MXPA06006583A - Composiciones que comprenden dos poblaciones distintas de conjugados de polimero-agente activo - Google Patents

Abstract

Se proveen composiciones que comprenden dos poblaciones diferentes de conjugados de polímero-agente activo, en las cuales es diferente el peso molecular promedio en peso de los polímeros asociados con cada población. También se proveen métodos para preparar dichas composiciones y métodos para administrar dichas composiciones.

Description

COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN DOS POBLACIONES DISTINTAS DE CONJUGADOS POLÍMERO-AGENTE ACTIVO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente con composiciones que comprenden dos poblaciones de conjugados polímero-agente activo apropiados para proporcionar un perfil farmacocinético cuando se administran a un paciente. Además, esta invención se relaciona con métodos para preparar las composiciones, preparados farmacéuticos que comprendan las mismas y similares . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los científicos y clínicos enfrentan diversos retos en sus intentos de desarrollar agentes activos en formas apropiadas para su entrega a los pacientes. Los agentes activos que sean polipéptidos, por ejemplo, a menudo se entregan por vía de inyecciones en lugar de la vía oral. De esta manera, el polipéptido se introduce en el torrente sanguíneo sin exponerlo al entorno proteolítico del estómago. La inyección de polipéptidos, sin embargo, tiene varias desventajas. Por ejemplo, muchos polipéptidos tienen una vida media relativamente breve y, por lo tanto, se necesitan inyecciones repetidas, las que a menudo son inconvenientes y dolorosas. Más aún, algunos polipéptidos pueden inducir una o más respuestas inmunes, con la consecuencia de que el sistema inmune del paciente puede activarse para degradar el polipéptido. Por lo tanto, es a menudo problemática la entrega de agentes activos tales como los polipéptidos, aún cuando estos agentes sean administrados mediante inyecciones. Se ha obtenido algún éxito en responder a los problemas de la entrega de agentes activos mediante inyecciones. Por ejemplo, la conjugación del agente activo a un polímero soluble en agua ha resultado en conjugados polímero-agente activo con una inmunogenicidad y una antigenicidad reducidas. Además, estos conjugados polímero- agente activo tienen a menudo una vida media muy incrementada en comparación con sus contrapartes no conjugadas como resultado de una disminución de su eliminación por medio del hígado y/o una disminución de la degradación enzimática en la circulación sistémica. Como consecuencia de tener una vida media más larga, el conjugado polímero-agente activo requiere una dosificación menos frecuente, lo que a su vez reduce el número total de las penosas inyecciones y de las inconvenientes visitas a un profesional del cuidado médico. Más aún, los agentes activos que son solamente marginalmente solubles demuestran un aumento significativo de la solubilidad en agua cuando se conjugan a un polímero soluble en agua.

Debido a la seguridad documentada así como a la aprobación por parte de la Administración de Drogas y Alimentos (FDA, por sus siglas en inglés) de los Estados Unidos, para un uso tanto tópico como interno, se ha conjugado el polietilenglicol a agentes activos. Cuando un agente activo se conjuga a un polímero de polietilenglicol o "PEG", se refiere al agente activo conjugado como "PEGilado" . El éxito comercial de los agentes activos PEGilados tales como el interferón alfa-2a PEGilado PEGASYSF (Hoffman-La Roche, NJ) , el interferón alfa-2b PEGilado PEG-INTRON® (Schering Corp., Kennilworth, NJ) y la PEG-filgastrima NEULASTA™ (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) demuestran que la administración de una forma conjugada de un agente activo puede tener ventajas significativas sobre la contraparte sin conjugar. También se han preparado conjugados con moléculas pequeñas tales como la diestearoilfosfatidiletanolamina (Zalipsky (1993) Bioconjug. Chem. 4(4) :296-299) y el fluoroacilo (Ouchi y col. (1992) Drug Des. Discov. 9 (1) : 93-105) . A pesar de estos éxitos, es a menudo un desafío proporcionar preparados farmacéuticos que contengan conjugados que sean farmacológicamente activos y que al mismo tiempo presenten el balance apropiado entre un inicio rápido y una acción sostenida. Por ejemplo, el interferón alfa-2a PEGilado de marca PEGASYST tiene solamente aproximadamente un 7% de actividad in vitro en comparación con la forma nativa de este interferón. Aunque el producto de interferón PEGilado resultante compensa la disminución de la actividad con una vida media más larga, no todos los productos farmacéuticos tendrán la flexibilidad para meramente proporcionar una actividad sostenida en vivo; muchos productos farmacéuticos idealmente proporcionarían tanto un inicio relativamente rápido como una actividad sostenida en vivo. Por lo tanto, la presente invención busca satisfacer estas y otras necesidades de la técnica proporcionando composiciones que contengan conjugados donde la administración de la composición a un paciente cause un inicio relativamente rápido seguido de una actividad relativamente sostenida. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, la invención proporciona una composición que comprende: una primera población de conjugados polímero-agente activo, en la que cada conjugado polímero-agente activo comprende uno o más polímeros con un peso molecular medio ponderado; y una segunda población de conjugados polímero-agente activo, en la que cada conjugado polímero-agente activo comprende uno o más polímeros con un peso molecular medio ponderado, caracterizadas en que el peso molecular medio ponderado del o de los polímeros de la primera población es distinto del peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la segunda población. La invención también proporciona una composición que se caracteriza en que cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo de aproximadamente 100 Daltones a menos de 20,000 Daltones y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 100 Daltones a aproximadamente 120,000 Daltones, donde el peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la primera población es distinto del peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la segunda población. Además , la invención proporciona una composición caracterizada en que cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 100 Daltones a menos de 20,000 Daltones y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 100 Daltones a aproximadamente 120,000 Daltones, donde el peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la primera población es distinto del peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la segunda población. La invención proporciona además una composición caracterizada en que cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 100 Daltones a menos de 20,000 Daltones y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 20,000 Daltones a aproximadamente 100,000 Daltones. La invención además proporciona una composición caracterizada en que la diferencia absoluta entre el peso molecular medio ponderado de los polímeros de la primera y de la segunda población es desde aproximadamente 500 a aproximadamente 100,000. Además, la invención proporciona una composición caracterizada en que la diferencia absoluta entre el peso molecular medio ponderado de los polímeros de la primera y de la segunda población es desde aproximadamente 2,000 a aproximadamente 100,000. La invención proporciona también una composición caracterizada en que cada polímero tanto en la primera como en la segunda población es un poli (etilenglicol) . La invención proporciona también una composición caracterizada por comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable, para de esa manera proporcionar un preparado farmacéutico. También, la invención proporciona un método para preparar una composición, donde el método comprende las etapas de: (i) proporcionar una primera población de conjugados polímero-agente activo; (ii) proporcionar una segunda población de conjugados polímero-agente activo; y (iii) combinar la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo, para de esa manera formar una mezcla de la primera y de la segunda población de conjugados polímero-agente activo, donde la primera y la segunda población son distintas. La invención proporciona además un método para proporcionar un inicio temprano de la actividad y un inicio retardado de la misma, donde el método se caracteriza por comprender las etapas de: (i) administrar a un paciente una primera población de conjugados polímero-agente activo, donde cada conjugado polímero-agente activo comprende uno o más polímeros con un peso molecular medio ponderado; y (ii) administrar a un paciente una segunda población de conjugados polímero-agente activo, donde cada conjugado polímero-agente activo comprende uno o más polímeros con un peso molecular medio ponderado mayor que el peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la primera población. En la descripción que sigue se establecerán características adicionales y novedosas de la invención que, en parte, se volverán evidentes para las personas capacitadas en la técnica una vez que estas personas hayan leído la descripción, o pueden ser aprendidas mediante la práctica de la invención.

En una realización de la invención, se proporciona una composición que comprende dos poblaciones de conjugados polímero-agente activo. En la primera población, los conjugados se preparan a partir de polímeros cada uno de los cuales tiene un peso molecular medio ponderado que es sustancialmente el mismo. Similarmente, los conjugados de la segunda población también se preparan a partir de polímeros que tienen cada uno de ellos un peso molecular medio ponderado que es sustancialmente el mismo, pero distinto del peso molecular medio ponderado de los polímeros de la primera población. Los conjugados en una población dada cualquiera pueden comprender conjugados unidos de una manera individual (es decir, un polímero único unido a un agente activo único, un tipo de conjugado denominado "1-mer") , así como conjugados unidos de una manera múltiple tales como dos polímeros unidos individualmente a un agente activo único (o un "2-mer") , tres polímeros unidos individualmente a un agente activo único (o un "3-mer") y así sucesivamente. La presente descripción incluye conjugados donde un único polímero se une a dos agentes activos. Se contemplan también combinaciones de conjugados unidos de manera individual o múltiple. Aunque se puede utilizar cualquier polímero para formar un conjugado, se prefiere que el polímero sea un poli (etilenglicol) . Además, el vínculo del conjugado que conecta el polímero al agente activo puede ser un vínculo estable o un vínculo que pueda soltarse (por ejemplo, un vínculo hidrolizable) . Más aún, cada conjugado dentro la composición puede tener un vínculo estable o un vínculo que pueda soltarse, o la composición puede comprender una combinación donde algunos conjugados en la mezcla tienen vínculos estables y otros conjugados en la composición tienen un vínculo que puede soltarse. En otra realización de la invención, se proporciona un método para preparar una composición. Aunque se encuentran disponibles diversos métodos para preparar las composiciones descritas en esta memoria, un método comprende, a manera de ejemplo, las etapas de: (i) proporcionar una primera población de conjugados polímero- agente activo; (ii) proporcionar una segunda población de conjugados poliméricos a agentes activos; y (iii) a combinar la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo, formando de esta manera una mezcla de ambas (primera y segunda) poblaciones de conjugados polímero-agente activo, donde la primera y la segunda población son distintas entre sí. Sin importar el procedimiento que se utilice para preparar las composiciones, se prefiere incluir una etapa de mezclado a continuación de la etapa de combinación para proporcionar una composición sustancialmente homogénea. Ventajosamente, se puede agregar a la composición un excipiente farmacéuticamente aceptable, obteniéndose de esta manera una composición farmacéutica. Como se explica en más detalle a continuación, una ventaja de las composiciones que se describen en este documento es la capacidad de proporcionar un perfil farmacocinético deseado al ser administradas a un paciente. Por lo tanto, se proporciona un método para proporcionar un inicio temprano de la actividad y un inicio retardado de la misma, donde el método se caracteriza por comprender las etapas de: (i) administrar a un paciente una primera población de conjugados polímero-agente activo, donde cada conjugado polímero-agente activo comprende uno o más polímeros con un peso molecular medio ponderado; y (ii) administrar a un paciente una segunda población de conjugados polímero-agente activo, donde cada conjugado polímero-agente activo comprende uno o más polímeros con un peso molecular medio ponderado mayor que el peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la primera población. Típica pero no necesariamente, la administración tiene lugar de manera simultánea como es el caso cuando la primera y la segunda población se encuentran presentes en una única composición, la que se administra al paciente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1 y 2 son representaciones gráficas de los resultados aproximados y esperados de las cuentas de reticulocitos y de los niveles de hemoglobina para los conjugados y las mezclas descritas en el Ejemplo 1 cuando los mismos se administran a un paciente. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de describir la presente invención en detalle, se debe entender que la misma no se limita a polímeros, técnicas de síntesis ni agentes activos particulares, ya que los mismos pueden variar. Se debe tomar en cuenta que, de la manera en que se utilizan en esta memoria técnica y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a un "polímero" incluye tanto a un polímero único como a dos o más polímeros iguales o distintos, una referencia a un "conjugado" incluye tanto a un conjugado único como a dos o más conjugados iguales o distintos, una referencia a un "excipiente" incluye tanto a un excipiente único como a dos o más excipientes iguales o distintos, entre otros ejemplos similares. Para describir y reivindicar la presente invención, la siguiente terminología se utilizará de acuerdo con las definiciones que se describen a continuación. De la manera en que se utilizan en este documento, los términos "PEG", "polietilenglicol" y "poli (etilenglicol) " tienen el propósito de abarcar cualquier poli (óxido de etileno) soluble en agua. Típicamente, los PGE que se utilizan de acuerdo con la invención comprenden la siguiente estructura "-0(CH2 CH20)m- " donde (m) es de 2 a 4000. De la manera en que se utiliza en este documento, PEG también incluye "-CH2CH2-0(CH2 C 2 ) m-CE2Cn2-" y "-(CH2 CH20)m-", dependiendo de si los oxígenos terminales han sido o no desplazados. Cuando los PEG comprenden además un grupo espaciador (el que se describirá en más detalle a continuación) , los átomos que comprenden el grupo espaciador, cuando están covalentemente unidos a un segmento del polímero soluble en agua, no resultan en la formación de un enlace oxígeno-oxígeno (es decir, un enlace "-0-0-" o peróxido) . Para toda la memoria técnica y las reivindicaciones, se debe recordar que el término "PEG" incluye estructuras con diversos grupos terminales o de "cobertura de extremo" . El término "PEG" también significa un polímero que contiene una mayoría, es decir, más del 50%, de subunidades monómeras -CH2CH20-. Con respecto a formas específicas, los PEG pueden tener diversos pesos moleculares así como diversas estructuras o geometrías tales como "ramificadas" , "lineales" , "bifurcadas", "multifuncionales" y otras similares, que se describen en más detalle a continuación. Las expresiones "de extremo cubierto" o "terminalmente cubierto" se utilizan en este documento de manera intercambiable para referirse a una terminal o punto extremo de un polímero que tenga un grupo de cobertura de extremo. Típica, pero no necesariamente, el grupo de cobertura de extremo comprende un grupo hidroxi o alcoxi C1-20. Por lo tanto, los ejemplos de grupos de cobertura de extremo incluyendo alcoxi (es decir, metoxi, etoxi y benciloxi) , así como arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo y similares. Además, se contemplan formas saturadas, insaturadas, sustituidas y no sustituidas de los anteriores. Más aún, el grupo de cobertura de extremo también puede ser un silano. De manera ventajosa, el grupo de cobertura de extremo puede también comprender un marcador detectable. Cuando el polímero tiene un grupo de cobertura de extremo que comprenda un marcador detectable, se puede determinar la cantidad o la ubicación del polímero y/o la porción (es decir, el agente activo) a la que se acopla el polímero mediante el uso de un detector apropiado. Tales marcadores incluyen, entre otras, sustancias fluorescentes, quimioluminiscentes, porciones utilizadas en el etiquetado de enzimas, etiquetas colorimétricas (por ejemplo, colorantes) , iones metálicos, grupos radioactivos y similares. Los detectores apropiados incluyen fotómetros, películas, espectrómetros y similares. La expresión "que no ocurre naturalmente" con respecto a un polímero o segmento de polímero soluble en agua significa un polímero que no se encuentra en su totalidad en la naturaleza. Un polímero o un segmento de polímero soluble en agua que no ocurra naturalmente puede, sin embargo, contener una o más subunidades o porciones de una subunidad que ocurra naturalmente, siempre que la estructura global del polímero no se encuentre en la naturaleza. El término "soluble en agua" como en "segmento de polímero soluble en agua" y "polímero soluble en agua" es cualquier segmento o polímero que sea soluble en agua a temperatura ambiente. Típicamente, un polímero o segmento soluble en agua transmitirá por lo menos aproximadamente 75%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 95% de la luz transmitida por la misma solución luego de una filtración. Sobre una base en peso, un polímero soluble en agua o un segmento del mismo preferentemente será por lo menos aproximadamente 35% (en peso) soluble en agua, más preferentemente por lo menos aproximadamente 50% (en peso) soluble en agua, aún más preferentemente por lo menos aproximadamente 70% (en peso) soluble en agua y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 85% (en peso) soluble en agua. Sin embargo, lo más preferido es que el polímero soluble en agua o el segmento del mismo sea aproximadamente 95% (en peso) soluble en agua o completamente soluble en agua. "Masa molecular" , en el contexto de un polímero de la invención, que sea soluble en agua y que no ocurra naturalmente, tal como PEG, se refiere al peso molecular medio ponderado, que típicamente se determina mediante cromatografía por exclusión de tamaños, técnicas de dispersión de la luz o la determinación de la velocidad intrínseca en 1, 2,4-triclorobenceno. Se puede determinar la masa verdadera de un polímero mediante un planteamiento al que las personas con una capacitación normal en la técnica la refieren como MALDI. Los polímeros de la invención son típicamente polidispersos, con valores de polidispersividad bajos preferentemente de menos de aproximadamente 1.2, más preferentemente de menos de aproximadamente 1.15, aún más preferentemente de menos de aproximadamente 1.10, todavía más preferentemente de menos de aproximadamente 1.05 y de máxima preferencia de menos de aproximadamente 1.03.

