 50°C o 65°C (para ARNr 18S y TpdesN respectivamente) durante 30 segundos y 72°C durante 2 minutos, posteriormente 72°C durante 10 minutos. Como un marcador para expresión constitutiva, el gen ARNr 18S se amplificó con el iniciador TH18S5' (5'-GGTAACGAATTGTTAG-3') y TH18S3', (5'-GTCGGCATAGTTTATG-3'). ADNc TpdesN se amplificó utilizando iniciadores DESNR2 (5'-GTGAGAGCACTAACCAAGCTT-3') y DESN2 (5'-CAATCAGTAGGCTTCGTC G-3'). Las alícuotas de la reacción PCR pasaron por electroforesis a través de un gel de agarosa al 1 %. La identidad del fragmento de diagnóstico amplificado con iniciadores específicos de TpdesN se verificó por secuenciación después de clonar en el vector pGEM-T Easy (Promega).

Caracterización funcional de TpDESl en levadura La región codificadora de Tpdesl total se amplificó a partir de ADNc T.pseudonana con iniciadores DeslNB 5'- GCGGGATCCACCATGGCTGGAAAAGGAGGAGAC-3' (codón de inicio de ORF se indica mediante el tipo en negritas; la secuencia subrayada es un sitio BamHI; la secuencia itálica es un codón de alanina agregado, no presente en la secuencia original de Pldesl) y DesICE 5'- GCGAATTCTTACATGGCAGGGAAATC-3' (codón finalizador de ORF se indica en el tipo de negritas; la secuencia subrayada es un sitio EcoRI). El sistema Expand High Fidelity PCR (Roche) se empleó para reducir al mínimo los errores de PCR potenciales. El producto amplificado fue purificado con gel, restringido y clonado en los sitios correspondientes atrás del promotor GAL1 inducible por galactosa de pYES2 (Invitrogen) para producir el plásmido pYDES Este vector se transformó en una cepa S. cerevisiae Invsd (Invitrogen) mediante un método de acetato de litio, y se seleccionaron los transformantes en placas de medio mínimo que carecen de uracilo. Para expresión funcional, los cultivos se hicieron crecer a 25°C en presencia de 2% (p/v) de rafinosa y 1 % (p/v) de Tergitol NP-40 (Sigma). La expresión del transgen se incluyó cuando OD6oonm alcanzó 0.2-0.3 mediante suplementación de lactosa a 2% (p/v). En ese momento, los ácidos grasos apropiados se agregaron a una concentración final de 50 µM. La incubación se llevó a cabo a 25°C durante 3 días.

Caracterización funcional de TpDESN en levadura El ADN genómico de las células T. pseudonana se extrajo utilizando un equipo de aislamiento de ADN Puregene (Gentra Systems) y 100 ng se utilizaron para amplificar toda región codificadora de TpdesN con iniciadores DesNNB 5'-GCGGGATCCACCATGGCTGACTTTCTCTCCGGC-3' (codón de inicio ORF se indica en el tipo en negritas; la secuencia subrayada es un sitio BamH\; la secuencia itálica es un codón de alanina agregado, no presente en la secuencia original de TpdesN) y DesNCE 5'-GCGAATTCTCAATCAGTAGGCTTCGT-3' (codón Analizador ORF se indica en negritas; la secuencia subrayada es un sitio EcoRI). El sistema Expand High Fidelity PCR (Roche) se empleó para reducir al mínimo los errores potenciales de PCR. El producto amplificado es purificado en gel, restringido con EcoRI y BamH\ y clonado en los sitios correspondientes detrás del promotor GAL1 inducible con galactosa de pYES2 (Invitrogen) para producir el plásmido pYDESN. La fidelidad del producto PCR clonado se verificó mediante secuenciación. El vector pYDESN entonces se transformó en la cepa S. cerevisiae Invsd (Invitrogen) mediante un método de acetato de litio, y los transformantes se seleccionaron en placas de medio mínimo que carecen de uracilo. Para el experimento de alimentación con PUFA, los cultivos se hicieron crecer a 22°C en presencia de 2% (p/v) de rafinosa y 1 % (p/v) de Tergitol NP-40 (Sigma). La expresión del transgen se indujo cuando OD6oonm alcanzó 0.2-0.3 mediante suplementación de galactosa a 2% (p/v). En ese momento, se agregaron los ácidos grasos apropiados en una concentración final de 50 µM. La incubación se llevó a cabo a 22°C durante tres días y posteriormente 15°C durante otros tres días. Para el experimento de alimentación con ácidos grasos saturados, una sola colonia Invsd se transformó con pYES2 (plásmido vacío, control) o pYDESN se inoculó en 10 ml de medio mínimo menos uracilo que contiene 2% de rafinosa y se hizo crecer durante la noche a 30°C con agitación (300 rpm). Después de 16-24 horas, las células se recolectaron al hacer girar a 4500 rpm durante 10 minutos. Después de desechar el sobrenadante, la pella celular se resuspendió en el mismo medio mencionado anteriormente suplementado con galactosa al 2% y tergitol al 1 %, para obtener una densidad celular de 5x107 células/ml. Quince mi de esta suspensión celular se agregaron a un matraz de 100 ml con o sin adición de ácidos grasos (como menciona en el texto) a una concentración final de 500 µM. La inducción de desaturasa entonces se llevó a cabo a 20°C con agitación (300 rpm) durante 3 días.

