MXPA06003836A - Un promotor de maiz preferido de raiz nombrado crwaq81. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona composiciones y metodos para regular la expresion de secuencias de nucleotido heterologas en una planta. Las composiciones incluyen una secuencia de nucleotidos novedosa para un promotor preferido de raiz para el gen que codifica CRWAQ81. Se proporciona un metodo para expresar una secuencia de nucleotidos heterologa en una planta utilizando las secuencias de promotor divulgadas en la presente. El metodo comprende establemente incorporar en el genoma de una celula de planta una secuencia de nucleotidos operablemente enlazada al promotor preferido de raiz de la presente invencion y regenerar una planta establemente transformada que expresa la secuencia de nucleotidos.

Description

UN PROMOTOR DE MAÍZ PREFERIDO DE RAÍZ NOMBRADO CRWAQ81 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al campo de biología molecular de plantas, más particularmente a la regulación de la expresión de gen en plantas . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La expresión de las secuencias de DNA heterólogas en un hospedero de planta es dependiente de la presencia de un promotor operablemente enlazado que es funcional dentro del hospedero de planta. El tipo de secuencia de promotor elegido está basado en cuando y donde se desea dentro de la expresión del organismo del DNA heterólogo. Donde se desea la expresión en tejidos u órganos específicos, se pueden utilizar promotores preferidos de tejido. Donde se desea la expresión de gen en respuesta a un estimulo, los promotores inducibles son el elemento regulatorio de elección. En contraste, donde se desea la expresión continua por todas las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos.

Las secuencias regulatorias adicionales corriente arriba y/o corriente abajo desde una secuencia de promotor de núcleo pueden ser incluidas en construcciones de expresión de vectores de transformación para dar origen a niveles variables de expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica. La alteración en forma genética de las plantas a través del uso de técnicas de ingeniería genética para producir plantas con atributos útiles de esta manera requiere la disponibilidad de una variedad de promotores. Frecuentemente es deseable expresar una secuencia de DNA en tejidos u órganos particulares de una planta. Por ejemplo, la resistencia incrementada de una planta a la infección por patógenos portados por tierra y/o portados por aire podria ser realizada mediante la manipulación genética del genoma de la planta para comprender un promotor preferido de tejido, operablemente enlazado a un gen de resistencia a patógenos heterólogo tal que las proteínas de resistencia a patógenos son producidas en el tejido de planta deseado. Alternativamente, podria ser deseable inhibir la expresión de una secuencia de DNA nativa dentro del tejido de una planta para lograr un fenotipo deseado. En este caso, tal inhibición podría ser realizada con la transformación de la planta para comprender un promotor preferido de tejido operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos antisentido tal que la expresión de la secuencia antisentido produce un transcripto de RNA que interfiere con la traducción del RNA de la secuencia de DNA nativa. Hasta la fecha, la regulación de la expresión de gen en raices de plantas no se ha estudiado adecuadamente a pesar de la importancia de la raíz para el desarrollo de la planta. En algún grado esto es atribuible a una falta de funciones bioquímicas específicas de la raíz, fácilmente disponibles cuyos genes pueden ser clonados, estudiados y manipulados. Varios genes que son preferencialmente expresados en tejidos de raiz de plantas han sido identificados. Ver, por ejemplo, Takahashi y colaboradores, (1991) Plant J. 1:327-332; Takahashi y colaboradores, (1990) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 87:8013-8016; Hertig y colaboradores, (1991) Plant Mol Biol . 16 : 111-114 ; Xu y colaboradores, (1995) Plant Mol . Biol . 27:237-248; Capone y colaboradores, (1994) Plant Mol . Biol . 25:681-691; Masuda y colaboradores, (1999) Plant Cell Physiol . 40 (11) : 1177-81; Luschning y colaboradores, (1998) Genes Dev. 12 (14) : 2175-87; Goddemeier y colaboradores, (1998) Plant Mol . Biol . 36(5) :799-802; y Yamamoto y colaboradores, (1991) Plant Cell 3 (4) : 371-82) . Aunque los promotores específicos de raíz se han caracterizado en varios tipos de plantas, promotores no específicos de raíz del maíz han sido descritos en la literatura. La expresión constitutiva de algunas proteínas heterólogas, tales como insecticidas, conduce a efectos fenotípicos y agronómicos indeseables. La expresión limitada de las proteínas insecticidas, por ejemplo, los tejidos objetivo de la alimentación de insectos (raíz, en este caso), permite a la planta dedicar más energía al crecimiento normal antes que hacia la expresión de la proteina por toda la planta. La utilización de promotores preferidos de raíz, también puede limitar la expresión de la proteina en porciones indeseables de la planta. Sin embargo, muchos de los promotores preferidos de raiz que se han aislado no se dirigen a la expresión de cantidades suficientes de un transgen para la eficacia en plantas. Asi, se necesita el aislamiento y la caracterización de promotores preferidos de tejido, particularmente preferidos de raíz, que pueden dirigir la transcripción de un nivel suficientemente alto de una secuencia de nucleótidos heteróloga deseada. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para regular la expresión de gen en una planta. Las composiciones comprenden secuencias de nucleótidos novedosas para un promotor que inicia la transcripción en una manera preferida de raíz. Más particularmente, se proporcionan las regiones de iniciación de transcripción aisladas del gen de planta CRWAQ81. Además las composiciones de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 y las secuencias de promotor de planta depositadas en hospederos bacterianos como Depósito de Patente No. PTA-5126 y fragmentos de las mismas. Las composiciones de la invención además comprenden secuencias de nucleótidos que tienen por lo menos 80% de identidad de secuencia a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o 2 y que inducen la expresión preferida de raiz de una secuencia de nucleótidos operablemente enlazada. También se incluyen secuencias de nucleótidos que hibridan bajo condiciones severas a ya sea la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 1 o la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 2, secuencias de promotor de planta depositadas en hospederos bacterianos como Depósito de Patente No. PTA-5126, o sus complementos. Las composiciones de la presente invención también incluyen casetes de expresión que comprenden un promotor de la invención operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. La invención además proporciona vectores de expresión, y plantas o células de plantas que tienen establemente incorporado en sus genomas un cásete de expresión mencionado en lo anterior. Adicionalmente, las composiciones incluyen semilla transgénica de tales plantas. Los métodos de la invención comprenden un medio para expresar selectivamente una secuencia de nucleótidos en una raiz de planta, que comprende transformar una célula de planta con un cásete de expresión, y regenerar una planta transformada a partir de la célula de planta, el cásete de expresión que comprende un promotor y una secuencia de nucleótidos heteróloga operablemente enlazada al promotor, en donde el promotor inicia la transcripción preferida de raíz de la secuencia de nucleótidos en una célula de planta. De esta manera, las secuencias de promotor son útiles para controlar la expresión de secuencias de codificación operablemente enlazadas en una manera preferida de raíz. Corriente abajo de y bajo la regulación de iniciación de transcripción del promotor estará una secuencia de interés que proporcionará la modificación del fenotipo de la planta. Tal modificación incluye la modulación de la producción de un producto endógeno, en cuanto a la cantidad, distribución relativa, o los similares, o la producción de un producto ' de expresión exógeno para proporcionar una función útil o producto en la planta. Por ejemplo, está comprendida una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un producto de gen que confiere resistencia a herbicida, sal, sequía, frío, patógeno o insecto. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los resultados de hibridación in situ del patrón de expresión del gen CRWAQ81 en las puntas de raiz de maiz. La Figura IB muestra el análisis de manchado de northern del patrón de expresión específico de tejido del gen CRWAQ81 en plantas de maíz no infestadas, o en plantas de maiz infestadas con huevecillos del Gusano de Raiz de Maíz del Oeste (WCRW) . Las Figuras 2A y B revelan varias características de la secuencia de promotor CRWAQ81 de -3.6 kb (SEQ ID NO: 2) . Las repeticiones en tándem no perfectas están resaltadas. MITE1 es identificado por la secuencia subrayada mientras que las letras cursivas identifican MITE2. La secuencia en negritas y subrayada denota MITE3. El cuadro TATA putativo es indicado por un cuadro. La región 5' no traducida se muestra en letras minúsculas. La SEQ ID NO: 1 que es un fragmento de la secuencia de promotor CR AQ81 se extiende desde el nucleótido 1443 al nucleótido 3583. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las composiciones de la presente invención comprenden secuencias de nucleótidos novedosas para promotores de plantas, particularmente un promotor "preferido de raíz" para el gen CRWAQ81, más particularmente, el promotor CRWAQ81 de maiz. En particular, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden las secuencias de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, secuencias de promotor de plantas depositadas en hospederos bacterianos como Depósito de Patente No. PTA-5126, y fragmentos, variantes y complementos de las mismas. Los plásmidos que contienen las secuencias de nucleótidos de promotor de plantas de la invención se depositaron con el Depositario de Patentes de la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC) , Manassas, Virginia, el 4 de abril del 2003, y se asignó al Depósito de Patente No.

PTA-5126. Este depósito será mantenido bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente. Este depósito se hizo meramente como una conveniencia para aquellos de habilidad en la técnica y no es una admisión de que un depósito sea requerido bajo 35 U.S.C. §112. Las secuencias de promotor de la invención son útiles para expresar secuencias de nucleótidos operablemente enlazadas en una manera preferida de tejido, particularmente preferido de raiz. Las secuencias de la invención también encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la transformación subsecuente en plantas de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes similares a CRWAQ81, como marcadores moleculares y los similares. El promotor CRWAQ81 de la invención se aisló de la región 5' no traducida que flanquea el sitio de iniciación de transcripción CRWAQ81. El método específico utilizado para obtener el promotor CRWAQ81 de la presente invención se describe en el Ejemplo 5 después. Los artículos "un" y "una" se utilizan en la presente para referirse a más de uno (es decir, por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. La invención comprende composiciones de ácido nucleico aisladas o sustancialmente purificadas. Una molécula de ácido nucleico "aisladas" o "sustancialmente purificadas" o porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se producen mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetizan químicamente. Óptimamente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (óptimamente secuencias de codificación de proteína) que naturalmente flanquean el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el DNA genómico del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de secuencias de nucleótidos que naturalmente flanquean la molécula de ácido nucleico en el DNA genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico. Las composiciones de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden las secuencias de nucleótidos de promotor expuestas en la SEQ ID NOS: 1 y 2. Por "promotor" se propone que significa una región regulatoria del DNA que usualmente comprende un cuadro de TATA para dirigir la RNA polimerasa II para iniciar la síntesis de RNA en el sitio de iniciación de transcripción apropiado para una secuencia de codificación particular. Un promotor adicionalmente puede comprender otras secuencias de reconocimiento generalmente ubicadas corriente arriba o 5' al cuadro TATA, referido como elementos de promotor corriente arriba, que influyen en la proporción de iniciación de transcripción. Se reconoce que habiéndose identificado la secuencia de nucleótidos para las regiones de promotor divulgadas en la presente, está dentro del estado de la técnica aislar e identificar elementos regulatorios adicionales en la región 5' no traducida corriente arriba de las regiones de promotor particular identificadas en la presente. Asi, por ejemplo, las regiones de promotor divulgadas en la presente además pueden comprender elementos regulatorios corriente arriba tales como aquellos responsables para la expresión en tejido y temporal de la secuencia de codificación, aumentadores y los similares. Ver particularmente, la Patente Australiana No. AU-A-77751/94 y las patentes norteamericanas Nos. 5,466,785 y 5,635,618. De la misma manera, los elementos de promotor que permiten la expresión en el tejido deseado tal como la raiz, pueden ser identificados, aislados y utilizados con otros promotores de núcleo para conseguir la expresión preferida de raiz. En este aspecto de la invención un, "promotor de núcleo" es un promotor sin elementos de promotor. La región de promotor de núcleo contiene un cuadro TATA y frecuentemente un elemento iniciador así como el sitio de iniciación. La longitud precisa de la región del promotor de núcleo no está fijada pero usualmente es fácilmente reconocible. Tal región normalmente está presente, con algo de variación, en la mayoría de los promotores. Las secuencias de base que yacen entre los diversos elementos bien caracterizados se presentan que son de menor importancia. La región de promotor de núcleo es frecuentemente referida como una región de promotor mínima debido a que es funcional en si misma para promover un nivel basado en transcripción. Las secuencias de promotor preferidas de raíz de maíz de la presente invención, cuando se ensamblan dentro de una construcción de DNA tal que el promotor está operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos de interés, permite la expresión de la secuencia de nucleótidos en las células de una planta establemente transformadas con esta construcción de DNA.. "Operablemente enlazado" se propone para dar a entender un enlace funcional entre dos o más elementos. Por ejemplo, un enlace operable entre un promotor de la presente invención y un nucleótido heterólogo de interés es un enlace funcional que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. Los elementos operablemente enlazados pueden estar contiguos o no contiguos. Cuando se utiliza para referirse a la unión de dos regiones de codificación de proteina, por operablemente enlazado se propone que las regiones de codificación están en el mismo cuadro de lectura. El cásete adicionalmente puede contener por lo menos un gen adicional para ser cotransformado en el organismo. Alternativamente, el (los) gen (es) adicional (es) puede (n) ser proporcionado (s) en múltiples casetes de expresión. Tal cásete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para la inserción de la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés que está bajo la regulación de transcripción de las regiones regulatorias. El cásete de expresión adicionalmente puede contener genes marcadores seleccionables . De esta manera, las secuencias de nucleótidos para los promotores de la invención se proporcionan en casetes de expresión junto con una secuencia de nucleótidos de interés, típicamente una secuencia de nucleótidos heteróloga, para la expresión en la planta de interés. Por "secuencia de nucleótidos heteróloga" se propone para dar a entender una secuencia que no está de manera natural operablemente enlazada con la secuencia de promotor, incluyendo múltiples copias que ocurren no naturalmente de una secuencia de DNA que ocurre naturalmente. Mientras que esta secuencia de nucleótidos es heteróloga en la secuencia de promotor, esta puede ser homologa, o nativa, o heteróloga o foránea al hospedero de planta. Se reconoce que el promotor también puede inducir la expresión de su secuencia de nucleótidos homologa o nativa. En este caso, la planta transformada tendrá un cambio en el fenotipo. Las secuencias de nucleótidos heterólogas, incluyen pero no están limitadas a, secuencias de codificación insecticidas, secuencias de codificación nematicidas, secuencias de codificación de tolerancia a herbicida, secuencias de codificación antimicrobianas, secuencias de codificación anti-fungales, secuencias de codificación anti-virales, secuencias de codificación de tolerancia al estrés abiótico, secuencias de codificación de calidad nutricional, secuencia de codificación de marcador visible y secuencias de codificación de marcador seleccionable. La expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas puede variar dependiendo del tipo del promotor utilizado. Una categoría de promotores conocida como "promotores específicos del tejido" expresa los genes bajo su control en solamente uno o más tipos de células en órganos específicos, tejidos específicos, o tipos de células específicas. Los promotores específicos de tejido incluyen promotores que son temporalmente regulados, tal como la embriogénesis temprana o tardía, durante la maduración del fruto en el desarrollo de semillas o el fruto, en hoja completamente diferenciada, o en el inicio de la senectud. En