MXPA06008409A

MXPA06008409A - Metodo para purificar oocistos utilizando digestion enzimatica de desechos fecales

Info

Publication number: MXPA06008409A
Application number: MXPA/A/2006/008409A
Authority: MX
Inventors: James E Hutchins; Robert C Tuttle
Original assignee: Embrex Inc; James E Hutchins; Robert C Tuttle
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2006-07-26
Publication date: 2006-12-13

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la purificación de oocistos de protozoo;en modalidades particulares, los oocistosson oocistos de Eimeria;los métodos comprenden poner en contacto una composición que comprende materia fecal y oocistos de protozoo con polisacaridasa bajo condiciones adecuadas para reducir la cantidad de material fecal en la composición.

Description

For two-letíer codes and other abbreviations, refer lo the "Guidance Notes on Codes andAbbreviations" appearing at the be.gin-ning ofeach regular issue ofthe PCT Gazetle.

MÉTODO PARA PURIFICAR OOCISTOS UTILIZANDO DIGESTIÓN ENZIMATICA DE DESECHOS FECALES INFORMACIÓN RELACIONADA CON LA SOLICITUD Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/558,348 presentada el 31 de marzo del 2004, la cual se incorpora como referencia en la presente invención en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos y composiciones para la purificación de oocistos de protozoos; en particular, la presente invención provee métodos y composiciones para la purificación de oocistos de Eimeria que pueden ser utilizados para producir vacunas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La coccidiosis de las aves de corral es una enfermedad ocasionada por parásitos protozoos del género Eimeria. Los oocistos de la especie Eimeria son ubicuos en el ambiente y persisten por muchos meses en la cama de paja de las aves de corral. La ingestión de oocistos lleva a una infección de las diversas regiones del tracto intestinal de manera especie específica. El organismo prolifera en el intestino durante un período de varios días, resultando en la excreción de la siguiente generación de oocistos en las heces. Los múltiples ciclos de infección llevan a la inmunidad, y cuando la infección se presenta temprano en una bandada y en una dosis uniforme entre la bandada, la inmunidad desarrollada durante varios ciclos de exposición puede ser bastante fuerte. En contraste, cuando las aves no están presentes con la infección de manera uniforme, se pueden generar situaciones en las cuales las aves sin afección se someten a una infección repentina, masiva, que lleva a un desarrollo pobre en términos de conversión de forraje y ganancia de peso, y un alto riesgo de infecciones secundarias. Actualmente, el método más común utilizado para el control de la coccidiosis en la industria de las aves de corral no es la vacunación, sino más bien la administración de fármacos anticoccidial en el forraje. La baja relación de vacunación frecuentemente se atribuye a incertidumbre en la uniformidad en la dosificación vía el forraje o agua en la instalación para crecimiento o mediante vacunación en la cabina para aspersión en la instalación para eclosión, las cuales son las rutas y tiempos de administración tradicionales. Hay un interés en incremento para mejorar la uniformidad de distribución durante la administración en la instalación para eclosión. Recientemente, se ha encontrado que las técnicas de vacunación in ovo son aplicables a la administración de una vacuna para la coccidiosis basada en oocisto vivo (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,500,438; Patente de E.U.A. No. 6,495,146; y Patente de E.U.A. No. 6,627,205; todas de Pfizer, Inc.). La ruta de administración in ovo provee un método conveniente de distribución de una dosis uniforme de la vacuna a cada embrión mientras aún se encuentra en el huevo. La distribución de vacunas aviares in ovo se practica habitualmente para aproximadamente 85% de los 9 mil millones de aves para asarse producidas en los Estados Unidos cada año y en un porcentaje en crecimiento de los 21 mil millones de aves para asarse producidas fuera de los Estados Unidos cada año (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,458,630; al gobierno de los Estados Unidos). Por lo tanto, el mercado potencial para una vacuna de coccidíosis viva, distribuida ¡n ovo es considerablemente mayor que el mercado actual para vacunas de coccidiosis distribuida después de la eclosión. Los oocistos para uso en una vacuna de coccidiosis viva se derivan a partir de las heces, las cuales están iniciaimente pesadamente cargadas con microorganismos contaminantes. Típicamente, las agencias reguladoras requieren que se demuestre que las vacunas distribuidas ¡n ovo esencialmente están libres de microorganismos contaminantes. Para asegurar que los niveles de la biocarga se minimicen completamente en el producto final, es benéfico utilizar composiciones y metodologías que controlan efectivamente el nivel de microorganismos contaminantes en cada etapa del proceso de producción de oocisto. La reducción en los sólidos extraños puede incrementar la eficiencia de las metodologías para reducción de la biocarga.

Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de métodos mejorados para la purificación de oocistos de protozoo, especialmente para uso en la elaboración de vacunas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos mejorados y composiciones para la purificación de oocistos de protozoo (por ejemplo, oocisíos de Eirneria), por ejemplo, para uso en la elaboración de vacunas. Con particular consideración a las vacunas para aves de corral, la invención es adecuada para la producción de vacunas para uso post eclosión o in ovo. De manera similar, la vacuna se puede utilizar en las industrias de las aves para asarse, para producción de huevos, para cruza, pavos, aves para pasatiempo y/o aves domesticadas. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la materia fecal que contiene oocistos se puede digerir enzimáticamente mediante polisacaridasa sin impactar indebidamente la viabilidad y/o recuperación de oocistos. Por lo tanto, la invención provee métodos mejorados para la reducción de la materia fecal en una composición que comprende oocistos mediante la digestión de la materia fecal con polisacaridasa. La invención también provee métodos para la purificación de oocistos a partir de una composición que comprende materia fecal mediante un procedimiento que comprende digerir la materia fecal en la composición con polisacaridasa. La polisacaridasa actúa escindiendo el desecho vegetal sólido, insoluble hacia sub-componentes solubles, los cuales se pueden remover. Por ejemplo, los productos solubles de la digestión enzimática se pueden remover mediante la separación y concentración de los oocistos vía técnicas tales como centrifugación o filtración en flujo tangencial. Los métodos y composiciones de la invención son ventajosos para los procedimientos comerciales de producción de oocisto (por ejemplo, para vacunas) mediante la reducción de la carga fetal y facilitando el uso de una escala menor del procedimiento. La minimización de ¡os desechos fecales extraños en la composición es benéfica para el control de ios microorganismos contaminantes y, si se desea, la producción de un producto final estéril. Además, la digestión enzimática puede reducir sustancialmente la cantidad de sólidos en la composición, por lo tanto resultando en una escala de operación proporcionalmente reducida para todos los procedimientos cascada abajo. La reducción en la escala de procesamiento puede hacer al proceso más eficiente y económico. La digestión enzimática se puede incorporar dentro de un esquema de purificación más grande y se puede utilizar en conjunción con, o como un sustituto para, las técnicas actuales para la purificación de oocistos (por ejemplo, tamizaje, flotación, centrifugación, etc.). Si los procedimientos de flotación se reemplazan por la digestión enzimática, las ventajas incluyen (1 ) eliminación de sales o reducción de sales, las cuales son corrosivas al equipo, a partir de los procedimientos de purificación; y/o (2) fuerza mejorada de los procedimientos. Si la digestión enzimática se utiliza antes de un paso de flotación, los beneficios pueden incluir una reducción en el volumen de la solución para flotación, la cual es generalmente directamente proporcional al volumen inicial de la materia fecal. Por consiguiente, como un primer aspecto, la invención provee un método para la purificación de oocistos (por ejemplo, oocistos viables) a partir de una composición que comprende materia fecal, el método que comprende poner en contacto la composición con polisacaridasa bajo condiciones adecuadas para reducir ¡a cantidad de materia fecal en ia composición. En modalidades particulares, la polisacaridasa comprende, consiste esencialmente de, o consiste de celulasa. En otras modalidades, la polisacaridasa comprende, consiste esencialmente de, o consiste de celulasa y pectinasa. Incluso en modalidades representativas adicionales, la polisacaridasa comprende, consiste esencialmente de, o consiste de celulasa, pectinasa y amilasa. Como un aspecto adicional, la ¡nvención provee métodos para la purificación de oocistos de Eimeria (por ejemplo, oocistos viables de Eimeria) a partir de una composición que comprende materia fecal, el método que comprende poner en contacto la composición con polisacaridasa que comprende celulasa bajo condiciones adecuadas para reducir la cantidad de materia fecal en la composición. La invención también provee métodos para la purificación de oocistos de Eimeria (por ejemplo, oocistos viables de Eimeria) para uso en la producción de una vacuna, el método comprendiendo poner en contacto la composición con polisacaridasa que comprende celulasa bajo condiciones adecuadas para reducir la cantidad de materia fecal en la composición. Incluso como otro aspecto, la invención provee una composición que comprende polisacaridasa para uso en la purificación de oocistos de protozoo (por ejemplo, para la elaboración de vacunas) utilizando los métodos de la invención. Estos y otros aspectos de la invención se establecen con mayor detalle en ia descripción de la invención a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra un curso del tiempo de la digestión de los desechos fecales utilizando 20% (v/v) de celulasa y 4% (v/v) de pectinasa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se describirá a continuación con referencia a las modalidades preferidas de la ¡nvención. Sin embargo, esta ¡nvención puede ser incorporada en diferentes formas y no debe considerarse como limitante de las modalidades establecidas en la presente invención. Más bien, estas modalidades se proveen de manera que esta descripción será detallada y completa, y comunicará completamente el alcance de la invención a aquellos expertos en la técnica. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente inveción tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica al cual pertenece esta invención. La terminología utilizada en la descripción de la invención aquí solamente es para el propósito de describir modalidades particulares y no se pretende que sea limitante de la ¡nvención. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente invención se incorporan como referencia en su totalidad. La terminología utilizada en la descripción de la ¡nvención aquí solamente es para el propósito de describir modalidades particulares y no se pretende que sea limitante de la ¡nvención. Como se utiliza en la descripción de la invención y ias reivindicaciones anexas, las formas particulares "un", "una" y "el/la" se pretende que también incluyan las formas plurales, a menos que el contexto claramente lo indique de otra manera. La presente ¡nvención es adecuada para la purificación de oocistos tanto para usos medicinales como veterinarios. Los términos "animal" y "sujetos animales" incluyen pero no se limitan a sujetos mamíferos y/o aves. Los sujetos mamíferos adecuados incluyen pero no se limitan a sujetos humanos y sujetos primates no humanos tales como sujetos simios, porcinos, bovinos (por ejemplo, ganado), caprinos, equinos, felinos, ovinos, caninos, murinos (por ejemplo, ratón, rata) y lagomorfos. Los términos "aves" y "sujetos aviares" (por ejemplo, "aves" y "sujetos aves"), como se utilizan en la presente ¡nvención, se pretende que incluyan machos y hembras de cualesquiera especies de aves, pero se pretende que principalmente comprendan aves de coral que se crían comercialmente para obtención de huevos, carne o como mascotas. Por consiguiente, los términos "ave" y "sujeto ave" se pretende que comprendan particularmente pero no se limitan a pollos, pavos, patos, gansos, codornices, faisanes, pericos, papagayos, cacatúas, cacatúas de cabeza amarilla, avestruces, emúes y los similares. En modalidades particulares, el sujeto ave es un sujeto pollo o un sujeto pavo. En otras modalidades, el sujeto ave es un pollo. Como se utiliza en la presente invención, un "ave" o "sujetos aves" se puede referir a un embrión de ave in ovo o a un ave post-eclosión. La presente invención se refiere generalmente a ios métodos y composiciones para la purificación de oocistos de protozoo. Dichos métodos y composiciones encuentran uso, por ejemplo, en los métodos para elaboración de vacunas. Adicionalmente, los métodos se pueden utilizar para purificar oocistos los cuales han sido genéticamente modificados, por ejemplo, para producción de proteína recombinante. Muchos protozos forman un estado de vida designado como un "oocisto". La invención se puede practicar para purificar a los oocistos a partir de cualesquiera especies de protozos, incluyendo pero no limitados a Eimeria, Cryptosporidium, Toxoplasma, Plasmodia e Isospora. En modalidades de la invención, los métodos y composiciones de la invención se utilizan para purificar oocistos de Eimeria. Los términos "protozos", "oocisto", "esporocisto", "esporozoíto" y "merozoíto" tienen los significados aceptados en la técnica. A menos que se indique de otra manera, se pretende que estos términos se refieran a protozos vivos (por ejemplo, viables), oocistos, esporocistos, esporozoítos y merozoítos, incluyendo formas atenuadas, aunque aquellos expertos en la técnica apreciarán que las vacunas se pueden formular utilizando protozos muertos, oocistos, esporocisíos, esporozoítos y merozoítos. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que las vacunas muertas se preparan usualmente mediante una primera purificación del organismo vivo. También se comprenden los protozoos, oocistos, esporocistos, esporozoítos y merozoítos genéticamente modificados. Los oocistos pueden ser esporulados o no esporulados. El término "Eimeria" indica una o más especies del género Eimeria. El término "Eimeria" incluye pero no se limita a cepas o especies de Eimeria que infectan a las especies de aves (por ejemplo, pollo, pavo) o mamíferos (por ejemplo, ganado, oveja o conejo). Dichas especies de Eimeria incluyen aquellas que se encuentran en pollos, incluyendo E. tenella, E. acervulina, E. máxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox, E. mivati y E. brunetti; y también aquellas que se encuentran en pavos, incluyendo E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. innocua, y E. subrotunda, y aquellas que infectan al ganado tales como E. bovis y E, zuernii; las especies de Eimeria que infectan a las ovejas tales como especies de E. ahsata, E. bakuensis, E. crandallis, E. faurei, E. granulosa, E, intricata, E. marsica, E. ovinoídalis, E. paluda, E. parva, E. weybridgensis; y Eimeria que infectan a los conejos incluyendo E. intestinalis, E. vejdovskyi, E. piriformis, E. coecicola, E. irresidua, E. flavescens, E. exigua, E. magna, E, perforans, E, media, y E. stiedai. Además, el término "Eimeria" ¡ncluye todas las cepas de las especies precedentes de Eimeria, incluyendo pero no limitados a cepas de tipo silvestre, precoces o cepas seleccionadas de otra manera, cepas atenuadas, y oocisíos que han sido atenuados, por ejemplo, mediante irradiación, tratamiento químico y los similares. Además, el término "Eimeria" también incluye cualesquiera cepas recientemente descubiertas o especies de Eimeria. Finalmente, el término "Eimeria" comprende Eimeria viva y muerta, aunque se pretende que sea Eimeria viva a menos que se indique de otra manera. La viabilidad se puede evaiuar, por ejempio, mediante la determinación de la infectividad de los oocistos en un hospedero. En modalidades particulares, los oocistos "viables" purificados de conformidad con los métodos de la invención tienen al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% de la ¡nfectividad de oocistos que no han sido sometidos al tratamiento enzimático de conformidad con la presente invención. Las composiciones que comprenden oocistos de Eimeria encuentran uso en métodos de inmunización de aves en contra de coccidiosis.