Análisis de ácido graso Las microalgas o células de levadura se cosecharon mediante centrifugado. Los ácidos grasos totales se extrajeron y transmetilaron como se describió previamente [4]. La mayoría de FAME se identificaron mediante comparación de los tiempos de retención a una mezcla de 37 FAME (Supelco). También se identificaron FAME PUFA mediante la comparación de una muestra de aceite Menhaden estándar (Supelco) transmetilado como por las muestras. Los aductos de ¡sulfuro de dimetilo (DMDS) se utilizaron para determinar la posición de doble enlace y FAME monosaturado identificada no identificado. Estos se realizaron al agregar juntos 50 µl de DMDS (Aldrich), 100-1000 ng de FAME disuelto en 50 µl de hexano, y 5 µl 50 mg mi"1 de yodo en éter dietílico. Esta solución se calentó a 40°C durante 15 horas y se dividió con 200 µl de hexano y 100 µl 5% (p/v) de tiosulfato de sodio. La fase de hexano se removió, se secó al vacío, se reconstituyó en hexano fresco 50 µl y se utilizó para análisis de GC-MS. Una traza GC 2000 (ThermoQuest) ajustada con una columna ZB-1 con espesor de película de 30 m x 0.25 mm x 0.5 µm (Phenomenex) se utilizó para cromatografiar aductos de DMDS de 2 µl inyectados a 250°C y una relación de división 50:1 con He como un gas portador a 0.6 ml min"1 en un modo de flujo constante. El programa de horno fue 120°C durante 1 min posteriormente a 340°C a 5°C min'1. Los espectros de masa se obtuvieron utilizando un espectrómetro de masa GCQ (ThermoQuest) que opera en un modo de exploración total sobre 50-500 m/z. Los esteres de picolinilo también fueron elaborados a partir de FAME para confirmar sus entidades. Estos se obtuvieron al agregar 15 µl de 3-(hidroximetil)-p¡ridina nuevamente preparada 2:1 (v/v) (Aldrich): solución de tert butóxido de potasio 1 M en tetrahidrofurano (Aldrich a 50 µl FAME se disolvió en diclorometano. Esta solución se calentó a 40°C durante 30 minutos y se dividió con 200 µl de hexano y 100 µl 2.5% (p/v) de carbonato ácido de sodio. La fase de hexano fue removida, se secó al vacío y se reconstituyó en 50 µl de hexano fresco. Se inyectaron esteres de picolinilo y se separaron por GC-MS utilizando las mismas condiciones para los aductos de DMDS; Sperling P., Zahringer U. y Heinz E. (1998) A sphingolipid desaturase from higher plantas, J. Biol. Chem. 273, 28590-28596; Sperling P., Libisch B., Zahringer U., Napier J.A. y Heinz E. (2001 ) Functional ¡dentification of a D8-sphingolipid desaturase from Borago officínalís. Arch. Biochem. Biophyx. 388, 293-298; Whitney H.M., Michaelson, L.V., Sayanova, O., Pickett J.A. y Napier, J.A. (2003) Functional characterization of two two cytochrome b-5 fusión desaturases from Anemone leveillei: The unexpected identificación of a fatty acid ?6-desaturase. Planta 217, 983-992; cada uno de los cuales se incorporan como referencia.