contraste, los "promotores constitutivos" se refieren a promotores que son capaces de expresar los genes bajo su control en todos o casi todos los tejidos de planta durante todas o casi todas las etapas de desarrollo de la planta, generando de esta manera la "expresión constitutiva" de los genes. Todavía otro tipo de promotor conocido como un "promotor inducible" es un tipo de promotor regulado que puede ser activado en uno o más tipos de células mediante un estímulo externo, tal como una sustancia química, luz, hormona, estrés o un patógeno. Las secuencias regulatorias de la presente invención, cuando se enlazan operablemente a una secuencia de nucleótido heteróloga de interés y establemente incorporadas en el genoma de la planta induce la expresión "preferida de raiz" de la secuencia de nucleótido heteróloga. Por "preferido de raíz" se propone que la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga es más abundante en la raiz. Por "raíz" se propone que significa cualquier parte de estructura de la raíz, incluyendo pero no limitada a, la cofia, meristema apical, protoderma, meristema del suelo, procambium, endodermos, corteza, corteza vascular, epidermis y los similares. Mientras que algún nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga puede ocurrir en otros tipos de tejido de planta, la expresión ocurre más abundantemente en la raíz, que puede incluir, pero no está limitada a raíces primarias, laterales y adventicias. Las modificaciones de las secuencias de promotor aislado de la presente invención pueden proporcionar un intervalo de expresión para la secuencia de nucleótidos heteróloga. Asi, se pueden modificar para ser promotores débiles o promotores fuertes. Generalmente, por "promotor débil" se propone para dar a entender un promotor que induce la expresión de una secuencia de codificación de interés a un nivel bajo. Por "nivel bajo" se propone para dar a entender que el transcripto para la secuencia de codificación de interés representa aproximadamente 1 de cada 10,000 transcriptos a aproximadamente 1 de cada 500,000 transcriptos que son producidos en la célula en cualquier punto dado en el tiempo. A la inversa, bajo condiciones celulares equivalentes, un promotor fuerte induce la expresión de una secuencia de codificación de interés a un alto nivel, tal que el transcripto para la secuencia de codificación de interés representa aproximadamente 1 de cada 10 transcriptos a aproximadamente 1 de cada 1,000 transcriptos que son producidos en la célula en cualquier punto dado en el tiempo. Alternativamente, se reconoce que los promotores débiles también comprenden promotores que son expresados en solamente unas cuantas células y no en otras para dar un nivel bajo total de expresión en cualquier punto dado en el tiempo. Los fragmentos y variantes de las secuencias de promotor divulgadas también están comprendidos por la presente invención. Por "fragmento" se propone para dar a entender una porción de la secuencia de promotor. Los fragmentos de una secuencia de promotor pueden retener la actividad biológica y por consiguiente ser capaces de inducir la expresión preferida de raíz de una secuencia de nucleótidos operablemente enlazada. Así, por ejemplo, menos de la secuencia de promotor completa divulgada en la presente puede ser utilizada para inducir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés operablemente enlazada, tal como una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína heteróloga. Está dentro de la habilidad en la técnica determinar si tales fragmentos disminuyen los niveles de expresión o alteran la naturaleza de la expresión, es decir, la expresión constitutiva o inducible. Alternativamente, los fragmentos de una secuencia de nucleótido de promotor que son útiles como sondas de hibridación, como es descrito enseguida, generalmente no retienen su actividad regulatoria. Asi, los fragmentos de una secuencia del promotor pueden variar de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos y hasta la secuencia del promotor de longitud completa de la invención. Así, un fragmento de una secuencia de nucleótido de promotor CRWAQ81 puede codificar una porción biológicamente activa del promotor CRWAQ81 o puede ser un fragmento que puede ser utilizado como una sonda de hibridación o cebador de PCR utilizando los métodos divulgados enseguida. Una porción biológicamente activa de un promotor CRWAQ81 se puede preparar al aislar una porción de una de las secuencias de nucleótido de promotor CRWAQ81 de la invención y al estimar la actividad de esa porción del promotor CRWAQ81. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de promotor comprende por lo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1500, 1800, 2000 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en la secuencia de nucleótidos de promotor de longitud completa divulgada en la presente, por ejemplo, 2136 nucleótidos para la SEQ ID NO: 1. Nucleótidos "contiguos" como se utiliza en la presente, se refiere a secuencias de ácido nucleico que están inmediatamente precedentes o después entre sí. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos del promotor CRWAQ81 de longitud completa que son capaces de funcionar como un promotor pueden comprender, por ejemplo, nucleótidos 931 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 936 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 941 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 946 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 951 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 956 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 961 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 971 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 981 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 991 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1001 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1051 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1101 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1151 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1201 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1251 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1301 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1351 a 2113 de la SEO ID NO: 1; nucleótidos 1401 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1451 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1501 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1551 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1601 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1651 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1701 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1751 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1777 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1782 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1787 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1792 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1801 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1851 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1901 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 1951 a 2113 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 931 a 2110 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 931 a 2107 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 931 a 2104 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos 931 a 2100 de la SEQ ID NO: 1.

Los nucleótidos de tales fragmentos usualmente comprenderán la secuencia de reconocimiento TATA de la secuencia de promotor particular. Tales fragmentos pueden ser obtenidos mediante el uso de enzimas de restricción para segmentar la secuencia de nucleótidos de promotor que ocurre naturalmente divulgada en la presente; al sintetizar una secuencia de nucleótidos de la secuencia que ocurre naturalmente en la secuencia de DNA de promotor; o se puede obtener a través del uso de la tecnología de PCR. Ver particularmente, Mullis y colaboradores, (1987) Methods Enzymol . 155:335-350 y Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, New York) . Las variantes de estos fragmentos de promotor, tales como aquellas que resultan de la mutagénesis dirigida al sitio, también están comprendidas por las composiciones de la presente invención. Por "variantes" se propone para dar a entender secuencias que tienen similitud sustancial con una secuencia de promotor divulgado en la presente. Para secuencias de nucleótidos, una variante comprende una supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro de la molécula de ácido nucleico nativa y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en la molécula de ácido nucleico nativa. Como se utiliza en la presente, una molécula de ácido nucleico "nativa" comprende una secuencia de nucleótidos que ocurren naturalmente. Las variantes que ocurren naturalmente tales como éstas pueden ser identificadas con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, con la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación como son resumidas enseguida. Las secuencias de nucleótido variantes también incluyen secuencias de nucleótidos sintéticamente derivadas, tales como aquellas generadas, por ejemplo, al utilizar la mutagénesis dirigida al sitio. Generalmente, las variantes de una secuencia de nucleótidos particular de la invención tendrá por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a aquella secuencia de nucleótidos particular como es determinado por los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte en la presente. Las variantes biológicamente activas también están comprendidas por la presente invención. Las variantes biológicamente activas incluyen, por ejemplo, la secuencia de promotor nativa de la invención que tiene una o más sustituciones, supresiones o inserciones de nucleótidos. La actividad del promotor se puede medir al utilizar técnicas tal como el análisis de manchado de Northern, las mediciones de actividad de reportador tomadas de fusiones de transcripción, y los similares. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) , incorporada en la presente por referencia. Alternativamente, los niveles de un gen reportador tal como la proteína fluorescente verde (GFP) o los similares producidos bajo el control de un fragmento de promotor o variante pueden ser medidos. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,072,050, incorporada en la presente por referencia. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 82:488-492; Kunkel y colaboradores, (1987) Methods in Enzymol . 154:367-382; patente norteamericana No. 4,873,192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techñiques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las referencias citadas en las mismas. Las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser utilizadas para aislar secuencias correspondientes de los organismos, particularmente otras plantas, más particularmente otras monocotiledóneas. De esta manera, los métodos tales como PCR, hibridación y los similares se pueden usar para identificar tales secuencias basadas en su homología de la secuencia a las secuencias expuestas en la presente. Las secuencias aisladas basadas en su identidad de secuencia a la secuencia de promotor CRWAQ81 completa expuesta en la presente o fragmentos de la misma están comprendidas por la presente invención. Así, las moléculas de ácido nucleico aisladas que tienen actividad de promotor y que hibridan bajo condiciones severas a las secuencias de promotor divulgadas en la presente, o variantes o fragmentos de las mismas, están comprendidas por la presente invención. En un procedimiento de PCR, los cebadores de oligonucleótido pueden ser diseñados para el uso en reacciones de PCR para amplificar la secuencia de DNA correspondientes a partir del cDNA o DNA genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y la clonación de PCR son generalmente conocidos en la técnica y son divulgados en Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Ver también Innis y colaboradores, eds. (1990) PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York) . Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero no están limitados a, métodos utilizando cebadores emparejados, cebadores empalmados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector, cebadores parcialmente desigualados, y los similares. En técnicas de hibridación, toda o parte de una secuencia de nucleótidos conocida se utiliza como una sonda que selectivamente hibrida a otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de DNA genómico clonados o fragmentos de cDNA (es decir, librerías genómicas o de cDNA) de un organismo elegido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de DNA genómicos, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA, u otros oligonucleótidos, que pueden ser marcadas con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable. Asi, por ejemplo, las sondas para hibridación se pueden hacer al marcar oligonucleótidos sintéticos basados en las secuencias de promotor CRWAQ81 de la invención. Los métodos para la preparación de sondas para la hibridación y para la construcción de cDNA en librerías genómicas son generalmente conocidos en la técnica son divulgados en Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) . Por ejemplo, las secuencias de promotor CRWAQ81 completas divulgadas en la presente, o una o más porciones de las mismas, se pueden utilizar como una sonda capaz de hibridar específicamente a secuencias de promotor CRWAQ81 correspondientes. Para lograr la hibridación específica de bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias de promotor de CRWAQ81 y son óptimamente de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos en longitud, y más óptimamente por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos en longitud. Tales sondas se pueden utilizar para amplificar secuencias de promotor CRWAQ81 correspondientes a partir de una planta elegida mediante PCR. Esta técnica también puede ser utilizada para aislar secuencias de codificación adicionales a partir de una planta deseada o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en una planta. Las técnicas de hibridación incluyen la clasificación de hibridación de librerías de DNA colocadas en placas (ya sea placas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) . La hibridación de tales secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones severas. Por "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" se proponen condiciones bajo las cuales una sonda hibridará su secuencia objetivo a un grado detectablemente más grande que otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces sobre el antecedente) . Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, las secuencias objetivo que son 100% complementaras a la sonda pueden ser identificados (sondeos homólogos) . Alternativamente, las condiciones de severidad se pueden ajustar para permitir algo de desigualación en las secuencias de modo que grados menores de similitud son detectados (sondeos heterólogos) . Generalmente, una sonda es menor que aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud, óptimamente menor que 500 nucleótidos en longitud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de ion NA, de manera típica aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion NA (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo -menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tal como formamida. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación de una solución reguladora de formamida de 30 al 35%, NaCl 1M, SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio) a 37°C y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3.0M/citrato de trisodio 0.3M) a 50 a 55°C. Las condiciones de severidad moderadas ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45%, NaCl 1.0M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60 °C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluye la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1M, SDS al 1% a 37 °C y un lavado final en 0. IX SSC a 60 a 65°C durante por lo menos aproximadamente 20 minutos. La duración de la hibridación es generalmente menor que aproximadamente 24 horas, de manera usual aproximadamente 40 a aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será por lo menos una duración de tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio. Opcionalmente, soluciones reguladoras de lavado pueden comprender SDS al 0.1% a aproximadamente 1%. La especificidad es típicamente la función de lavados de post-hibridación, los factores críticos que son la intensidad iónica y la temperatura de la solución de lavado final. La Tm (punto de fusión térmico) es la temperatura (bajo intensidad iónica definida y pH) en la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria se hibrida a una sonda perfectamente igualada. Para híbridos de DNA-DNA, la Tm puede ser aproximada de la ecuación de Meinkoth y Walhl (1984) Anal . Biochem. 138:267-284: Tm=81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el DNA, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm se reduce por aproximadamente 1°C por cada 1% de desigualación; asi, la Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm puede ser disminuida a 10°C. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menor que la Tm para la secuencia especifica y su complemento a una intensidad iónica definida y pH. Sin embargo, Las condiciones severamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4°C menor que la Tm; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10°C menor que la Tm; las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20°C menor que la Tm. Utilizando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado, y la Tm deseada, a aquellos de habilidad ordinaria entenderán que son inherentemente descritas variaciones en la severidad y la hibridación y/o las soluciones de lavado. Si el grado deseado de desigualación da por resultado una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), se prefiere incrementar la concentración de SSC de modo que se puede utilizar una temperatura más alta. Una guia extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Technigues in Biochemistry and Molecular Biology-Hibridization wi th Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York) ; y Ausubel y colaboradores, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) . Ver también Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) . Asi, las secuencias aisladas que tienen actividad de promotor preferido de raiz y que hibrida bajo condiciones severas a las secuencias de promotor CRWAQ81 divulgadas en la presente, o fragmentos de las mismas, están comprendidas dentro por la presente invención. Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia de dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia" y (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para la comparación de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de un cDNA de longitud completa o secuencia de gen, o el cDNA completo o secuencia de gen. (b) Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo especificado de una secuencia de polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) comparados con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o más larga. Aquellos expertos en la técnica entienden que para evitar una alta similitud en una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótido una sanción de espacio típicamente se introduce y se sustrae del número de igualaciones. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Así, la determinación del por ciento de identidad de secuencia entre cualquiera de dos secuencias pueden ser realizado utilizando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitativos de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineación local de Smith y colaboradores, (1981) Adv. Appl . Math . 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48:443-453; el método de búsqueda para alineación local de Pearson y Lipman (1988) Proc . Nati . Acad. Sci . 85:2444-2448; y el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90:5873-5877. Las implementaciones en computadora de estos algoritmos matemáticos pueden ser utilizadas para comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no están limitados a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California) , el programa ALIGN (Versión 2.0); el programa ALIGN PLUS (Versión 3.0 copyright 1997); y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Genética de Wisconsin del Grupo de Computadora Genética, Versión 10 (disponible de Accelrys, 9685 Scranton Road, San Diego, CA, 92121, USA) . La matriz de registro utilizada en la Versión 10 del Paquete de Software de Genética de Wisconsin es BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 89:10915) . Las alineaciones utilizando estos programas se pueden realizar utilizando los parámetros de error. El programa CLUSTAL es bien descrito por Higgins y colaboradores, (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins y colaboradores, (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet y colaboradores, (1988) Nucleic Acids Res . 16:10881-90; Huang y colaboradores, (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson y colaboradores, (1994) Meth . Mol . Biol . 24:307-331. Los programas ALIGN y ALIGN PLUS están basados en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra . Una tabla de residuo de ponderación PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12, y una sanción de espacio de 4 se pueden utilizar con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul y colaboradores, (1990) J. Mol . Biol . 215:403 están basados en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra . Las búsquedas de nucleótidos de BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, registro^lOO, longitud de palabra=12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogos a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de la invención. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden realizar con el programa BLAST, registro=50, longitud de palabra=3, para obtener las secuencias de aminoácidos homólogos a una proteina o polipéptido de la invención. Para obtener alineaciones espaciadas para propósitos de comparación, Gapped BLAST (en BLAST 2.0) se pueden utilizar como es descrito en Altschul y colaboradores, (1997) Nucleic Acids Res . 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (en BLAST 2.0) se puede utilizar para realizar una búsqueda iterada que detecta las relaciones distantes entre las moléculas. Ver Altschul y colaboradores, (1997) supra . Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, los parámetros de error de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para las secuencias de nucleótido, BLASTX para proteínas) pueden ser utilizados. Ver el sitio de la red para el Centro Nacional de Información de Biotecnología en la red mundial. La alineación también puede ser realizada manualmente por la inspección. A menos que se establezca de otra manera los valores de identidad/similitud de secuencia de nucleótidos proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando la ponderación GAP de 50 y la Ponderación de Longitud de 3; y el nwsgapdna.cmp scoring matriz; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62; o cualquier programa equivalente del mismo. Por "programa equivalente" se propone que significa cualquier programa de comparación de secuencia que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene igualaciones de residuo de nucleótido de aminoácido idénticas y un porción de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10. El programa GAP utiliza el algoritmo de Neddleman y Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48:443-453, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de igualaciones y minimiza el número de espacios. GAP considera todas las alineaciones posibles y las posiciones de espacio y crea la alineación con el número más grande de bases igualadas y los menores espacios. Esto permite la provisión de una sanción de creación de espacio y una sanción de extensión de espacio en unidades de bases igualadas. GAP debe hacer un aprovechamiento del número de sanción de creación de espacio de igualaciones para cada espacio que este inserta. Si una sanción de extensión de espacio mayor que cero es elegida, GAP debe hacer, además, un aprovechamiento para cada espacio insertado en la longitud de los tiempos de espacio de la sanción de extensión de espacio. Los valores de sanción de creación de espacio de error y los valores de sanción de extensión de espacio en la Versión 10 del Paquete de Software Genetics Wisconsin para las secuencias de proteína son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótido de sanción de creación de espacio de error es 50 mientras que la sanción de extensión de espacio de error es 3. Las sanciones de creación de espacio y de extensión de espacios se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consisten de 0 a 200. Asi, por ejemplo, las sanciones de creación de espacio y extensión de espacio cada una puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más grande. GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Pueden existir muchos miembros de estas familias, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP muestra cuatro cifras de mérito para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. La Relación es la calidad dividida entre el número de bases en el segmento más corto. El por ciento de Identidad es el por ciento de los símbolos que realmente se igualan. El por ciento de Similitud es el por ciento de los símbolos que son similares. Los Símbolos que están a través de los espacios son ignorados. Una similitud es registrada cuando el valor de matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, el umbral de similitud. (c) Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o de polipéptido hacen la referencia a los residuos en las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para la correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza en referencia a proteínas se reconoce que las porciones de residuo que no son idénticas frecuentemente difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde los residuos de aminoácidos son sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Las secuencias que difieren por tales sustituciones conservativas se dice que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Típicamente esto involucra registrar una sustitución conservativa como una desigualación parcial antes que completa, para de esta manera incrementar el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, donde un aminoácido idéntico se le da un registro de 1 y una sustitución no conservativa se le da un registro de cero, una sustitución conservativa se le da un registro entre cero y 1. El registro de sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, como es implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California) . (d) Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa . el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una-ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) como es comparado por la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales el residuo de base de ácido nucleico o aminoácido idéntico ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias de promotor de CRWAQ81 divulgadas en la presente son útiles para la ingeniería genética de plantas, por ejemplo, para la producción de una planta transformada o transgénica, para expresar un fenotipo de interés. Varios cambios en el fenotipo son de interés incluyendo, pero no limitados a, la modificación de la expresión de un gen en una raiz de planta, la alteración de un mecanismo de defensa a patógenos o insectos de la planta, el incremento de la tolerancia de la planta a herbicidas, la alteración de desarrollo de la raíz para responder al estrés ambiental, y los similares. Estos resultados se pueden lograr al proporcionar la expresión de la expresión heteróloga o incrementada de productos endógenos en plantas. Alternativamente, los resultados se pueden lograr al proporcionar una reducción de la exposición de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas, transportadores, cofactores, o que afecta la captación de nutrientes en la planta. Estos cambios dan por- resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada. Como se utiliza en la presente, los términos "planta transformada" y "planta transgénica" se refiere a una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo está establemente integrado dentro del genoma de una planta transgénica o transformada tal que el polinucleótido se pasa a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede ser integrado en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante. Se va a entender que como se utiliza en la presente, el término "transgénico" incluye cualquier célula, línea de célula, callo, tejido, parte de la planta o la planta, el genotipo del cual se ha alterado mediante la presencia de ácido nucleico heterólogo incluyendo aquellos transgénicos inicialmente alterados de esta manera así como aquellos creados por cruzas sexuales o la propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término "transgénico" como se utiliza en la presente, no comprende la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) mediante métodos de reproducción de plantas convencionales o mediante eventos que pueden naturalmente tal como la fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.

Un "evento" transgénico se produce mediante transformación de células de planta con una construcción de DNA heteróloga, incluyendo un cásete de expresión de ácido nucleico que comprende un transgén de interés, la regeneración de una población de plantas que resulta de la inserción del transgen en el genoma de la planta, y la selección de una planta particular caracterizada por la inserción en una localización del genoma particular. Un evento se caracteriza fenotípicamente por' la expresión de transgen. En el nivel genético, un evento es parte de la constitución genética de una planta. El término "eventos" también se refiere a la progenie producida por un cruzamiento sexual entre el transformante y otra variedad que incluye el DNA heterólogo. Como se utiliza en la presente, el término "planta" incluye la referencia a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raices, etc.), semillas, células de planta y progenie de las mismas. Las partes de plantas transgénicas dentro del alcance de la invención, se van a entender que comprenden, por ejemplo, células de plantas, protoplastos, tejidos, callo, embriones, así como flores, tallos, frutos, óvulos, hojas o raíces que se originan en plantas transgénicas o su progenie previamente transformada con una molécula de DNA de la invención, y por lo tanto que consisten de por lo menos en parte de células transgénicas.

Como se utiliza en la presente, el término "célula de planta" incluye, sin limitación, cultivo de suspensión de semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces; retoños, gametofitas, esporofitas, polen y microesporas. La clase de plantas que pueden ser utilizadas en los métodos de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores disponibles para las . técnicas de transformación, incluyendo plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Los genes de interés son reflectivos de los mercados comerciales y los intereses de aquellos involucrados en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y mercados de interés cambian, y como las naciones en desarrollo se abren a los mercados mundiales, nuevos cultivos y tecnologías también emergerán. Además, como el entendimiento de los atributos y características agronómicas tal como la producción y la heterosis se incrementan, la elección de genes para la transformación cambiará por consiguiente. Las categorías generales de genes de interés para la presente invención incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, aquellos genes involucrados en información, tal como las extensiones de Zinc, aquellos involucrados en comunicación, tales como quinasas,' y aquellos involucrados en el mantenimiento, tal como las proteínas de choque térmico. Categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen, pero no están limitados a, genes que codifican proteínas que confieren resistencia al estrés abiótico, tal como sequía, temperatura, salinidad y toxinas tales como pesticidas y herbicidas, o al estrés biótico, tal como los ataques por hongos, virus, bacterias, insectos y nemátodos y el desarrollo de enfermedades asociadas con estos organismos. Es reconocido que cualquier gen de interés puede ser operablemente enlazado a las secuencias de promotor de la invención y expresado en raíces de plantas. Una construcción de DNA que comprende uno de estos genes de interés puede ser utilizada con técnicas de transformación, tales como aquellas descritas enseguida, para crear resistencia a la enfermedad o insectos en fenotipos de plantas susceptibles o para mejorar la resistencia a la enfermedad o insecto en fenotipos de plantas resistentes. Por consiguiente, la invención comprende métodos que se dirigen a proteger .plantas contra patógenos fúngales, bacterias, virus, nemátodos, insectos y los similares. Por "resistencia a la enfermedad" o "resistencia a los insectos" se propone para dar a entender que las plantas evitan los síntomas dañinos que son el efecto de las interacciones de la planta-patógeno. Los genes de resistencia a la enfermedad y resistencia a los insectos tales como lisocimas, cecropinas, maganinas o tioninas para protección antibacteriana, o las proteínas relacionadas con patogénesis (PR) tales como glucanasas y quitinasas para protección antifungal, o endotoxinas de Bacillus thuringiensis, inhibidores de proteasa, colagenasas, lectinas y glicosidasas para controlar nemátodos o insectos todos son ejemplos de productos de gen útiles. Los patógenos de la invención incluyen, pero no están limitados a, virus o viroides, bacterias, insectos, nemátodos, hongos y los similares. Los virus incluyen pero no están limitados al virus de mosaico de tabaco o de pepino, virus de mancha anular, virus de necrosis, virus de mosaico enano de maíz, etc. Los nemátodos incluyen pero no están limitados a nemátodos parasíticos tal como el nudo de raiz, quiste y nemátodos de lesión, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp., y Globodera spp.; miembros particulares de los nemátodos de quiste, incluyen, pero no están limitados a i?eterodera glycines (nematodo de quiste de soya) ; .Heterodera schachtii (nematodo de quiste de remolacha) ; Heterodera avenae (nematodo de quiste de cereal) ; y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodos de quiste de papa) . Los nemátodos de lesión incluyen pero no están limitados a Pratylenchus spp. Los genes que codifican los atributos de resistencia incluyen pero no están limitados a genes de destoxificación, tal como contra fumonisinas (patente norteamericana No. 5,792,931); genes de avirulencia (avr) y de resistencia a enfermedad (R) (Jones y colaboradores, (1944) Science 266:789; Martin y colaboradores, (1993) Science 262:1432; Mindrinos y colaboradores, (1944) Cell 78:1089) ; y los similares. Los atributos de resistencia al herbicida pueden ser introducidos en plantas por genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de acetolactato sintasa (ALS) , en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a tal resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra) , genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) , glifosato (por ejemplo, el gen EPSPS y el gen GAT; ver, por ejemplo, la publicación norteamericana No. 20040082770 y la publicación Internacional No. WO 03/092360) u otros de tales genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica la resistencia a los antibióticos canamicina y geneticina, y el gen ALS codifica la resistencia al herbicida clorosulfurón. Los productos exógenos incluyen enzimas de plantas y productos asi como aquellos de otras fuentes incluyendo procariotas y otras eucariotas. Tales productos incluyen, enzimas, cofactores, hormonas y los similares.

