MXPA06004473A - Terapia adyuvante con herceptin - Google Patents

Abstract

La presente solicitud describe una terpaia adyuvante de cáncer de mama no metastásico usando HERCEPTIN(r).

Description

TERAPIA ADYUVANTE CON HERCEPTIN Campo de la invención La . presente invención se relaciona con la terapia adyuvante contra el cáncer de mama no metastásico utilizando HERCEPTIN. Antecedentes de la Invención Receptores HER y Anticuerpos contra estos La familia HER de receptores de tirosina cinasas son mediadores importantes del crecimiento, diferenciación y supervivencia celular. La familia de receptores incluye cuatro distintos miembros incluyendo el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbBl, o HERÍ), HER2 (ErbB2 o pl85neu) , HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tyro2) . El EGFR, codificado por el gen erfoBl, ha sido causalmente implicado en la malignidad en humanos . En particular la expresión creciente del EGFR se ha observado en el cáncer de mama, vejiga, pulmón, cabeza, cuello y estómago así como también en glioblastomas. La creciente expresión del receptor EGFR frecuentemente se ha asociado con el incremento en la producción del ligando de EGFR, el factor de crecimiento de transformación alfa (TGF-a) , por las mismas células del tumor originando la activación del receptor por medio de un camino de estimulación autócrina. Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994). Se han evaluado anticuerpos REF:171509 monoclonales dirigidos contra el EGFR o sus ligandos, TGF-a y EGF, como agentes terapéuticos en el tratamiento de estos males. Véase, p. ej . , Baselga and Mendelsohn, supra; Masui et al . Cáncer Research 44:1002-1007 (1984); y Wu et al . J. Clin . Invest . 95:1897-1905 (1995). El Segundo miembro de la familia HER, pl85neu, se identificó originalmente como el producto. del gen de transformación de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. La forma activada del neu proto-oncogen resulta de una mutación puntual (valina en ácido glutámico) en la región transmembrana de la proteína codificada. Se observó amplificación del homólogo de humano del neu en los cánceres de mama y ovario, y se correlaciona con una pobre prognosis (Slamon et al . , Science, 235:177-182 (1987); (Slamon et al . , Science, 244:707-712 (1989); y la Pat. US No. 4,968,603).

Hasta la fecha, no se han reportado análogos de mutación puntual en el neu proto-oncogen para tumores de humanos.

También se ha observado sobre-exprésion del HER2 (frecuentemente pero no de manera uniforme debido a la amplificación del gen) en otros carcinomas que incluyen carcinomas de estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñon, colon, tiroides, páncreas y vejiga. Véase entre otros, King et al . , Science, 229:974 (1985); Yo ota et al . , Lancet : 1:765-767 (1986); Fukushige et al . , Mol Cell Biol . , 6:955-958 (1986); Guerin et al . , Oncogene Res . , 3:21-31 (1988); Cohén et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cáncer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Cáncer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cáncer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cáncer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog . 3:254-257 (1990); Aasland et al., Br. J. Cáncer, 57:358-363 (1988); Williams et al., Pathobiology 59:46-52 (1991); y McCann et al., Cáncer, 65:88-92 (1990) . El HER2 puede estar sobreexpresado en cáncer de próstata (Gu et al., Cáncer Lett. 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28:827-33 (1997); Ross et al., Cáncer 79:2162-70 (1997); y Sadasivan et al., J. Urol. 150:126-31 (1993) ) . La amplificación/sobreexpresión de HER2 es un resultado prematuro que se asocia con la enfermedad agresiva y pobre prognosis. La amplificación del gen HER2 se encuentra en 20-25% de los tumores de mama primarios (Slamon et al., Science 244-707-12 (1989); Owens et al., Breast Cáncer Res Treat 76:S68 resumen 236 (2002)). La enfermedad HER2 positivo se correlaciona con libre de recaída y supervivencia global disminuida (Slamon et al., Science 235:177-82 (1987); Pauletti et al., J Clin Oncol 18:3651-64 (2000)). La amplificación del gen HER2 se asocia con el tiempo significativamente reducido para una recalda y pobre supervivencia en la enfermedad positiva en nodulos (Slamon et al. (1987); Pauletti et al. (2000) ) y pobre resultado en la enfermedad negativa en nodulos (Press et al . , J Clin Oncol 1997; 15:2894-904 (1997); Pauletti et al . (2000) . Se han descrito anticuerpos dirigidos contra los productos de la proteína HER2 de humano y pl85neu de rata. Drebin y colegas han desarrollado anticuerpos contra el producto del .neu gen de rata, pl85neu. Véase, por ejemplo, Drebin et al . , Cell 41:695-706 (1985); Myers et al . , Meth. Enzym . 198:277-290 (1991); y W094/22478. Drebin et al . , Oncogene 2:273-277 (1988) reporta que las mezclas de anticuerpos reaccionan con dos diferentes regiones del pl85neu originando efectos sinérgicos anti-tumorales en las células NIH-3T3 transformadas en neu implantadas en ratones atímicos. Véase también la Patente 5,824,311 publicada el 20 de Octubre de 1998. Hudziak et al . , Mol . Cell . Biol . 9 (3) : 1165-1172 (1989) describe la generación de un panel de anticuerpos HER2 los cuales se caracterizaron utilizando la linea celular de tumores de mama en humanos SK-BR-3. La relativa proliferación celular de las células SK-BR-3 después de la exposición a los antibióticos se determinó por medio de la tinción con cristal violeta de las monocapas después de 72 horas. Utilizando esta prueba, se obtuvo la inhibición máxima con el anticuerpo llamado 4D5 que inhibió la proliferación celular en 56%. Otros anticuerpos en el panel redujeron la proliferación celular a un menor grado en esta prueba. Se encontró además que el anticuerpo 4D5 sensibiliza a las líneas celulares de tumor de mama de sobreexpresión de HER-2 a los efectos citotóxicos del TNF-a. Véase también la Patente No. 5,677,171 publicada el 14 de Octubre de 1997. Los anticuerpos de HER2 se revelan en Hudziak et al., se caracterizan más en Fendly et al., Cáncer Research 50: 1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro 26(3) :59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol . 11 (3) : 117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol. 11 (2) : 979-986; Lewis et al., Cáncer Immunol . Immunother . 37:255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cáncer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scout et al., J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al., Cáncer Research 56:1457-1465 (1996); y Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997) . Una versión humanizada recombinante del anticuerpo 4D5 de HER2 murino (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumab o HERCEPTIN®; Patente US No. 5,821,337) es clínicamente activa en pacientes con cánceres de mama metastásicos de sobreexpresión HER-2 que han recibido terapia extensiva anti-cáncer previa (Baselga et al., Clin. Oncol. 14:737-744 (1996) ) . El trastuzumab recibió aprobación de comercialización por parte de la Food and Drugs Administration el 5 de Septiembre de 1988 para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores sobreexpresan la proteína HER2. El trastuzumab se indica como tratamiento semanal en pacientes en terapia de primera línea en combinación con paclitaxel y como un solo agente en terapia de segunda y tercera línea. En las pruebas clínicas, el HERCEPTIN® ha mostrado un beneficio de supervivencia cuando se usa en combinación con la quimioterapia. En Diciembre del 2001, Genetech recibió aprobación de la FDA para incluir datos que mostraron un incremento de 24 por ciento en la supervivencia global promedio para mujeres con cáncer de mama metastásico HER2 positivo tratado inicialmente con HERCEPTIN® y quimioterapia comparado con la quimioterapia sola (media de 25.1 meses comparado con los 20.3 meses) . Se ha usado el HERCEPTIN® en combinación diferentes agentes quimioterapéuticos, incluyendo taxoides como el paclitaxel (Salmón et al . , N. Engl . J. of Med. 344:783-792 (2001); Leyland-Jones et al . , J. Clin . Oncol . 21 (21) :3965-3971 (2003)), y docetaxel (Esteva et al . , J. Clin . Oncol . (7) :1800-1808 (2002); (Extra et al . , Breast Cáncer Res Treat 82 (Suppl. 1) :217 (2003)); taxoides y compuestos de platino (Pergra et al . , J. Nati . Cáncer Inst . 96 (10) : 759-69 (2004); Yardley et al . , Breast Cáncer Res Treat 76:S113 resumen 439(2002)); compuesto de platino (como cisplatin o carboplatin) (Robert et al., Ann. Oncol., 15 (suppl 3) :39 (resumen 144P) (2004); Pegram et al., J. Clin. Oncol. 16:2659-71 (1998)); vincas como vinorelbina (NAVELBINE®) (Burstein et al., J. Clin. Oncol. 19(10); 2722-2730 (2001)); inhibidores de aromatasa como letrozol y anastrazol (Jones, et al., Annals of Oncology 14:1697-1794 (2003)'; Wong et al., Breast Cáncer Res Treat. 82 (Suppl. 1):444 (2003)); anti-estrógeno como fulvestrant (FASLODEX®) (Jones, A., supra); gemcitabina (GEMZAR®) (millar et al., Oncology 15(2): 38-40 (2001); CShaughnessy et al., Breast Cáncer Res Treat. 69:302 resumen 523 (2001)); doxorubicina liposomal (Theodoulou et al., Proc Am Soc Clin Oncol. 21:216 resumen 216 (2002)); docetaxel/vinorelbina (con G-CSF y profilaxis quinolona) Limentani et al., Breast Cáncer Res Treat. 76: resumen 162 (2002)); epirubicina y ciclofosfamida (Untch et al., Eur. J. C ncer 40:988-97 (2004b). Véase también Pegram et al., J. Nati. Cáncer. Inst. 96 (10) : 739-49 (2004) para diferentes combinaciones de terapias incluyendo trastuzumab. Se han descrito otros anticuerpos HER2 con diferentes propiedades en Tagliabue et al., Int. J. Cáncer. 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al., Cáncer Res 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (EUA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cáncer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cáncer 53:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al . , Cáncer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al . , Cáncer Res 51:4575-4580 (1991); Shawver et al . , Cáncer Res . 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al . , Cáncer Res . 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al . , J. Biol . Chem. 267:15160-15167 (1992); Patente US No. 5,783,186; y Klapper et al . , Oncogene 14:2099-2109 (1997). La homología del muestreo ha originado la identificación de otros dos miembros de la familia de receptores HER; HER3 (Patentes US Nos. 5,183,884 y 5,480,968 así como también Kraus et al . , PNAS (EUA) 86:9193-9197 (1989)) y HER4 (Solic. Pat. EP No. 599,274; Plowman et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al . , Nature, 366:473-475 (1993)). Ambos receptores muestran expresión incrementada en al menos algunas líneas celulares del cáncer de mama. Generalmente se encontraron receptores HER en diferentes combinaciones en células y heterodimerización se considera que se incrementó la diversidad de las respuestas celulares a una variedad de ligandos HER (Earp et al . , Breast Cáncer Research and Treatment 35:115-132 (1995)). El EGFR se une con seis diferentes ligandos; el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el factor de crecimiento de transformación alfa (TGF-a) , amfiregulina, factor de crecimiento epidérmico que une heparina (HB-EGF) , betacelulina y epiregulina (Groenen et al . , Growth Factors 11:235-257 (1994)). Una familia de proteínas de heregulina resulta del corte y empalme de un solo gen son los ligandos HER3 y HER4. La familia heregulina incluye alfa, beta y gama heregulinas (Colmes et al . , Science, 256:1205-1210 (1992); la Patente US No. 5,641,869; y Schaefer et al . , Oncogene 15:1385-1394 (1997)); factores de diferenciación neu (NDFs) , factores de crecimiento glial (GGFs) ; actividad de inducción del receptor de acetilcolina (ARIA) ; y factor derivado sensorial y neuromotor (SMDF) . Para una revisión, véase Groenen et al . , Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. G. Mol . & Cell . Neurosci . 7:247-262 (1996) y Lee et al . , Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). Se identificaron recientemente tres ligandos HER adicionales; neuregulina-2 (NRG-2) la cual se reporta que une ya sea HER3 o HER4 (Chang et al . , Nature 387 509-512 (1997)); y Carraway et al . , Nature 387:512-516 (1997)); neuregulina-3 que une el HER4 (Harare et al . , Oncogene 18:2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulina y epiregulina también se unen a HER4. Mientras el EGF y el TGF-a no se unen a HER2, EGF estimula EGFR y HER2 para formar un heterodímero, el cual activa el .EGFR y origina la transfosforilación del HER2 en el heterodímero. La dimerización y/o transfosforilación parece activar el HER2 tirosina cinasa. Véase Earp et al . , supra . Del mismo modo, cuando HER3 se co-expresa con HER3 , se forma un complejo con señalización activa y los anticuerpos dirigidos contra HER2 son capaces de romper este complejo (Sliwkowski et al . , J. Biol . Chem . , 269 (20) :14661-14665 (1994)).

Adicionalmente, la afinidad de HER3 por la heregulina (HRG) se incrementa a un estado de mayor afinidad cuando se co-expresa con HER2. También véase, Levi et al . , Journal of Neuroscience 15:1329-1340 (1995); Morrissey et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA 92:1431-1435 (1995); y Lewis et al . , Cáncer Res . 56:1457-1465 (1996) con respecto al complejo de proteína HER2-HER3. HER4 al igual que HER3 , forma un complejo con señalización activa con el HER2 (Carrawayand Cantley, Cell 78:5-8 (1994)).

Las publicaciones de patentes relacionadas a los anticuerpos HER incluyen: US 5,677,171, US 5,720,937, US 5,720,954, US 5,725,856, US 5,770,195, US 5,772,997, US 6,165,464, US 6,387,371, US 6,399,063, US2002/0192211A1, US 6,015,567, US 6,333,169, US 4,968,603, US 5,821,337, US 6,054,297, US 6,407,213, US 6,719,971, US 6,800,738, US2004/0236078A1, US 5,648,237, US 6,267,958, US 6,685,940, US 6,821,515, W098/17797, US 6,127,526, US 6,333,398, US 6,797,814, US 6,339,142, US 6,417,335, US 6,489,447, W099/31140, US2003/0147884A1 US2003/0170234A1, US2005/0002928A1, US 6,573,043, US2003/0152987A1, W099/48527, US2002/0141993A1, WOOl/00245, US2003/0086924, US2004/0013667A1, WO00/69460, WOOl/00238, WOOl/15730, US 6,627,196B1, US 6,632,979B1, WO01/00244, US2002/0090662A1, WO01/89566, US2002/0064785, US2003/0134344, WO 04/24866, US2004/0082047, US2003/0175845A1, WO03/087131, US2003/0228663 , W02004/008099A2, US2004/0106161, W02004/048525 , ll US2004/0258685A1, US 5,985,553, US 5,747,261, US 4,935,341, US 5,401,638, US 5,604,107, WO 87/07646, WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412,116 Bl, EP 494,135 Bl, US 5,824,311, EP 444,181 Bl, EP 1,006,194 A2 , US 2002/0155527A1, WO 91/02062, US 5,571,894, US 5,939,531, EP 502,812 Bl, WO 93/03741, EP 554,441 Bl, EP 656,367 Al, US 5,288,477, US 5,514,554, US 5,587,458, WO 93/12220, WO 93/16185, US 5,877,305, WO 93/21319, WO 93/21232, US 5,856,089, WO 94/22478, US 5,910,486, US 6,028,059, WO 96107321, US 5,804,396, US 5,846,749, EP 711,565, WO 96/16673, US 5,783,404, US 5,977,322, US 6,512,097, WO 97/00271, US 6,270,765, US 6,395,272, US 5,837,243, WO 96/40789, US 5,783,186, US 6,458,356, WO 97/20858, WO 97/38731, US 6,214,388, US 5,925,519, WO 98/02463, US 5,922,845, WO 98/19489, WO 98/33914; US 5,994,071, WO 98/45479, US 6,358,682 Bl, US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 Al, WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, WO02/05791, WO 02/11677, US 6,582,919, US2002/0192652A1, US 2003/0211530A1 , WO 02/44413, US 2002/0142328, US 6,602,670 B2 , WO 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US 2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, O 03/012072, WO 03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1,357,132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, US 5,705,157, US 6,123,939, EP 616,812 Bl, US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6,403,630 Bl, WO 00/61145, WO 00/61185, US 6,333,348 Bl, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 Al, US 6,767,541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 Al, WO 01187334, WO 02105791, WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842 y WO 03/86467. Los pacientes tratados con el trastuzumab anticuerpo HER2 puede seleccionarse por terapia en base a la sobre-expresión/amplificación de HER2. Véase, por ejemplo, WO99/31140 (Patón et al.), US2003/0170234A1 (Hellmann, S.) y US2003/0147884 (Patón et al.), así como también WO01/89566, US2002/0064785, y US2003/0134344 (Mass et al.,). Véase también, US2003/0152987, Cohén et al., que se relaciona con la inmunoquímica (IHC, por sus siglas en inglés) y hibridación in si tu fluorescente (FISH, por sus siglas en inglés) para detectar la sobreexpresión y amplificación de HER2. La WO2004/053497 y US2004/024815A1 (Bacus et al.), así como también US 2003/0190689 (Crosby and Smith) , se relacionan con la determinación y predicción de la respuesta a la terapia con trastuzumab. La US2004/013297A1 (Bacus et al.) se relaciona con la determinación o predicción de la respuesta a la terapia con anticuerpo ABX0303 EGFR. La WO2004/000094 (Bacus et al . ) se relaciona con la determinación de la respuesta al GW572016, una pequeña molécula, inhibidor de EGFR-HER2 tirosina cinasa. La WO2004/063709, Amler et al., se refiere a los biomarcadores y los métodos para determinar la sensibilidad al inhibidor EGFR, erlotinib HCl. La US2004/0209290, Cobleigh et al., se relaciona con los marcadores de expresión del gen para la prognosis de cáncer de mama. Los pacientes tratados con pertuzumab pueden seleccionarse para la terapia a base de la activación o dimerización HER. Las publicaciones de Patentes que se relacionan con el pertuzumab y la selección de pacientes para la terapia con el mismo incluyen: WO01/00245 (Ada s et al.); US2003/0086924 (Sliwkoski, M.); US2004/0013667A1 (Sliwkoski, M.); así como también WO2004/008099A2 y US2004/0106161 (Bossenmaier et al . ) . Cronin et al . , Am. J. Path . 164(1) :35-42 (2004) describe la medición de la expresión del gen en tejidos imbibidos en parafina en archivos. Ma et al . , Cáncer Cell 5:607-616 (2004) describe el perfil del gen por medio de microdisposición oligonucleótida del gen utilizando el 7ARN aislado de las secciones de tejido del tumor tomadas de las biopsias primarias archivadas . Terapia adyuvante La terapia adyuvante, en el sentido más amplio, es el tratamiento dado además de la terapia principal para matar cualquier célula cancerosa que pueda haberse propagado, aun si la propagación no se detecta por medio de pruebas radiológicas o de laboratorio. Las pruebas clínicas contemporáneas han evaluado la eficacia de los agentes quimioterapéuticos para la terapia adyuvante del cáncer de mama, principalmente BCIRG (comparando el paclitaxel, doxorubicina, y ciclofosfamida (TAC) con el fluorouracil , doxorubicina, y ciclofosfamida FAC) ; CALGB 9741 (prueba de dosis compacta) ,- CALGC 9344 (antraciclina + ciclofosfamida (AC) comparada con AC + paclitaxel (AC/T) ) . En la prueba BCRIG 001, la relación de riesgo de supervivencia sin enfermedad (DFS) fue de 0.72 (p = 0.0010), DFS de 5 años para TAC fue del 75%, y para FAC fue de 68%. La relación de riesgo de supervivencia global (OS) fue de 0.70 (p = 0.0080), OS de 5 años para TAC fue del 87%, y para FAC fue de 81%. Para HER2 positivo (HER2+) pacientes (n = 328) en esta prueba, la relación de riesgo de DFS fue de 0.60 (p = 0.0088) . La CALGB 9741 fue una prueba de dosis compacta comparando AC x 4 con T x 4 ; secuencial A x 4 a T x 4 a C x 4 ; dosis secuencial compacta A x 4 a T x 4 a C x 4; y dosis compacta Ac x 4 a T x 4 (A = antraciclina; C = ciclofosfamida; T = paclitaxel) . La relación de riesgo DFS (dosis compacta contra estándar) fue de 0.74 (p = 0.010); DFS de 4 años fue de 82% contra 75%. La relación de riesgo OS (dosis compacta contra estándar) fue de 0.69 (p = 0.013). La CALGB 9344 comparó la eficacia de AC a AC/T. La relación de riesgo DFS fue de 0.83 (p = 0.002); con DFS de 5 años fue de 65% para AC y 70% para AC/T. La relación de riesgo OS fue de 0.82 (p = 0.0064), con OS de 5 años para AC de 77% y para AC/T de 80%. De acuerdo con Sociedad Americana de Cáncer, un estimado de 211,000 mujeres se les diagnosticó cáncer de mama y aproximadamente 40,000 mujeres murieron a causa de esta enfermedad en los Estados Unidos de América en 2005. El cáncer es la causa más común de cáncer en mujeres en los Estados Unidos de América y se diagnostica una mujer con cáncer de mama cada tres minutos en los Estados Unidos de América. Aproximadamente 30% de las mujeres con cáncer de mama tendrán cáncer de mama positivo en nodulos linfáticos. Breve Descripción de la Invención La invención en la presente se relaciona con los resultados obtenidos en estudios clínicos del uso de HERCEPTIN® adyuvante en pacientes humanos con cáncer de mama de alto riesgo, no metastásico. La eficacia, evaluada como supervivencia libre de la enfermedad (DFS) y supervivencia global (OS) fue remarcable, especialmente cuando se compara con los datos de DFS y OS para los agentes quimioterapéuticos probados recientemente en pruebas clínicas que se utilizan en la composición adyuvante. Sorprendentemente, los pacientes en las pruebas clínicas que recibieron el HERCEPTIN® en combinación paclitaxel, seguida por quimioterapia con antraciclina (doxorubicina) /ciclofosfamida (AC) , tuvieron una disminución del 52% en la presencia de la enfermedad (primer evento de cáncer de mama) comparado con los pacientes que se les probó con AC seguido por paclitaxel solo en 3 años . La diferencia fue significativamente alta. Los resultados fueron particularmente impresionantes y sorprendentes, dado que los pacientes tuvieron HER2 positivo, y por lo tanto un alto riesgo de recurrencia, ya que la amplificación o sobreexpresión de HER2 se ha relacionado con la enfermedad más agresiva y mayor riesgo de recurrencia, a no ser por su forma positiva HER2, los pacientes incluidos en las pruebas se seleccionaron por medio del criterio además incrementó su riesgo de recurrencia, incluyendo el número de nodulos linfáticos involucrados, el tamaño del tumor primario, etc. No se esperó particularmente una mejora significativa sobre la quimioterapia sola, aplicada en estos pacientes. Esta invención constituye una separación médica significativamente a través de proveer la asistencia más efectiva de los pacientes con cáncer de mama no metastásico. En un aspecto, la invención se relaciona con un método de terapia adyuvante que comprende administrar a un paciente humano con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico, seguido por cirugía definitiva, una cantidad efectiva de un anticuerpo que se une con HER2 Dominio IV unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) y al menos un agente quimioterapeutico, para ampliar la supervivencia libre de enfermedad (DFS) o la supervivencia global (OS) en el paciente, en donde la DFS o la OS se evalúa aproximadamente de 2 a 5 años después de iniciado el tratamiento. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para curar el cáncer de mama no metastásico en una población de pacientes humanos con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico que comprende administrar una cantidad efectiva de trastuzumab (HERCEPTIN®) y taxoide a la población de pacientes después de cirugía definitiva, y evaluar la población de pacientes después de cuatro años para confirmar que no ha ocurrido la recurrencia de la enfermedad en al menos aproximadamente 80% de la población. Aun en otro aspecto, la invención se relaciona con método para disminuir la recurrencia de la enfermedad en una población de pacientes humanos con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico que comprende administrar una cantidad efectiva de trastuzumab (HERCEPTIN®) y taxoide a los pacientes seguido de cirugía definitiva, en donde la recurrencia de la enfermedad en aproximadamente 3 años diminuyó al menos en aproximadamente 50% comparado con los pacientes tratados solo con taxoide . En una modalidad particular de estos métodos, la administración del anticuerpo y el agente quimioterapeutico disminuye la recurrencia del cáncer en la población de pacientes en aproximadamente 50% comparado con los pacientes tratados con quimioterapia, tal como la antraciclina/ciclofosfamida seguida por paclitaxel, solo. En otra modalidad, el paciente tiene un alto riesgo de recurrencia de cáncer. En otra modalidad, la población, comprende 3000 o más pacientes de humano. Aun en otro aspecto, la invención se relaciona con un método de terapia adyuvante que comprende administrar a un paciente humano con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico, seguido por cirugía definitiva, un anticuerpo el cual se une al HER2 Dominio IV unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) y al menos un agente quimioterapeutico, en una cantidad efectiva para ampliar la supervivencia libre de enfermedad (DFS) o la supervivencia global (OS) , con relación al estándar de asistencia con quimioterapia, en donde la DFS o la OS se avalúa al menos una vez al año durante aproximadamente 3 años después del inicio del tratamiento, en donde la DFS se amplia si el paciente permanece vivo, sin la recurrencia de cáncer durante al menos un año, y la OS se amplia si el paciente permanece vivo durante al menos un año, desde el inicio del tratamiento. Aun más en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para instruir a un paciente humano con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico identificado como que tiene un alto riesgo de recurrencia de cáncer o baja probabilidad de supervivencia seguida por cirugía definitiva, y quien ha sido tratado únicamente por medio de la asistencia estándar con quimioterapia para recibir el tratamiento con un anticuerpo el cual se une al HER2 Dominio IV que se une por el trastuzumab (HERCEPTIN®) y al menos una gente quimioterapeutico. En un aspecto diferente, la invención se relaciona con un método promocional, que comprende promover, el tratamiento del cáncer de mama HER2 positivo no metastásico en pacientes humanos identificados que tienen alto riesgo de recurrencia de cáncer o baja probabilidad de supervivencia seguido por cirugía definitiva; (a) un agente quimioterapeutico en combinación con un anticuerpo el cual se une al HER2 Dominio IV unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) ; o (b) un anticuerpo el cual se une al HER2 Dominio IV unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) en combinación con un agente quimioterapéutico . Aun en otro aspecto, la invención se relaciona con un método de negocio, que comprende la comercialización de un agente quimioterapéutico para tratar el cáncer de mama HER2 positivo no metastásico en pacientes humanos identificados como de alto riesgo de recurrencia del cáncer o baja probabilidad de supervivencia seguido por cirugía definitiva en combinación con un anticuerpo que se une al HER2 Dominio IV unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) , a fin de disminuir la probabilidad de recurrencia del cáncer en los pacientes o incrementar la probabilidad de supervivencia de los pacientes. En otro aspecto adicional, la invención se relaciona con un método de negocio, que comprende la comercialización de un anticuerpo que se une al HER2 Dominio IV unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) para tratar el cáncer de mama HER2 positivo no metastásico en pacientes humanos identificados como de alto riesgo de recurrencia del cáncer o baja probabilidad de supervivencia seguido por cirugía definitiva en combinación con un agente quimioterapeutico, a fin de disminuir la probabilidad de recurrencia del cáncer en los pacientes o incrementar la probabilidad de supervivencia de los pacientes . La invención también se relaciona con un método de terapia adyuvante que comprende administrar a un paciente humano con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico, seguido por cirugía definitiva, un anticuerpo que se une al HER2 Dominio IV unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) , como un solo agente, en una cantidad efectiva para ampliar la supervivencia libre de enfermedad (DFS) o supervivencia global (OS) , en donde la DFS o la OS se confirma al menos aproximadamente una vez al año después de iniciar la administración del anticuerpo. En todos los aspectos, un anticuerpo preferido bloquea la unión del trastuzumab (HERCEPTIN®) al HER2. Más preferentemente, el anticuerpo comprende trastuzumab (HERCEPTIN®) . El agente quimioterapeutico puede seleccionarse, sin limitación, del grupo que consiste de taxoide, vinca, compuesto de platino, inhibidor de aromatasa, anti-estrógeno, etoposido, tiotepa, ciclofosfamida, metotrexato, doxorubicina liposomal, doxorubicina liposomal pegilada, capecitabina y gemcitabina. En una modalidad particular, el agente quimioterapeutico es un taxoide, tal como, por ejemplo, paclitaxel o docetaxel, con más preferencia paclitaxel. En todos los aspectos, preferentemente el agente quimioterapeutico, el taxoide y el anticuerpo se administran concurrentemente . En todos los aspectos, el agente quimioterapeutico, tal como taxoide, y el anticuerpo se administran preferentemente después de otra quimioterapia estándar, administrada postoperación. En una modalidad preferida, la quimioterapia es la administración de antraciclina (doxorubicina) y ciclofosfamida. En todos los aspectos, el paciente preferentemente de forma relativa joven, p.ej., menor de aproximadamente 50 años, o menor de aproximadamente 45 años, o menor a 40 años de edad.