EJEMPLO 1 Identificación y análisis fotogenético de secuencias putativas de T. pseudonana desaturasa con otras desaturasas caracterizadas funcionalmente Las investigaciones de Tbiastn con 13 desaturasas funcionalmente caracterizadas revelaron 427 secuencias crudas no redundantes con valores E de menos de 0.001. Se ensamblaron doce únicos contigs después de retribuir estas secuencias y los modelos genéticos fueron construidos manualmente basándose en la homología de secuencia. Estos 12 contigs genéticos se designaron arbitrariamente TpdesA a TpdesL. Los 12 presentaron una significativa similaridad de secuencia a las secuencias de consulta con 9 conteniendo marcos de lectura abiertos de longitud casi completa en comparación con las otras desaturasas conocidas (fig. 1A). Es interesante notar que la secuencia de aminoácidos predicha de las nueve Tpseudonana desaturasas tienen una característico dominio de unión a hemo del citocromo 65 fusionado (HP[G/A]G) en su término N y tres recuadros de histidina (H[X]3-4H, H[X]2-3HH AND Q[X]2-3HH) con el reemplazo de la primera histidina por glutamina en el tercer recuadro de histidina en todas excepto dos de las proteínas predichas (TpDESA y TpDESB). Estas son características comunes de un grupo secundario grande de desaturasas del grupo acilo del extremo delantero [21]. Estos motivos del recuadro de histidina son importantes para la actividad de desaturasa, más probablemente debido a que sirven para coordinar el componente diiron-oxo del sitio activo. Las tres secuencias restantes (TpDESD, TpDESL y TpDESH) parecen ser parciales, cubriendo solamente el extremo C-terminal de desaturasas, pero sin embargo si contienen un tercer recuadro de histidina típico del grupo secundario de desaturasas mencionado anteriormente (fig. "\A). Para obtener una visión interior de las relaciones de estas secuencias de T.pseudonana con otras desaturasas funcionalmente caracterizadas y especialmente desaturasas de algas, construimos un árbol filogenético sin raíces utilizando un método de Fitch-Margoliash con una confianza estadística medida por el análisis de remuestreo (Fig. 1 B). Las relaciones de cuatro desaturasas putativas de T.pseudonana están bien soportadas en grupos secundarios (valor de remuestreo de >70%) con por lo menos una desaturasa funcionalmente caracterizada a partir de otra especie. Las dos TpDESM y TpDESO agrupadas con PtDELd, una ?5-desaturasa de otra diatomea, P. tricornutum [5], sugiriendo que estas dos enzimas también pueden tener una actividad de ?5-desaturasa. En forma similar la TpDESK se agrupa con dos ?4-desaturasas TFAD4 y EgDEL4 provenientes de Thraystochytrium sp. ATCC21685 [22] y E. gracilis respectivamente. La TpDESI se agrupó con PtDEL6, una ?6-desaturasa de P. tricornutum. Esto indica que TpDESK y TpDESI puede tener actividades de ?4 y ?6-desaturasa respectivamente. Sin embargo, como también se encuentran enzimas con diferentes regios selectividades en un grupo secundario bien soportado (EgDELd, CeDELd y CeDEL6; ?8, ?5 y ?6-desaturasa respectivamente) y como la regioselectividad pueden incluso derivarse independientemente después de una duplicación más reciente (CeDELd y CeDELd) [23], las predicciones basadas en homología pueden ser engañosas y esto es esencial para caracterizar funcionalmente cada enzima, d Las cinco secuencias de 7. pseudonana restantes están dentro de los tres grupos secundarios separados (TpDESE; TpDESA y Tp DESB; TpDESG y TpDESN) que no se agrupan con ninguna otra desaturasa funcional conocida con alta confianza. Por lo tanto es posible que estas proteínas exhiban una regioselectividad novedosa. El presente estudio está 0 enfocado en la caracterización de una de estas proteínas, TpDESN.