Como se utiliza en esta memoria, el término "ácido carboxílico" como en "derivado de ácido carboxílico" o II es una porción con un grupo funcional -G*OH [también representado como "-COOH" o "-C(0)OH"] . A menos que el contexto indique claramente lo contrario, el término ácido carboxílico incluye no sólo la forma acida, si no también los esteres y las formas protegidas correspondientes. Se hace referencia a Greene y colaboradores, Protecting Groups in Organic Chemistry, tercera edición, Wiley, Nueva York, 1999 con respecto a los grupos protectores apropiados para los ácidos carboxílicos y otros grupos funcionales . El término "reactivo" o "activado" cuando se lo utiliza conjuntamente con un grupo funcional específico se refiere a un grupo funcional reactivo que reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo de otra molécula. Esto contrasta con aquellos grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción altamente imprácticas para reaccionar (es decir, un grupo "inerte" o "no reactivo") . De la manera en que se utiliza en esta memoria, el término "grupo funcional" o cualquier sinónimo del mismo abarca las formas protegidas del grupo. El término "espaciador" o "porción espaciadora" se utiliza en esta memoria para referirse a un átomo o conjunto de átomos utilizado opcionalmente para vincular una porción a otra. Las porciones espadadoras de la invención pueden ser hidrolíticamente estables o pueden incluir un vínculo fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente degradable.

"Electrófilo" se refiere a un ion o átomo o conjunto de átomos, que pueden ser iónicos, con un centro electrofílico, es decir, un centro que busca electrones, y que es capaz de reaccionar con un nucleófilo. "Nucleófilo" se refiere a un ion o átomo o conjunto de átomos, que pueden ser iónicos, con un centro nucleofílico, es decir, un centro que busca un centro electrofílico o con un electrófilo. Un enlace "fisiológicamente escindible" o "hidrolizable" o "degradable" es un enlace relativamente débil que reacciona con agua (es decir, es hidrolizado) bajo condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua dependerá no sólo del tipo general del vínculo que conecta dos átomos centrales sino también de los sustituyentes unidos a estos átomos centrales. Los vínculos hidrolíticamente inestables o débiles apropiados incluyen, entre otros, esteres carboxilato, esteres fosfato, anhídridos, acétales, cetales, éteres aciloxialquilo, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos. Un "vínculo enzimáticamente degradable" significa un vínculo que puede ser degradado por una o más enzimas. Un vínculo o enlace "hidrolíticamente estable" se refiere a un enlace químico, típicamente un enlace covalente, que es sustancialmente estable en agua, es decir, no sufre hidrólisis bajo condiciones fisiológicas en ninguna medida apreciable durante un período de tiempo extenso. Ejemplos de vínculos hidrolíticamente estables incluyen, entre otros, los siguientes: enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en las cadenas alifáticas) , éteres, amidas, uretanos y similares. Generalmente, un vínculo hidrolíticamente estable presenta una tasa de hidrólisis de menos de aproximadamente 1 a 2% por día bajo condiciones fisiológicas . Las tasas de hidrólisis de enlaces químicos representativos pueden encontrarse en la mayoría de los textos de química estándares. Los términos "agente activo" , "agente biológicamente activo" y "agente farmacológicamente activo" se utilizan de manera intercambiable en esta memoria y se definen para incluir cualquier agente, droga, compuesto, composición de la materia o mezclas que proporcionen algún efecto farmacológico, a menudo beneficioso, que puede demostrarse in vivo o in vitro. Estos incluyen alimentos, complementos alimenticios, nutrientes, nutricéuticos, drogas, proteínas, vacunas, anticuerpos, vitaminas y otros agentes benéficos. Como se utiliza en esta memoria, estos términos incluyen además cualquier sustancia fisiológica o farmacológicamente activa que produzca un efecto localizado o sistémico en un paciente. Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" o un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que puede incluirse en las composiciones de la invención y que no causa al paciente ningún efecto toxicológico adverso significativo. Los términos "cantidad farmacológicamente eficaz", "cantidad fisiológicamente eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se utilizan de manera intercambiable en este documento para significar la cantidad de un conjugado polímero-agente activo típicamente presente en un preparado farmacéutico- que se necesita para proporcionar un nivel deseado de agente activo y/o conjugado en el torrente sanguíneo o en un tejido determinado. La cantidad exacta dependerá de numerosos factores, por ejemplo, el agente activo específico, los componentes y las características físicas del preparado farmacéutico, la población de pacientes objetivo, consideraciones del paciente y similares, y puede ser fácilmente determinada por una persona con una capacitación normal en la técnica, basándose en la información provista en esta memoria y la que se encuentra disponible en la bibliografía pertinente. En el contexto de un polímero de la invención, "multifuncional" significa un polímero con 3 o más grupos funcionales contenidos en el mismo, donde los grupos funcionales pueden ser los mismos o diferentes. Los polímeros multifuncionales de la invención típicamente contendrán desde aproximadamente 3 a aproximadamente 100 grupos funcionales, o desde 3 a 50, o desde 3 a 25, o 3 a 15 o 3 a 10 grupos funcionales, o contendrán 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 grupos funcionales dentro del polímero. Un polímero "bifuncional" significa un polímero que contiene dos grupos funcionales, sean iguales (es decir, homobifuncional) o distintos (es decir, heterobifuncional) . "Ramificado" , en referencia a la geometría o estructura global de un polímero, se refiere a un polímero que tenga 2 o más "brazos" poliméricos. Un polímero ramificado puede tener 2 , 3 , 4 , 6, 8 o más brazos poliméricos. Un tipo particular de polímero altamente ramificado es un polímero dendrítico o dendrímero, el que, para los fines de la invención, se considera que tiene una estructura distinta de la de un polímero ramificado. Un "dendrímero" o polímero dendrítico es un polímero globular, monodisperso en tamaño, en el que todos los enlaces emergen de forma radial desde un punto focal central o núcleo con un patrón regular de ramificaciones y con unidades de repetición cada una de las cuales contribuye al punto de ramificación. Los dendrímeros presentan ciertas propiedades del estado dendrítico tales como el encapsulamiento de núcleos, lo que los diferencia de manera única de otros tipos de polímeros.

El término "paciente" se refiere a un organismo vivo que sufre de un trastorno, o es propenso al mismo, que puede prevenirse o tratarse mediante la administración de un conjugado como los que se proporcionan en esta memoria, e incluye tanto a humanos como a animales. "Opcional" y "opcionalmente" significan que las circunstancias que se describan a continuación pueden o no ocurrir, de manera tal que la descripción incluye tanto instancias en que ocurre la circunstancia como instancias en que no lo hace. Refiriéndonos ahora a la primera realización de la invención, se proporciona una composición que comprende dos poblaciones distintas de conjugados polímero-agente activo. En contraste con las composiciones que contienen conjugados previamente descritas, las composiciones de mezcla de poblaciones descritas en esta memoria proporcionan tanto un inicio relativamente rápido de la acción farmacológica como una duración relativamente larga de dicha acción cuando son administradas a un paciente. En particular, al proporcionar un inicio relativamente rápido de la acción farmacológica, las composiciones descritas en este documento proporcionan una mejora con respecto a las composiciones de conjugados descritas con anterioridad, las que tradicionalmente sólo han proporcionado una duración relativamente larga de la acción farmacológica.

Ventajosamente, las composiciones descritas en este documento proporcionan un inicio de la acción relativamente rápido y una duración de la acción relativamente prolongada al proporcionar dos poblaciones diferentes del conjugado polimérico del agente activo. Por lo tanto, las composiciones comprenden una primera y una segunda población de conjugados polímero-agente activo.