En todos los aspectos, los métodos incluyen el tratamiento de pacientes que tienen un tumor mayor de 2 centímetros de diámetro, y/o pacientes con cáncer positivo en nodulos linfáticos (que tienen de 4-9, ó 10 o más nodulos linfáticos involucrados) , y/o pacientes negativos en el receptor de estrógeno (ER) , y/o pacientes negativos del receptor de progesterona (PG) .

En todos los aspectos, el anticuerpo puede, por ejemplo, ser un anticuerpo intacto, desnudo. En una modalidad particular, la DFS o OS se evalúa 5 años después del inicio del tratamiento. En otra modalidad adicional, la administración de un anticuerpo y el agente quimioterapeutico disminuye la recurrencia de la enfermedad en una población de pacientes en aproximadamente 50% comparada con los pacientes tratados con el agente quimioterapeutico, sin el anticuerpo. Breve Descripción de las Figuras La Fig. 1 proporciona un esquema de la estructura de la proteína HER2 , y la secuencia de aminoácidos para los Dominios I-IV (SEC ID NOS: 1-4, respectivamente) del dominio extracelular de esta. Las Figs . 2A y 2B muestran las secuencias del aminoácido de la cadena ligera de trastuzumab (Fig. 2A, SEC ID NO: 5) y la cadena pesada (Fig. 2B, SEC ID NO: 6), respectivamente. La Fig. 3 muestra las diferencias entre las funciones de dos diferentes anticuerpos HER2; trastuzumab y pertuzumab. La Fig. 4A muestra el diseño de estudio para el NSABP B-31 y estudios NCCTG N9831 (Intergrupo) , respectivamente. La Fig. 4B muestra el diseño del estudio usado para el análisis de unión del NSABP B31 y los resultados del estudio NCCTG N9831 (Intergrupo) . Combinación AC antraciclina/ciclofosfamida. Los datos de eficacia en el Ejemplo 1 en la presente incluye todos los pacientes de NSABP B-31 pero excluye los pacientes del Intergrupo quienes no iniciaron el HERCEPTIN® simultáneamente con TAXOL® (brazo 2) .

La Fig. 5 muestra las características del paciente y el tumor para los brazos de AC—paclitaxel y AC—paclitaxel + trastuzumab de los estudios B-31 y N9831. Los resultados se agruparon por edad de los pacientes, número de nodulos linfáticos positivos, estado del receptor de hormona y tamaño del tumor. La Fig. 6 representa la supervivencia libre de enfermedad para los estudios B31/N9831. La Fig. 7 es una gráfica de Forest para la supervivencia libre de enfermedad, donde los pacientes se agruparon por edad, estado de la hormona, tamaño del tumor y número de los nodulos positivos . La Fig. 8 muestra la supervivencia libre de enfermedad para los brazos AC?T y AC?TH de los estudios B31 (panel izquierdo) y N9831 (panel derecho) . La Fig. 9 muestra el tiempo para la reaparición distante para los brazos AC?T y AC?TH de los estudios B31/N9831. La Fig. 10 muestra el riesgo de reaparición distante para los brazos AC?T y AC?TH de los estudios B31/N9831. La Fig. 11 muestra los datos de supervivencia para los brazos AC?T y AC?TH de los estudios B31/N9831. La Fig. 12 es un resumen de la eficacia de los análisis finales . La Fig. 13 presenta la incidencia acumulativa de los eventos cardiacos en el compañero evaluable (solo para el estudio de NSAPB B-31) . Las Figs . 14A y 14B muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de pertuzumab (Fig. 14A; SEC ID NO: 7) y la cadena pesada (Fig. 14B; SEC ID NO: 8) . Los CDRs se muestran en negritas. La masa molecular calculada de la cadena ligera y la cadena pesada son 23,526.22 Da y 49,216.56 Da (cisteinas en forma reducida). El radical de carbohidrato se unió al Asn 299 de la cadena pesada. Descripción Detallada de la Invención I. Definiciones "Terapia adyuvante" en la presente se refiere a la terapia dada después de la cirugía, donde no se puede detectar evidencia de enfermedad residual, para reducir el riesgo de la reaparición de la enfermedad. El objetivo de la terapia adyuvante es la reaparición del cáncer, y por lo tanto reducir la posibilidad de muerte relacionada con el cáncer. La terapia adyuvante en la presente excluye específicamente terapias neoadyuvantes, p.ej., donde el paciente se trata con un agente quimioterapéutico y/o HERCEPTIN®, previo a la cirugía definitiva. "Cirugía definitiva" se refiere a la extracción completa del tumor y tejido circundante así como también cualquier nodulo linfático involucrado. Esta cirugía incluye lumpectomía, mastectomía, tal como disección axiliar más mastectomía total, doble mastectomía etc. "Cáncer de mama" en la presente se refiere al cáncer que involucra las células o tejido del seno. Cáncer de mama "metastásico" se refiere al cáncer que se propaga por partes del cuerpo en lugar del seno y los nodulos linfáticos regionales. Cáncer de mama "no metastásico" se refiere al cáncer que se confina al seno y/o nodulos linfáticos regionales. "Superviviente" se refiere al paciente que permanece vivo, e incluye la supervivencia libre de enfermedad (DFS) así como también la supervivencia global (OS) . "Supervivencia libre de enfermedad (DFS) " se refiere al paciente que sigue vivo, sin que regrese el cáncer, durante un periodo de tiempo definido, tal como aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 10 años, etc., desde el inicio del tratamiento o desde la diagnosis inicial . En los estudios que fundamentan la presente invención, la DFS se analizó de acuerdo con el principio del intento de tratamiento, es decir, se evaluaron los pacientes en base a su terapia asignada. Los eventos usados en el análisis de la DFS incluyó la reaparición local, regional y distal del cáncer, la presencia de cáncer secundario, muerte del paciente por cualquier causa sin un evento previo (reaparición del cáncer de mama o segundo cáncer primario) . "Supervivencia global" se refiere al paciente que sigue vivo, durante un periodo de tiempo definido, tal como aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años , aproximadamente 4 años , aproximadamente 5 años , aproximadamente 10 años, etc., desde el inicio del tratamiento o desde la diagnosis inicial . En los estudios que fundamentan la presente invención el evento usado para el análisis de supervivencia fue la muerte por cualquier causa. El término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco o combinación de fármacos efectiva para tratar el cáncer en el paciente . La cantidad efectiva del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, disminuir en algún grado y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas dentro de los órganos periféricos; inhibir (es decir, disminuir en algún grado y preferentemente detener) la metástasis tumoral, en algún grado, el crecimiento del tumor; y/o aliviar en algún grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. El grado del fármaco que puede prevenir el crecimiento y/o la muerte de las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. La cantidad efectiva puede mejorar la supervivencia libre de enfermedad (DFS) , mejora la supervivencia global (OS) , disminuye la probabilidad de reaparición, amplia el tiempo de reaparición, amplia el tiempo de reaparición distante (es decir, la reaparición fuera del seno) , curación del cáncer, mejora los síntomas del cáncer de mama (p.ej., que se mide utilizando una inspección específica del cáncer de mama) , reduce el cáncer de mama contralateral, reduce la aparición del segundo cáncer primario, etc. "Supervivencia ampliada" significa la DFS y/o OS en un paciente tratado relativo a un paciente sin tratamiento (es decir, relativo a un paciente no tratado con el anticuerpo HER2, HERCEPTIN®) , o relativo al protocolo de tratamiento de control, tal como el tratamiento solo con el agente quimioterapeutico, tal como paclitaxel. Se supervisó la supervivencia durante aproximadamente seis meses, o al menos aproximadamente 1 año, o al menos aproximadamente 2 año, o al menos aproximadamente 3 año, o al menos aproximadamente 4 año, o al menos aproximadamente 5 años, o al menos aproximadamente 10 año, etc., seguido por iniciación del tratamiento o seguido por la diagnosis inicial . "Relación de riesgo" en el análisis de supervivencia es un resumen de la diferencia entre dos curvas de supervivencia, que representan la reducción en el riesgo de muerte en el tratamiento comparado con el control , durante un periodo que se lleva a cabo . La relación de riesgo es una definición estadística del índice de eventos. Para el propósito de la presente invención, el índice de riesgo se define que representa la probabilidad de un evento en el brazo experimental dividido por la probabilidad de un evento en el brazo de control en cualquier punto específico de tiempo. El término "concurrentemente" se usa en la presente para referirse a la administración de dos o más agente terapéuticos, donde al menos parte de la administración se traslapa en el tiempo. Por consiguiente, la administración concurrente incluye un régimen de dosis donde la administración de uno o más agente (s) continúa después de discontinuar la administración de uno o más de otro(s) agente (s) . Para los métodos de la presente invención, el término "instruir" a un paciente significa proporcionar direcciones para la terapia aplicable, medicación, tratamiento, regímenes de tratamiento y los similares, por cualquier medio, pero preferentemente por escrito, tal como en forma de paquete de encartes u otro material promocional escrito. Para los métodos de la presente invención, el término "promover" significa ofrecer, anunciar, vender o describir un fármaco particular, combinación de fármacos, o modalidad de tratamiento, por cualquier medio, incluyendo escrito, como en forma de paquete de encartes . Promover en la presente se refiere a la promoción de un agente terapéutico, tal como un anticuerpo HER2 o agente quimioterapéutico, para una indicación, tal como cáncer de mama adyuvante, donde esta promoción se autoriza por la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) que ha sido demostrado que se asocia con la eficacia terapéutica estadísticamente significativa y aceptable de forma segura en la población de pacientes. El término "comercialización" se usa en la presente para describir la promoción, venta o distribución de un producto (p.ej., fármaco). La comercialización específica incluye el empacado, anunciar cualquier actividad de negocios con el propósito de comercializar un producto. Un "paciente" en la presente es un paciente humano. Una "población" de pacientes se refiere a un grupo de pacientes con cáncer de mama, tal como en una prueba clínica, o como se ve por los oncólogos que siguen la aprobación de la FDA para una indicación particular, tal como la terapia adyuvante contra el cáncer de mama. En una modalidad, la población comprende al menos 3000 pacientes. El "cáncer de mama positivo en nodulos" es el cáncer de mama que se propaga a los nodulos linfáticos regionales (usualmente aquellos bajo el brazo) . Los pacientes con cáncer de mama positivo en nodulos en la presente incluye aquellos con 1-3 nodulos involucrados, 4-9 nodulos involucrados, y 10 o más nodulos involucrados . Los pacientes con 4 o más nodulos involucrados son de alto riesgo de reaparición que aquellos con menos o sin nodulos involucrado. La "reaparición de cáncer" en la presente se refiere a un regreso del cáncer después del tratamiento, e incluye el regreso del cáncer en el seno, así como también la reaparición distante, donde el cáncer regresa fuera del seno. Un paciente con "alto riesgo de reaparición de cáncer" es uno que tiene una mayor posibilidad de experimentar reaparición del cáncer, por ejemplo, relativo a pacientes jóvenes (p.ej., menores de aproximadamente 50 años de edad), aquellos con nodulos linfáticos positivos, particularmente 4 o más nodulos linfáticos involucrados (incluyendo de 4-9 nodulos linfáticos involucrados, y 10 o más nodulos linfáticos involucrados) , quienes con tumores mayores de 2 cm de diámetro, quienes con cáncer de mama HER2 positivo y quienes con cáncer de mama negativo de receptor de hormona (es decir, receptor de estrógeno (ER) negativo y receptor de progesterona (PR) negativo) . Puede determinarse un nivel de riesgo del paciente por un médico con experiencia en el campo.

Generalmente, tales pacientes con alto riesgo tendrán nodulos linfáticos involucrados (por ejemplo con 4 o más nodulos linfáticos involucrados) ; sin embargo, los pacientes sin nodulos linfáticos involucrados también son de alto riesgo, por ejemplo, si su tumor es mayor o igual a 2 cm. Cáncer "positivo del receptor de estrógeno (ER) " es el cáncer el cual tiene prueba positiva para la expresión del ER.

A la inversa, el cáncer "ER negativo" el cual tiene prueba negativa para tal expresión. El análisis del estado ER puede desarrollarse por cualquier método conocido en la técnica. Para el propósito de los estudios en la presente, tumores con ER positivo se definen como > 10 fmol/mg de proteína de citosol por el carbón recubierto con Dextran o el método de gradiente de densidad con sucrosa, o positiva (utilizando el criterio individual de laboratorio) por el método de análisis inmunoenzimático (EIA) , o por prueba de inmunocitoquímica. El cáncer "positivo del receptor de progesterona (PR) " es el cáncer que presenta prueba positiva para la expresión de PR. A la inversa, la prueba negativa de cáncer "negativo para PR" para tal expresión. El análisis del estado de PR puede desarrollarse por medio de cualquier método conocido en la técnica. Con el propósito de estudios en la presente, los métodos aceptables incluyen el carbón recubierto con Dextran o métodos de gradiente de densidad de sucrosa, técnicas de análisis inmunoenzimático (EIA) , y pruebas de inmunocitoquímica . En donde, la "iniciación del tratamiento" se refiere al inicio de un régimen de tratamiento seguido de la extirpación quirúrgica del tumor. En una modalidad, el cual puede referirse a la administración de AC seguido por cirugía. Alternativamente, esto puede referirse a una administración inicial del anticuerpo HER2 y/o agente quimioterapéutico.

