MXPA06002171A - Sensor antioxidante, metodos y composiciones - Google Patents

Abstract

La presente invención incluye un aparato y un método para detectar directamente la actividad antioxidante de ambos antioxidantes lipófobos que utiliza un sensor sensible a radicales de oxígeno en comunicación fluida con una muestra en una mezcla de solvente/agua/surfactante;en donde el sensor sensible a radicales de oxígeno detecta concurrentemente los antioxidantes tanto lipófilos como lipófobos en la mezcla de solvente/agua/surfactante. La figuras más representativa de la invención es la número 1.

Description

FR, GB, GR, HU, IE, IT, LU, MC, NL, PL, PT, RO, SE, SI, (48) Date of publication of tl?s corrcctcd versión: SK, TR), OAPí (BF, BJ, CF, CG, Cl, CM, GA, GN, GQ, 10 November 2005 GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG). Declaration under Rule 4.17: (ld) Information about Correction: — of invenlor iip (Rule 4. V7(iv))for US only see PCT Gazette No. 45/2005 of 10 November 2005, Section p Publlshed: — with intemational search report For two-letter codes and other abbreviations, refer lo íhe "Guid¬ (88) Date of publication of the International search report: ance Notes on Codes andAbbreviations" appearing at the begin- 23 June 2005 ning ofeach regular issue ofthe PCT Gazelte.

SENSOR ANTIOXIDANTE, MÉTODOS Y COMPOSICIONES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general al campo de los sensores antioxidantes, y más particularmente, a sensores antioxidantes y a métodos que miden directamente los antioxidantes tanto hidrófilos como hidrófobos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reclama la prioridad para, y es una continuación en parte de, la solicitud de patente norteamericana número de serie 10/648,047, presentada el 26 de Agosto de 2004. Sin limitar el alcance de la invención, sus antecedentes se describen en conexión con la tecnología de sensores antioxidantes y métodos para la detección. Los sistemas biológicos han desarrollado sistemas antioxidantes para combatir los efectos de radicales y otras especies pro-oxidantes. Un antioxidante es cualquier sustancia que retarda o impide significativamente la oxidación de un sustrato oxidable cuando está presente en concentraciones bajas en comparación con aquella del sustrato oxidable. Existen enzimas que son antioxidantes, tales como superóxido-dismutasa y catalasa, las cuales son codificadas por muchos organismos. Las sustancias tales como la vitamina C y fenoles vegetales son antioxidantes introducidos a través de la dieta en los sistemas biológicos. Se ha propuesto que los niveles de origen natural de estas sustancias no son producidos adecuadamente en el cuerpo o ingeridos en la dieta normal . La dieta normal frecuentemente no proporciona suficientes antioxidantes debido a que es deficiente en frutas y verduras y/o las frutas y verduras que están en la dieta son empobrecidos en cuanto a sus antioxidantes debido al procesamiento actual. La dieta normal podria mejorarse, sin embargo, los estilos de vida de hoy en día y la pobre composición de los alimentos occidentales hacen del uso de complementos la forma más práctica para suministrar los antioxidantes requeridos por el cuerpo . Para complementar la dieta normal , es necesario determinar las capacidades antioxidantes de los componentes incluidos en los complementos . Se han desarrollado varios métodos de laboratorio para determinar la capacidad de una sustancia para suprimir un radical libre o para determinar su capacidad antioxidante; cada uno de estos ensayos se describe en detalle posteriormente en este documento. En resumen, estos ensayos incluyen: TEAC, RMN-19F, TRAP, TRAP modificado, FRA.P, métodos basados en fluorescencia, detección de complejos de fosfomolibdeno y la ORAC, todos los cuales se proponen para medir algún aspecto de una capacidad de las sustancias para suprimir especies de radicales libres. Lo siguiente es una breve descripción de cada método, inclusive las ventajas y desventajas inherentes. Ensayo de TEAC. El ensayo de la Capacidad Antioxidante en Equivalentes de TroloxMR (TEAC, por sus siglas en inglés) se basa en la observación que cuando el ácido 2-2 ' -azinobis- (3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS) es incubado en presencia de una peroxidasa y peróxido de hidrógeno o en presencia de radicales hidroxilo, peroxilo, alcoxilo e inorgánicos, se genera el catión del radical ABTS'+ ligeramente más estable. Desde el momento que el ABTS, metmioglobina, regulador y peróxido de hidrógeno se adicionan juntos, la absorbancia de la radiación infrarroja se mide a una longitud de onda de 734 nm con respecto al tiempo . A medida que comienza a formarse el catión del radical ABTS'+, incrementa la absorbancia. Cuando se agregan antioxidantes antes de la adición de peróxido de hidrógeno, los antioxidantes eliminan los radicales formados por el peróxido de hidrógeno, retardando la formación del catión del radical ABTSA induciendo de esta manera un incremento en el porcentaje de inhibición de la absorbancia. La unidad de medición en este ensayo es la TEAC, la cual es la concentración (mmol/l) de TroloxMR con la capacidad antioxidante equivalente a una solución 1.0 mmol/l de la sustancia que es sometida a prueba. El ensayo de TEAC detecta la capacidad antioxidante de fármacos solubles en agua o fármacos que pueden ser solubilizados. También, debido a la capacidad del ensayo de TEAC para detectar la contribución de otros componentes, el ensayo de TEAC puede utilizarse para medir la capacidad antioxidante del sistema. El método de TEAC puede utilizarse para estudios farmacológicos y nutricionales. El uso del método de TEAC es limitado debido a que las peroxidasas presentes en la muestra producen un valor de absorbancia mayor y el producto químico sometido a prueba también puede absorber a 734 nm. Por lo tanto, el método de TEAC no puede garantizar la especificidad del antioxidante de la muestra para suprimir directamente los radicales libres debido a las interacciones directas entre la muestra de antioxidante y los reactivos debido a la concentración relativamente baja del H202. El método de TEAC también se efectúa por medio de la dilución de la muestra, produciendo un incremento en los valores de TEAC en concentraciones menores de la muestra. Ensayo de RMN-19P. Otro método utiliza la RMN-19F (resonancia magnética nuclear) , en el cual se detectan las aminas aromáticas fluoradas con RMN-19F. Las aminas aromáticas reaccionan rápidamente con radicales hidroxilo para formar una mezcla de productos hidroxilados. El detector fluorado, N- (4-hidroxifenil) -trifluoroacetamida, es descompuesto por el ataque de radicales hidroxilo para producir CF3CONH2, trifluoroacetamida (TFAM) , junto con otros productos. La TFAM se utiliza para determinar la capacidad de una sustancia para proteger el detector fluorado del ataque de radicales hidroxilo. Si la muestra es buena en la protección del detector fluorado del ataque de radicales libres, entonces el área bajo el pico de TFAM será más pequeña que si la sustancia es pobre en la protección del detector fluorado. Los reactivos se mezclan conjuntamente y se toma una medición utilizando la RMN. El área del pico se mide y entonces se normaliza contra la concentración total de las especies que contienen flúor. El método de RMN-19F es un método simple que mide las propiedades antioxidantes de biomoléculas de bajo peso molecular, sin embargo, el indicador solo aparece si están involucrados los radicales hidroxilo, flúor radioactivo utilizado en el método y el equipo de RMN es extremadamente costoso para la adquisición y la operación. Ensayo de TRAP. Las dispersiones acuosas de compuestos orgánicos, oxidables son iniciadas rápida y reproduciblemente a una velocidad constante, Ri, por medio de la peroxidación utilizando el compuesto azo soluble en agua clorhidrato de 2 , 2' -azo-bis- (2-amidipropano) (ABAP) , el cual sirve como la base para el método del Parámetro Antioxidante Total de Captura de Radicales (TRAP, por sus siglas en inglés) . El método del TRAP detecta la longitud de tiempo en el cual es inhibida la captación de oxígeno por el plasma peroxidable con una sonda de oxígeno y este valor es referido como el TRAP. El TroloxMR se utiliza como un control antioxidante en este método durante un segundo período de inducción después de que han sido empobrecidos los antioxidantes naturales . El segundo período de inducción se utiliza para calcular un valor Ri, el cual se utiliza para calcular el valor del TRAP. El valor del TRAP es reportado como el número de moles de radicales peroxilo capturados por litro de fluido. Desafortunadamente la duración del tiempo es lo único que es medido en el método del TRAP, limitando su utilidad para análisis de alto rendimiento. El tiempo tomado para impedir la captación máxima de oxígeno no puede medirse de forma fácil y precisa, la capacidad total de captura de radicales por mol de algunos antioxidantes es dependiente de su concentración inicial; y el grado real de inhibición no es medido. El método del TRAP consume tiempo debido a que, con solo un recipiente de reacción, solo puede someterse a prueba una muestra a la vez. Mientras que el método del TRAP es más específico que el método de TEAC debido a que el método del TRAP requiere altos niveles de dilución de plasma para producir la fase lag requerida y el proceso para realizar esto acorta la longitud de cadena de lípidos necesaria para una rápida reacción en cadena. Se propuso que al adicionar ácido linoleico, el acortamiento de la longitud de cadena podría ser compensado, pero con un estudio adicional se mostró que la adición de ácido línoleico introdujo otras fuentes de error (Ghiselli A; Serafini M; Maiani G; Azzini E; Ferro-Luzzi A., A fluorescence-based method for measuring total plasma antioxidant capability. Free Radie. Biol. Med. Enero de 1995; 18: 29-36) . En el sistema de ensayo del método del TRAP, la capacidad total de captura de radicales peroxilo de algunos antioxidantes tal como la vitamina C fue dependiente de la concentración inicial . Ensayo del TRAP modificado. Un ensayo del TRAP modificado corrige las interferencias de las proteínas plasmáticas o la dilución de muestras (Ghiselli y colaboradores . , supra) . El método del TRAP modificado mide indirectamente el efecto del ataque de radicales peroxilo producido por ABAP sobre las propiedades fluorescentes de la proteína ß-ficoeritrina (ß-PE) y la capacidad del plasma para proteger la ß-PE. La protección se realiza al precipitar la proteína fuera del plasma con sulfato de amonio y ultracentrifugación. El ensayo del TRAP modificado se realiza al adicionar los reactivos conjuntamente dentro de celdas fluorométricas de cuarzo y mantener a 37 °C durante 5 minutos. Después de que se adiciona ABAP, la fluorescencia se mide a 495 nm y se supervisa durante 5 minutos. El método del TRAP modificado produce una disminución lineal en la fluorescencia debido a la descomposición térmica de ABAP como el método original basado en sondas de oxígeno. Un período de protección total es indicado por una fase lag con la adición de cualquier compuesto antioxidante, sin embargo, se presume que la capacidad antioxidante total del plasma está relacionada directamente con la longitud de la fase lag. El TRAP es cuantificado al comparar la fase lag producida por el compuesto antioxidante con la fase lag producida por una solución de TroloxMR de concentración conocida. El método del TRAP modificado no mide la capacidad del plasma para romper la cadena de peroxidación de lípidos provocada por ABAP, pero no se define completamente si y a que grado los antioxidantes solubles en lípidos están involucrados en el TRAP. Este método del TRAP modificado solo puede manejar de cuatro a ocho muestras de plasma a la vez. Ensayo de FRAP . El ensayo de la Capacidad de Reducción Férrica del Plasma (FRAP, por sus siglas en inglés) fue desarrollado por Benzie y Strain y fue publicado en 1996 y se lleva a cabo en un analizador espectrofotométrico COBAS FARA IIMR. El reactivo de FRAP junto con todas las soluciones son preparados recientemente cada día. El reactivo de FRAP se calienta a 37°C. Se toma una lectura de la solución blanco y entonces se adiciona una muestra de antioxidante y agua. Comenzando 0.5 segundos después de que se inicia la reacción, las lecturas se toman cada 15 segundos durante el experimento. Para determinar la diferencia en la absorbancia, el cambio en la medición de absorbancia de la solución blanco a aquel de la medición final se calcula y entonces se relaciona con el cambio en la absorbancia de una solución estándar de hierro (II) que se somete a prueba en paralelo. El ensayo de FRAP no es dependiente de la concentración, no mostrando una desviación de la tendencia lineal esperada de los resultados yendo hasta el origen. El ensayo de FRAP tiene ciertos problemas conocidos, específicamente, no existen radicales libres introducidos en el sistema. El ensayo de FRAP utiliza una reacción de oxidación/reducción para medir la capacidad de una muestra para reducir el hierro (III) a hierro (II) . Un antioxidante dona electrones de la misma manera como un reductor en una oxidación/reducción, de manera que se presume que el ensayo de FRAP es un método para evaluar la capacidad antioxidante . Sin embargo, el ensayo de FRAP no mide directamente la capacidad antioxidante de un antioxidante potencial . También, puesto que no existen radicales libres introducidos en el sistema, no existe una forma para comparar la capacidad antioxidante hacia diferentes clases de radicales. El ensayo de FRAP no puede medir de manera precisa la capacidad antioxidante de ciertos antioxidantes tales como ácido ascórbico, el cual puede reaccionar con el hierro (II) y antioxidantes que contienen grupos SH. El ensayo de FRAP no toma en cuenta la cantidad de inhibición; de esta manera, el FRAP deja fuera un componente importante de la capacidad antioxidante total. La incapacidad de los ensayos de FRAP y TEAC para determinar de manera precisa la capacidad antioxidante es evidente con la comparación de los resultados de los dos ensayos donde no existe una correlación lineal. Métodos Basados en Fluorescencia. El método basado en fluorescencia es un método basado en el descubrimiento que la fluorescencia de ß-ficoeritrina cambia con respecto al tiempo con el daño causado por el ataque de radicales peroxilo e hidroxilo. El método de ß-ficoeritrina utiliza un espectrofotómetro de fluorescencia Perkin-Elmer MPF 44BMR para detectar la fluorescencia. Se proporciona una medición de fluorescencia con respecto al tiempo y se utiliza para determinar la cantidad de protección que un antioxidante proporciona al observar que tan largo es un "período plano" con respecto a un control . En estos métodos indirectos basados en fluorescencia, si el nivel de absorbancia permanece igual, el "período plano" para un período más largo de tiempo para el producto químico A que para el producto químico B, entonces se dice que el producto químico A protege del ataque de radicales mejor que el compuesto B y por lo tanto es un antioxidante más fuerte . El método de fluorescencia proporciona un método para cuantificar rápidamente el nivel de antioxidantes diferentes del suero en plasma u otros fluidos biológicos sobre muestras pequeñas y se ha utilizado para analizar el potencial antioxidante del plasma, proteínas, ADN, neurotransmisores y sustancias relacionadas, vitaminas y sus derivados y otros productos químicos. Sin embargo, el método de fluorescencia indirecto contiene algunos problemas. Por ejemplo, estos ensayos miden el porcentaje de inhibición calculado a partir de la velocidad lineal, inicial de pérdida de fluorescencia en lugar de tomar en cuenta el tiempo de inhibición de, por ejemplo, ß-PE. El método de fluorescencia ni ofrece una forma para determinar la contribución de los antioxidantes solubles en lípidos ni para determinar la contribución de una proteína en el suero a la capacidad antioxidante total . Ensayo de Complejos de Fosfomolibdeno (PCA, por sus siglas en inglés) . La formación de un complejo de fosfomolibdeno es similar al método de FRAP. El método de PCA se basa en el cambio en la absorbancia después de la reducción del molibdeno (VI) a molibdeno (V) . Para reducir el molibdeno (VI) a molibdeno (V) , debe estar presente una especie reductora como, por ejemplo, un antioxidante . Las muestras se preparan justo antes de utilizarse por medio de la dilución en el solvente apropiado . Para los compuestos solubles en agua, se utiliza agua. Para las sustancias solubles en solventes orgánicos, se utiliza etanol, metanol, sulfóxido de dimetilo o hexano con concentraciones exactas determinadas a partir de los coeficientes de absorción basados en la bibliografía. Después de ser molidas y congeladas, las muestras de semilla son disueltas y se realiza una extracción si es necesario. Entonces se mezcla una muestra con la solución de reactivo que contiene molibdeno. Después de un período de incubación y enfriamiento, se toma una medición de absorbancia contra una solución blanco utilizando, por ejemplo, un espectrofotómetro visible por luz UV. En las muestras desconocidas, las capacidades de antioxidantes orgánicos y solubles en agua son expresadas como equivalentes de c-tocoferol y ácido ascórbico, respectivamente. La capacidad antioxidante es cuantificada en base a la comparación del coeficiente de absorción molar del complejo de fosfomolibdeno. Mientras el coeficiente de absorción molar esté más cercano a uno, es mejor el antioxidante. El método de fosfomolibdeno es un método bueno, simple para determinar el potencial antioxidante de antioxidantes más fuertes tales como la vitamina E de 25-37°C. Este método es una alternativa económica para otros métodos disponibles para determinar el potencial antioxidante total . Ensayos Tradicionales de ORAC. Los métodos de Capacidad de Absorbancia de Radicales de Oxígeno (ORAC, por sus siglas en inglés) utilizan las propiedades químicas de fícoeritrinas, proteínas fluorescentes. El ensayo de ORAC difiere del método Glazer en que la reacción es conducida para la competencia en el método de ORAC mientras que, como se estableció al principio, el método Glazer se dirige a lo que es reportado como el período plano . El método ORAC puede utilizar suero con proteínas removidas por medio del tratamiento con sulfato de amonio, seguido por ultracentrifugación. El generador de radicales peroxilo, diclorhidrato de 2 , 2 ' -azobis (2-amidinopropano) (AAPH) se utiliza en este ensayo. La detección de los métodos tradicionales de ORAC se realiza utilizando, por ejemplo, un espectrofotómetro de fluorescencia Perkin-Elmer LS-5MR hasta que ocurre una fluorescencia cero. Los reactivos se adicionan a las cubetas y después de la adición de AAPH, la mezcla de reacción se incuba a 37°C y se toman mediciones de fluorescencia cada 5 minutos hasta completar la reacción.

Los resultados son reportados como el valor de ORAC, el cual se refiere al área de protección neta bajo la curva de supresión de ß-PE en presencia de un antioxidante . El valor de ORAC es calculado al dividir el área bajo la curva para la muestra por el área bajo la curva para TroloxMR con ambas áreas siendo corregidas al substraer el área bajo la curva para la solución blanco. Una unidad de ORAC es asignada como que es el área de protección neta proporcionada por TroloxMR 1 µM en la concentración final. Cuando el área bajo la curva para la muestra se compara con el área bajo la curva para TroloxMR, el resultado se proporciona en equivalentes de TroloxMR. Un método de ORAC automatizado utiliza, por ejemplo, un analizador de centrífuga COBAS FARA II1^. Después de que se adiciona el iniciador, se toman mediciones de fluorescencia después de 0.5 segundos y luego cada 2 minutos después de la lectura inicial. El analizador COBAS FARA nMR está equipado con una centrífuga que permite la centrifugación y el mezclado de las muestras. El analizador COBAS FARA IIMR es capaz de manejar hasta 30 muestras a la vez y los resultados son reportados utilizando el área bajo la curva para determinar el valor de ORAC como estuvieron en el método original . El método de COBAS FARA IIMR ha sido utilizado efectivamente para evaluar varias matrices de muestras.