EJEMPLO 2 Expresión temporal del gen TpDESN d Se llevó a cabo un análisis RT-PCR del transcripto TpdesN en diferentes etapas del crecimiento de alga para establecer si este gen es expresado y cuándo. Después de la extracción de ARN y de la síntesis de ADNc, se amplificaron los productos de PCR específicos de TpdesN. Se llevó a cabo la amplificación de PCR del gen 18S ADNr como un control para la 0 cantidad de ADNc utilizado durante las reacciones de PCR. La figura 2A y 2B muestra que el diagnóstico del producto de amplificación de ADNc 519 bp esperado para TpdesN estaba presente a un nivel similar en las diferentes etapas de cultivo de las células de microalga. Así, el TpdesN es transcripcionalmente activo a un nivel constitutivo durante el crecimiento de Thalassiosira, lo cual sugiere que puede codificar una desaturasa con una función de mantenimiento. d EJEMPLO 3 Caracterización funcional de TpDESN en levadura La secuencia de desaturasa putativa anotada TpdesN fue contenida en un contig de ADN genómico de 2d80 bp en el cual no se 0 detectaron intrones. Para establecer la función de la proteína codificada por este gen, la secuencia de longitud completa fue amplificada a partir de ADN genómico. Un codon de alanina que contenía una G como la primera letra, se agregó inmediatamente corriente abajo del codon de inicio de TpdesN, para asegurar una traslación óptima en levadura [24]. El tiene una longitud de d TpdesN ORF es 1434 bp, y codifica una proteína de 477 aminoácidos TpDESN (Fig. 1 C), que tiene un peso molecular de d3.8 kDa. El análisis de la estructura secundaria de TpDESN utilizando un software SOSUI (http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.ip/sosuiframeO.html) [2d] predijo cuatro regiones transmembranales (no aparecen). La alineación de TpDESN con 0 secuencias de desaturasa funcionalmente caracterizadas que se mencionaron antes, indicó una identidad general del 2d%, con el dominio de tipo 6d de citocromo y las tres áreas de motivo ricas en histidina conservadas demostrando una mayor homología.

La secuencia primaria de TpDESN exhibió características típicas de las desaturasas del extremo delantero involucradas en la síntesis de PUFA. Para caracterizar la especificidad de esta proteína, primero se alimentaron PUFA (18:2?9, 12; 20:2?11 , 14; 20:3?8, 11 , 14; 22:4?5,8,11 ,14; 18:3?9,12,1d; 20:3?11 , 14,17; 20:4?8,11 ,14,17; 22:5?7,10,13,16,19) en la levadura hospedera transformada con pYDESN y el vector solo (pYES2) como un control. Inesperadamente después de seis días de incubación, el TpDESN no desaturó nada del sustrato de PUFA suplementado. Además, no pareció haber ninguna producción de 18:2?9,12 a partir del 18:1?9 endógeno. Sin embargo se observó un aumento significativa para un pico eluyéndose en la escala de 16 FAME monosaturados de carbono en la levadura transformada con pYDESN (figura 3A y 3B). Se determinó la posición el enlace doble en este producto mediante un análisis de GC-MS de los FAME derivados en los aductos DMDS [26] y esteres de picolinilo. El aducto de DMDS de 16:1?9 FAME produjo dos fragmentos principales en m/z 145 y 217 (figura 4A). La fragmentación del pico incrementado de FAME encontrada en la levadura sin alimentar o alimentada transformada con pYDESN produjo dos fragmentos de diagnóstico en m/z 117 y 245 (figura 4B). Este patrón de fragmentación fue indicativo de un FAME de dieciséis carbonos monosaturado ?11 , 16:1?11 , sugiriendo que el TpDESN codifico una nueva ?11 -desaturasa. También se midieron pequeñas cantidades de éste FA en células de Thalassiosira (Cuadro 1 ). Para sustanciar adicionalmente estos resultados, la levadura transformada con pYDESN y el vector vacío de control, pYES2, fueron cultivados en un medio suplementado con FA saturado (14:0; 16:0; 18:0) representando sustratos potenciales para la síntesis del producto monosaturado. Se analizaron los perfiles de ácido graso de levadura después de tres días de incubación a 20°C. Los resultados en el cuadro 2 demuestran que una pequeña cantidad de 16:1?11 (0.23% de FA totales) se detecto en la levadura transformada con pYES2, sugiriendo una síntesis endógena de éste FA a partir de 16:0. Este FA acumulado a un nivel más alto en ambos tipos de levadura transformada después de alimentar con 14:0, con valores de hasta 5.84% en transformantes de pYDESN. Una explicación posible para este aumento en los transformantes pYES2 es que la ?9-desaturasa de levadura endógena fue capaz de utilizar 14:0 adicional para producir 14:1?9 que alargo subsecuentemente a 16:1?11. Además se ha reportado que las células de levadura de tipo natural cultivadas en un medio suplementado con 14:1?9 sintetizaron 16:1 ?11 mediante un alargamiento carboxi terminal dependiente de Elo 1p [27]. Después de una suplementación de 18:0, el porcentaje de 16:1?1 , de aproximadamente 6% del total de FA, fue similar al que se observó después de la alimentación con 16:0. La presencia de 18:0 extra pudo llevar a una inhibición del sistema de alargamiento de la cadena 16:0, lo cual pudo permitir que mas 16:0 estuviera disponible para la desaturación de ?11. Por otro lado, 18:1?11 representa el 1.2% del total de FA en levadura transgénica. No se monitoreo ninguna variación en esta proporción bajo diferentes condiciones de incubación, incluso después de la suplementación con 18:0 en transformantes de pYDESN. Esto sugiere que éste FA se origina a partir del alargamiento de 16:1?9 en vez de la desaturación de ?11 de 18:0.