Una "administración inicial" de un anticuerpo HER2 y el agente quimioterapéutico significa una primera dosis del anticuerpo HER2 o agente quimioterapéutico como parte de un plan de tratamiento . "Curar" el cáncer en la presente significa la ausencia de reaparición de cáncer en aproximadamente 4 o aproximadamente 5 años después de iniciar la terapia adyuvante. Un "receptor HER" es un receptor de la proteína tirosina cinasa que pertenece a la familia de receptores HER e incluye receptores EGFR, HER2, HER3 Y HER4. El receptor HER generalmente comprenderá un dominio extracelular, el cual puede unir un ligando HER y/o se dimeriza con otra molécula del receptor HER; un dominio lipofílico transmembrana; un dominio de tirosina cinasa conservada intracelular; y varios residuos de tirosina que protegen el dominio que señalan la terminal carboxi los cuales pueden estar fosforilados . El receptor HER puede ser un receptor HER @ secuencia Anativo o una variante® de la secuencia de Aaminoácidos de estos . Preferentemente el receptor HER es el receptor HER de humano de secuencia nativa. La "activación HER" se refiere a la activación, o fosforilación, de uno o más de los receptores HER. Generalmente, la activación HER resulta en la transducción de la señal (p.ej., que se origina por un dominio de cínasa intracelular de un receptor HER que fosforila los residuos de tirosina en el receptor HER o un substrato de polipéptido) . La activación HER puede estar mediada por el enlace del ligando HER a un dímero HER que comprende el receptor HER de interés . El ligando HER que se une a un dímero HER puede activar el dominio de la cinasa de uno o más de los receptores HER en el dimero y por medio de esto origina la fosforilización de los residuos de tirosina en uno o más de los receptores HER y/o la fosforilación de los residuos de tirosina en el substrato adicional de polipéptido (s) , tal como las cinasas intracelulares Akt o MAPK. Las expresiones "ErbB2" y "HER2" se usan intercambiablemente en la presente y se refieren a la proteína HER2 de humano descrita, por ejemplo, en Se ba et al . , PNAS (USA) 82: 6497'-6501 (1985) y Yamamoto et al . Nature 319:230-234 (1986) (Genebank número de acceso X03363) . El término "AerbB2" se refiere al gen que codifica el ErbB2 de humano y Aneu@ se refiere al gen que codifica el pl85neu de rata. 'El HER2 preferido es el HER2 de humano de secuencia nativa. En la presente, el "dominio extracelular HER2" o "ECD HER2" se refiere a un dominio de HER2 que está fuera de una célula, ya sea anclado a una membrana celular, o en circulación, que incluye fragmentos de este. En una modalidad, el dominio extracelular de HER2 puede comprender cuatro dominios : ADominio I@ (residuos de aminoácidos desde aproximadamente 1-195; SEC ID NO: 1), ADominio II@ (residuos de aminoácidos desde aproximadamente 196-319; SEC ID NO: 2) , ADominio III® (residuos de aminoácidos desde aproximadamente 320-488; SEC ID NO: 3), y un ADominio IV® (residuos de aminoácidos desde aproximadamente 489-630; SEC ID NO: 4) (numerar el residuo sin señalar el péptido) . Véase Garrett et al . Mol . Cell . 11:495-505 (2003), Cho et al . Nature 421:756-760 (2003), Franklin et al . Cáncer Cell 5:317-328 (2004), y Plowman et al . Proc . Nati . Acad. Sci . 90:1746-1750 (1993), así como también en la Fig. 1 en la presente. Un anticuerpo que se "une al Dominio IV HER2 unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) " se une a un epítopo que comprende o incluye residuos desde aproximadamente 489-630 (SEC ID NO: 4) del ECD HER2. El anticuerpo preferido es trastuzumab, o una variante madurada afín de este, y/o que comprende una región Fc variante (por ejemplo con función efector mejorada) . Un anticuerpo el cual "bloquea el enlace de trastuzumab (HERCEPTIN®) a HER2 es uno el cual puede demostrarse que bloquea el enlace de trastuzumab a HER2, o completar con trastuzumab para enlazarse al HER2. Tales anticuerpos pueden identificarse utilizando pruebas de bloqueo cruzado tal como aquellas descritas en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988) ; o Fendly et al . Cáncer Research 50:1550-1558 (1990), por ej emplo . El "epítopo de trastuzumab (HERCEPTIN®) " en la presente es la región en el dominio extracelular de HER2 a la cual el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463) o trastuzumab se unen. Este epítopo está cerca al dominio transmembrana de HER2 , y dentro del Dominio IV de HER2. Para tamizar los anticuerpos que se unen a este epítopo, puede realizarse una prueba de bloqueo cruzado tal como la que se describe en Antibodies, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988); o Fendly et al . Cáncer Research 50:1550-1558 (1990). Alternativamente, la cartografía del epítopo puede realizarse para avaluar donde se une el anticuerpo al epítopo de Trastuzumab de HER2 (p.ej., uno o más residuos en la región de aproximadamente el residuo 529 a aproximadamente el residuo 625, inclusive del ECD HER2 , numerar el residuo incluyendo la señal del péptido) . Uno también puede estudiar la estructura del anticuerpo-HER2 (Franklin et al . Cáncer Cell 5:317-328 (2004)) para ver que epítopo de HER2 se une por el anticuerpo. Para los propósitos en la presente, "trastuzumab" "HERCEPTIN®" y "huM?b4D5-8" se refiere a un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada en SEC ID NO: 5 y 6, respectivamente. Para los propósitos en la presente, un cáncer o tumor "positivo en HER2" es uno que expresa HER2 con un nivel que excede el nivel encontrado en las células o tejidos normales del seno. Tal forma positiva HER2 puede esta originada por la amplificación del gen HER2 , y/o transcripción y/o traducción incrementada. Los tumores positivos en HER2 pueden identificarse de diferentes formas, por ejemplo, al evaluar la expresión/sobreexpresión de la proteína (p.ej., utilizando DAKO HERCEPTEST®) prueba de inmunohistoquímica, al evaluar el ácido nucleico en la célula (por ejemplo vía la hibridación in situ fluorescente (FISH) , véase el documento W098/45479 publicado en Octubre de 1998, incluyendo como la prueba Vysis PATHVISION® FISH; transferencia Southern; o técnicas de reacción de la cadena de polimerasa (PCR) , incluyendo la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) ) , al medir el antígeno circundante (p.ej., dominio extracelular HER) en un fluido biológico tal como el suero (véase, p.ej., la Patente US No. Publicada el 12 de Junio de 1990; WO91/05264 publicada el 18 de abril de 1991; Patente US 5,401,638 publicada el 28 de Marzo de 1995; y Sias et al . J. Immuol . Methods 1332:73-80 (1990) ) , o al exponer las células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo el cual opcionalmente está etiquetado con una etiqueta que se puede detectar, p.ej., un isótopo radioactivo, y unir el anticuerpo a las células en el paciente se pueden evaluar, p.ej., por exploración externa de la radioactividad o al analizar una biopsia tomada de un paciente previamente expuesta al anticuerpo. Además, las muestras de cáncer o tumor HER2 ' positivo pueden identificarse indirectamente, por ejemplo al evaluar la señalización secuencia abajo mediada a través del receptor de HER2, realizando el perfil de expresión del gen etc. Los términos "ErbBl", "HERÍ" "receptor del factor de crecimiento epidérmico" y "EGFR" se usan intercambiablemente en la presente y se refieren al EGFR revelado, por ejemplo, en Carpenter et al . Ann . Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), incluyendo naturalmente las formas mutantes que se presenten de estos (p.ej., deleción de un EGFR mutante como en Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). ErbBl se refiere al gen que codifica el producto de la proteína EGFR. "AerbB3" y "AHER3" se refiere al polipéptido receptor como se revela, en las Patentes US Nos. 5,183,884 y 5,480,968 así como también Kraus et al . PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989) .

"ErbB4" y "AHER4" se refiere al polipéptido receptor como se revela, por ejemplo, en la Solic. Pat. EP No. 599,274; Plowman et al . Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al . Nature, 366:473-475 (1993), incluyendo las isoformas de estos, p.ej., como se revelan en W099/19488, publicada el 22 de Abril de 1999. "Ligando HER" significa un polipéptido que se une y/o activa un receptor HER. El ligando HER de interés particular en la presente es un ligando HER de humano con secuencia nativa tal como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Savage et al . J. Biol . Chem. 247:7612-7621 (1972)); el factor de crecimiento de transformación alfa (TGF-a) (Marquardt et al . Science 223:1079-1082 (1984)); amfiregulina también conocido como schwanoma o ceratinocito factor de crecimiento autócrino (Shoyab et al . Science 243:1074-1076 (1989); Kimura et al . Nature 348:257-260 (1990); y Cook et al . Mol . Cell . Biol . 11:2547-2557 (1991)), betacelulina (Shing et al . Science 259:1604-1607 (1993); y Sasada et al . Biochem . Biophys . Res . Commun . 190:1173 (1993)); factor de crecimiento epidérmico que une la heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al . Science 251:936-939 (1991)); epiregulina (Toyada et al . J. Biol . Chem. 270:7495-7500 (1995); y Komurasaki et al . Oncogene 15:2841-2848 (1997) ) ; una heregulina (véase enseguida) ; neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al . Nature 387:512-516 (1997)); neuregulin-3 (NRG-3) (Zhang et al . Proc . Nati . Acad. Sci . 94:9562-9567 (1997)); neuregulin-4 (NRG-4) (Harari et al . Oncogene 18:2681-89 (1999)); y cripto (CR-1) (Kannan et al. J. Biol . Chem. 272 (6) :3330-3335 (1997)). Los ligandos HER que se unen al EGFR incluyen EGF, TGF-a, amfiregulina, betacelulina, HB-EGF y epiregulina. Los ligandos HER que se unen al HER3 incluyen heregulinas. Los ligandos HER capaces de unir al HER4 incluyen betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 y heregulinas. "Heregulina" (HRG) cuando se usa en la presente se refiere a un polipéptido codificado por el producto del gen heregulina como se revela en la Patente US No. 5,641,869, o Marchionni et al . Nature, 362:312-318 (1993). Ejemplos de heregulinas incluyen la heregulina-a, heregulina-ßl, heregulina-ß2 y heregulina-ß3 (Holmes et al . Science, 256:1205-1210 (1992); y la Patente US No. 5,641,869); factor de diferenciación neu (NDF) (Peles et al . Cell , 69:205-216 (1992) ) ; actividad de inducción del receptor de acetilcolina (ARIA) (Falls et al . Cell . 72:801-815 (1993)); factores de crecimiento glial (GGFs) (Marchionni et al . Nature, 362:312-318 (1993)); factor derivado neuromotor y sensorial (SMDF) (Ho et al . J. Biol . Chem. 270:14523-14532 (1995)); ?-heregulina (Schaefer et al . Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Un "dímero HER" en la presente es un dímero asociado no covalentemente que comprende al menos los receptores HER. Tales complejos pueden formarse cuando una celular que expresa dos o más receptores HER se expone a un ligando HER y puede aislarse por inmunoprecipitación y analizase por SDS-PAGE como se describe en Sliwkowski et al . J. Biol . Chem . 269 (20) :14661-14665 (1994), por ejemplo. Otras proteínas, tal como una subunidad del receptor de citosina (p.ej., gpl30) puede asociarse con el dímero. Preferentemente, el dímero HER comprende HER2. Un "heterodímero HER" en la presente es un heterodímero asociado no covalentemente que comprende al menos dos diferentes receptores HER, tal como los heterodímeros EGFR-HER2, HER2-HER3 o HER2-HER4. Un "inhibidor HER" es un agente que interfiere con la activación o función HER. Ejemplos de inhibidores HER incluyen los anticuerpos HER (p.ej., anticuerpos EGFR, HER2, HER3 o HER4) ; fármacos blancos de EGFR; antagonistas HER de molécula pequeña; inhibidores de HER tirosina cinasa; inhibidores duales de HER2 y EGFR tirosina cinasa tal como lapatinib/GW572016; moléculas antisentido (véase, por ejemplo, WO2004/87207) ; y/o agentes que se unen a, o que interfieren con la función de, las moléculas de señalización secuencia abajo, tal como MAPK o Akt . Preferentemente, el inhibidor HER es un anticuerpo o molécula pequeña que se une a un receptor HER. Un "inhibidor de heterodimerización HER2" es un agente que inhibe la formación de un heterodímero que comprende HER2. Preferentemente, el inhibidor de heterodimerización HER2 es un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo que se une al HER2 en el sitio de enlace heterodimérico de este. El inhibidor de heterodimerización HER2 más preferido en la presente es pertuzumab o Mab 2C4. Otros ejemplos de los inhibidores de heterodimerización HER2 incluyen anticuerpos que se unen al EGFR e inhiben la dimerización de este con el HER2 (por ejemplo el anticuerpo monoclonal EGFR 806, Mab 806, que se une al EGFR activado "no ligado"; véase Johns et al . J. Biol . Chem . 279 (29) :30375-30384 (2004)); anticuerpos los cuales se unen al HER3 e inhiben la dimerización de este con HER2 ; los anticuerpos que se unen al HER4 e inhiben la dimerización de este con HER2 ; los inhibidores de la dimerización del péptido Patente US No. 6,417,168); inhibidores de dimerización antisentido, etc. Un anticuerpo que se une a un sitio® de unión heterodímico de HER2 , se une a los residuos del dominio II (y opcionalmente también se une a los residuos en otro de los dominios del dominio extracelular de HER2, tal como los dominios I y III) , y puede impedir estéricamente, al menos en algún grado, la formación de un heterodímero HER2-EGFR, HER2-HER3, o HER2-HER4. Franklin et al . Cáncer Cell 5:317-328 (2004) caracteriza la estructura cristalina de HER2-pertuzumab, depositada con el RCSB Protein Data Bank (ID Code IS78) , que ilustra un anticuerpo de ejemplificación que se une en el sitio de unión heterodimérico de HER2. "Expresión" de la proteína se refiere a la conversión de la información codificada en un gen en el ARN mensajero (ARNm) y después a la proteína. En la presente, una muestra o célula que "expresa" una proteína de interés (tal como la HER2) es una en donde el ARNm que codifica la proteína, o la proteína, que incluye fragmentos de esta, se determina que está presente en la muestra o célula. Un polipéptido de "secuencia nativa" es uno el cual tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido (p.ej., receptor de HER o ligando de HER) derivado de la naturaleza, incluyendo que se presenta naturalmente o variantes alélicas . Tales polipéptidos con secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. Así, un polipéptido con secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos que se presenta de forma natural presente en el polipéptido de humano, polipéptido de múridos, o polipéptido de cualquier otra especie de mamífero.

El término "anticuerpo" en la presente se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre los anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p.ej., anticuerpos biespecificos) , y fragmentos de anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, p.ej., los anticuerpos individuales comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo (s), excepto para posibles variantes que pueden surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales variantes generalmente están presentes en cantidades menores . Tales anticuerpos monoclonales típicamente incluyen un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos que se unen a un blanco, en donde la secuencia de polipéptido que se une al blanco se obtuvo por medio de un proceso que incluye la selección de una sola secuencia de polipéptido que se une al blanco de una pluralidad de secuencia de polipéptidos. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como una mezcla de clones de hibridoma, clones fago o clones de ADN recombinantes . Se debe entender que la secuencia que une al blanco seleccionado puede alterarse más, por ejemplo, para mejorar la afinidad por el blanco, para humanizar la secuencia de unión al blanco, para mejorar su producción en el cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo comprende la secuencia de unión al blanco alterada también es un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste a las preparaciones del anticuerpo policlonales la cuales típicamente incluyen anticuerpos diferentes contra los determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en un antígeno. Además su especificidad, las preparaciones del anticuerpo monoclonal son ventajosas en que no están típicamente contaminadas por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, y no se construye como requerimiento de producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán de acuerdo con la presente invención pueden hacerse a partir de una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el método de hibridoma (p.ej., Kohler, et al . Nature, 256:495 (1975); Harlow et al . , Antíbodies : A Laboratory Manual , (cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed. 1988) ; Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, NY. , 1981)), métodos de ADN recombinante (véase p.ej., la Patente US No. 4,816,567), tecnologías de exposición en fago (véase, p.ej., Claxon et al . , Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al . J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991); Sidhu et al . J. Mol . Biol . 338 (2) :299-310 (2004); Lee et al . J. Mol . Biol . 340 (5) : 1073-1093 (2004); Fellouse Proc. Nat . Acad. Sci . USA 101 (34) : 12467-12472 (2004); y Lee et al . J. Immunol . Methods 284 (1-2) : 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos de humano o similares a los de humano en animales que tienen partes o todas las posiciones o genes de inmunoglobulina de humano que codifican las secuencias de la inmunoglobulina de humano (véase, p.ej., WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/337535; WO 1991/10741; Jacobovits et al . Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90:2551 (1993); Jacobovits et al . Nature. 362:255-258 (1993); Brugge ann et al . Year in Immuno . 7:33 (1993); las Patentes US Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (todas de GenPharm) ; la Patente US No. 5,54,807; WO 1997/17852; las Patentes US Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425 y 5,661,016; Marks et al . Bio /Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al . Nature. 368:856-859 (1994); Morrison Nature. 368:812-813 (1994); Fishwild et al . Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); y Lonberg and Huszar, ínter. Rev. Immunol . 13:65-93 (1995)). Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, aunque el resto de la(s) cadena (s) es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como también los fragmentos de tales anticuerpos, mientras que exhiban la actividad biológica deseada (Patente US No. 4,816,567; y Morrison et al . Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 81:6851-6855 (1984) ) . Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos Aprimatized® que comprenden secuencias que unen el antígeno con dominio variable derivados de un primate no humano (p.ej., Mono del Viejo Mundo, Chimpancé etc.) y secuencias de región constante de humano, así como también anticuerpos "humanizados" . Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p.ej., roedor) son los anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas de humano (anticuerpo receptor) en donde los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por los residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo, o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina de humano se reemplazan por los correspondientes residuos que no son de humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para reafinar más el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todas o al menos una, y típicamente dos, dominios variables, en donde todos o substancialmente todos los bucleshipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina que no es de humano y todos o substancialmente todas las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina de humano. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región de contraste de inmunoglobulina (Fc) , típicamente que de una inmunoglobulina de humano. Para mayores detalles, véase Jones et al . Nature. 321:522-525 (1986); Reichmann et al . Nature . 332:323-329 (1988)-; y Presta, Curr.

Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992). Los anticuerpos HER2 humanizados incluyen huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7, huMAb4D5-8, o trastuzumab (HERCEPTIN7) como se describe en la Tabla 3 de la Patente US 5,821,337 incorporada expresamente en la presente como referencia; 520C9 humanizada (W093/21319) ; y anticuerpos 2C4 humanizados tal como pertuzumab como se describe en la presente . En la presente, Apertuzumab® y AOMNITARGJ® se refiere a un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y pesada en SEC ID NOS: 7 y 8, respectivamente . Un anticuerpo® Aintacto es uno que comprende dos regiones de unión antígenas, y una región Fc . Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una región Fc funcional . "Fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, que comprende la región que une el antígeno de este. Ejemplos de fragmentos de antígeno incluyen Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos Fv; anticuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados con fragmento (s) de anticuerpo (s) . "Anticuerpos nativos" son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltones, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada una de las cadenas se unen a una cadena pesada por un enlace covalente de disulfuro, mientras el número de enlaces de disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isótopos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro intracadenas regularmente separadas . Cada una de las cadenas tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por diferentes dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Los residuos de aminoácidos particulares se cree que forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho que ciertas porciones de los dominios variables son diferentes extensivamente en la secuencia entre los anticuerpos y se usa en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a través de todos los dominios variables de los anticuerpos . Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables en ambos dominios variables, en la cadena ligera y la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman las regiones de las estructuras . Los dominios variables de las cadenas tanto la pesada como la ligera nativas cada uno comprende cuatro FRs, adoptando en gran medida una configuración ß-capa, conectados por tres regiones, la cuales forman buclesque conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura ß-capa. Las regiones hipervariables en cada una de las cadenas se mantienen juntas en proximidad cercana por los FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace del antígeno del anticuerpo (véase Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no se involucran directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diferentes funciones del efector, tal como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . El término región® Ahipervariable cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que es responsable del enlace del antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácidos desde una región @ que determina Acomplementariamente o ACDR® (p.ej., residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un bucle® Ahipervariable (p.ej., residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chotia and Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)). Residuos de la "Región de la Estructura" o "FR" son aquellos residuos con dominio variable en lugar de los residuos con región hipervariable como se definen en la presente . La digestión de la papaina de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos que unen el antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de enlace de antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de enlace del antígeno y aun es capaz de enlazar de forma cruzada el antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un completo reconocimiento del antígeno y el sitio de enlace del antígeno. Esta región consiste de un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera en asociación estrecha no covalente . Esto es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace del antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de enlace del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aun un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y enlazar el antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de enlace completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Fab = diferentes fragmentos de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el carboxi final del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cistinas de la región bisagra. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en donde el/los residuos de cisteina de los dominios constantes llevan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteinas bisagra entre estos . También se conocen otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpo. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno o dos tipos claramente diferentes, llamados kappa (K) y lambda (?) , basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . El termino "región Fc" en la presente se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo las regiones Fc de secuencia nativa y las regiones Fc variantes. Aunque las fronteras de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina puede variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG de humano usualmente se define reducir desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, al carboxilo-final de este. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o por ingeniería recombinante codificando el ácido nucleico de la cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos sin todos los residuos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447. A menos que se indique de otra forma, en la presente la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es que del índice EU como en Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) , expresamente incorporado en la presente como referencia. El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración del residuo del anticuerpo EU IgGl de humano. Una "región Fc funcional" posee una "función efector" de una región Fc de secuencia nativa. Las "funciones efector" de ejemplificación incluyen el enlace Clq; citotoxicidad completamente dependiente; enlace del receptor Fc; citotoxicidad mediada con célula dependiente del anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de los receptores de superficie celular (p.ej., receptor de células B; BCR) , etc. Estas funciones eféctor generalmente requieren que la región Fc esté combinada con un dominio de enlace (p.ej., un dominio variable del anticuerpo) y puede evaluarse utilizando diferentes análisis como se revela en la presente, por ejemplo . Una "región Fc con secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc de humano con secuencia nativa incluyen una región Fc IgGl de humano con secuencia nativa (alotipos A y no A) ; región Fc IgG2 de humano con secuencia nativa; región Fc IgG3 de humano con secuencia nativa; y región Fc IgG4 de humano con secuencia nativa así como también las variantes que se presentan naturalmente de estas . Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere del de la región Fc con secuencia nativa en virtud al menos de una modificación del aminoácido, preferentemente una o más substitución (es) de aminoácido. Preferentemente, la región Fc variante tiene al menos una substitución de aminoácido comparada con la región Fc con secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido precursor, p.ej., desde aproximadamente uno a alrededor de diez substituciones de aminoácidos, y preferentemente desde alrededor de uno a aproximadamente cinco substituciones de aminoácidos en una región Fc con secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido precursor. La región Fc variante en la presente preferentemente poseerá al menos aproximadamente 80% de homología con una región Fc con secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido precursor, y más preferentemente al menos alrededor de 90% de homología con este, más preferentemente al menos alrededor de 95% de homología con este . Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden asignarse los anticuerpos intactos a diferentes Aclases®. Existen cinco clases de anticuerpos intactos: IaA, IgD, IgE, IgG y IgM y varios de estos pueden además dividirse en Asubclases® (isótopos), p.ej., IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4, IgA, y IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman a, d, e, ?, y µ, respectivamente . Se conocen bien las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas. La citotoxicidad® mediada con células dependientes de Anticuerpos y AADCC® se refieren a una reacción mediada con células en donde las células citotóxicas no específicas que expresan los receptores Fc (p.ej., células Asesinas Naturales (NK, por sus siglas en inglés) , neutrófilos, y macrófagos) reconocen el enlace de anticuerpo en una célula blanco y posteriormente originan la lisis de la célula blanco. Las células primarias para mediar la ADCC, células NK, expresión Fc?RIII únicamente, mientras los monolitos expresan Fc?RI, Fc?RII y FcR?lII . La expresión de FcR en las células hematopoyeticas se resumen en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol . 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede desarrollarse un análisis ADCC in vi tro, tal como el que se describe en la Patente US No, 5,500,362 ó 5,821,337. Las células efectores útiles para tales análisis incluyen las células periféricas mononucleares de la sangre (PBMC) y las células asesinas naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, p.ej., en un modelo animal tal como el que se describe en Clynes et al . PNAS (USA) 95:652-656 (1998) . Las células® efector de Ahumano son leucocitos que expresan una o más FcRs y desarrollan funciones de efector. Preferentemente, las células expresan al menos la Fc?RIII y desarrollar la función de efector ADCC. Ejemplos de leucocitos de humano los cuales median la ADCC incluyen las células periféricas mononucleares de la sangre (PBMC) , células asesinas naturales (NK) , mocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; prefiriéndose las PBMCs y las células NK. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente natural de esta, p.ej., de la sangre o las PBMCs como se describe en la presente . Los términos "receptor Fc" o AFcR® se usan para describir un receptor que se una a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR de humano con secuencia nativa. Sin embargo, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gama) e incluye los receptores de las subclases Fc?RI, Fc?RII y Fc?RIII, incluyendo las variantes alélicas y alternativamente las formas con corte y empalme de estos receptores. Los receptores Fc?RII incluyen Fc?RIIA (un "receptor de activación") y Fc?RIIB (un "receptor inhibidor"), el cual tiene secuencias de aminoácido similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de estos . El receptor de activación Fc?RIIA contiene un motivo de inhibición a base del inmunoreceptor de tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase la revisión M en Daéron, Ann. Rv. Immunol . 15:203-234 (1997)). Las FcRs se revisaron en Ravetch and Knet, Ann . Rv. Immunol . 9:303-41 (1995) . Otras FcRs, incluyendo aquellas que serán identificadas en el futuro, están abarcadas por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, el cual es responsable de transferir los IgGs maternos al feto (Guyer et al . J. Immunol . 117:587 (1976) y Kim et al . J. Immunol . 24:249 (1994)), y regula la homeostasis de las inmunoglobulinas. La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula a realizar lisis a un blanco en presencia del complemento. La trayectoria de activación del complemento se inicia con el enlace del primer componente del sistema de complemento (Clq) a una molécula (p.ej., un anticuerpo) complejo con un antígeno cognado. Para evaluar la activación de complemento, puede realizarse un análisis CDC, p.ej., como se describe en Gazzano. Santero et al . J. Immunol . Methods 202:163 (1996). Los fragmentos del anticuerpo "Fv de cadena simple" "scFv" comprenden los dominios V y VL, en donde los dominios están presentes en una cadena simple del polipéptido. Preferentemente, el polipéptido Fv además comprende un ligador entre los dominios VH y VL que permiten que el scFv forme la estructura deseada para enlazar el antígeno. Para una revisión del scFv véase Plücktum en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315. Los fragmentos de scFv del anticuerpo HER2 se describen en los documentos W093/16185; Patente US. No. 5,571,894; y la Patente US No. 5,587,458. El término "diacuerpos" se refiere pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace del antígeno, tales fragmentos comprenden un dominio pesado variable (VH) conectado a un dominio ligero variable (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Al usar un ligador que es muy corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios de la otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos se describen con mayor detalle en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al . Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993). Un anticuerpo® Adesnudo en la presente es un anticuerpo que no se conjuga con un radical citotóxico o radioetiquetado.