Ejemplos de otros genes aplicables y su fenotipo asociado incluyen, pero no están limitados, al gen que codifica la proteina de recubrimiento viral y/o RNA, u otros genes virales o de plantas que confieren resistencia viral; genes que confieren resistencia fungal; genes que confieren resistencia a los insectos; genes que promueven la mejora del rendimiento; y genes que proporcionan resistencia al estrés, tal como la deshidratación que resulta del calor y salinidad, metal tóxico o elementos menores, o los similares. En otras modalidades de la presente invención, las secuencias de promotor CRWAQ81 están operablemente enlazados a genes de interés que mejoran el crecimiento de la planta o incrementan los rendimientos del cultivo bajo condiciones de alta densidad de plantas. Por ejemplo, el promotor CRWAQ81 de la invención puede ser operablemente enlazado a secuencias de nucleótidos que expresan genes agronómicamente importantes que dan por resultado sistemas de raiz primarios o laterales mejorados. Tales genes incluyen, pero no están limitados a, transportadores de nutrientes/agua e inductores de crecimiento. Ejemplos de tales genes, incluyen pero no están limitados a, H+_ATPasa de - membrana de plasma de maíz (MHA2) (Frías y colaboradores, (1996) Plant Cell 8:1533-44); AKT1, un componente del aparato de captación de potasio en Arabidopsis (Spanding y colaboradores, (1999) J. Gen. Physiol . 113:909-18); genes RML, que activan el ciclo de división celular en las células apicales de raíz (Cheng y colaboradores, (1995) Plant Physiol . 108:881); genes de glutamina sintetasa de maíz (Sukanya y colaboradores, (1994) Plant Mol . Biol . 26:1935-46); y hemoglobina (Duff y colaboradores, (1997) J. Biol . Chem. 27:16749-16752; Arredondo-Peter y colaboradores, (1997) Plant . Physiol , 115:1259-1266; Arredondo-Peter y colaboradores, (1997) Plant Physiol . 114:493-500 y las referencias citadas en las mismas) . La secuencia de promotor CRWAQ81 también pueden ser útiles en expresar secuencias de nucleótidos antisentido de genes que afectan negativamente el desarrollo de la raíz bajo condiciones de alta densidad de plantación. La secuencia de nucleótidos heteróloga operablemente enlazada al promotor CRWAQ81 y secuencias de promotor relacionadas divulgadas en la presente pueden ser una secuencia antisentido para un gen dirigido. Por "secuencia de nucleótido DNA antisentido" se propone para dar a entender una secuencia que está en orientación inversa a la orientación 5' a 3' normal de esa secuencia de nucleótidos. Cuando se suministra en una célula de planta, la expresión de la secuencia de DNA antisentido previene la expresión normal de la secuencia de nucleótidos de DNA para el gen dirigido. La secuencia de nucleótidos antisentido codifica un transcripto de RNA que es complementario a y capaz de hibridar el RNA mensajero endógeno (mRNA) producido por la transcripción de la secuencia de nucleótidos de DNA para el gen dirigido. En este caso, la producción de la proteina nativa codificada por el gen dirigido es inhibida para lograr una respuesta fenotípica deseada. Las modificaciones de las secuencias antisentido se pueden hacer mientras que las secuencias hibridan a, e interfieren con la expresión del mRNA correspondiente. De esta manera, las construcciones antisentido que tienen 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia a las secuencias de antisentido correspondientes pueden ser utilizadas. Además, las porciones de los nucleótidos antisentido pueden ser utilizadas para interrumpir la expresión del gen objetivo. Generalmente, se pueden utilizar secuencias de por lo menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos o más grandes. Asi, las secuencias de promotor divulgadas en la presente pueden estar operablemente enlazadas á la secuencia de DNA antisentido para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en la raíz de la planta. En una modalidad de la invención, los casetes de expresión comprenderán una región de iniciación de transcripción que comprende una de las secuencias de nucleótidos de promotor divulgadas en la presente, o variantes o fragmentos de las mismas, operablemente enlazadas a una secuencia de nucleótidos heteróloga cuya de expresión va a ser controlada por los promotores preferidos de raiz de la invención. Tal cásete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia de nucleótidos que está bajo la regulación de transcripción de las regiones regulatorias. El cásete de expresión adicionalmente puede contener genes marcadores seleccionables . El cásete de expresión incluirá en la dirección 5' a 3' de transcripción, una región de iniciación de transcripción y de traducción (es decir, un promotor preferido de raíz descrito en la presente) , una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés y una región de terminación de transcripción y de transducción (es decir, región de terminación) funcional en plantas. La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de transcripción que comprende la secuencia de nucleótidos del promotor de la presente invención, puede ser nativa con la secuencia de DNA de interés, puede ser nativa con un hospedero de planta, o puede ser derivado de otras fuentes (es decir, foráneo o heterólogo al promotor, la secuencia heteróloga de interés, el hospedero de planta o cualquier combinación de los mismos) . Las regiones de terminación convenientes están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también, Guerineau y colaboradores, (1991) Mol . Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y colaboradores, (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe y colaboradores, (1990) Gene 91:151-158; Bailas y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res . 17:7891-7903 y Joshi y colaboradores, (1987) Nucleic Acid Res . 15:9627-9639. El cásete de expresión que comprende una secuencia de promotor de la presente invención operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos heteróloga también puede contener por lo menos una secuencia de nucleótidos adicional para un gen que es cotransformado en el organismo. Alternativamente, la(s) secuencia (s) adicional (es) se puede (n) proporcionar en otro cásete de expresión. Los casetes de expresión que comprenden una secuencia de promotor de la presente invención adicionalmente pueden contener secuencias guía 5' no traducidas o secuencias 5' de no codificación. Como se utiliza en la presente, "secuencia guía 5 ", "secuencia guía de traducción" o "secuencia 5' de no codificación" se refiere a aquella porción de secuencia de DNA de un gen entre el promotor y la secuencia de codificación que es transcrita en RNA y está presente en el mRNA completamente procesado o corriente abajo (5') del codón de inicio de traducción. Una secuencia guía 5' no traducida es usualmente caracterizada como aquella porción de la molécula de mRNA que más típicamente se extiende desde sitio 5' CAP a el codón de iniciación de traducción de la proteína AUG. La secuencia guía de traducción puede afectar el procesamiento del transcripto primario mRNA, estabilidad de mRNA o la eficiencia de traducción (Turner . y colaboradores, (1995) Molecular Biotechnology 3:225). Asi, las secuencias guias de traducción desempeñan una función importante en la regulación de la expresión de gen. Las guías de traducción son conocidas en la técnica e incluyen pero no están limitadas a: guías de picornavirus, por ejemplo, guía EMCV (región 5' de no codificación de Encefalomiocarditis) (Elroy-Stein y colaboradores, (1989) Proc. Nt . Acad. Sci . USA 86:6126-6130); guías de potivirus, por ejemplo, guía TEV (Virus de Grabado de Tabaco) (Allison y colaboradores, (1986) ) ; guía MDMV (Virus de Mosaico de Maíz Enano) ; proteína de enlace de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak y colaboradores, (1991) Nature 353:90-94); guía no traducida del mRNA de proteína de recubrimiento del virus de mosaico de alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling y colaboradores, (1987) Nature 325:622-625); guía de virus de mosaico de tabaco (TMV) (Gallie y colaboradores (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256) y guía de virus moteado clorótico de maiz (MCMV) (Lommel y colaboradores, (1991) Virology 81:382-385) . Ver también Della-Cioppa y colaboradores, (1987) Plant Physiology 84:965-968. Varias secuencias de intrón se han mostrado que mejoran la expresión, particularmente en células monocotiledóneas. Los intrones del gen Adhl del maiz se han encontrado que mejoran significativamente la expresión del gen de tipo- silvestre bajo su promotor cognado cuando se introduce en células de maíz. El intrón 1 se encontró que es particularmente efectivo y mejoró la expresión en construcciones de fusión con el gen cloranfenicol acétiltransferasa (Callis y colaboradores, (1987) Genes Develop. 1:1183-1200). En el mismo sistema experimental, el intrón del gen bronce 1 de maíz tuvo un efecto similar en mejorar la expresión. El intrón Adhl también se ha mostrado que mejora la expresión de CAT 12 veces (Mascarenhas y colaboradores, (1990) Plant Mol . Biol 6:913-920). Las secuencias de • intrón son incorporadas rutinariamente en vectores de transformación de plantas, típicamente dentro de la guía no traducida. Ver también, Christensen y Quail (1996) Transgenic Res . 5:213-218; Christensen y colaboradores, (1992) Plant Molecular Biology 18:675-689; Kyozuka y colaboradores, (1991) Mol . Gen. Genet . 228:40-48; y Kyozuka y colaboradores, (1990) Maydica 35:353-357. El cásete de expresión que comprende una secuencia de promotor de la presente invención adicionalmente puede contener una secuencia 3' de no codificación. Una "secuencia 3' de no codificación" o "región 3' no traducida" se refiere a una secuencia de nucleótidos localizada 3' (corriente abajo) a una secuencia de codificación e incluye secuencias de señal de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales regulatorias capaces de afectar la adición de tractos de ácido poliadenilico al extremo 3' del precursor de mRNA. Una región 3' no traducida comprende una región del mRNA que generalmente comienza con el codón de terminación de traducción y que se extiende por lo menos más allá del sitio de poliadenilación. Las secuencias no traducidas- localizadas en el extremo 3' de un gen se han encontrado que influyen en los niveles de expresión de gen. Ingelbrecht y. colaboradores, (ver, Plant Cell, 1:671-680, 1989) evaluaron la importancia de estos elementos y encontraron grandes diferencias en la expresión en plantas estables dependiente de la fuente de la región 3' no traducida. Utilizando las regiones 3' no traducidas asociadas con octopina sintasa, proteina de semilla 2S de Arabidopsis, subunidad pequeña de rbcS de Arabidopsis, . extensión de zanahoria y c alcona sintasa de Antirrhinium, se observó una diferencia de 60 veces entre la construcción de mejor expresión (que contuvo la región 3' no traducida de rbcS) y la construcción de más baja expresión (que contuvo la región 3' de chalcona sintasa) . Los niveles de transcripción también se pueden incrementar mediante la utilización de mejoradores en combinación con las regiones de promotor de la invención. Los mejoradores son secuencias de nucleótidos que actúan para incrementar' la expresión de una región de- promotor. Los mejoradores son conocidos en la técnica e incluyen la región mejoradota SV40, el elemento mejorador 35S y los similares. En la preparación del cásete de expresión, los diversos fragmentos de DNA pueden ser manipulados, para proporcionar las secuencias de DNA en la orientación apropiada y, como se ha apropiado en el cuadro de lectura apropiado. Así este fin, adaptadores o enlazadores pueden ser empleados para unir los fragmentos de DNA u otras manipulaciones que pueden ser involucradas para proporcionar sitios de restricción convenientes. Los sitios de restricción pueden ser adicionados o removidos, el DNA superfluo puede ser removido, u otras modificaciones se pueden hacer a las secuencias de la invención. Para este propósito, la mutagénesis in vi tro, reparación del cebador, restricción, templado, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones, pueden estar involucrados. Los genes reportadores o genes marcadores seleccionables pueden ser incluidos en los casetes de expresión. Ejemplos de genes reportadores adecuados conocidos en la técnica se pueden encontrar en, por ejemplo, Jefferson y colaboradores, ' (1991) in Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin y colaboradores, (Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33; DeWet y colaboradores, (1987) Mol . Cell . Biol . 7:725-737; Golff y colaboradores, (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain y colaboradores, (1995) BioTechníques 19:650-655 y Chiu y colaboradores, (1996) Current Biology 6:325-330. Los genes marcadores seleccionables para la selección de células objetivo transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a antibiótico o resistencia a herbicida. Ejemplos de genes marcadores seleccionados adecuados incluyen, pero no están limitados a, genes que codifican la resistencia a cloranfenicol (Herrera Estrella y colaboradores, (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella y colaboradores, (1983) Nature 303:209-213 y Meijer y colaboradores, (1991) Plant Mol . Biol . 16:807-820); higromicina (Waldron y colaboradores, (1985) Plant Mol . Biol . 5:103-108 y Zhijian y colaboradores, (1995) Plant Science 108:219-227); estreptomicina (Jones y colaboradores, (1987) Mol . Gen. Genet . 210:86-91); espectino icina (Bretagne-Sagnard y colaboradores, (1996) Transgenic Res . 5:131-137), bleomicina (Hille y colaboradores, (1990) Plant Mol . Biol . 7:171-176); sulfonamida (Guerineau y colaboradores, (1990) Plant Mol . Biol . 15:127-136); bromoxinilo (Stalker y colaboradores, (1988) Science 242:419-423) ; glifosato (Shaw y colaboradores, (1986) Science 233:478-481 y solicitud de patente norteamericana No. de serie 10/004,357); y fosfinotricina (DeBlock y colaboradores, (1987) EMBO J. 6:2513-2518) . Otros genes que podrían tener utilidad en la recuperación de eventos transgénicos pero que no podrían ser requeridos en el producto final incluirían, pero no limitados a, ejemplos tales como GUS (b-glucoronidasa; Jefferson (1987) Plant Mol . Biol . Rep. 5:387), GFP (proteina de fluorescencia verde; Chalfie y colaboradores, (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs y colaboradores, (1987) Nucleic Acids Res . 15(19): 8115 y Luehrsen y colaboradores, (1992) Methods Enzymol . 216:397-414) y los genes de maíz que codifican para la producción de antocianina (Ludwig y colaboradores, (1990) Science 247:449) . Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención son útiles en métodos dirigidos a expresar una secuencia de nucleótidos en una planta. Esto se puede realizar al transformar una célula de planta de interés con un cásete de expresión que comprende un promotor identificado en la presente, operablemente enlazada a una secuencia de nucleótidos heteróloga, y al regenerar una planta establemente transformada de la célula de planta. Los métodos de la invención también se dirigen a expresar selectivamente una secuencia de nucleótidos en una raiz de planta. Estos métodos comprenden transformar una célula de planta con un cásete de expresión que comprende un promotor identificado en la presente que inicia la transcripción preferida de raíz en una célula de planta, operablemente enlazada a una secuencia de nucleótidos heteróloga, y al regenerar una planta transformada a partir de la célula de planta.