La ORAC puede modificarse adicionalmente al utilizar una sal de fluoresceína en lugar de ß- ficoeritrina. La ß-ficoeritrina es aproximadamente 30% pura debido al proceso de aislamiento y es inconsistente de lote a lote . Se determinó que debido a la reactividad variable para los radicales peroxilo, la ß-ficoeritrina también produce una inconsistencia de lote a lote. También, la ß- ficoeritrina puede ser fotodecolorada después de exponerla a luz de excitación durante un cierto tiempo. Debido al enlace no específico a proteínas, la ß-ficoeritrina interactúa con polifenoles lo cual afecta la estabilidad. También, la ß-ficoeritrina es mucho más costosa que la fluoresceína. Por estas razones, la fluoresceína se utilizó en lugar de la ß-ficoeritrina. El método de ORAC se adaptó para ser capaz de analizar las muestras de antioxidantes solubles en lípidos al introducir beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente (RMCD, por sus siglas en inglés) en una mezcla de acetona 50%-agua. Esta mezcla de acetona: agua hizo que los antioxidantes solubles en lípidos fueran solubles en regulador de fosfato. El método de ORAC es una manera simple, sensible y confiable para medir la capacidad de absorción de radicales peroxilo de los antioxidantes y el suero u otros fluidos biológicos . La capacidad de absorción de radicales hidroxilo del suero ha sido realizada exitosamente utilizando el método de ORAC. El método de ORAC(fl) puede utilizarse con un lector de microplacas de fluorometría utilizando una placa de 96 pozos para realizar el análisis cinético simultáneo de muchas muestras y para reducir la cantidad de muestra de suero requerida. El método de ORAC es único en su análisis ya que toma en cuenta el tiempo de inhibición y el grado de inhibición en una cantidad individual al medir el área bajo la curva.9 El método de ORAC no es afectado por la dilución.5 Se condujo una comparación con el ensayo automatizado de COBAS FARA IIMR utilizando ß-ficoeritrina con los ensayos de FRAP y TEAC y no hubo una correlación lineal entre los ensayos de ORAC y TEAC, indicando además la incapacidad del ensayo de TEAC para determinar de manera precisa la capacidad antioxidante de una muestra. Sin embargo, hubo una correlación lineal bastante débil entre los ensayos de ORAC y FRAP, lo cual muestra la baja precisión del ensayo de FRAP para determinar la capacidad antioxidante de un antioxidante potencial . Se han revisado varios métodos para determinar el potencial antioxidante de sustancias . Todos estos métodos tienen beneficios, pero también tienen limitaciones. El alto costo de estos métodos (inclusive el equipo —algunos de los cuales ya no son fabricados— reactivos, costos de personal, etcétera) los hace imprácticos para el uso por la mayoría de las compañías pequeñas que forman la industria de antioxidantes. Otros métodos incluyen, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,518,590, expedida a Fang, la cual describe sensores electroquímicos para aceites de motor y otros lubricantes. En resumen, un sensor electroquímico sensible y rápido supervisa el deterioro del aceite de motor, particularmente la propiedad de antioxidación, al determinar el nivel de agente antioxidante y antidesgaste que permanece en una formulación de aceite. El sensor electroquímico es una celda electroquímica de dos o tres electrodos que tiene un líquido de electrolito conductivo o una interfase similar a gel sobre las superficies de los electrodos. El grado de deterioro del aceite de motor es supervisado por mediciones de la capacidad antioxidación o antidesgaste del aceite. El sensor electroquímico se utiliza para supervisar otros lubricantes e hidrocarburos que contienen aditivos electroactivos . El sensor electroquímico permite que las mediciones se realicen in-si tu, sin ningún pre-tratamiento químico o físico del aceite . Otro ejemplo de un sensor antioxidante se muestra en la patente norteamericana No. 6,638,415, expedida a Hodges, la cual describe un dispositivo y un método para medir el nivel de un analito oxidante o antioxidante en una muestra de fluido. El dispositivo incluye una celda electroquímica desechable, tal como una celda electroquímica de capa delgada, que contiene un reactivo capaz de someterse a una reacción redox con el analito . Cuando el dispositivo y el método se utilizan con analitos de reacción lenta, se puede aplicar calor a la muestra por medio de un elemento de calentamiento resistivo en el dispositivo o por medio de un material exotérmico contenido dentro de la celda electroquímica. Se piensa que la aplicación de calor acelera la velocidad de la reacción redox entre el reactivo y el analito, lo cual facilita la medición electroquímica de analitos de reacción lenta. Finalmente, la solicitud de patente norteamericana No. 20020182736 describe métodos para medir indirectamente la actividad antioxidante lipófila. Se describe un método selectivo para medir la actividad antioxidante de lípidos dentro de un compartimiento lipídico de una muestra utilizando generadores de radicales lipófilos e indicadores lipófilos oxidables. Se dice que la invención determina de forma precisa y eficiente la actividad antioxidante total de una muestra en compartimientos tanto lipidíeos como acuosos . Los métodos de la invención se pueden utilizar para la diagnosis y la protección contra trastornos que surgen del exceso de radicales libres presentes en un sujeto. Los reactivos utilizados en los métodos de la invención también pueden proporcionarse en un estuche de ensayo. Sin embargo, el valor de la Capacidad de Absorbancia de Radicales de Oxígeno (ORAC) se mide indirectamente utilizando sondas fluorescentes estándar.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye sensores antioxidantes y métodos que miden directamente los niveles de oxidación total de las muestras y el efecto de antioxidantes sobre el estado de oxidación total de las muestras . La invención también incluye composiciones y métodos que son útiles para proporcionar cantidades efectivas de antioxidantes a un individuo para una salud óptima. El aparato y el método descritos en este documento detectan la capacidad antioxidante total de una muestra, concurrentemente y directamente en tiempo real . Los presentes inventores reconocieron que la técnica ha creado artificialmente dos categorías mutuamente exclusivas de antioxidantes (lipófilos y lipófobos) y los ha medido por separado. Además, la técnica también ha medido indirectamente en general la existencia de los radicales, esto es, utilizando una molécula reportera detectable. La presente invención supera las limitaciones de los detectores y los métodos de la técnica anterior al utilizar un sistema de detección rápido, económico y directo. Para tratar estas limitaciones, los presentes inventores desarrollaron el aparato de Capacidad de Absorbancia de Radicales de Oxígeno-Oxígeno (ORAC (o), por sus siglas en inglés) y el método descrito en este documento. Utilizando el aparato de ORAC (o), los presentes inventores fueron capaces de medir, por primera vez, el efecto de los antioxidantes tanto lipófilos como lipófobos sobre los niveles de oxígeno disuelto, concurrentemente y en tiempo real. Utilizando el ensayo de ORAC (o) , los inventores también fueron capaces de desarrollar una composición antioxidante sinérgica, la cual se puede utilizar sola o en combinación con uno o más potenciadores antioxidantes . Más particularmente, la presente invención incluye un aparato para detectar directamente la actividad antioxidante de antioxidantes tanto lipófilos como lipófobos que incluye un sensor de oxígeno disuelto en comunicación fluida con una muestra y una molécula sensible a radicales de oxígeno en una mezcla de solvente/agua/surfactante; en donde el sensor sensible a radicales de oxígeno detecta concurrentemente los antioxidantes tanto lipófilos como lipófobos en la mezcla de solvente/agua/surfactante. Las moléculas sensibles a radicales de oxígeno pueden ser moléculas que reaccionarán con oxígeno, por ejemplo, moléculas con enlaces dobles conjugados; o compuestos que contienen nitrógeno o azufre. Los ejemplos de una molécula sensible a radicales de oxígeno, por ejemplo, fluoresceína, ß-ficoeritrina (ß-PE) , glutationa-S-transferasa, ácido linoleico o combinaciones de los mismos. El nivel de radicales de oxígeno es determinado directamente utilizando un medidor o sensor de oxígeno disuelto en una mezcla de solvente/agua/surfactante . El nivel de oxígeno disuelto puede determinarse utilizando un sensor de oxígeno, por ejemplo, un sensor electroquímico, quimioluminiscente, de resonancia de plasmón superficial, infrarrojo, de acoplamiento capacitivo, de fibra óptica acoplado a tinte o de oxígeno hiperespectral . El medidor o sensor de oxígeno disuelto puede colocarse en línea para el análisis de alto rendimiento, puede ser un detector de muestras individuales y/o puede adaptarse para el uso en oficinas o aún en el hogar. El solvente puede ser un solvente orgánico, por ejemplo, acetona. El surfactante puede ser un detergente, por ejemplo, un detergente no iónico tal como Tween-20MR. El solvente en la mezcla de solvente/agua/surfactante es generalmente al menos de aproximadamente 10 a 90 por ciento en volumen de la mezcla de solvente/agua/surfactante, por ejemplo, 33%. El agua en la mezcla de solvente/agua/surfactante es generalmente al menos de aproximadamente 10 a 90 por ciento en volumen de la mezcla de solvente/agua/surfactante, por ejemplo de 33 a 67%. El surfactante (o detergente) en la mezcla de solvente/agua/surfactante es al menos de aproximadamente 0.1 a 10 por ciento en volumen de la mezcla de solvente/agua/surfactante y puede almacenarse disuelto en agua. En un ejemplo específico, la relación de solvente/agua/surfactante es de aproximadamente 1:1:1. El aparato puede incluir además uno o más procesadores, por ejemplo, una computadora que puede: controlar el detector, capturar datos, almacenar datos, realizar cálculos en base a los datos y/o una base de datos de información y/o exhibir los datos o resúmenes de los datos en forma de tablas, gráficas, diagramas y similares. El procesador/computadora también puede conectarse y aún controlar un sistema fluídico que está en comunicación fluida con el sensor de oxígeno y la mezcla de solvente/agua/detergente. La presente invención mide un área bajo la curva que se relaciona con la desaparición relativa de oxígeno que resulta de la actividad de la muestra que es sometida a prueba por la capacidad antioxidante con la desaparición relativa de oxígeno observada como resultado de la actividad de un estándar conocido. Utilizando la presente invención, y los métodos descritos en el presente documento, el nivel de oxígeno disuelto se mide directamente en la solución que incluye antioxidantes tanto lipófilos como lipófobos, concurrentemente. Un ejemplo de la fórmula para calcular el AUC puede ser: AUCs p-AUCßLN X 1000 (mg/gr) X [TRLX (µmol/ml)] AUCTRLX-AUCBLNK ORAC(o)— [SMP (mg/ml)] en donde AUCSMP es el valor del área bajo la curva de la muestra; en donde AUCBNK es el valor del área bajo la curva de la solución blanco; en donde AUCTRLX es el valor del área bajo la curva para TroloxMR; y en donde SMP es la muestra. La presente invención también incluye un método para determinar directamente la actividad antioxidante que incluye los pasos que consisten en: determinar el nivel de oxígeno disuelto en una solución de prueba disuelta en una mezcla de solvente/agua/surfactante en presencia de uno o más antioxidantes y un objetivo de radicales de oxígeno, en donde la actividad de antioxidantes solubles tanto en agua como en lípidos es medida con un detector de oxígeno. El nivel de radicales de oxígeno disuelto puede determinarse utilizando un detector de oxígeno, por ejemplo, un sensor electroquímico, quimioluminiscente, de resonancia de plasmón superficial, de acoplamiento capacitivo, de fibra óptica acoplado a tinte o de oxígeno hiperespectral . La actividad antioxidante puede medirse a aproximadamente 37 grados centígrados. Los ejemplos de iniciadores de radicales incluyen, por ejemplo diclorhidrato de 2,2'-azobis [2- (5-metil-2-imidazolin-2-il) propano] , diclorhidrato de 2 , 2 ' -azobis (2-amidinopropano) (AAPH), diclorhidrato de 2 , 2' -azobis (2-amidinopropano) [2- (N-estearil) amidinopropano] (SA-1) , diclorhidrato de 2 , 2 ' -azo (2- (2-imidiazolin-2-il) -propano) - [2- [2- (4-n-octil) imidazolin-2-il] -propano] (C-8) , 2,2' -azobis (4-metoxi-2 , 4-dimetilvaleronitrilo) (MeO-AMVN) , 2,2' -azobis (2, 4-dimetilvaleronitrilo) (AMVN) , azo-bis-isobutilnitrilo, 2 , 2 ' -azobis (2-metilproprionato) (DAMP) y 2 , 2 ' -azobis- (2-amidinopropano) , sales, mezclas o equivalentes de los mismos. El detector puede ser aún desechable . La presente invención también incluye un complemento alimentario que incluye cualquier antioxidante lipófobo aislado y purificado y cualquier antioxidante lipófilo aislado y purificado, en donde los antioxidantes lipófobos y lipófilos combinados tienen un valor de oxígeno disuelto mayor que 6,000 µMol de Equivalentes de Trolox01 (TE, por sus siglas en inglés) /gramo . La persona experta reconocerá que el valor también puede ser expresado como equivalentes de líquido, por ejemplo, 6,000 µMol de Equivalentes de TroloxMR (TE) /mililitro . Los antioxidantes lipófobos y lipófilos son liberados a través del tiempo y pueden incluir una o más vitaminas E seleccionadas de tocoferoles alfa, beta, delta, épsilon, gamma, zeta, eta, xil, xi2 y sigma y tocotrienoles alfa, beta delta y gamma, análogos de los mismos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de antioxidantes lipófilos incluyen quercetina, kaempferol, miricetina, apigenina y derivados, análogos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos. El complemento alimentario que incluye cualquier antioxidante lipófobo aislado y purificado y cualquier antioxidante lipófilo aislado y purificado también puede incluir dos o más sacáridos esenciales, por ejemplo, galactosa, galactosamina, glucosamina, glucosa, mañosa, mañosa acetilada, ácido N-acetilneuramínico, fucosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina y/o xilosa. En una modalidad, el complemento también incluye una fuente de vitamina C, por ejemplo, una fuente vegetal con un alto nivel de vitamina C biodisponible, natural, tal como un ciruelo arbustivo australiano ( Terminalia ferdinandiana) . En otra modalidad específica, la vitamina C es un potenciador de la actividad antioxidante de una fuente vegetal de vitamina C tal como el ciruelo arbustivo australiano, silvestre ( Terminal ia ferdinandiana) , el cual tiene un porcentaje más alto de vitamina C que el ciruelo arbustivo cultivado en una plantación. El complemento también puede incluir uno o más pro-bióticos, por ejemplo, Lactobacillus sp . y Bifidobacterium sp . El complemento puede ser comprimido para proporcionar una superficie generalmente impermeable al oxígeno, por ejemplo, una partícula comprimida con rodillos, cápsula, tableta, minitableta, comprimido, tableta efervescente o combinaciones de los mismos . Como un punto de comparación con el aparato de ORAC (o) y el método descrito anteriormente en este documento, los antioxidantes lipófilos y lipófobos aislados y purificados tendrán un valor de ORAC (f1-lipo) antioxidante mayor que 7000 µMol de Equivalentes de Trolox^ (TE) /gramo. La presente invención se utilizó en un estudio con el conocimiento del medicamento utilizado para medir el cambio en los niveles antioxidantes en cada individuo que tomaba una mezcla de antioxidante/gliconutriente que incluyó los antioxidantes de la presente invención en sus dietas. Cuando se proporcionan a un paciente, los antioxidantes lipófobos y lipófilos proporcionaron un incremento promedio superior a 13% medido por ORAC (ß-PE) del nivel antioxidante de línea de referencia promedio, acumulativo de la población de pacientes . La presente invención también incluye una variedad de composiciones. Las composiciones descritas en este documento se basan en el reconocimiento que los complementos alimentarios que están disponibles actualmente fallan en combinar antioxidantes lipófilos y lipófobos con actividades mensurables sobre aquellas esperadas de los componentes individuales. Utilizando el aparato y el método de la presente invención, los presentes inventores fueron capaces no únicamente de desarrollar combinaciones sinérgicas de antioxidantes lipófilos y lipófobos, sino también de adicionar potenciadores de la actividad antioxidante . Se ha mostrado recientemente que los flavonoides como quercetina incrementan la transcripción de la subunidad pesada de la enzima de velocidad limitante en la síntesis de glutationa, gamma-glutamilcisteína sintetasa, a través de los elementos sensibles a antioxidantes del gen. La transcripción incrementada es traducida subsecuentemente en niveles intracelulares incrementados de la glutationa reducida (activa) en células de cultivo de tejido. La quercetina es un componente principal del vino tinto, la cascara de uva y las cebollas. Los estudios de quercetina del vino tinto, la cascara de uva y las cebollas sugieren efectos benéficos a la salud. Se ha mostrado que la quercetina es bien absorbida por los humanos . Un estudio mostró que toda la quercetina ingerida fue metabolizada dos horas después de un alimento (European Research on Functional Effects of Dietary Antioxidants, 25-28 de Septiembre de 2002, Cambridge, UK) . Con el descubrimiento de la oxidación de LDL sustancialmente disminuida en sujetos que consumían cantidades moderadas de vino tinto, los investigadores afirmaron que los efectos protectores podrían atribuirse muy probablemente a la actividad de la quercetina y sus metabolitos. También se ha mostrado que la quercetina mejora la estabilidad de los eritrocitos. Los presentes inventores reconocieron que debido a los numerosos y diversos factores que influyen en la tensión oxidativa, el complemento antioxidante necesitaría ser diseñado a la medida de la necesidad y química del individuo. Además, se reconoció que se requería una combinación de tocoferoles para satisfacer las diferentes necesidades de los individuos . La combinación de tocoferoles es necesaria debido a que algunos antioxidantes son "seleccionados" por el cuerpo. Por ejemplo, la forma predominante- de la vitamina E en la dieta norteamericana es gamma-tocoferol, la cual se encuentra comúnmente en aceites vegetales así como también en productos derivados de semillas de soya y maíz. Sin embargo, el cuerpo retiene predominantemente el alfa-tocoferol. Se ha descubierto que un método específico, que depende de la proteína de transferencia de alfa-tocoferol, regula la concentración del alfa-tocoferol en el cuerpo. A diferencia de las composiciones antioxidantes de la técnica anterior, la presente invención utiliza tocoferoles mezclados para proveer al cuerpo con muchas formas de vitamina E, permitiendo la selección, retención y uso de las cantidades óptimas de cada forma. Además, la combinación sinérgica de quercetina y tocoferoles mezclados provee al cuerpo con un amplio orden de una selección óptima de nutrientes antioxidantes, los cuales pueden diferir en base a las necesidades de un individuo . Los presentes inventores buscaron aumentar al máximo adicionalmente la actividad de la combinación sinérgica de quercetina y tocoferoles mezclados al adicionar compuestos que ayudan a aumentar la potencia de la actividad de estos antioxidantes. Uno de estos potenciadores es la Vitamina C. La Vitamina C tiene actividad antioxidante significativa que se atribuye a ésta así como también varias funciones nutritivas no oxidantes. Muchos atribuyen propiedades pro-oxidantes a la vitamina C, especialmente en presencia de metales de transición. Las propiedades pro-oxidantes de la vitamina C pueden no ser destructivas completamente. Sin embargo, los investigadores afirman que descubrieron que la vitamina C se comporta como un antioxidante, aún en presencia de metales no enlazados. Otros potenciadores de la actividad antioxidante incluyen extractos naturales, tales como extracto de semilla de uva y extracto de té verde. En un estudio, el té verde exhibió una potente actividad anti utagénica in vitro e inhibió el desarrollo de lesiones pre-neoplásicas inducidas por carcinomas en el colon de rata. El té verde también inhibió significativamente la formación de pólipos intestinales. Por lo tanto, los presentes inventores no únicamente hicieron una combinación sinérgica de antioxidantes purificados y aislados de fuentes naturales, tales como quercetina y tocoferoles mezclados, sino que agregaron adicionalmente potenciadores que incrementaron la actividad antioxidante de estos agentes . Más particularmente, las composiciones de un complemento alimentario que incluyen una cantidad nutricionalmente efectiva de dos o más sacáridos esenciales; un supresor de radicales de oxígeno lipófobo, aislado y purificado; y un supresor de radicales de oxígeno lipófilo, aislado y purificado, en donde los supresores de radicales de oxígeno lipófobos y lipófilos combinados tienen un valor de supresión de radicales de oxígeno mayor que 6,000 µMol de Equivalentes de TroloxMR (TE) /gramo. En un ensayo, los supresores de radicales de oxígeno lipófobos y lipófilos cuando se administran a un paciente proporcionan un incremento promedio mayor que 13% medido por la ORAC(fl- lipo) del nivel antioxidante de línea de referencia de la población de pacientes. Los supresores de radicales de oxígeno lipófobos y lipófilos son empacados para la liberación extendida y pueden incluir una o más de las siguientes moléculas de vitamina E: tocoferoles alfa, beta, delta, épsilon, gamma, zeta, eta, xil, xi2 y sigma y tocotrienoles alfa, beta, delta y gamma, análogos de los mismos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos. El supresor de radicales de oxígeno lipófilo puede incluir uno o más de los siguientes: flavonoles, quercetina, kaempferol, miricetina, apigenina y derivados, análogos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos. El complemento puede incluir además dos o más sacáridos seleccionados del grupo que consiste de galactosa, glucosa, mañosa, ácido N-acetilneuramínico, fucosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina y xilosa, derivados, análogos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Para un entendimiento más completo de las características y ventajas de la presente invención, ahora se hace referencia a la descripción detallada de la invención junto con las figuras asociadas y en las cuales: la FIGURA 1 representa un aparato antioxidante directo de ORAC (o); la FIGURA 2 es un diagrama de flujo del método de ORAC (o) de la presente invención; la FIGURA 3 son dos gráficas que comparan la solución blanco en una medición de ORAC (o) (porcentaje de oxígeno) con las mediciones de ORAC(fl) (fluorescencia) utilizando AAPH como iniciador, Trolox1^ como el estándar y ácido linoleico o fluoresceína, respectivamente como los obj.etivos de radicales de oxígeno; la FIGURA 4 son dos gráficas que comparan el estándar antioxidante TroloxMR en una medición de ORAC (o) (porcentaje de oxígeno) con las mediciones de ORAC(fl) (fluorescencia) utilizando AAPH como iniciador, TroloxMR como el estándar y ácido linoleico o fluoresceína, respectivamente como los objetivos de radicales de oxígeno; la FIGURA 5 son dos gráficas que comparan la solución blanco, el estándar y la muestra, en una medición de ORAC (o) (porcentaje de oxígeno) con las mediciones de ORAC(fl) (fluorescencia) utilizando AAPH como un iniciador, TroloxMR como el estándar y ácido linoleico o fluoresceína, respectivamente como los objetivos de radicales de oxígeno; la FIGURA 6 es una gráfica que muestra un efecto antioxidante de la combinación de quercetina (Q) a 5 µg/mL y tocoferoles mezclados (MT) a 5 µg/mL en comparación con cada ingrediente por separado a una concentración de 10 µg/mL medido por el método de ORAC (o) de la presente invención; la FIGURA 7 es una gráfica que muestra un efecto antioxidante de la combinación de quercetina (Q) a 5 µg/mL y tocoferoles mezclados (MT) a 5 µg/mL y TroloxMR como un control medido por medio del método de ORAC (o) de la presente invención; la FIGURA 8 es una gráfica de los resultados del Área Bajo la Curva (AUC) de la relación titulada de quercetina y tocoferoles mezclados utilizando el método de ORAC (o) para medir la capacidad antioxidante; la FIGURA 9 es otra gráfica de los resultados de AUC de la relación titulada de quercetina y tocoferoles mezclados utilizando el método de ORAC (o) para medir la capacidad antioxidante que demostró los resultados esperados (línea) y el grado de sinergia detectado sobre la línea en comparación con los resultados esperados de la titulación de la quercetina y los tocoferoles mezclados; la FIGURA 10 es una gráfica que muestra los resultados de los ensayos de ORAC (o) para variar las relaciones de extracto de cascara de uva y extracto de té verde en presencia de 49.18% de quercetina, 32.79% de tocoferoles mezclados y 1.64% de ciruelo arbustivo. La relación óptima de extracto de cascara de uva con el extracto de té verde es 60/40 a 80/20; la FIGURA 11 es una gráfica que muestra los resultados de ORAC(fl) de la combinación de quercetina (Q) a 5 µg/mL y tocoferoles mezclados (MT) a 5 µg/mL en comparación con cada ingrediente por separado a una concentración de 10 µg/mL. la FIGURA 12 es una gráfica de un ensayo de ORAC(fl) que mide una titulación de quercetina contra a-tocoferol disueltos en acetona : agua; la FIGURA 13 es una gráfica de un ensayo de ORAC(fl) que mide la actividad antioxidante medida para una relación fija de la relación de quercetina: -tocoferol disuelta en una mezcla de solvente : agua: detergente; la FIGURA 14 es una gráfica de un ensayo de ORAC(fl) que mide la actividad antioxidante medida para una relación fija de una relación de quercetina : a-tocoferol disuelta en dos diferentes relaciones de solvente: agua con mezclas de detergente; la FIGURA 15 es una gráfica que muestra los valores de ORAC (o) obtenidos con diferentes relaciones de quercetina y tocoferoles mezclados; la FIGURA 16 es una gráfica que muestra los valores de ORAC (o) para una relación diferente de extracto de semilla de uva y extracto de té verde; y la FIGURA 17 es una gráfica que muestra los valores de ORAC (o) de la combinación de las relaciones máximas de quercetina: tocoferol mezclado y el extracto de semilla de uva y extracto de té verde .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Mientras que la elaboración y el uso de varias modalidades de la presente invención se describen en detalle posteriormente, se debe apreciar que la presente invención proporciona muchos conceptos inventivos aplicables que pueden incorporarse en una amplia variedad de contextos específicos . Las modalidades específicas descritas en este documento son únicamente ilustrativas de las formas específicas para elaborar y utilizar la invención y no limitan el alcance de la invención. Para facilitar el entendimiento de esta invención, a continuación se define una variedad de términos . Los términos definidos en este documento tienen los significados entendidos comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en las áreas relevantes para la presente invención. Los términos tales como "uno" "una" y "el, la, los, las" no se proponen para referirse únicamente a una entidad singular, sino que incluyen la clase general de la cual se puede utilizar un ejemplo específico para ilustración. La terminología se utiliza en este documento para describir las modalidades específicas de la invención, pero su uso no limita la invención, excepto como se resume en las reivindicaciones. La presente invención se basa, en parte, en el reconocimiento que la técnica ha creado artificialmente dos categorías mutuamente exclusivas de antioxidantes y las ha medido por separado. Además, la técnica también ha medido indirectamente en general la existencia de los radicales, esto es, utilizando una molécula reportera. La presente invención proporciona un aparato y un método que no detectan únicamente la capacidad antioxidante total de una muestra, concurrentemente, sino que lo hace directamente. Como se utiliza en este documento, el "antioxidante" se refiere a cualquier molécula que retarda o impide la oxidación de una molécula objetivo, oxidable.