Además de cualquier otra diferencia, el peso molecular medio ponderado del polímero asociado con la primera población es distinto del peso molecular medio ponderado de la segunda población de conjugados polímero-agente activo. Debido a que el peso molecular medio ponderado asociado con los polímeros de cada población no es el mismo, el peso molecular medio ponderado del polímero asociado con una población será necesariamente menor que el peso molecular medio ponderado del polímero asociado con la otra población. Sólo por consistencia y mayor claridad en la descripción de la invención, los conjugados de agentes activos asociados con el peso molecular medio ponderado relativamente más bajo serán típicamente referidos como la "primera población" mientras que los conjugados de agentes activos asociados con el peso molecular medio ponderado relativamente más alto serán típicamente referidos como la "segunda población". Se deberá tener presente, sin embargo, que los términos "primera" y "segunda" sólo sirven para identificar y distinguir las distintas poblaciones entre sí y no se le deben atribuir ningún otro significado o valor. Por lo tanto, es perfectamente aceptable referirse a la población de conjugados polímero-agente activo asociada con el peso molecular medio ponderado relativamente bajo como la "segunda población" y a la población con el peso molecular medio ponderado relativamente alto como la "primera población" . Aunque no se tiene el propósito de atarse a ninguna teoría, se piensa que la diferencia entre los pesos moleculares medio ponderado asociados con la primera y la segunda población proporciona las acciones combinadas deseadas de un inicio relativamente rápido y de una larga duración. En particular, se piensa que la población de conjugados con polímeros de peso molecular más bajo proporciona un inicio relativamente rápido que no se encuentra presente en la población de conjugados con polímeros de peso molecular más alto. Por lo tanto, al proporcionar una mezcla de cada población, las composiciones descritas en esta memoria resultan (luego de su administración a un paciente) en un perfil farmacocinético con un inicio relativamente rápido así como una duración relativamente larga. Tanto la primera como la segunda población comprende conjugados polímero-agente activo. Un conjugado polímero-agente activo comprende por lo menos un polímero y por lo menos un agente activo. Con respecto al agente activo, se puede utilizar cualquier agente activo y la invención no se limita en este respecto. Los agentes apropiados pueden seleccionarse, por ejemplo, entre hipnóticos y sedantes, energizantes psíquicos, tranquilizantes, drogas respiratorias, antiespasmódicos, relajantes musculares, agentes antiparkinson (por ejemplo, antagonistas de la dopamina) , analgésicos, antiinflamatorios, drogas contra la ansiedad (por ejemplo, ansiolíticos) , supresores del apetito, agentes contra la migraña, contractores musculares, antiinfecciosos (por ejemplo, antibióticos, antivirales, antifungosos y vacunas) , antiartríticos, antimaláricos, antieméticos, antiepilépticos, broncodilatadores, citocinas, factores de crecimiento, agentes anticancerígenos, agentes antitrombóticos, antihipertensivos, drogas cardiovasculares, antiarrítmicos, antioxidantes, agentes antiasmáticos, agentes hormonales (incluidos los anticonceptivos) , simpatomiméticos, diuréticos, agentes regulatorios de lípidos, agentes antiandrógenos, antiparasitarios, anticoagulantes, neoplásicos, antineoplásicos, hipoglucémicos, agentes y complementos nutricionales, complementos de crecimiento, agentes contra la enteritis, anticuerpos, agentes de diagnóstico y agentes contrastantes . Más particularmente, el agente activo puede caer dentro de diversas clases estructurales que incluyen, entre otras, moléculas pequeñas (preferentemente, moléculas pequeñas insolubles) , péptidos, polipéptidos, proteínas, polisacáridos, esteroides, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, grasas, electrolitos y similares. Preferentemente, un agente activo para acoplarse con un polímero como se describe en esta memoria tiene un grupo amino nativo o, en la alternativa, se modifica para contener por lo menos un grupo amino reactivo apropiado para la conjugación con un polímero como se describe en este documento. Ejemplos específicos de agentes activos apropiados para una unión covalente incluyen, entre otros, asparaginasa, amdoxivir (DAPD) , antide, becaplermina, calcitoninas, cianovirina, denileuquina diftitox, eritropoyetina (EPO) , agonistas de EPO (por ejemplo, péptidos desde aproximadamente 10 a 40 aminoácidos en longitud y que comprenden una secuencia núcleo particular) , dornasa alfa, proteína estimulante de la eritropoyesis (NESP) , factores de coagulación tales como el Factor V, Factor VII, Factor Vlla, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XII, Factor XIII, factor de von Willebrand; ceredasa, cerezima, alfa-glucosidas, colágeno, ciclosporina, alfa defensinas, beta defensinas, exedina-4, factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF) , trombopoyetina (TPO) , inhibidor de la alfa-1 proteinasa, elcatonina, factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GMCSF) , fibrinógeno, falgrastima, hormonas de crecimiento, hormona del crecimiento humano (hGH) , hormona de liberación de la hormona de crecimiento (GHRH) , GRO-beta, anticuerpo de GRO-bata, proteínas morfogénicas de los huesos tales como proteína-2 morfogénica de los huesos, proteína-6 morfogénica de los huesos, OP-1; factor de crecimiento de fibroblastos acídico, factor de crecimiento de fibroblastos básico, liogando CD-40, heparina, albúmina de suero humano, heparina de bajo peso molecular (LMWH) , interferones tales como interferón alfa, interferón beta, interferón gama, interferón omega, interferón tau, interferón consenso; interleucinas y receptores de interleucinas tales como el receptor de interleucina-1, interleucina-2, proteínas de fusión de interleucina-2, antagonista del receptor de interleucina-1, interleucina-3, interleucina-4, receptor de interleucina-4, interleucina-6, interleucina-8, interleucina-12, receptor de interleucina- 13, receptor de interleucina-12; lactoferrina y fragmentos de lactoferrina, hormona liberadora de la hormona leutinizante (LHHR) , insulina, pro-insulina, análogos de la insulina (por ejemplo, insulina mono acilada como se describe en la patente de los Estados Unidos N° 5,922,675), amilina, péptido C, somatostatina, análogos de la somatostatina incluyendo octreotida, vasopresina, hormona estimulante de folículos (FSH) , vacuna contra la influenza, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) , insulintropina, factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) , activadores de plasminógeno tales como la alteplasa, uroquinasa, reteplasa, estreptokinasa, pamiteplasa, lanoteplasa, y teneteplasa; factor de crecimiento de los nervios (NGF) , osteoprotegerina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factores de crecimiento de tejidos, factor-1 de crecimiento de transformación, factor de crecimiento vásculo endotelial, factor de inhibición de la leucemia, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) , factor de crecimiento glial (GGF) , receptores de células T, moléculas/antígenos CD, factor de necrosis tumoral (TNF) , proteína-1 quimioatrayente de monocitos, factores de crecimiento endotelial, hormona paratiroidea (PTH) , péptido similar al glucagón, somatotropina, timosina alfa 1, rasburicasa, inhibidor de la timosina alfa 1 Ilb/lIIa, timosina beta 10, timosina beta 9, timosina beta 4, antitripsina alfa-1, compuestos de la fosfodiesterasa (PDE) , VLA-4 (antígeno-4 muy tardío) , inhibidores de VLA-4, bisfosfonatos, anticuerpo del virus sincitial respiratorio, gene regulador de transmembrana de la fibrosis cística (CFTR) , desoxiribunocleasa (Dnasa) , proteína de incremento de permeabilidad/bactericida (BPI) y anticuerpo anti-CMV. Los anticuerpos monoclonales del ejemplo incluyen etanercept (una proteína de fusión dímera que consiste de la porción extracelular ligando-enlazante del receptor de TNF de 75 kD unida a la porción Fe de IgGl) , abciximab, adalimumab, afelimomab, alemtuzumab, anticuerpo del linfocito B, atlizumab, basiliximab, bevacizumab, biciromab, bertilimumab, CDP-571, CDP-860, CDP-870, cetuximab, clenoliximab, daclizumab, ecullizumab, edrecolomab, efalizumab, apratuzumab, fontolizumab, gavilimomab, gentuzumab ozogamicina, ibritumomab tiuxetano, infliximab, imolimomab, keliximab, labetuzumab, lerdelimumab, olizumab, lym'l radioetiquetado, metelimumab, mepolizumab, mitumomab, muromonad-CD3, nebacumab, natalizumab, odulimomab, omalilzumab, oregovomab, palivizumab, pemtumomab, pexelizumab, rhuMAb-VEGF, rituximab, satumomab pendetida, sevirumab, siplizumab, tositumomab, I131 tositumomab, trastuzumab, tuvirumab, visilizumab, tacrina, memantina, rivastigmina, galantamina, donepezil, levetiracetam, repaglinida, alefacept, vardenafil, sildenafil y valaciclovir. Agentes adicionales apropiados para una unión covalente incluyen, entre otros, adofivir, alosetrón, amifostina, amiodarona, ácido aminocaproico, aminohipurato de sodio, aminogluteimida, ácido aminolevilínico, ácido aminosalicílico, amsacrina, anagrelida, anastrazol, aripiprazol, asparaginasa, , antraciclinas, bexaroteno, bicalutamida, bleomicina, buserilina, busulfano, cabergolina, capecitabina, carboplatina, carmustina, clorambucilo, cilastatina sódica, cisplatina, cladribina, clodronato, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, campotecinas, ácido 13-cis retinoico, todos los ácidos retinoicos trans; dacarbazina, daunorubicina, deferoxamina, diclofenac, dietilstilbestrol, docexatel, doxorubicina, dutasterida, epirubicina, estramustina, etopósido, exemestano, ezetimiba, fexofenadina, fludarabina, fludrocortisona, gama-hidroxibutirato, gemcitabina, epinefrina, L-dopa, hidroxiúrea, idarubicina, ifostamida, imanitib, irinotecano, itraconazol, goserelina, letrozol, leucorovina, levamisol, lisinopropil, lovotiroxina sódica, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalano, mercaptopurina, bitartrato de metaraminol, metotrexato, metoclopramida, mexiletina, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, naloxona, nicotina, nilutamida, nitisinona, octreotida, oxaliplatina, pamidronato, pentostatina, pilcamicina, porfímero, prednisona, procarbazina, proclorperazina, ondansetrón, palonosetrón, oxaliplatina, raltitrexed, sirolimús, estreptozocina, tacrolimús, pimecrolimús, tamoxifeno, tegaserod, temozolomida, tenipósido, testosterona, tetrahidocanabinol, talidomida, tioguanina, tiotepa, topotecano, treprostinil, tretinoína, valdecoxib, celecoxib, rofecoxib, valrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, voriconazol, dolasetrón, granisetrón; formoterol, fluticasona, leuprolida, alprazolam, anfotericina B, podofilotoxinas, nucleósidos antivirales, aroilohidrazonas, sumatriptán, eletriptán, macrólidos tales como eritromicina, oleandomicina, troleandomicina, roxitromicina, claritromicina, davercin, azitromicina, fluritromicina, diritromicina, josamicina, espiromicina, midecamicina, loratadina, desloratadina, leucomicina, miocamicina, rokitamicina, andazitromicina y swinholida A; fluoroquinolonas tales como ciprofloxacino, ofloxacino, levofloxacino, trovafloxacino, alatrofloxacino, moxifloxacino, norfloxacino, enoxacino, grepafloxacino, gatifloxacino, lomefloxacino, esparfloxacino, temafloxacino, pefloxacino, amifloxacino, fleroxacino, tosufloxacino, prulifloxacino, irloxacino, pazufloxacino, clinafloxacino and sitafloxacino; aminoglucósidos tales como gentamicina, netilmicina, paramecina, tobramicina, amikacina, kanamicina, neomicina, y estreptomicina, vancomicina, teicoplanina, ramoplanina, mideplanina, colistina, daptomicina, gramicidina, colistemetato; polimixinas tales como polimixina B, capreomicina, bacitracina, penemas; penicilinas incluyendo agentes sensibles a la penicilinasa como penicilina G, penicilina V; agentes resistentes a la penicilinasa como meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, floxacilina, nafcilina, agentes activos para microorganismos gram negativo como ampicilina, amoxicilina, hetacilina, cilina y galampicilina; penicilinas antiseudomonales como carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina y piperacilina; cefalosporinas como cefpodoxima, cefprozil, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefalotina, cefapirina, cefalexina, cefadrina, cefoxitina, cefamandol, cefazolina, cefaloridina, cefaclor, cefadroxilo, cefaloglicina, cefuroxima, ceforanida, cefotaxima, cefatrizina, cefacetrilo, cefepima, cefixima, cefonicida, cefoperazona, cefotetán, cefmetazol, ceftazidima, loracarbef y moxalactama, monobactamas como aztreonama; y carbapenemas tales como imipenema, meropenema, ertapenema, isotionato de pentamidina, sulfato de albuterol, lidocaína, sulfato de metaprotenerol, dipropionato de beclometasona, triamcinolona acetamida, budesonida acetonida, fluticasona, bromuro de ipratropio, flunisolida, cromolín sódico y tartrato de ergotamina; taxanos tales como paclitaxel; SN- 38, y tirfostinas.