El cásete de expresión que comprende la secuencia de promotor particular de la presente invención operablemente enlazada a una secuencia de nucleótido de interés se puede utilizar para transformar cualquier planta. De esta manera, se pueden obtener plantas genéticamente modificadas, es decir, transgénicas o transformadas, células de plantas, tejido de plantas, semilla, raíz y los similares. La presente invención se puede utilizar para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitada a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no están limitados a maiz ( Zea mays) r Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea) , particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuente de aceite de semilla, alfalfa, (Medicago sativa) , arroz ( Oryza sativa) , centeno ( Sécale cereale) , sorgo ( Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perlado ( Pennisetum glaucum) ) , mijo proso (Panicum miliaceum) , mijo de cola de zorro (Setaria itálica) , mijo de extensión (Eleusine coracana) ) , girasol (Helianthus annuus) , cártamo ( Carthamus tinctorius) , trigo ( Triticum aestivum) , soya ( Glicine max) , tabaco (Nicotiana tabacum) , papa ( Solanum tubero sum) , cacahuates (Arachis hypogaea) , algodón ( Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum) , camote ( Ipomoea batatus) , cassava (Manihot esculenta) , café ( Coffea spp.), coco (Cocos nucífera) , pina (Ananas comosus) , árboles cítricos ( Ci trus spp.), cacao (Theobroma cacao), té ( Camellia sinensis) , plátano (Musa spp.), aguacate ( Persea americana) , higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifera indica) , olivo ( Olea europaea) , papaya ( Carica papaya) , anocardo (Anacardium occidentale) , macadamia (Macadamia integrifolia) , almendra ( Prunus amygdalus) , remolacha (Beta vulgaris) , caña de azúcar ( Saccharum spp.), avena, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coniferas. Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon esculentum) , lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa) , habichuelas ( Phaseolus vulgaris) , habas (Phaseolus limensis) , frijoles (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis tal como pepino (C. sativus) , cantalupo (C. cantalupensis) y melón ( C. meló) . Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hidrangea (Macrophylla hydrangea) , hibiscus (Hibiscus rosasanensis) , rosas (Rosa spp.), tulipanes ( Tulipa spp.), narcisos atrompetados (Narcissus spp.), petunias (Petunia hibrida) , clavel (Dianthus caryophyllus) , pastura roja (Euphorbia pulcherrima) , y crisantemo. Las coniferas que pueden ser empleadas en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tal como el pino de incienso (Pinus taeda) , pino de tala (Pinus elliotii) , pino ponderosa (Pinus ponderosa) , pino de construcción (Pinus contorta) y pino Monterrey (Pinus radiata) ; abeto Douglas (Pseudotsuga menziesií) , pinabete del oeste ( Tsuga canadensis) ; abeto Sitka (Picea glauca) ; madera roja (Sequoia sempervirens) ; abetos naturales tal como el abeto plateado (Aies amabilis) y abeto de bálsamo (Abies ¿alsamea) ; y cedros tal como el cedro rojo del Occidente ( Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska ( Chamaecyparis nootkatensis) . Óptimamente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maiz, alfalfa, girasol, Brassica , soya, algodón, cártamo, cacahuate, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.), más óptimamente plantas de maíz y soya, todavía más óptimamente plantas de maíz. Esta invención es particularmente adecuada para cualquier miembro de la familia de plantas monocotiledóneas incluyendo, pero no limitado a, maíz, arroz, cebada, avenas, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, pina, camotes, cebolla, plátano, coco y dátiles. Como se utiliza en la presente, "vector" se refiere a una molécula de DNA tal como un plásmido, cósmido, o fago bacteriano para introducir una construcción de nucleótidos, por ejemplo, un cásete de expresión, en una célula hospedera. Los vectores de clonación típicamente contienen uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción en el cual las secuencias de DNA foráneas pueden ser insertadas en un aspecto determinable sin la pérdida de la función biológica esencial del vector, así como un gen marcador que es adecuado para el uso en la identificación y la selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores típicamente incluyen genes que proporcionan resistencia a tetraciclina, resistencia a higromicina, resistencia a ampicilina o resistencia a glifosato. Los métodos de la invención involucran la introducción de una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducción" se propone para dar a entender que se presenta a la planta la construcción de nucleótidos de tal manera que la construcción gana acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no dependen de un método particular para introducir una construcción de nucleótidos a una planta, solamente que la construcción de nucleótidos gane acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Los métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas son conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transiente, y métodos mediados por virus. Por "transformación transiente" se propone para dar a entender que una construcción de nucleótidos introducidos en una planta no se integra en el genoma de la planta. Por "transformación estable" se propone para dar a entender que la construcción de nucleótidos introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredada por la progenie de la misma. Por plantas transgénicas "transformantes primarias" y "generación TO" que son de la misma generación genética como el tejido que fue inicialmente transformado (es decir, que no ha tenido a través de la meiosis y la fertilización desde la transformación) se proponen. Los "Transformantes secundarios" y las "TI, T2, T3 y generaciones subsecuentes" se refieren a plantas transgénicas derivadas de transformantes primarios a través de uno o más ciclos eióticos y de fertilización. Ellos pueden ser derivados mediante la auto-fertilización de transformantes primarios o secundarios o cruzas de transformantes primarios o secundarios con otras plantas transformadas o no transformadas. Las construcciones de nucleótido de la invención se pueden introducir en plantas al poner en contacto las plantas con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, tales métodos se involucran en la incorporación de una construcción de nucleótidos de la invención dentro de una molécula de DNA o RNA viral. Los métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas y que expresa una proteina codificada en las mismas, que involucran moléculas de DNA o RNA virales, son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367 y 5,316,931; incorporadas en la presente por referencia. Los protocolos de transformación asi como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para la transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótido en células de plantas y la inserción subsecuente en el genoma de la planta incluye microinyección (Crossway y colaboradores, (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs y colaboradores, (1986) Proc . Ntl . Acad. Sci . USA 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (patentes norteamericanas Nos. 5,981,840 y 5,563,055), transferencia de gen directa (Paszkowski y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración de partícula balística (ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; y 5,932,782; Tomes y colaboradores, (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Micropojectile Bombardment", in Plant Cell , Tissue, and Organ Cultura : Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlin) ; McCabe y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:923-926) y la transformación Lecl (WO 00/28058) . También ver Wissinger y colaboradores, (1988) Ann. Rev. Genet . 22:421-477; Sanford y colaboradores, (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou y colaboradores, (1988) Plant Physiol . 87:671-674 (soya); McCabe y colaboradores, (1988) Bio /Technology 6:923- 926 (soya) ; Finer y, McMullen In Vitro Cell Dev. Biol 271P:175-182 (soya); Singh y colaboradores, (1988) Theor. Appl . Genet . 96:319-324 (soya); Datta y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein y colaboradores, (1988) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 85:4305-4309 (maíz); Klein y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:559-563 (maiz) ; Tomes, patente norteamericana No. 5,240,855; Buising y colaboradores, patentes norteamericanas Nos. 5,322,783 y 5,324,646; Klein y colaboradores, (1988) Plant Physiol . 91:440-444 (maíz), Fromm y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren y colaboradores, (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen y colaboradores, patente norteamericana No. 5,736,369 (cereales); Bytebier y colaboradores, (1987) Proc. Nati .

Acad. Sci . USA 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet y colaboradores, (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Ed. Chapman y colaboradores, (Longman, New York) , pp. 197-209 (polen) ; Kaeppler y colaboradores, (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler y colaboradores, (1992) Theor. Appl . Genet . 84:560-566 (transformación mediada por whisker) ; D'Halluin y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li y colaboradores, (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda y colaboradores, (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz por la vía de Agrobacterium turne faciens) ; todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. En modalidades específicas, la secuencia heteróloga de interés puede ser proporcionada en una planta utilizando una variedad de métodos de transformación transientes. Tales métodos de transformación transientes incluyen, pero no están limitados a, la introducción de la proteína heteróloga o variantes y fragmentos de la misma directamente de la planta o la introducción de un transcripto heterólogo en la planta. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la microinyección o bombardeo de partículas. Ver, Por ejemplo, Crossway y colaboradores, (1986) Mol Gen. Genet . 202:179-185; Nomura y colaboradores, (1986) Plant Sci . 44:53-58; Hepler y colaboradores, (1994) Proc. Nati . Acad. Sci . 91:2176-2180 y Hush y colaboradores, (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Alternativamente, el polinucleótido heterólogo de interés puede ser transientemente transformado en la planta utilizando técnicas conocidas en el arte. Tales técnicas incluyen el sistema de vector viral y la precipitación del polinucleótido de una manera que evita la liberación subsecuente del DNA. Asi, la transcripción del DNA enlazada a partícula puede ocurrir, pero la frecuencia con la cual es liberado para llegar a ser integrado en el genoma es grandemente reducida. Tales métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEÍ; Sigma #P3143) . Métodos son conocidos en la técnica para la inserción dirigida de un polinucleótido a una ubicación específica en el genoma de la planta. En una modalidad, la inserción del polinucleótido de interés en una ubicación única deseada se logra utilizando un sistema de recombinación específico del sitio. Ver, por ejemplo, W099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Brevemente, el polinucleótido heterólogo de interés puede estar contenido en un cásete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos . El cásete de transferencia se introduce en la planta que tiene establemente incorporado en su genoma un sitio objetivo que es flanqueado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos que corresponden a los sitios del cásete de transferencia. Se proporciona una recombinasa apropiada y el cásete de transferencia se integra en el sitio objetivo. El polinucleótido de interés es de esta manera integrado en un sitio cromosómico específico en el genoma de la planta. Las células que se han transformado pueden ser cultivadas en plantas de acuerdo con maneras convencionales . Ver, por ejemplo, McCormick y colaboradores, (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas luego pueden ser cultivadas, ya sea polinizada, con la misma cepa transformada o diferentes cepas y el híbrido resultante que tiene expresión preferida de raíz de la característica fenotípica deseada identificada. Dos o más generaciones pueden ser cultivadas para asegurar que la expresión preferida de raiz de la característica fenotípica deseada sea aisladamente mantenida y heredada y luego las semillas cosechadas para asegurar la expresión preferida de raíz de la característica fenotípica deseada que se ha logrado. Asi como se utiliza en la presente, "semillas transformadas" se refiere a semillas que contienen la construcción de nucleótidos establemente integrada en el genoma de la planta. Varios métodos están disponibles para estimar la actividad del promotor utilizando los métodos de transformación tanto transiente como estable. Los casetes de expresión pueden ser construidos con un marcador tal como un marcador visible. Utilizando métodos de transformación tal como el bombardeo de microproyectiles, transformación por Agrobacterium o transformación de protoplasto, los casetes de expresión se suministran a las células o tejidos de planta. La actividad del gen reportador, tal como la actividad de ß-glucoronidasa, actividad de luciferasa o florescencia de GFP se monitorea a través del tiempo después de la transformación, por ejemplo 2 horas, 5 horas, 8 horas, 16 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas y 72 horas después del suministro de DNA utilizando métodos bien conocidos en la técnica. La actividad del gen reportador puede ser monitoreada mediante actividad enzimática, al manchar células o tejidos con sustrato para la enzima codificada por el gen reportador o mediante la visualización directa bajo una longitud de onda de luz apropiada. La secuencia de promotor de longitud completa, supresiones y mutaciones de la secuencia de promotor pueden ser analizadas y sus niveles de expresión comparados. Adicionalmente, los niveles de RNA pueden ser medidos utilizando métodos bien conocidos en la técnica, tal como, manchado de Northern, los ensayos de PCR de transcriptasa inversa y protección de RNAsa competitivos. Estos ensayos miden al nivel de expresión de un promotor al medir la concentración de "estado permanente" de un mRNA reportador transcrito estándar. Esta medición es indirecta puesto que la concentración del mRNA reportador es dependiente no solamente de su proporción de síntesis, sino también de la proporción en la cual se degrada el mRNA. Por lo tanto, el nivel de estado permanente es el producto de las proporciones de síntesis y proporciones de degradación. La proporción de degradación puede ser considerada, sin embargo, que procede a una proporción fija cuando las secuencias transcritas son idénticas, y de esta manera su valor puede servir como una medición de las proporciones de síntesis.

La confirmación adicional de la actividad del promotor se obtiene mediante la transformación estable del promotor en un cásete de expresión que comprende un marcador visible o gen de interés en una planta como es descrito en lo anterior. Utilizando los diversos métodos descritos anteriormente tal como los ensayos de actividad enzimática, análisis de RNA y ensayos de proteína, la actividad del promotor se puede monitorear sobre el desarrollo, y adicionalmente monitorear en diferentes tejidos en los transformantes primarios y a través de generaciones subsecuentes de plantas transgénicas. La invención proporciona composiciones para clasificar compuestos que modulan la expresión dentro de raíces de embriones y plantas y dentro de nodulos de raices. Los vectores, células y plantas se pueden utilizar para clasificar moléculas candidatas para agonistas y antagonistas del promotor CRWAQ81. Por ejemplo, un gen reportador puede ser operablemente enlazado a un promotor CRWAQ81 y expresado como un transgen en una planta. Los compuestos a ser probados se adicionan y la expresión del gen reportador se mide para determinar el efecto sobre la actividad del promotor. Por toda la especificación la palabra "que comprende" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" será entendido que implica la inclusión del elemento establecido, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación. EJEMPLOS Ejemplo 1; Identificación del EST, CRWAQ81 El residuo de secuencia expresado (EST) nombrado CRWAQ81 primero se identificó utilizando un programa de análisis de secuencia patentado. Ese programa contuvo un algoritmo que permitió a los ESTs de todas las librerías de maiz relacionadas con maíz patentadas ser comparado con los ESTs de todas las librerías de maíz no de raíz patentadas. Los ESTs, o agrupamientos de ESTs sobrepuestos referidos como contiguos, que se regresaron por el programa, se identificaron como preferidos de la raiz o potencialmente específicos de la raiz. El EST nombrado CRWAQ81 se identificó en un contiguo preferido de raíz comprendido de 13 ESTs únicos, 11 de los cuales fueron de librerías de raíz. Ocho de esos 11 fueron de una librería de raíz sintetizada de plántulas de terminación de 2-3 días de edad y las 3 restantes fueron de una librería de raíz generada de plantas en etapa V5 (plantas en etapa V5 que tienen 5 hojas con collar) infestadas con el gusano de raiz de maiz del occidente (WCRW) . Los 2 ESTs no de raíz fueron de librerías de retoños hechos de plántulas de 2-3 días de edad. El EST CRWAQ81 se seleccionó para caracterización adicional debido a que comprendió casi aproximadamente 78bp de los 703 bp contiguos. La evidencia adicional de que el EST CRWAQ81 es preferido de raíz se obtuvo utilizando la tecnología de Secuenciación de Signatura Masivamente Paralela (MPSS) (ver, Brenner y colaboradores (2000) Nature Biotechnlogy 18:630-634 y Brenner y colaboradores (2000) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 97:1665-1670). Esta tecnología involucra la generación de 17 residuos de signatura de base a partir de las muestras de mR?A que se han transcrito inversamente. Los residuos son simultáneamente secuenciados y asignados a los genes o ESTs. La abundancia de estos residuos da un valor numérico que es normalizado a partes por millón (PPM) que luego permite la expresión del residuo, o abundancia del residuo, que se ha comparado a través de tejidos diferentes. Asi, la plataforma de MPSS se puede utilizar para determinar el patrón de expresión de un gen particular y su nivel de expresión en diferentes tejidos. La secuencia del EST CRWAQ81 se introdujo en la base de datos de MPSS y el residuo de signaturas se identificó iniciando aproximadamente 247 bases corriente arriba del sitio poli (A) . El residuo se encontró que está en librerías de raiz en niveles que promedian un PPM ajustado de 2126. Este nivel es comparable al gen ubicuitin de maíz, que tiene un valor de PPM ajustado de 2916. El gen de ubicuitin de maíz, se considera que es un gen altamente expresado y por lo tanto se utilizó como una referencia para comparar los niveles de expresión. Estos resultados también indicaron que el EST CRWAQ81 es preferido de raíz. El residuo para CRWAQ81 se encontró en 2 librerías no de raíz en la base de datos de MPSS, específicamente una librería de endosperma a un PPM ajustado de 3, y una librería de hoja a un PPM ajustado de 5. Estos valores de PPM indicaron que el nivel de expresión en estos tejidos fue esencialmente como el antecedente. Estos datos indicaron que el gen para CRWAQ81 es preferido de raiz y expresado a niveles relativamente altos. Ejemplo 2: El CRWAQ81 no es Regulado Hacia Abajo mediante la alimentación de WCRW Una característica importante de un promotor que dirige la expresión de un gen insecticida es que este no es regulado hacia abajo mediante la alimentación de insectos. Para el gen CRWAQ81, la regulación hacia abajo en respuesta a la alimentación de WCRW se probó. Para la prueba, cRNA fluorescentemente marcado se generó a partir de hojas, tallos, raíces nodales y raíces laterales de plantas en etapa V6 (las plantas en etapa V6 tienen 6 hojas con collar) y se híbrido a un chip de microarreglo de DNA Affymetrix® que contiene unas sondas de oligonucleótido del EST CRWAQ81.