Un anticuerpo "aislado" es uno el cual se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con el diagnóstico o usos terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95% en peso del anticuerpo como se determina por el método Lowry, y más preferentemente más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos del N-terminal o la secuencia de aminoácidos con el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) para homogeneidad por SDS-PAGE bajo reducción o no reducción de las condiciones utilizando azul Coomasie o, preferentemente, manchado con plata. Los anticuerpos aislados incluyen el anticuerpo in si tu dentro de las células recombinantes ya que al menos uno de los componentes del medio natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación. Un anticuerpo con "afinidad madurada" es uno o más alteraciones en una o más regiones hipervariables de este lo cual .origina una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, comparado con un anticuerpo precursor que no posee esta(s) alteración (es) . Los anticuerpos con afinidad madurada tendrán afinidades nanomolares o aun picomolares por los antígenos blanco. Los anticuerpos con afinidad madurada se producen por medio de procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al . Bio /Technology 10:779-783 (1992) describe la afinidad madura al mezclar el domino VH y VL. La mutagénesis aleatoria del CDR y/o residuos de la estructura se describe por: Barbas et al . Proc. Nati . Acad. Sci . USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al . J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al . J. Immunol . 154 (7) :3310-9 (1995); y Hawkins efc al . J. Mol . Bio. 226:889-896 (1992) . El término "anticuerpo de la especie principal" en la presente se refiere a la estructura del anticuerpo en una composición la cual es la molécula de anticuerpo cuantitativamente predominante en la composición. Eñ una modalidad, el anticuerpo de la especie principal es un anticuerpo HER2, tal como un anticuerpo que se une al Dominio IV de HER2 ECD unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) . La modalidad preferida en la presente del anticuerpo de la especie principal es uno que comprende las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y la cadena pesada en la SEC ID Nos. 5 y 6 (trastuzumab) . Un anticuerpo con "secuencia de aminoácidos variante" en la presente es un anticuerpo con una secuencia de aminoácidos que difieren de un anticuerpo de la especie principal . Ordinariamente, las variantes de la secuencia de aminoácidos poseerán aproximadamente 70% de homología con el anticuerpo de la especie principal, y preferentemente, tendrá al menos alrededor de 80%, más preferentemente al menos alrededor 90% de homología con el anticuerpo de la especie principal . Las variantes de la secuencia de aminoácidos poseen substituciones, eliminaciones, y/o adiciones en ciertas posiciones dentro o adyacentes a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la especie principal. Ejemplos de las variantes de la secuencia de aminoácidos en la presente incluyen una variante acida (p.ej., la variante del anticuerpo des-amidado) , una variante básica, un anticuerpo con un residuo de lisina con C-terminal en una o dos cadenas pesadas de este, etc., e incluyen combinaciones de las variaciones a las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y/o ligera . Un anticuerpo con "variante de glucosilación" en la presente es un anticuerpo con uno o más radicales de carbohidratos unidos a este, los cuales difieren de uno o más radicales de carbohidratos unidos a un anticuerpo de la especie principal. Ejemplos de las variantes de glucosilación en la presente incluyen el anticuerpo con una estructura de oligosacárido Gl ó G2 , en lugar de una estructura de oligosacárido GO, unida a una región Fc de este, el anticuerpo con uno o dos radicales de carbohidratos unidos a una o dos de las cadenas ligeras de este, el anticuerpo sin carbohidratos unidos a una o dos cadenas pesadas del anticuerpo, etc., y combinaciones de las alteraciones de glucosilación. Donde el anticuerpo tiene una región Fc, una estructura de oligosacárido puede unirse a una o dos cadenas pesadas del anticuerpo, p.ej., en el residuo 299 (298, numeración EU de los residuos) . Un anticuerpo "des-amidado" es uno en donde se han derivado uno o más residuos de asparagina de este, p.ej., en un ácido aspártico, una succinamida, o un ácido iso-aspártico. • Una "muestra de tumor" en la presente es una muestra derivada de, o que comprende células del tumor de, un tumor del paciente . Ej emplos de muestras del tumor en la presente incluyen, pero no se limitan a, biopsias del tumor, células circulantes del tumor, proteínas del plasma circulante, fluido ascítico, cultivos celulares primarios o líneas celulares derivadas de tumores o que exhiben propiedades similares al tumor, así como también muestras del tumor preservadas, tal como muestras del tumor imbibido en parafina, fija con formalina, o muestras congeladas del tumor. Una muestra del tumor "fija" es una la cual se ha preservado histológicamente utilizando un fijador. Una muestra del tumor "fija con formalina" es una la cual se ha preservado utilizando formaldehído como el fijador. Una muestra del tumor "imbibido" es una rodeada por una película y generalmente un medio duro como la parafina, cera, celoidina, o una resina. La imbibición hace posible el cortar en secciones delgadas para el examen microscópico o para la generación de microrrayos del tejido (TMAs) . Una muestra del tumor "imbibido en parafina" es una rodeada por una mezcla purificada de hidrocarburos sólidos derivados del petróleo. En la presente, una muestra del tumor "congelada" se refiere a una muestra del tumor que está, o ha sido, congelada . En la presente, realizar el "perfil de expresión del gen" se refiere a una evaluación de la expresión de uno o más genes como un sustituto para determinar directamente la expresión del receptor HER2. Un "análisis fosfo-ELISA" en la presente es un análisis en donde se evalúa la fosforilización de uno o más receptores HER especialmente HER2 , en un análisis inmunoabsorción ligado a una enzima (ELISA) utilizando un reactivo, usualmente un anticuerpo, para detectar el receptor HER fosforilado, substrato o molécula de señalización secuencia abajo. Preferentemente, un anticuerpo que detecta el HER2 fosforilado usado. El análisis puede realizarse en lisatos celulares, preferentemente de muestras biológicas frescas o congeladas . Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en la presente se refiere como se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula con cáncer que expresa HER ya sea in vi tro o in vivo. Así, el agente inhibidor de crecimiento puede ser uno que reduzca significativamente el porcentaje de HER que expresa células en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un sitio diferente a la fase S) , tal como los agentes que inducen la detención Gl y la detención de la fase M. Los clásicos bloqueadores de la fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxoides, e inhibidores topo II tales como doxirubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido, y bleomicina. Aquellos agentes que detienen el Gl también revelan en la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes de alquilación del ADN tales como tamoxifen, prednisona, dicarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Información adicional puede encontrarse en The Molecular Basis of Cáncer, Mendensohn and Israel, eds. Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastics drugs" por Murakami et al. (WB Saunders : Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. Ejemplos de anticuerpos inhinidores® de Acrecimiento son aquellos que unen el HER2 e inhiben el crecimiento de las células cancerosas que sobreexpresan HER2. Los anticuerpos HER2 inhibidores del crecimiento inhiben el crecimiento de células de tumor de mama SK-BR-3 en el cultivo celular por más del 20%, y preferentemente más del 50% (p.ej., desde aproximadamente 50% a alrededor del 100%) con una concentración del anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µg/ml, donde la inhibición del crecimiento se determinó seis días después de la exposición de las células SK-BR-3 al anticuerpo (véase la Patente US No. 5,677,171 publicada el 14 de Octubre de 1997) . El análisis de la inhibición del crecimiento celular SK-BR-3 se describe con mayor detalle en esta patente y más adelante . El anticuerpo inhibidor del crecimiento preferido es una variante humanizada del anticuerpo monoclonal murino 4D5, p.ej., trastuzumab. Un anticuerpo el cual "induce la apóptosis" es uno que induce la muerte celular programada que se determina por la unión de la anexina V, fragmentación del ADN, encogimiento celular, dilación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas con membrana (llamadas cuerpos apoptóticos) . La célula usualmente una que sobreexpresa el receptor HER2. Preferentemente la célula es una célula del tumor, p.ej., una célula de mama, ovario, estómago, endometrial, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroides, pancreática, o de vejiga. In vivo, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, célula Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SK0V3. Diferentes métodos están disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con la apóptosis. Por ejemplo, puede medirse la translocación de la fosfatidil serina (PS) por la unión de anexina; puede evaluarse la fragmentación del ADN a través del patrón de fragmentación del ADN; y puede evaluarse la condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación del ADN por medio de cualquier incremento en las células hipoliploides . Preferentemente, el anticuerpo que induce la apóptosis es uno que origina aproximadamente de 2 a 50 dobleces, preferentemente alrededor de 5 a 50 dobleces y más preferentemente alrededor de 10 a 50 dobleces, la inducción de la unión de anexina con relación a la célula sin tratamiento en un análisis de enlace de anexina utilizando células BT474. Ejemplos de anticuerpos HER2 que inducen la apóptosis son los 7C2 y 7C3. Véase, en particular, W098/17797.

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como al profiláctico o las medidas de prevención. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con cáncer así como también aquellos en donde se ha prevenido el cáncer. Por lo tanto, el paciente que será tratado en la presente puede haberse diagnosticado como que tiene cáncer o puede estar predispuesto o es susceptible al cáncer. El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o origina la destrucción de las células . El término se intenta que incluya los isótopos radioactivos (p . ej . , At211 , I131 , I125 , Y90 , Re18S , Re188 , Sm153 , Bi212 , P32 y los isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacterial, fúngico, vegetal o animal incluyendo los fragmentos y/o variantes de estas . Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN®) ; sulfonatos de alquilo, como el busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metila elaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapacona; beta-lapacol; colquicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el topotecan análogo sintético (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina, y 9-aminocamptotecina) ; brioestatina; caliestatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bezelesina) ; podofilotoxina; ácido podofílinico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptofisina 1 y criptofisina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongiestatina; mostazas de nitrógeno como clorambucil, clornafazina, clorfosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato del óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenestirina, prednimustina, trifosfamida, mostaza de uracilo, nitrosureas como la carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimustina; antibióticos como los antibióticos de enediina (p.ej., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama II y caliqueamicina omega II (véase , p. ej . , Agnew, Chem. Intl . Ed. Engl . , 33:183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo la dinemicina A; una esperamicina; así como también el neocarzinostatin cromoforo y los cromoforos antibióticos de la cromoproteína de enediina) , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-azo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de liposoma HCl doxorubicina, (DOXIL®) , doxorubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®) , doxorubicina liposomal pegilada (CAELYX®) , y desoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas como motomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, anti-metabolitos como el metotrexato, gemcitabina, (GEMZAR®) , tegafur (UFTORAL®) , capecitabina (XELODA®) , una epitilona, y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tal como la fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como la ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, fluxoridina; anti-adrenales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; restaurador de ácido fólico como el ácido frolinico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tal como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidracido; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxana; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2 , 2 ' , 2' ' -triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente la toxina T-2, verracurin A, roridin A y anguidina) ; uretano; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C") ; tiotepa; taxoide, p.ej., (TAXOL®) , formulación de paclitaxel con nanopartículas diseñadas con albúmina (ABRAXANE™) , y docetaxel (TAXOTERE®); cloranbucil; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino como cisplatino, oxaplatino, y carboplatino; vincas los cuales previenen la polimerización de tubulina en la formación de microtubos, incluyendo vinblastina (VELBAN®) , vincristina (ONCOVIN®) , vindesina (ELDISENE®, FILDESIN®) , Y vinorelbina (NAVELBINE®) ; ETOPOSIDO (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; leucovovina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopteina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilonitina (DMFO) ; retinoides como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®) ; biofosfonatos como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®) , etidronato (DIDROCAL®) , NE-58095, ácido zoledrinico/zoledronato (ZOMETA®) , ALENDRONATO (FOSAMAX®) , pamidronato (AREDIA®) , tiludronato (SKELID®) , o risedronato (ACTONEL®) ; troxacitabina (un análogo de 1, 3-dioxolano nucleósido citosina), oligonucleótidos antisentidos, particularmente aquellos que inhiben la expresión de los genes en trayectorias de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, como por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas como la vacuna THERATOPE® y las vacunas para terapia del gen, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; inhibidor de topomerasa 1 (p.ej., LURTOTECAN®) ; mRH (p.ej., ABARELIX®) ; BAY439006 (sorafenib; Bayer) ; SU-11248 (Pfizer) ; perifosina, inhibidor del COX-2 (p.ej., celecoxib o etoricoxib) , inhibidor de proteosoma (p.ej., PS341) ; bortezomib (VELCADE®) ; CCI-779; tipifarnib (R11577) ; orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersen sódico (GENASENSE®) ; pixantrona; inhibidor de EGFR (véase la definición siguiente) ; inhibidores de tirosina cinasa (véase la definición siguiente) ; y las sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como también las combinaciones de dos o más de las anteriores tal como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisolona, y FOLFOX, y la abreviatura para el tratamiento del régimen con oxaliplatin (ELOXATIN™) combinada con el 5-FU y leucovovina. En la presente, los agentes quimioterapéuticos incluyen "agentes anti-hormonales" o "endocrino terapéuticos" que actúan para regular, reducir, bloquear, o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer. Estos pueden ser hormonas de los mismos, incluyendo pero no limitándose a: anti-estrógenos con el perfil agonista/antagonista mezclado, incluyendo, tamoxifen (NOLVADEX®) , 4-hidroxitamoxifen, toremifen (FARESTON®) , idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®) , trioxifeno, ceoxifeno, y moduladores del receptor de estrógeno selectivos (SERMs) tales como SERM3 ; anti-estrógenos puros sin propiedades agonistas, como fulvestrant (FASLODEX®) , y EM800 tales agentes pueden bloquear la dimerización del receptor de estrógeno (ER) , inhibir el enlace de AND, incrementar el cambio de ER, y/o suprimir los niveles de ER) ; inhibidores de aromatasa, incluyendo los inhibidores de aromatasa esteroideos como formestana y exemestana (AROMASIN®) , e inhibidores de aromatasa no esteroideos como anastrazol (ARIMIDEX®) , letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida, y otros inhibidores de aromatasa incluyen vorozol (RIVISOR®) , acetato de megestrol (MEGASE®) , fadrozol, y 4 (5) -imidazoles; agonistas de la hormona que libera la hormona luteinizante, incluyendo luprolido (LUPRON® y ELIGARD®) , goserelina, buserelina, y tripterelina; esferoides sexuales, incluyendo progestinas como el acetato de megestrol y el acetato de mdroxiprogesterona, estrógenos como dietilestilbestrol y premarin, y andrógenos/retinoides como el fluoximesterona, todos los ácidos transretinoicos y fenretinido; onapristona; anti-progesteronas; reguladores reductores del receptor de estrógeno (ERDs) ; anti-andrógenos como flutamida, nilutamida, y bicalutamida; y las sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como también las combinaciones de dos o más de los anteriores . En la presente, un "taxoide" es un agente quimioterapéutico que funciona para inhibir la despolimerización de los microtubos . Ejemplos incluyen paclitaxel (TAXOL®) , formulación de paclitaxel con nanopartículas diseñadas con albúmina (ABRAXANE™) , y docetaxel (TAXOTERE®) . El taxoide preferido es paclitaxel . Como se usa en la presente, el término "inhibidor de EGFR se refiere a los compuestos que se unen o de otro modo interactúan- directamente con el EGFR y previenen o reducen su actividad de señalización, y alternativamente se prefieren como un "antagonista de EGFR". Ejemplos de tales agentes incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que unen el EGFR.

Ejemplos de anticuerpos que unen el EGFR incluyen Mab 579 (ATCC CRL HB 8506) , Mab 455 (ATCC CRL HB8507) , Mab 225 (ATCC CRL 8508) , MAb 528 (ATCC CRL 8509) (véase la Patente US No 4,943,533, Mendelsohn et al.) y variantes de estos, tal como los quimerizados 225 (C225 o Cetuximab; ERBUTIX®) y la reforma de humano 225 (H225) (véase, WO 96/40210, Imclone Systems Inc. ) ;IMC-11F8, un anticuerpo con blanco EGFR totalmente de humano (Imclone) ; anticuerpos que se unen con el EGFR mutante tipo II (Patente US No. 5,212,290); anticuerpos humanizados y quiméricos que unen el EGFR como se describe en la Patente US No. 5,891,996; y los anticuerpos de humano que se unen con EGFR, tal como ABX-EGF o Panitumumab (véase WO98/50433, Abgenix/ mgen) ; EMD 55900 (Stragliotto et al . J. Cáncer 32A: 636-640 (1996)); EMD7200 (matuzumab) un anticuerpo EGFR humanizado dirigido contra el EGFR que compite con el EGF y el TGF-alfa para la unión de EGFR (EMD/Merck) ; anticuerpo EGFR de humano, HuMax-EGFR (GenMab) ; anticuerpos totalmente de humano conocidos como El.l, E2.5, E6.2, E6.4, E2.ll, E6.3 Y E7.6.3. y se describen en US 6,235,883; MDX-447 (Medarex Inc.); y mAb 806 o mAb 806 humizado (Johns et al, J. Biol . Chem. 279(29) :30375-30384 (2004)). El anticuerpo del anti-EGFR puede estar conjugado con un agente citotóxico, generando así un inmunoconjugado (véase, p.ej., EP 659,439A2, Merck Patent GMBH) . Los agonistas de EGFR incluyen pequeñas moléculas tal como los compuestos descritos en las Patentes US Nos : 5,616,582, 5,457,105, 5,475,001, 5,654,307, 5,679,683, 6,084,095, 6,265,410, 6,455,534, 6,521,620, 6,596,726, 6,713,484, 5,770,599, 6,140,332, 5,866,572, 6,399,602, 6,344,459, 6,602,863, 6,391,874, 6,344,455, 5,760,041, 6,002,008 y 5,747,498, así como también las siguientes publicaciones: W098/14451, WO98/50038, WO99/0916, y WO99/24037. Agonistas de EGFR de moléculas pequeñas particulares incluyen OSI-774 (CP-358774, erlotinib, TARCEVA® Genetech/OSI Pharmaceuticals); PD 183805 (Cl 1033, 2-propenamida, N- [4- [ (3-cloro-4-fluorofenil) amino] -7- [3- (4-morfolinil)propoxi] -6-quinazolinil] - , diclorhidrato, Pfizer Inc.); ZD1839, gefitinib (IRESSAJ) 4- (3' -cloro-4' -fluoroanilino) -7-metoxi-6- (3-morfolinopropoxi) quinazol, AstraZeneca); ZM 105180 ( (6-amino-4- (3-metilfenil-amino) quinazolina, Zeneca) ; BIBX-1382 (N8- (3-cloro-4-fluoro-fenil) -N2- (l-metil-piperidin-4-il) -pirimido [5,4-d]pirimidin-2,8-diamina, Boehringer Ingelheim) ; PKI-166 ( (R) -4- [4- [ (1-feniletil) amino] -lH-pirrolo [2 , 3-d]pirimidin-6-il] -fenol) ; (R) -6- (4-hidroxifenil) -4- [ (1- feniletil) amino] -7H-pirrolo [2 ,3-d] pirimidina; CL-387785 (N- [4- [ (3-bromofenil) amino] -6-quinazolinil] -2-butinamida) ; EKB-569 (N- [4- [ (3-cloro-4-fluorofenil) amino] -3-ciano-7-etoxi-6-quinolinilo] -4- (dimetilamino) -2-butenamida) (Wyeth); AG1478 (Sugen); AG1571 (SU 5271; Sugen) ; inhibidores de tirosina cinasa EGFR/HER2 dual tal como lepatinib (GW 572016 ó N- [3-cloro-4- [ (3-flourofenil) metoxi] fenil] -6- [5- [ [ [2-metilsulfonil) etil] amino] metil] -2-furanil] -4-quinazolinamina; Glaxo-SmithKline) .