Las moléculas pequeñas preferidas para el acoplamiento con un polímero como se describe en esta memoria son aquellas que tienen por lo menos un grupo amino o un grupo hidroxilo que ocurra en la naturaleza. Las moléculas preferidas que tienen un grupo amino incluyen aminohipurato de sodio, anfotericina B, doxorubicina, ácido aminocaproico, ácido aminolevulínico, ácido aminosalicílico, bitartrato de metaraminol, pamidronato disódico, daunorubicina, levotiroxina sódica, lisinopril, cilastatina sódica, mexiletina, cefalexina, deferoxamina y amifostina. Los péptidos o proteínas preferidos para acoplar a un polímero como se describe en esta memoria incluyen EPO (eritropoyetina) , IFN-ct [interferón alfa] , IFN-ß [interferón beta] , IFN consenso [interferón consenso] , Factor VIII, Factor IX, GCSF [factor estimulante de colonias de granulocitos] , GMCSF [factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos] , hGH [hormona del crecimiento humano] , insulina, FSH [hormona estimulante de los folículos] y PTH [hormona paratiroidea] . Los agentes biológicamente activos precedentes tienen el propósito de abarcar, cuando corresponda, análogos, agonistas, antagonistas, inhibidores, isómeros y formas salinas farmacéuticamente aceptables de los mismos. Con respecto a péptidos y proteínas, la invención tiene el propósito de abarcar formas sintéticas, recombinantes, nativas, glicosiladas y no glicosiladas, así como fragmentos biológicamente activos de las mismas . Los agentes activos particularmente preferidos de la presente inmensidad incluyen EPO (eritropoyetina) o cualquier agente farmacológicamente activo que tenga actividad agonista eritropoyética. Los agentes activos con actividad eritropoyética incluyen aquellos descritos en por ejemplo la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos N° 2002/0081734, la publicación internacional N° WO 96/40749 y las patentes de los Estados Unidos Nos 5,106,954, 6,642,353, 6,048,971, 5,986,047 y 5,888,772. La determinación de si un agente activo dado cualquiera tendrá actividad agonista eritropoyética se puede lograr mediante experimentos de rutina. Por ejemplo, como se explica en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos N° 2002/0081734, la determinación de la actividad agonista eritropoyética se puede lograr midiendo el crecimiento (de haberlo) de una línea de células humanas dependientes de EPO, TF-1, cultivada en un medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero fetal de ternero donde se coloca al agente activo propuesto en contacto con las células. Véase Kitamura y col. (1989) Blood 73:375-380. Los agentes activos que inducen la proliferación de estas células son agentes que tienen actividad eritropoyética.

Por supuesto, también se pueden utilizar otros métodos para determinar si un agente activo tiene actividad agonista eritropoyética. Se prefiere que la eritropoyetina (o cualquier agente activo peptídico que tenga actividad agonista eritropoyética) sea producida por métodos recombinantes, pero también se pueden utilizar otros métodos (especialmente para péptidos de menor tamaño) como, por ejemplo, técnicas de síntesis en fase sólida como se describe en, por ejemplo, Merrifield (1963) J". Am. Chem. Soc. 85_:2149. Se prefiere particularmente que el agente activo utilizado de acuerdo con la presente invención sea eritropoyetina recombinante humana. Con respecto al polímero, se puede utilizar cualquier polímero siempre que el mismo sea no antigénico y no inmunogénico. En particular, para agentes activos relativamente grandes (por ejemplo, proteínas) , se prefiere que el polímero en el conjugado sea soluble en agua. Con respecto a agentes activos relativamente pequeños (típicamente, agentes activos no peptídicos) , el polímero en el conjugado puede ser soluble en agua o no. Con respecto al polímero asociado con conjugados, sin embargo, el polímero es típicamente no peptídico. Aunque se prefiera un poli (etilenglicol) , los polímeros apropiados para utilizarse en esta invención pueden ser, por ejemplo, otros poli (alquilenglicoles) solubles en agua, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli (alcoholes olefínicos) , poli (vinilpirrolidona) , poli (hidroxialquilmetacrilamida) , poli (hidroxialquilmetacrilato) , poli (sacáridos) , poli (ácido a-hidroxi) , poli (alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , como se describe en la patente de los Estados Unidos N° 5,629,384 y copolímeros, terpolímeros y polímeros de bloque aleatorio y no aleatorio de cualquiera de los anteriores. Más aún, aunque los polímeros utilizados en los conjugados de la primera población sean preferentemente del mismo tipo (por ejemplo, lineal, ramificado, bifurcado, etc.) que los polímeros utilizados en la segunda población, las composiciones incluyen instancias en que los polímeros de cada población son diferentes. Por ejemplo, se puede utilizar un polímero de tipo poli (etilenglicol) tanto para la primera como para la segunda población de conjugados. Además, se puede utilizar un polímero de tipo poli (etilenglicol) para una población y un copolímero de etilenglicol y propilenglicol para la otra población de la composición. Además, el polímero es a menudo lineal, pero puede ser de otras formas (por ejemplo, ramificado, bifurcado y similares) como se describe en más detalle a continuación. En el contexto de su presencia dentro de una estructura global, un segmento de polímero soluble en agua tiene desde 1 a aproximadamente 300 terminales. Además de las formas del polímero descritas anteriormente, el polímero también puede tener uno o más vínculos degradables en el mismo. Por ejemplo, se puede preparar un poli (etilenglicol) ("PEG") con vínculos éster en el polímero que estén sujetos a hidrólisis. Como se muestra a continuación, esta hidrólisis resulta en la escisión del polímero en fragmentos de peso molecular más bajo: -PEG-C02-PEG-+H20 - -PEG-CO2H+HO-PEG- Otros vínculos hidrolíticamente degradables, útiles como vínculos degradables dentro del polímero, incluyen vínculos carbonato, vínculos imina que resultan, por ejemplo, de la reacción de una amina con un aldehido (véase, por ejemplo, Ouchi y col. (1997) Polymer Preprints 3_8 (1) :582-3) ; vínculos de esteres de fosfatos formados, por ejemplo, haciendo reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; vínculos hidrazona que se forman típicamente haciendo reaccionar una hidrazida con un aldehido; vínculos acetal que típicamente se forman haciendo reaccionar un aldehido y un alcohol; vínculos ortoéster que se forman, por ejemplo, haciendo reaccionar un formiato con un alcohol; vínculos amida formados por un grupo amina, por ejemplo, en el extremo de un polímero tal como un PEG y un grupo carboxilo de otra cadena del PEG; vínculos uretano formados por la reacción de, por ejemplo, un PEG con un grupo isocianato terminal y un alcohol PEG; vínculos péptidos formados por un grupo amina, por ejemplo, en un extremo de un polímero tal como un PEG y un grupo carboxilo de un péptido; y vínculos oligonucleótidos formados mediante, por ejemplo, un grupo fosforamidita, por ejemplo, en el extremo de un polímero y un grupo 5 ' hidroxilo de un oligonucleótido . Típicamente, el polímero es biocompatible y no inmunogénico. Con respecto a la biocompatibilidad, una sustancia se considera biocompatible si el efecto benéfico asociado con el uso de la sustancia por separado o con otra sustancia (por ejemplo, un agente activo) en conexión con tejidos vivos (por ejemplo, la administración a un paciente) sobrepasa cualquier efecto perjudicial según la evaluación de un clínico, por ejemplo, un médico. Con respecto a la no inmunogenicidad, una sustancia se considera no inmunogénica si el uso de la sustancia por separado o con otra sustancia en conexión con tejidos vivos no produce una respuesta inmune (por ejemplo, la formación de anticuerpos) o, de producirse una respuesta inmune, dicha respuesta no se considera clínicamente significativa o importante según la evaluación de un clínico. Debido a su solubilidad en agua, su no inmunogenicidad y su biocompatilidad, el poli (etilenglicol) es un polímero preferido para su uso con ambas poblaciones de conjugados polímero-agente activo de las composiciones descritas en esta memoria. Estructuralmente, un poli (etilenglicol) es un polímero lineal que termina en cada extremo con grupos hidroxilos : HO-CH2CH2?-(CH2CH2?)m.-CH2CH2-OH donde (m' ) es un entero positivo que representa el número de monómeros repetidos (típicamente desde aproximadamente 2 a aproximadamente 4,000). El poli (etilenglicol) puede convenientemente abreviarse como "PEG" y dondequiera se muestre una estructura en la que aparezca un "PEG" , se supondrá que corresponde la siguiente estructura: -CH2CH2?-(CH2CH2O)m-CH2CH2- donde (m1) es como se ha definido anteriormente. Además, el polímero puede tener una o más terminales cubiertas con un grupo relativamente inerte como, por ejemplo, un grupo alcoxi. En consecuencia, por ejemplo, el poli (etilenglicol) lineal que se muestra arriba posee una terminal que tiene un grupo metoxi relativamente inerte. La estructura del "metoxi-poli (etilenglicol) " se muestra a continuación: CH30-CH2CH2?-(CH2C?2?)m"CH2CH2-OH donde (m?) es como se ha definido anteriormente. Son también posibles otros grupos de cobertura de extremos que no sean alquilo. Ejemplos de porciones de cobertura de extremos incluyen aquellas porciones que pueden seleccionarse del grupo que consiste en alquiloxi, alquiloxi sustituido, alqueniloxi, alqueniloxi sustituido, alquiniloxi, alquiniloxi sustituido, ariloxi, ariloxi sustituido e hidroxi . Los grupos preferidos de cobertura de extremos se seleccionan del grupo que consiste en alquiloxi (por ejemplo, metoxi) e hidroxi. Como se manifestó precedentemente, las composiciones de la invención comprenden una primera y una segunda población de conjugados. Los conjugados de una población cualquiera dada pueden prepararse utilizando cualquier técnica conocida por las personas con una capacitación normal en la técnica. Típicamente, sin embargo, se permite que un polímero reaccione con un agente activo en condiciones apropiadas para la conjugación. Aunque los polímeros descritos anteriormente pueden reaccionar con ciertos agentes activos, a menudo se utiliza un reactivo polimérico que comprende el polímero unido a un grupo reactivo. El uso de dichos reactivos poliméricos proporciona un modo fácil de unir un polímero a un agente activo, formando de esa manera un conjugado polímero-agente activo. Los reactivos poliméricos y los métodos representativos para conjugar estos reactivos poliméricos a un agente activo son conocidos en la técnica y están descritos en más detalle en Zalipsky y col., "Use of functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modifications of Polypeptides" en Polyethylene Glycol Chemistry: Biothechnical and Biomedical Applications, J.M. Harris, Plenum Press, Nueva York (1992) y en Zalipsky (1995) Advanced Drugs Reviews 16:157-182. Convenientemente, muchos reactivos poliméricos están disponibles de Nektar Therapeutics (Huntsville, AL) . Estos y otros reactivos poliméricos se describen en más detalle a continuación. El grupo reactivo del reactivo polimérico puede ser cualquier grupo apropiado para reaccionar con un agente activo. Generalmente, el grupo reactivo comprende un grupo electrofílico o nucleofílico que permita una unión covalente del agente activo bajo condiciones de acoplamiento covalente. Ejemplos de dichos grupos reactivos asociados con el reactivo polimérico incluyen, entre otros, aquellos seleccionados del grupo que consistente en hidroxilo (-0H) , éster, ortoéster, carbonato, acetal, aldehido, hidrato de aldehido, cetona, hidrato de cetona, tiona, hidrato de tiona, hemicetal, hemicetal sustituido con azufre, cetal, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, amina, hidrazida, tiol, hidrato de tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, maleimida succinimida benzotriazol , vinilsulfona, cloroetilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxales, mesilatos, tosilatos, tiosulfonato, tresilato, silano y similares, y también las formas protegidas o activadas de los mismos.

Con respecto al agente activo, los grupos preferidos que proporcionan puntos de unión covalente para un grupo reactivo de un reactivo polimérico incluyen amino (preferentemente un grupo amino primario) , ácido carboxílico y tiol. Cuando el agente activo es un péptido, la terminal N del péptido puede proporcionar un grupo amino apropiado mientras que la terminal C del péptido puede proporcionar un grupo carboxi apropiado para reaccionar con un reactivo polimérico. Un grupo amino apropiado puede también asociarse con el grupo amino de una cadena lateral de cualguier residuo o residuos de lisina del péptido. La cadena lateral de un residuo de histidina de un péptido puede ser útil como punto de unión. De una manera similar, se puede utilizar un grupo tiol de la cadena lateral de un péptido que contenga cisteína. Además, se puede también utilizar otros grupos asociados con porciones carbohidrato (como, por ejemplo, las formas glicosiladas de algunos péptidos) de agentes activos para formar conjugados con un reactivo polimérico. A continuación se describen con más detalle, ejemplos de reactivos poliméricos. Los reactivos poliméricos de los ejemplos incluyen aquellos reactivos poliméricos en los que el grupo reactivo es un electrófilo. Dichos reactivos poliméricos "electrofílicamente activados" son reactivos a las aminas (tales como en un residuo de lisina) que se encuentran en algunos agentes activos. Ejemplos no limitativos de reactivos poliméricos específicos útiles para formar vínculos covalentes con las aminas disponibles asociadas con algunos agentes activos incluyen propionato de mPEG- succinimidilo (como se describe en la patente de los Estados Unidos N° 5,672,662), butanato de mPEG-succinimidilo (como se describe en la patente de los Estados Unidos N° 5,672,662), carbonato de mPEG-benzotriazol (como se describe en la patente de los Estados Unidos N° 5,650,234), mPEG-propionaldehído (como se describe en la patente de los Estados Unidos N° 5,824,784), mPEG-acetaldehído (como se describe en la patente de los Estados Unidos N.° 5,990,237), todos los cuales se encuentran disponibles de Nektar Therapeutics (Huntsville, AL) .