Los métodos de vacunación de aves en contra de coccidiosis se conocen en la técnica, e incluyen métodos de vacunación in ovo (por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,500,438; Patente de E.U.A. No. 6,495,146; y Patente de E.U.A. No. 6,627,205; Pfizer Inc.) y post eclosión (por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 3,147,186 a Auburn Research Foundation; Patente de E.U.A. No. 5,055,292 y Patente de E.U.A. No. 4,438,097, ambas a National Research Development Corporation). Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los oocistos se pueden procesar adicionalmente para liberar otras etapas de vida (por ejemplo, esporozoítos o esporocístos) para uso en la composición final de la vacuna, o para producir extractos o proteínas para propósitos de vacunación. El término "protozoo" incluye cepas de tipo silvestre, precoces o cepas seleccionadas de otra manera, cepas atenuadas, y oocistos que han sido atenuados, por ejemplo, mediante irradiación, tratamiento químico y los similares. Además, el término "protozoo" también incluye cualesquiera cepas recientemente descubiertas o especies de protozoos. Finalmente, el término "protozoo" abarca tanto a los protozoos vivos como muertos, aunque se pretenden los protozoos vivos a menos que se indique de otra manera. Los términos "produce", "producir" o "producción" de oocistos, y los similares generalmente se refieren a los procedimientos de cosecha de los oocistos a partir de un animal y purificar los oocistos a partir de la materia fecal.

A menos que se indique de otra manera, los términos "depurar", "purificación", "purificar" y "purificado" como se utilizan en la presente inveción con respecto a las preparaciones de oocistos se refieren a la separación a partir de, o remoción de, desechos fecales y otro material no deseado a partir de preparaciones que contienen los oocistos. Se pretende que estos términos indiquen que el grado de aislamiento o separación de los oocistos a partir de otro material presente en las heces ha sido mejorado, pero no que absolutamente todo (o incluso la maypría) el material extraño se remueve a paríir de las preparaciones de oocisío. De manera similar, ¡a preparación de oocisto puede contener cierto grado de contaminación microbiana, siempre y cuando la preparación final sea adecuada para su uso pretendido (por ejemplo, como una vacuna posí-eclosión). En modalidades particulares, las vacunas pretendidas para administración in ovo a los aves están esencialmente libres de contaminación detectable por microorganismos no deseables (por ejemplo, diferentes a los oocistos de protozoo de interés), en particular, microorganismos contaminanfes que son patogénicos (por ejemplo, ocasiona enfermedad o mortalidad significativa) al embrión. Dependiendo del contexto, un procedimiento de "purificación" se puede referir al procedimiento completo para la purificación de oocistos a partir de las heces para producir una preparación adecuada para propósitos de vacunación. Alternaíivameníe, un procedimiento de "purificación" se puede referir a cualquier subpoblación de pasos, o incluso un paso particular, dentro del esquema de purificación completo.

La preseníe invención provee méíodos y composiciones para la purificación de oocistos (por ejemplo, oocisíos de Eimeria). Los méíodos de digestión de la invención se pueden combinar con uno o más de otros pasos de purificación como parte de un esquema de purificación. Por ejemplo, los métodos de la invención se pueden uíilizar en conjunción con oíros méíodos conocidos en la técnica. Los métodos para la producción de oocisíos, lales como los oocisíos de Eimeria, se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No.3, 147,186 a Auburn Research Foundation; Pateníe de E.U.A. No. 4,544,548 a Iníernaíionale Octrooi Maatschappij Octropa" . B.V.; Pateníe de E.U.A. No. 4,863,731 a, Unilever Patent Holdings; Publicaciones de Paíeníe Iníemacional WO 00/50072 a Pfizer, Inc.; WO 03/020917 a Embrex, Inc.; y WO 02/37961 a Novus International, Inc.; Hammond et al., (1944) Amer. J. Veí. Res. 5: 70; Hill eí al., (1961 ) J. Parasií. 47: 357; Jackson, (1964) Parasitology 54: 87; Lotze eí al., (1961 ) J. Parasií. 47: 588; Schmatz et al., (1984) J. Protozool. 31 : 181 ; Whiílock, (1959) Ausí. Veí. J. 35: 310). Como se utilizan en la presente invención, si un paso o procedimiento "se lleva a cabo antes" o "se lleva a cabo después" o se utiliza un lenguaje equivalente con respecto a otro paso o procedimiento, se entiende que el primer paso o procedimiento se presenta aníes de o después de, respectivamente, el segundo paso en el esquema de purificación y no excluye la posibilidad de pasos intermedios, Los términos "contaminación microbiana", "confaminación por microorganismos", y términos similares se pretende que indique la presencia de microorganismos defecíables y no deseables viables incluyendo pero no limitados a bacterias, mohos, hongos, levaduras y virus (por ejemplo, microorganismos diferentes a los oocisíos de protozoo de interés). En modalidades particulares, la preparación de oocisto está esencialmente libre de contaminación microbiana detectable, significando que no se detecía un nivel significativo de confaminación microbiana en la preparación, o la preparación de oocisío esíá libre de cualquier coníaminación microbiana detectable. Se conocen en la técnica los métodos de detección de microorganismos y dependen de la clase de microorganismo a ser detecfado. Por "sanitizar" o "sanitización" o "saniíizado" (y términos similares) se eníiende que existe una reducción en la coníaminación microbiana (por ejemplo, microorganismos coníaminaníes viables, como se definió anteriormente) en ia preparación de oocisto. No es necesario que la preparación de oocisto no contenga absolutamente nada de contaminación microbiana, siempre y cuando la preparación final sea adecuada para su uso pretendido (por ejemplo, como una vacuna). En el caso de composiciones pretendidas para administración in ovo a los aves, la preparación generalmente estará esencialmente libre de coníaminación microbiana deíecíable (por ejemplo, no se deíecían niveles significativos de microorganismos coníaminaníes) o libre de cualquier contaminación microbiana detecíable, por ejemplo, es axénica.