Los antioxidantes actúan al: eliminar radicales libres, reactivos, biológicamente importantes u otras especies de oxígeno reactivo (por ejemplo, 0~, H202, HOCl, ferrilo, peroxilo, peroxinitrito y alcoxilo) ; al impedir la formación de radicales de oxígeno; o al convertir catalíticamente el radical libre u otra especie de oxígeno reactivo a una especie menos reactiva. Los antioxidantes se dividen generalmente en dos clases: (1) antioxidantes lipidíeos (lipófilos o hidrófobos) ; y (2) antioxidantes acuosos (lipófobos o hidrófilos) . Los ejemplos de antioxidantes lipidíeos incluyen, pero no están limitados a, carotenoides (por ejemplo luteína, zeaxantina, ß- criptoxantina, licopeno, a-caroteno y ß-caroteno) , los cuales están localizados en el compartimiento lipídico del núcleo y tocoferoles (por ejemplo, vitamina E, a-tocoferol, ?-tocoferol y d-tocoferol) , los cuales están localizados en la interfaz del compartimiento lipídico y retinoides (por ejemplo, vitamina A, retinol y palmitato de retinilo) y polifenoles solubles en grasa, por ejemplo, quercetina. Los ejemplos de antioxidantes acuosos incluyen, pero no están limitados a, ácido ascórbico y su forma oxidada, "ácido deshidroascórbico" , ácido úrico y su forma oxidada "alantoína" , bilirrubina, albúmina y vitamina C y polifenoles solubles en agua tales como catequinas, las cuales tienen alta afinidad hacia las membranas de fosfolípidos, isoflavonas y procianidinas . Un método comúnmente utilizado para detectar los niveles relativos de radicales de oxígeno y la capacidad antioxidante es el ensayo de Capacidad de Absorbancia de Radicales de Oxígeno (ORAC) . En los ensayos de tipo ORAC conocidos, el valor antioxidante es medido indirectamente al medir el efecto de un radical de oxígeno sobre, por ejemplo, una molécula fluorescente u otra molécula detectable, que puede no ser un buen objetivo para la oxidación por el radical de oxígeno particular. Generalmente, cuando los antioxidantes se adicionan a una muestra de prueba, una disminución detectable en la cantidad de un radical libre, tal como superóxido o una especie de oxígeno reactivo no radical, tal como peróxido de hidrógeno, se puede observar en la muestra, en comparación con una muestra no tratada con el antioxidante (es decir, muestra de control) . Sin embargo, estos métodos indirectos supervisan el cambio en el estado antioxidante por vía de un intermediario (por ejemplo, fluoresceína, ß-fitoeritrina (ß-PE) , etcétera) medido con la hipótesis que el efecto del radical sobre el intermediario es un reflejo verdadero del nivel relativo de oxidantes y antioxidantes . Los controles para estos ensayos son concentraciones conocidas de generadores de radicales de oxígeno y antioxidantes conocidos que son medidos y utilizados como estándares para las muestras. Como se utiliza en este documento, el término "radical libre" se refiere a moléculas que contienen al menos un electrón impar. La mayoría de moléculas contienen números pares de electrones y sus enlaces covalentes incluyen normalmente pares de electrones compartidos. La escisión de estos enlaces produce dos radicales libres separados, cada uno con un electrón impar (además de cualquier electrón apareado) . Los radicales libres pueden ser cargados eléctricamente o pueden ser neutros, son altamente reactivos y tienen una vida usualmente corta. Los radicales libres se combinan entre sí o con átomos que tienen electrones impares. En reacciones con moléculas intactas, los radicales libres tratan de completar su propia estructura electrónica, generando nuevos radicales, los cuales van reaccionando con otras moléculas creando una reacción en cadena. Las reacciones en cadena de radicales libres son particularmente importantes en la descomposición de sustancias a altas temperaturas y en la polimerización. En el cuerpo, los radicales libres oxidados son responsables del daño a tejidos. El calor, la luz ultravioleta y la radiación ionizante generan todos radicales libres. Los radicales libres se generan como un efecto secundario del metabolismo oxidante. Un exceso de radicales libres puede abatir a las enzimas protectoras naturales tales como superóxido-dismutasa, catalasa y peroxidasa. Los radicales libres tales como peróxido de hidrógeno (H202) , radical hidroxilo (HO") , oxígeno singlete (102) , radical de anión de superóxido (0'2~) , radical de óxido nítrico (NO") , radical peroxilo (ROO") , peroxinitrito (ONOO") pueden estar en los compartimientos ya sea lipidíeos o acuosos. Los nutrientes antioxidantes (por ejemplo, vitaminas C y E, selenio, polifenoles) pueden reducir estos efectos.

Como se utiliza en este documento, la frase "compartimiento lipídico" se refiere a compuestos que tienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga, cíclicos o acíclicos y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, amino-alcoholes y aldehidos. Por ejemplo, los lípidos comunes incluyen ácidos grasos, grasas, fosfolípidos, esteroides, eicosanoides, ceras y vitaminas solubles en ' grasa. Algunos lípidos pueden clasificarse generalmente en dos grupos, los lípidos simples y los lípidos complejos, por ejemplo triglicéridos o grasas y aceites, esteres de ácidos grasos de glicerol, ceras, esteres de ácidos grasos de alcoholes de cadena larga y esteroides tales como colesterol y ergosterol . Los lípidos complejos incluyen, por ejemplo, fosfatidas o fosfolípidos (lípidos que contienen fósforo) , glicolípidos (lípidos que contienen carbohidratos) y esfingolípidos (lípidos que contienen esfingosina) . Como se utiliza en este documento, el término "lípido" incluye grasas o sustancias similares a la grasa. El término es descriptivo preferiblemente un nombre químico tal como proteína o carbohidrato. Los lípidos incluyen grasas verdaderas (es decir, esteres de ácidos grasos y glicerol), lipoides (es decir, fosfolípidos, cerebrósidos, ceras) y esteróles (es decir, colesterol, ergoesterol) . Los lípidos pueden ser un objetivo de la oxidación a través de mecanismos, tales como la autooxidación. Como se utiliza en este documento, el término "ácido graso" se refiere a un grupo de cadenas de hidrocarburos generalmente lineales, por ejemplo cargados negativamente. Las cadenas de hidrocarburos de ácidos grasos varían en su longitud y estados de oxidación. Generalmente, los ácidos grasos tienen una porción cargada negativamente (por ejemplo, en el extremo carboxilo) y una porción de "cola", la cual determina la solubilidad en agua y las características antipáticas del ácido graso. Por ejemplo, los ácidos grasos son componentes de los fosfolípidos que incluyen membranas biológicas, como grasas, las cuales se utilizan para almacenar energía dentro de las células o para transportar grasa en el torrente sanguíneo. Como se utiliza en este documento, el término "fosfolípido" se refiere a cualquiera de las clases de esteres de ácido fosfórico que incluyen al menos uno de los siguientes grupos secundarios : un ácido graso, un alcohol y una base nitrogenada. Como se utiliza en este documento, el término "grasa" o "grasas" se refiere a cualquiera de los esteres de glicerilo de ácidos grasos, por ejemplo, las formas de monoacilglicerol, diacilglicerol y triacilglicerol de ácidos grasos. Los triglicéridos se refieren a aquellas moléculas que están cargadas neutralmente y que son completamente hidrófobas, es decir, moléculas reducidas.