Como referencia, a continuación se muestran ejemplos de cada uno de dichos derivados: propionato de mPEG-succinimidilo; butanato de mPEG- succinimidilo; Carbonato de mPEG-benzotriazol; mPEG- propionaldehído; y Dietilacetal de mPEG-acetaldehído donde (n) representa el número de veces que se repite el monómero de óxido de etileno. También son útiles para las reacciones de conjugación a aminas las cetonas, hidratos de cetonas, hemicetales y reactivos poliméricos que tengan cetales (así como sus formas sustituidas con azufre correspondientes) . Un beneficio adicional de estos derivados poliméricos es su relativa estabilidad (por lo menos en comparación con las formas aldehido correspondientes) que permite una conjugación más específica y dirigida. Se conocen también versiones ramificadas de polímeros activados electrofílicamente, tales como "mPEG2- N-hidroxisuccinimida" y "mPEG2-aldehido" que se muestran a continuación: mPEG2-N-hidroxisuccinimida; y mPEG2-aldehido, donde (n) representa el número de veces que se repite el monómero óxido de etileno. Nuevamente, reactivos tales como la "mPEG2-N- hidroxisuccinimida" y el "mPEG2-aldehido"se encuentran disponibles de Nektar Therapeutics (Huntsville, AL) . Se pueden emplear reacciones de acoplamiento convencionales usando condiciones de reacción conocidas para conjugar el reactivo polimérico al agente activo. Dichas reacciones y condiciones de reacción están explicadas en la bibliografía pertinente así como en los muchos artículos, patentes y solicitudes de patente que se citan en esta memoria.

Un planteamiento típico es una reacción de aminación reductiva utilizada, por ejemplo, para conjugar aminas primarias con un polímero funcionalizado con una cetona o un aldehido. En este planteamiento, la amina primaria de un agente activo reacciona con el grupo carbonilo del aldehido o de la cetona, formando de esa manera una base de Schiff. La base de Schiff, a su vez, puede ser convertida reductivamente en la presencia de borohidruro de sodio para formar un conjugado estable. A pH menores, son posibles las reacciones selectivas de la terminal N. De esta manera, son posibles conjugados específicos (por ejemplo, conjugados que tengan de uno a tres polímeros solubles en agua unidos covalentemente) . Se encuentran disponibles otros reactivos poliméricos que reaccionan con grupos de un agente activo distintos de la amina. Por ejemplo, si el reactivo polimérico es funcionalizado o "activado" en su extremo con un grupo hidroxilo, se puede formar un vínculo éster haciendo reaccionar el reactivo polimérico terminado en hidroxi con un agente activo que contenga un grupo ácido carboxílico. Más aún, si el grupo activo se funcionaliza con un grupo tiol, se formará un vínculo tioéster entre el tiol del reactivo polimérico y el agente activo que contiene un grupo ácido carboxílico.

Reactivos poliméricos adicionales incluyen aquellos que contienen una porción hidrazida. Dichos reactivos poliméricos que contienen hidrazida también son útiles para la conjugación a cualquier grupo carboxilo disponible de un agente activo. Un ejemplo de dichos reactivos poliméricos incluye un reactivo polimérico que tenga la siguiente estructura: donde POLY es un polímero. Se conocen reactivos poliméricos que reaccionan con los grupos tiol (como, por ejemplo, en un residuo de cisteína) de un agente activo. Ejemplos no limitativos de reactivos poliméricos específicos útiles para formar vínculos covalentes con los grupos tiol disponibles asociados con algunos agentes activos incluyen el reactivo polimérico N-maleimidilo como se describe en la patente de los Estados Unidos N° 5,739,208 y en la publicación internacional N° WO 01/62827, Ejemplos de PEG selectivos al sulfidrilo para ser utilizado en esta realización específica incluyen mPEG-maleimida bifurcada [mPEG(MAL)2] , mPEG2-maleimida bifurcada [mPEG2 (MAL) 2] , mPEG-maleimida [mPEG-MAL] y mPEG2-maleimida [mPEG2-MAL] , todos los cuales se encuentran disponibles de Nektar Therapeutics (Huntsville, AL) .

Las estructuras de estos PEG activados son las siguientes : mPEG-CONHCH[CH2CONH(CH2CH2?)2CH2CH2-MAL]2: mPEG2-lysine-NH-CH[CH2CONH(CH2CH2O)2CH2CH2-MAL]2; mPEG-MAL; y mPEG2-lysine-NH-CH2CH2NHC(O)CH2CH2MA respectivamente, donde mPEG es un PEG monometoxi, lisina es el aminoácido lisina y MAL representa maleimida, es decir, Otros reactivos poliméricos adicionales, convencionalmente llamados polímeros "selectivos de tiol", son apropiados para reaccionar con los grupos tiol y se describen en la publicación internacional N° WO 04/63250. Aunque el reactivo polimérico (y, por extensión, el polímero en el conjugado polímero-agente activo resultante) utilizado para formar los conjugados en ambas poblaciones puede tener casi cualquier peso molecular medio ponderado (siempre que los polímeros asociados con cada población tengan un peso molecular medio ponderado diferente) , el peso molecular medio ponderado se encontrará típicamente dentro de uno o más de los siguientes intervalos: desde aproximadamente 50 Daltones a aproximadamente 130,000 Daltones, desde aproximadamente 100 Daltones a aproximadamente 100,000 Daltones, desde aproximadamente 500 Daltones a aproximadamente 80,000 Daltones, desde aproximadamente 1,000 Daltones a aproximadamente 50,000 Daltones, desde aproximadamente 2,000 Daltones a aproximadamente 25,000 Daltones y desde aproximadamente 5,000 Daltones a aproximadamente 20,000 Daltones . Ejemplos de pesos moleculares medio ponderado incluyen aproximadamente 100 Daltones, aproximadamente 200 Daltones, aproximadamente 300 Daltones, aproximadamente 400 Daltones, aproximadamente 500 Daltones, aproximadamente 600 Daltones, aproximadamente 700 Daltones, aproximadamente 750 Daltones, aproximadamente 800 Daltones, aproximadamente 900 Daltones, aproximadamente 1,000 Daltones, aproximadamente 2,000 Daltones, aproximadamente 2,500 Daltones, aproximadamente 3,000 Daltones, aproximadamente 4,000 Daltones, aproximadamente 5,000 Daltones, aproximadamente 6,000 Daltones, aproximadamente 7,000 Daltones, aproximadamente 7,500 Daltones, aproximadamente 8,000 Daltones, aproximadamente 9,000 Daltones, aproximadamente 10,000 Daltones, aproximadamente 11,000 Daltones, aproximadamente 12,000 Daltones, aproximadamente 12,500 Daltones, aproximadamente 15,000 Daltones, aproximadamente 20,000 Daltones, aproximadamente 25,000 Daltones, y aproximadamente 30,000 Daltones, aproximadamente 40,000 Daltones, aproximadamente 50,000 Daltones, aproximadamente 60,000 Daltones, aproximadamente 70,000 Daltones, aproximadamente 75,000 Daltones, aproximadamente 80,000 Daltones, aproximadamente 85,000 Daltones, aproximadamente 90,000 Daltones, aproximadamente 100,000 Daltones y aproximadamente 120,000 Daltones. Aunque se han descrito muchos ejemplos de reactivos poliméricos, se encuentran disponibles reactivos poliméricos adicionales para formar conjugados polímero- agente activo. Por lo tanto, la invención no se limita a conjugados polímero-agente activo formados a partir de los reactivos poliméricos descritos en este documento. Mas aún, la invención no está limitada con respecto a ningún peso molecular medio ponderado, ya que son posibles un intervalo amplio de pesos moleculares. Para formar cada población de conjugados polímero-agente activo, se permite que un reactivo polimérico apropiado se contacte con un agente activo. Aquellas personas de capacitación normal en la técnica conocen o pueden determinar mediante experimentos de rutina si un reactivo polimérico dado es apropiado para formar un conjugado con un agente activo específico. Por ejemplo, los agentes activos que tengan uno o más grupos amino reaccionarán con reactivos poliméricos que tengan un grupo electrofílico, como ya se trató con anterioridad. Además, uno puede simplemente contactar un reactivo polimérico propuesto con el agente activo y determinar si se ha efectuado la conjugación haciendo pasar la mezcla reaccionante a través de una columna de exclusión por tamaños; los conjugados relativamente grandes -que comprenden tanto el polímero como el agente activo- eluirán primero tanto antes que el reactivo polimérico no conjugado como antes que el agente activo. Habiéndose seleccionado un reactivo polimérico y un agente activo para formar una población deseada de conjugados, típicamente se agrega el reactivo polimérico al agente activo en una cantidad equimolar (con respecto al número deseado de grupos apropiados para reaccionar con el grupo reactivo) o en exceso. Por ejemplo, el reactivo polimérico puede agregarse al agente activo seleccionado en una proporción molar 1:1 (polímero:agente activo), 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 8:1, 10:1, 20:1 ó 40:1.

Se permite que la reacción de conjugación proceda hasta que sustancialmente no tenga lugar ninguna conjugación adicional, lo que generalmente se determina siguiendo el avance de la reacción en el tiempo. Se puede seguir el avance de la reacción extrayendo alícuotas de la mezcla reaccionante a diversos puntos en el tiempo y analizando la mezcla reaccionante mediante espectrometría de masa SDS-PAGE o MALDI-TOF, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en inglés) o cualguier otro método analítico apropiado. Una vez que se alcance un cierto nivel con respecto a la cantidad formada de conjugado o la cantidad de reactivo polimérico restante sin conjugar, se supone que se ha completado la reacción. Típicamente, la reacción de conjugación torna desde unos minutos a varias horas (por ejemplo, de cinco minutos a 24 horas o más) . Se prefiere, aunque no es necesario, purificar la población de conjugados polímero- agente activo resultante para separar los reactivos en exceso, los reactantes sin conjugar (por ejemplo, el agente activo) , especies muíticonjugadas indeseables y el reactivo polimérico libre o sin reaccionar. La población resultante también puede ser caracterizada utilizando métodos analíticos tales como MALDI, electroforesis capilar, electroforesis de geles y/o cromatografía.