La abreviatura "v/v" se refiere a "volumen/volumen." La abreviatura "p/v" se refiere a "peso/volumen." Los aspectos individuales de la presente invención se describen con mayor deíalle a continuación.

Purificación de oocisíos de protozoos medianíe digestión enzimática de desechos fecales Los presentes inventores han hecho el descubrimiento de que la digestión enzimáíica con polisacaridasa se puede uíilizar para reducir desechos fecales sin reducir indebidamente la viabilidad y/o recuperación de oocistos de protozoos. La polisacaridasa acíúa al degradar el material vegetal insoluble hacia una forma soluble (por ejemplo, en solución acuosa) que se puede remover fácilmente a partir de los oocistos. Por lo tanto, la invención provee métodos para la purificación de oocistos a partir de una composición que comprende maíeria fecal, en donde los méíodos comprenden poner en coníacfo la composición con polisacaridasa bajo condiciones adecuadas para reducir la cantidad de materia fecal (por ejemplo, solubilizar y por lo tanto volver fácilmente removible cierta parte o iodo el maíeria fecal sólido) en la composición. En modalidades particulares, los oocisíos son oocisfos viables. Los métodos de la invención se pueden practicar con cualquier composición que comprende materia fecal y oocistos. Para ilustrar, los oocistos se pueden recolectar a partir de las heces, núcleos cecales, revesíimieníos interiores intestinales u otros tejidos, y los similares a partir de animales infecíados. Para propósitos comerciales, los oocistos íípicameníe se recolecían a partir de las heces de animales infectados. La polisacaridasa de conformidad con la presente invención puede comprender una o más enzimas degradadoras de polisacárido. Cuando las una o más enzimas degradadoras de polisacárido se utilizan en los métodos de la invención, las enzimas se pueden ufílizar concurrentemente o secuencialmente en cualquier orden. Las polisacaridasas se conocen en la técnica e incluyen pero no se limitan a celulasa, pectinasa, amilasa, xilanasa, arabinasa, a-galactosidasa, hemi-celuiasa, ß-glucanasa, ß-glucosidasa, y amiloglucosidasa. En una modalidad representativa de la invención, la polisacaridasa comprende, consiste esencialmente de, o consisíe de celulasa.

Por "consisfe esencialmente de" celulasa, se entiende que la polisacaridasa contiene solamente niveles significativos de una polisacaridasa diferente a la celulasa. En otras modalidades representativas, la composición se pone en contacto con una celulasa y una pectinasa. En otras modalidades ejemplares, la composición se somete a digestión por una celulasa, una pecíinasa y una amilasa. En una de dichas modalidades, la composición se digiere inicialmente con la celulasa y la pectinasa, y luego se somete a digestión con la amilasa (por ejemplo, después de la degradación enzimática con la celulasa y pectinasa se complete o se compleía subsíancialmente, por ejemplo, al menos 70%, 80% o 90% compleía).

Las reacciones específicas de reacción para la digestión enzimáíica se pueden seleccionar y optimizar para alcanzar cualquier punto final(es) deseado(s) como grado de pureza, recuperación de oocistos, viabilidad de oocisfos, escala de procesamiento, eficiencia de íiempo, eficiencia de costo, compatibilidad con otros pasos en el procedimienío, compatibilidad con el equipo, y los similares. La caníidad de enzima añadida a la composición se selecciona para alcanzar el nivel deseado de purificación sin afecfar de manera adversa la recuperación y/o viabilidad de los oocisíos. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que el periodo de tiempo requerido para completar la digestión enzimática es dependieníe de la íemperaíura y conceníración enzimática así como de la enzima particular utilizada. Por lo íanío, con conceníraciones enzimáíicas inferiores, íípicameníe se utiliza un tiempo de reacción más largo y/o mayor temperatura de reacción para obtener el mismo grado de digestión. En modalidades particulares, cada enzima está presente a una concentración de al menos aproximadamente 0.25 x 103 unidades/litro, aproximadamente 0.5 x 103 unidades/litro, aproximadamente 1 x 103 unidades/liíro, aproximadamente 2 x 103 unidades/liíro, aproximadameníe 5 x 103 unidades/lifro, aproximadameníe 1 X 104 unidades/lifro, aproximadamente 2 x 104 unidades/liíro, aproximadameníe 4 x 104 unidades/liíro, aproximadameníe 5 x 104 unidades/liíro, aproximadameníe 1 x 105 unidades/liíro, aproximadamente 2 x 105 unidades/litro o aproximadamente 3 x 105 unidades/lilro y menos de aproximadameníe 2 x 104 unidades/liíro, aproximadamente 3 x 10 unidades/litro, aproximadameníe 5 x 10 unidades/liíro, aproximadamenle 8 x 104 unidades/lilro, aproximadamente 10 x 104 unidades/litro, aproximadamente 12 x 104 unidades/litro, aproximadamente 15 x 104 unidades/litro, aproximadamente 20 x 104 unidades/litro, aproximadamente 25 x 104 unidades/litro, aproximadameníe 30 x 104 unidades/litro, aproximadamente 40 x 104 unidades/litro, aproximadameníe 50 x 104 unidades/liíro, aproximadamente 10 x 105 unidades/litro, aproximadamente 15 x 105 unidades/liíro, aproximadameníe 20 x 105 unidades/litro, aproximadameníe 35 x 105 unidades/litro, aproximadamente 50 x 105 unidades/liíro, aproximadameníe 10 x 106 unidades/litro, aproximadamente 20 x 106 unidades/litro, aproximadameníe 25 x 106 unidades/liíro, o aproximadamente 30 x 106 o más, con cualquier combinación en los límites superiores e inferiores. Con respecto a la celulasa, en modalidades ilustrativas, la ceiuiasa está preseníe en una cantidad de aproximadameníe 0.5 x 104 a 35 x 05 unidades por litro, aproximadamente 1 x 104 a 15 X 105 unidades/litro, aproximadamente 2 x 104 a 50 x 104 unidades/liíro, aproximadamente 3 x 104 a 30 x 104 unidades/litro, aproximadamente 4 x 104 a 25 x 104 unidades/litro, o aproximadamente 8 x 104 a 20 x 104 unidades/lilro o más. Para pecíinasa, en modalidades represeníalivas, la pecíinasa está presente en una cantidad de aproximadamente 5 x 104 a 20 x 106 unidades/litro, aproximadamente 1 x 105 a 10 x 106 unidades/litro, aproximadamente 2 x 105 a 5 x106 unidades/litro, o aproximadamenle 3 x 105 a 2.5 x 106 unidades/liíro o más. Para amilasa, en modalidades represenlaíivas, la amilasa esíá presente en una caníidad de aproximadameníe 0.25 x 103 a 15 x 104 unidades/liíro, aproximadamente 0.5 x 103 a 8 x 104 unidades/litro, aproximadamente 1 x 103 a 5 x 104 unidades/litro, o aproximadamenle 2 x 103 a 3 x 104 unidades/litro o más. La duración de la digestión enzimática se selecciona para lograr la reducción deseada en desechos fecales sin afectar de manera adversa la recuperación y/o viabilidad de los oocistos. Como se discutió anteriormente, la velocidad de la reacción enzimática generalmente depende de la temperalura de reacción, concentración enzimática y la polisacaridasa particular utilizada.

En modalidades particulares, la reacción de digestión se lleva a cabo por al menos aproximadamente 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas o 3 horas y por lanío como por aproximadamente 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 24, 30 ó 36 horas o más, con cualquier combinación en los límites superiores e inferiores.

Los intervalos de tiempo ilustrativos para llevar a cabo la digestión enzimática son de aproximadamente 30 minutos a 24 horas, de aproximadamente 1 a 20 horas, de aproximadamente 1 a 15 horas, de aproximadamente 2 a 10 horas, de aproximadamente 2 a 8 horas, y de aproximadamente 2 a 5 horas. En algunos casos, la digestión enzimática se lleva a cabo por un periodo de tiempo más largo que es necesario para completar la reacción de digestión.