Un "inhibidor de tirosina cinasa" es una molécula que inhibe la actividad de la tirosina cinasa de una tirosina cinasa tal como el receptor HER. Ejemplos de tales inhibidores incluyen los fármacos con blanco EGFR denotados en el párrafo precedente; el inhibidor de tirosina cinasa HER2 de molécula pequeña tal como el TAK165 disponible por Takeda; CP-724,714, un inhibidor selectivo oral de la tirosina cinasa receptora de ErbB2 (Pfizer OSI) ; inhibidores HER duales tales como EKB-569 (disponible por Wyeth) que unen preferencialmente el EGFR pero inhiben las células de sobreexpresión de EGFR y HER2; lapatinib (GW572016; disponible Glaxo-Smith-Kline) un inhibidor de tirosina cinasa HER2 y EGFR, PKI-166 (disponible por Novartis) ; inhibidores pan-HER como el canertinib (CI-1033; Pharmacia); inhibidores Raf-1 tal como el agente antisentido ISIS-5132 disponible por ISIS Pharmaceuticals que inhibe la señalización Raf-1; inhibidores de TK sin blanco HER como mesilato de Imatinib (GLEEVACJ) disponible por Glaxo; MAPK inhibidor de cinasa I regulados extracelular CI-1040 (disponible por Pharmacia) ; quinazolinas, tal como PD 153035, 4- (3-cloroanilino) quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas ; pirrolopiri idinas , tal como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706; pirazolpirimidinas, 4- (fenilamina) -7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidinas; curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis- (4-fluoroanilino) ftalimida) ; tirfostinas que contienen radicales de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber) ; moléculas antisentido (p.ej., aquellas que unen al ácido nucleico que condifica HER); quinoxalinas (Patente US No. 5,804,396); trifostinas (Patente US No. 5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca) ; PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; inhibidores de pan-HER tal como CI-1033 (Pfizer) ; Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly) ; mesilato de Imatinib (Gleevc; Novartis) ; PKI 166 (Novrtis) ; GW2016 (Glaxo SmithKline) ; CI-1033 (Pfizer) ; EKB-569 (Wyeth) ; Semaxinab (Sugen) ; ZD6474 (AstraZeneca) ; PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; INC-1C11 (Imclone) ; o como se describe en cualquiera de las siguientes publicaciones de patentes: Patente US No. 5,804,396; WO99/09016 (american Cyanamid); WO98/43960 (American Cyanamid) ; W097/38983 (Warner Lambert) ; WO99/06378 (Warner Lambert) ; WO99/06396 (Warner Lambert) ; WO96/30347 (Pfizer, Inc.); W096/33978 (Zeneca); W096/3397 (Zeneca) ; y WO96/33980 (Zeneca) . En la presente, quimioterapia "estándar de asistencia" se refiere a los agentes quimioterapéuticos usados rutinariamente para tratar un cáncer en particular. Por ejemplo, para cáncer de mama operable, incluyendo el cáncer positivo en nodulos, la terapia adyuvante del estándar de asistencia puede ser la quimioterapia de antraciclina/ciclofosfamida (AC) , ciclofosfamida, metotrexato, quimioterapia de fluorouracilo (CMF) , fluorouracilo, antraciclina y quimioterapia de ciclofosfamida (FAC) , o AC seguida por paclitaxel (T) (AC ? T) . Para los pacientes descritos en los ejemplos en la presente, "estándar de asistencia" ha sido el tratamiento AC ? T. Donde un agente anti-cáncer, tal como HERCEPTIN®, se administra como un "agente simple" esto es el único agente administrado al paciente, durante un régimen de tratamiento, para tratar el cáncer, es decir, el agente no se proporciona en combinación con otros agentes anti-cáncer. Sin embargo, tal tratamiento incluye la administración de otros agentes anticáncer sustancialmente previo a, o después de, la administración del agente anti-cáncer. Un ágete® Aanti-angiogénico se refiere a un compuesto que bloquea, o interfiere hasta cierto punto, el desarrollo de vasos sanguíneos. El factor anti-angiogénico puede, por ejemplo, ser una molécula pequeña o anticuerpo que se une a un factor de crecimiento o el receptor del factor de crecimiento involucrado en promover la angiogenesis . El factor anti-angiogénico preferido en la presente es un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , tal como bevacizumab (AVASTIN7) . El término "citosina" es un término genérico para proteínas relacionadas con una población celular que actúa en otra célula como mediadoras intercelulares. Ejemplos de estas citocinas son limfocinas, monocinas, y las tradicionales hormonas polipéptidos . Se incluye entre las citocinas la hormona del crecimiento tal como la hormona del crecimiento en humanos, la hormona del crecimiento de humano N-metionilo, y la hormona de crecimiento de bovino, ; hormona paratiroides; tiroxina; insulina; pro insulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteínas como la hormona de estimulación del folículo (FSH) , hormona de estimulación tiroidea (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento fibroblástico; prolactina; lactógeno placental; factor-a y -ß de necrosis del tumor; sustancia inhibidora muleriana; péptido asociado con la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factor de crecimiento del nervio como el NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; factores del crecimiento de transformación (TGFs) tal como TGF-a y TGF-ß; factor-1 y -II de crecimiento similar a la insulina; reitropoyetina (EPO) ; factores ' osteoinductivos; interferonas como interferona-a, -ß, -?, factores de estimulación de la colonia (CSFs) tal como macrófago-CSF (M-CSF) ; granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granulocito-CSF (G-CSF); interieucinas (lis) tal como IL-1, IL-a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis del tumor tal como TNF-a o TNF-ß; y otros factores polipéptidos que incluyen LIF y el ligando KIT (KL) . Como se usa en la presente, el término citosina incluye las proteínas de origen natural o del cultivo celular recombinante y los equivalentes biológicamente activos de las citocinas con secuencia nativa. Una dosis de "carga" en la presente generalmente comprende una dosis inicial de un agente terapéutico administrado a un paciente y es seguido por una o más dosis de mantenimiento de este. Generalmente, se administra una dosis de carga simple, pero se contemplan dosis de carga múltiple en la presente. Usualmente, la cantidad de dosis de carga administrada (s) excede la cantidad de la(s) dosis de mantenimiento administrada (s) y/o la(s) dosis de carga se administra (n) con mayor frecuencia que la(s) dosis de mantenimiento, para alcanzar la concentración del estado estacionario deseado del agente terapéutico antes que puede alcanzarse con la(s) dosis de mantenimiento. Una dosis de "mantenimiento" en la presente se refiere a una o más dosis de un agente terapéutico administrado al paciente durante un periodo de tratamiento. Usualmente, las dosis de mantenimiento se administran con intervalos de tratamiento separados, tal como aproximadamente cada semana, aproximadamente cada 2 semanas, aproximadamente cada 3 semanas o aproximadamente cada 4 semanas .

II. Producción de Anticuerpos Una descripción sigue a las técnicas de ejemplificación para la producción de los anticuerpos HER2 usadas de acuerdo con la presente invención. El antígeno HER2 que será usado para la producción de los anticuerpos puede ser, p.ej., una forma soluble del dominio extracelular de un receptor HER2 o una porción de este, que contiene el epítopo deseado. Alternativamente, H?R2 expresa la célula en su superficie celular (p.ej., las células NIH-3T3 transformadas para sobreexpresar HER2 ; o una línea celular de carcinoma tal como las células SK-BR-3, véase Stancovski et al . PNAS (USA) 88:8695 (1991)) puede usarse para generar anticuerpos. Otras formas de HER2 útiles para generar anticuerpos serán aparentes para las personas con experiencia en la técnica. (i) Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales preferentemente surgen de animales por inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil para conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en las especies que serán inmunizadas, p.ej., hemocianina de lapa clave, suero de albúmina, tiroglobulina de bovino, o el inhibidor de tripsina de soya que utilizan un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, el éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de los residuos de cisteina) , N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina) , glutaraldheído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes. Los animales se inmunizaron contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados al combinar, p.ej., 100 µg ó 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos, o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes del adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios . Un mes después a los animales se les incrementó con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en el adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días después se sangraron los animales y el suero se analizó por prueba sexológica de inmunidad del anticuerpo . Se les incrementó a los animales hasta la meseta de la prueba sexológica de inmunidad. Preferentemente, el animal se incrementó con el conjugado del mismo antígeno a una diferente proteína y/o a través de diferente reactivo de reticulación. Los conjugados también pueden hacerse en cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. También, agentes de agregación como alumbre se usan adecuadamente para mejorar la respuesta inmune. (ii ) Anticuerpos monoclonales Diferentes métodos para elaborar anticuerpos monoclonales en la presente están disponibles en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales puede hacerse usando el primer método de hibridoma descrito por Kholer et al . Nature, 256:495 (1975) , por medio de métodos de ADN recombinante (Patente US No. 4,816,567) . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como hámster, se inmunizó como se describe anteriormente para que produzcan linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vi tro . Los linfocitos después se fusionan con las células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Las células de hibridoma preparadas así se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contienen preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma precursoras, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirán hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , estas sustancias previenen el crecimiento de las células deficientes de HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan un nivel estable alto para la producción de anticuerpos por las células que producen el anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio como el medio HAT. Entre estas, la líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, tal como tal como aquellas derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 Y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles por la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Las líneas celulares de heteromieloma de ratón-humano y mieloma de humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales de humano (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); y Brodeur et al . Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). El medio de cultivo en donde las células de hibridoma crecen se analizó para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad del enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determinó por inmunoprecipitación o por un análisis de enlace in vi tro, tal como el análisis de radioinmunología (RÍA) o análisis inmunoabsorción ligado a una enzima (ELISA) . La afinidad del enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis Scatchard de Munson et al . Anal . Biochem. , 107:220 (1980). Después que se identificó que las células de hibridoma producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse al limitar los procedimientos de dilución y crecimiento por medio de métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp . 59-103 (Academic Press, 1986)). El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, el medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores ascitis en un animal . Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascitis, o suero por procedimientos de purificación del anticuerpo convencional tal como, por ejemplo, la proteína A-Sefarosa, cromatografía con hidroxilapatita, electrofóresis en gel, diálisis, o cromatografía con afinidad. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y realiza la secuencia usando procedimientos convencionales (p.ej., usando pruebas de oligonucleótidos que son capaces de enlazar específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murino) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, los cuales después se transfectan en las células huésped como las células de E. Coli, células COS, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que de otro modo no producen anticuerpos, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células recombinantes del huésped. La revisión de los artículos en la expresión recombinante en bacterias del ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al . Curr. Opinión in Immonuol . , 5:256-262 (1993) y Plückthum, Immunol . Revs . 130:151-188 (1992). En otra modalidad, los anticuerpos monoclonales o fragmentos del anticuerpo pueden aislarse de la genoteca del anticuerpo fago generado que usa las técnicas descritas en McCafferty et al . Nature, I. 348:552-554 (1990). Clackson et al . Nature . 352:624-628 (1991) y Marks et al . J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos de murino y humano, respectivamente, utilizando genotecas fago. Las publicaciones subsecuentes describen la producción de alta afinidad (variedad nM) de anticuerpos de humano al mezclar la cadena (Marks et al . Bio /Technology, 10:779-783 (1992)), así como también la infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir genotecas fago muy grandes (Waterhouse et al . Nuc. Acids Res . , 21:2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son alternativas viables en técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales . El ADN también puede modificarse, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación para los dominios constantes de la cadena pesada y de la cadena ligera de humano en lugar de las secuencias homologas murino (Patente US No. 4,816,567; y Morrison et al . Proc. Nati . Acad. Sci USA, 81:6851 (1984)), o por unión covalente con la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido sin inmunoglobulina.

Típicamente estos polipéptidos sin inmunoglobulina se sustituyen para los dominios constantes de un anticuerpo, o están substituidos por los dominios variables de un sitios que combina el antígeno de un anticuerpo para crear u anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio que combina el antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio que combina el antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente. (iii) Anticuerpos humanizados Los métodos para humanizar los anticuerpos que no son de humano se han descrito en la técnica. Preferentemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos dentro de este desde una fuente la cual no es de humano. Estos residuos de aminoácidos que no son de humano frecuentemente referidos como "importación" de residuos, los cuales generalmente se toman de un dominio variable "importación" . La humanización puede desarrollarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores Jones et al . Nature, 321:522-525 (198619; Riechmann et al . Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al . Science, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir las secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo de humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente US No. 4,816,567) en donde substancialmente se ha sustituido menos del dominio variable de humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie que no es humano. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente anticuerpos de humano en donde algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por los residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores . La elección de los dominios variables de humano, ambos ligero y pesado, que serán usados al elaborar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método llamado así "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se tamiza contra la genoteca completa de las secuencias del dominio variable de humano. La secuencia de humano la cual es más cercana a la del roedor después se acepta como la región de la estructura de humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al . J. Immunol . 151-2296 (1993); Chotia et al . J.

Mol . Biol . 196:901 (1987)). Otro método usa una región de la estructura particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos de humano de un subgrupo particular de las cadenas ligera o pesada. La misma estructura puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al . Proc. Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta et al . J. Immunol . , 151:2623 (1993)). Es más importante que los anticuerpos estén humanizados con retención de gran afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan por medio de un proceso de análisis de las secuencias precursoras y diferentes productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias de las secuencias humanizadas y precursoras. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales son comúnmente disponibles y son familiares para las personas con experiencia en la técnica. Están disponibles otros programas computacionales que ilustran y muestran las probables estructuras conformacionales tridimensionales de las secuencias de inmunoglobulina candidata seleccionadas. La inspección de estos análisis permite mostrar el probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencias de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influencia la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unir su antígeno. De esta forma, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias receptoras e importadoras a fin de que se logren las características deseadas del anticuerpo, tal como incremento de la afinidad por el/los antígeno (s) blanco (s). En general, los residuos de la región hipervariable se involucran directamente y más sustancialmente se ven involucradas en la influencia del enlace del antígeno. Se contemplan diferentes formas de anticuerpote con afinidad madura o anticuerpos humanizados. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o anticuerpo con afinidad madura puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como, un Fab, el cual se conjuga opcionalmente con uno o más agente (s) a fin de generar un inmunoconjugado . Alternativamente, el anticuerpo humanizado o anticuerpo con afinidad madura puede estar ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgGl intacto. La humanización del anticuerpo 4D5 murino para generar variantes humanizados de este, incluyendo Trastuzumab, se describe en la Patente US Nos. 5,821,337, 6,054,297, 6,407,213, 6,639,055, 6,719,971, y 6,800,738, así como también Cárter et al . PNAS (USA) 89:4285-4289 (1992) . 3-dobleces del antígeno HER2 unido a HuMAb4D5-8 (trastuzumab) más estrecho que el anticuerpo de ratón 4D5, y tuvo una función inmune secundaria (ADCC) que permitió la actividad citotóxica directa del anticuerpo humanizado en presencia de las células efector de humano. Los residuos CDR ligeros (VL) variables comprendidos de HuMAb4D5-8 se incorporan en una estructura de consenso de VL kappa subgrupo I, y los residuos CDR (VH) pesados variables se incorporan dentro de la estructura consenso VH subgrupo III. El anticuerpo además comprende substituciones en la región de estructura (FR) como las posiciones: 71, 73, 78 y 93 del VH (numeración Kabat de los residuos FR) ; y una sustitución FR en la posición 66 del VL (numeración Kabat de los residuos FR) . El Trastuzumab comprende la región gama 1 Fc de humano sin A alotipo. (iv) Anticuerpos de humano Como una alternativa a la humanización, pueden generarse los anticuerpos de humano. Por ejemplo, ahora es posible el producir animales transgénicos (p.ej., ratón) que son capaces, una vez inmunizados, producir un total repertorio de anticuerpos de humano en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción hoozigo del gen (JH) región de unión de la cadena pesada del anticuerpo en ratones mutantes con línea quimérica y germ origina la completa inhibición de la producción de anticuerpos endógenos . La transferencia del arreglo del gen de inmunoglobulina con línea germ de humano en tales ratones mutantes con línea germ originará la producción de anticuerpos de humano con el reto del antígeno. Véase, p. ej .' , Jakobovits et al . Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al . Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al . Year in Immunol . 7:33 (1993); y las Patentes US Nos. 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. Alternativamente, la tecnología que muestra lo fagos (McCafferty et al . Nature, 348:552-553 (1990) ) puede usarse para producir anticuerpos de humano y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de los receptores del gen con dominio (V) variable de inmunoglobulina de los donantes inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes con dominio V del anticuerpo se clonaron en la estructura dentro del gen de la proteína de recubrimiento mayor y menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se mostró como fragmentos de anticuerpo funcional sobre la superficie de la partícula fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN estandarizada simple del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gen que codifica al anticuerpo que exhibe estas propiedades. Así, algunos mímicos fago de las propiedades de la célula-B . La exhibición del fago puede desarrollarse en una variedad de formatos; para su revisión véase, p.ej., Jonson, Kevin S. and Chriswell, David J. Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Pueden usarse varias fuentes de los segmentos del gen-V para exhibir el fago. Claxon et al . Nature, 352:624-628 (1991) aisló un arreglo diverso de anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña genoteca combinatoria aleatoria de los genes V derivados de los bazos de los ratone inmunizados. Un repertorio de genes V de los donantes humanos inmunizados puede construirse y pueden aislarse anticuerpos en un arreglo diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al . J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991),- o Griffith et al . EMBOJ 12:725-734 (1993). Véanse también, las Patentes US Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Como se discute anteriormente, los anticuerpos de humano también pueden generarse por las células B activadas in vi tro (véase las Patentes US Nos. 5,567,610 y 5,229,275). Los anticuerpos HER2 de humano se describen en la Patente US No. 5,772,997 publicada el 30 de Junio de 1998 y WO 97/00271 publicada el 3 de Enero de 1997. (v) Fragmentos de anticuerpos Se han desarrollado diferentes técnicas para la producción de fragmentos que comprenden una o más regiones que unen el antígeno. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron vía digestión proteolltica de anticuerpos intactos (véase, p.ej., Morimoto et al . Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al .

Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las genotecas del fago anticuerpo revelados anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente del E. coli y acoplarse químicamente a los fragmentos con forma F(ab')2 (Cárter et al . Bio /Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otra aproximación, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente del cultivo celular del huésped recombinante.

Otras técnicas para la producción de los fragmentos de anticuerpos serán aparentes para las personas con práctica en la técnica. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFV) . Véase WO 93/16185; Patente US No. 5,571,894; y la Patente US No. 5,587,458. El fragmento del anticuerpo también puede ser un anticuerpo® Alineal, p.ej., como se describe en la Patente US No. 5,641,870 por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespecíficos o biespecíficos . (vi) Anticuerpos biespecíf icos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que especificidades de enlace por al menos dos epítopos diferentes. Como ejemplificación los anticuerpos bioespecíficos pueden unir a dos epítopos diferentes de la proteína HER2. Otros anticuerpos pueden combinar un sitio de enlace HER2 con el/los sitios de enlace para EGFR, HER3 y/o HER4. Alternativamente, un brazo de HER2 puede combinarse con un brazo que se une a una molécula activadora en un leucocito tal como la molécula receptora de la célula T (p.ej., CD2 o CD3) , o los receptores de Fc para IgG (Fc?R) , tal como Fc?RI (CD64) , Fc?RII (CD32) y Fc?RIII (CD16) a fin de enfocar los mecanismos de defensa celular con la célula que expresa HER2. Los anticuerpos biespecíficos también pueden usarse para localizar los agentes citotóxicos en los HER2 que expresan células . Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace de HER2 y un brazo que se une con el agente citotóxico (p.ej., saporina, anti-interferona-a, vinca alcaloide, cadenas A ricina, metotrexato o hapteno isótopo radioactivo) . Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (p.ej., anticuerpos biespecíficos F(ab')2- WO 96/16673 describe un anticuerpo HER2/Fc?RIII biespecífico y la Patente US No. 5,837,234 revela un anticuerpo HER2/Fc?RI biespecífico IDMI. (Osidem) . Se muestra un anticuerpo HER2/Fca biespecífico en WO98/02463. La Patente US No. 5,821,337 enseña un anticuerpo HER2/CD3 biespecífico. MDX-210 es un HER2-Fc?RIII biespecífico Ab. Los métodos para elaborar los anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos con longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas la cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al . Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadrotas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de los cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se hace usualmente por medio de etapas de cromatografía de afinidad, es más incómoda, y las producciones son bajas. Procedimientos similares se revelan en WO 93/08829, y Traunecker et al. EMBO J. 10:3655-3659 (1991). De acuerdo con un experimento diferente, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan en secuencias con dominio constante de inmurioglobulina . La fusión preferentemente es con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, las regiones CH2, y CH3. Se prefiere que tengan la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones . Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan dentro de los vectores de expresión separados, y se co-transfectan dentro del organismo huésped adecuado . Esto proporciona mayor flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en las modalidades cuando relaciones diferentes de las tres cadenas de polipéptidos se usen en la construcción proporcionando el rendimiento óptimo. Es, sin embargo, posible insertar las secuencias de codificación para dos o las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos con relaciones iguales origine altos rendimientos o cuando las relaciones sean poco significativas. En una modalidad preferida de este experimento, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo, y un par de cadenas ligera-pesada de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de la cadena de inmunoglobulina indeseada, con la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica se proporciona para una fácil separación. Este experimento se revela en WO 94/04690. Para otros detalles de la generación de anticuerpos biespecificos véase, por ejemplo, Suresh et al. Methods in Enzymology, 121:210 (1986) . De acuerdo con otro experimento descrito en la Patente US No. 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpos puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros los cuales se recuperan del cultivo celular recombinante . La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas secundarias pequeñas de aminoácidos de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplaza con las cadenas secundarias más grandes (p.ej., tirosina o triptofano). Se crean "cavidades" compensatorias idénticas o de tamaño similar a la(s) cadena (s) secundaria (s) grande (s) sobre la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar cadenas secundarias de aminoácidos grandes con una pequeñas (p . ej . , alanina o treonina) . Así se proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre los productos finales indeseables tal como los homodímeros . Los anticuerpos biespecíficos incluyen los • anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos han, por ejemplo, sido propuestos como blanco de células del sistema inmune para células indeseadas (Patente US No. 4,676,980), y para el tratamiento de infección VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089. Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse utilizando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados se conocen bien en la técnica, y se revelan en la Patente US No. 4,676,980, junto con diferentes técnicas de reticulación. Técnicas para la generación de anticuerpos biespecíficos de los fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando el enlace químico. Brennan et al. Science, 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se separan proteolíticamente para generar los fragmentos F(ab')2- Estos fragmentos se reducen en presencia del agente de formación de complejos ditiol arsenito de sodio para estabilizar los diotioles vecinales y prevenir la formación de bisulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados después se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab' -TNB después se reconvierte en Fab' -tiol por reducción con la mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de las enzimas. El reciente progreso ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab' -SH de E. coli, los cuales puede acoplarse químicamente para formar loa anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al. J. Exp. Med. 175:217:225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento de Fab' se secretó de forma separada del E. coli y se sujetó a enlace químico dirigido in vi tro para formar un anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado así fue capaz de enlazarse con células que sobreexpresan el receptor de HER2 y células T normales de humano, así como activador de la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos de humano contra blancos del tumor de mama de humano. También se han descrito varias técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente del cultivo celular recombinante. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando cierres de leucina. Kostelny et al. J. Immunol . 148 (5) :1547-1553 (1992). Los péptidos con cierre de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos por fusión de genes. Se redujeron los homodímeros de anticuerpos en la región finge para formar los monómeros y después oxidarlos de nuevo para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este método puede utilizarse para la producción de los monodímeros de anticuerpos . La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alterno para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecíficos . Los fragmentos comprenden un dominio _(VH) variable de cadena pesada conectado a el dominio (VL) variable de cadena ligera por medio de un enlazador el cual es muy corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de uno de los fragmentos se fuerza a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, por medio de esto forman dos sitios de enlace de antígeno. También se ha reportado otra estrategia para elaborar los fragmentos de anticuerpo biespecíficos con el uso de los dímeros (sFv) de cadena simple. Véase Gruber, et al. J. Immunol. 152:5368 (1994). Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos . Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991). (vii) Otras modificaciones a la secuencia de aminoácidos Descritas en la presente se contemplan modificación (es) de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos. Por ejemplo, puede ser deseable el mejorar la afinidad de enlace y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan al introducir los cambios del nucleótido apropiado dentro del ácido nucleico del anticuerpo, o • por síntesis del péptido. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, las delaciones de, y/o inserciones dentro y/o substituciones de, residuos dentro de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción, y substitución se hace para llegar a la construcción final, con la condición que la construcción final posea las características deseadas . Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos de post-translación del anticuerpo, tal como el cambio de número o posición de los sitios de glucosilación. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se llama "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham and Wells Science, 244-1081-1085 (1989) . Aquí, un residuo o grupo de residuos blanco se identifican (p.ej., residuos cambiados tal como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran la sensibilidad funcional a las substituciones después se definen de nuevo al introducir otro variante en, o con, los sitios de substitución. Así, aunque se predetermina el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos, la naturaleza de la mutación per se necesita no estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desarrollo de una mutación en un sitio dado, mutagénesis de exploración o aleatoria de ala se realiza en el codón blanco o la región y las variantes del anticuerpo expresadas se exploran buscando la actividad deseada. Las inserciones de la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxi-terminales con variedades en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen un ciento o más de residuos, así como también las inserciones de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen anticuerpos con un residuo de metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado con un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al N- ó C-terminal del anticuerpo a una enzima (p.ej., para ADEPT) o un polipéptido el cual incrementa la vida media del suero del anticuerpo .