Se pueden modificar las condiciones de la reacción de conjugación para proporcionar un resultado deseado. Por ejemplo, ajustar el pH del medio reaccionante a menudo influencia la reactividad entre el reactivo polimérico y el agente activo de manera tal que se puede ajustar el número de polímeros que se une al agente activo. Por ejemplo, un reactivo polimérico que tenga aldehidos puede reaccionar con un cierto péptido a un pH de 7.5 de manera tal que la especie predominante sea un conjugado con tres polímeros unidos individualmente a un único agente activo. Sin embargo, la conjugación del mismo reactivo polimérico que tiene aldehidos y el péptido a un pH de 6.5 puede resultar predominantemente en un único polímero unido al péptido. Tal selectividad puede ser determinada por una persona con capacitación normal en la técnica llevando a cabo una reacción de conjugación dada cualguiera bajo una gama de condiciones (por ejemplo, un intervalo de condiciones de pH) y determinar qué condiciones producen el resultado deseado (por ejemplo, el número deseado de polímeros unidos al número deseado de agentes activos) . Con respecto a una población dada cualquiera de conjugados polímero-agente activo, los conjugados pueden purificarse para obtener/aislar distintas especies conjugadas. En la alternativa, y con preferencia para polímeros de peso molecular más bajo (por ejemplo, menos de aproximadamente 20,000 Daltones, más preferentemente menos de aproximadamente 10,000 Daltones), la población de conjugados polímero-agente activo puede purificarse para obtener la distribución de polímeros por agente activo. Por ejemplo, cada población puede purificarse para obtener un promedio desde uno a cinco PEG por agente activo (por ejemplo, una proteína) , típicamente un promedio de aproximadamente uno a tres PEG por agente activo (por ejemplo, una proteína) . La estrategia para la purificación de la mezcla reaccionante de conjugados final dependerá de diversos factores, incluso, por ejemplo, el peso molecular del reactivo polimérico empleado, el agente activo específico, el régimen de dosificación deseado y la actividad residual y las propiedades in vitro del conjugado o conjugados individuales. Aunque se prefiere tener un único polímero unido a un único agente activo, son posibles otros conjugados con uno o más polímeros unidos a uno o más agentes activos. Más aún, cada población dentro de la composición puede tener polímeros numerados diferentemente unidos a agentes activos numerados diferentemente (por ejemplo, una composición que comprenda una primera población que tenga polímeros unidos de manera simple y doble a un agente activo, y una segunda población que sustancialmente tenga un único polímero unido a un único agente activo) . La Tabla 1 presenta ejemplos de conjugados apropiados para cualquier población de la composición. Tabla 1 Conjugados con ejemplos de número de polímeros a número de agentes activos Si se desea, una población dada cualquiera de conjugados que tengan pesos moleculares distintos (debido al número de polímeros unidos) puede aislarse utilizando cromatografía u otras técnicas de separación sin resinas (por ejemplo, diafiltración, membranas y otras) . Es decir, se puede utilizar cromatografía de filtración sobre gel así como otras técnicas para fraccionar cocientes numéricamente diferentes de polímero a agente activo (por ejemplo, 1-mer, 2-mer, 3-mer, etc., donde "1-mer" indica un polímero por agente activo, "2-mer" indica dos polímeros por agente activo, y así sucesivamente) sobre la base de sus diferentes pesos moleculares (donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio de los segmentos de polímero solubles en agua) . Por ejemplo, en una reacción ejemplar donde una proteína de 100,000 Daltones se conjuga aleatoriamente a un PEG-ácido alcanoico con un peso molecular de aproximadamente 20,000 Daltones, la mezcla de reacción resultante probablemente contendrá proteína sin modificar (peso molecular de 100,000 Daltones), proteína monoPEGilada (peso molecular de 120,000 Daltones), proteína biPEGilada (peso molecular de 140,000 Daltones), etc. Mientras que se puede utilizar este enfoque para separar PEG y otros conjugados polímero-agente activo que tengan distintos pesos moleculares, el mismo es generalmente ineficaz para separar isómeros de posición que tengan distintos sitios de unión del polímero dentro de la proteína. Por ejemplo, se puede utilizar cromatografía de filtración sobre gel para separar entre sí las mezclas de PEG 1-mer, 2-mer, 3-mer, etc., aunque cada composición PEG mer recobrada puede contener PEG unidos a diferentes grupos amino reactivos (por ejemplo, grupos e-amino de residuos de lisina) dentro del agente activo. Las columnas de filtración sobre gel apropiadas para llevar a cabo este tipo de separación incluyen las columnas Superdex™ y Sephadex™ disponibles de Amersham Biosciences (Piscata ay, NJ) . La selección de una columna en particular dependerá del intervalo de fraccionamiento deseado. La elución se lleva a cabo generalmente utilizando un amortiguador apropiado como, por ejemplo, fosfato, acetato o similares . Las fracciones recolectadas pueden analizarse mediante diversos métodos distintos, por ejemplo, (i) densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) a 280 nm para el contenido de proteína, (ii) ensayos basados en colorantes de proteína utilizando un estándar tal como albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) , (iii) prueba de yodo para el contenido de PEG [Sims y col. (1980) Anal . Biochem, 107:60-63] , y (iv) electroforesis de gel de poliacrilamida-sulfato de docecilo y sodio (SDS PAGE) , seguido de tinción con yoduro de bario para el PEG y Coomassie u otro colorante para el péptido. Se pueden utilizar también otras técnicas de separación conocidas por las personas con capacitación normal en la técnica.

La separación de isómeros de posición se lleva a cabo mediante cromatografía en fase inversa utilizando una columna C18 (Amersham Biosciences o Vydac) de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC, por sus siglas en inglés) o por cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna de intercambio iónico, por ejemplo una columna de intercambio iónico Sepharose'" disponible de Amersham Biosciences. Cualquiera de estos enfoques puede utilizarse para separar isómeros de agente activo-polímero que tengan el mismo peso molecular (isómeros de posición) . Como se indicó anteriormente, las composiciones descritas en esta memoria comprenden dos poblaciones distintas de conjugados polímero-agente activo caracterizadas en que la diferencia entre las dos poblaciones radica en el peso molecular medio ponderado del polímero. Como un resultado de ello, las composiciones de la presente invención pueden formarse mediante el método siguiente: (a) se prepara una primera población de conjugados formados haciendo reaccionar un reactivo polimérico con un cierto peso molecular medio ponderado; (b) se prepara una segunda población de conjugados formados haciendo reaccionar un reactivo polimérico con un cierto peso molecular medio ponderado distinto del peso molecular medio ponderado del reactivo polimérico usado en el paso (a) ; y (c) se combinan la primera y segunda población para formar una composición. Las composiciones de la invención también pueden prepararse en un proceso de síntesis de "un recipiente" . En este proceso, los conjugados se forman combinando un agente activo y dos reactivos poliméricos, donde cada reactivo polimérico tiene un peso molecular medio ponderado distinto. Típicamente, en este proceso, el grupo reactivo de cada reactivo polimérico será exactamente el mismo. Además, el polímero de cada reactivo polimérico será típicamente el mismo (por ejemplo, un PEG) , pero cada uno tendrá un peso molecular medio ponderado distinto. Sin importar qué enfoque se adopte para su formación, se puede llevar a cabo un paso opcional de mezclado de la composición para formar una mezcla sustancialmente homogénea, utilizando técnicas convencionales. Con respecto al enfoque que implica la formación por separado de las dos distintas poblaciones, se prefiere incluir el paso opcional de mezclado de la primera y segunda población de polímero-agente activo para formar una mezcla sustancialmente homogénea. El peso molecular medio ponderado específico del polímero asociado con cada población para un propósito dado (por ejemplo, un inicio rápido o una acción sostenida) es conocido por las personas con capacitación en la técnica o puede ser determinado sin experimentación excesiva. Por ejemplo, un tamaño apropiado de polímero para la primera población de conjugados polímero-agente activo puede determinarse formando una serie de conjugados cada uno con un peso molecular medio ponderado relativamente pequeño (por ejemplo, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000 y 5,000), y determinando entonces (por ejemplo, a través de su administración a un sujeto animal de prueba) el tamaño que proporcione un inicio de la acción tan rápido como se desee (por ejemplo, de 12 horas a 2 días) . Similarmente, se forma una serie de conjugados cada uno con un peso molecular medio ponderado relativamente grande (por ejemplo, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 100,000 y 120,000), y se determina entonces (por ejemplo, a través de su administración a un sujeto animal de prueba) el tamaño que proporcione la actividad sostenida deseada (por ejemplo, de 4 días a varias semanas) . La combinación que se requiere para proporcionar tanto un inicio rápido como una acción sostenida puede entonces determinarse mediante la selección de (i) la población de conjugados formada con uno de los polímeros de peso molecular medio ponderado relativamente pequeño que se encontró que proporciona el inicio rápido deseado y (ií) la población de conjugados formada con uno de los polímeros de peso molecular medio ponderado relativamente grande que se encontró que proporciona la acción sostenida deseada. Los pesos moleculares ponderados en peso incluyen como ejemplo los siguientes: cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 50 Daltones a menos de 30,000 Daltones, y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 5,000 Daltones a menos de aproximadamente 130,000 Daltones (donde el peso molecular medio ponderado de los polímeros asociados con cada población es distinto) ; cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 100 Daltones a menos de 20,000 Daltones, y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 20,000 Daltones a aproximadamente 100,000 Daltones; cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 1,000 Daltones a aproximadamente 15,000 Daltones, y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de aproximadamente 25,000 Daltones a aproximadamente 50,000 Daltones; cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 2,500 Daltones a aproximadamente 10,000 Daltones, y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 30, 000 Daltones a aproximadamente 40,000 Daltones; y cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado de aproximadamente 5,000 Daltones, y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 3,000 Daltones a ap oximadamente 40,000 Daltones . Si se utiliza una molécula pequeña como el agente activo en ambas poblaciones, los pesos moleculares medios ponderados son típicamente (aunque no necesariamente) más pequeños. Por lo tanto, como ejemplo, los pesos moleculares medios ponderados para moléculas pequeñas incluyen los siguientes: cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 50 Daltones a menos de 5,000 Daltones, y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 100 Daltones a menos de aproximadamente 10,000 Daltones; cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 100 Daltones a menos de 3,000 Daltones, y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 200 Daltones a menos de aproximadamente 5,000 Daltones; y cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 150 Daltones a menos de 1,000 Daltones, y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 500 Daltones a menos de aproximadamente 3,000 Daltones; donde (para cada ejemplo) el peso molecular medio ponderado de los polímeros asociados con cada población es distinto. Además, debido a que los pesos moleculares ponderados en peso asociados con cada una de las distintas poblaciones son distintos, es posible caracterizar numéricamente esta diferencia. Por ejemplo, la diferencia absoluta entre un conjugado polímero-agente activo de 5,000 Daltones y un conjugado polímero-agente activo de 30,000 Daltones es 25,000 Daltones. Las diferencias absolutas ejemplares entre el peso molecular medio ponderado de los polímeros de la primera población y el peso molecular medio ponderado de la segunda población incluyen los siguientes: desde aproximadamente 500 a aproximadamente 100,000; desde aproximadamente 2,000 a aproximadamente 100,000; desde aproximadamente 10,000 a aproximadamente 100,000; desde aproximadamente 20,000 a aproximadamente 100,000; desde aproximadamente 30,000 a aproximadamente 100,000; desde aproximadamente 20,000 a aproximadamente 40,000; y desde aproximadamente 25,000 a aproximadamente 35,000. Se reconocerá que se utiliza la diferencia absoluta para no tener en cuenta el efecto de realizar los cálculos y obtener un resultado con un valor negativo. Cada población de la composición también se asociará con un cociente molar. Los ejemplos de cocientes molares entre la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo incluyen los siguientes: de aproximadamente 1000:1 a aproximadamente 100:1; de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 10:1; de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:1; de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10; de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:100; y de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:1000. Ventajosamente, el cociente específico entre la primera y la segunda población se puede ajustar para proporcionar el perfil far acocinético deseado. Por ejemplo, una composición que comprenda un cociente inicial 1:1 de la primera población a la segunda población puede prepararse y administrarse a un sujeto de prueba, a quien se le sigue la actividad farmacológica a lo largo del tiempo. Si se atiende mejor la indicación clínica proporcionando un inicio más rápido, se podría incrementar la población que comprende el polímero más pequeño del conjugado. Además, si se atendiera mejor la indicación clínica proporcionando una acción más duradera, se podría aumentar la población que comprende el polímero más grande del conjugado. En otro enfoque, se podría proporcionar y administrar separadamente una serie de composiciones a distintos pacientes, donde cada una de las composiciones tiene un cociente único de cada población. Se puede vigilar a cada paciente a lo largo del tiempo y se puede determinar el mejor cociente seleccionando la composición que se dio al paciente que exhiba la mejor respuesta farmacológica global (demostrada por un inicio suficientemente rápido y una actividad suficientemente duradera) . Se pueden utilizar estos y otros enfoques para optimizar el mejor cociente entre las poblaciones para una aplicación dada cualquiera. Con respecto a los conjugados polímero-agente activo para entregas subcutáneas y transdérmicas, la presente invención es particularmente aplicable. Esto se debe a que las entregas subcutáneas y transdérmicas están influenciadas, entre otras cosas, por el tamaño del agente terapéutico ya que todo agente debe atravesar varias capas de la piel para alcanzar el sistema circulatorio. Como resultado, aumentar el tamaño de una molécula resulta en un aumento concomitante del tiempo para la circulación sistémica en el caso de entregas subcutáneas y transdérmicas. Por lo tanto, las composiciones proporcionadas en esta memoria pueden proporcionar tanto un inicio relativamente rápido de la acción empleando un polímero relativamente pequeño asociado con una primera población de conjugados (para proporcionar conjugados relativamente pequeños) que pueden atravesar mejor las capas dérmicas como una duración más larga de la acción empleando un polímero relativamente grande asociado con una segunda población de conjugados (para proporcionar conjugados relativamente más grandes) que requieran más tiempo para atravesar las capas dérmicas. La presente invención también incluye preparados farmacéuticos que comprenden la composición como se proporciona en este documento en combinación con un excipiente farmacéutico. Por lo tanto, el método para hacer las composiciones de esta memoria incluye el paso adicional de agregar un excipiente farmacéuticamente aceptable. En general, la composición misma será una forma sólida (por ejemplo, un precipitado) , la que se puede combinar con un excipiente farmacéuticamente aceptable que puede ser tanto una forma sólida como una forma líquida. Por ejemplo, las composiciones (los preparados farmacéuticos correspondientes) pueden proporcionarse en una forma liofilizada o en una solución. Los excipientes incluyen, entre otros ejemplos, aquellos que se seleccionan del grupo que consiste en carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, surfactantes, amortiguadores, ácidos, bases y combinaciones de los mismos. Puede estar presente como un excipiente un carbohidrato, por ejemplo, un azúcar, un azúcar derivado, por ejemplo, alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado y/o un polímero de azúcar. Los carbohidratos específicos que se pueden utilizar como excipientes incluyen, por ejemplo: monosacáridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melezitosa, altodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactilol, sorbitol (glucitol) , piranosil sorbitol, mioinositol y similares. El excipiente también puede incluir una sal inorgánica o un amortiguador tal como ácido cítrico, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, nitrato de potasio, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico y combinaciones de los mismos.