EJEMPLO 4 Caracterización funcional de TpDESI Para establecer la función de TpDESI, se expresó ADNc de longitud completa en levadura Invsd bajo el control de un promotor de galactosa inducible. Los sustratos potenciales de las desaturasas de extremo frontal (18:2?9,12; 18:3?9,12,1 d; 20:3?8,11 ,14; 20:4?8,11 ,14,17; 22:4?7,10,13,16; 22:d?7,10,13,16,19) fueron probados. Las figuras 12A y 12B muestran que después de la suplementación del medio con 18.2?9,12 y 18:3?9,12'15 respectivamente, y después de tres días de incubación, las células de levadura que contienen pYDESI tuvieron ácidos grasos extra. Los picos extra observados cuando las células fueron alimentadas con 18:2?9,12 tuvieron un tiempo de retención idéntico al de 16:2?6,9, 18:2?6,12 y 18:3?6,9,12 (figura 12A). Los picos extra observados cuando las células fueron alimentadas con 18:3?9,12,1d tuvieron un tiempo de retención idéntico al de 16:2?6,9, 18:2?6,12 y 18:4?6,9,12,1d (figura 12B). Estos resultados demuestran que el Tpdesl codifica una ?6-desaturasa que puede introducir un enlace doble en los ácidos grasos 18:2?9,12 y 18:3?9,12,1d alimentados en forma exógena, pero también en los ácidos grasos 16:1?9, y 18:1?9 endógenos. Los porcentajes de conversión de estos sustratos diferentes se proporcionan en el cuadro 3. El perfilado de los ácidos grasos de la microalga marina demostró que 7. pseudonana representa un buen candidato para descubrir los d genes que están involucrados en la producción y el almacenamiento de PUFA [4]. El análisis del genoma borrador recientemente completado de esta microalga reveló la presencia de muchos genes candidatos para actividades de alargamiento y de desaturación que están más probablemente involucradas en los diferentes pasos de catálisis del procedimiento biosintético 0 de PUFA. Identificamos 12 posibles genes de desaturasa, de los cuales de 9 existe la suficiente información de secuencia para demostrar que exhiben las características típicas de desaturasas de extremo frontal, es decir, un dominio de unión al citocromo 6d en el término N y 3 agrupamíentos de histidína localizados en regiones altamente conservadas. El análisis filogenético reveló d que varios de estos genes están cercanamente relacionados con un número de desaturasas de extremo delantero previamente caracterizadas que están involucradas en la síntesis de PUFA. Sin embargo, el trabajo actual señala el echo de que la función de la desaturasa, en términos de regioselectividad, no se puede basar únicamente en la predicción a partir de la homología primaria 0 de la secuencia de aminoácidos. El perfilado de ácido graso de las células de 7. pseudonana es bastante diverso (cuadro 1 ), con el conteo benéfico para la salud EPA (20:d?d,8,11 ,14,17) y DHA (22:6?4,7,10,13,16,19) para una gran proporción.