Los resultados indicaron que, en plantas no infestadas, CRWAQ81 se expresó a niveles 240 veces más alto en raíces laterales que en las hojas. El gen también se expresó a niveles de 240 veces más grande en raíces laterales que en los tallos. Estos resultados indicaron que el gen CRWAQ81 se expresa en altos niveles en tejidos de raíz, pero no en el tejido de hoja o de tallo. La comparación de las raíces laterales a las raíces nodales mostró una diferencia de menos de dos veces en la expresión del gen CRWAQ81. Asi, entre los dos tipos de raiz, no hay virtualmente diferencia en el nivel de expresión del gen CRWAQ81. Cuando los tejidos se comparan entre plantas infestadas con WCRW y no infestadas, virtualmente no se encontraron diferencias en los niveles de expresión de CRWAQ81. En particular, una diferencia menor que dos veces la expresión se detectó entre las raíces de plantas infestadas con WCRW y las raices de plantas no infestadas. Estos resultados fueron sustentados por la plataforma de MPSS, que mostró que hubo solamente una diferencia del 25% en los niveles de expresión de CRWAQ81 entre las raices de plantas infestadas con WCRS y plantas no infestadas. Asi, estos datos indican que el gen para el CRWAQ81 no es significativamente regulado hacia abajo mediante la alimentación de WCRW y permanece a un nivel de expresión alto. Materiales y Métodos Plantas de maíz de la línea B73 se cultivaron bajo condiciones de invernadero a la etapa V6 (6 hojas con collar). Las hojas (hoja V6) , tallo (pedúnculo) raíces nodales alargadas, y raíces laterales adventicias se cosecharon de plantas infestadas con WCRW y no infestadas. Para las plantas infestadas con WCRW, los huevecillos de WCRW se aplicaron a una proporción de 50 por planta. Este nivel de infestación produjo raíces que fueron dañadas y deterioradas, pero no diezmadas. El RNA se extrajo de aproximadamente 200 mg del tejido utilisando el reactivo Trizol® (Invitrogen, Carlsbad, CA) . PoliA+RNA (-1.0 µg) se aisló utilizando el Sistema de Aislamiento de RNA IV PoliATtract® (Promega, Madison, Wl) . El cDNA de doble hebra se sintetizó utilizando el Sistema de Plásmido SuperScript™ II (Invitrogen) . La marcación de la transcripción in vitro del cRNA de ribonucleótidos conjugados con biotina se realizó con el equipo MEGAscript® T7 (Ambion, Inc., Austin, TX) seguido por el mini protocolo de RNeasy® de QIAGEN, Inc. (Valencia, CA) para la limpieza de RNA. El cRNA resultante se fragmentó y se hibridó durante 16 horas a un arreglo de GeneChip® adaptado de oligonucleótidos de Zea mays, luego se lavó y se manchó con estreptavidina, conjugado de R-ficoeritrina, utilizando el Affymetrix® GeneChip Fluidics Station. El Escáner de Arreglo de Gen Hewlett-Packard G2500A y el software del Sitio de Análisis GeneChip Affymetrix® se utilizaron para analizar los resultados. Ejemplo 3: Análisis de Northern de la Expresión de CRWAQ81 El análisis de manchado de Northern se realizó para demostrar adicionalmente la preferencia de expresión espacial para el gen CRWAQ81. El RNA derivado de hojas y mazorcas completas de plantas de maiz B73 en etapa Rl (la etapa Rl es identificada por la calda de polen/maduración) se sometió a electroforesis y se manchó con RNA de las hojas, tallo, raices laterales y nodales de las plantas de maiz B73 en etapa V6 infestadas con WCRW no infestadas. La mancha se hibridó con sondas sintetizadas de EST CRWAQ81. No se observó hibridación en las franjas que contiene RNA de hoja de la etapa Rl o plantas en etapa V6 infestadas con WCRW no infestadas. De manera similar, no se observó hibridación en las franjas que contiene RNA de las mazorcas en etapa Rl o tallos en etapa V6. La hibridación fuerte solamente fue detectada en franjas que contiene RNA del tejido de raiz. Este fue independiente de si las raíces se muestrearon de las plantas infestadas con WCRW o no infestadas . Estos resultados proporcionan evidencia adicional que el gen CRWAQ81 es expresado a un alto nivel, es preferido de raíz y no es regulado hacia abajo o mediante la alimentación de WCRW. Materiales y Métodos Plantas de maíz de la línea, B73, se cultivaron bajo condiciones de invernadero a la etapa Rl (caída de polen/maduración). Las hojas (hoja #11), mazorcas completas (incluyendo farfolla, parte sedosa y pedúnculo) y espiguillas completas (incluyendo anteras/polen) se cosecharon. Las plantas B73 también se cultivaron a la etapa V6, se infestaron con WCRW y se muestrearon como es descrito en el Ejemplo 2. Las plantas en etapa V6 infestadas también se muestrearon, como es descrito en el Ejemplo 2. El RNA se extrajo de los diferentes tejidos utilizando el reactivo Trizol® (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las muestras de RNA se sometieron a electroforesis a través de un gel de formaldehido estándar. Después, el gel se lavó dos veces en 20X SSC durante un total de 15 minutos, luego se mancharon a una membrana de nylon durante la noche en 10X SSC. La membrana fue reticulada con luz UV durante 2 minutos. La prehibridación de la mancha totalizó 2 horas en 42 °C en 5X SSC, reactivo de Bloqueo al 2% para la hibridación de ácido nucleico, N-laurilsarcosina al 0.1%, SDS al 7%, Formamida al 50% (ULTRAhyb®, Ambion, Austin, TX) . Las sondas de DNA de una sola hebra se hicieron a partir del EST CRWAQ81 mediante PCR. 50 ng de sonda desnaturalizada se adicionó por 1 ml de solución ULTRAhyb®. La hibridación se dejó proceder durante la noche a 42 °C en 10 ml de solución. Al siguiente día la membrana se lavó dos veces en solución de lavado 2X (2X SSC que contiene SDS al 0.1%) a temperatura ambiente durante 15 minutos, y luego se lavó dos veces en solución de lavado 0.5X (0.5X SSC que contiene SDS al 0.1%) a 65°C durante 15 minutos) . La visualización de los transcriptos CRWAQ81 se realizó utilizando el Genios System de Boehringer Mannheim.

Brevemente la membrana se equilibró en Solución Reguladora 1 (Acido Maleico 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5) durante 1 minuto, luego se colocó en la solución de bloqueo (reactivo de Bloqueo al 1% para la hibridación de ácido nucleico en Solución Reguladora 1) durante 1 hora. La membrana se incubó en fosfato anti-DIG-alcalino diluido 1:10,000 en solución de bloqueo durante 30 minutos y se lavó 2 veces en Solución Reguladora 1 para un total de 15 minutos. Después del equilibrio en Solución Reguladora 3 (Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM, pH 9.5) durante 2 minutos, 20 gotas de CSPD (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, catálogo no. 1755633) se aplicaron a la membrana. Esto se cubrió con un protector de página de plástico y se expuso a la película de rayos X durante la noche . Ejemplo 4: Hibridación In si tu Los experimentos de hibridación de RNA In situ se realizaron de acuerdo con el protocolo expuesto en Di Laurenzio y colaboradores (1996) Cell 86:423-433, para determinar el patrón de expresión especifico de célula del gen CRWAQ81 en las puntas de raíz de maíz. Los experimentos de hibridación se realizaron por duplicado utilizando raíces primarias incrustadas de plántulas de maiz cultivadas en papel de germinación. Una sonda antisentido y una sonda de sentido se generaron a partir del clon EST, CRWAQ81, utilizando un procedimiento basado en PCR. La hibridación con las sondas antisentido del EST CRWAQ81 indicó que el gen es casi ubicuitamente expresado en las puntas de raíz de maíz. La señal se detectó en la epidermis, corteza, endodermis y el cilindro central (tejido de periciclo y vascular) . La señal no se detectó en la cofia, incluyendo la columela. Las sondas de sentido del EST CRWAQ81 produjeron un patrón de hibridación similar. Mientras que la intensidad de la señal fue relativamente alta, el nivel fue menor que el observado con la sonda antisentido. Ejemplo 5: Aislamiento del Promotor para el Gen CRWAQ81 El análisis del gen CRWAQ81 indicó que se expresó en altos niveles y de una manera preferida de raiz. Asi, el promotor CRWAQ81 podría ser usado para dirigir niveles altos de expresión en las raíces del maíz transgénico. Un fragmento de DNA de -2.1 kb (SEQ ID NO:l) y un fragmento de DNA -3.6 kb (SEQ ID NO: 2) de la secuencia 5' flanqueante se aisló utilizando una combinación de TAIL PCR (Liu y colaboradores (1995) Plant J. 8:457-463) y la PCR mediada por ligación (Universal Geno e Walter kit, Clontech) . Para definir el extremo 3' putativo del promotor, 5' RACE se realizó, de acuerdo con el protocolo del fabricante. El análisis de secuencia de los productos RACE reveló un sitio de inicio de transcripción individual a aproximadamente 34 bp corriente arriba de la región de codificación CRWAQ81 putativa. Esto fue corroborado por la posición de una señal TATA putativa (TATAAAAT) localizada en -25 bp con relación al sitio de inicio de transcripción. El análisis adicional de la secuencia 5' flanqueante reveló 2 repeticiones en tándem imperfectas grandes . La repetición más próxima al sitio de inicio de transcripción, designada como Repetición A2, está localizada en -500 bp con relación al sitio de inicio y es de aproximadamente 745 bp en longitud. La repetición distal al sitio de inicio, designada como Repetición Al, está localizada en -1368 bp y de aproximadamente 738 bp en longitud. Localizadas en el promotor CRWAQ81 está en las secuencias con significante similitud a los elementos transposables de repetición invertido de miniaturas (MITEs) . Los MITEs son elementos transposables cortos que varían en tamaño de 125-500 bp que se han encontrado en las regiones de no codificación de los genes de maíz, incluyendo promotores (Wessler y colaboradores (1995) Current Opinión in Genetics & Development 5:814-821). Mientras que la biología de MITE continua siendo estudiada, una escuela de enseñanza presente considera los MITES que desempeñan funciones importantes tal como proporcionar secuencias regulatorias, similar a un cuadro TATA o un sitio de enlace de transcripción, o los similares. De manera interesante, 2 de los MITEs en la región del promotor CRWAQ81 comparten homología a los MITEs encontrados en 2 de otros promotores de maíz. La secuencia MITE más próxima a la región de codificación CRWAQ81 está localizada en -408, con relación al sitio de enlace de transcripción. Este tiene 77% de identidad de nucleótido a una secuencia MITE encontrada en el promotor del P-gen Zea mays (Derwent GeneSeq Acceso No. AAV32438) . Las otras 2 secuencias MITE, designados MITE1 y MITE2, se sobreponen entre si. MITE1 está localizado en -975 y tiene 79% de identidad a una secuencia MITE en el intrón 3 del gen GapC4 de Zea mays (Acceso de GenBank No: X73152) . MITE2, localizado en -948, tiene 65% de identidad a una secuencia MITE en el promotor del gen alfa zeina de 22 kd de maiz (Acceso de GenBank No. X61085) . Ejemplo 6: Actividad promotora de CRWAQ81 Para demostrar que los fragmentos de DNA aislados como la función del promotor CRWAQ81 funcionan como un promotor, se realizó en una serie de ensayos transientes. Estos ensayos proporcionaron una estimación rápida de si el fragmento de DNA probado es capaz de dirigir la expresión del gen. El fragmento del promotor -2.1 kb (SEQ ID NO:l) un componente de la secuencia de promotor -3.6 kb (SEQ ID NO:2), se introdujo en un cásete de expresión que aloja el gen ß-glucoronidasa (GUS) . El bombardeo biolistico del tejido de raiz de plántulas de maiz de 5 días de edad con este cásete de expresión dio por resultado la aparición de puntos azules en el manchado GUS histoquímico. Esto indicó que el fragmento de promotor CRWAQ81 fue capaz de dirigir la expresión del gen. La actividad del promotor además se demostró en ensayos transientes utilizando embriones inmaduros en la transformación mediada por Agrobacteri um de acuerdo con el protocolo expuesto en la patente norteamericana No. 5,981,840. Durante el proceso de cocultivo con Agrobacteríum, la expresión transiente puede ser detectada, aun de algunos promotores preferidos de tejido, por ejemplo de promotores preferidos de raíz. Para el fragmento de promotor CRWAQ81 de -2.1 kb, embriones inmaduros se mancharon para la actividad de GUS después de 2 días y 5 días de cocultivo. En 2 días, no se observó manchado de GUS. Sin embargo, en 5 días bajo niveles de manchado de GUS punteados se observaron en los bordes externos del escutelo que circunda el embrión. Esta actividad del promotor confirmada, como controles negativos careció del manchado en ambos puntos del tiempo. Materiales y Métodos Semillas B73 se colocaron a lo largo de un borde de papel de crecimiento empapado en una solución de sacarosa al 7%. Un pieza adicional de papel de crecimiento idéntico en tamaño al primero también se empapó en sacarosa al 7% y se sobrepuso sobre las semillas. La intercalación de papel de 5 crecimiento-semilla-papel de crecimiento se enrolló subsecuentemente con el borde de la semilla en la parte superior al rollo. El rollo se colocó direccionalmente en un vaso de solución de sacarosa al 7% con las semillas de la parte superior para permitir el crecimiento roto de la raiz. ' 10 Las semillas se dejaron germinar y se desarrollaron durante 2-3 días en la oscuridad a 27-28°C. Antes del bombardeo, la capa de piel externa del cotiledón se removió y las plántulas se colocaron en una caja petri estéril (60 mm) sobre una capa de papel filtro W atman #1 humedecido con 1 ml de H20. Dos 15 plántulas por placa se arreglaron en orientaciones opuestas y se fijaron al papel filtro con una solución de agarosa a 0.5%. Secciones de punta de raíz de 2-3 cm también se extirparon de las plántulas y se arreglaron longitudinalmente en las placas para el bombardeo. 