Otro tipo de variante es una variante con sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazada por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluye las regiones hipervariables, pero las alteraciones FR también están contempladas. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones originan un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse más cambios sustanciales, denominados "sustituciones de ejemplificación" en la Tabla 1, o como se describe enseguida en referencia a las clases de aminoácidos, y los productos tamizarse. Tabla 1 Las modificaciones substanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se realizan al seleccionar las substituciones que difieren significativamente en su efecto al mantener (a) la estructura de la cadena principal de polipéptido en el área de la substitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio blanco, o (c) la masa total de la cadena secundaria. Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con las similitudes en las propiedades de sus cadenas secundarias (en A. L. Lehninger, en biochemistry, segunda ed. , pp. 73-75, Worth publishers, New York (1975)): (1) no polar: Ala (A), Val (V), Leu (L) , He (I), Pro (P) , Phe (F) , Trp (W) , Met (M) (2) (2) polar no cargado: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) (3) ácido: Asp (D) , Glu (E) (4) básico: Lys (K) , Arg (R) , His (H) Alternativamente, los residuos que se presentan de forma natural pueden dividirse en grupos basados en las propiedades de la cadena secundaria común: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe. Sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de uno de estas clases por otra clase. Cualquiera de los residuos de cisteina no involucrada en mantener la conformación propia del anticuerpo también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidante de la molécula y previene la reticulación aberrante. A la inversa, el/los enlaces de cisteina pueden adicionarse al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . Un tipo de variante de sustitución particularmente preferido involucra la sustitución de una o más residuos de con región hipervariable de un anticuerpo precursor (p . ej . , un anticuerpo humanizado o de humano). Generalmente, la(s) variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para otro desarrollo tendrá (n) propiedades biológicas mejoradas con relación al anticuerpo precursor desde donde se genera (n) . Un camino conveniente para generar tales variantes por sustitución involucra la maduración de la afinidad usando la exhibición del fago. Brevemente, varios sitios de la región hipervariables (p.ej., 6-7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones de aminos posibles en cada sitio. Las variantes del anticuerpo generados así se exhiben en una forma monovalente de las partículas filamento fagos como fusiones al producto del gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes de fago exhibidas después se tamizan de acuerdo a su actividad biológica (p.ej., afinidad de enlace) como se revela en la presente. A fin de identificar los sitios con región hipervariable candidatos para la modificación, puede desarrollarse mutagénesis de exploración de alanina puede desarrollarse para identificar los residuos con región hipervariable que contribuyen significativamente a enlazar el antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el HER2 de humano. Tales residuos en contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente . Una vez que se generaron las variantes, el panel de variantes se sujeta a tamizado como se describe en la presente y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes para un posterior desarrollo. Las variantes de trastuzumab de ejemplificación en la presente incluyen aquellas descritas en US2003/0228663A1 (Lowman et al . ) , incluyendo las sustituciones de una o más de las siguientes posiciones VL: Q27, D28, N30, T31, A32, Y49, F53, Y55, R66, H91, Y92 y/o T94; y/o sustituciones de una o más posiciones VH: W95, D98, F100, YlOOa, y/o Y102. Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. Alterar significa eliminar uno o más radicales de carbohidratos encontrados en el anticuerpo, y/o adicionar uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glucosilación de los anticuerpos es típicamente N-enlazado u O-enlazado. N-enlazado se refiere al enlace del radical de carbohidrato a una cadena secundaria de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas aspargina-X-serina y aspargina-X-treonina, donde X es un aminoácido excepto prolina, don las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del radical carbohidrato con la cadena secundaria de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de las secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial . La glucosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno o más azucares N-aceilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina ó 5-hidroxilisina. Se realizan convenientemente la adición de sitios de glucosilación al anticuerpo al alterar la secuencia de aminoácidos tal que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glucosilación N-enlazados) . La alteración también puede hacerse con la adición de, o sustitución por, uno o más serinas o residuos de treonina a la secuencia original del • anticuerpo (los sitios de glucosilación O-enlazados) . Donde el anticuerpo comprende una región F, puede alterarse el carbohidrato adherido a este. Por ejemplo, se describen los anticuerpos con una estructura madura de carbohidrato que carece de mucosa unida a una región Fc del anticuerpo en la Solicitud de Patente US No. US 2003/0157108 Al, Presta, L. Véase también US 2004/0093621 Al (Kyowa Hakko Kogyo Co . , Ltd) . Anticuerpos con una bisección de N-acetilglucosamina (GlcNAc) en el carbohidrato unido a una región Fc del anticuerpo se hace referencia en WO 03/011878, Jean-Mairet et al. y US Patente No. 6,602,684, Umana et al. Anticuerpos con por lo menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a una región Fc del anticuerpo se reportan en WO97/30087, Patel et al. Véase, también, W098/58964 (Raju, S.) y W099/22764 (Raju, S.) que se relaciona con anticuerpos con carbohidrato alterado unido a la región Fc de este. Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efector, p.ej., para mejorar la citotoxicidad mediada con células dependientes del antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse al introducir una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, pueden introducirse en la región Fc el/los residuo (s) de cisteina, por medio de esto se permite la formación de enlaces de bisulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado así puede tener capacidad de internación mejorada y/o el asesinato mejorado de células mediadas con complemento y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase Carón et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 y Shopes, B. J. Immunol . 148-2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumoral mejorada también pueden prepararse usando compuestos de reticulación heterobifuncionales como se describe en Wolf et al. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede diseñarse el cual tiene regiones Fc duales y puede por medio de esto tener lisis mejorada del complemento y capacidades de ADCC. Véase Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3 :219-230 (1989). WO 00/42072 (Presta, L.) describe anticuerpos con función ADCC mejorada en presencia de células efector de humano, donde los anticuerpos comprenden sustituciones de aminoácidos en la región Fc de estos. Preferentemente, el anticuerpo con ADCC mejorado comprende las sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de residuos) . Preferentemente la región Fc alterada es una región Fc IgGl de humano que comprende o consiste de sustituciones en una o dos o tres de estas posiciones. Estas sustituciones se combinan opcionalmente con sustitución (es) lo cual incrementa el enlace Clq y/o CDC. Los anticuerpos con el enlace Clq alterado y/o citotoxicidad dependiendo del complemento (CDC) se describen en W099/51642, Patente US No. 6,194,551B1, Patente US No. 6,242,195B1, Patente US No. 6,528,624B1 y Patente US No. 6,538,124 (Idusogie et al.). Los anticuerpos comprenden una sustitución de aminoácidos en uno o más de las posiciones de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 y/o 334 de la región Fc de estos (numeración EU de los residuos) . Para incrementar la vida media del suero el anticuerpo, por ejemplo, uno puede incorporar un epítopo que une el receptor de salvamento dentro del anticuerpo (especialmente un fragmento del anticuerpo) como se describe en la Patente US 5,739,277. Como se usa en la presente, el término "epítopo que une el receptor de salvamento" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula IgG (p.ej., IgG?, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de incrementar la vida media del suero in vivo de la molécula IgG. Los anticuerpos con el enlace mejorado con el receptor Fc neonatal (FcRn) , y la vida media incrementada, se describen en WO 00/42072 (Presta, L.) y US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en estos lo cual mejora el enlace de la región Fc con el FcRn. Por ejemplo, la región Fc puede tener sustituciones en una o más posiciones 238, 250, 256, 265, 272, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 ó 434 (numeración Eu de los residuos) . La variante del anticuerpo que comprende la región Fc preferida con enlace FcRn mejorado comprende sustituciones de aminoácidos en una, dos o tres de las posiciones 307, 380 y 434 de la región Fc de este (numeración Eu de los residuos) . Los anticuerpos diseñados con tres o más sitios de enlace de antígeno funcional (preferentemente cuatro) también están contemplados (Solicitud US No. US2002/0004587 Al, Miller et al.) . Las variantes de la secuencia de aminoácidos que codifican las moléculas de ácido nucleico del anticuerpo se preparan por medio de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que se presentan de forma natural) o la preparación por medio de la mutagénesis (o sitio dirigido) mediada con oligonucleótido, mutagénesis por cásete de una variante preparada anteriormente o una versión de variante del anticuerpo. (viii ) Tamizado de los anticuerpos con las propiedades deseadas Se han descrito anteriormente las técnicas para generar los anticuerpos . Uno puede seleccionar más los anticuerpos con ciertas características biológicas, que se desean. Para identificar un anticuerpo HER2 que se une con el Dominio IV HER2 unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) , uno puede evaluar la capacidad de enlazar el péptido con Dominio IV aislado, el Dominio IV que se presenta en HER2 ECD; o mientras este salga en el receptor HER2 intacto (donde el ECD o receptor pueda aislarse o presentarse sobre la superficie de una célula), etc. Opcionalmente, uno puede evaluar si el anticuerpo HER2 de interés se une al Trastuzumab o el epítopo 4D5, o bloquea o compite con el enlace de Trastuzumab o 4D5 por HER2 ; tales anticuerpos necesariamente serían considerados para enlazarse con el Dominio IV HER2 unido por Trastuzumab (HERCEPTIN®) . Para tamizar los anticuerpos que se unen a un epítopo en HER2 unido por un anticuerpo de interés, un análisis de bloqueo cruzado de rutina tal como el que se describe en Antibodies, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988) , puede desarrollarse para evaluar si el anticuerpo bloquea el enlace de un anticuerpo, tal como trastuzumab o 4D5 a HER2. Véase, también, Fendly et al. Cáncer Research 50:1550-1558 (1990), donde se hicieron estudios de bloqueo cruzado en anticuerpos HER2 por fluorescencia directa en células positivas HER2. Se consideraron anticuerpos monoclonales HER2 para compartir un epítopo si cada enlace bloqueado del otro por 50% o más en comparación con un control de anticuerpo monoclonal irrelevante. En los estudios en Fendly et al., el 3H4 y 4D5 se unen al mismo epítopo. Alternativa, o adicionalmente, la cartografía del epítopo puede realizarse por medio de métodos conocidos en la técnica y/o uno puede estudiar la estructura del anticuerpo-HER2 (Franklin et al. Cáncer Cell 5:317-328 (2004)) para ver que dominio o epítopo de HER2 se une (n) al anticuerpo. El Trastuzumab ha sido mostrado en ambos análisis in vitro y en animales, que inhibe la proliferación de las células del tumor en humanos que sobreexpresan HER2. Hudziak et al. Mol. Cell Biol. 9:1165-1172 (1989); Patente US No. ,677,171; Lewis et al. Cáncer Immunol . Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al. Encogen 1998; 17:2235-49 (1998); y Baselga et al. Cáncer Res. 58:2825-2831 (1998). El HERCEPTIN® tiene ambos efectos citostático y citotóxico en las líneas celulares del tumor HER2 positivo (Lewis et al. (1993)). A fin de seleccionar otro anticuerpo HER2 inhibidor del crecimiento con esta propiedad, pueden usarse estos análisis in vi tro o in vivo para tamizar los anticuerpos HER2 por actividad biológica de inhibición del crecimiento. En particular, para identificar los anticuerpos HER2 inhibidores del crecimiento, uno puede tamizar los anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células cancerosas que sobreexpresan HER2 in vitro. En una modalidad, el anticuerpo inhibidor de crecimiento de elección es capaz de inhibir el crecimiento de las células SK-BR-3 en el cultivo celular por aproximadamente 20-100% y preferentemente alrededor de 50-100% con una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µg/ml. Para identificar estos anticuerpo, el análisis SK-BR-3 descrito en la Patente US No. 5,677,171 puede desarrollarse. De acuerdo con este análisis, las células SK-BR-3 crecen en una mezcla 1:1 de F12 y el medio DMEM complementado con 10% de suero de ternero, glutamina y penicilina estreptomicina. Las células SK-BR-3 se colocan en placas con 20,000 células en un plato de cultivo celular de 35 mm (plato de 2 mls/35 mm) . Se adicionaron 0.5 a 30 µg/ml del anticuerpo HER2 por plato. Después de seis días, el número de células se comparó, con las células sin tratamiento y se contabilizaron utilizando un contador celular electrónico COULTERJ. Los anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células SK-BR-3 por aproximadamente 20-100% o alrededor de 50-100% pueden seleccionarse como anticuerpos inhibidores del crecimiento. Véase la Patente US No. 5,677,171 para análisis de tamizado de los anticuerpos inhibidores del crecimiento, tal como 4D5 y 3E8. A fin de seleccionar los anticuerpos HER2 que inhiben el crecimiento de los tumores HER2 positivo in vivo, pueden usarse estudios de xenoinjerto, tal como en Pietras et al. (1998) y Baselga et al. (1998), para tamizar los anticuerpos HER2 por sus propiedades . El Trastuzumab es un mediador de la citoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Hotaling et al. Proc. Am. Assoc. Cáncer Res. 37:471 (1996), resumen 3215; Pegram et al. Proc. Am. Assoc. Cáncer Res. 38:602 (1997), Resumen 4044; Patente US No. 5,821,337, 6,054,297, 6,407,213, 6,639,055, 6,719,971 y 6,800,738; y Cárter et al. PNAS (USA) 89:4285-4289 (1992); Clynes et al. Nature Medicine 6:443-6 (2000)). Otros anticuerpos HER2 que median la ADCC pueden identificarse utilizando diferentes análisis, incluyendo aquellos descritos en estas referencias . También se ha reportado que Trustuzumab inhibe la división del ectodominio HER2 (Molina et al. Cáncer Res. 61:4744-4749 (2001)), y otros anticuerpos HER2 con esta función pueden identificarse utilizando la metodología usada por Molina et al., por ejemplo.

También se ha reportado que HERCEPTIN® induce la normalización y regresión de la vasculatura del tumor en tumores de mama en humano HER2 positivo al modular los efectos de los factores angiogénicos (Izumi et al. Nature 416:179-80 (2002)). Otros anticuerpos HER2 con esta propiedad pueden identificarse utilizando los experimentos descritos en Izumi et al . (ix) Composiciones de HERCEPTIN® La composición de HERCEPTIN® generalmente comprende una mezcla de un anticuerpo de la especie principal (que comprende las secuencias de la cadena ligera y la cadena pesada de SEC ID NOS: 5 y 6, respectivamente), y formas variantes de estas, en particular variantes acidas (incluyendo variantes desamidadas) . Preferentemente la cantidad de variantes acidas en la composición es menor de aproximadamente 25%. Véase, la Patente US No. 6,339,142. Véase también, Harris et al Chromatography B 752:233-245 (2001) que se relaciona con las formas de trastuzumab resolubles por cromatografía de intercambio catiónico, incluyendo el Pico A (Asn30 desamidada en Asp en ambas cadenas ligeras) : Pico B (Asn55 desamidada en isoAsp en una cadena pesada) ; Pico 1 (Asn30 desamidada en Asp en una cadena ligera) ; Pico 2 (Asn30 desamidada en Asp en una cadena ligera, y Aspl02 isomerizada en isoAsp en una cadena pesada) ; pico 3 (forma el pico principal, o anticuerpo de la especie principal) ; pico 4 (Aspl02 isomerizado en isoAsp en una cadena pesada) ; y Pico C (Aspl02 succinamida (Asu) en una cadena pesada) . Tales formas de variantes y composiciones se incluyen en la invención en la presente . (x) Inmunocon jugados En otro aspecto, la invención proporciona inmunoconjugados, o conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) , que comprende un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (p.ej., una toxina enzimáticamente activa de origen bacterial fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de estos) , o un isótopo radioactivo (p.ej . , radioconjugado) . El uso de anticuerpo-fármaco conjugados para el suministro local de los agentes citotóxicos o citostáticos, p.ej., fármacos para matar o inhibir las células del tumor en el tratamiento de cáncer (Syrigos and Epenetos Antisancer Research 19:605-614 (1999); Niculescu-Duvaz and Springer Adv. Drug Del . Rev. 26:151-172 (1997); la patente US 4,975,278) permite el suministro en un blanco del radical del fármaco a los tumores, y la acumulación intracelular en este, donde la administración sistémica de estos agentes no conjugados con fármacos pueden originar niveles inaceptables de toxicidad en células normales así como también las células del tumor se busca que se elimine. La eficacia máxima con la toxicidad mínima se busca por medio de esto. Ambos anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales han sido reportados como útiles en estas estrategias (Rowland et al . Cáncer, Immunol . Immunother. 21:183-87 (1986)). Los fármacos usados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorubicina, metotrexato, y vindesina. Las toxinas usadas en el conjugado anticuerpo-toxina incluye toxinas bacteriales tal como toxina de la difteria, toxinas de plantas tal como ricina, toxinas de moléculas pequeñas tal como geldanamicina (Mandler et al . Jour, of . The Nat . Cáncer Inst . 92 (19) : 1573-1581 (2000); Mandler et al Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028 (2000); Mandler et al Bioconjugated Chem. 13:786-791 (2002)), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al. Proc . Nati . Acad. Sci .

USA 93:8618-8623 (1996)), y caliqueamicina (Lode et al. Cáncer Res . 58:2928 (1998); Hincan et al. Cáncer Res . 53:3336-3342 (1993)). Las toxinas pueden afectar sus efectos citotóxicos y citostáticos por medio de mecanismos incluyendo el enlace de tubulina, enlace del ADN o inhibición de topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con los anticuerpos grandes o ligandos receptores de proteínas . Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmunoconjugados se describen anteriormente. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de estas que pueden usarse incluyen la cadena de la difteria A, fragmentos activos no enlazados de la toxina de la difteria, la cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleuritas fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y tricotecenos . Véase p.ej., WO 93/21232 publicada el 28 de Octubre de 1993. Conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen utilizando una variedad de agentes bifuncionales de enlace de proteína tal como el N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HCl) , esteres activos (tal como el suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (como glutaraldehído) , compuestos bis-azo (como (p-azidobenzoilo) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tal como 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activo (tal como 1, 5-difluoro-2,4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al. Science, 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético etiquetado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante de ejemplificación para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. Véase WO 94/11026.

Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tal como caliqueamicina, maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, un tricoteceno, y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad tóxica, también están contempladas en la presente. En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo (longitud completa o fragmentos) de la invención conjugado con una o más moléculas de maitansinoide . Los maitansinoides son inhibidores mitotóxicos que actúan al inhibir la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló primero del arbusto Africano del este Maytenus serrata (Patente US No. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tal como el maitansinol y los esteres de maitansinol C-3 (Patente US No. 4,151,042). El maitansinol sintético y los derivados y análogos de estos se revelan, por ejemplo en las Patentes Nos. 4,137,230 4,248,870 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757 4,307,016 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946 4,315,929 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650 4,364,866 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663 y 4,371,533. Los radicales del fármaco de maitansinoide son radicales de fármaco atractivos en los conjugados del fármaco del anticuerpo porque son: (i) relativamente accesibles de preparar por medio de fermentación o modificación química, derivación de los productos de la fermentación, (ii) sensible a la derivación con grupos funcionales adecuados para la conjugación a través de los enlazador sin bisulfuro a los anticuerpos, (iii) estable en plasma, y (iv) efectivo contra una variedad de líneas celulares de tumores. Las modalidades de ejemplificación de radicales de fármacos maitansinoides incluyen: DM1; DM3 y DM4, que tienen las estructuras: en donde la línea ondulada indica la unión covalente del átomo de azufre con el fármaco con un enlazador (L) de un conjugado anticuerpo fármaco. El HERCEPTIN® (trastuzumab) enlazado por SMCC al DMl ha sido reportado en (WO 2005/037992) . Otros conjugados del fármaco anticuerpo maitansinoide de ejemplificación tienen las siguientes estructuras y abreviaciones, (donde Ab es el anticuerpo y p es 1 a aproximadamente 8) : Ab-SMCC-DMI Los conjugados de anticuerpo fármaco de ejemplificación donde DMl se enlaza a través de un enlazador BMPEO con un grupo tiol del anticuerpo tienen la estructura y abreviaciones : donde ab es el anticuerpo; n es O, 1, ó 2; y p es l, 2, 3 ó 4. Los inmunoconjugados contienen maitansinoides, métodos para elaborar los mismos, y su uso terapéutico se revelan, por ejemplo, en la Patente US No. 5,208,020; 5,416,064 y la Patente Europea EP 0425 235 Bl, las revelaciones de esta se incorporan expresamente en la presente como referencia. Liu et al. Proc. Nati . Acad. Sci . USA 93:8618-8623 (1996) describen inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado MDl enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorectal de humano. El conjugado se encontró que es ligeramente citotóxico para las células de cáncer de colon cultivadas, y mostró actividad antitumoral en un análisis de crecimiento del tumor in vivo. Cari et al. Cáncer Research 52:127-131 (1992) describe los inmunoconjugados en donde se conjugó vía un enlazador de bisulfuro con el anticuerpo A7 murino uniéndose con un antígeno en las líneas celulares de cáncer de colon de humano, o con otro anticuerpo TA.l monoclonal murino que une el HER2. Los conjugados anticuerpo-maitansinoide se preparan por medio del enlace químico de un anticuerpo a una molécula maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o la molécula de maitansinoide. Véase, p.ej., la Patente US No. 5,208,020. Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia en' la citotoxicidad de las células blanco sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque aun una molécula de toxina/anticuerpo se esperaría para mejorar la citotoxicidad con el uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides se conocen bien en la técnica y pueden sintetizarse por medio de técnicas conocidas o aislarse de las fuentes naturales. Se revelan los maitansinoides, por ejemplo, en la Patente US No. 5,208,020 y en las otras patentes y publicaciones que no son patentes referidas anteriormente. Los maitansinoides preferidos son el maitansinol y los análogos de maitansinol en el anillo aromático o en las otras posiciones de la molécula de maitansinol, tal como los diferentes esteres de maitansinol . Existen diferentes grupos de enlace en la técnica para producir conjugados de anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, aquellos revelados en la Patente US No. 5208020 o Patente EP 0 425 235 Bl, Cari et al. Cáncer Research 52:127-131 (1992) . También pueden prepararse los conjugados anticuerpo-maitansinoide que comprende el compuesto enlazador SMCC. Los grupos de enlace incluyen los grupos bisulfuro, grupos tioéter, grupos ácido lábil, grupos fotolábiles, grupos péptidos lábil, o grupos esterasa lábil, como se revela en las patentes identificados como grupos bisulfuro y tioéter preferidos . Los grupos de enlace adicionales se describen y ejemplifican en la presente. Los conjugados del anticuerpo y maitansinoides pueden hacerse utilizando una variedad de agentes que acoplan proteínas bifuncionales tal como el N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato (SMCC) , imminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como adipimidato dedimetilo HCl) , esteres activos (como suberato de disuccinimidilo) aldehidos (como glutaraldehído) , compuestos bis-azo (como bis- (p-azidobenzoilo) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina), diisocianatos (tal como 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activo (tal como 1,5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Los agentes de enlace particularmente preferidos incluyen el N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al. Biochem. J. 173:723-737 (1978)) y N-succinimidil-4- (2-piridiltio) pentaonato (SPP) para proporcionar un enlace de bisulfuro. El enlazador puede unirse a la molécula de maitansinoide en diferentes posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace de éster puede formarse por la reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de enlace convencionales . La reacción puede presentarse en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, en la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición c-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, se forma el enlace en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol . En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con análogos peptídicos de dolastatinas o dolostatinas, las auristatinas (Patentes US Nos. 5,635,483 y 5,780,588). Se ha mostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con las dinámicas del microtubulo, hidrólisis GTP y la división celular y nuclear (Woyke et al. Antimicrob . Agents and Chemother. 45(12) :2580-3584 (2001)) y tienen actividad anticáncer (Patente US No. 5,663,149) y antifúngica (Pettit et al. Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965 (1998)). El radical del fármaco dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo a través del N (amino) terminal o el C (carboxilo) terminal del radical del fármaco peptídico (WO 02/088172) . Las modalidades de auristatina de ejemplificación incluyen los radicales del fármaco monometilauristatina enlazado con N-terminal DE y DF, revelados en "Senter et al, Procedimientos de la Asociación Americana para la Investigación del Cáncer, Volumen 45, Resumen Número 623, presentado el 28 de Marzo de 2004. Una modalidad de auristatina de ejemplo es MMAE (en donde la línea ondulada indica la unión covalente con el enlazador (L) de un conjugado anticuerpo fármaco) .