Por ejemplo, puede ser conveniente llevar a cabo la digestión durante toda la noche, aún cuando la reacción se completa en un periodo de tiempo más corto. El procedimiento de digestión enzimática típicamente se lleva a cabo a una temperatura(s) que alcanza la velocidad de reacción deseada (por ejemplo, íiempo del procedimienío) pero que no aféela de manera adversa la recuperación y/o viabilidad de los oocistos. En general, la temperatura es usualmente menor de aproximadamente 31 °C o 32°C. En modalidades de la invención, la temperatura es de al menos aproximadamente 12, 15, 18, 20, 21 , 22 ó 24°C y es menor de aproximadamente 26, 27, 28, 29 ó 30°C, con cualquier combinación en los límites superiores e inferiores. Las temperaturas ilustrativas para la digestión enzimática se encuentran en el intervalo de aproximadamente 15°C a 30°C, aproximadamente 18°C a 29°C, y de aproximadamente 21 °C a 27°C. De manera similar, el pH de la reacción se puede seleccionar de manera rutinaria para alcanzar el nivei deseado de actividad enzimática y de purificación de los oocistos. En modalidades ejemplares, la digestión con celulasa y/o pectinasa se lleva a cabo a un pH en el intervalo de aproximadamente pH 1 a pH 7.5, de aproximadamente pH 2 a pH 6.5, de aproximadamente pH 3 a pH 6, o de aproximadamente pH 4 a pH 5.5 ó 6. En el caso de amilasa, la reacción generalmente se lleva a cabo de aproximadamente pH 4 a pH 7.5, dependiendo en parte de la fuente de la amilasa (por ejemplo, a partir de bacterias u hongos). En modalidades particulares, la reacción se lleva a cabo en un intervalo de aproximadamente pH 4.5 a pH 7, de aproximadamente pH 6 a pH 8 o de aproximadamente pH 6.5 a pH 7.5. Si se utiliza más de una enzima para la digestión, el pH de la solución se puede ajustar para cada reacción enzimática. En métodos ejemplares, la composición se digiere inicialmente con celulasa y/o pectinasa a un pH en el intervalo de aproximadamente pH 3 a pH 6 o de aproximadamente pH 4 a pH 5.5 ó 6. El pH de la solución se ajusta entonces de aproximadamente pH 4 a pH 7.5 o de aproximadamente pH 6.5 a pH 7.5, por ejemplo, mediante la adición de la base o mediante el intercambio con una solución en el intervalo de pH deseado (por ejemplo, concentración mediante centrifugación y resuspensión en la solución novedosa) para la digestión con amilasa. Al llevar a cabo la reacción dentro de una temperatura o "intervalo" de pH, se entiende que la reacción se puede llevar a cabo en una o más temperaturas o pH dentro dei intervalo indicado de temperaíura o de pH, respectivamente. Después de que se ha alcanzado el nivel deseado de digestión enzimáíica, la enzima(s) se puede remover opcionalmente (por ejemplo, mediante la separación de los oocistos a partir del maíerial líquido mediante técnicas estándares tales como la centrifugación o filíración en flujo fangencial) o inactivar (por ejemplo, mediante el cambio de la temperatura y/o pH y/o medianíe inactivación mecánica). Por lo íanío, en modalidades particulares, el método comprende adicionalmente remover la enzima a partir del contacto con los oocistos, y opcionalmente recolectar los oocistos (por ejemplo, mediante centrifugación, flotación o filtración en flujo tangencial) para el siguiente paso en el esquema de purificación, para sanitización, o para un uso terminal lales como la elaboración de la vacuna). Un méíodo ejemplar de digestión enzimáíica de conformidad con la preseníe invención se establece a continuación. De conformidad con esta modalidad, la composición comprende oocistos de Eimeria. La composición se digiere con celulasa, y opcionalmente con pectinasa, por aproximadameníe 2 a 18 horas, a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 21 °C a 27°C, y un pH en el intervalo de aproximadamente pH 4 a pH 6. La concentración de la celulasa se encuentra en el intervalo de aproximadamente 8 x 104 a 20 x 104 unidades/litro y, si está presente, la concentración de pectinasa se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1 x 105 a 10 x 106 unidades/litro. Los métodos de digestión enzimática de ¡a ¡nvención se pueden utilizar solos o se pueden incorporar dentro de un esquema de purificación de oocisto más grande. Los métodos para la producción de oocistos se conocen en la técnica e incluyen méíodos para la producción de oocisíos de Eimeria como se describe por la Patente de E.U.A. No. 3,147,186 a Auburn Research Foundation; Pateníe de E.U.A. No. 4,544,548 a Internationale Octrooi Maatschappij "Octropa" B. V.; Pateníe de E.U.A. No. 4,863,731 a Unilever Patent Holdings; Publicaciones de Patente Internacional WO 00/50072 a Pfizer, Inc.; WO 03/020917 a Embrex, Inc.; y WO 02/37961 a Novus International, Inc.; Hammond et al., (1944) Amer. J. Vet. Res. 5: 70; Hill et al., (1961 ) J. Parasit. 47: 357; Jackson, (1964) Parasiíology 54: 87; Lofze et al., (1961 ) J. Parasit. 47: 588; Schmatz et al., (1984) J. Protozool. 31 : 181 ; Whitlock, (1959) Aust. Vet. J. 35: 310 (la descripción de las cuales se incorporan como referencias en la preseníe invención en su totalidad). En general, estos métodos incluyen la infección de un animal con los protozoos de interés, la recolección de las heces que contienen oocistos a partir del animal infectado, purificar los oocistos a partir de la materia fecal a través de una serie de procedimientos de separación tales como el tamizaje, centrifugación, filtración y/o flotación por densidad, esporulación de los oocisíos, pasos opcionales de separación adicional, y, si se desea, sanitizar los oocistos esporulados para inactivar a los microorganismos coníaminanfes. Posteriormente se pueden combinar diferentes preparaciones de oocistos (por ejemplo, a partir de diferentes especies o cepas) para formar un producto final, por ejemplo, una vacuna en contra de múltiples especies de protozoos (por ejemplo, Eimeria). La digestión enzimática se puede llevar a cabo en cualquier punto deníro del procedimiento de purificación del oocisto. La digestión enzimática se puede llevar a cabo durante o después del término de la recolección de las heces, antes de los procedimientos para purificación corriente arriba tal como el tamizaje. En otras modalidades representativas, el procedimiento de digestión enzimática se lleva a cabo después de los pasos para purificación corriente arriba, tales como el tamizaje o cenfrifugación. En general, puede ser ventajoso el uso del procedimiento de digestión enzimáíica antes de los pasos de purificación cascada abajo fales como la floíación para reducir la escala de procesamiento. En otras modalidades, la digestión enzimática se lleva a cabo antes de, o en lugar de, los pasos de purificación cascada abajo, tales como la flotación. Además, la esporulación de los oocistos se puede presentar antes de, concurrentemente con, o después de la digestión enzimática. En algunas modalidades, los oocistos se concentran antes o después de la esporulación ya sea medianíe concentración vía centrifugación o mediante remoción de! líquido por técnicas íales como la filíración en flujo tangencial. Los procedimientos de digestión enzimática se pueden incorporar ya sea antes o después de dicho paso de concentración. En una modalidad ¡lusírativa de la invención, los oocisíos en la composición fecal se someten a paso de purificación corriente arriba (por ejemplo, cenfrifugación y/o íamizaje) y posteriormente esporulación. De conformidad con esía modalidad, la digestión enzimática se lleva a cabo en un punto después del paso de esporulación y antes de (o en lugar de) los pasos de purificación cascada abajo, tal como la flotación por densidad. En modalidades particulares, los procedimientos de purificación comprenden adicionalmente un paso de flotación por densidad, por ejemplo, flotación en una solución salina (por ejemplo, sulfato de magnesio) o solución de glicerol (por ejemplo, glicerol-arginina). Los métodos de soluciones salinas y no iónicas para flotación por densidad y flotación por densidad utilizando soluciones salinas y no iónicas se describen en las Publicaciones de Pateníe Internacional WO 00/50072 (Pfizer, Inc.) y WO 03/020917 (Embrex, Inc.), las cuales se incorporan como referencias en la presente ¡nvención en sus íolalidades. En modalidades represenlalivas, ei procedimienío para floíación por densidad se lleva a cabo después los procedimientos de digestión enzimáíica. Los méíodos para llevar a cabo la flotación por densidad de oocistos se conocen en la técnica. En modalidades particulares, la flotación por densidad comprende: suspender una preparación que contiene oocistos en una composición que comprende un líquido de alta densidad para formar una suspensión bajo condiciones adecuadas para resultar en la flotación de los oocistos, y la recuperación de los oocistos a partir de la suspensión. Generalmente, el material que contiene los oocistos se mezcla con la solución para flotación, y se deja que la solución se separe, con los oocistos remanentes en la fracción sobrenadante y los desechos fecales que forman un concentrado. La centrifugación se puede utilizar para facilitar o mejorar la separación. El medio para flotación se puede remover a partir de los oocistos mediante cualquier méíodo adecuado conocido en la técnica, incluyendo paso de cenírifugación/lavado, diálisis y filíración (por ejemplo, filfración en flujo tangencial). Si se desea, los oocistos purificados se pueden sanitizar para producir una solución estéril. Un paso de sanitización es un paso opcional que íípicamente se emplea en métodos para la producción de oocistos para vacunas aviares in ovo y algunas veces también se utiliza para vacunas aviares post eclosión. Como se sabe en la técnica, los oocisíos para uso en preparaciones de vacuna se sanilizan convencionalmenle utilizando soluciones de hipoclorito de sodio. Otros métodos para sanitización de oocistos se describen en WO 03/020917 (Embrex, Inc.); la descripción de la cual se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad. En modalidades de la invención, la digestión enzimática (y, opcionalmente, otros, pasos de purificación) se lleva a cabo en una solución aníi-microbiana. La acción de la polisacaridasa en la liberación de los carbohidratos simples puede promover potencialmente el rápido crecimiento de microorganismos conlaminantes. Los ejemplos de soluciones antimicrobianas adecuadas se describen en la Publicación de Pateníe Internacional WO 03/020917 (Embrex, Inc.); la descripción de la cual se incorpora en la presente invención como referencia en su íolalidad. En modalidades particulares, la composición que comprende la maíeria fecal y los oocistos se pone en contacto con oirás enzimas tales como la lipasa y/o la proteasa además de la polisacaridasa (por ejemplo, concurrentemente o secuencialmente en cualquier orden). Los inventores han encontrado adicionalmente que la eficiencia de la digestión enzimática de los desechos fecales se puede influir por la dieta para alimentación a los animales a partir de los cuales se recolecía la materia fecal. En modalidades particulares, los animales son alimentados con una dieta que tiene un famaño medio de partícula grande duraníe y/o antes del período de recolección del oocisto. Las dietas ejemplares con tamaño de partícula grande contienen granos enteros íales como la cebada, maíz (por ejemplo, maíz fragmeníado), írigo, avena, mijo y/o sorgo. Por ejemplo, la alimeníación a los aves con una dieía que contiene cebada parece producir una composición que se digiere más eficientemente. La cebada puede estar en cualquier forma que es adecuada para uso en una dieta para aves de corral, tal como cebada en hojuelas mediante procesamiento con vapor. Por lo tanto, los métodos de la invención se pueden, llevar a cabo con materia fecal que contiene oocistos recolectados a partir de la alimentación de un ave(s) con una dieta que contiene cebada, por ejemplo una dieta de cebada-soya. Las dietas ilustrativas contienen al menos aproximadameníe 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más cebada (p/p). Oirás dielas ejemplares contienen de aproximadamente 15% a 70% (p/p), de aproximadameníe 20% a 60% (p/p), de aproximadameníe 20% a 50% (p/p), de aproximadamente 25% a 45% (p/p), o de aproximadamente 25% a 40% (p/p) de cebada. Una dieta representativa contiene aproximadamente 35% (p/p) de cebada en hojuelas mediante procesamiento con vapor; aproximadamente 35% (p/p) de harina de soya con alto contenido de proteína, aproximadamente 10% (p/p) de avena ondulada; aproximadamente 6% (p/p) de salvado de arroz y otras grasas, minerales, vitaminas y suplementos para mantener la salud de los aves.