20 Las mezclas de DNA/partícula de oro se prepararon para el bombardeo en el siguiente método. Sesenta mg de partículas de oro de 0.6-1.0 mieras se prelavaron con etanol, se enjuagaron con H20 destilada estéril y se resuspendieron en un total de 1 ml de H20 estéril. Alícuotas de 50 µl de la 25 suspensión de partículas de oro se almacenaron en tubos Eppendorf siliconizados a temperatura ambiente. El DNA se precipitó sobre la superficie de las partículas de oro al combinar, en orden, alícuota de 50 µl de partículas de oro 0.6 µM prelavadas, 5-10 µg de DNA de prueba, 50 µl de CaClc 2.5 M y 25 µl de espermidina 0.1 M. La solución se giró en vórtice inmediatamente durante 3 minutos y se centrifugó brevemente para formar en pelotilla el DNA/particulas de oro. El DNA/oro se lavó una vez con 500 µl de etanol al 100% y se suspendió en un volumen final de 50 µl de etanol al 100%. La solución de DNA/oro se incubó a -20°C durante al menos 60 minutos antes de formar alícuotas de 6 µl de la mezcla de DNA/oro sobre cada macroportador de mylar. Las plántulas preparadas como es indicado en lo anterior y las puntas de raíz extirpadas se bombardearon dos veces utilizando la pistola PDS-1000/He a 1100 psi bajo 27-28 pulgadas de Hg de vacío. La distancia entre el macroportador y la criba de detención estuvo entre 6-8 cm. Las placas se incubaron en recipientes sellados durante 24 h en la oscuridad a 27-28 °C seguido del bombardeo. Después de 18-24 horas de incubación las plántulas bombardeadas y las puntas de raiz se analizaron para la expresión de GUS transiente. Las plántulas y las raíces extirpadas se sumergieron en 10-15 ml de solución reguladora de ensayo que contiene NaH2P04-H20 100 mM (pH 7.0), EDTA 10 mM, K4FE(CN)6-3H20 0.5 mM, Tritón X-100 al 0.1% y 5-bromo-4-cloro-3-indoil glucoronido 2 mM. Los tejidos se incubaron en la oscuridad durante 24 h a 37°C. El reemplazo de la solución de manchado GUS con etanol al 100% detuvo el ensayo. La expresión/manchado de GUS se visualizó bajo un microscopio. Ejemplo 7: Patrón de Expresión de CRWAQ81 Plantas transformadas estables se crearon para permitir una caracterización más detallada de la actividad del promotor, incluyendo el patrón de expresión, nivel de expresión, y regulación temporal del promotor. Callos establemente transformados con los casetes de expresión que contienen el fragmento de promotor CRWAQ81 de -2.1 kb (SEQ ID NO:l) operablemente conectado al gen GUS (abreviado como CRWAQ81GUS) o el fragmento de promotor CRWAQ81 -2.1 kb operablemente enlazado al intrón Adhl y el gen GUS (abreviado como CRWAQ81 (Intrón 1 Adhl ) :GUS) se mancharon histoquimicamente para la actividad de GUS. El intrón Adhl se incluyó para el propósito de la expresión incrementada ya que se ha mostrado que en células de cereales la expresión de genes foráneos es aumentada por la presencia de un intrón en construcciones de gen (Ver, Callis y colaboradores (1987) Genes and Development 1:1183-1200 y Kyozuka y colaboradores (1990) Maydica 35:353-357). Los resultados del manchado histoquímico revelaron un número pequeño de eventos de callo que expresan GUS. La presencia del intrón Adhl incrementó el número de eventos de expresión por un factor de 3. La mayor parte del manchado se localizó en los embriones somáticos, sin embargo, algo del manchado del callo se observó. Estos resultados sustentan los resultados del ensayo transiente y demuestran que el fragmento de promotor CRWAQ81 dirige la expresión del gen en los eventos de callo. La hoja y tejido de raiz de plantas regeneradas que crecen en agar nutriente se analizaron histoquimicamente para la actividad de GUS. Unos cuantos eventos de CRWAQ81:GUS manchados para GUS y la mayoría de los eventos transformados con el CRWAQ81 (intrón 1 Adhl ) vector expresado GUS. Esto indica que el fragmento de promotor CRWAQ81 de -2.1 kb fue activo. En ambos casos, sin embargo, la expresión tendría a ser baja. El patrón de expresión dirigido por el fragmento de promotor CRWAQ81 de -2.1 kb en plantas regeneradas fue principalmente preferido de raiz. Mucho de la expresión fue en las regiones maduras de la raíz (>1 cm desde la punta de la raíz) y se dividió espacialmente entre 2 tipos de expresión: expresión ubicuita en todos los tipos de células y expresión localizada en el cilindro vascular. En la punta de la raíz (el primer centímetro) no se detectó expresión. Ni se detectó expresión en las raices laterales emergentes (<1 cm en longitud) . Los factores tal como la etapa de desarrollo pueden afectar la expresión de este fragmento de promotor. La evidencia para esta hipótesis se sustenta en dos observaciones. Primera, el fragmento de promotor CRWAQ81 de -2.1 kb se presenta que es más activo en plantas de invernadero en la etapa V5 (5 hojas con collar) . De 10 eventos de transformación CRWAQ81:GUS enviados al invernadero para la colocación en maceta en tierra, solamente 3 fueron positivos de GUS en el cultivo de tejido (es decir, crecimiento en agar nutriente) . Cuando las mismas plantas se analizaron en la etapa V5 en el invernadero, 9 de las 10 fueron positivas de GUS. Un fenómeno similar se observó en los eventos de CRWAQ81 (intrón 1 Adhl ) :GUS, pero a un menor grado como la mayoría de las plantas inicialmente enviadas al invernadero para la colocación en macetas en tierra fueron ya positivas de GUS. La expresión incrementada no es probablemente un resultado de la acumulación de GUS incrementada causada por el cambio bajo de la proteina de GUS debido a una búsqueda del experimento en un grupo de plantas CRWAQ81-.GU y CRWAQ81 (intrón 1 Adhl): GUS y la etapa V5, y luego nuevamente en la etapa Rl no mostraron diferencia en el nivel de manchado. Además, un examen de la base de datos Lyns MPSS mostró un incremento incremental en la expresión del gen CRWAQ81 entre la etapa V2 y Rl . Específicamente, el valor de PPM ajustado en la etapa V2 fue 944. En la etapa V6, el valor de PPM ajustado fue de casi 1772 y la etapa Rl el valor de PPM ajustado fue de 2870. Asi, la expresión incrementada en plantas más viejas puede ser un resultado de la regulación temporal del fragmento de promotor CRWAQ81. El patrón espacial de expresión permaneció preferido en la raíz en plantas en etapa V5. Para los eventos CRWAQ81-.GUS, la expresión fue ubicua y las regiones maduras de la raíz. No se observó expresión en las puntas de la raíz (el primero 1 cm) o en las raices laterales emergentes <1 cm en longitud) . Pocos eventos se han manchado en las hojas. El patrón de expresión en los eventos CRWAQ81 (intrón 1 Adhl ) :GUS sin embargo, fue notablemente diferente. La expresión fue obicua en las regiones maduras de la raíz. La expresión también se observó en la cofia y débilmente en la región de alargamiento de algunos eventos. Aproximadamente 50% de los eventos mostraron algún nivel de expresión en la vasculatura de la hoja. La razón para la expresión ectópica no está clara. La expresión en las partes sedosas y la etapa R1-R2 también se examinó (en la etapa R2 la etapa sedosa está sobresaliendo desde el extremo de la mazorca están comenzando a secarse y a oscurecerse en color) . Ninguno de los eventos analizados mostraron expresión. Esto incluyó los eventos tanto con y sin el intrón Adhl . No se observó expresión de GUS en el polen. Nuevamente, esto fue verdadero si el intrón Adhl estuvo presente o no estuvo presente. Las espiguillas, esencialmente no se observó expresión en las glumas o raquis de las plantas CRWAQ81 : GUS . El manchado débil se observó en las glumas y raquis de unas cuantas plantas CRWAQ81 (Intrón 1 Adhl ) : GUS . Sin embargo, la diferencia más significante entre las espiguillas CRWAQ81:GUS y CRWAQ81 (intrón 1 Adhl ) : GUS fue el manchado observado en los tejidos cerca de los lodiculos. En las plantas CRWAQ81 (intrón 1 Adhl ) :GUS, la mayoría de los eventos tuvo algo del nivel de manchado de GUS: Sin el intrón, solamente unos cuantos eventos se mancharon en esta región. Materiales y Métodos Manchado Histoquímico de Callos y Tejidos de Plantas para la Actividad GUS La actividad GUS se evaluó en la cofia, el meristema, la región de alargamiento y las regiones maduras de raices extirpadas. Las secciones de hoja extirpadas de casi la punta de la hoja con collar más joven también se evaluaron. La detección de la actividad GUS se realizó al colocar el tejido de plantas transformadas regeneradas en placas de 48 cavidades que contienen 0.5 ml de solución reguladora de ensayo GUS (receta de solución reguladora del ensayo descrita en el Ejemplo 6) o en el caso de plantas cultivadas en invernadero, una placa de 12 cavidades que contiene 2 ml de solución reguladora de ensayo GUS. Las placas se colocaron bajo vacio doméstico durante 10 minutos, luego se incubaron en la oscuridad a 37°C durante la noche. El tejido se aclaró de pigmentación con 2 incubaciones sucesivas de 12 horas en etanol al 100% a temperatura ambiente. Los tejidos se almacenaron en etanol al 70% a 4°C. El manchado de las partes sedosas y las ramificaciones de espiguillas extirpadas fue similar al tejido de hoja y raíz excepto que los tejidos se colocaron en placas de 6 cavidades que contienen 3-5 mis de solución reguladora de ensayo GUS. Los tejidos se aclararon de pigmentación, como es' descrito en lo anterior. El manchado GUS histoqui ico de los callos se realizó como es descrito para los embriones inmaduros en el Ejemplo 6. Ejemplo 8: Transformación del Maiz Mediante Bombardeo de Partículas y la Regeneración de Plantas Transgénicas Embriones del maíz inmaduros a partir de plantas donadoras de invernadero se bombardean con moléculas de DNA que comprenden un promotor de la invención operablemente enlazado a un gen de interés. Un marcador seleccionable se proporciona en el mismo vector de transformación, o alternativamente, el gen marcador seleccionable se proporciona en una molécula de DNA separada. La transformación se realiza como sigue. Las recetas del medio se muestran enseguida. Preparación del Tejido Objetivo Las mazorcas son despinochadas y esterilizadas en la superficie en blanqueador Clorox™ al 30% más Micro detergente al 0.5% durante 20 minutos, y enjuagados dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros son extirpados y colocado el eje del embrión con el lado hacia abajo (el lado de escutelo hacia arriba) , 25 embriones por placa, en el medio 560Y por 4 horas y luego alineados con la zona objetivo 2.5-cm en la preparación para el bombardeo. Preparación de DNA Se hace un vector de plásmido que comprende una secuencia de promotor de la invención. El vector adicionalmente contiene un gen marcador seleccionable PAT inducido por un promotor CaMV35S e incluye un terminador CaMV35S. Opcionalmente, el marcador seleccionable puede residir en un plásmido separado. Una molécula de DNA que comprende una secuencia de promotor de la invención asi como un marcador seleccionable PAT se precipita sobre pelotillas de tugsteno de 1.1 µm (diámetro promedio) utilizando un procedimiento de precipitación deseada CaCl2 como sigue: 100 µl de partículas de tugsteno preparadas en agua 10 µl (1 µg) de DNA en solución reguladora Tris EDTA (1 µg de DNA total) 100 µl de CaCl2 2.5 M 10 µl de espermidina 0.1 M Cada reactivo se adiciona secuencialmente a una suspensión de partícula de tugsteno, mientras que se mantiene en el formador de vórtice de multitubo. La mezcla final se zonica brevemente y se deja incubar bajo formación de vórtice constante durante 10 minutos. Después del período de precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, se remueve el liquido, se lavan con 500 ml de etanol al 100% y se centrifugan durante 30 segundos. Nuevamente el liquido se remueve y 105 µl de etanol al 100% se adiciona a la pelotilla de partículo de tugsteno final. Para el bombardeo de pistola con partículas, las partículas de tugsteno/DNA se sonican brevemente y 10 µl se manchan sobre el centro de cada macroportador y se dejan secar aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Tratamiento con Pistola de Partículas Las placas de muestra se bombardearon en el nivel #4 en la pistola de partícula #HE34-1 o #HE34-2. Todas las muestras reciben un solo disparo en 650 PSI, con un total de diez alícuotas d cada tubo de partículas preparadas/DNA. Tratamiento Subsecuente Después del bombardeo, los embriones se conservan en el medio en 560Y durante 2 días, luego se transfieren a 560R que contiene 3 g/litro de Bialafos y se subcultivan cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callos resistentes a la selección se transfieren al medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración del embrión somático (2-4 semanas) , los ' embriones somáticos bien desarrollados se transfieren al medio para la germinación y se transfieren a un cuarto de cultivo alumbrado. Aproximadamente 7-10 días después, las plantitas en desarrollo se transfieren al medio libre de hormona 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plantitas están bien establecidas. Las plantas luego se transfieren al inserto en cajones de semillero (equivalente a maceta de 2.5") que contiene tierra para maceta y se cultivan durante 1 semana en una cámara de crecimiento, subsecuentemente se cultivan 1-2 semanas adicionales en el invernadero, luego se transfieren a 600 macetas clásicas (1.6 galones) y se cultivan hasta la madurez. Las plantas se monítorean y se registran para la expresión mediante los ensayos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, inmuensayos y manchado de Western con un anticuerpo que enlaza la proteina de interés. Bombardeo y Medio de Cul tivo El medio de bombardeo (560Y) comprende 4.0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416) , 1.0 ml/1 de Mezcla de Vitamina de Eriksson (lOOx SIGMA-1511), 0.5 mg/l de tiamina HCl, 120.0 g/l de sacarosa, 1.0 mg/l de 2,4-D y 2.88 g/l de L-prolina (llevado a volumen con H20 di después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 2.0 g/l de Gelrite™ (adicionado después de llevar al volumen con H20 di), y 8.5 mg/l de nitrato de plata (se adicionaron después de esterilizar el medio y el enfriamiento a temperatura ambiente) . El medio de selección 560R) comprende 4.0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1.0 ml/1 de Mezcla de Vitamina de Eriksson (lOOOx SIGMA-1511), 0.5 mg/l de tiamina HCl, 30.0 g/l de sacarosa y 2.0 mg/l de 2,4-D (llevado a volumen con H20 di después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 3.0 g/l de Gelrite™ (adicionado después de llevar al volumen con H20 di); y 0.85 mg/l de nitrato de plata y 3.0 mg/l de Bialafos (ambos adicionados después de la esterilización del medio y el enfriamiento a temperatura ambiente) . El medio de regeneración de plantas (288J) comprende 4.3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/1 de solución de extracto de vitaminas MS (0.100 g de ácido nicotínico, 0.02 g/l de tiamina HCl, 0.10 g/l de piridoxina HCl y 0.40 g/l de Glicina llevado a un volumen con H20 D-1 purificados) (Murashige y Skoog (1962) Physiol . Plant . 