Otra modalidad de auristatina de ejemplificación es MMAF (en donde la línea ondulada indica la unión covalente con el 'enlazador (L) de un conjugado anticuerpo fármaco) : Ejemplos de las modalidades adicionales que comprenden MMAE o MMAF y diferentes componentes enlazadores (descrito adicionalmente en la presente) tienen las siguientes estructuras y abreviaciones (en donde Ab significa anticuerpo y p es 1 a aproximadamente 8) : Ab-MC-vc-PAB-M AE Por lo regular, los radicales del fármaco basados en péptidos pueden prepararse formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Estos enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis en fase líquida (ver E. Schróeder and K. Lübke, "The Peptides", volumen 1, pp. 76-136, Academic Press (1965) ) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Los radicales del fármaco de auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los métodos de: US 5635483; US 5780588; Petit et al. J. Am . Chem . Soc. 111:5463-5465 (1989); y Petit et al. Anti-Cancer Drug Design 13:243-277 (1998). En otras modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de la caliqueamicina es capaz de producir cortes de ADN de doble hebra a concentraciones sub-picomolares . Para la preparación de los conjugados de la familia de la caliqueamicina, ver las patentes U.S. Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas asignadas a American Cyanamid Company) . Los análogos estructurales de la caliqueamicina que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a., Yi1, a2I, CL31 , N-acetil-yi1, PSAG y ?i1 (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes U.S. mencionadas anteriormente para American Cyanamíd) . Otro fármaco anti-tumoral en que el anticuerpo puede conjugarse es QFA que es un antifolato. La caliqueamicina y QFA tienen sitios de acción intracelulares y no cruzan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes por medio de la internalización mediada por anticuerpos mejora ampliamente sus efectos citotóxicos. Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse a los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de los agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descrita en las patentes U.S. 5,053,394, 5,770,710, así como las esperamicinas (patente U.S. 5,877,296).- Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos de no unión de la toxina difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993. La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o ADN endonucleasa, tal como una desoxirribonucleasa; DNasa) . Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re18S, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 y los isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para los estudios de centelleo gráficos, por ejemplo tc99m o I123 o una etiqueta de espín para la formación de imagen por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imagen de resonancia magnética nuclear, mri) , tales como yodo-123 nuevamente, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Las radio-etiquetas u otras pueden incorporarse en el conjugado mediante las formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede ser biosintetizado o puede sintetizarse mediante la síntesis química de aminoácidos usando los precursores de aminoácidos apropiados, que involucran, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Las etiquetas, tales como tc99m o I123, Re186, Re188 e In111 pueden unirse por medio un residuo de cisteína en el péptido. Puede unirse el itrio-90 por medio de un residuo de lisina. El método descrito en Fraker et al., Biochem. Biophys . Res . Commun. 80: 49-57 (1978) puede usarse para incorporar el yodo-123. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico pueden elaborarse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridiltio) (SPDP), ciclohexan-1-carboxilato de succinimidil-4- (N-maleimidometilo) (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoilo) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como l,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de un agente de quelación para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver WO 94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador de corte" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un enlazador de ácido lábil, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente U.S. No. 5,208,020). Los compuestos de la invención contemplan expresamente, pero no se limitan a, ADC preparado con reactivos de enlazador cruzado: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (benzoato de succinimidil- (4-vinilsulfona) ) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, en Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA.). Ver las páginas 467- 498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog. En los conjugados del fármaco del anticuerpo (ADC) de la invención, un anticuerpo (Ab) se conjuga a uno o más radicales del fármaco' (D) , por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 20 radicales del fármaco por anticuerpo, por medio de un enlazador (L) . Los ADC de la Fórmula I pueden prepararse por varias rutas, empleando las reacciones de química orgánica, condiciones y los reactivos conocidos por los experimentados en la técnica, que incluyen: (1) reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente, para formar Ab-L, por medio de un enlace covalente, seguido de la reacción con un radical de fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleofílico de un radical de fármaco con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, por medio de un enlace covalente, seguido de la reacción con un grupo nucleofílico de un anticuerpo. Los métodos adicionales para la preparación de ADC se describen en la presente. Ab~(L-D)p I El enlazador puede estar compuesto de uno o más componentes enlazadores. Ejemplos de los componentes enlazadores incluyen 6-maleimidocaproilo ("MC") , maleimidopropanoilo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe") , p-aminobenciloxicarbonilo ("PAB"), 4- (2-piridiltio) pentanoato de N-succinimidilo ("SPP"), 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1 carboxilato de N-succinimidilo ("SMCC") y (4-yodo-acetil) aminobenzoato de N-succinimidilo ("SIAB") . Los componentes enlazadores adicionales son conocidos en la técnica y algunos se describen en la presente. En algunas modalidades, el enlazador puede comprender residuos de aminoácidos. Ejemplos de los componentes enlazadores de aminoácidos incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido. Ejemplos de los dipéptidos incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-phe) . Ejemplos de los tripéptidos incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Los residuos de aminoácidos que comprenden un componente de enlazador de aminoácido incluyen los que se presentan naturalmente, así como los aminoácidos menores y los análogos de aminoácidos que no se presentan naturalmente, tal como la citrulina. Los componentes enlazadores de aminoácidos pueden diseñarse y optimizarse en su selectividad para el corte enzimático mediante enzimas particulares, por ejemplo, una proteasa asociada con tumor, catepsina B, C y D o una plasmina proteasa. Ejemplos de las estructuras del componente enlazador se muestran a continuación (en donde la línea ondulada indica los sitios de unión covalente a otros componentes de los ADC) : Ejemplos de los componentes enlazadores adicionales y las abreviaciones incluyen (en donde se representan el anticuerpo (Ab) y el enlazador y p es 1 a aproximadamente 8) : MC-val at-PAB Los grupos nucleofílicos en los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (i) grupos de amina N-terminal, (ii) grupos de amina de cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cisteina, y (iv) grupos hidroxilo o amino de azúcar, en donde el anticuerpo está glucosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleofílicos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con los grupos electrofílicos en los radicales del enlazador y los reactivos del enlazador que incluyen: (i) esteres activos tales como esteres de NHS, esteres de HOBt, haloformatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida. Algunos anticuerpos tienen disulfuros de inter-cadena reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para la conjugación con los reactivos enlazadores mediante el tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol) . De esta manera, cada puente de cisteína formará, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Los grupos nucleofílicos adicionales pueden introducirse en los anticuerpos por medio de la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) resultando en la conversión de una amina en un tiol . Los grupos de tiol reactivos pueden introducirse en el anticuerpo (o fragmento del mismo) introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos de aminoácidos de cisteína no nativos) . Los conjugados del fármaco del anticuerpo de la invención también pueden producirse por modificación del anticuerpo para introducir los radicales electrofílicos, que pueden reaccionar con los sustituyentes nucleofílicos sobre el reactivo enlazador del fármaco. Los azúcares de los anticuerpos glucosilados pueden oxidarse, por ejemplo, con reactivos de oxidación de periodato, para formar los grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de los reactivos enlazadores o los radicales del fármaco . Los grupos de la base de Schiff de la imina resultante pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo, mediante los reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una modalidad, la reacción de la porción del carbohidrato de un anticuerpo glucosilado con galactosa oxidasa o meta-periodato de sodio puede producir los grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con los grupos apropiados en el fármaco (Técnicas Hermanson, Bioconjugadas) . En otra modalidad, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina N-terminales pueden reaccionar con meta-periodato de sodio, resultando en la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroli, Bioconjugate Chem. 3:138-146 (1992); patente U.S. No. 5,362,852). Este aldehido puede hacerse reaccionar con un radical de fármaco o nucleófilo enlazador. Asimismo, los grupos nucleofílicos en un radical de fármaco incluyen, pero no se limitan a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con los grupos electrofílicos sobre los radicales del enlazador y los reactivos enlazadores, que incluyen: (i) esteres activos, tales como esteres de NHS, steres de HOBt, haloformatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida. De manera alternativa, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y el agente citotóxico puede hacerse, por ejemplo, mediante las técnicas recombinantes o síntesis de péptidos . La longitud del ADN puede comprender las regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado ya sea adyacente entre sí o separado por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado . En aún otra modalidad, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para el uso en el pre-blanco tumoral, en donde el conjugado del anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la remoción del conjugado no unido de la circulación usando un agente de clarificación y después de la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) . Otros inmunoconjugados se contemplan en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede unirse a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol . El anticuerpo también puede atraparse en microcápsulas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli (metacrilato de metilo, respectivamente), en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en microemulsiones. Estas técnicas se describen en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A., Ed. , (1980). Los anticuerpos descritos en la presente también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por los métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 77:4030 (1980); Patente U.S. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y WO 97/38731 publicada el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente U.S. No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extrudieron a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) por medio de una reacción de intercambio de bisulfuro. Un agente quimioterapéutico está contenido opcionalmente dentro del liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cáncer Inst. 81 (19) 1484 (1989). III. Selección de los pacientes para terapia El general, el paciente en la presente se somete a una prueba de diagnóstico antes de la terapia para identificar los pacientes HER2 positivos. Por ejemplo, la prueba de diagnóstico puede evaluar la expresión de HER2 (incluyendo la sobre-expresión) , amplificación y/o activación (incluyendo fosforilación o dimerización) . En general, si se realiza una prueba de diagnóstico, puede obtenerse una muestra de un paciente que necesita la terapia. Cuando el paciente tiene cáncer, en general la muestra es una muestra de tumor. En la modalidad preferida, la muestra de tumor es de una biopsia de cáncer de mama. La muestra biológica en la presente puede ser una muestra fijada, por ejemplo, una muestra acoplada con parafina, fijada con formalina (FFPE) o una muestra congelada. Para determinar la expresión de HER2 o la amplificación en el cáncer, están disponibles varias pruebas de diagnóstico/pronóstico. En una modalidad, la sobre-exprésion de HER2 puede analizarse por IHC, por ejemplo, usando HERCEPTEST® (Dako) . Las secciones de tejido acopladas con parafina de una biopsia de tumor pueden someterse a la prueba IHC y concederse un criterio de intensidad de la tinción de proteína HER2 como sigue: Registro 0 no se observa la tinción o se observa la tinción de membrana en menos de 10% de las células de tumor. Registro 1+ se detecta una tinción de membrana casi imperceptible/apenas perceptible en más de 10% de las células de tumor. Las células se tiñen únicamente en parte de su membrana . Registro 2+ se observa una tinción de membrana completa débil a moderada en más de 10% de las células de tumor. Registro 3+ se observa una tinción de membrana completa moderada a fuerte en más de 10% de las células de tumor. Los tumores con registros 0 ó 1 para la valoración de la sobre-expresión HER2 puede caracterizarse como la no sobre-expresión de HER2 , mientras que los tumores con registros 2+ ó 3+ pueden caracterizarse como HER2 de sobre-expresión. Los tumores que sobre-expresan HER2 pueden clasificarse por los registros inmunohistoquímicos que corresponden al número de copias de las moléculas HER2 expresadas por célula y pueden determinarse bioquímicamente : 0 = 0-10,000 copias/célula, 1+ = por lo menos aproximadamente 200,000 copias/célula, 2+ = por lo menos aproximadamente 500,000 copias/célula, 3+ = por lo menos aproximadamente 2,000,000 copias/célula . La sobre-expresión de HER2 al nivel 3+, que conduce a una activación independiente del ligando de la tirosina cinasa (Hudziak et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 84: 7159-7163 (1987) ) , se presenta en aproximadamente 30% de los cánceres de mama, y en estos pacientes, se disminuyen la supervivencia sin recaída y la tasa de supervivencia global (Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); Slamon et al., Science, 235:177- 182 (1987) ) . De manera alternativa, o además, las pruebas FISH, tales como la INFORM® (vendida por Ventana, Arizona) o PATHVISION™ (Vysis, Illinois) pueden llevarse a cabo sobre tejido del tumor fijado con formalina, acoplado con parafina para determinar el grado (si existiera) de amplificación HER2 en el tumor. También puede- evaluarse el carácter positivo HER2 usando una prueba de diagnóstico in vivo, por ejemplo, administrando una molécula (tal como un anticuerpo) que une la molécula que se detectará y se marca con una etiqueta detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo) y explorando externamente al paciente para la localización de la etiqueta. Otros métodos para identificar los tumores HER2 positivos se contemplan en la presente,, que incluyen, pero no se limitan a, antígeno de cobertizo y detección de de tumores HER2 positivos indirectamente, tales como evaluando la señalización del sitio 3 'a 5' mediada por medio del receptor HER2, el perfil de expresión del gen, etc. De preferencia, los pacientes se seleccionan quienes tienen un tumor HER2 positivo o muestra que sobre-expresa HER2 como se evalúa por la inmunohistoquímica (IHC) y/o tiene gen HER2 amplificado como se evalúa por FISH. IV. Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos HER2 usados de acuerdo con la presente invención se preparan para el almacenamiento, mezclando un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con los vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) ) , en general en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los cristales del anticuerpo también se contemplan (ver Solicitud de patente US 2002/0136719) . Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menor de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes de quelación, tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones que forman sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEENJ, PLURONICSJ o polietilenglicol (PEG) . Las formulaciones de anticuerpo liofilizado se describen en las patentes US Nos. 6,267,958, 6,685,940 y 6,821,515, incorporadas expresamente en la presente por referencia. La formulación de HERCEPTIN® preferida es un polvo liofilizado sin conservadores estéril, blanco a amarillo pálido para la administración intravenosa (IV) , que comprende 440 mg de trastuzumab, 400 mg de dihidrato de , a-trehalosa, 9.9 mg de L-histidina-HCl, 6.4 mg de L-histidina y 1.8 mg de polisorbato 20, USP. La reconstitución de 20 mL de agua bacteriostática para inyección (BWFI) , que contiene alcohol bencílico al 1.1% como un conservador, produce una solución multidosis que contiene 21 mg/mL de trastuzumab, a pH de aproximadamente 6.0.