Las dietas animales que tiene un tamaño medio de partícula grande se describen en WO 03/020917 (Embrex, Inc.), la cual se incorpora como referencia en la preseníe invención en su íoíalidad. Se conocen en la técnica los métodos para proporcionar enzimas a los aves mediante alimentación para mejorar la digestión de alimento que contiene polisacárido (véase, por ejemplo, Pateníe de E.U.A. RE38,047; hemicelulasa), para mejorar la velocidad de crecimiento (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. 6,333,062; alfa-galactosidasa), para tratar la mala absorción (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. WO 91/04673; celulasa o xilanasa) y/o síndrome del tipo pasty vent. Por lo tanío, la polisacaridasa se puede proporcionar medianíe alimentación a los animales (por ejemplo, aves) a partir de los cuales se recolecta la materia fecal y los oocistos son cosechados. Las preparaciones multienzimáticas están comercialmente disponibles, por ejemplo, Natugrain®, Selfeed®, y Hemicell®. Los métodos de digestión enzimática de la invención se pueden llevar a cabo para alcanzar las reducciones deseadas en la maíeria fecal, por ejemplo, de al menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% (v/v), (p/p) o (p/v) o mayor. Además, en modalidades particulares, la recuperación de oocistos (opcionalmente, oocistos viables) a partir del procedimiento de digestión enzimática es de al menos aproximadameníe 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% (v/v), (p/p) o (p/v) o mayor. Se conocen en la técnica los métodos para la determinación de la viabilidad del oocisto, por ejemplo mediante la evaluación de la infectividad de los oocistos (véase, por ejemplo, el ejemplo 7).

Composiciones inmunoqénicas Las composiciones inmunogénicas producidas ufilizando los méíodos de la preseníe ¡nvención se pueden adminisírar a un sujeto animal para vacunar en contra de una enfermedad por protozoos. Se puede administrar una composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna) que contiene oocistos que se ha producido utilizando los métodos de la presente invención para inducir una respuesta inmune. Típicamente, la composición inmunogénica comprende una cantidad inmunogénica de oocisfos como se describe en la preseníe invención en combinación con un vehículo farmacéuíicamente acepíable. Una "cantidad inmunogénica" es una cantidad de los oocisíos que es suficiente para iniciar o evocar una respuesla inmune en el sujeto al cual se le administra la composición inmunogénica. Como se entiende por aquellos expertos en la técnica, la composición ¡nmunogénica se puede formular con organismos vivos, atenuados y/o muertos. Este método también es aplicable a otras etapas de vida parasiíaria, tales como los esporozoítos o esporocistos. Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es biológicamente indeseable o indeseable de otra manera, por ejemplo, el material se puede adminisírar a un sujeto sin ocasionar efectos biológicos indeseables. Por lo tanto, dicha composición farmacéutica se puede utilizar, por ejemplo, para preparar composiciones para inmunización. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener otros compuestos incluyendo pero no limitados a estabilizantes, sales, reguladores de pH, adyuvantes y/o conservadores (por ejemplo, agentes antibacterianos, antifungales y antivirales) como se conocen en la técnica. El vehículo farmacéuticamente aceptable no íiene que esíar estéril, aunque generalmeníe éste será para administración ¡n ovo a embriones aviares. Se puede emplear cualquier ruta de administración de la composición ¡nmunogénica conocida en la técnica siempre y cuando se induzca una respuesta inmune activa (preferiblemente, una respuesla inmune protectora) en contra del protozoo. Cuando el sujeto es un ave, la composición inmunogénica se puede administrar in ovo o post-eclosión. Las rutas ejemplares de administración son administración oral post-eclosión o inyección ¡n ovo (por ejemplo, dentro del amnios). En modalidades particulares de la invención, se emplea la administración in ovo utilizando equipo para inyección automatizada. Los términos "vacunación" o "inmunización" se entienden bien en la técnica. Por ejemplo, los términos vacunación o inmunización se pueden entender como un procedimiento que resulte en y/o incrementa una reacción inmune del sujeto hacia un antígeno, y por lo tanto su capacidad para resistir o superar la infección. Los métodos de vacunación de aves in ovo en contra de Eimeria se conocen en la técnica (por ejemplo, Patente de E.U.A. No: 6,500,438; Patente de E.U.A. No. 6,495,146; y Patente de E.U.A. No. 6,627,205; Pfizer, Inc.). Los términos "inmunidad protectora" o "respuesta inmune protectora", como se utilizan en la presente invención, se pretende que signifiquen que el animal hospedero monta una respuesta inmune activa a la vacuna, de íal manera que después de la exposición o prueba subsecuente, el animal es capaz de combatir la infección. Por lo íanlo, una respuesía inmune protectora disminuirá la incidencia de morbidez y mortalidad a partir de la exposición subsecuente al patógeno entre los animales tratados. Aquellos expertos en la técnica entenderán que en una instalación comercial para cría de animales domésticos, la producción de una respuesía inmune protectora se puede evaluar medianíe la evaluación de los efectos de vacunación sobre la bandada o rebaño como un iodo, por ejemplo, aún pueden existir signos de enfermedad o de morbidez y mortalidad en una minoría de los animales vacunados. Por "respuesta inmune activa", se entiende cualquier nivel de protección a partir de la exposición subsecuente al proíozoo o aníígenos del proíozoo que es de cierto beneficio en una población de sujetos, ya sea en la forma de una mortalidad disminuida, lesiones disminuidas, velocidades mejoradas de conversión del alimento, o la reducción de cualquier otro efecto detrimental de la enfermedad, y los similares, sin importar si la protección es parcial o completa. Una "respuesta inmune activa" o "inmunidad activa" se caracteriza por la "participación de tejidos y células del hospedero después de un encuentro con el inmunógeno. Esfa incluye la diferenciación y proliferación de las células inmunocompelentes en tejidos linforeticulares, lo cual lleva a la síntesis del anticuerpo o la reactividad mediada por desarrollo celular, o ambos". Herberí B. Herscowiíz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, en IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). Alternativamente se ha establecido que una respuesta inmune activa se monte por el hospedero después de la exposición a inmunógenos medianíe la infección, o como en el presente caso, mediante la vacunación. La inmunidad activa se puede contratar con la inmunidad pasiva, la cual se adquiere a través de la "transferencia de sustancias preformada (anticuerpo, factor de transferencia, injerto tímico, inferleucina-2) a partir de un hospedero activamente inmunizado hacia un hospedero no inmune." Id. Los ejemplos, a continuación, se establecen para ilustrar la presente invención, y no deben considerarse como limitaníes de la misma.

EJEMPLO 1 Pruebas enzimáticas Se llevó a cabo un experimento inicial para evaluar la viabilidad de utilizar enzimas digestivas para purificar oocistos de Eimeria. Los oocistos de E. máxima se produjeron en aves para asar. Las heces que coníienen oocistos se recoleclaron de 5 a 8 días post-ínoculación dentro de una solución antimicrobiana que consiste de 10% de ácido cítrico, 0.75 a 3% de peróxido de hidrógeno, y 0.25% de ácido propiónico. Los materiales fueron tamizados para remover desechos grandes y esporularon en 10% de ácido cífrico, 0.75 a 3% de peróxido de hidrógeno, y 0.25% de ácido propiónico con agiíación y aereación por al menos 48 horas. Una muesíra de maíerial se lomó después de la esporulación y se sometió a diversos tratamientos enzimáticos (véase el cuadro 1). Las enzimas (celulasa y amilasa) se obtuvieron a partir de dos fuentes comerciales (Novozymes y Genencor) para uso en este experimento. Las enzimas se añadieron a 20% (v/v) a cada preparación. El pH de la muestra se ajustó a aproximadamente pH 4.5 para tratamiento con celulasa o traíamienío con celulasa + amilasa y a pH 7.0 para fratemienlo con amilasa sola. Los materiales se incubaron por hasía 3 días con agiíación suave, y se llevó a cabo la cuenta de oocistos y las determinaciones de los desechos. Los oocistos se coníaron mediante el método de McMasters (Hodgson, J. N., (1970) Coccidiosis: ovocites counting technique for coccidiosíat evaluation. Exper. Parasitol. 28: 99-102). Los valores de los desechos se determinaron mediante centrifugación de una submuestra representativa a 1800 x g por 10 minutos, midiendo el volumen de los sólidos concentrados y calculando el volumen de sólidos que se pueden concenírar por volumen de muestra. Posteriormente se determinaron los sólidos totales al multiplicar el valor para los sólidos que se pueden concentrar por mL de muestra por el volumen de muestra toíal. Los resulíados se presenten en el cuadro 1 a continuación.

En esíe ejemplo y en los siguientes ejemplos, la acíividad específica de las preparaciones enzimáficas recibidas para la elaboración fueron como sigue: celulasa (8.4 x 105 unidades/litro); pecíinasa (2.6 x107 unidades/lilro); y amilasa (3 x 105 unidades/litro). Los materiales se diluyeron en una base v/v como se indica para cada experimento.