El preparado también puede incluir un agente antimicrobiano para prevenir o impedir el crecimiento microbiano. Ejemplos no limitativos de agentes microbianos apropiados para la presente invención incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timersol y combinaciones de los mismos . En los preparados también puede estar presente un antioxidante. Los antioxidantes se utilizan para prevenir la oxidación y de esa manera evitar el deterioro del conjugado o de los otros componentes del preparado. Los antioxidantes apropiados para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, galato de propilo, bisulfito de sodio, formaldehído sulfoxilato de sodio, metabisulfito de sodio y combinaciones de los mismos. Un surfactante puede estar presente como un excipiente. Ejemplos de surfactantes incluyen: polisorbatos, tales como "Tween 20" y "Tween 40" y plurónicos tales como F68 y F88 (ambos se encuentran disponibles de BASF, Mount Olive, Nueva Jersey) ; esteres de sorbitano; lípidos, tales como fosfolípidos, por ejemplo, lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiloetanolaminas (aunque preferentemente no en forma liposómica) , ácidos grasos y esteres grasos; esteroides, por ejemplo, colesterol; y agentes quelantes como, por ejemplo, EDTA, cinc y otros cationes apropiados. Ácidos o bases pueden estar presentes como un excipiente en el preparado. Ejemplos no limitativos de los ácidos que se pueden utilizar incluyen aquellos ácidos seleccionados del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido mélico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico y combinaciones de los mismos. Ejemplos de bases apropiadas incluyen, entre otras, las bases seleccionadas del grupo que consiste en hidróxido de sodio, acetato de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, acetato de amonio, acetato de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de sodio, formiato de sodio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fumarato de potasio y combinaciones de los mismos. Los preparados farmacéuticos abarcan todos los tipos de formulaciones y en particular aquellas que sean apropiadas para inyección, por ejemplo, polvos que puedan reconstituirse así como suspensiones y soluciones . La cantidad del conjugado (es decir, el conjugado formado entre el agente activo y el polímero como se describe en esta memoria) en la composición dependerá de diversos factores, pero óptimamente será una dosis terapéuticamente eficaz cuando la composición se almacene en un recipiente de dosis unitaria (por ejemplo, un frasco) . Además, el preparado farmacéutico puede estar alojado en una jeringa. Se puede determinar experimentalmente la dosis terapéuticamente eficaz mediante la administración repetida de cantidades crecientes del conjugado para determinar la cantidad que produzca un punto final clínicamente deseado. La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición dependerá de la actividad del excipiente y las necesidades particulares de la composición. Típicamente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina mediante experimentos de rutina, es decir, preparando composiciones que contengan distintas cantidades del excipiente (oscilando de valores bajos a altos) , examinando la estabilidad y otros parámetros, y entonces determinando el intervalo en que se logra el rendimiento óptimo sin efectos adversos significativos. Sin embargo, el excipiente generalmente estará presente en la composición en una cantidad de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 99% en peso, preferentemente entre el 5 al 98% en peso, más preferentemente entre aproximadamente el 15 al 95% en peso, con concentraciones de menos del 30% en peso siendo las más preferidas . Los excipientes farmacéuticos precedentes junto con otros excipientes se describen en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19- edición, Williams & Williams, (1995), "Physician1 s Desk Reference", 52a edición, Medical Economics, Montvale, NJ (1998) , y Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, American Pharmaceutical Association [Asociación Farmacéutica de los Estados Unidos], Washington, D.C., 2000. Los preparados farmacéuticos de la presente invención son, típica pero no necesariamente, administrados mediante inyecciones y, por lo tanto, son generalmente soluciones o suspensiones líquidas inmediatamente antes de la administración. El preparado farmacéutico puede también tomar otras formas tales como jarabes, cremas, geles, ungüentos, tabletas, polvos y similares. Se incluyen también otros modos de administración, tales como pulmonar, rectal, transdérmica, transmucosal, oral, intratecal, subcutánea, intraarterial, etc. Ventajosamente, el preparado farmacéutico (así como la composición) puede proporcionarse en formas de dosificación unitaria. Además, el preparado farmacéutico (así como la composición) puede usarse en un frasco (por ejemplo, un frasco de vidrio o de plástico) o en una jeringa previamente llenada. Como se describió con anterioridad, el preparado farmacéutico puede inyectarse parenteralmente mediante una inyección intravenosa, o menos preferentemente, mediante una inyección intramuscular o subcutánea. Los tipos de formulación apropiados para una administración parenteral incluyen, entre otros, soluciones listas para ser inyectadas, polvos secos para ser combinados con un solvente antes del uso, suspensiones listas para su inyección, composiciones insolubles secas para ser combinadas con un vehículo antes del uso, y emulsiones y concentrados líquidos para ser diluidos antes de su administración. Típicamente, el preparado se proporciona en una forma seca (por ejemplo, una forma liofílizada) para ser almacenado y se reconstituye con un diluyente líquido apropiado. Los diluyentes líquidos preferidos se seleccionan del grupo que consiste en agua bacterioestática para inyección, dextrosa al 5% en agua, solución salina amortiguadora de fosfatos, solución de Ringer, solución salina, agua esterilizada, agua desionizada y sus combinaciones . La invención también incluye un método para proporcionar un inicio temprano de la actividad y un inicio retardado de la misma, donde el método se caracteriza por comprender las etapas de: (i) administrar a un paciente una primera población de conjugados polímero-agente activo, donde cada conjugado polímero-agente activo comprende uno o más polímeros con un peso molecular medio ponderado dado; y (ii) administrar a un paciente una segunda población de conjugados polímero-agente activo, donde cada conjugado polímero-agente activo comprende uno o más polímeros con un peso molecular medio ponderado mayor que el peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la primera población. Típicamente, ambas (primera y segunda) poblaciones se administran de manera simultánea. La administración simultánea es convenientemente efectuada administrando un preparado farmacéutico como se describe en esta memoria. Es posible también, sin embargo, administrar la primera y la segunda población en serie, ya sea una a continuación de la otra, o luego de una demora, para determinar, por ejemplo, si el paciente responde a la terapia. En algunas circunstancias, puede ser deseable administrar la mezcla de poblaciones de conjugados polímero-agente activo sólo como una dosis inicial con las administraciones subsecuentes limitadas a, por ejemplo, la segunda población de conjugados polímero-agente activo asociada con el peso molecular medio ponderado más alto. Por lo tanto, por ejemplo, el personal médico de emergencia puede utilizar una composición de la invención en un caso de urgencia, mientras que el mantenimiento de los niveles terapéuticos del polímero-agente activo puede lograrse administrando una población única de polímero-agente activo en forma rutinaria.

La invención también proporciona un método para administrar el preparado farmacéutico como se presenta en esta memoria a un paciente que sufra un trastorno que responda a un tratamiento con conjugados polímero-agente activo. El método comprende administrar, generalmente mediante inyecciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de los conjugados polímero-agente activo (preferentemente proporcionados como parte de un preparado farmacéutico) . El método de administración puede utilizarse para tratar cualquier trastorno que pueda ser remediado o prevenido mediante la administración de composiciones de polímero-agente activo particulares . Las personas con capacitación normal en la técnica podrán apreciar qué trastornos pueden ser efectivamente tratados con un conjugado polímero-agente activo específico. La dosis real a administrarse dependerá de la edad, el peso y el estado general del paciente así como de la gravedad del trastorno en tratamiento, la opinión del profesional de cuidado médico y del conjugado que se administra. Las cantidades terapéuticamente eficaces son conocidas por las personas capacitadas en la técnica y/o están descritas en los textos de referencia y en la bibliografía pertinente. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva oscilará desde aproximadamente 0.001 mg a 100 mg, preferentemente en dosis desde 0.01 mg/día a 75 mg/día, y más preferentemente en dosis desde 0.10 mg/día a 50 mg/día. La dosis unitaria de un conjugado dado (de nuevo, preferentemente provista como parte de un preparado farmacéutico) puede administrarse de acuerdo con diversos programas de dosificación que dependen del criterio del clínico, las necesidades del paciente, etc. El programa de dosificación específico será conocido por las personas con una capacitación normal en la técnica o puede determinarse experimentalmente utilizando métodos rutinarios. Los ejemplos de programas de dosificación incluyen, entre otros, una administración de cinco veces por día, cuatro veces por día, tres veces por día, dos veces por día, una vez diaria, tres veces por semana, dos veces por semana, una vez por semana, dos veces por mes, una vez por mes y combinaciones de las mismas. Una vez que se haya alcanzado el punto final clínico, se detendrá la dosificación de la composición. Cuando los conjugados incluyen polímeros que pueden ser escindidos del agente terapéutico, una ventaja de las composiciones es la capacidad de los polímeros relativamente grandes de ser eliminados del organismo como consecuencia de la disminución del tamaño luego de la escisión del polímero del resto del conjugado. Óptimamente, la escisión de cada polímero se facilita por medio del uso de vínculos fisiológicamente escindibles y/o enzimáticamente degradables tales como los vínculos que contienen uretano, amida, carbonato o éster. De esta manera, la eliminación del conjugado (por medio de la escisión de los polímeros individuales) puede modularse seleccionando el tamaño molecular del polímero y el tipo de grupo funcional que proporcionará las propiedades de eliminación deseadas . Una persona con capacitación normal en la técnica puede determinar el tamaño molecular apropiado del polímero así como el grupo funcional a ser escindido. Por ejemplo, una persona con capacitación normal en la técnica, utilizando experimentos de rutina, puede determinar el tamaño molecular apropiado y el grupo funcional a ser escindido, preparando primero diversos conjugados con distintos pesos moleculares y grupos funcionales que pueden ser escindidos, y obtener entonces el perfil de eliminación (por ejemplo, por medio de la toma de muestras periódicas de sangre u orina) mediante la administración del derivado polimérico a un paciente y la toma periódica de muestras de sangre y/u orina. Una vez que se haya obtenido una serie de perfiles de eliminación para cada conjugado ensayado, se puede identificar un conjugado apropiado. Se debe entender que aunque la invención haya sido descrita conjuntamente con realizaciones específicas preferidas de la misma, la descripción precedente así como los experimentos que se describen a continuación tienen el propósito de ilustrar y no de limitar el alcance de invención. Otros aspectos, ventajas modificaciones dentro del alcance de la invención serán evidentes para aquellas personas capacitadas en la técnica a la cual pertenece la invención. EXPERIMENTAL La práctica de la invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de síntesis orgánica y similares, que son entendidas por las personas con una capacitación normal en la técnica y que se explican en la bibliografía. En los siguientes ejemplos, se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero se deberá tomar en cuenta algún error o desviación experimental . Cada uno de los siguientes ejemplos proféticos proporciona beneficios inesperados con respecto al estado anterior de la técnica.

Ejemplo 1 Se prepara una primera población de un conjugado rhEPO de mono-PEG-conjugado lineal de acuerdo con el ejemplo 8 de la patente europea EP 1 333 036. El peso molecular medio ponderado de la porción polimérica del conjugado de esta primera composición es de 5,000 Daltones. Se prepara una segunda población de un conjugado rhEPO de mono-PEG-conjugado lineal de acuerdo con el ejemplo 8 de la patente europea EP 1 333 036 excepto que el peso molecular medio ponderado de la porción polimérica del conjugado de esta segunda composición es de 30,000 Daltones . Entonces, se combinan y mezclan bien la primera y la segunda población. Cada una de las poblaciones (primera y segunda) y la mezcla combinada se administran a ratas siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 11 de la patente europea EP 1 333 036. Brevemente, cada una de las poblaciones (primera y segunda) y la mezcla combinada se diluyen a 2.5 µg/ml (suponiendo una proporción 1:1 del conjugado de la primera población al conjugado de la segunda para la mezcla combinada) con una solución salina fisiológica que contenga 0.05% de albúmina de suero de rata y 0.05% de Tween 20. Se administran cada una de las poblaciones (primera y segunda) y la mezcla combinada a un grupo separado de ratas mediante una inyección única en el rabo en una proporción de 2ml/kg. Se obtienen muestras de sangre de cada rata de cada grupo (extrayendo la sangre de la vena del rabo) en los días 1, 2, 4, 5, 7, 10, 15, 21, 29 y 35 luego de la administración. Cada muestra de sangre se analiza para determinar la cuenta de reticulocitos y el nivel de hemoglobina. Los promedios aproximados y esperados de cada grupo se proporcionan en las Figuras 1 (cuenta de reticulocitos) y 2 (nivel de hemoglobina) . Como se puede ver en las Figuras 1 y 2, la mezcla de conjugados PEG-EPO combinados proporciona un inicio de la acción relativamente más rápido junto con una acción relativamente sostenida en comparación con cualquiera de las poblaciones administrada separadamente.