Los monoacilglicéridos y los diacilglicéridos son intermediarios metabólicos en la síntesis de fosfolípidos, mientras que los triglicéridos forman las moléculas de grasa que se utilizan para almacenar energía química en un estado compacto, libre de agua. Como se utiliza en este documento, el término "vitaminas solubles en grasa" se refiere a, por ejemplo, vitaminas solubles en grasa comunes que incluyen la Vitamina (A) (retinol) , Vitamina D (por ejemplo, Vitamina D3 (colecalciferol) ) , Vitamina E, Vitamina K y similares. Como se utiliza en este documento, la frase "actividad antioxidante de lípidos" o "capacidad antioxidante de lípidos" se utilizan intercambiablemente y se refieren a la medición de la capacidad antioxidante que surge del compartimiento lipídico de una muestra. Como se utiliza en este documento, la frase "actividad antioxidante acuosa" o "capacidad antioxidante acuosa" se utilizan intercambiablemente y se refieren a la medición de la capacidad antioxidante que surge del compartimiento acuoso de una muestra. Como se utiliza en este documento, la frase "actividad antioxidante total" o "capacidad antioxidante total" se utilizan intercambiablemente y se refieren a la medición de la capacidad antioxidante que surge de las porciones lipídicas y acuosas de una muestra. Como se utiliza en este documento, la frase "compartimiento acuoso" se refiere a la porción de una muestra de fluido que no interactúa con el compartimiento lipídico. El compartimiento acuoso incluye muestras de fluido biológico tales como sangre, plasma, suero, heces, fluido cerebroespinal, fluido amniótico, fluido intersticial, fluido linfático y fluido sinovial. Por ejemplo, el compartimiento acuoso de una muestra de fluido tal como suero puede incluir no únicamente la porción líquida que permanece después de que la sangre se ha dejado coagular y es centrifugada para remover las células sanguíneas y los elementos de coagulación, sino también otros compuestos tales como: proteínas, por ejemplo, albúmina y globulinas; anticuerpos; enzimas; cantidades pequeñas de materiales orgánicos nutritivos, tales como aminoácidos y glucosa; sustancias inorgánicas tales como sodio, cloruro, sulfatos, fosfatos, calcio, potasio, bicarbonato, magnesio, yodo, zinc y hierro; cantidades pequeñas de productos de desecho, tales como urea, ácido úrico, xantina, creatinina, creatina, pigmentos biliares y amoníaco; y cantidades traza de gases tales como oxígeno y dióxido de carbono . La muestra de fluido también puede ser una muestra no biológica, por ejemplo, formulaciones químicas, composiciones sintéticas o productos alimenticios y productos cosméticos . Como se utiliza en este documento, el término "muestra" se refiere a una muestra biológica líquida o fluida, o una muestra biológica sólida en la cual los radicales libres pueden generarse utilizando un generador de radicales libres (por ejemplo, un generador de radicales libres lipófilo o un generador de radicales libres hidrófilo) y se pueden detectar utilizando el detector (ORAC (o)) y un método de la presente invención. Las muestras biológicas incluyen, por ejemplo sangre, plasma, suero, fluido cerebroespinal, orina, fluido amniótico, fluido intersticial y fluido sinovial. Las muestras biológicas sólidas incluyen, por ejemplo un tejido, células, cultivo de tejido, células fijas, sobrenadantes de células o aún porciones (o extractos) de tejido o material celular. El término muestra también incluye muestras no biológicas tales como una solución química, composición sintética y alimento. Como se utiliza en este documento, los términos "ORAC (o) relativa" y "ORAC (o) " se refieren al mismo valor, el cual se mide por la equivalencia a micromoles de TroloxMR por gramo o mililitro. Un valor negativo ORAC (o) refleja menos actividad de supresión de radicales que aquella obtenida con una solución blanco lo que indica que una composición es un pro-oxidante, es decir, un agente que promueve la oxidación, preferiblemente que actuar como un antioxidante. Como se utiliza en este documento, las frases "generador de radicales" o "iniciador de radicales" se utilizan intercambiablemente y se refieren a un agente, compuesto o molécula que produce radicales libres. El generador de radicales es capaz de producir radicales libres a un nivel mensurado, por ejemplo, a un nivel en el cual los antioxidantes o indicadores oxidables pueden interactuar con los radicales libres para producir un resultado mensurable o detectable. Los ejemplos de generadores de radicales incluyen, por ejemplo, generadores de radicales azo, los cuales son compuestos que producen un flujo de radicales libres a una velocidad constante conocida. Los ejemplos de generadores de radicales azo incluyen, por ejemplo, 2 , 2 ' -azobis (4-metoxi-2 , 4-dimetilvaleronitrilo) (MeO-AMVN) , 2 , 2 ' -azobis (2 , 4-dimetilvaleronitrilo) (AMVN) , azo-bis-isobutilnitrilo, 2,2' -azobis (2-metilproprionato) (DAMP) y 2 , 2 ' -azobis- (2-amidinopropano) , diclorhidrato de 2 , 2 ' -azobis [2- (5-metil-2-imidazolin-2-il) propano] , hierro, ácido ascórbico y iones de metal . Como se utiliza en este documento, el "sujeto" se refiere a cualquier organismo vivo. El término sujeto incluye, por ejemplo, peces, mamíferos, reptiles, aves, insectos y similares. Los ejemplos específicos incluyen: humanos, primates no humanos tales como chimpancés y otros simios y especies de monos; animales de granja, tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos, tales como perros y gatos; animales de laboratorio inclusive roedores tales como ratones, ratas y cobayos y similares. El término no representa una edad o sexo particular. De esta manera, se propone que sean cubiertos los sujetos adultos o recién nacidos, así como también fetos, ya sea masculinos o femeninos. Como se utiliza en este documento, la frase "trastorno asociado con radicales libres" se refiere a una condición patológica de la producción de o la exposición a radicales libres. Como se utiliza en este documento, el término "trastorno asociado con radicales libres" incluye estados patológicos donde el daño de los radicales libres contribuye a la patología del estado de enfermedad o en donde la administración de un inhibidor de radicales libres (por ejemplo desferrioxamina) , eliminador (por ejemplo, tocoferol, glutationa) o catalizador (por ejemplo, SOD, catalasa) se muestra que produce un beneficio detectable al disminuir los síntomas, al incrementar la supervivencia o al proporcionar otros beneficios clínicos detectables en la protección o prevención del estado patológico. Los ejemplos de trastornos asociados con radicales libres incluyen, pero no están limitados a, lesión por reperfusión isquémica, enfermedades inflamatorias, lupus eritematoso sistémico, infarto de miocardio, apoplejía, hemorragia traumática, trauma en la médula espinal, enfermedad de Crohn, enfermedades autoinmunes (por ejemplo, artritis reumatoide, diabetes) , formación de cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Alzheimer, uveitis, enfisema, úlceras gástricas, toxicidad de oxígeno, neoplasia, apoptosis celular indeseada o enfermedad de radiación. Como se utiliza en este documento, el término "tensión oxidante" se refiere al nivel de daño producido por los radicales libres de oxígeno en un sujeto. El nivel de daño depende de que tan rápido sean creadas las especies de oxígeno reactivas y luego sean inactivadas por antioxidantes así como también la ubicación y la velocidad de la reparación. Como se utiliza en este documento, el término "desviación" o "desviar" relacionado con el estado oxidante y la tensión oxidante se utilizan de manera intercambiable y se refieren a un cambio en la actividad antioxidante de una muestra. El cambio en el estado oxidante puede ser un incremento, disminución, elevación o depresión de la actividad antioxidante de un valor normal, conocido. Por ejemplo, un incremento o una disminución de la actividad antioxidante en el compartimiento lipídico de una muestra, el compartimiento acuoso de una muestra o en el compartimiento tanto lípido como acuoso de la muestra. Como se utiliza en este documento, el término "sacáridos esenciales" se utiliza para definir los monosacáridos encontrados comúnmente en las cadenas de oligosacáridos de las glicoproteínas celulares y los cuales pueden no ser disponibles fácilmente a través de la dieta o la elaboración bioquímica en el cuerpo humano (véase, por ejemplo, Harper' s Biochemistry (Murray y colaboradores, 1996) (ítem ocho) y Principies of Biochemistry, Vol II (Zubay y colaboradores, 1995) (ítem once) . En la naturaleza se han descubierto más de 200 monosacáridos, se cree que estos once son importantes para mantener una buena salud en mamíferos: galactosa, glucosa, mañosa, ácido N-acetilneuramínico, fucosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, xilosa, ácido idurónico, arabinosa y ácido glucurónico. Las estructuras de estos carbohidratos son bien conocidas (véase, por ejemplo, Stryer' s Biochemistry (Stryer, 1995) y the Merck Index, 12a Edición, 1996) . Como se utiliza en este documento, el término "cantidad nutricionalmente efectiva" se utiliza para definir la cantidad que proporcionará un efecto o respuesta nutricional, benéfica en un mamífero. Por ejemplo, como respuesta nutricional a los complementos alimentarios que contienen vitaminas y minerales varía de mamífero a mamífero, se debe entender que las cantidades nutricionalmente efectivas de las vitaminas y minerales variarán, respectivamente. De igual manera, se sabe que la falta de aminoácidos esenciales, vitamina C, hierro, yodo, vitaminas, minerales, carbohidratos, lípidos y similares afecta las funciones fisiológicas y celulares. Una cantidad nutricionalmente efectiva de los antioxidantes y sacáridos descritos en este documento sirve para conservar y/o elevar los niveles de esos nutrientes críticos en la dieta de, por ejemplo, un humano que busca mantener o aumentar su dieta por estos complementos nutricionales. De esta manera, mientras que un mamífero puede requerir un perfil particular de vitaminas y minerales presentes en cantidades definidas, otro mamífero puede requerir el mismo perfil particular de vitaminas y minerales presentes en diferentes cantidades definidas . Como se utiliza en este documento, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se utiliza para describir aquellas sales que son, dentro del alcance del juicio médico acertado, adecuadas para el uso en, sobre o con los tejidos de humanos y animales inferiores sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica indebidas y similares y son conmensuradas con una relación razonable de beneficio/riesgo. Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en el campo (véase, por ejemplo, S. M. Berge y colaboradores, J. Pharmaceutical Sciences, 1977, porciones relevantes incorporadas en este documento a manera de referencia) . Las sales adecuadas pueden prepararse durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos de la invención o por separado mediante la reacción de una función de base libre con un ácido orgánico adecuado. Las sales de adición de ácido representativas incluyen, pero no están limitadas a, acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencen-sulfonato, bisulfato, butirato, canforato, canfor-sulfonato, digluconato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietansulfonato (isotionato) , lactato, maleato, metano-sulfonato, nicotinato, 2-naftalen-sulfonato, oxalato, palmitoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, fosfato, glutamato, bicarbonato, p-toluensulfonato y undecanoato. Los ejemplos de grupos que contienen nitrógeno básicos que se utilizan como agentes de cuaternización incluyen: haluros de alquilo inferior (cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo) ; sulfatos de dialquilo (sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo) ; haluros de cadena larga (cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo) ; haluros de arilalquilo (bromuros de bencilo y fenetilo) y similares. Los ejemplos de ácidos que pueden emplearse para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable incluyen ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico y ácidos orgánicos tales como ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico y ácido cítrico. Las sales de adición de bases también se pueden preparar in si tu durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos antioxidantes descritos en este documento con una base adecuada tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión de metal farmacéuticamente aceptable o con amoníaco o una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitadas a, cationes basados en metales alcalinos o metales alcalinotérreos, tales como sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio y similares y cationes de amoníaco y amina cuaternarios, no tóxicos que incluyen amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamonio, dimetilamonio, trimetilamonio, trietilamonio, dietilamonio y etilamonio entre otros. Otras aminas orgánicas representativas que son útiles para la formación de sales de adición de bases incluyen etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina, piperazina y similares. Como se utiliza en este documento, el término "aumentar la potencia" se refiere a uno o más agentes que actúan directa o indirectamente para incrementar o mejorar la actividad de los antioxidantes lipófobos y/o lipófilos de la presente invención. Uno de estos potenciadores es la Vitamina C, la cual puede actuar para reactivar o reciclar los antioxidantes y puede tener por sí misma una actividad antioxidante significativa. Las propiedades pro-oxidantes de la vitamina C han sido observadas en presencia de metales de transición. Otros potenciadores de actividad antioxidante pueden incluir extractos naturales, tal como el extracto de semilla de uva o el extracto de té verde. En un estudio, el té verde exhibió una actividad antimutagénica potente in vitro e inhibió el desarrollo de lesiones preneoplásicas inducidas por carcinoma en el modelo animal. Como tal, el potenciador mejora o puede aún crear una sinergia con los antioxidantes purificados y aislados de fuentes naturales, tal como quercetina y tocoferoles mezclados. Como se utiliza en este documento, los términos "gliconutricional" o "gliconutriente" se refieren a carbohidratos o sacáridos complejos o azúcares simples que son sintetizados en la naturaleza y son necesarios para la síntesis bioquímica de varias clases de moléculas de comunicación y señales que pueden estar libres en fluidos celulares intersticiales, pueden ser activos en la comunicación de célula a célula (es decir, citocinas, factores de crecimiento, etcétera) o pueden constituir la configuración molecular que comprende los puntos centrales de la actividad molecular altamente específica de membranas celulares (es decir, sitios receptores, canales de transporte iónicos, identificación antigénica y similares) . Como se utiliza en este documento, los términos "fitonutricional" o "fitonutriente" se refieren a moléculas sintetizadas naturalmente que se encuentran solo en plantas las cuales son producidas para proteger las células de la planta. Los fitonutrientes tienen principalmente actividad antioxidante, eliminadores de radicales libres y micronutriente vital. Estas moléculas, suministradas a través del complemento alimentario, se encuentran en tej idos vegetales maduros y están más concentradas en cascaras de semillas y en tejidos frutales que circundan la semilla. En los tejidos de mamíferos, estas moléculas, cuando se suministran en la dieta, son activas en la optimización de la bioquímica, inmunología y fisiología en el microambiente celular. Como se utiliza en este documento, los términos "extracto vegetal" y "extracto herbáceo" se utilizan intercambiablemente para referirse a fitoquímicos que son producidos en tejidos vegetales y que pueden extraerse por medio de solventes acuosos, polares o de petróleo y que tienen algún grado de actividad terapéutica o benéfica para la salud. Muchos agentes herbáceos pueden ser tóxicos, especialmente cuando están concentrados, pero son generalmente seguros cuando se utilizan en su manera más tradicional en tés y cataplasmas como una "medicina tradicional para el tratamiento de una enfermedad y la promoción de la buena salud" . Como se utiliza en este documento, el término "agente herbáceo de tonicidad corporal" se refiere a sustancias que han sido observadas por los inventores que reducen e invierten el daño al tejido elástico y fibras de colágeno causado por el envejecimiento o daño solar evidenciado por una restauración del turgor y la elasticidad de la piel, el cual reduce o elimina efectivamente las arrugas, ablandamiento, hiperpigmentación y la regresión de otros elementos indeseables de la apariencia cosmética perdida. Los carbohidratos incluidos en el complemento alimentario de la invención son disponibles a partir de una amplia variedad de fuentes naturales y sintéticas tales como arbustos, árboles, plantas, levaduras, hongos, mohos, gomas, resinas, derivados de almidón y celulosa y fuentes de mucina naturales. Específicamente, algunas de las fuentes naturales incluyen: (a) exudados de arbustos o árboles que contienen goma acacia, karaya, tragacanto o ghatti; (b) gomas marinas que incluyen agar, algina o carregenina; (c) gomas de semillas que incluyen guar, algarroba o zaragatona; (d) extractos vegetales que contienen pectinas o polimanosa acetilada; (e) derivados de almidón y celulosa tales como hexametil-almidón, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropil- metilcelulosa, metilcelulosa, celulosa oxidada y gomas microbianas que contienen dextranos, xantano. Sin embargo, se debe reconocer que no se propone que la composición de la invención sea limitada por la fuente de la cual se obtienen los carbohidratos respectivos. Los sacáridos de la invención se pueden encontrar en la naturaleza como mono-, oligo- y/o polisacáridos. De esta manera, las composiciones de la invención pueden contener los sacáridos en sus formas monoméricas, oligoméricas y/o poliméricas . Para una lista de fuentes naturales conocidas para los sacáridos y sus usos, debe hacerse referencia a la solicitud de patente norteamericana NO. US2003072770, las porciones relevantes son incorporadas en este documento a manera de referencia. Como se utiliza en este documento, el término "carbohidrato" se utiliza intercambiablemente con los términos "sacárido", "polisacárido", "oligosacárido" y "azúcar" las definiciones de los cuales son bien conocidas para aquellas personas expertas en el campo de la química de carbohidratos . Aunque se propone que las composiciones de la invención incluyan al menos dos o más sacáridos esenciales, se debe observar que los sacáridos pueden estar en la forma de mono-, oligo- y/o polisacáridos, por ejemplo, una composición que contiene goma de tragacanto y goma guar será considerada como que contiene ácido galacturónico, ácido siálico, mañosa y galactosa. Por lo tanto, al controlar la cantidad de gomas particulares en un complemento alimentario dado, uno puede controlar la cantidad de sacáridos respectivos en el complemento alimentario. Como se utiliza en este documento, el término "una mezcla de al menos dos formas de vitamina E" se utiliza para describir una mezcla de al menos dos formas de tocoferol seleccionadas de tocoferoles alfa, beta, delta, épsilon, gamma, zeta, eta, xil, xi2 y sigma y tocotrienoles alfa, beta, delta y gamma y combinaciones o derivados de los mismos. En una modalidad, "una mezcla de al menos dos formas de vitamina E" es una mezcla de al menos dos formas de tocoferol seleccionadas de tocoferol alfa, beta, delta y gamma. En otra modalidad, "una mezcla de al menos dos formas de vitamina E" es una mezcla de tocoferol alfa, beta, delta y gamma. "Una mezcla de al menos dos formas de vitamina E" puede obtenerse de VITAECAPS, SA, España, de Henkel Corporation; o de Cognis Corporation (Kankakee, IL) , por ejemplo. COVITOL FYSOM^ es comercialmente disponible de Cognis y contienen alfa-tocoferol de fuente natural con tocoferoles mezclados los cuales se obtienen de aceites vegetales comestibles. La mezcla particular de tocoferoles incluidos en la composición antioxidante de la presente invención se determina al conducir una determinación de antioxidantes de ORAC (o). Las sales o derivados de tocoferoles incluyen sales farmacéuticamente aceptables tales como acetato, sulfato, succinato, nicotinato, alofanato, fosfato, quinona o derivados halogenados; esteres; estereoisómeros y similares. La invención incluye el uso de derivados de vitamina E en los cuales las sustituciones, adiciones y otras alteraciones han sido hechas en el anillo y/o cadena lateral de 6-cromanol, con la condición que los derivados mantengan la actividad antioxidante de una vitamina E. Por ejemplo, los tocoferoles y sus derivados pueden variar por el número y la posición de grupos alquilo, enlaces dobles y otros sustituyentes y variaciones en el anillo y la cadena lateral . Un grupo "alquilo" es un grupo químico de cadena cíclica, ramificada o recta que contiene solo carbono e hidrógeno, tal como metilo, butilo y octilo. Los grupos alquilo pueden ser ya sea sustituidos o no sustituidos por uno o más sustituyentes, por ejemplo, halógeno, alcoxi, aciloxi, amino, hidroxilo, mercapto, carboxi o bencilo. Los grupos alquilo pueden ser saturados o insaturados en una o varias posiciones. Típicamente, los grupos alquilo comprenderán de 1 a 8 átomos de carbono, de 1 a 6 o de 1 a 4 átomos de carbono. Los tocoferoles adicionales pueden construirse por medio de la conjugación con la estructura de anillo o cadena lateral de otras diversas porciones, tales como aquellas que contienen oxígeno, nitrógeno, azufre y/o fósforo. Los derivados de tocoferol también se pueden elaborar al modificar la longitud de la cadena lateral de aquella encontrada en los tocoferoles prototípicos tales como tocoferol alfa, beta, delta y gamma. Los tocoferoles también pueden variar en la estereoquímica y la saturación de enlaces en la estructura de anillo y la cadena lateral. Los derivados de tocoferol adicionales, inclusive profármacos, se pueden elaborar por medio de la conjugación de azúcares u otras porciones a la cadena lateral o estructura de anillo. Los tocoferoles mezclados incluyen sin limitación mezclas de estereoisómeros de un tocoferol individual (por ejemplo, estereoisómeros + y - de alfa-tocoferol; (+/-) indica una mezcla racémica) o mezclas de tocoferoles estructuralmente distintos (por ejemplo, tocoferol alfa más gamma) . Aunque la presente invención incluye los once sacáridos esenciales citados anteriormente, se debe observar que otros sacáridos, compuestos nutricionales o compuestos biológicamente activos o inertes pueden incluirse en el complemento alimentario de la invención. Estos otros compuestos nutricionales incluyen cualquiera de uno o más fitonutrientes, complejo de Dioscorea, extractos vegetales, extractos herbáceos, partes de plantas, componentes herbáceos, vitaminas o minerales. Estos compuestos nutricionales se pueden adicionar al complemento alimentario de la invención o se pueden proporcionar por separado a un mamífero al cual se administra el complemento alimentario. Por ejemplo, una persona que recibe la forma de dosificación que contiene gliconutrientes de la invención también puede recibir un fitonutriente ya sea en la misma forma de dosificación o en una forma de dosificación separada. Los compuestos inertes pueden incluir saborizantes, materiales de relleno, lubricantes, reguladores, geles, sustancias aglutinantes, excipientes, portadores y/u otros de estos compuestos que facilitan la formulación o administración del complemento alimentario inventivo . Todas las composiciones de complementos alimentarios que contienen gliconutrientes de la invención, aún aquellas que contienen compuestos, agentes u otras sustancias adicionales, se pueden obtener directamente de Mannatech, Inc. (Coppell, Tex.). La presente invención incluye un aparato y un método para medir directa y concurrentemente la capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC) de una composición que incluye antioxidantes tanto hidrófobos y/o hidrófilos. El término "ORAC (o) " se utiliza puesto que el ensayo mide la capacidad de los antioxidantes para suprimir radicales al rastrear directamente la desaparición del oxígeno en un ensayo de capacidad de absorción de radicales de oxígeno, midiendo directamente el contenido de oxígeno en una muestra (ORAC (o)) . Los ensayos estándar de la industria actual tales como ORAC(fl) y ORAC (ß-PE), miden la capacidad antioxidante al medir indirectamente la degradación de emisiones fluorescentes de un compuesto fluorescente (fluoresceína o ß-ficoeritrina) con la exposición a radicales de oxígeno. Estos ensayos funcionan bien con antioxidantes hidrófilos, pero tienen una efectividad limitada en la medición de antioxidantes hidrófobos o mezclas de antioxidantes hidrófobos e hidrófilos. Además, a diferencia de los sistemas conocidos de ORAC(fl) y ORAC (ß-PE), el sistema de ORAC (o) descrito en este documento es adecuado para la simplificación y preparación de un sensor desechable. El sistema es suficientemente robusto para permitir aún la preparación de un sistema para oficina o aún para el hogar para la evaluación inmediata de la capacidad oxidante de un usuario de muestras biológicas. Aparato de ORAC (o) . La FIGURA 1 es una representación de un aparato antioxidante directo de ORAC (o) 10. El aparato 10 tiene, como se representa, tres componentes básicos: un sistema detector 12, un sistema fluídico 14 y un sistema procesador de datos 16, los cuales pueden estar interconectados para proporcionar la captura de datos, el control fluídico y de muestras y el procesamiento de datos. El sistema detector 12 tiene un sensor de oxígeno 18, el cual está en comunicación fluida con el sistema fluídico 14 por vía de uno o más conductos 20. El fluido que fluye a través de uno o más conductos 20 es controlado utilizando una o más válvulas 22, las cuales pueden ser controladas manualmente y/o pueden estar bajo el control del sistema procesador de datos 16. En operación, una muestra 24 entra al sistema fluídico y se dirige al interior del detector 18 y después de la captura de datos es suministrado al almacenamiento de desechos 26. El sistema fluídico 14 también puede incluir una o más soluciones 28 que son dirigidas al tránsito a través del sistema fluídico 14 por medio de bombas, por medio del vacío o por medio de presión, por ejemplo, gas inerte presurizado. Las soluciones 28 en el sistema fluídico 14 serán mezcladas previamente o equilibradas generalmente, para el uso con la presente invención pueden incluir generalmente: agua, un solvente, un detergente o una mezcla de agua : detergente, un generador de radicales de oxígeno, un objetivo de oxidación, etcétera y pueden mezclarse en una cámara de mezclado 30 antes del suministro a la cámara de detección de oxígeno 34. La selección del sistema fluídico dependerá del grado de automatización deseado o seleccionado, como será conocido para aquellas personas expertas en el campo. La muestra 24 puede ser mezclada previamente con la misma solución que se utiliza para calibrar el sensor de oxígeno 18 o puede aún ser mezclada previamente en la cámara de mezclado 30. Los ejemplos de detectores de oxígeno 18 para el uso con la presente invención incluirán cualquier sensor de oxígeno disuelto que sea capaz de detectar el oxígeno disuelto en presencia de un solvente, agua y un detergente. Los ejemplos de sensores de oxígeno disuelto incluyen, por ejemplo, sensores de oxígeno electroquímicos, quimioluminiscentes, de resonancia de plasmón superficial, infrarrojos, de acoplamiento capacitivo, de fibra óptica acoplados a tinte o aún hiperespectrales . En un ejemplo específico, el sensor de oxígeno disuelto es un sensor de oxígeno biológico YSI 5300A (YSI, EUA) un sensor SPREETA (Texas Instruments) , un sensor PASCO PS2108 (Pasco, EUA) y similares. En un ejemplo, el sensor de oxígeno disuelto tiene las siguientes especificaciones: Intervalo de: 0-20 mg/L; Precisión: ± 10% de la escala completa; Resolución: 0.01 mg/L; Velocidad de Muestra Máxima: 20 sps; Velocidad de Muestra por Omisión: 2 sps; Respuesta: 98% en 60 segundos; Intervalo de Temperatura: 0-50°C; Compensación de Temperatura: 10-40°C; Cátodo: Platino; Ánodo: Ag/AgCl ; Membrana: silicio de 1 ml y se puede utilizar en conjunto con los elementos de programación (software) proporcionados por el fabricante, por ejemplo, Dissolved Oxygen EZ (Pasco, EUA) . El sistema también puede incluir sensores de pH, ORP, conductividad o turbiedad en comunicación fluida con el sistema fluídico. En operación, el sistema de ORAC (o) descrito en este documento se puede utilizar como sigue: un usuario recolecta una muestra y la disuelve en o con un estuche de solventes de ORAC (o) (seco o líquido) . Un sensor de ORAC (o), por ejemplo, un sensor de oxígeno de resonancia de plasmón superficial portátil (véase, por ejemplo, el sensor SPREETA de Texas Instruments) es expuesto a uno o más estándares de calibración y luego es expuesto a la muestra del usuario. El sensor de oxígeno se conecta a un procesador que evalúa el resultado de la superficie del detector en el sensor y provee al usuario con una lectura. La lectura puede ser exhibida en una pantalla, puede ser impresa y/o transmitida a un procesador, memoria y similares. La muestra del usuario puede ser orina, saliva, lágrimas, secreciones mucosas, sudor, sangre (o productos sanguíneos) , tejido, heces u otras muestras biológicas que se . sospecha que tienen radicales de oxígeno. En un ejemplo, la muestra es una o más respiraciones (una o más inhalaciones y/o exhalaciones) que son colectadas por un respirador, por ejemplo, un respirador cerrado. Los valores detectados por el sensor pueden aún ser grabados en una memoria (volátil, semi-permanente o permanente) para referencia futura o para comparación con valores pasados o futuros para evaluar el estado oxidante del usuario . Los componentes básicos del ensayo de ORAC (o) para la actividad antioxidante de la presente invención toman ventaja de los métodos existentes similares a ORAC y por lo tanto son fácilmente adaptables para el uso en laboratorios sin la necesidad de entrenamiento extensivo, si existe. En resumen, la ORAC (o) utiliza un sensor de oxígeno, por ejemplo un sensor de oxígeno de plasma sanguíneo un sensor de oxígeno disoluble para medir la actividad pro-oxidante, por ejemplo al medir directamente las actividades relativas de una o más moléculas generadoras de radicales de oxígeno en la solución de muestra y un supresor oxidante (antioxidante) como estándares. Se debe observar que ciertos agentes, por ejemplo, agentes reductores o volátiles, que pueden conducir a la absorción o la producción de oxígeno en solución en ausencia de una fuente de radicales, por ejemplo AAPH, pueden afectar la cantidad de oxígeno en la solución. Utilizando la presente invención, el artífice experto puede diferenciar entre las actividades supresoras de radicales o no supresoras de radicales de las muestras al, por ejemplo, evaluar el comportamiento de la muestra en solución antes de la adición del iniciador de radicales libres. Se debe observar que las actividades tanto de supresión de radicales como de no supresión de radicales de las muestras sometidas a prueba, determinadas por medio del uso de la presente invención, se refieren al estado oxidante. Las actividades relativas del generador de radicales de oxígeno y el supresor de radicales de oxígeno pueden titularse y/o medirse a través del tiempo como con los métodos indirectos ORAC(fl), ORAC (fl-lipo) , ORAC (ß-PE) y similares . La Figura 2 es un diagrama de flujo 50 que resume los pasos básicos del método de la presente invención. En el paso 52, la sonda de oxígeno disoluble es equilibrada y/o calibrada en presencia de la mezcla de solvente : agua: detergente y se mide una línea de referencia. En un ejemplo, la mezcla de solvente : agua: detergente es una mezcla de acetona : agua : Tween-20MR en una relación de 1:1:1. En el paso 54, la determinación de una línea de referencia de la actividad antioxidante sirve como el control positivo y la línea de referencia para comparación de la actividad antioxidante utilizando, por ejemplo, TroloxMR como el antioxidante. Una ventaja del TroloxMR y las moléculas relacionadas es que estos derivados de Vitamina E son más estables de lote a lote, tienen menos variación del lote y son sintéticos, proporcionando con lo cual una concentración confiable de la actividad antioxidante . La mezcla en el paso 54 se combina, en el paso 56, con un objetivo de radicales de oxígeno, por ejemplo, ácido linoleico antes de la adición del generador de radicales de oxígeno en el paso 58. El ensayo se deja conducir y, en el paso 60, el área bajo la curva (AUC) es calculada al medir la desaparición del oxígeno disuelto a través del tiempo y el valor para la muestra se almacena. En serie o en paralelo, una muestra se disuelve en la mezcla de solvente : agua: detergente (paso 66) seguido por la adición del objetivo de radicales de oxígeno en el paso 68. Generalmente, es común utilizar el mismo tipo de objetivo de radicales de oxígeno en los pasos 56 y 68 y el mismo tipo de generador de radicales de oxígeno en los pasos 58 y 70. En el paso 72, el AUC para la muestra se detecta y el valor para la muestra se almacena. Ahora que se ha determinado el AUC para el estándar y el AUC para la muestra, los valores son normalizados al substraer el AUC para la solución blanco. Los valores normalizados del AUC para el estándar y la muestra entonces se utilizan para comparar y calcular el nivel de actividad antioxidante en la muestra.