CUADRO 1 Tratamiento de heces de polio que contienen oocistos esporulados de E. Máxima con enzimas ND: No determinado.

Resultados. Las muestras conírol parecen normales. El mejor resultado se observó con las Novozymes celulasa a 1 día de incubación. Esencialmente se obtuvo la recuperación cuantitativa de oocistos, y los oocistos tuvieron una apariencia normal. Aproximadamente 73% de los desechos se han hecho solubles después de 1 día de incubación. La reducción de los desechos no cambia mucho con la incubación adicional. Basándose en estos resulíados, se llevaron a cabo esfudios adicionales enfocándose en el tratamiento con celulasa y/o amilasa.

EJEMPLO 2 Experimentos Multi-enzima I: Estudios utilizando sólidos fecales a partir de los cuales los oocistos han sido removidos Los aves para asar se infectaron con oocistos de E. máxima, y las heces que contienen oocistos se recoleclaron de 5 a 8 días posí infección. Las heces se recolecíaron dentro de 10% de ácido cítrico, 0.75 a 3% de peróxido de hidrógeno, y 0.25% de ácido propiónico. La suspensión se tamizó para remover las partículas grandes, y los oocistos se esporularon por al menos 48 horas en 10% de ácido cítrico, 0.75 a 3% de peróxido de hidrógeno, y 0.25% de ácido propiónico con agitación y aereación. Después de la esporulación, la suspensión se centrifugó para concentrar los oocislos y los desechos fecales, y el sobrenadante se desechó. El concenírado se resuspendió en solución para flolación de sulfato de magnesio ajustada a una densidad de 1.2 g/mL y cenírifugada a 1800 x g por aproximadamente 10 minuíos. Los oocisíos, contenidos en el sobrenadante, se diluyeron con agua y se procesaron adicíonalmente para uso en oíros experimentos. El maíerial remanente concenírado, el cual representa el materia fecal no digerido a partir de las aves de producción, se resuspendió en 10% de ácido cítrico y 0.25% de ácido propiónico. Estos sólidos representan los desechos vegetales residuales insolubles blanco a partir de las heces los cuales se solubilizaron vía digestión enzimática. Los sólidos se utilizaron en una serie de experimentos para evaluar las diversas condiciones de digestión enzimática. La reducción de los desechos se evaluó como se describe en el ejemplo 1.

Tratamiento utilizando celulasa y celulasa + xilanasa. Nueve concentrados por triplicado de 15 mL se prepararon mediante la centrifugación de porciones de los sólidos aníeriormente descritos. Los concentrados se lavaron una vez con PBS. Luego la suspensión se cenfrifugó y los concenfrados se resuspendieron en la solución apropiada para íralamienlo.

CUADRO 2 Tratamientos con celulasa y xilanasa Todos los duplicados se incubaron a temperatura ambiente durante toda la noche con agitación suave. Las suspensiones se centrifugaron entonces a 3000 rpm por 10 minutos, y se midió el volumen de los sólidos concentrados.

CUADRO 3 Resultados del experimento Multi-enzima I: Tratamiento enzimático de sólidos fecales a partir de los cuales los oocistos han sido removidos Resulíados El íraíamienío con celulasa proveyó una reducción del 67% en los desechos. El tratamiento con celulasa + xilanasa no parece ofrecer ninguna ventaja sobre el traíamiento con celulasa sola. Un experimento adicional se llevó a cabo utilizando los 3 fubos por duplicado del experimento 1 írafamienlo 2-Celulasa. La pecíinasa, amiloglucosidasa, o beía-glucosidasa se añadió direcfameníe al fratamienío con celulasa y se incubó durante toda la noche con agiíación suave.

CUADRO 4 Tratamiento con celulasa seguido por pectinasa, amiloglucosidasa o beta-glucosidasa Resulíados El traíamiento con celulasa + pectinasa produjo un sobrenadante clarificado por arriba del concentrado de desechos más pesado. Ni el tratamiento con amiloglucosidasa ni con beta-glucosidasa ofreció ninguna ventaja visible sobre el tratamiento con celulasa sola.

EJEMPLO 3 Experimentos Multi-enzima II: Estudios utilizando materia fecal que contiene oocistos de Eimeria Los pollos para asar se inocularon con cualesquiera de los oocisíos E. acervuiina, E. máxima, o E. tenelia. Las heces que contienen oocistos se recolecíaron durante el periodo pico de producción íoíal de oocistos para cada especie. Las heces se recolectaron dentro de una solución antimicrobiana que consiste de 10% de ácido cítrico, aproximadamente 0.75 a 3% de peróxido de hidrógeno, y 0.25% de ácido propiónico. Las muestras se tamizaron para remover las partículas de desechos grandes y se centrifugó para concentrar los desechos. Las tres muestras por duplicado, cada una de las cuales consiste de 5 mL de sólidos concentrados resuspendidos en PBS pH 5.0 sirvieron como controles para cada tratamiento. Se prepararon las muestras por duplicado por tratamiento enzimático. Las muestras se resuspendieron ya sea en una solución al 20% de celulasa o 20% de celulasa con 4% de pectinasa en PBS pH 5.0 y se incubó a temperatura ambiente con agitación suave por al menos 4 horas. Los oocistos se enumeraron en muestras control y traíamienío utilizando el método de McMasters, y los sólidos se deíerminaron medianíe los métodos descritos en el ejemplo 1. Se calcularon la reducción de los desechos y la recuperación de oocistos con relación a las muestras control.

Preparación de sólidos Se prepararon nueve concentrados por duplicado de 5 mL para cada muestra. Los concentrados se lavaron una vez utilizando PBS. Los concentrados lavados se resuspendieron en la solución enzimática apropiada para los tratamientos 1-3 como se indica en el cuadro 5 a continuación.

CUADRO 5 Tratamiento utilizando celulasa o celulasa + pectinasa Procedimiento Después de la preparación de los traíamieníos 1-3, se llevó a cabo el coníeo de oocisíos y medición de los desechos para el íraíamiento 1 Regulador de pH conírol. Los íraíamieníos 2 y 3 se incubaron durante toda la noche con agilación suave. Después de la incubación, los oocislos se coníaron y se llevaron a cabo las determinaciones de desechos para los íraíamientos 2 y 3. Luego se prepararon los tralamientos con 2-amilasa y 3-amilasa utilizando materiales residuales para los traíamientos 2 y 3 como se indica en el cuadro 6.

CUADRO 6 Tratamientos utilizando celulasa o celulasa + pectinasa seguido por amilasa Los tubos que contienen el material residual a partir de los traíamieníos 2 y 3 se cenírifugaron y los concenírados se lavaron una vez con PBS. Los concenírados lavados se resuspendieron en solución de amilasa. Después de la incubación a temperaíura ambiente durante toda la noche con agitación suave, los oocistos se contaron (Hodgson, J.N., (1970) Coccidiosis: ovocites counting technique for coccidiostaí evaluaíion. Exper. Parasilol. 28: 99-102) y se llevaron a cabo las determinaciones de los desechos para los fraíamientos #2 y 3.

CUADRO 7 Resultados de pruebas enzimáticas utilizando heces de pollo que contienen oocistos de E. acervulina cp Resultados El traíamienío con celulasa + pectinasa produjo una mayor reducción de los desechos que el traíamiento con celulasa sola. El íratamienío con amilasa produjo una mejor reducción de los desechos cuando la muesíra se íraíó inicialmente con celulasa + pectinasa. Aproximadamente 79% de los desechos se removieron utilizando tratamiento con celulasa + pectinasa seguido por traíamiento con amilasa. La recuperación general del oocisío varió eníre 57 y 68% para esíos írafamientos. El frafamienfo enzimáfico proveyó una recuperación aceptable de oocisíos, comparable a o mejor que el 50 al 90% de la recuperación de oocistos típicamente lograda vía técnicas estándares para flotación.

CUADRO 8 Resultados de las pruebas enzimáticas utilizando las heces de pollo que contiene oocistos de E. tenella 4^ --J Resulíados La celulasa + pecíinasa produjo una mucho mayor reducción en los desechos, aproximadamente dos veces en comparación con aquella del íraíamienío con celulasa sola. El íraíamienío con amilasa produjo una mejor reducción de desechos cuando la muestra se trató inicialmente con celulasa + pecíinasa. Aproximadamente 73% de los desechos se removieron utilizando íraíamienío con celulasa + pecíinasa seguido por íraíamienío con amilasa. La recuperación general de oocistos fue esencialmente cuantitativa en esta serie de experimentos.

CUADRO 9 Resultados de las pruebas enzimáticas utilizando heces de pollo que contienen oocistos de E. máxima -P=> Resultados La celulasa + pectinasa produjo una mayor reducción de desechos que el tratamiento con celulasa sola. El tratamiento con amilasa produjo una reducción de desechos mucho mejor (~4X mayor) cuando la muestra se trató inicialmente con celulasa + pectinasa. Aproximadamente 81 % de los desechos se removieron utilizando tratemienío con celulasa + pecíinasa seguido por fraíamiento con amilasa. La recuperación general del oocisto fue de aproximadamente 70% en esta serie de experimentos.

Conclusiones generales La celulasa + pectinasa produjo una mayor reducción de desechos que el traíamiento con celulasa sola. El fratamiento con amilasa produjo una reducción de desechos mucho mejor (~5X mayor) cuando la muestra se trató inicialmente con celulasa + pectinasa. Aproximadamente 80% de los desechos se removieron utilizando tratamiento con celulasa + pectinasa seguido por tralamienío con amilasa. La recuperación del oocisto general fue de aproximadamente 75 a 95% en esía serie de experimentos.

Resumen Digestión enzimática uíilizando una combinación de celulasa y pecíinasa a pH 5. Los niveles de desechos se redujeron después de la esporulación en aproximadamente un 60% para todas las cepas de vacunas; la recuperación del oocisto promedió aproximadamente 82%.

El fratemienío con celulasa + pectinasa se siguió por digestión con amilasa a pH 7 produciendo un íoíal de aproximadameníe 80% en la reducción de los desechos después de la esporulación; la recuperación del oocisto después del tratamiento con amilasa promedió 94.4% para el paso. La recuperación general del oocisto utilizando la secuencia de traíamienfos enzimáíicos promedió 76%.