Sin embargo, el número de secuencias genéticas de desaturasa que se encontraron en el genoma fue mucho más alto del que esperábamos basándonos en el número de las diferentes reacciones de desaturación que se requieren para producir la diversidad de FA en esta microalga. Esto sugería d que las reacciones de desaturación no obvias también podrían ocurrir en las células de Thalassiossira. Como un primer paso para establecer la función de muchas secuencias putativas de desaturasa, nos enfocamos en el contig de TpdesN debido al hecho de que la secuencia era de longitud completa y sin intrones. Un estudio temporal de expresión demostró que TpdesN se 0 transcribía constitutivamente durante el cultivo de algas. La expresión de TpdesN ORF en la levadura suplementada con PUFA como substratos potenciales para la desaturación, no reveló nuevos productos. Tampoco hubo evidencia de la actividad con el 18.1?9 endógeno que excluye la posibilidad de que TpDESN actúe como una ?12-desaturasa. Sin embargo, se identificó d un aumento en el área pico de un FAME de elusión en la escala de los dieciséis FAME de carbono, y el análisis basado en GC-MS reveló que es un ácido graso de 16:1?11. También se encuentran presentes pequeñas cantidades de este FA en la levadura de tipo natural. Sin embargo, la comparación cuantitativa de los niveles de FA en los transformantes pYES2 y 0 pYDESN de vector vacío demostró que las proporciones de 16:1?11 aumentaron en la presencia de TpdesN tanto en células alimentadas como en células que habían sido alimentadas con FA de saturación diferente. No se detectó ningún otro cambio en el área pico o en los picos nuevos en los transformantes pYDESN, lo cual indicó que TpDESN está involucrado específicamente en la conversión de 16:0 a 16: 1?11. La presencia de pequeñas cantidades de 16:1?11 había sido reportada previamente en muchas microalgas, incluyendo 7. pseudonana. Sin d embargo, no se ha establecido una función de este FA en las células de alga. La baja cantidad observada en muchas microalgas marinas sugiere que puede actuar como un intermediario en una vía biosintética que permanece no identificada. En células de insectos, 16:1?11 representa un precursor importante para la síntesis de feromona, en donde es producida por una Acyl-0 CoA ?11 -desaturasa. Es interesante notar que las ?11 -desaturasas de insecto no poseen un dominio unión al citocromo 6d en su región N-terminal. Esto representa una diferencia mayor de la estructura primaria en comparación con TpDESN. El dominio unión al citocromo 6d no es un determinante en la especificidad del sustrato [28]. La alineación del dominio de desaturasa de d TpDESN con la secuencia completa de ?11 -desaturasas de insectos demostró una identidad del 20% (datos no mostrados). En las células de insectos, las ?11 -desaturasas son más o menos específicas dependiendo del origen de la secuencia y existen trabajos bien documentados sobre esta materia [14,15]. 0 Por lo tanto en conclusión, aunque la secuencia primaria de TpDESN es muy similar a las desaturasas de extremo delantero, no deberá ser considerada como un miembro de esta familia de desaturasas, debido a que actúa solamente en 16:0. La identificación de dicha enzima novedosa expande el repertorio funcional de las desaturasas unidas a membrana y deberá proporcionar una información comparativa útil para el entendimiento de las relaciones filogenéticas entre estas enzimas. Una cuestión que permanece sin resolver se refiere a si el citocromo 6d estaba fusionado d independientemente a desaturasas que ya habían adquirido sus especificidades diferentes, o si una proteína de fusión ancestral para la modificación próxima de lípidos se duplicó y subsecuentemente se involucró en diferentes desaturasas. Algunos estudios sobre la estructura primaria de las diferentes desaturasas de PUFA apoyan el echo de que la conversión de 0 enzimas (es decir el cambio de especificidad) se puede lograr a través de relativamente pocos cambios estructurales [29]. El alto grado de homología entre muchas desaturasas potenciales de extremo delantero identificadas en el genoma de 7. pseudonana apoyan esta noción. Dado el perfil de FA de las células de 7. pseudonana y la complejidad de la familia de genes de d desaturasa, es probable que diferentes genes codifiquen ?4, ?d y ?6 desaturasas. Ahora sería muy interesante caracterizar funcionalmente estos genes restantes putativos de desaturasa y estudiar la relación que hay entre la regioselectividad, la secuencia primaria de aminoácidos y la relación filogenética. Todavía no se encuentra disponible una estructura de cristal para 0 estas enzimas, debido a las dificultades técnicas en la obtención de cantidades suficientes de proteína purificada unida a membrana. Los enfoques genéticos moleculares que involucran la mutagénesis dirigida ai sitio, han proporcionado nuevos puntos de vista sobre las relaciones de estructura-función, incluyendo, por ejemplo, que se ha encontrado que los residuos que se encuentran en una proximidad cercana con los motivos de histidina están involucrados en el cambio de relación de las actividades de desaturación/hidroxilación [30]. Los análisis comparativos detallados y la modelación por computadora de estas diversas desaturasas provenientes de 7 pseudonana también puede servir como guía en los estudios de mutagénesis dirigida al sitio, que pretenden definir los residuos claves que controlan la especificidad del sustrato y la regioselectividad del enlace doble introducido.