La siguiente descripción se utiliza para ayudar a ilustrar la invención y no debe utilizarse para limitar su alcance. El detergente Tween 20MR puede ayudar en la dispersión del ácido linoleico. El ácido linoleico proporciona enlaces dobles a través de los cuales se puede absorber el oxígeno. TroloxMR es un antioxidante sintético que se utiliza como un estándar interno. Los valores obtenidos de todas las muestras son relacionados nuevamente con aquellos del Trolox™1. La molécula generadora de radicales de oxígeno: diclorhidrato de 2 , 2 ' -azobis- (2- amidinopropano) (AAPH) reacciona con el oxígeno para crear radicales centrados de carbono. Los radicales generados por AAPH causan la oxidación del ácido linoleico. Como resultado de la oxidación del ácido linoleico, los enlaces dobles del ácido linoleico se vuelven cetonas, enlazándose con moléculas de oxígeno en el radical centrado de carbono . La sonda de oxígeno toma mediciones de la velocidad a la cual el oxígeno está siendo removido de la cámara de reacción debido a la oxidación del ácido linoleico. El radical azo puede reaccionar directamente con el ácido linoleico, causando la formación de un radical de ácido linoleico. El radical de ácido linoleico entonces reacciona con el oxígeno presente en la cámara de reacción para formar una cetona. A través de cualquier mecanismo propuesto, el oxígeno es consumido debido a la oxidación del ácido linoleico. El antioxidante disminuye la velocidad del consumo de oxígeno en la cámara de reacción al impedir la oxidación del ácido linoleico. El cálculo del área bajo la curva para el diagrama de oxígeno disuelto contra tiempo produce una medición de la capacidad antioxidante de la muestra que es demostrada por su capacidad para disminuir la velocidad de la oxidación del ácido linoleico. Los generadores de radicales de oxígeno. Los generadores de radicales azo están presentes en el ensayo de ORAC (o) de la presente invención a una concentración conocida para generar radicales para mediciones de la actividad antioxidante . Los iniciadores azo incluyen, por ejemplo, diclorhidrato de 2 , 2 ' -azobis [2- (5-metil-2-imidazolin-2-il) propano] , diclorhidrato de 2 , 2 ' -azobis (2-amidinopropano) (AAPH), diclorhidrato de 2 , 2 ' -azobis (2-amidinopropano) [2- (N-estearil) amidinopropano] (SA-1) , diclorhidrato de 2 , 2 ' -azo (2- (2-imidazolin-2-il) -propano) - [2- [2- (4-n-octil) imidazolin-2-il] -propano] (C-8) , 2,2'-azobis (4-metoxi-2,4-dimetilvaleronitrilo) (MeO-AMVN) , 2,2'-azobis (2, 4-dimetilvaleronitrilo) (AMVN) , azo-bis-isobutilnitrilo, 2 , 2 ' -azobis (2-metilproprionato) (DAMP) y 2,2' -azobis- (2 -amidinopropano) . Por ejemplo, el generador de radicales diclorhidrato de 2 , 2 ' -azobis (2-amidinopropano) (AAPH) se descompone en nitrógeno molecular y dos radicales de carbono. Los radicales de carbono se combinan para dar por resultado productos estables o reaccionan con el oxígeno molecular para proporcionar radicales peroxilo. La vida media del AAPH es de aproximadamente 175 horas (37°C a pH neutro) . Por lo tanto, la velocidad de generación de radicales libres es esencialmente constante durante las primeras horas en solución. El AAPH se utiliza frecuentemente para la peroxidación de lípidos en dispersiones acuosas de ácidos grasos, como tal; se puede utilizar solo o en combinación con un generador de radicales lipófilos y/o lipófobos. El sistema de solventes descrito en este documento permite el uso de generadores de radicales ya sea o tanto lipófilos y/o lipófobos ya que el aparato mide el oxígeno total en la muestra. Sistema de Solventes. El sistema de solventes para la ORAC (o) es un sistema tripartita que incluye un solvente, una fase acuosa y un detergente. Por ejemplo, el solvente puede ser un solvente orgánico seleccionado de alcoholes, aminas, esteres, éteres glicólicos, glicoles, terpenos y/o mezclas de los mismos. El sistema de solventes orgánicos se formula para ser menos de aproximadamente 50%, alrededor de 30 o 33 por ciento, menos de 20% y en algunos casos menos de 10% de los componentes de solventes. En una modalidad, el solvente es acetona, el cual puede ser entre aproximadamente 10 y 90 por ciento en volumen/volumen del sistema de solventes de ORAC (o) , la porción acuosa de entre aproximadamente 10 y 90 por ciento en volumen/volumen del sistema de solventes de ORAC (o) y el detergente de 0.001 a 90% del sistema de solventes. Por ejemplo, el sistema de solventes de ORAC (o) puede ser un tercio de agua, un tercio de detergente ("un tercio" de solvente) y la muestra a una concentración de, por ejemplo, 1 mg/mL. Las diluciones entonces se hacen utilizando el mismo solvente. El detergente puede ser un detergente no iónico tal como T EENMR (es decir, TWEEN 20ffi) , BRIJ™1 O TRITONMR; un detergente zwitteriónico tal como CHAPS^; un detergente catiónico; o un detergente aniónico tal como colato, desoxicolato, dodeciisulfato de sodio o TWEEN 80^; o un surfactante . La relación del agua con acetona con detergente puede ser de entre aproximadamente 5% a 90% a 90% a 5%, respectivamente. A diferencia de la ORAC(fl), que utiliza un sistema de dos componentes que utiliza una mitad de acetona y una mitad de agua, los detergentes del sistema de solventes de ORAC (o) permiten una medición directa del oxígeno de la muestra total. Una variante es la ORAC(fl-lipo) que utiliza una ß-ciclodextrina metilada aleatoriamente . Usos para el Ensayo de ORAC (o) : El ensayo de ORAC (o) se puede utilizar para medir la actividad antioxidante total de muestras biológicas-, para la evaluación de componentes para los complementos nutricionales de la presente invención y aún para someter a prueba y evaluar el competidor y/o el complemento alimentario final de la presente invención. Para el uso en la evaluación de muestras biológicas, éstas pueden ser, por ejemplo, suero, una fracción de suero soluble en lípidos, una fracción de suero soluble en agua, orina, una fracción de orina soluble en lípidos, una fracción de orina soluble en agua, una fracción de LDL, homogenados de tejido, control de calidad de complementos antioxidantes, productos alimenticios o conservadores, el desarrollo de nuevos complementos antioxidantes, el desarrollo de nuevos productos alimenticios, nuevos conservadores o nuevas terapias antioxidantes, control de calidad de preparación y procesamiento de alimentos, evaluación de la actividad antioxidante de plantas o supervisión de la actividad antioxidante de productos cosméticos, por ejemplo.

EJEMPLO 1: Comparación de la Actividad Antioxidante Utilizando los Ensayos de ORAC(fl) y ORAC (o) Los ingredientes para una composición antioxidante se analizaron por la actividad antioxidante utilizando un método de capacidad de absorción de radicales de oxígeno de la técnica anterior que mide la fluorescencia (ORAC(fl)) y utilizando el método de la presente invención que mide el oxígeno disuelto (ORAC (o) ) . La actividad antioxidante de un producto es su capacidad para proteger al sistema del daño causado por radicales peroxilo. Método de la Técnica Anterior para Medir la Actividad Antioxidante para la Comparación. Para el ensayo de ORAC(fl) se siguió el método de Ou y colaboradores (Ou, B., Hampsch-Woodill, M. y Prior, R. L., J. Agrie. Food Chem. 2001, 49, 4619-4626) . Las diferencias del procedimiento de Ou como se publicó incluyeron la velocidad del agitador orbital (Ou, 400 rpm; en este documento, 280 rpm) y la velocidad de la centrífuga (Ou, 14,000 rpm, 15 minutos; en este documento, 3200 rpm, 15 minutos) y la longitud del ensayo (Ou, 30 minutos; en este documento, 100 minutos) . La fluoresceína, sal de sodio, se obtuvo de Aldrich (Milwaukee, Wl) . Para el método de Ou, se adiciona una cantidad estándar de fluoresceína a un producto antioxidante que es sometido a prueba y se mide el nivel inicial de la fluorescencia. Se adiciona un iniciador de radicales libres y se mide el tiempo y grado de desaparición de la fluorescencia. TroloxMR, ácido 6-hidroxi-2, 5, 7, 8-tetrametilcroman-2-carboxílico, es un derivado de vitamina E soluble en agua, permeable a las células con potentes propiedades antioxidantes . El TroloxMR impide la tensión oxidante mediada por peroxinitrito y la apoptosis en timocitos de rata y es un antioxidante sintético que es consistente de lote a lote y se utiliza como el estándar y la conducción para una comparación con cada muestra. Una solución blanco (control) utilizada en los cálculos del valor de ORAC (o) para cada muestra se puede incluir en cada corrida. La fluorescencia contra el tiempo se gráfica. La solución blanco (control) es sustraída de cada curva. El área bajo la curva neta del antioxidante se compara con el área bajo la curva neta del TroloxMR. Mientras más grande sea el área bajo la curva neta, mayor será la capacidad antioxidante de las moléculas en la muestra. Todos los análisis de ORAC(fl) se realizaron en un analizador de centrífuga COBAS FARA IIMR (Roche Diagnostic System Inc., Branchburg, NJ; longitud de onda de excitación = 493 nm y filtro de emisión = 515 nm) . Los resultados se proporcionan como micromoles de equivalentes de TroloxMR por gramo de muestra. Método para Medir la Actividad Antioxidante . En operación, el ensayo de ORAC (o) de la presente invención se utilizó para evaluar las composiciones antioxidantes, combinaciones y similares de las soluciones contra una molécula objetivo (ácido linoleico) con oxígeno presente en equilibrio con el aire. Se adiciona un iniciador de radicales libres y se mide el tiempo que toma para que el oxígeno desaparezca, produciendo la velocidad de desaparición. El TroloxMR se utiliza como el estándar y una solución blanco se corre como un control . La cantidad de oxígeno disuelto contra el tiempo se gráfica permitiendo la comparación directa de las áreas bajo la curva netas. Un método detallado es como sigue: Los reguladores (K2HP0 (F.W. 174.2), NaH2P04 (FW 120.0)) se obtuvieron de Sigma (San Luis, MO) . El ácido linoleico 99%, TroloxMR (ácido 6-hidroxi-2 , 5, 7, 8-tetrametilcroman-2- carboxílico) 97%, TWEEN 20MR y diclorhidrato de 2,2' -azobis (2-metilpropionamidina) 97% (AAPH) , se obtuvieron de Aldrich (Milwaukee, Wl) . La acetona de grado de C AR se obtuvo de Fisher (Hampton, NH) . Un medidor de oxígeno biológico YSI 5300A se obtuvo de YSI (Yellow Springs, Ohio) y se utilizó de acuerdo con las especificaciones del fabricante . Método de ORAC (o) . Se utilizaron las siguientes soluciones madre. Preparación del regulador de fosfato (75 mM, pH 7.4); K2HP04 750 mM (F.W. 174.2); Pesar 65.33 g en un matraz volumétrico de 500 mL y adicionar dH20 hasta la marca. La concentración es 750 mM. Almacenar la solución madre de K2HP04 750 mM en un refrigerador (2 a 8°C) equipado con un termómetro calibrado. La temperatura objetivo es 4°C. NaH2P04 750 mM (FW 120.0); Pesar 45.00 g en un matraz volumétrico de 500 mL y adicionar dH20 hasta la marca. La concentración es 750 mM. Almacenar la solución madre de NaH2P04 750 mM en un refrigerador (2 a 8°C) equipado con un termómetro calibrado. La temperatura objetivo es 4°C. Mezclar 40 ml de la solución madre de K2HP04 750 mM y 10 ml de solución madre de NaH2P04 750 mM (relación de 4 a 1) . Esto producirá 50 mL de la solución reguladora madre de ORAC. Almacenar la solución madre en un refrigerador (2 a 8°C) equipado con un termómetro calibrado. La temperatura objetivo es 4°C. Diluir la mezcla con dH20 (1:9) para elaborar una solución de trabajo del regulador de ORAC y medir el pH. Este debe ser 7.4. Mantener cubierto a temperatura ambiente hasta que esté listo para el uso. Preparación de TweenMR. Pesar 10 g de Tween 2O™1 y adicionar 90 g de agua desionizada. Cubrir y agitar la mezcla durante toda la noche. La solución madre de Tweenm se mantiene durante una semana. Mantener sobre el mostrador. Preparación del Solvente. Mezclar 25 mL de acetona, 25 mL de agua desionizada y 25 mL de Tween 20MR. Utilizar este solvente para preparar las muestras. Antes de que se realice una corrida: la sonda debe ser inspeccionada por algún daño poniendo atención particular a la membrana, reemplazar si es necesario. Las sondas deben ser almacenadas con las puntas en agua desionizada. Solo se debe utilizar una sonda y una cámara de reacción para este ensayo. Conducir una solución blanco y Trolox"11 (a 10 µg/ml o 0.03995 µmol/ml) cada 8 horas.

Las muestras deben ser corridas a una concentración de 10 µg/ml. La concentración de las muestras y la concentración de TroloxMR deben ser las mismas. Las diluciones se preparan al pesar 1 mg de la muestra y adicionar 1 ml de solvente para realizar la extracción inicial. Agitar durante una hora, colocar 0.5 ml de solución de extracción inicial en un frasquito de centelleo de vidrio y luego adicionar 4.5 ml de solvente, haciendo la primera dilución. Agitar la primera dilución durante aproximadamente 30 segundos. Su concentración es 0.1 mg/ml o 100 ppm. Tomar 0.5 ml de la primera dilución, colocarla en otro frasquito de centelleo de vidrio y entonces adicionar 4.5 ml de solvente, agitar durante aproximadamente 30 segundos, para producir una concentración de 0.01 mg/ml o 10 ppm. Tomar 0.5 ml de la muestra del frasquito y colocarla en otro frasquito de centelleo de vidrio y entonces adicionar 4.5 ml de solvente, agitar durante aproximadamente 30 segundos, para producir una concentración de 0.01 mg/ml o 10 ppm. Los frasquitos se colocan en un refrigerador a 4°C. En un baño de agua a 37°C, permitir que el ácido linoleico se derrita y preparar una solución de ácido linoleico (con luz mínima) al adicionar 0.18 mL de solución madre de Tween"11, 0.18 mL de regulador y 0.44 mL de agua desionizada a 70.8 mg de ácido linoleico. Mantener el tubo de la solución enrollado en una hoja delgada de metal. Elaborar una solución de ácido linoleico reciente cada 8 horas. Preparar el generador de radicales de oxígeno, pesar 67.8 mg de AAPH y disolver en 0.9 mL de regulador. Mantener el AAPH refrigerado, puede utilizarse durante hasta ocho horas. Agitar durante 1 hora. La solución de TroloxMR debe mantenerse refrigerada en todo momento. Para comenzar la medición de la actividad antioxidante, adicionar 1.86 mL de regulador en cada recipiente de reacción, 2.36 mL de agua, a los frasquitos de centelleo a 37°C y permitir tres minutos de agitación mientras la matriz de reacción llega a la temperatura. Adicionar 0.284 mL de la muestra y colocar la punta de la sonda en el recipiente sin tocar la solución de reacción y permitir un minuto de agitación. Las mediciones se hacen mejor en un ambiente hermético a la luz . Después de la captura de datos, remover la sonda de la cámara, adicionar 0.357 mL de cada solución de ácido linoleico y colocar nuevamente el extremo de la sonda dentro de la cámara inmediatamente. Adicionar 0.357 ml de solución de AAPH y colocar la sonda dentro del tubo de la solución de manera cuidadosa pero rápidamente de manera que no se dejen burbujas en el área de reacción y la solución no esté en el reborde de rebose sobre la cubierta de la sonda. Después, colocar la sonda dentro de la solución y tomar una lectura. Capturar los datos y calcular la actividad antioxidante. Las muestras se prepararon a una concentración de 1 mg/mL en "un tercio de solvente" (también referido como el sistema de solventes de ORAC (o) ) . Un "tercio" de solvente es partes iguales de agua, acetona y una solución de TWEEN 20MR diluida 1:9 con agua. Las muestras se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital a 280 rpm. La solución de muestra estuvo lista -para el análisis después de la dilución adicional (generalmente a 10 µg/mL) con "un tercio" de solvente. "Un tercio" de solvente también se utilizó como la solución blanco. El ensayo de ORAC (o) se llevó a cabo utilizando el medidor de oxígeno biológico YSI 5300A. El ácido linoleico se preparó al adicionar 0.18 mL de regulador de fosfato 75 mM (pH 7.4), 0.18 mL de solución madre de TWEEN 20MR 10 por ciento en peso y 0.44 mL de agua desionizada a 70.8 mg de ácido linoleico. El AAPH se preparó al adicionar 0.9 mL de regulador a 67.8 mg de AAPH. En el volumen de reacción final (5.218 mL) , el ácido linoleico (21.59 mM) se utilizó como el objetivo del ataque de radicales libres y el AAPH (19.00 mM) se utilizó como un generador de radicales peroxilo. El TroloxMR (a 10 µg/mL) se utilizó como un estándar. Las lecturas se tomaron cada segundo hasta que se observó una lectura cero.

La fórmula para calcular el valor de ORAC (o) (electrodo específico para el oxígeno de la Capacidad de Absorbancia de Radicales de Oxígeno) es : AUCSMP-AUCBLNK X 1000 (mg gr) X [TRLX (µmol/ml)] AUC?UX-AUCBLNK ORAC(o)~ " [SMP (mg/ml)] Alternativamente la ORAC (o) puede calcularse en mililitros cuando se evalúa una fórmula líquida. Este cálculo produce una cantidad conocida como micromoles de equivalentes de TroloxMR por gramo de muestra. Una ORAC (o) de valor negativo refleja menos actividad de supresión de radicales que la obtenida con una solución blanco que indica que una composición es un pro-oxidante, es decir, un agente que promueve la oxidación, más que actuar como un antioxidante . Una hipótesis del ensayo de ORAC (o) es que el oxígeno no está siendo absorbido o liberado por la muestra, sin embargo, cualquier efecto en el nivel de oxígeno de la muestra puede evaluarse y utilizarse para la compensación en el valor del antioxidante calculado. Comparación de Parámetros de los Ensayos de ORAC(o) y ORAC(fl). Las ventajas de la ORAC(o) en comparación con la ORAC(fl) se midieron en una medición directa contra indirecta del potencial antioxidante . La ORAC(fl) es un método de detección de radicales de oxígeno indirecto debido a que depende de la hipótesis que la fluoresceína (molécula objetivo) es el único componente fluorescente que se mide. Sin embargo, muchos compuestos antioxidantes producen fluorescencia naturalmente (por ejemplo, los arándanos); y las combinaciones de estos compuestos de reacciones de radical-radical también producen fluorescencia. Por lo tanto, la fluorescencia de la muestra puede tergiversar los resultados de un ensayo basado en la fluorescencia. Por otra parte, el método de ORAC (o) es una medición directa de la captación de oxígeno, esto es, una medición directa de la desaparición de oxígeno en los radicales libres. Este método de medición de la capacidad antioxidante no es dependiente de si el oxígeno se une a componentes solubles en agua o a lípidos. Una comparación de los parámetros de ensayo de los métodos de ORAC(fl) y ORAC (o) se proporciona en la Tabla 1.