EJEMPLO 4 Digestión de desechos utilizando ceiuiasa y pectinasa para tres especies de Eimeria Los pollos para asar se inocularon con cualesquiera de los oocisíos de E. acervulina, E. máxima, o E. tenella. Las heces que contiene oocisíos se recolecíaron duraníe el periodo pico de producción íoíal de oocisíos para cada especie. Las heces se recolectaron dentro de una solución antimícrobiana que consistía de 10% de ácido cítrico, aproximadamente 0.75 a 3% de peróxido de hidrógeno, y 0.25% de ácido propiónico. Las muestras se tamizaron para remover las partículas de desechos grandes y se centrifugaron para concentrar los desechos. Tres muestras por duplicado, cada una de las cuales consiste de mL de sólidos concentrados resuspendidos en PBS pH 5.0 sirvieron como controles para cada traíamienío. Se prepararon íres mueslras por duplicado por íraíamiento enzimáíico. Las muesíras se resuspendieron ya sea en una solución al 20% de celulasa o 20% de celulasa con 4% de pecíinasa en PBS pH 5.0 y se incubaron a íemperalura ambieníe con agiíación suave por al menos 4 horas. Los oocistos se contaron utilizando técnicas microscópicas estándares en muestras control y tratamiento, y los sólidos se determinaron mediante centrifugación de las muestras y medición del volumen concentrado. Se calculó la reducción de los desechos y la recuperación del oocisto, con relación a las muestras control. Los resultados se muestran en el cuadro 10 a continuación: CUADR0 10 Digestión de desechos utilizando celulasa sola o en combinación con pectinasa para tres especies de Eimeria Los resultados indican que la celulasa en combinación con pecíinasa produjo una mayor reducción de los desechos que el tratamienío con celulasa sola. Cualquier tratamiento proveyó recuperación aceptable de oocisto, comparable con o mejor que el 50 a 90% de recuperación del oocisto típicamente lograda vía técnicas estándares para flotación.

EJEMPLO 5 Curso de tiempo de los desechos fecales Digestión utilizando 20% de celulasa y 4% de pectinasa Los pollos para asar se inocularon con oocistos de E. máxima.

Las heces que contienen los oocistos se recolectaron de 5 a 8 días post inoculación. Las heces se recolectaron deníro de una solución anfimicrobiana que consisíe de 10% de ácido cíírico, de aproximadameníe 0.75 a 3% de peróxido de hidrógeno, y 0.25% de ácido propiónico. La muesíra se íamizó para remover las partículas grandes de los desechos y se centrifugó para concentrar los desechos. Se prepararon veinte muesfras por duplicados de 5 mL de los sólidos concentrados. El pH de the las muestras se ajustó a aproximadamente pH 5.0. Las muestras se centrifugaron para concentrar los sólidos. Dos muestras control se resuspendieron en PBS ajustado a pH 5.0. Las dos muestras se centrifugaron para concentrar los sólidos y se midió el volumen de los concentrados. Las 18 muestras remanentes se resuspendieron en 20% de celulasa más 4% de pectinasa en PBS ajustado a pH 5.0. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente con agitación suave. A aproximadamente intervalos de media hora, un duplicado se centrifugó y se midió el volumen del concentrado: Se calculó el porcentaje de reducción de los desechos en relación con el volumen promedio del concentrado de las dos muestras conírol. Los resultados se muestran en la figura 1.

Los resulfados indican que la digesíión enzimáíica de desechos uíilizando una combinación de celulasa y pecíinasa esíuvo aproximadameníe 90% compleía en aproximadameníe 1 hora y aproximadameníe 99% compleía en 3 a 5 horas. En general, la celulasa y la pectinasa solubilizaron aproximadamente el 57% de los desechos en la muestra.

EJEMPLO 6 Uso de enzimas en el alimento Se sabe que el uso de enzimas en el alimento para pollo contribuye a la capacidad de digestión general del alimento. Se evaluó la posibilidad de que las enzimas en el alimento también pudieran reducir los niveles de sólidos fecales después de la recolección de los oocislos. Se evaluó una dieía a base de maíz/soya con y sin la presencia de enzimas adicionales en la formulación. Se incluyó una combinación de tres preparaciones enzimáticas comerciales en la diela que contiene enzima (Nalugrain®, Selfeed®, y Hemicell®). Las aves para asar se colocaron 9 por corral utilizando 5 corrales por duplicado para cada uno de los tratamientos de dieta. Las aves se inocularon con oocistos de E. máxima. Las heces que contienen oocistos se recolectaron de los días 5 a 8 post inoculación. Las heces se recolecíaron deníro de una solución anfimicrobiana que consiste de 10% de ácido cítrico, de aproximadamente 0.75 a 3% de peróxido de hidrógeno, y 0.25% de ácido propiónico. Cada muestra por duplicado se ajustó a un volumen toíal de 8 L, se agiíó bien, y se submuesíreó. Se tomaron dos submuesíras de -50 mL a partir de cada muesíra y se almacenaron a 4°C. Las muesíras se analizaron para contenido de los desechos y la conceníración de oocisfos. Se aguparon dos muesíras por duplicado de 8 L y se tamizaron para remover las partículas grandes de los desechos y se cenlrifugaron para concentrar los desechos. Las variables ensayadas en el estudio incluyeron los niveles iniciales de desechos y la producción tolal de oocisíos por ave. El cuadro 11 muestra el materiai concenfrado promedio por ave en las heces recolecladas de 5 a 8 días posí inoculación y los oocisíos promedio por ave. Para aquellos corrales en donde se presentó mortalidad se calculó el número de aves promedio basándose en el día de mortalidad. Los tratamientos se compararon utilizando pruebas t de muestras independientes y no se encontraron diferencias significativas en los tralamientos ya sea para el concentrado por ave o para la producción total de oocistos por ave, aunque el concentrado por ave fue numéricamente inferior con enzimas añadidas a la dieta. No se encontraron diferencias significativas en el volumen del concentrado por ave o en la producción tofal de oocisíos por ave eníre las dieías experiménteles con vs. sin enzimas.

CUADRO 11 Comparación de los oocistos promedio por ave y del concentrado por ave para los corrales con dietas diferentes después de la pueba con E. máxima Principal efecto de la dieta no significativo (p>.05). Las muestras de la materia fecal derivadas a partir de una dieta con maíz/soya y sin enzimas se tamizaron y se compararon los resultados. Para cada traternienlo, se aguparon dos duplicado de las mueslras que represenían un total de 18 aves y se tamizaron secuencialmente a través de íamices de malla 18, 60, y 230. Los volúmenes se registraron y se tomaron submuestras representativas en cada etapa del tamizaje. Las muestras se analizaron para contenido de Desechos y concentración de oocistos. Se calcularon la recuperación de oocistos y la reducción de los desechos a través del procedimiento de tamizaje.

CUADRO 12 Análisis de los resultados del tamizaje utilizando la dieta con maíz/soya CUADRO13 Análisis de los resultados del tamízale utilizando la dieta con maíz/soya + enzimas en oo Los resultados indican que la recuperación de oocistos y los niveles del concentrado final fueron similares para ambas dietas. Durante el procedimiento de tamizaje, se observó cualitativamente que la muestra derivada a partir de la dieta con maíz soya + enzimas fue menos viscosa y pasó a través de los tamices más fácilmente que las muestras con el tratamienío no enzimático. En general, el uso de enzimas en el alimento no redujo significativamente el volumen de sólidos ya sea por la recolección o después del tamizaje. Sin embargo, se observó una disminución en los problemas del síndrome tipo pasty vent con las aves que consumen la dieta que contiene enzima, lo cual probablemente se atribuye al efecto reductor de la viscosidad de las enzimas. Aunque las enzimas en el alimento no fueron exitosas para reducir la cantidad de sólidos iniciales, la inclusión de enzimas en la dieta durante la producción de oocistos puede proveer beneficios auxiliares tales como salud generai mejorada del ave y características mejoradas de tamizaje. Los materiales producidos utilizando la dieta con maíz/soya con o sin enzimas así como una dieta con cebada/soya con enzimas se evaluaron adicionalmeníe uíilizando procesamientos cascada abajo ya sea con o sin enzimas seguido por flotación utilizando dos diferentes soluciones para flotación.

Solamente floíación Una muestra de 3 L de material lamizado se concentró mediante cenírifugación a 3000 rpm por 10 minuíos. El sobrenadaníe se decantó y se esíimó el volumen del concenírado. Se utilizaron tres volúmenes de la solución para flotación (ya sea sulfato de magnesio o glicerol-arginina) para resupender el concentrado. La muestra se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos para hacer flolar a los oocistos. Todo el sobrenadante incluyendo los oocistos flotados se decantó denlro de oíro contenedor y se diluyó con 4 volúmenes de agua. La muesíra se cenírifugó a 3000 rpm por 10 minuíos para concenírar los oocisíos. El sobrenadaníe se decantó y se desechó. El concenírado de oocisíos se resuspendió en 200 mL de ácido cítrico al 5%.

Tratamienío enzimático seguido por flotación Una muestra de 3 L de material tamizado se concentró mediante centrifugación a 3000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante se decantó y se estimó el volumen del concentrado. Se utilizaron dos volúmenes de agua para resupender el concentrado. El fosfato de potasio dibásico se añadió para ajustar el pH a 5.0. La celulasa se añadió a 20%, y se añadió la pectinasa a 4%. La muestra se incubó a íemperaíura ambiente y se agitó por aproximadameníe 4 horas. La muesíra se cenfrifugó a 3000 rpm por 10 minuíos. El sobrenadante se decantó y se esíimó el volumen del concenírado.

El concenírado se resuspendió ufilizando 3 volúmenes de solución para floíación (ya sea sulfato de magnesio o glicerol-arginina). La muestra se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos para hacer flotar a los oocistos. Todo el sobrenadante incluyendo los oocistos floíados se íransfirió deníro de oíro coníenedor y se diluyó con 4 volúmenes de agua. La mueslra diluida se cenírifugó a 3000 rpm por 10 minuíos para concenírar los oocisíos. El sobrenadaníe se desechó y el concenírado de oocislos se resuspendió en 200 mL de ácido cítrico al 5%.