Ejemplo 2 Se encuentra que una primera composición que comprende una población única de conjugados de interferón (un único polímero unido a un único interferón) , donde el polímero (un PEG) tiene un peso molecular medio ponderado relativamente pequeño (por ejemplo, aproximadamente 5,000 Daltones) tiene un inicio relativamente rápido (por ejemplo, aproximadamente cinco horas) como se evidencia por medio de su Tmá (es decir, la cantidad de tiempo después de la administración en que el agente alcanza su concentración máxima) . Se encuentra que una segunda composición que comprende una población única de conjugados de interferón (un único polímero unido a un único interferón) , donde el polímero (un PEG) tiene un peso molecular medio ponderado relativamente grande (por ejemplo, aproximadamente 40,000 Daltones) tiene un inicio relativamente largo (es decir, de aproximadamente 96 horas) como se evidencia por medio de su Imáx. Las dos poblaciones de polímero-interferón se combinan y mezclan bien para formar una única composición que comprende las diferentes poblaciones. Se espera que, luego de una administración subcutánea a un paciente, la composición única proporcione niveles relativamente altos de un conjugado de PEG-interferón rápidamente (alcanzando así la concentración terapéutica mínima de una manera relativamente rápida) así como niveles sostenidos a lo largo del tiempo (manteniendo así a lo largo del tiempo concentraciones por encima de la concentración terapéutica mínima) .

Ejemplo 3 Se encuentra que una primera composición que comprende una población única de conjugados de G-CSF (por ejemplo, filgrastima) , donde el polímero (un PEG) tiene un peso molecular medio ponderado relativamente pequeño (por ejemplo, aproximadamente 5,000 Daltones) tiene un inicio relativamente rápido como se evidencia por medio de su Tmg? (es decir, la cantidad de tiempo después de la administración en que el agente alcanza su concentración máxima) . Se encuentra que una segunda composición que comprende una población única de conjugados de G-CSF (por ejemplo, filgrastima) , donde el polímero (un PEG) tiene un peso molecular medio ponderado relativamente grande (por ejemplo, aproximadamente 20,000 Daltones) tiene un inicio relativamente largo como se evidencia por medio de su Tmáx. Las dos poblaciones de polímero-G-CSF se combinan y mezclan bien para formar una única composición que comprende las diferentes poblaciones. Se espera que, luego de una administración subcutánea a un paciente, la composición única proporcione niveles relativamente altos de un conjugado de PEG-G-CSF rápidamente, así como niveles sostenidos a lo largo del tiempo, hasta que la cuenta absoluta de neutrófilos posnadir regrese a los valores normales .

Ejemplo 4 Se encuentra que una primera composición que comprende una población única de conjugados de insulina, donde el polímero (un PEG) tiene un peso molecular medio ponderado relativamente pequeño (por ejemplo, aproximadamente 750 Daltones) tiene un inicio relativamente rápido como se evidencia por medio de su Tmá? (es decir, la cantidad de tiempo después de la administración en que el agente alcanza su concentración máxima) . Se encuentra que una segunda composición que comprende una población única de conjugados de insulina, donde el polímero (un PEG) tiene un peso molecular medio ponderado relativamente grande (por ejemplo, aproximadamente 5,000 Daltones) tiene un inicio relativamente largo como se evidencia por medio de su Tmá?. Las dos poblaciones de polímero-insulina se combinan y mezclan bien para formar una única composición que comprende las diferentes poblaciones. Se espera que, luego de una administración subcutánea a un paciente, la composición única proporcione niveles relativamente altos de un conjugado de PEG-insulina rápidamente, así como niveles sostenidos a lo largo del tiempo.

Claims (57)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES 1. Una composición caracterizada porque comprende: una primera población de conjugados polímero-agente activo, en la que cada conjugado polímero-agente activo de la primera población comprende uno o más polímeros con un peso molecular medio ponderado; y una segunda población de conjugados polímero-agente activo, en la que cada conjugado polímero-agente activo de la segunda población comprende uno o más polímeros con un dado peso molecular medio ponderado, donde el peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la primera población es distinto del peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la segunda población.
2. 2. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 100 Daltones a menos de 120,000 Daltones y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 100 Daltones a aproximadamente 120,000 Daltones, donde el peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la primera población es distinto del peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la segunda población.
3. 3. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 100 Daltones a menos de 20,000 Daltones y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 100 Daltones a aproximadamente 120,000 Daltones, donde el peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la primera población es distinto del peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la segunda población.
4. 4. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 100 Daltones a menos de 20,000 Daltones y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 20,000 Daltones a aproximadamente 100,000 Daltones.
5. 5. La composición de la reivindicación 4 , caracterizada porque cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 1,000 Daltones a aproximadamente 15,000 Daltones y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de aproximadamente 25,000 Daltones a aproximadamente 50,000 Daltones.
6. 6. La composición de la reivindicación 5, caracterizada porque cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 2,500 Daltones a aproximadamente 10,000 Daltones y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde más de 30,000 Daltones a aproximadamente 40,000 Daltones .
7. 7. La composición de la reivindicación 6, caracterizada porque cada polímero de la primera población tiene un peso molecular medio ponderado de aproximadamente 5,000 Daltones y cada polímero de la segunda población tiene un peso molecular medio ponderado en el intervalo desde aproximadamente 35,000 Daltones a aproximadamente 40,000 Daltones.
8. 8. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la diferencia absoluta entre el peso molecular medio ponderado de los polímeros de la primera y de la segunda población es desde aproximadamente 500 Daltones a aproximadamente 100,000 Daltones.
9. 9. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la diferencia absoluta entre el peso molecular medio ponderado de los polímeros de la primera y de la segunda población es desde aproximadamente 2,000 Daltones a aproximadamente 100,000 Daltones.
10. 10. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la diferencia absoluta entre el peso molecular medio ponderado de los polímeros de la primera y de la segunda población es desde aproximadamente 10,000 Daltones a aproximadamente 100,000 Daltones.
11. 11. La composición de la reivindicación 1, caracterizada en que la diferencia absoluta entre el peso molecular medio ponderado de los polímeros de la primera y de la segunda población es desde aproximadamente 20,000 Daltones a aproximadamente 100,000 Daltones.
12. 12. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la diferencia absoluta entre el peso molecular medio ponderado de los polímeros de la primera y de la segunda población es desde aproximadamente 30,000 Daltones a aproximadamente 100,000 Daltones.
13. 13. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la diferencia absoluta entre el peso molecular medio ponderado de los polímeros de la primera y de la segunda población es desde aproximadamente 20,000 Daltones a aproximadamente 40,000 Daltones.
14. 14. La composición de la reivindicación 1, caracterizada en que la diferencia absoluta entre el peso molecular medio ponderado de los polímeros de la primera y de la segunda población es desde aproximadamente 25,000 Daltones a aproximadamente 35,000 Daltones.
15. 15. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el cociente molar entre la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo es desde aproximadamente 1000:1 a aproximadamente 100:1.
16. 16. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el cociente molar entre la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo es desde aproximadamente 100:1 a aproximadamente 10:1.
17. 17. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el cociente molar entre la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo es desde aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:1.
18. 18. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el cociente molar entre la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo es desde aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10.
19. 19. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el cociente molar entre la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo es desde aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:100.
20. 20. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el cociente molar entre la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo es desde aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:1000.
21. 21. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque cada polímero de la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo se selecciona independientemente del grupo que consiste en un poli (óxido de alquileno) , poli (vinilpirrolidona) , poli (alcohol vinílico), polioxazolina, poli (acriloilmorfolina) y poli (polioles oxietilados)
22. 22. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque cada polímero es un poli (etilenglicol) .
23. 23. La composición de la reivindicación 22, caracterizada porque cada poli (etilenglicol) es cubierto en sus extremos con una porción de cobertura de extremo.
24. 24. La composición de la reivindicación 23, caracterizada porque cada grupo de cobertura de extremo se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquiloxi, alquiloxi sustituido, alqueniloxi, alqueniloxi sustituido, alquiniloxi, alquiniloxi sustituido, ariloxi, ariloxi sustituido e hidroxi .
25. 25. La composición de la reivindicación 24, caracterizada porque cada grupo de cobertura de extremo es alcoxi .
26. 26. La composición de la reivindicación 25, caracterizada porque cada alcoxi es metoxi.
27. 27. La composición de la reivindicación 24, caracterizada porque cada porción de cobertura de extremo es hidroxi .
28. 28. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque cada polímero de la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo independientemente tiene una estructura que se selecciona del grupo que consiste en homopolímero, copolímero alternado, copolímero aleatorio, copolímero en bloque, tripolímero alternado, tripolímero aleatorio y tripolímero en bloque.
29. 29. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque cada uno de los conjugados polímero- agente activo de la primera población comprende un único polímero unido a un único agente activo.
30. 30. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque cada uno de los conjugados polímero- agente activo de la segunda población comprende un único polímero unido a un único agente activo.
31. 31. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque cada uno de los conjugados polímero-agente activo tanto de la primera como de la segunda población comprende un único polímero unido a un único agente activo.
32. 32. La composición de la reivindicación 31, caracterizada porque el polímero es un poli (etilenglicol) .
33. 33. La composición de la reivindicación 30, caracterizada porque el poli (etilenglicol) es lineal.
34. 34. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el agente activo tiene actividad eritropoyética.
35. 35. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el agente activo es eritropoyetina.
36. 36. La composición de la reivindicación 35, caracterizada porque la eritropoyetina es derivada por métodos recombinantes .
37. 37. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el agente activo es una molécula pequeña.
38. 38. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el agente activo es un péptido.
39. 39. La composición de la reivindicación 1, caracterizada en que el agente activo es una proteína.
40. 40. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable .
41. 41. La composición de la reivindicación 40, caracterizada porque el excipiente es un azúcar.
42. 42. La composición de la reivindicación 40, caracterizada porque está en una forma liofilizada.
43. 43. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un diluyente líquido.
44. 44. La composición de la reivindicación 37, caracterizada porque el diluyente líquido se selecciona del grupo que consiste en agua baterioestática para inyecciones, dextrosa al 5% en agua, solución salina amortiguadora de fosfatos, solución de Ringer, solución salina, agua esterilizada, agua desionizada y combinaciones de las mismas .
45. 45. La composición de la reivindicación 1, en una forma de dosificación unitaria.
46. 46. La composición de la reivindicación 40, alojada en un frasco de vidrio.
47. 47. Un método para preparar una mezcla, caracterizado porgue dicho método comprende los pasos de: (i) proporcionar una primera población de conjugados polímero-agente activo; (ii) proporcionar una segunda población de conjugados polímero-agente activo; y (iii) combinar la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo, formando de esa manera una mezcla de la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo.
48. 48. El método de la reivindicación 47, caracterizado porque comprende además la etapa de mezclar la primera y la segunda población de conjugados polímero-agente activo para formar una mezcla sustancialmente homogénea.
49. 49. El método de la reivindicación 48, caracterizado porque comprende además la etapa de agregar un excipiente farmacéuticamente aceptable .
50. 50. El método de la reivindicación 49, caracterizado porque el excipiente es un azúcar.
51. 51. El método de la reivindicación 47, caracterizado porque comprende además la etapa de liofilizar la mezcla.
52. 52. Un método para entregar un preparado farmacéutico caracterizado porque comprende la etapa de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de la reivindicación 40.
53. 53. Un método para proporcionar un inicio temprano de actividad y un inicio demorado de actividad, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (i) administrar a un paciente una primera población de conjugados polímero-agente activo, donde cada conjugado polímero-agente activo comprende uno o más polímeros con un peso molecular medio ponderado; y (ii) administrar a un paciente una segunda población de conjugados polímero-agente activo, donde cada conjugado polímero-agente activo comprende uno o más polímeros con un peso molecular medio ponderado mayor que el peso molecular medio ponderado del uno o más polímeros de la primera población.
54. 54. El método de la reivindicación 53 , caracterizado porque la primera y la segunda población se administran en serie.
55. 55. El método de la reivindicación 53, caracterizado porque la primera y la segunda población se administran simultáneamente .
56. 56. El método de la reivindicación 53, caracterizado porque la primera y la segunda población se administran mediante inyecciones.
57. 57. Un gel caracterizado porque comprende la composición de la reivindicación 1.