Tabla 1: Comparación de Parámetros de Ensayo para ORAC(fl) y ORAC (o) Parámetro de Ensayo ORAC(fl) ORAC(o) Durante el Ensayo Temperatura 37°C 37°C concentración de AAPH 1.28 x 10 en regulador de 19.00 mM en regulador de fosfato fosfato Concentración de fluoresceína, 43.8 nM en ácido linoleico 21.59 nM, en molécula objetivo regulador de fosfato mezcla de TWEEN 20MR 10%, regulador y agua (.18 mL, .18 mL, .44 mL) Concentración de la inicialmente a 500 mg en 20 1 mg/mL inicialmente, diluida muestra mL, sobrenadantes diluidos a a 10 µg/mL 10 µg/mL con regulador Solvente de la muestra diluciones de acetona/agua, diluciones de 50/50 v/v en regulador de agua/acetona/10% en peso fosfato de TWEEN 20MR, v/v/v ("un tercio" de solvente) en "un tercio" de solvente Regulador para el fosfato 75 M, pH 7.4 fosfato 75 mM, pH 7.4 ensayo, concentración Volumen de ensayo final 400 µl 5.218 mL Solución blanco (control) regulador "un tercio" de solvente Estándar 62.5 µM de Trolox .MmR? en Trolox .M' R . a 10 µg/mL (38.755 regulador µM) en "un tercio" de solvente Una ventaja distinta de la presente invención es que el usuario no necesita aprender nuevas técnicas o adquirir equipo para incorporar el presente aparato y método en su ambiente de laboratorio. Por ejemplo, cuando se mide la saturación de la muestra, la presente invención utiliza muchos de los mismos reguladores, condiciones, pasos de extracción y/o separación como en el sistema de medición indirecta bien establecido que fue desarrollado por, por ejemplo, Ou y colaboradores. Ou y colaboradores prepararon muestras en acetona/agua (50:50, v/v) a una concentración de 500 mg en 20 mL, las agitaron en un agitador giratorio a 400 rpm durante 1 hora, las centrifugaron a 14,000 rpm durante 15 minutos y las diluyeron con regulador de fosfato de potasio 75 mM a pH 7.4 (Ou y colaboradores, Development and Validation of Oxigen Radical Absorbance Capacity Assay for Lipophilic Antioxidants Usings Randomly Methylated-ß-Cyclodextrin as the Solubility Enhancer, J. Agrie. Food Chem. 2002, 50, 1815-1821) . Los presentes inventores encontraron que una gran parte de una muestra de prueba no entraría en solución bajo las condiciones de Ou (condiciones de ORAC(fl)), los componentes mas solubles desplazan a los componentes menos solubles. Consecuentemente, solo aquella porción de la muestra que fue solubilizada bajo las condiciones de ORAC(fl) se incluyó en la muestra y medición de ORAC(fl). Por lo tanto, no es probable que una solución de sobrenadante hecha de acuerdo con el método de ORAC(fl) para el análisis sea representativa de la actividad antioxidante total de la muestra real . Puesto que una solución de una muestra en el regulador de ORAC(fl) no refleja siempre los contenidos de la muestra, los resultados pueden ser tergiversados utilizando la ORAC(fl) . El problema con la disolución de las muestras fue reconocido y se observó una falta de contribución de los tocoferoles mezclados para una medición de antioxidantes llevada a cabo sobre una mezcla de quercetina y tocoferoles mezclados cuando se utilizó la ORAC(fl) . Como se muestra en la FIGURA 7, utilizando el sistema de ORAC (o), se encontró que el efecto antioxidante de la combinación de quercetina a 5 µg/mL y tocoferoles mezclados a 5 µg/mL en comparación con cada ingrediente por separado a 10 µg/mL. En contraste, el sistema indirecto de ORAC(fl) no muestra un efecto adicional de la misma combinación que va más allá del valor de la quercetina sola (véase la FIGURA 11) . La falta de actividad de esta combinación con los tocoferoles mezclados y los problemas de saturación están ausentes del método de ORAC (o) puesto que la concentración de la muestra es más diluida y puesto que el solvente para la muestra contiene acetona, agua y un detergente para solubilizar todos los componentes de una muestra. La presencia de TWEEN 20MR en el solvente para la muestra explicó la detección de la actividad de los tocoferoles mezclados. Como un control para la actividad del TroloxMR, la FIGURA 7 muestra la quercetina a 5 µg/mL y los tocoferoles mezclados a 5 µg/mL en comparación con cada ingrediente por separado a 10 µg/mL pero también incluye el control de Trolox"11 y demuestra la capacidad de ORAC (o) para detectar el nivel de radicales de oxígeno que permanecen en la muestra a través del tiempo. La ORAC (o) proporciona un ahorro significativo en comparación con la ORAC(fl) más costosa (automatizada alrededor de $250,000; no automatizada alrededor de $50,000) . En contraste, el aparato de ORAC (o) descrito en este documento toma ventaja de los sistemas de sensores de oxígeno disponibles comercialmente que pueden ser miniaturizados fácilmente y/o automatizados de manera que puedan ser desarrollados para la venta a consultorios y aún para el uso en el hogar a una fracción de los costos de los grandes sistemas de detección de fluorómetros . La validación, conducida por las guías de la Asociación de Químicos Analíticos Oficial (AOAC, por sus siglas en inglés) para la validación de laboratorio individual, proporcionó los resultados en las Tablas 2, 3 y 4.

Tabla 2 : Prueba de 5 Días para la Precisión (Repetibilidad) Los valores para cada día son un promedio de 3 corridas de la muestra de quercetina a una concentración de 10 µg/mL. El valor HORRAT es la relación entre los valores RSDR observados y los valores RSDR pronosticados por la ecuación Horwitz conocida para aquellas personas expertas en el campo y se considera como una indicación de la aceptabilidad de un método con respecto a su precisión. En un estudio de desempeño de laboratorio individual, una serie de relaciones de HORRAT entre 0.5 y 2.0 indican la precisión aceptable de un método. El valor HORRAT para la prueba de 5 días es 1.98. Una determinación del intervalo analítico como un intervalo lineal se proporciona en la Tabla 3.

Tabla 3. Determinación del Intervalo Analítico y = 2.8335X + 332.16; R2 = 0.9231 para la gráfica de 1-1000 y = 4.3353x + 176.66; R2 = 0.9967 para la gráfica de 0-500 La integridad lineal parece declinar a medida que la concentración de la muestra se acerca a 1000 µg/mL. Con la determinación del intervalo analítico como un intervalo lineal, se determina el valor del área bajo la curva de concentraciones variables hasta 500 µg/mL. La Tabla 4 proporciona los resultados para la precisión de los resultados de días individuales .

Tabla 4. Prueba de Días Individuales para la Precisión (Repetibilidad) La prueba de precisión de días individuales involucró 5 corridas separadas de la muestra de quercetina a una concentración de 10 µg/mL. El valor HORRAT de la Tabla 4 para el método de ORAC (o) es 0.65448. El ensayo de ORAC (o) se utilizó para optimizar las relaciones de los ingredientes en una composición antioxidante como se expone en el Ejemplo 2. Una modalidad de la composición tiene relaciones en peso de quercetina, 49.18%; tocoferoles mezclados, 32.79%; extracto de cascara de uva, 9.84%; extracto de té verde, 6.56%; y ciruelo arbustivo, 1.64% para proporcionar un valor antioxidante utilizando la ORAC (o) de 17,254 micromoles de equivalentes de TroloxMR por gramo. La misma composición proporcionó un valor antioxidante utilizando la ORAC(fl) de 5,281 micromoles de equivalentes de TroloxMR por gramo. Estos datos demuestran que los métodos de ORAC (o) y ORAC(fl) para medir la actividad antioxidante difieren en los resultados obtenidos debido a las limitaciones del método indirecto de ORAC(fl) .

EJEMPLO 2 : Una Composición Antioxidante Sinérgica De acuerdo con el complemento alimentario de la presente invención, cinco ingredientes se combinaron en una composición antioxidante, cada uno de los cuales es prominente en la dieta de personas longevas de regiones alrededor del mundo. Los presentes inventores seleccionaron ingredientes basados en una investigación completa de las dietas en áreas conocidas por la longevidad. Los presentes inventores reconocieron que las dietas en estas regiones eran ricas en flavonoles y tocoferoles. Los inventores además reconocieron que ciertos compuestos naturales interactúan favorablemente con moléculas que reactivan su actividad antioxidante, por ejemplo, la vitamina C. De hecho, la investigación extensiva soporta el papel de la vitamina C en la regeneración de, por ejemplo, a-tocoferol (Pizzorno y Murray, Textbook of Natural Medicine, 1999, 2a Ed. Nueva York, Churchill Livingston) . En base a esta investigación, los inventores combinaron extractos aislados y purificados de fuentes naturales y otras fuentes que incluyen altos porcentajes de compuestos biodisponibles de las diversas regiones de personas longevas en una formulación. En un ejemplo de la presente invención, se seleccionaron los siguientes ingredientes básicos: flavonoles, tocoferoles mezclados, extracto de cascara de uva, extracto de té verde o ciruelo arbustivo son prominentes en la dieta de personas de la aldea Andean de Vilcabamba en Ecuador, la población de Huza en Karakoram Range en Cachemira o en Abkazia en el estado Georgiano de la antigua Unión Soviética, por ejemplo, como es citado en Leaf A. , Launois J. "A Scientist Visits Some of de World' s Oldest People" , National Geographic Enero de 1973; de la isla italiana de Sardinia (Koenig R. "Sardinia's Mysterious Male Methuselahs" , Science . 2001, 16 de Marzo) y de Australia. Las composiciones de la presente invención demostraron una actividad antioxidante sinérgica. Sin esperar que sean limitados por alguna teoría, los diversos ingredientes de la composición antioxidante tienen actividad para proteger el citosol intracelular, membranas celulares y fluido extracelular de tal manera que el cuerpo está protegido en todo respecto . El componente de ciruelo arbustivo tiene un alto contenido de, por ejemplo, vitamina C natural, el cual puede introducirse en la célula, es hidrófilo y está disponible para proteger el citosol; el extracto de cascara de uva y el extracto de té verde son hidrófilos, no pueden entrar a la célula y están disponibles para proteger el fluido extracelular; y los tocoferoles mezclados son lipófilos y junto con los flavonoles (por ejemplo, quercetina), los cuales son tanto hidrófilos como lipófilos protegen las membranas. Además, cualquier fibra que esté incluida en la dieta, o aún en el complemento alimentario mismo, puede proporcionar un vehículo adecuado para la eliminación. Componentes de la composición Antioxidante Sinérgica. Con la disponibilidad del aparato de ORAC (o) y los métodos de la presente invención, los presentes inventores fueron capaces de medir la actividad antioxidante total de la combinación de antioxidantes tanto lipófilos como lipófobos y otros agentes que ayudan en la potenciación de la actividad antioxidante de estos agentes, por ejemplo la vitamina C y similares. Utilizando el sistema de ORAC (o), se desarrolló una composición antioxidante que tiene actividad sinérgica que incluye flavonoides, por ejemplo, quercetina, una mezcla de al menos dos formas de vitamina E y opcionalmente extracto de cascara de uva, extracto de té verde y ciruelo arbustivo australiano. El sinergismo se observa particularmente en una relación en peso de quercetina con la mezcla de formas de vitamina E de 40/60 a 90/10%. Una modalidad de la composición incluye las siguientes relaciones en peso: quercetina, 49.18%; tocoferoles mezclados, 32.79%; extracto de cascara de uva, 9.84%; extracto de té verde, 6.56%; y ciruelo arbustivo, 1.64%. La FIGURA 6 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de ORAC (o) que compara la quercetina, tocoferoles mezclados y una mezcla de tocoferoles y quercetina y el estándar antioxidante sintético: TroloxMR (Hoffman-La Roche) . Flavonoides tales como Quercetina. El flavonoide de la composición puede ser una flavona, un flavonol, una isoflavona, un isoflavonol, un análogo de los mismos, una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos o una mezcla de los mismos. Los ejemplos de un flavonol incluyen quercetina, kaemferol y miricetina. El flavonoide particular o el análogo o sal de flavonoide incluido en la composición se determina al correr una determinación antioxidante de ORAC (o) . Una actividad dentro de 80% de aquella de la quercetina se contempla para proporcionar un análogo. La referencia a un flavonoide, en particular quercetina, también se propone para referirse a la aglicona o un glicósido de la misma donde el azúcar es arabinosa, ramnosa, galactosa o glucosa, por ejemplo. El glicósido ramnosa de quercetina es conocido como rutina o quercetrina y el glicósido ramnosa de miricetina es conocido como miricitrina. Los análogos de quercetina incluyen aquellos compuestos que comprenden un grupo sustituyente diferente de un grupo -OH en una o más de las posiciones 3, 5, 7, 3' y 4'. Otros grupos sustituyentes incluyen: alquilo, menor de 5 átomos de carbono, acetilo, sulfilo y malonilo. Para los análogos de quercetina, solo una o dos de las posiciones son sustituidas por cualquier otro grupo diferente de -OH. Los flavonoides tales como quercetina son sintetizados fácilmente in vitro. Sin embargo, los flavonoides (inclusive quercetina) están presentes y pueden aislarse y purificarse de, por ejemplo, alimentos de origen natural en particular, frutas y verduras, tales como manzanas, peras, uvas, cebollas, vino tinto, pimientos dulces, grosellas rojas, casis, limones, cerezas, arándanos, grosellas silvestres, tomates, aceitunas, rábanos, colirrábanos, rábanos picantes, papas y espárragos. La quercetina puede obtenerse de Pharmline (Florida, NY) . Ciruelo Arbustivo: El ciruelo arbustivo australiano ( Terminalia ferdinandiana) contiene aproximadamente 5% de vitamina C y una variedad de ingredientes como se demuestra por medio de la cromatografía CLAR (no se muestran los datos) . Se cree que estos ingredientes incluyen flavonas y flavonoides . La cromatografía CLAR es de una columna C18 de fase inversa utilizando un gradiente progresivo de 0.1% de ácido trifluoroacético y 100% de metanol, a una velocidad de flujo de 1 mL/minuto utilizando una muestra de metanol y polvo de ciruelo arbustivo deshidratado. Las condiciones se desarrollaron para separar los flavonoides y para separar la vitamina C. La absorbancia se midió a 245 nm. La pulpa y la cascara de un ciruelo arbustivo se remueven de la semilla de la fruta y se elabora una suspensión espesa en agua. La suspensión espesa es liofilizada y molida. Para las composiciones antioxidantes de este documento, el material liofilizado es pesado en la cantidad deseada. El ciruelo arbustivo está presente en la composición de la presente invención en una cantidad de 0% a 87.9% o en otra modalidad, en aproximadamente 2% en peso. Extracto de cascara de uva. El extracto de cascara de uva se elabora de cascaras de uva y contiene 30- 82% de polifenoles y puede obtenerse de Polyphenolics, Madera, CA; Hunan Kinglong, Bio-Resource Co . Ltd, Changsha Economic Development Zone, China; o de Pharmline, Florida, NY. Extracto de té verde. El extracto de té verde es un extracto de las hojas de Camellia sinensis, contiene 35- 95% de polifenoles y se puede obtener de Amax NutraSource Inc., Eugene, OR; Blue California, Rancho Santa Margarita, CA; o de PL Thomas & Co., Morristown, N.J. Otros Ingredientes. Las composiciones antioxidantes de la presente invención pueden incluir uno o más portadores farmacéuticamente aceptables no tóxicos tales como lactosa, almidón, sacarosa, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, manitol, sorbitol, ciclodextrina, derivados de ciclodextrina o similares. Utilizando uno o más de estos portadores, las cápsulas o tabletas pueden formularse fácilmente y se pueden hacer fáciles de ingerir o masticar. Las tabletas pueden contener portadores, sustancias aglutinantes, lubricantes, diluyentes, agentes desintegrantes, agentes colorantes, agentes saborizantes, agentes inductores de flujo o agentes de fusión adecuados. Una tableta se puede elaborar por medio de la compresión o el moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes adicionales. Las tabletas comprimidas se pueden preparar al comprimir el ingrediente activo en una forma que fluye libremente (por ejemplo, polvo, granulos) mezclado opcionalmente con una sustancia aglutinante (por ejemplo, gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa) , lubricante, diluyente inerte, conservador, desintegrante (por ejemplo, glicolato de almidón sódico, carboximetil-celulosa reticulada) agente tensoactivo o dispersante. Las sustancias aglutinantes adecuadas incluyen almidón, gelatinas, azúcares naturales tales como glucosa y beta- lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como goma acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, ceras o similares. Los lubricantes utilizados en estas formas de dosificación incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio o similares. Los desintegrantes incluyen, por ejemplo, almidón^ metilcelulosa, agar, bentonita, goma de xantano o similares . Las tabletas moldeadas se pueden elaborar al moldear en una máquina adecuada una mezcla del ingrediente activo en polvo que está humedecido con un diluyente líquido inerte . Las cápsulas o tabletas pueden ser recubiertas o marcarse opcionalmente y pueden formularse para proporcionar una liberación lenta o controlada de la composición antioxidante . Las composiciones de liberación temporizada para la liberación controlada de agentes contienen generalmente partículas de agentes mezcladas con o recubiertas con un material que es resistente a la degradación o desintegración entérica durante un período de tiempo seleccionado. La liberación del agente puede ocurrir por la adherencia como sanguijuela, erosión, ruptura, difusión o acciones similares . Los portadores pueden promover la estabilidad antioxidante así como también proporcionar la liberación a través del tiempo. Una mezcla de carbohidratos vegetales denominada fórmula AMBROTOSE PhytoMR puede combinarse con la composición antioxidante. Esta combinación extiende la vida de anaquel de la composición antioxidante y proporciona una forma de liberación a través del tiempo. La fórmula AMBROTOSE PhytoMR contiene, en una relación en peso/peso de aproximadamente 30/30/20/19/1, goma arábiga, (goma acacia), goma de xantano, goma de tragacanto, goma ghatti (la cual se puede obtener de TicGum) y un extracto de gel de aloe vera (por ejemplo gel de hoja interior, Carrington Labs, Irving, TX, polvo MANAP0LMR o un producto similar) . La fórmula AMBROTOSE PhytoMR es combinada con la composición antioxidante de la presente invención en una relación en peso de 2:1 a 1:2. En otra modalidad, la fórmula AMBROTOSE PhytoMR es combinada con la composición antioxidante en una relación en peso de 2:1.

Las cápsulas o tabletas pueden contener componentes vegetales adicionales en porcentajes en peso menores que aproximadamente 0.1% a 90% dependiendo de la formulación específica. En el caso de portadores, los portadores mismos no tendrán generalmente un efecto nutricional significativo para la composición, sin embargo, estos portadores pueden tener una significancia en el perfil de liberación, temporización y ubicación de la liberación de las cantidades nutricionalmente efectivas de la presente invención. Por ejemplo, uno o más de los antioxidantes de la presente invención pueden ser liberados en uno o más bolos para anular los niveles antioxídantes detectados en, por ejemplo, la sangre y la orina, en una serie de eventos de liberación. En otra modalidad, los antioxidantes pueden ser liberados algo uniformemente equitativamente o pueden ser proporcionados aún como un gradiente con anulaciones en los niveles en la sangre o la orina. De hecho, la presente invención puede incluir aún la liberación de antioxidantes lipófobos y lipófilos en diferentes momentos y/o ubicaciones durante la digestión. Por ejemplo, se puede proporcionar un antioxidante en un portador efervescente para la liberación inmediata, mientras que se proporciona un antioxidante diferente para la liberación por, por ejemplo, el ácido estomacal o en el tracto intestinal.