CUADRO 14 Purificación de oocistos: Efectos de la dieta, tratamiento enzimático en proceso, y composición de solución para flotación sobre la remoción de los desechos y la recuperación de oocisto El tratamiento en proceso con enzimas seguido por flotación utilizando giicerol-arginina produjo mejor remoción de desechos en comparación con otros tratamientos. Generalmente, ia recuperación de oocisío se mejoró utilizando la dieta basada en cebada.

EJEMPLO 7 Viabilidad de oocistos producidos utilizando enzimas Se evaluó el efecto de la utilización de las enzimas ya sea en el forraje o en el procesamiento en la viabilidad de oocisto en E. máxima. Los oocistos de E. máxima se produjeron en aves para asar ya sea con o sin enzimas en el alimento. Los oocistos producidos utilizando cualquier alimento fueron purificados posteriormente con o sin enzimas en el procedimiento de purificación. Para evaluar la viabilidad de los oocistos purificados producidos como se describió anteriormente, se colocaron cinco aves para asar por corral con cinco corrales por traíamiento en jaulas en batería. Las aves fueron alimeníadas con forraje normal inicial para aves de corral a lo largo del esíudio. A las aves se les adminisfraron 1000 oocisíos esporulados de E. máxima del íraíamienío apropiado vía cebadura oral. Los oocisíos fueron de menos de dos meses de edad en el momento de la adminisíración. Los lechos se sacaron y se añadieron 2 L de fluido para recolección (ácido cítrico al 10% y 0.25% de ácido propiónico) a cada corral al D5 después de la prueba. Al día D8 después de la prueba, los aves se eutanizaron, y las heces se recolectaron a partir de cada corral individualmente. Cada muestra se ajustó a un volumen total de 4L con agua, se mezcló brevemente a una velocidad media en una mezcladora comercial, y se submuestreó. Las concentraciones de oocistos se determinaron utilizando el método de McMasters. Los resultados fueron como se indican en el siguiente cuadro: CUADRO 15 Comparasión de la producción total de oocistos que resulta a partir de oocistos producidos y/o procesados utilizando enzimas Conclusión El uso de enzimas ya sea en la dieta o en el procesamiento o ambos no tiene efecto sobre la viabilidad del oocisto como se determina por la producción total del oocísto.

EJEMPLO 8 Uso de producción a escala de enzimas para métodos de purificación de oocistos Los pollos se infectaron con Eimeria, y las heces resultantes ricas en oocistos se recolecíaron denfro de una solución de ácido cílrico al 10%, 0.75% de peróxido de hidrógeno, y 0.25% de ácido propiónico duraníe el periodo pico de producción total para cada especie. Las heces se tamizaron para remover las partículas más grandes, y los oocislos se esporularon. La suspensión se cenírifugó para concenírar los oocisíos, y el sobrenadante libre de oocistos se desechó. El material concentrado que contiene los oocistos se resuspendió en regulador de pH con fosfato a pH ~5. Las enzimas celulasa y pectinasa se añadieron de aproximadamente 5 a 10% cada una en una base en volumen, y la suspensión se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. Los oocistos tolales y los sólidos totales se determinaron antes y después del tratamiento enzimático.

Resulíados Los resulíados se muestran en el cuadro 16 a continuación: CUADRO 16 Resultados del uso en la producción a escala de enzimas en purificación de oocistos La digestión enzimáíica redujo exitosamente el volumen de sólidos en un promedio de 59%. La recuperación de oocistos fue esencialmente cuantitativa en cada caso. La reducción de la cantidad de sólidos a ser procesados íiene varios efectos positivos sobre el procedimiento, incluyendo 1 ) la reducción de la cantidad de reactivos necesarios para el procesamiento corriente abajo, 2) la reducción de la escala del equipo necesarios para el procesamiento corriente abajo, y 3) la mejoría de la eficiencia de los pasos de purificación subsecuentes. Aunque la invención precedente se ha descriío en cierto defalle a manera de ilusíración y se ejemplifica para propósitos de claridad y entendimiento, será evideníe que ciertos cambios y modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y equivalentes de las mismas.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para purificación de oocistos a partir de una composición que comprende materia fecal, que comprende poner en contacto la composición con polisacaridasa bajo condiciones adecuadas para reducir la cantidad de materia fecal en la composición.

2.- Ei método de conformidad con la reivindicación 1 , caracíerizado además porque comprende adicionalmeníe remover la polisacaridasa a partir del contacto con los oocistos.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende adicionalmente recolectar los oocistos después del contacto con la polisacaridasa.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la polisacaridasa comprende una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste de celulasa, pectinasa, amilasa, xilanasa, arabinasa, alfa-galactosidasa, hemi-celulasa, beta-glucanasa, beía-glucosidasa, amiloglucosidasa, y cualquier combinación de las mismas.

5.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 4, caracíerizado además porque la polisacaridasa comprende celulasa.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la polisacaridasa comprende celulasa y pectinasa.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la celulasa está presente en una cantidad en el intervalo de 2 x 104 a 50 x 104 unidades/litro.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la celulasa está presente en una cantidad en el intervalo de 4 x 104 a 25 xlO4 unidades/litro.

9.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el método comprende: poner en contacto la composición con polisacaridasa que comprende celulasa y pectinasa, y posteriormente poner en contacto la composición con polisacaridasa que comprende amilasa.

10.- El método de conformidad con ia reivindicación 1 , caracterizado además porque los oocistos son oocistos esporulados.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los oocistos son oocistos de Eimeria.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque los oocistos de Eimeria se seleccionan a partir del grupo que consisíe de oocisíos de E. máxima, oocisíos de E. miíis, oocistos de E. íenella, oocislos de E. acervulina, oocistos de E. brunetti,

oocistos de E. necatrix, oocistos de E. praecox, oocistos de E. mivati, y cualquier combinación de los mismos.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque los oocistos de Eimeria se seleccionan a partir del grupo que consiste de oocistos de E. meleagrimitis, oocistos de E. adenoeides, oocistos de E. gallopavonis, oocistos de E. dispersa, oocistos de E. innocua, y oocistos de E. subrotunda, y cualquier combinación de los mismos.

14.- El rnéíodo de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque los oocistos de Eimeria se seleccionan a partir del grupo que consiste de oocistos de E. zuernii, oocistos de E. bovis, y cualquier combinación de los mismos.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque los oocistos de Eimeria se seleccionan a partir del grupo que consisíe de oocisíos de E. ahsaía, oocistos de E. bakuensis, oocistos de E. crandallis, oocistos de E. faurei, oocistos de E. granulosa, oocistos de E. intricata, oocistos de E. marsica, oocístos de E. ovinoidalis, oocistos de E. paluda, oocistos de E. parva, oocistos de E. weybridgensis, y cualquier combinación de los mismos.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracíerizado además porque los oocistos de Eimeria se seleccionan a partir del grupo que consisíe de oocistos de E. intesíinalis, oocisíos de E. vejdovskyi, oocislos de E. piriformis, oocisíos de E. coecicola, oocistos de E.

irresidua, oocistos de E. flavescens, oocistos de E. exigua, oocistos de E. magna, oocistos de E. perforans, oocistos de E. media, oocisíos de E. síiedai, y cualquier combinación de los mismos.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque ta composición se pone en contacto con la polisacaridasa por 30 minutos a 24 horas.

18.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 15, caracíerizado además porque la composición se pone en confacío con la polisacapdasa por dos horas a diez horas.

19.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 1 , caracíerizado además porque la composición se pone en coníaclo con la polisacaridasa a una lemperalura en el intervalo de 15°C a 30°C.

20.- El mélodo de conformidad con la reivindicación 19, caracíerizado además porque la composición se pone en contacto con la polisacaridasa a una temperatura en ei intervalo de 21 °C a 27°C.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la composición se pone en contacto con la polisacaridasa a un pH en el intervalo de pH 1 a pH 7.5.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la composición se pone en contacto con la polisacaridasa a un pH en el intervalo de pH 4 a pH 6.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el método comprende dos pasos de digestión enzimática, los cuales se llevan a cabo a pH diferente.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el método comprende: poner en contacto la composición con la polisacaridasa que comprende celulasa y amilasa a un pH en el intervalo de pH 4 a pH 5.5, y posteriormente poner en contacto la composición con la polisacaridasa que comprende amilasa a un pH en el n ucí vaiw uc t a µn i .o.

25,- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el método comprende adicionalmente un procedimiento para flotación por densidad.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el procedimiento para flotación por densidad se iieva a cabo después de poner en coníacto la composición con ¡a polisacaridasa.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la solución para flotación por densidad es una solución salina.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la solución salina es una solución de sulfato de magnesio.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la solución para flotación por densidad es una solución de glicerol.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la solución de glicerol es una solución de glicerol-poliarginina.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la materia fecal ha sido recolectada a partir de un animal que ha sido alimentado con una dieta que íiene un tamaño medio de partícula grande antes del periodo de recolección.

32.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque la dieta de partícula grande comprende cebada.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la dieta de partícula grande comprende cebada-soya.

34.- Un método para purificación de oocistos de Eimeria a partir de una composición que comprende materia fecal, que comprende poner en contacío la composición con polisacaridasa que comprende celulasa bajo condiciones adecuadas para reducir la caníidad de materia fecal en la composición.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque comprende adicionalmente remover la polisacaridasa a partir del coníacío con los oocisíos.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque comprende adicionalmente recolectar los oocistos después del contacto con la polisacaridasa. 37.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque la polisacaridasa comprende adicionalmente pectinasa. 38.- Un método para purificación oocistos de Eimeria a partir de una composición que comprende materia fecal, que comprende poner en contacto la composición con polisacaridasa que consisíe de celulasa y pecfinasa bajo condiciones adecuadas para reducir la caníidad de maíeria fecal en la composición.