15:473), 100 mg/l de mioinositol, 0.5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarosa y 1.0 ml/1 de ácido abscísico 0.1 mM (llevado a volumen con H20 di purificada después de ajustar a pH 5.6); 3.0 g/l de Gelrite™ (adicionado después de llevar al volumen con H20 di) y 1.0 mg/l de ácido indolacético y 3.0 mg/l de Bialafos (adicionado después de la esterilización del medio y el enfriamiento a 60 °C) . El medio libre de hormona (272V) comprende 4.3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/1 de solución de extracto de vitaminas MS (0.100 g/l de ácido nicotínico, 0.02 g/l de tiamina HCl, 0.10 g/l piridoxina HCl y 0.40 g/l de Glicina (llevado a volumen con H20 di purificado) 0.1 g/l mio-inositol y 40.0 g/l de sacarosa (llevado a volumen con H20 di purificado después de ajustar a pH a 5.6); y 6 g/l de Bacto-agar (adicionado después de llevar al volumen con H20 di purificado) , esterilizado y enfriado a 60 °C. Ejemplo 9: Transformación mediada por Agrobacteri um del Maíz y Regeneración de Plantas Transgénicas Para la transformación mediada por Agrobacteri um del maíz con una secuencia de promotor de la invención, óptimamente se emplea el método de Zhao (patente norteamericana No. 5,981,840, y publicación de patente de PCT WO 98/32326; los contenidos de las cuales son incorporados en la presente por referencia) . Brevemente, los embriones inmaduros se aislan de maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium bajo condiciones mediante las cuales las bacterias son capaces de transferir la secuencia de promotor de la invención a por lo menos una célula de por lo menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1:1a etapa de infección). En esta etapa los embriones inmaduros se sumergen óptimamente en una suspensión de Agrobacterium para la iniciación de la inoculación. Los embriones se co-cultivan durante un tiempo con el Agrobacteri um (Etapa 2: la etapa de co-cultivo) . Óptimamente, los embriones inmaduros se cultivan en el medio sólido después de la etapa de infección. Después de este periodo de co-cultivo se contempla una etapa de "reposo" opcional. En este etapa de reposo, los embriones se incuban en la presencia de por lo menos un antibiótico conocido que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para transformantes de plantas (etapa 3: etapa de reposo) . Óptimamente, los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación de Agrobacteri um y para una fase de reposo para las células infectadas. Enseguida, los embriones inoculados se cultivan en el medio que contienen un agente selectivo y el callo transformado en crecimiento se recupera (etapa 4:1a etapa de selección). Óptimamente, los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido con un agente selectivo que da por resultado el crecimiento selectivo de células transformadas. El callo luego se regenera en plantas (etapa 5:1a etapa de regeneración), y óptimamente los callos cultivados en el medio selectivo se cultivan en el medio sólido para regenerar las plantas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes se incorporan en la presente por referencia al mismo grado como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente fuera específicamente e individualmente indicada y que es incorporada por referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden ser practicados dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Referencia de archivo del Solicitud internacional No. Solicitante o agente 35718 /283375 PCT/US2004/no asignada INDICACIONES RELACIONADAS CON EL MICROORGANISMO DEPOSITADO U OTRO MATERIAL BIOLÓGICO ( PCRT Regla 13jbis) A. Las indicaciones hechas enseguida se relacionan al microorganismo depositado u otro material biológico referido en la descripción en la página 3, linea 8 y 15 IDENTIFICACIÓN DEL DEPOSITO Depósitos adicionales son identificados en una hoja adicional [] Nombre de la institución depositarla American Type Culture Collection Dirección de la institución depositarla (incluyendo el código postal y el pais) 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA Fecha de depósito Número de Acceso 04 de Abril del 2003 PTA-5126 INDICACIONES ADICIONALES (dejar en Esta información se continúa blanco si no es aplicable) en una hoja adicional [] Página 4, lineas 26 y 29; Página 50, linea 7; Página 52, lineas 2 y 27; Página 53, linea 21 ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS CUALES SE HACEN INDICACIONES (si los indicadores no son para todos los Estados designados) E. PROVISIÓN SEPARADA DE INDICACIONES (dejar en blanco si no es aplicable) Las indicaciones listadas enseguida serán enviadas al Buró Internacional después (especificada en la naturaleza general de las indicaciones por ejemplo., "Número de Acceso del Depósito") Para uso de la oficina receptora solamente Para uso del Buró Internacional solamente [] Esta hoja fue recibida con la solicitud [] Esta hoja fue recibida con el Buró internacional Internacional en: Funcionario autorizado Funcionario autorizado ATCC 10807 University Blvd. - Manassas, VA 20110-2209 - Teléfono: 703-365-2700 - Fax: 703-365-2745 TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPOSITO DE MICROORGANISMOS PARA LOS PROPÓSITOS DE PROCEDIMIENTO DE PATENTE EOBMA INTERNACIONAL RECIBO EN EL CASO DE UN DEPOSITO ORIGINAL EXPEDIDO CONFORME A LA REGLA 7.3 Y DECLARACIÓN DE VIABILIDAD EXPEDIDA CONFORME A LAS REGLAS 10.2 a: (Nombre y Dirección del Depositador o Apoderado) Pioneer Hi-Bred Internacional, Inc. Attn: Lynne E. Slms 7250 NW 62a Avenue PO BOX 552 Johnston, IA 50131 Depositado a favor de: Pioneer Hi-Bred Internacional, Inc. Referencia de Identificación por el Depositador: Designación de Depósito de Patenüe Mezcla del vector pCR2.1 de DNA de Plásmido (Invitrogen) que contiene el inserto de Zea Mays y pBluescript KS+ (Stratagene) que contiene el inserto de Zea mays: CRWAQ81 2.1 kb pro. frag-; CRWAQ81 3.6 kg pro. PTA-5126 El depósito fue acompañado por: una descripción científica una descripción taxonómica propuesta indicada en lo anterior. El depósito fue recibido el 4 de Abril del 2003 por la Autoridad Depositarla Internacional y ha sido aceptado. EN SU PETICIÓN: X Nosotros le informaremos de las peticiones para la cepa por 30 años. La cepa será hecha disponible si un signatario de la oficina de patente al Tratado de Budapest certifica el derecho de uno para recibir, o si una Patente Norteamericana es expedida citando la cepa, y ATCC es instruida por la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos o el depositador para liberar la cepa. Si el cultivo muriera o se destruyera durante el plazo efectivo del depósito, será su responsabilidad reemplazarlo con el cultivo vivo del mismo. La cepa será mantenida durante un período de por lo menos 30 años desde la fecha de depósito, o cinco años después de la petición más reciente para una muestra, cualquiera que sea mas largo. Los Estados Unidos y muchos otros países son signatarios al Tratado de Budapest. La viabilidad del cultivo citado en lo anterior se probó el 22 de Abril del 2003. En esa fecha, el cultivo fue viable. Autoridad Depositaría Internacional: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209 USA. Firma de la persona que tiene autoridad para representar ATCC: FIRMADO Fecha: 2 de Junio, 2003 Marie Harris, Especialista en Patentes, Depositario de Patentes ATCC ce: Luise Foutch

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO: 2; b) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de promotor de planta de los plásmidos depositados como Depósito de Patente No. PTA-5126; c) una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia inicia la transcripción en una célula de planta; d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia inicia la transcripción en una célula de planta; e) una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones severas al complemento de a) o b) , en donde la secuencia inicia la transcripción en una célula de planta; y f) una secuencia de nucleótidos que comprende un fragmento de una secuencia de a) o b) , en donde el fragmento mantiene la función de la secuencia de nucleótidos de a) o b) . 2. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 operablemente enlazada a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. 3. Un vector, caracterizado porque comprende el cásete de expresión de la reivindicación 2. 4. Una célula de planta, caracterizada porque tiene establemente incorporada en su genoma el cásete de expresión de la reivindicación 2. 5. La célula de planta de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la célula de planta es de una monocotiledónea. 6. La célula de planta de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la monocotiledónea es de maiz. . La célula de planta de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la célula de planta es de una dicotiledónea. 8. Una planta, caracterizada porque tiene establemente incorporada en su genoma el cásete de expresión de la reivindicación 2. 9. La planta de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la planta es una monocotiledónea. 10. La planta de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la monocotiledónea es maiz. 11. La planta de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la planta es una dicotiledónea. 12. Una semilla transgénica de la planta de la reivindicación 8. 13. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende, en secuencia, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, que está operablemente enlazada a una región no traducida 3' que incluye una señal de poliadenilación. 14. Un vector, caracterizado porque comprende el cásete de expresión de la reivindicación 13. 15. Una célula de planta, caracterizada porque tiene establemente incorporada en su genoma el cásete de expresión de la reivindicación 13. 16. Una planta, caracterizada porque tiene establemente incorporada en su genoma el cásete de expresión de la reivindicación 13. 17. Una semilla transgénica de la planta de la reivindicación 16. 18. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 10, 11 o 16, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés codifica un producto de gen que confiere resistencia a herbicida, sal, patógeno, sequía, frió o insectos. 19. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una célula de planta, el método caracterizado porque comprende introducir en la célula de planta un cásete de expresión que comprende un promotor operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, en donde el promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO: 2; b) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de promotor de planta de los plásmidos designados como Depósito de Patente No. PTA-5126; c) una secuencia de nucleótido que comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en la célula de planta; d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en la célula de planta; y, e) una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones severas al complemento de a) o b) , en donde la secuencia inicia la transcripción en la célula de planta. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la célula de planta es de una dicotiledónea. 21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la célula de planta es de una monocotiledónea. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la monocotiledónea es maiz. 23. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una planta, el método caracterizado porque comprende introducir en una célula de planta un cásete de expresión, el cásete de expresión que comprende un promotor y operablemente enlazado al promotor una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, en donde el promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 2; b) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de promotor de la planta de los plásmidos designados como Depósito de Patente No. PTA-5126; c) una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula de planta; d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula de planta y e) una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones severas al complemento de a) o b) , en donde la secuencia inicia la transcripción en una célula de planta; y regenerar una planta transformada de la célula de planta, en donde la planta tiene establemente incorporada en su genoma el cásete de expresión. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés es selectivamente expresada en raices. 25. Un método para expresar selectivamente una secuencia de nucleótidos en una raiz de planta, el método caracterizado porque comprende introducir una célula de planta a un cásete de expresión, y regenerar una planta transformada de la célula de planta, el cásete de expresión que comprende un promotor y una secuencia de nucleótidos heteróloga operablemente enlazada al promotor, en donde el promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 2; b) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de promotor de planta de los plásmidos designados como Depósito de Patente No. 'PTA-5126; c) una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:l o SEO ID NO: 2, en donde la secuencia inicia la transcripción en una célula de raiz de planta; d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia inicia la transcripción en una célula de raiz de planta y e) una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones severas al complemento de a) o b) , en donde la secuencia inicia la transcripción en una célula de raiz de planta. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés altera el fenotipo de la planta. 27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-26, caracterizado porque la planta es una dicotiledónea . 28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-26, caracterizado porque la planta es una monocotiledónea. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la monocotiledónea es maiz. 30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-29, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés codifica un producto de gen que confiere resistencia a herbicida, sal, patógeno, sequía, frío o insectos.