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Claims (12)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES d 1.- Una célula transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico la cual comprende a su vez una secuencia de ácido nucleico representada en las figuras dA, dB, 6A, 6C, 7A, 8A, 8B, 9A, 10A, 11 A, 11 B, 11 D, o moléculas de ácido nucleico que hibridan a estas secuencias, en donde dichas moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido que tiene 0 una actividad de desaturasa. 2.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dichas condiciones de hibridación son condiciones de hibridación estringentes. 3.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, d caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico que se representa en las figuras dA, dB, 6A, 6C, 7A, 8A, 8B, 9A, 10A, 11A, 11 B, 11 D. 4.- La célula de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico consiste en la 0 secuencia de ácido nucleico que se representa en las figuras dA, dB, 6A, 6C, 7A, 8A, 8B, 9A, 10A, 11 A, 11 B, 11 D. 5.- La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque dicha célula sobre-expresa dicha desaturasa codificada por dicha molécula de ácido nucleico. 6.- La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a d, caracterizada además porque dicha célula transgénica es transfectada con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico como la que se representa en la figura 10A y que codifica un polipéptido desaturasa, en donde dicho polipéptido tiene una actividad de ?11 -desaturasa, o una molécula de ácido nucleico que híbrida a la molécula de ácido nucleico de la figura 10A y que codifica un polipéptido con actividad de ?11 -desaturasa. 7 '.- La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a d, caracterizada además porque dicha célula transgénica es transfectada con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico como la que se representa en la figura 8A y que codifica un polipéptido de desaturasa, en donde dicho polipéptido tiene una actividad de ?6-desaturasa, o una molécula de ácido nucleico que híbrida a la molécula de ácido nucleico de la figura 8A y que codifica un polipéptido con actividad de ?6-desaturasa. 8.- La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada además porque dicha célula transgénica es una célula eucariótica. 9.- La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada además porque dicha célula es una célula procariótica. 10.- La célula de conformidad con la reivindicación 8, d caracterizada además porque dicha célula eucariótica es una célula vegetal. 11.- Una planta que comprende una célula como la que se reclama en la reivindicación 8. 12.- Una semilla que comprende una célula como la que se reclama en la reivindicación 9. 0 13.- La planta o semilla de conformidad con las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizada además porque dicha planta o semilla es una planta de semilla oleaginosa. 14.- Un recipiente de reacción que comprende por lo menos un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico, en donde dicha d molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que consiste en las secuencias representadas en las figuras, dA, dB, 6A, 6C, 7A, 8A, 8B, 9A, 10A, 11 A, 11 B, 11 D, o moléculas de ácido nucleico que hibridan a estas secuencias y que codifican un polipéptido que tiene actividad de desaturasa; substratos de ácido graso y co-factores, en donde dicho 0 recipiente está adaptado para la desaturación de dichos substratos de ácido graso. 1d.- El recipiente de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho polipéptido es expresado por una célula de acuerdo con la invención. 16.- El recipiente de conformidad con la reivindicación 16, d caracterizado además porque dicha célula es una célula de levadura. 17.- El recipiente de conformidad con la reivindicación 1d, caracterizado además porque dicha célula es una célula procariótica. 18.- Un método para desaturar un substrato de ácido graso, que comprende los pasos de: i) proveer un recipiente de reacción como el que se 0 reclama en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17; y ii) cultivar dichas células que están contenidas en dicho recipiente de reacción bajo condiciones que permitan la desaturación de por lo menos un substrato de ácido graso.