Procesos de Formulación. Un proceso para formular una composición antioxidante compactada ' con rodillos comprende mezclar la fórmula AMBROTOSE PhytoMR con la composición antioxidante expuesta en este documento. La mezcla resultante se transfiere a un compactador de rodillos y es compactada entre rodillos para formar un producto compacto. La presión impartida sobre la mezcla aumenta la adherencia física entre los ingredientes . El producto compacto es molido subsecuentemente para formar una granulación. Entonces se forma una granulación en la forma de dosificación deseada tal como cápsulas o tabletas . En un ejemplo, un compactador de rodillos Fitzpatrick Chilsonator Modelo 4LX10D se puede utilizar con rodillos que están ranurados transversalmente con respecto a la cara y giran perpendicularmente, que tienen una fuerza fija de 10 toneladas y una criba Fitzmill de aproximadamente 0.093. El dispositivo de compactación de rodillos puede tener capacidades variables de velocidad de rotación, aplicación de fuerza y anchura de abertura, por ejemplo, un sistema compactador de rodillos en seco Gerteis Polygran (Gerteis, Alemania) . El compactador de rodillos funciona al aplicar presión uniformemente sobre una mezcla al pasar la mezcla entre dos rodillos que giran en sentido contrario. La presión impartida sobre la mezcla por los rodillos comprime la mezcla en un material compacto, tal como una lámina o una cinta, el cual es molido típicamente para producir granulos. Alternativamente, la granulación se puede lograr mediante la elaboración de trozos, la molienda y el tamizado como pueda requerirse. Los granulos que tienen un tamaño de malla #20-80 se seleccionan. Una vida de anaquel más larga de la combinación compactada con rodillos de la composición antioxidante con la fórmula AMBROTOSE PhytoMR se cree que es debido a la reducción en la cantidad de área superficial de la composición antioxidante que está expuesta al oxígeno. La combinación compactada con rodillos también elimina la necesidad de materiales de relleno excipientes en el proceso de elaboración de cápsulas o tabletas. Los beneficios adicionales . de una combinación de la fórmula AMBROTOSE PhytoMR con la composición antioxidante expuesta en este documento incluyen: la provisión de fibra no soluble que puede servir como un depósito para los electrones impares en el intestino y la provisión de monosacáridos para corregir la estructura de glicoformas celulares responsables de la comunicación mediada por células en la reparación de células dañadas por los radicales libres. Dosificación. Las formulaciones de dosificación útiles para la administración de las composiciones de la presente invención .incluyen cápsulas o tabletas de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 mg de composición antioxidante . En una modalidad, no se adicionan materiales de relleno, portadores o estabilizadores a la composición. En otra modalidad, la fórmula AMBROTOSE Phyto"11 se mezcla con la composición antioxidante de la presente invención en una relación en peso de 2:1, 1:1 o 1:2. En otra modalidad, la fórmula AMBROTOSE PhytoMR se mezcla con la composición antioxidante en una relación en peso de 2:1. En otra modalidad, una cápsula o tableta proporciona 500 mg de composición antioxidante mezclada con la fórmula AMBROTOSE Phyto"R. Para esta modalidad, se pueden tomar dos tabletas o cápsulas al día. Se pueden aplicar recubrimientos apropiados para incrementar la palatabilidad o para retardar la absorción. La FIGURA 8 y la FIGURA 9 muestran los resultados del área bajo la curva (AUC) NETA para relaciones variantes de quercetina y tocoferoles mezclados utilizando el método de ORAC (o) para medir la capacidad antioxidante. La concentración total de la muestra (Q + MT) es 10 µg/mL para cada porcentaje evaluado. Por ejemplo, a 0% de quercetina, la concentración de tocoferoles mezclados es 10 µg/mL y no existe quercetina en la muestra. A 10% de quercetina, la muestra tiene 1 µg/mL de quercetina y 9 µg/mL de tocoferoles mezclados. A 20% de quercetina, la muestra tiene 2 µg/mL de quercetina y 8 µg/mL de tocoferoles mezclados. La sinergia se observa fácilmente entre 40 y 100% de quercetina y se observa más fácilmente de 40 a 90% de quercetina. La línea recta representa el efecto aditivo, es decir, a 10% de quercetina, la línea representa la suma 5 de 90% de la actividad de los tocoferoles mezclados solos y 10% de la actividad de la quercetina sola. Sobre esta línea se encuentra un efecto sinérgico. Los ingredientes antioxidantes primarios de la composición de la presente invención (flavonoides, 10 representados por quercetina, y una mezcla de al menos dos formas de la vitamina E) comprenden de 12.1% a 100%, 30% a 85% o en otra' modalidad aproximadamente 82% en peso de los cinco ingredientes. En una modalidad, la cantidad de quercetina es 49.18% y la cantidad de las formas de -15 vitamina E es 32.79% del peso total de los cinco ingredientes . Los ingrediente secundarios (o potenciadores) de la composición de la presente invención (extracto de cascara- de uva, extracto de té verde y ciruelo arbustivo) 20 comprenden de 0% a 87.9%, 15% a 70% o aproximadamente 18% en peso de los cinco ingredientes . Como se muestra en la FIGURA 10, la relación óptima del extracto de cascara de uva y el extracto de té verde se determinó en presencia de 49.18% de quercetina, 32.79% de tocoferoles mezclados y 25 1.64% de ciruelo arbustivo. La relación óptima del extracto de cascara de uva con el extracto de té verde es 60/40 a 80/20. En una modalidad, el extracto de cascara de uva es 9.84% y el extracto de té verde es 6.56% del peso total de la composición antioxidante . El ciruelo arbustivo ( Terminalia ferdinandiana) se proporciona como un ingrediente de la composición en una cantidad de entre aproximadamente 0% a 87.9% o en otra modalidad de aproximadamente 2%. En la modalidad de la FIGURA 10, el ciruelo arbustivo es 1.64% de la composición. El ensayo de ORAC (o) muestra que una mezcla antioxidante que tiene las siguientes relaciones en peso: quercetina, 49.18%; tocoferoles mezclados, 32.79%; extracto de cascara de uva, 9.84%; extracto de té verde, 6.56%; y ciruelo arbustivo, 1.64% tiene una actividad antioxidante de 17,254 micromoles de equivalentes de Trolox"11 por gramo. Estabilidad de AMBROTOSE A?"R. AMBROTOSE A?"R, una mezcla de AMBROTOSEMR (Mannatech, EUA) y la formulación antioxidante de la presente invención a una relación en peso de 2:1, se ha mostrado que mantiene su actividad bajo condiciones de estabilidad acelerada (40 °C a 75% de humedad relativa) que igualan a una vida de anaquel de aproximadamente seis meses . Validación del ensayo de ORAC (o) en comparación con el ensayo de ORAC(fl) . La FIGURA 11 es una gráfica de los resultados de ORAC(fl) que no muestra una contribución a la actividad AO por el a-tocoferol cuando se mezcla en diferentes relaciones con quercetina. La gráfica muestra un incremento lineal en AUC que es directamente proporcional al incremento en la concentración de quercetina en el ensayo de ORAC(fl) en la solución estándar de acetona : agua . La falta de contribución a la actividad AO puede ser debido a la falla del a-tocoferol para disolverse en acetona : agua . Las FIGURAS 12A y 12B son gráficas de los resultados de la ORAC (fl-lipo) utilizando tocoferol mezclado y los resultados relativos de AUC utilizando la solución de solvente/agua/detergente para disolver la muestra y para detectar la capacidad de antioxidantes tanto lipófilos como lipófobos. En la FIGURA 11 (anteriormente) se mostró que no se pudo detectar una actividad estadísticamente significativa para el a-tocoferol utilizando el método estándar de ORAC(fl) para detectar la contribución de AO de los AOs lipófilos. Como se muestra en la FIGURA 12A, el AUC de ORAC (fl-lipo) para el a-tocoferol se comparó entre el método publicado de ORAC(fl-lipo) (acetona: agua) y acetona: agua: Tween-2o"11 y se detectó un gran incremento en la AUC del ensayo de ORAC (fl-lipo) . La FIGURA 12B demuestra que no existe sinergia detectada utilizando el método conocido de ORAC (fl-lipo) cuando se combina la quercetina y tocoferoles mezclados ya que los resultados siguen una línea recta a través de la abscisa, lo cual indica la falta de sinergia utilizando este ensayo. La obtención de estos resultados con ensayos conocidos no se basa sorprendentemente en una investigación de la bibliografía y los métodos recomendados en la misma. Los estándares actuales para la evaluación de los comúnmente llamados "Alimentos con Alta ORAC" (véase www . ars . usda . gov) indican que el estándar es para medir el potencial antioxidante de los antioxidantes lipófilos por separado de los antioxidantes lipófobos. La presente invención elimina la necesidad de esta dicotomía, una dicotomía que da por resultado probablemente la desconexión que los investigadores han observado cuando se relacionan los valores de ORAC en tubo de ensayo con el ' efecto sobre los valores de ORAC en el suero. Cuando se miden los efectos antioxidantes en el suero en comparación con una evaluación de ORAC(fl), el Servicio de Investigación Agrícola de USDA descubrió que, por ejemplo, las espinacas se clasifican más abajo que las fresas en el ensayo de ORAC en tubo de ensayo, pero las espinacas tuvieron un efecto mayor sobre los valores de ORAC en el suero que en las fresas. Utilizando la presente invención y las composiciones descritas en este documento, los presentes inventores han remediado la desconexión al desarrollar un sistema que permite la interacción entre un antioxidante con solubilidades variables, el cual refleja mejor la actividad de los antioxidantes dentro del cuerpo humano. Los métodos indirectos de ORAC(fl) y/o ORAC (fl-lipo) fallan en medir la actividad antioxidante total y fallan en detectar los efectos sinérgicos de ciertos alimentos. La FIGURA 13 es una gráfica de los resultados de AUC de ORAC(fl) utilizando un a-tocoferol con una variación en la cantidad de detergente utilizado para mostrar su efecto sobre las mediciones de AUC. En este ensayo, el tercio de solvente se utilizó en su tercio completo y en una mezcla con una cantidad más pequeña de Tween-20MR. La FIGURA 14 es una gráfica de un ensayo de ORAC(fl) que mide la actividad antioxidante medida para una relación fija de la relación de quercetina : a-tocoferol disuelta en dos relaciones diferentes de solvente : agua con mezclas de detergentes. Los resultados en la FIGURA 13 y la FIGURA 14 muestran que el detergente (Tween-20MR) explicó el incremento en AUC y por lo tanto muestran que la detección de la actividad de ORAC(fl) es incrementada en comparación con la mezcla estándar de acetona : agua .

EJEMPLO 3 : Detección de ORAC (o) de la Sinergia y Potenciación de Antioxidantes. Para mostrar que el ensayo de ORAC (o) fue capaz de detectar la actividad de antioxidantes tanto lipófilos como lipófobos, se condujo una serie de estudios para mostrar el efecto de combinaciones específicas de concentraciones conocidas de antioxidantes lipófilos y lipófobos y la potenciación de los mismos con la adición de, por ejemplo, extracto de semilla de uva y extracto de té verde en comparación con extracto de semilla de uva y extracto de té verde solos . La FIGURA 15 es una gráfica que muestra los valores de ORAC (o) obtenidos con diferentes relaciones de quercetina y tocoferoles mezclados. La FIGURA 16 es una gráfica que muestra los valores de ORAC (o) para una diferente relación de extracto de semilla de uva (GES, por sus siglas en inglés) y extracto de té verde (GTE, por sus siglas en inglés) . Después de la determinación de la relación máxima para la actividad antioxidante para el GSE y el GTE, los dos se combinaron con la relación optimizada para quercetina y tocoferoles mezclados. La FIGURA 17 es una gráfica que muestra los valores de ORAC (o) de la combinación de las relaciones máximas de quercetina : tocoferol mezclado y extracto de semilla de uva y extracto de té verde. Se encontró que la quercetina y los tocoferoles mezclados, GST, GTE combinados aumentaron al máximo el potencial antioxidante del complemento .

EJEMPLO 4: Efecto Antioxidante de AMBROTOSE AO" en un Pequeño Número de Individuos Saludables, Estudio con el Conocimiento del Medicamento Utilizado, No Controlado con Placebo . Un antioxidante se define como cualquier sustancia que pueda retardar o impedir la oxidación de sustratos biológicos. Las dietas ricas en frutas y verduras que contienen antioxidantes han sido asociadas con una incidencia disminuida de condiciones patológicas a través del resultado de la tensión oxidante. Sin embargo, el uso de complementos con los compuestos antioxidantes, aislados frecuentemente ha probado no ser efectivo en el mejoramiento de la salud, en algunos casos, y ha probado ser peligroso en otros.1'3,4 Se ha sugerido que los beneficios antioxidantes de una alta captación de frutas y verduras pueden no ser resultantes exclusivamente de antioxidantes individuales sino preferiblemente de una acción concertada de una combinación de diferentes antioxidantes que están presentes en los alimentos.5,6 Este planteamiento sobre antioxidantes individuales es una posible explicación en cuanto a porqué los científicos tienen que duplicar todavía los efectos protectores de una dieta con alto contenido de antioxidantes mediante el uso de complementos nutricionales.7 Los estudios recientes han sugerido que los complementos gliconutricionales (GN, por sus siglas en inglés) , complementos nutricionales que proporcionan azúcares que soportan la comunicación celular y la función inmune, tienen propiedades antioxidantes tanto in vi tro como in vivo . Las células de hígado de rata desarrolladas en un medio de cultivo que contenía complementos GN mostraron niveles más altos de glutationa reducida con relación a los controles, demostrando con lo cual una protección antioxidante incrementada.8 Un estudio clínico piloto demostró una reducción en los biomarcadores de la tensión oxidante y un incremento en los biomarcadores de la defensa oxidante en personas que consumían complementos GN. Los incrementos significativos se observaron en la capacidad de enlace a hierro total y ácido fólico, y una disminución significativa se observó en la relación de cobre/ceruloplasmina dentro de 76 días después de la adición diaria de 2 g de complemento GN a la dieta normal . También se observaron tendencias que sugieren una disminución en los alquenales, - homocisteína, 8-hidroxidesoxiguanosina (8-OHdG) y colesterol total en el suero y un incremento en la capacidad de absorbancia de radicales de oxígeno (0RACß_pE) X Los estudios recientes han demostrado que un amplio intervalo de nutrientes (algunos conocidos, otros todavía no identificados) explican la actividad antioxidante de frutas y verduras .10'11,12,13'14 Algunos de los antioxidantes benéficos, conocidos incluyen polifenoles y las vitaminas C y E.d Ciertos alimentos y bebidas, inclusive las uvas (y el vino tinto) , té verde y el ciruelo arbustivo australiano ( Terminalia ferdinandiana) contienen niveles relativamente altos de estos antioxidantes.6,15,16 Este estudio midió la protección antioxidante proporcionada por un complemento nutricional novedoso que combinó un complemento GN con una mezcla derivada de té verde, uvas, tocoferoles mezclados, quercetina y el ciruelo arbustivo australiano. Métodos : Las muestras de sangre fueron recolectadas por Cover-Tek, Inc., Dallas, TX. Todas las muestras de sangre y orina fueron analizadas por Genox Corporation, Baltimore, MD y todos los análisis estadísticos fueron realizados por Decisión Analyst, Arlington, TX. Se ha publicado una variedad de métodos para someter a prueba el potencial antioxidante de las muestras.17 La prueba utilizada en este estudio fue la medición de ORAC^- E del suero completo. Este método utiliza jS-ficoeritrina, una sonda fluorescente, para determinar la capacidad de eliminación de antioxidantes de la muestra de suero, específicamente contra radicales peroxilo, cuando se comparó con un estándar conocido, Trolox"R. Los resultados - son expresados en micromoles de equivalentes de Trolox"11 (TE) por gramo.18 Otras técnicas analíticas, estandarizadas que se utilizan en el estudio fueron la medición de hidroperóxidos y alquenales de lípidos en la orina, los cuales se relacionan indirectamente con la cantidad de daño por radicales libres a los lípidos y 8-OHdG en la orina, que se relaciona indirectamente con el daño al ADN.19,20'21 El complemento nutricional antioxidante utilizado en este estudio, Ambrotose A0MR, se desarrolló utilizando una evaluación in vi tro de los ingredientes: quercetina, tocoferoles mezclados, extracto de uva, extracto de té verde, el ciruelo australiano. Los valores antioxidantes in vitro de cada ingrediente se determinaron utilizando el método estándar de ORACfi (el cual utiliza una diferente sonda fluorescente, fluoresceína) . Los valores antioxidantes de las mezclas de ingredientes se determinaron utilizando un método recientemente desarrollado que mide directamente el oxígeno disuelto, el 0RACo. Puesto que los antioxidantes solubles en lípidos y solubles en agua trabajan en conjunto in vivo, la 0RACo, la cual mide simultáneamente las contribuciones e interacciones de los compuestos solubles en lípidos y agua, esto es un mejoramiento sobre los métodos basados en la fluorescencia (ORACfi, ORACfi_iipo y ORAC^-PE) . Estos métodos, en el mejor de los casos, miden las actividades de los compuestos solubles en lípidos o agua solos. Por lo tanto, la 0RACO proporciona una determinación más precisa de la actividad antioxidante total in vi tro de una mezcla de ingredientes solubles tanto en agua como en lípidos. Los ingredientes solubles en agua y lípidos fueron combinados y evaluados con la 0RACo para establecer la sinergia máxima y el valor de 0RACo in vi tro óptimo de la mezcla.* La mezcla subsecuente se compactó con rodillos con un complejo Ambrotose"R en una relación de 1:2 para crear Ambrotose AO"15. Muchas de las gomas naturales en AmbrotoseMR han sido utilizadas para controlar la liberación de compuestos proporcionando un suministro sostenido. El desarrollo del producto específico es el objetivo de una publicación separada y una solicitud de patente norteamericana . Este estudio se diseñó para determinar la actividad antioxidante in vivo, utilizando pruebas estandarizadas de diferentes cantidades de Ambrotose A0MR determinada directamente por la ORACß_pE del suero e indirectamente por medio de los análisis de hidroperóxido, alquenal y 8-OHdG de lípidos en la orina. Prior y Cao sugirieron' recientemente que una serie de pruebas, preferiblemente que cualquier prueba individual, es necesaria debido a que algunas condiciones patológicas, tal como falla renal, pueden alterar cualquier prueba totalmente no relacionada con la tensión oxidante.22 El consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes. Se enrolaron doce voluntarios adultos, saludables de ambos sexos que no tomaban complementos nutricionales o cualquier fármaco que interfiriera con el estudio. Los sujetos del estudio, cuatro hombres y ocho mujeres de edades de 22-61, consumieron cantidades crecientes del complemento antioxidante. Para evaluar la variabilidad de OR?Cß_PE a través del tiempo y para someter a prueba la reproducibilidad de los resultados de laboratorio, se recolectó una muestra de sangre y orina de un sujeto adicional quien no estaba tomando complementos. Durante el estudio, los participantes continuaron sus rutinas y dietas diarias, previas al estudio, normales. La Tabla 5 proporciona información acerca de los sujetos del estudio.

Los doce sujetos del estudio tuvieron análisis matinales en ayunas de orina y ORAC^PE del suero realizados después de un período de eliminación inicial de 2 semanas sobre la ausencia de complementos y al final de 2 semanas sobre cada cantidad creciente del complemento antioxidante. Las cantidades utilizadas fueron 500 mg (1 cápsula) cada día durante los primeros 14 días de uso del complemento (Período 1), 1.0 g (2 cápsulas) cada día durante el segundo período de 14 días (Período 2) y 1.5 g (3 cápsulas) cada día durante el tercer período de 14 días (Período 3) . Adicionalmente, una muestra de sangre y orina del individuo que no consumía complementos se analizó por triplicado para someter a prueba la precisión de los análisis. Las muestras de sangre y orina fueron recolectadas por el flebotomista independiente, se empacaron inmediatamente en hielo seco y se transportaron a un laboratorio hospitalario local para la preparación. Las muestras preparadas de suero y orina entonces se enviaron en hielo seco durante toda la noche a Genox para el análisis independiente por el protocolo Genox.23 Todas las muestras entonces se almacenaron en Genox en hielo seco y todas las mediciones de OR C^ E y orina se realizaron al mismo tiempo en la conclusión del estudio para minimizar cualquier variabilidad de reactivo analítico . Resultados: Valores de ORAC y Porcentaje de Cambio de los Datos de la Línea de Referencia. Los valores de ORAC/J-PE y el porcentaje de cambio de la línea de referencia para los doce participantes que tomaban Ambrotose A0MR se proporcionan en la Tabla 6. La línea de referencia es después de la eliminación de 2 semanas, Período 1 después de 2 semanas en 500 mg, Período 2 después de 2 semanas en 1.0 g y Período 3 después de 2 semanas en 1.5 g. Las etiquetas de los frasquitos de suero de algunas muestras del Período 2 se desecharon durante el envío a Genox. Los valores de ORAC/J- E solo pudieron asignarse específicamente a tres de los participantes del estudio para este período y no para el resto de los participantes del estudio o el individuo adicional que no estaba en el estudio .

Tabla 6 Valores de ORACß.Pe y Porcentaje de Cambio de la Línea de Referencia Análisis Estadístico de Datos de ORAC no Procesados . Un análisis ANOVA de mediciones repetidas se condujo para determinar si había una diferencia entre los datos de ORAC no procesados de la línea de referencia, Período 1, Período 2 y Período 3. Hubo diferencias significativas entre los períodos de tiempo totales (F(3,24)= 4.02, p = .020). Los análisis post hoc revelaron que el período 2 fue significativamente diferente de la línea de referencia (t(24) = -3.47, p = .002). El período 1 fue significativamente diferente del Período 2 (t(24) -2.77, p = .011). El Período 2 fue significativamente diferente del Período 3 (t(24) = 2.87, p = .009). El promedio de cada período de tiempo se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7. Valores Promedio de ORACbeta-PE para Cada Período de Tiempo Período de Número de Puntaje Promedio Tiempo Sujetos de ORAC Línea de Referencia 12 4279.5 847.9 Período 1 12 4898.3 699.1 Período 2 7376.5 3466.6 Período 3 12- 4814.6 1053.1 Análisis Estadístico del Porcentaje de Cambio de los Datos de ORAC de la Línea de Referencia. En contraste con los datos no procesados que se utilizaron en el análisis reportado anteriormente (Tabla 7) , este análisis examinó las diferencias entre los períodos de tiempo expresadas como porcentaje de cambio de la línea de referencia. Un análisis ANOVA de mediciones repetidas se condujo para evaluar las diferencias entre el porcentaje de cambio de la línea de referencia de los datos de ORAC del Período 1, Período 2 y Período 3. La prueba ómnibus no produjo una importancia total (F(2,13) = 0.71, p = .510). Adicionalmente, los análisis post hoc no revelaron diferencias significativas entre los períodos. El promedio para cada período de tiempo se muestra en la Tabla 8, con los diagramas de caja correspondientes mostrados en la Figura B .