La formulación de pertuzumab preferida para el uso terapéutico comprende 30 mg/mL de pertuzumab en acetato de histidina 20 mM, sacarosa 20 mM, polisorbato 20 al 0.02% a pH 6.0. Una formulación de pertuzumab alternativa comprende 25 mg/mL de pertuzumab, amortiguador de histidina-HCl 10 mM, sacarosa 240 mM, polisorbato 20 al 0.02%, pH 6.0. La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo conforme sea necesario, para la indicación particular que es tratada, de preferencia las actividades aquellas con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Los diferentes fármacos que pueden combinarse con el anticuerpo HER2 se describen en la Terapia Adyuvante posterior. Estas moléculas están presentes convenientemente en combinación en cantidades que son efectivas para los propósitos destinados . Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli (metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) . Pueden prepararse preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos apropiados de las preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que. contienen el anticuerpo, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de las matrices de liberación prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (alcohol vinílico)), polilacturos (Patente U.S. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOTJ (microesferas inyectables) compuesto del copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Las formulaciones que se usarán para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de una membrana de filtración estéril . V. Terapia Adyuvante La presente invención proporciona un método de terapia adyuvante que comprende administrar a un paciente humano con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico, siguiendo la cirugía definitiva, un anticuerpo que une al dominio IV de HER2 unido a trastuzumab (HERCEPTIN®) , en una cantidad efectiva para prolongar la supervivencia sin la enfermedad (DFS) o supervivencia global (OS) , en donde la DFS o la OS se evalúa de aproximadamente 2 a 5 años después de una administración inicial del anticuerpo. De preferencia, la DFS o OS del paciente se evalúa aproximadamente 3-5 años, aproximadamente 4-5 años o por lo menos aproximadamente 4, o por lo menos aproximadamente 5 años después de la iniciación del tratamiento o después del diagnóstico inicial . De preferencia, el anticuerpo es trastuzumab (HERCEPTIN®) . En general, el paciente tratado en la presente está en alto riesgo de ocurrencia. Cuando el tumor del paciente es HER2 positivo, este se conoce que es más agresivo y se enlaza con una probabilidad mayor de recurrencia. Además, el paciente puede estar en alto riesgo debido a una edad más joven (por ejemplo, cuando el paciente es menor de aproximadamente 50 años de edad) ; puede tener un tumor primario grande (por ejemplo un tumor mayor de 2 centímetros de diámetro) ; puede ser nodulo linfático positivo (por ejemplo, que tiene 4 o más nodulos linfáticos involucrados, que incluyen 4-9 nodulos linfáticos involucrados y 20 o más nodulos linfáticos involucrados) ; puede ser receptor de estrógeno (ER) negativo; y/o puede ser receptor de progesterona (PG) negativo) . El anticuerpo HER2 se administra a un paciente humano de acuerdo con los métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o mediante infusión continua durante un periodo, por las rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal , subcutánea, intra-articular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica o inhalación. Se prefiere la administración intravenosa del anticuerpo . Las dosificaciones preferidas para el anticuerpo HER2 están en el intervalo de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, más preferentemente de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg. Los regímenes de dosificación preferidos para el trastuzumab incluyen 4 mg/kg de trastuzumab administrado como una infusión de 90 minutos, seguido de una dosis de mantenimiento por semana de 2 mg/kg de trastuzumab, que puede administrarse como una infusión de 30 minutos si la dosis de carga inicial es bien tolerada. Sin embargo, se contemplan otros regímenes de dosificación para el trastuzumab, que incluyen menos de una dosis por semana, por ejemplo la administración cada 3 semanas, por ejemplo a una dosis de 6 mg/kg, 8 mg/kg o 12 mg/kg; e incluyen una dosis inicial de 8 mg/kg, seguido de 6 m9/kg cada tres semanas (ver, patente U.S. No. 6,627,196 Bl, Baughman et al . ; Leyland-Jones et al . , J. Clin . Oncol . 21:3965-71 (2003)). El número de dosis de Trastuzumab administradas puede ser por lo menos de 20 o más, de preferencia por lo menos 50, por ejemplo 52 dosis (en donde el anticuerpo se administra cada semana) . Cuando se usa una dosificación menos frecuente de trastuzumab, tal como una dosificación cada 3 semanas, puede administrarse dosis menores. En general, el paciente recibirá trastuzumab durante por lo menos aproximadamente 1 año, y el progreso del paciente será seguido después de tal tiempo. Mientras que el anticuerpo HER2 puede administrarse como un agente simple, el paciente se trata de preferencia con una combinación del anticuerpo HER2 y uno o más agentes quimioterapéuticos. De preferencia, por lo menos uno de los agentes quimioterapéuticos es un taxoide. La administración combinada incluye la co-administración o administración simultánea, usando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica simple y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde hay de preferencia un periodo de tiempo mientras que ambos (o todos) agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. De esta manera, el agente quimioterapéutico puede administrarse antes de, o después, de la administración del anticuerpo HER2. En esta modalidad, el tiempo entre por lo menos una administración del agente quimioterapéutico y por lo menos una administración del anticuerpo HER2 es de preferencia, de aproximadamente 1 mes o menos, y más preferentemente de aproximadamente 2 meses o menos. De manera alternativa, el agente quimioterapéutico y el anticuerpo HER2 se administran simultáneamente al paciente, en una formulación simple o formulaciones separadas . El tratamiento con la combinación del agente quimioterapéutico (por ejemplo, taxoide) y el anticuerpo HER2 (por ejemplo trastuzumab) puede resultar en un beneficio sinérgico, o más que aditivo, para el paciente. El agente quimioterapéutico, si se administra, se administra por lo regular a las dosificaciones conocidas del mismo, u opcionalmente disminuidas, debido a la acción combinada de los fármacos o los efectos secundarios negativos atribuidos a la administración del agente quimioterapéutico de antimetabolito. La preparación y los esquemas de dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por los practicantes experimentados. Cuando el agente quimioterapéutico es el paclitaxel, de preferencia, se administra cada semana (por ejemplo, a 80 mg/m2) o cada 3 semanas (por ejemplo a 175 mg/m2 ó 135 mg/m2) . Las dosificaciones de docetaxel apropiadas incluyen 60 mg/m2, 70 mg/m2, 75 mg/m2, 100 mg/m2, (cada 3 semanas) ; ó 35 mg/m2 ó 40 mg/m2 (cada semana) . Los diferentes agentes quimioterapéuticos que pueden combinarse se describen anteriormente. Los agentes quimioterapéuticos preferidos que se combinarán con el anticuerpo HER2 se seleccionan del grupo que consiste de un taxoide (que incluyen docetaxel y paclitaxel) vinca (tales como vinorelbina o vinblastina) , compuesto de platino (tal como carboplatina o cisplatina) inhibidor de aromatasa (tales como letrozol, anastrazol o exemestano) , anti-estrógeno (por ejemplo, ful estrant o tamoxifen) , etoposida, tiotepa, ciclofosfamida, metotrexato, doxorubicina liposomal, doxorubicina liposomal pegilada, capecitabina, gemcitabina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), o inhibidor de proteosoma (por ejemplo, PS342) . Más preferentemente, el anticuerpo HER2 se combina con un taxoide, tal como paclitaxel o docetaxel, opcionalmente en combinación con por lo menos otro agente quimioterapéutico, tal como un compuesto de platino (por ejemplo, carboplatina o cisplatina) . Cuando se administra al paciente una antraciclina (por ejemplo, doxorubicina o epirubicina) ésta se da, de preferencia, antes y/o después de la administración del anticuerpo HER2 , tal como en los protocolos descritos en el Ejemplo posterior, en donde se administró una combinación de antraciclina/ciclofosfamida al paciente después de la cirugía, pero antes de la administración del anticuerpo HER2 y el taxoide. Sin embargo, una antraciclina modificada, tal como doxorubicina liposomal (TLC D-99 (MYOCET®) , doxorubicina liposomal pegilada (CAELYX®) o epirubicina, con toxicidad cardiaca reducida, pueden combinarse con el anticuerpo HER2. La administración del anticuerpo y la quimioterapia pueden disminuir la recurrencia de la enfermedad (la recurrencia de cáncer en la mama y/o recurrencia distal) , en una población de pacientes en aproximadamente 50% en 3 años (en donde "aproximadamente 50%" en la presente, incluye un intervalo de aproximadamente 45% a aproximadamente 70%) , por ejemplo disminuye la recurrencia en la mama por aproximadamente 52% en 3 años, y/o disminuye la recurrencia distante por aproximadamente 53% en 3 años, comparado con los pacientes tratados únicamente con quimioterapia (por ejemplo, taxoide, tal como paclitaxel) . La invención en la presente proporciona un método para curar el cáncer de mama no metastásico en una población de pacientes humanos con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico, que comprende administrar una cantidad efectiva de trastuzumab (HERCEPTIN®) y un taxoide a los pacientes después de la cirugía definitiva, y evaluar a los pacientes después de cuatro o más años para confirmar que no se ha presentado recurrencia de la enfermedad después de aproximadamente 4 años en por lo menos aproximadamente 80% (de preferencia por lo menos aproximadamente 85%) de los pacientes. La población puede comprender 3000 o más pacientes humanos . La invención se relaciona además con un método para disminuir la recurrencia de la enfermedad en una población de pacientes humanos con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico, que comprende administrar una cantidad efectiva de trastuzumab (HERCEPTIN®) y un taxoide a los pacientes después de la cirugía definitiva, en donde la recurrencia de la enfermedad se disminuye en por lo menos aproximadamente 50% en 3 años comparado con los pacientes tratados únicamente con taxoide . Además del anticuerpo HER2 y el agente quimioterapéutico, pueden combinarse otros regímenes terapéuticos. Por ejemplo, un segundo (tercero, cuarto, etc.) agente (s) quimioterapéutico puede administrarse, en donde el segundo agente quimioterapéutico es ya sea otro agente quimioterapéutico taxoide diferente o un agente quimioterapéutico que no es un taxoide. Por ejemplo, el segundo agente quimioterapéutico puede ser un taxoide (tal como paclitaxel o docetaxel) , un vinca (tal como vinorelbina) , compuesto de platino (tal como cisplatina o carboplatina) un agente anti-hormonal (tal como un inhibidor de aromatasa o antiestrógeno) , gemcitabina, capecitabina, etc. Ejemplos de las combinaciones incluyen un compuesto taxoide/platino, gemcitabina/taxoide, gemcitabina/vinorelbina, vinorelbina/taxoide, capecitabina/taxoide, etc. Pueden administrarse los "cócteles" de los diferentes agentes quimioterapéuticos . El régimen de tratamiento preferido en la presente comprende lumpectomía/mastectomía y la disección auxiliar con los nodulos linfáticos patológicamente involucrados, seguido por antraciclina + ciclofosfamida (AC) , por ejemplo durante 4 ciclos, después la administración de un taxoide con HERCEPTIN® durante aproximadamente un año. Otros agentes terapéuticos que pueden combinarse con el anticuerpo HER2 incluyen cualquiera de uno de : un segundo anticuerpo HER2 , diferente (por ejemplo, un inhibidor de la heterodimerización de HER2 tal como pertuzumab o un anticuerpo HER2 que induce la apóptosis de una célula que sobre-expresa HER2, tal como 7C2, 7F3 o las variantes humanizadas de los mismos) ; un anticuerpo dirigido contra un antígeno asociada tumoral diferente, tal como EGFR, HER3 , HER4; compuesto antihormonal o terapéutico endocrino, por ejemplo, un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifen o un inhibidor de aromatasa; un cardioprotector (para evitar o reducir cualquier disfunción del miocardio asociada con la terapia) ; una citosina; un inhibidor de EGFR (tal como TARCEVA7, IRESSA7 o cetuximab) ; un agente anti-angiogénico (especialmente bevacizumab vendido por Genentech bajo la marca comercial AVASTINJ) ; un inhibidor de la tirosina cinasa; un inhibidor COX (por ejemplo, un inhibidor de COX-1 o COX-2) ; un fármaco anti-inflamatorio no esteroide, celecoxib (CELEBREX7) ; inhibidor de farnesil transferasa (por ejemplo, Tipifarnib/ZARNESTRA7 R115777 disponible en Johnson and Johnson o Lonafarnib SCH66336 disponible en Schering-Plough) ; vacuna HER2 (tal como vacuna H?R2 AutoVac de Pharmexia, o vacuna de proteínas APC8024 de Dendreon o vacuna del péptido HER2 de GSK/Corixa) ; otra terapia blanco de HER (por ejemplo, trastuzumab, cetuximab, ABX-EGF, EMD7200, gefitinib, erlotinib, CP724714, CI1033, GW572016, IMC-11F8, TAK165, etc.); inhibidor de Raf y/o ras (ver, por ejemplo, WO 2003/86467) inyección de liposoma de doxorubicina HCl (DOXIL®) ; inhibidor de topoisomerasa I tal como topotecano; taxoide; HER2 e inhibidor de la tirosina cinasa doble de EGFR, tal como lapatinib/GW572016; TLK286 (TELCYTA®) ; EMD-7200; 7?B1007 (anticuerpo de cadena pesada del Factor XII, B7C9) ; everolimis (CERTICAN®) ; sirolimus (rapamicina, RAPAMUNE®) ; un medicamento para reducir la temperatura corporal, tal como acetaminofeno, difenhidramina o meperidina; factor de crecimiento hematopoyético, etc. Las dosificaciones apropiadas para cualquiera de los agentes co-administrados anteriores don las usadas actualmente y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo HER2. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede someterse a terapia de radiación. De preferencia, el anticuerpo HER2 administrado es un anticuerpo intacto, desnudo. Sin embargo, el anticuerpo HER2 puede conjugarse con un agente citotóxico. De preferencia, el anticuerpo conjugado y/o antígeno al cual se une se internaliza (n) por la célula, resultando en una eficacia terapéutica aumentada del conjugado en la muerte de la célula cancerígena a la que se une. En una modalidad preferida, el agente citotóxico dirige o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerígena. Ejemplos de estos agentes citotóxicos incluyen maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleasas y ADN endonucleasas . VI . Depósito de Materiales Las siguientes líneas celulares de hibridoma se han depositado con el American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) : Los detalles adicionales de la invención se ilustran por los siguientes Ejemplos no limitantes. Las descripciones de todas las citas en la especificación se incorporan expresamente en la presente por referencia. EJEMPLO 1 Este ejemplo se refiere a un análisis interno de unión de los resultados obtenidos en los pacientes con cáncer de mama humanos tratados en las pruebas clínicas de Proyecto de Mama e Intestino Adyuvante Quirúrgico Nacional (National Surgical Adyuvant Breast and Bowel Project) (NSABP B-31) y el Intergrupo N9831 del Grupo de Tratamiento de Cáncer Central del Norte (North Central Cáncer Treatment Group (NCCTG) . El estudio NCCTG enroló a su primer paciente en junio de 2000 y ha enrolado a 3,406 pacientes a la fecha; el estudio NS7?BP comenzó a enrolar en marzo de 2000 y ha enrolado a 2,085 pacientes a la fecha. El análisis interino de este ejemplo se basó en la información de los 3,300 pacientes. Estas pruebas evaluaron la eficacia de trastuzumab (HERCEPTIN®) como terapia adyuvante para el cáncer de mama operado a alto riesgo. Diseño del Estudio El diseño de los estudios NSABP B-31 y NCCTG N9831 se representa en la Figura 4A. En la prueba NSABP B-31, los pacientes se trataron con antraciclina (60 mg/m2) más ciclofosfamida (600 mg/m2) , cada 3 semanas, durante cuatro ciclos (c 3 semanas x 4) después recibieron ya sea: paclitaxel (TAXOL®) (175 mg/m2) , cada 3 semanas, durante 4 ciclos (c 3 semanas x 4) (Brazo 1) o paclitaxel (175 mg/m2) cada 3 semanas, durante 4 ciclos y trastuzumab (4 mg/kg/semana de dosis de carga (LD) durante 4 semanas) , seguido de 2 mg/kg/semana de dosis de mantenimiento durante 51 semanas (Brazo 2) . En la prueba NCCTG N9831, que es una versión enmendada de la prueba NSABP B-31, se usó el siguiente protocolo de tratamiento : Brazo A: antraciclina (60 mg/m2) más ciclofosfamida (600 mg/m2) , cada 3 semanas, durante cuatro ciclos (c 3 semanas x 4) seguido de paclitaxel (80 mg/m2/semana) durante 12 semanas.

Brazo B: antraciclina (60 mg/m2) más ciclofosfamida (600 mg/m2) , cada 3 semanas, durante cuatro ciclos (c 3 semanas x 4) seguido de paclitaxel (80 mg/m2/semana) durante 12 semanas, seguido de trastuzumab (dosis de carga de 4 mg/kg/semana (LD) durante 4 semanas y dosis de mantenimiento de 2 mg/kg/semana durante 51 semanas) . Brazo C : antraciclina (60 mg/m2) más ciclofosfamida (600 mg/m2) , cada 3 semanas, durante cuatro ciclos (c 3 semanas x 4) seguido de paclitaxel (80 mg/m2/semana) durante 12 semanas y trastuzumab (dosis de carga de 4 mg/kg/semana (LD) durante 4 semanas y dosis de mantenimiento de 2 mg/kg/semana durante 51 semanas) . Los brazos usados en el análisis de unión de los dos diseños de estudio se representan en la Figura 4B. HERCEPTIN® es un polvo liofilizado sin conservadores, estéril, blanco a amarillo pálido para la administración intravenosa (IV) . El contenido nominal de cada ampolleta de HERCEPTIN® es de 440 mg de trastuzumab, 400 mg de a,a-trehalosa dihidratada, 9 . 9 mg de L-histidina-HCl, 6.4 mg de L-histidina y 1.8 mg de polisorbato 20, USP. La reconstitución de 20 mL del agua bacteriostática suministrada para inyección (BWFI) , que contiene alcohol bencílico al 1.1% como un conservador, produce una solución multi-dosis que contiene 21 mg/mL de trastuzumab, a pH de aproximadamente 6.0. HERCEPTIN® se administró como una dosis de carga de 4 mg/kg, seguido de la dosis de mantenimiento de 2 mg/kg cada semana. Para calificar estas pruebas, se requirió que los pacientes tuvieran cáncer de mama invasivo, resecado por lumpectomía, o mastectomía total, más disección auxiliar, con los nodulos auxiliares patológicamente involucrados. El protocolo, como se enmendó en N9831 seguido por el reclutamiento de los pacientes de nodulo negativo de alto riesgo. Los pacientes no se dejaron que tuvieran una enfermedad avanzada localmente o distante, tuvieran una función hematológica normal, hepática y renal, no recibieran terapia previa de antraciclina o taxanos y no tuvieran neuropatía sensorial/motora significativa. Los pacientes fueron HER2 positivos por FISH o +++ por inmunohistoquímica (IHC) verificada centralmente (N9831) o por laboratorio de referencia aprobado (B-31) . El paciente y las características del tumor para los pacientes en estos estudios se muestran en la Figura 5. La población del análisis de unión representa un grupo de riesgo muy alto para la recurrencia y muerte, comparado con más pacientes típicos incluidos en las pruebas clínicas adyuvantes. En particular, los pacientes: son jóvenes (edad mediana = 48) ; tienen tumores grandes (60% más de 2 cm) ; tienen nodulos linfáticos más involucrados (14-15% tuvieron más de 10 nodulos linfáticos involucrados) ; y todos fueron HER2 positivos (HER2+) . Los resultados de la población tratada se esperaron que eran muy pobres con la quimioterapia actualmente disponible . Resultados El punto final primaria de estas pruebas fue la supervivencia sin enfermedad (DFS) , analizada de acuerdo con el principio de intención para el tratamiento, es decir, los pacientes se evaluaron sobre la base de sus terapia asignada.

Los puntos finales secundarios fueron la supervivencia global (OS) y el tiempo para la lera recurrencia distante. El análisis definitivo se programó después de los eventos 710 DFS. El primer análisis interno se programó después de los eventos 355 DFS, después cada 6 meses; se reportan un total de 395 eventos en ambas pruebas en la presente. Las pruebas se interrumpieron únicamente si se rechazó la equivalencia a p=0.0005 (2p=0.001) . La DFS para los resultados del estudio B31 y N9831 combinados se muestra en la Figura 6. La Figura 7 presenta los datos de DFS para los diferentes grupos de pacientes, clasificados con base en la edad, estatus del receptor hormonal, tamaño del tumor y número de nodulos positivos, con relación a todos los datos (de ambos estudios) y se expresan como una relación de riesgo. Los resultados individuales para los dos estudios (N9831 y B-31, respectivamente) se muestran al fondo de la gráfica. La Figura 8 muestra los resultados de DFS para las pruebas N9831 y B-31 individualmente. El tiempo para la primera recurrencia distante para los resultados combinados de N9831 y B-31 se muestra en la Figura 9. La Figura 10 representa el Riesgo de Recurrencia Distante para las pruebas aleatorias B31/N9831, para los pacientes tratados con antraciclina y ciclofosfamida (AC) , seguido de paclitaxel (T) comparado con los pacientes tratados con antraciclina y ciclofosfamida (AC) , seguido del tratamiento de paclitaxel y trastuzumab (TH) . La Figura ilustra la disminución dramática en el riesgo de recurrencia distante en el grupo que recibe el tratamiento TH. De manera similar, los datos de supervivencia establecidos en la figura 11 muestran que la supervivencia de los pacientes en el grupo tratado con TH excedió significativamente la supervivencia de los pacientes en el grupo tratado con T. A los 3 años de aleatoriedad, el grupo AC + TH fue de 94% vs . 92% del grupo Ac + T. La diferencia fue aún mayor a los 4 años: 91% en el grupo AC + TH vs . 87% en el grupo AC + T. Los análisis de eficacia del punto final para los dos estudios se resumen en la Figura 12. La incidencia acumulada de los eventos cardiacos en la cohorte evaluada se representa y se resumen en la Figura 13.

Conclusiones Para el cáncer de mama HER2 positivo de nodulo positivo, trastuzumab administrado simultáneamente con paclitaxel siguiendo la quimioterapia AC, redujo el riesgo de un primer evento de cáncer de mama a 3 años por 52%. El beneficio de reducción del riesgo relativo estuvo presente y de magnitud similar en todos los subgrupos de pacientes analizados. La adición de trastuzumab redujo la probabilidad de recurrencia distante por 53% a 3 años y el riesgo de desarrollo de metástasis distante pareció que disminuía con el tiempo. Los resultados a un seguimiento de mediana a 2 años muestran una ventaja de supervivencia estadísticamente significativa con una reducción de riesgo relativa de 33%. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (44)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para terapia adyuvante, caracterizado porque comprende administrar a un paciente humano con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico, después de una cirugía definitiva, una cantidad efectiva de un anticuerpo que une al Dominio IV de HER2 unido a trastuzumab (HERCEPTIN®) y por lo menos un agente quimioterapéutico, para prolongar la supervivencia sin la enfermedad (DFS) o la supervivencia global (OS) en el paciente, en donde la DFS o la OS se evalúa aproximadamente 2 a 5 años después del inicio del tratamiento. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo bloquea la unión de trastuzumab (HERCEPTIN®) a HER2.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende trastuzumab (HERCEPTIN®) .
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de taxoide, vinca, compuesto de platino, inhibidor de aromatasa, anti-estrógeno, etopósido, tiotepa, ciclofosfamida, metotrexato, doxorubicina liposomal, doxorubicina liposomal pegilada, capecitabina y gemcitabina.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es un taxoide .
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el taxoide es paclitaxel o docetaxel.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el paclitaxel y el anticuerpo se administran después de la administración de antraciclina y ciclofosfamida.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo comprende trastuzumab (HERCEPTIN®) .
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la administración del anticuerpo y la quimioterapia disminuyen la recurrencia de la enfermedad en 3 años en una población de pacientes por aproximadamente 50% comparado con los pacientes tratados únicamente con quimioterapia .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la administración de paclitaxel y el anticuerpo disminuyen la recurrencia de la enfermedad en 3 años en una población de pacientes por aproximadamente 50% comparado con los pacientes tratados con paclitaxel sin el anticuerpo.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente tiene un alto riesgo de recurrencia de cáncer.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el paciente es menor de aproximadamente 50 años de edad.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el paciente tuvo un tumor mayor de 2 centímetros de diámetro.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el cáncer es nodulo linfático positivo.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el paciente tiene 4-9 nodulos linfáticos involucrados .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el paciente tiene 10 o más nodulos linfáticos involucrados .
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el paciente es receptor de estrógeno (ER) negativo) .
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el paciente es receptor de progesterona (PG) negativo.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo intacto, desnudo .
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la DFS o la OS se evalúa 4 años después del inicio del tratamiento.
21. 21. Un método para curar cáncer de mama no metastásico en una población de pacientes humanos con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de trastuzumab (HERCEPTIN®) y taxoide a la población de pacientes después de la cirugía definitiva, y evaluar la población de pacientes después de aproximadamente cuatro años para confirmar que no se presentó recurrencia de la enfermedad en por lo menos aproximadamente 80% de la población.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la población comprende 3000 o más pacientes humanos .
23. 23. Un método para disminuir la recurrencia de la enfermedad en una población de pacientes humanos con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de trastuzumab (HERCEPTIN®) y taxoide a los pacientes después de la cirugía definitiva, en donde la recurrencia de la enfermedad a aproximadamente 3 años se disminuye en por lo menos aproximadamente 50% comparado con los pacientes tratados únicamente con taxoide .
24. 24. Un método de terapia adyuvante, caracterizado porque comprende administrar a un paciente humano con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico, después de una cirugía definitiva, una anticuerpo que une al Dominio IV de HER2 unido a trastuzumab (HERCEPTIN®) y por lo menos un agente quimioterapéutico, en una cantidad efectiva para prolongar la supervivencia sin la enfermedad (DFS) o la supervivencia global (OS) , con relación al estándar de la quimioterapia de cuidado, en donde la DFS o la OS se evalúa por lo menos una vez por año durante por lo menos aproximadamente 3 años después del inicio del tratamiento, en donde la DFS se prolonga si el paciente permanece vivo, sin recurrencia de cáncer durante por lo menos un año y la OS se prolonga si el paciente permanece vivo durante por lo menos un año, a partir del inicio del tratamiento.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el anticuerpo bloquea la unión de trastuzumab (HERCEPTIN®) a HER2.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el anticuerpo comprende trastuzumab (HERCEPTIN®) .
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es un taxoide .
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el taxoide es paclitaxel o docetaxel.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la administración del anticuerpo y el agente quimioterapéutico disminuye la recurrencia de la enfermedad a 3 años en una población de pacientes por aproximadamente 50% comparado con los pacientes tratados únicamente con la quimioterapia.
30. 30. Un método para instruir a un paciente humano con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico, caracterizado porque se identifica que tiene un alto riesgo de recurrencia de cáncer o poca probabilidad de supervivencia después de la cirugía definitiva, y que está siendo tratado exclusivamente por el estándar de la quimioterapia de cuidado para recibir el tratamiento con un anticuerpo que une al Dominio IV de HER2 unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) y por lo menos un agente quimioterapéutico .
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es un taxoide .
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el paciente se trata como se instruye.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el tratamiento continúa durante por lo menos seis meses.
34. 34. Un método promocional, caracterizado porque comprende promover, para el tratamiento de cáncer de mama HER2 positivo no metastásico en los pacientes humanos identificados que están en alto riesgo de recurrencia de cáncer o poca probabilidad de supervivencia después de la cirugía definitiva: (a) un agente quimioterapéutico en combinación con un anticuerpo que une al Dominio IV de HER2 unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) ; o (b) un anticuerpo que une al Dominio IV de HER2 unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) en combinación con un agente quimioterapéutico.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es un taxoide .
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la promoción es mediante una inserción de empaque que acompaña una formulación comercial del agente quimioterapéutico o el anticuerpo.
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la promoción es por escrito o comunicación oral con un médico o persona para el cuidado de la salud.
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la promoción se sigue por el tratamiento de los pacientes con la combinación del agente quimioterapéutico y el anticuerpo.
39. 39. Un método de negocio, caracterizado porque comprende comercializar un agente quimioterapéutico para el tratamiento de cáncer de mama no metastásico HER2 positivo en pacientes humanos identificados que están en alto riesgo de recurrencia de cáncer o con poca probabilidad de supervivencia después de la cirugía definitiva, en combinación con un anticuerpo que une al Dominio IV de HER2 unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) , para disminuir la probabilidad del paciente de recurrencia de cáncer o aumentar la probabilidad del paciente de supervivencia .
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es un taxoide .
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la comercialización se sigue mediante el tratamiento de los pacientes con la combinación del agente quimioterapéutico y el anticuerpo.
42. 42. Un método de negocio, caracterizado porque comprende comercializar un anticuerpo que une al Dominio IV de HER2 unido a trastuzumab (HERCEPTIN®) para el tratamiento de cáncer de mama no metastásico HER2 positivo en pacientes humanos identificados que están en alto riesgo de recurrencia de cáncer o con poca probabilidad de supervivencia después de la cirugía definitiva, en combinación con un agente quimioterapéutico, para disminuir la probabilidad del paciente de recurrencia de cáncer o aumentar la probabilidad del paciente de supervivencia.
43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la comercialización se sigue mediante el tratamiento de los pacientes con la combinación del agente quimioterapéutico y el anticuerpo .
44. 44. Un método de terapia adyuvante, caracterizado porque comprende administrar a un paciente humano con cáncer de mama HER2 positivo no metastásico, después de la cirugía definitiva, un anticuerpo que une al Dominio IV de HER2 unido por trastuzumab (HERCEPTIN®) , como un agente simple, en una cantidad efectiva para prolongar la supervivencia sin la enfermedad (DFS) o la supervivencia global (OS) , en donde la DFS o la OS se confirma por lo menos aproximadamente un año después de una administración inicial del anticuerpo.