Los valores promedio de hidroperóxido, alquenal total y 8-OHdG de lípidos se resumen en la Tabla 9. Estos son corregidos por la variabilidad de concentración en la orina mediante la división por la creatinina en la orina medida al mismo tiempo en la misma muestra.

Calidad del Aire. Se sabe que la calidad del aire afecta los niveles de la tensión oxidante. Las concentraciones crecientes de contaminantes comunes, tales como ozono y dióxido de nitrógeno, disminuyen la calidad del aire . Esto conduce a un mayor potencial para la generación de ROS.24,25 Un resumen de los índices de calidad del aire promedio de la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (EPA, por sus siglas en 'inglés) para cada período de dos semanas en el área de Dallas/Fort Worth (DFW) , donde vivieron los sujetos, se proporciona en la Tabla 10. La EPA utiliza códigos de color para mapas de calidad del aire de las áreas: Verde: "Bueno" (0 - 79 partes por billón [ppb] de ozono), Amarillo: "Moderado" (80 - 99 ppb) , Anaranjado: "Nocivo para Grupos Sensibles" (100 - 124 ppb), Rojo: "Nocivo" (125 - 149 ppb) y Morado: "Muy Nocivo" (más de 150 ppb) . Un valor numérico para cada mapa diario de la EPA del área de estudio se calculó al asignar números a los colores: Verde: 1, Amarillo: 2, Anaranjado: 3, Rojo: 4 y Morado: 5 y al estimar el promedio numérico para cada día en base al área de cada color en los mapas publicados de la EPA. Los valores numéricos diarios entonces se promediaron para cada período de dos semanas del estudio (Tabla 10) .

Permitiendo la incertidumbre en la asignación de valores a los participantes del estudio en el Período 2 resumido anteriormente, se calculó la ORACp_p promedio más baja posible para los 12 participantes del estudio. Suponiendo que los 9 valores más bajos de las muestras de suero cuyas etiquetas no pudieron ser identificadas pertenecieron a los participantes y combinándolas con los 3 valores conocidos se produce el promedio más bajo posible y de esta manera el estimado más conservador del cambio de la línea de referencia. Los 9 valores de ORAC^- E más bajos fueron, 4727.9, 5233.9, 5104.3, 4599.9, 5699 . 9, 5364.8, 3987.3, 4179.7 y 4584.9. Cuando se combinaron con los 3 valores conocidos del Período 2 de la Tabla 5, esto proporcionó un valor de ORAC^-PE promedio de 5467.70 para los 12 participantes del estudio en el Período 2. Esto es 27.8% sobre el promedio de la línea de referencia de 4279.49. Discusión. Los estudios han mostrado que el consumo de dietas ricas en frutas y verduras es protector contra la tensión oxidante.7, 26, 7 Las guías alimentarias apoyan el consumo diario de 2-4 raciones de fruta y 3-5 raciones de verduras.28 A pesar de este conocimiento y estas recomendaciones, muy pocos individuos en los Estados Unidos consumen las cantidades diarias recomendadas . En un estudio clínico patrocinado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA, por sus siglas en inglés) , los investigadores descubrieron que el consumo incrementado de frutas y verduras, específicamente de las cinco raciones usuales a las diez raciones experimentales al día, incrementó significativamente los valores de ORAC^-PE en el suero por hasta aproximadamente 13% después de dos semanas.7 En el presente estudio, el incremento en los valores promedio de ORACß-PE en el suero utilizando cada cantidad de complemento fueron: 19.1% con 500 mg, 37.4% con 1.0 g y 14.3% con 1.5 g. Estos datos sugieren que la cantidad óptima que da por resultado el incremento más grande en la ORAC^-PE en el suero sobre la línea de referencia en personas saludables es 1.0 g. El estimado conservador de un incremento de 27.8% con 1.0 g de Ambrotose AOMR es más de dos veces que el 13% publicado que reportaron los individuos que consumieron cinco frutas y verduras adicionales al día. Los valores de hidroperóxido/creatinina de lípidos en la orina disminuyeron con el incremento del uso de complementos. La disminución para cada cantidad fue 12.1% con 500 mg, 15.0% con 1:0 g y 17.0% con 1.5 g, lo que sugiere que la protección del daño de lípidos incrementó con cantidades crecientes del complemento sobre el intervalo estudiado. No es claro porque los datos de hidroperóxido de lípidos no se correlacionan exactamente con los valores de ORACß-pE. La ORAC^-PE del suero es una medida de la protección antioxidante de la sangre con respecto a su capacidad para suprimir radicales libres al momento de la medición. Los hidroperóxidos de lípidos en la orina son un marcador del daño oxidante de lípidos en algún momento en el pasado. La relación temporal entre el daño de lípidos real y la aparición de hidroperóxidos de lípidos en la orina no está bien definida. Bien puede ser que estas diferencias temporales expliquen, en parte, esta variación. Además de los hidroperóxidos de lípidos en la orina, la 8-OHdG y los alquenales en la orina también se midieron en cada período de tiempo. No se observaron diferencias ni tendencias significativas. Esto puede estar relacionado nuevamente con la relación temporal entre el daño de lípidos y ADN real y la aparición de los biomarcadores en la orina. Los participantes en el estudio vivían en el área de DFW. Las mediciones de calidad del aire diarias de la EPA publicadas para DFW se promediaron para cada período de 2 semanas. La calidad del aire fue empeorando durante el curso del estudio . Se esperaría normalmente que esto incrementara la tensión oxidante al incrementar las ROS y por lo tanto al incrementar los biomarcadores del daño oxidante, tal como hidroperóxidos de lípidos.29 Por el contrario, la protección incrementada fue evidente como se midió por los valores incrementados de ORAC del suero. Además, una tendencia descendente en los valores de hidroperóxido de lípidos en la orina y la estabilidad de 8-OHdG y alquenales en la orina proporciona evidencia de un daño oxidante disminuido. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que los efectos antioxidantes proporcionados por el complemento podrían haber sido mayores que los efectos que fueron medidos realmente . Conclusiones. Mientras se recomienda que los individuos consuman frutas y verduras de acuerdo con las guías publicadas, la realidad es que la inmensa mayoría no lo hará. Estos datos preliminares sugieren que un complemento nutricional que contiene ingredientes antioxidantes óptimos que conservan una actividad antioxidante en el producto terminado incrementa la protección antioxidante en individuos saludables medida por medio de la ORAC^-PE del suero y disminuye el daño oxidante de lípidos medido por los hidroperóxidos de lípidos en la orina. La protección en las personas saludables demostrada por el incremento en la ORAC^- E del suero sobre la línea de referencia después de dos semanas fue mayor utilizando 500 mg, 1.0 g y 1.5 g de Ambrotose AOMR que aquella documentada en los datos publicados con la adición de cinco frutas y verduras a la dieta durante dos semanas (19.1%, 37.4% y 14.3% contra 13%) . Para nuestro conocimiento, éste es el primer estudio con un complemento antioxidante para examinar cuatro mediciones de tensión oxidante en personas saludables y que muestra este incremento en la ORAC^-PE del suero. Mientras que el intervalo óptimo entre los sujetos saludables sugerido por los valores de ORACe_pE fue 1 g al día, el investigador ha mostrado que los individuos con bajos valores de ORAC del suero pueden beneficiarse del uso de complementos antioxidantes en altas dosis.30 Por lo tanto, aquellos quienes sufren de tensión oxidante incrementada o de otra manera los individuos con tensión pueden beneficiarse de las dosis más grandes. Mientras que la 0RACo se utilizó en la formulación de mezclas antioxidantes, un laboratorio independiente utilizó un método establecido, la ORAC^-PE/ para analizar las muestras de plasma de ensayos clínicos en humanos. La evaluación in vivo de la efectividad antioxidante del producto Ambrotose AOMR no dependió del uso del método de 0RACo. Estos datos demuestran que el presente complemento antioxidante incrementa la protección antioxidante en consumidores medida por la ORAC(/3-PE) del suero y disminuye el daño oxidante de lípidos medido por los hidroperóxidos de lípidos en la orina. Será entendido que las modalidades particulares que son descritas en este documento se muestran a manera de ilustración y no como limitaciones de la invención. Las características principales de esta invención pueden emplearse en diversas modalidades sin apartarse del alcance de la invención. Aquellas personas expertas en el campo reconocerán, o serán capaces de descubrir utilizando no más que la experimentación de rutina, numerosos equivalentes para los procedimientos específicos que se describen en este documento. Se considera que estos equivalentes están dentro del alcance de esta invención y son cubiertos por las reivindicaciones . Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de experiencia de aquellas personas expertas en el campo al cual pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en este documento a manera de referencia al mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera indicada específica e individualmente para ser incorporada a manera de referencia. Todas las composiciones y/o métodos descritos y reclamados en este documento pueden elaborarse y ejecutarse sin la experimentación indebida en vista de la presente descripción. Mientras que las composiciones y los métodos de esta invención han sido descritos en términos de modalidades preferidas, será aparente para aquellas personas expertas en el campo que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito en este documento sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será aparente que ciertos agentes que están relacionados tanto química como físicamente pueden ser sustituidos por los agentes descritos en este documento mientras que se lograrían resultados iguales o similares. Se considera que todos estos sustitutos y modificaciones similares que son aparentes para aquellas personas expertas en el campo están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención definida por las reivindicaciones anexas .

LISTA DE REFERENCIAS 1. Koepke CM, Le L, McAnalley S y colaboradores . Results of clinical triáis with antioxidants : a review. GlycoScience. & Nutrition (Official Publication of GlycoScience corn: The Nutrition Science Site) . 2003; 4 (3) :l-7. 2. Ochi Hl Cheng RZ, Kantha SS y colaboradores.

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Claims (56)

REIVINDICACIONES

1. Un aparato para detectar directamente la actividad antíoxidante de antioxidantes tanto lipófilos como lipófobos, caracterizado porque comprende: un sensor de oxígeno en comunicación fluida con una muestra y una molécula sensible a radicales de oxígeno en una mezcla de solvente/agua/surfactante; en donde el sensor sensible a radicales de oxígeno detecta concurrentemente los antioxidantes tanto lipófilos como lipófobos en la mezcla de solvente/agua/surfactante.

2. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula sensible a radicales de oxígeno se selecciona de moléculas que reaccionan con oxígeno, moléculas con enlaces dobles conjugados; compuestos que contienen nitrógeno o azufre, fluoresceína, ß-PE, glutationa-S-transferasa, ácido linoleico o combinaciones de los mismos.

3. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un nivel de oxígeno disuelto es determinado utilizando un medidor de oxígeno disuelto.

4. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de oxígeno disuelto es determinado utilizando un sensor de oxígeno que

comprende un sensor electroquímico, quimioluminiscente, de resonancia de plasmón superficial, infrarrojo, de acoplamiento capacitivo, de fibra óptica acoplado a tinte o de oxígeno hiperespectral .

5. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el solvente se define adicionalmente como un solvente orgánico .

6. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el surfactante se define adicionalmente como un detergente.

7. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el surfactante se define adicionalmente como un detergente no iónico.

8. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el solvente en la mezcla de solvente/agua/surfactante es al menos 10 por ciento en volumen de la mezcla de solvente/agua/surfactante .

9. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agua en la mezcla de solvente/agua/surfactante es al menos 10 por ciento en volumen de la mezcla de solvente/agua/surfactante.

10. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el surfactante en la mezcla de solvente/agua/surfactante es al menos 10 por

ciento en volumen de la mezcla de solvente/agua/surfactante .

11. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la relación de solvente/agua/surfactante es de aproximadamente 1:1:1.

12. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el solvente comprende acetona .

13. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el surfactante comprende TweenMR.

14. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de radicales de oxígeno es determinado utilizando la fórmula:

AUCSMP-AUCBLNK AUCTRLX-AUCBLNK X 100° (mg/gr) x [TRLX (^ol/?nl)í

O AC(o)— —^——————.^———^—— ———^—.— [SMP (mg/ml)]

en donde AUCsmp es el valor del área bajo la curva de la muestra; en donde AUCbln es el valor del área bajo la curva de la solución blanco; en donde AUCtrix es el valor del área bajo la curva para TroloxMR; y en donde SMP es la muestra.

15. Un método para determinar la actividad antioxidante, caracterizado porque comprende los pasos de: determinar un nivel de oxígeno disuelto en una solución de

prueba disuelta en una mezcla de solvente/agua/surfactante en presencia de uno o más antioxidantes y un objetivo de radicales de oxígeno, en donde la actividad de antioxidantes solubles tanto en agua como en lípidos es medida con un detector de oxígeno .

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el nivel de oxígeno disuelto es determinado utilizando un detector de oxígeno que comprende un sensor electroquímico, quimioluminiscente, de resonancia de plasmón superficial, de acoplamiento capacitivo, de fibra óptica acoplado a tinte o de oxígeno hiperespectral .

17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el nivel de oxígeno disuelto es determinado utilizando un sensor de oxígeno disuelto.

18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el nivel de radicales de oxígeno se determina utilizando la fórmula:

AUCSMP-AUCBLNK — ~ X 1000 (mg/gr) X [TRLX (µmol/ml)] AUCTRLX-AU B N ORAC(O)= — — — — — — — — — — ^ — [SMP (mg/ml)]

en donde AUCsmp es el valor del área bajo la curva de la muestra; en donde AUCb?nk es el valor del área bajo la curva

de la solución blanco; en donde AUCrix es el valor del área bajo la curva para TroloxMR; y en donde SMP es la muestra.

19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el solvente se define adicionalmente como un solvente orgánico.

20. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el surfactante se define adicionalmente como un detergente .

21. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el surfactante se define adicionalmente como un detergente no iónico.

22. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el solvente en la mezcla de solvente/agua/surfactante es al menos 10 por ciento en volumen de la mezcla de solvente/agua/surfactante .

23. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el agua en la mezcla de solvente/agua/surfactante es al menos 10 por ciento en volumen de la mezcla de solvente/agua/surfactante .

24. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el surfactante en la mezcla de solvente/agua/surfactante es al menos 10 por ciento en volumen de la mezcla de

solvente/agua/surfactante .

25. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la relación de solvente/agua/surfactante es de aproximadamente 1:1:1.

26. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el solvente comprende acetona .

27. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el surfactante comprende un detergente aniónico, un detergente iónico o mezclas de los mismos.

28. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el surfactante comprende Tween"11.

29. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la actividad antioxidante es medida a aproximadamente 37 grados centígrados .

30. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende el paso de proporcionar un iniciador de radicales seleccionado del grupo que consiste de diclorhidrato de 2 , 2 ' -azobis [2- (5-metil-2-imidazolin-2-il) propanó] , diclorhidrato de 2,2'-azobis (2 -amidinopropano) (AAPH), diclorhidrato de 2,2'-azobis (2-amidinopropano) [2- (N-estearil) amidinopropano] (SA-

1), diclorhidrato de 2 , 2 ' -azo (2- (2-imidazolin~2-il) - propano) - [2- [2- (4-n-octil) imidazolin-2-il] -propano] (C-8) , 2,2' -azobis (4-metoxi-2 , 4-dimetilvaleronitrilo) (MeO-AMVN) , 2,2' -azobis (2, 4-dimetilvaleronitrilo) (AMVN) , azo-bis- isobutilnitrilo, 2 , 2 ' -azobis (2-metilproprionato) (DAMP) y 2 , 2' -azobis- (2 -amidinopropano) , sales, mezclas o equivalentes de los mismos.

32. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el detector es desechable.

33. Un complemento alimentario antioxidante, caracterizado porque comprende: un antioxidante lipófobo aislado y purificado; y un antioxidante lipófilo aislado y purificado, en donde los. antioxidantes lipófobos y lipófilos combinados tienen un valor de oxígeno disuelto mayor que 6,000 µMol de equivalentes de Trolox"R (TE) /gramo.

34. El complemento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque los antioxidantes lipófobos y lipófilos son liberados a través del tiempo.

35. El complemento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el antioxidante lipófobo se selecciona del grupo que consiste de una o más vitaminas E seleccionadas del grupo que consiste de tocoferoles alfa, beta, delta, épsilon, gamma, zeta, eta, xil, xi2 y sigma y tocotrienoles alfa, beta delta y gamma,

análogos de los mismos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos.

36. El complemento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el antioxidante lipófilo, se selecciona del grupo que consiste de quercetina, kaempferol, miricetina, apigenina y derivados, análogos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos.

37. El complemento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque además comprende dos o más sacáridos esenciales .

38. El complemento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque además comprende dos o más sacáridos seleccionados de galactosa, galactosamina, glucosamina, glucosa, mañosa, mañosa acetilada, ácido N-acetilneuramínico, fucosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina y xilosa.

39. El complemento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque además comprende una fuente vegetal de vitamina C.

40. El complemento de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la fuente vegetal de vitamina C comprende un ciruelo arbustivo australiano (Terminalia ferdinandiana) .

41. El complemento de conformidad con la

reivindicación 39, caracterizado porque la fuente vegetal de vitamina C comprende un ciruelo arbustivo australiano, silvestre ( Terminalia ferdinandiana) .

42. El complemento de conformidad con la reivindicación - 39, caracterizado porque además comprende uno o más pro-bióticos .

43. El complemento de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque además comprende uno o más pro-bióticos seleccionados de Lactobacillus sp . y Bifidobacterium sp.

44. El complemento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el complemento es comprimido para proporcionar una superficie generalmente impermeable al oxígeno.

45. El complemento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el complemento es una partícula comprimida con rodillos, cápsula, tableta, minitableta, comprimido, tableta efervescente o combinaciones de los mismos.

46. El complemento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado por el antioxidante lipófilo aislado y purificado, en donde los antioxidantes lipófilos y lipófobos tienen un valor de ORAC (fl-lipo) antioxidante mayor que 7000 µMol de equivalentes de TroloxMR (TE) /gramo.

47. El complemento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado por el antioxidante lipófilo aislado y purificado, en donde los antioxidantes lipófobos y lipófilos cuando se proporcionan a un paciente proporcionan un incremento superior a 13% medido por ORAC (ß-PE) del nivel de antioxidantes de línea de referencia del paciente .

48. Un complemento alimentario, caracterizado porque comprende: una cantidad nutricionalmente efectiva de dos o más sacáridos esenciales; un supresor de radicales de oxígeno lipófobo, aislado y purificado; y un supresor de radicales de oxígeno lipófilo, aislado y purificado, en donde los supresores de radicales de oxígeno lipófobos y lipófilos combinados tienen un valor de supresión de radicales de oxígeno mayor que 6,000 µMol de equivalentes de Trolox"R (TE) /gramo.

49. El complemento de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque los supresores de radicales de oxígeno lipófobos y lipófilos cuando se administran a un paciente proporcionan un incremento mayor que 13% medido por ORAC (ß-PE) del nivel de antioxidantes de línea de referencia del paciente.

50. El complemento de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque los supresores de radicales de oxígeno lipófobos y lipófilos son empacados

para la liberación prolongada.

51. El complemento de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el supresor de radicales de oxígeno lipófobo se selecciona del grupo que consiste de una o más vitaminas E seleccionadas del grupo que consiste de tocoferoles alfa, beta, delta, épsilon, gamma, zeta, eta, xil, xi2 y sigma y tocotrienoles alfa, beta, delta y gamma, análogos de los mismos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos.

52. El complemento de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el supresor de radicales de oxígeno lipófilo se selecciona del grupo que consiste de flavonoles, quercetina, kaempferol, miricetina, apigenina y derivados, análogos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos.

53. El complemento de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque además comprende dos o más sacáridos seleccionados del grupo que consiste de galactosa, glucosa, mañosa, ácido N-acetilneuramínico, fucosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina y xilosa, derivados, análogos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos.

54. El complemento de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque además comprende'

seis o más sacáridos seleccionados del grupo que consiste de galactosa, glucosa, mañosa, ácido N-acetilneuramínico, fucosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina y xilosa, derivados, análogos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos.

55. Un sistema para medir el potencial antioxidante de composiciones, caracterizado porque comprende: un sensor de oxígeno en comunicación fluida con una muestra y una molécula sensible a radicales de oxígeno en una mezcla de solvente/agua/surfactante; en donde el sensor sensible a radicales de oxígeno detecta concurrentemente los antioxidantes tanto lipófilos como lipófobos en la mezcla de solvente/agua/surfactante; un sistema fluídico en comunicación fluida con el sensor de oxígeno que comprende uno o más recipientes, valores y conductos; y un procesador conectado al sensor de oxígeno y el sistema fluídico.

56. El sistema de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque además comprende sensores de pH, ORP, conductividad o turbiedad en comunicación fluida con el sistema fluídico.